ES2312178T3 - Procedimiento de clasificacion de moleculas antifungicas activas en la actividad glucanosiltransferasa. - Google Patents
Procedimiento de clasificacion de moleculas antifungicas activas en la actividad glucanosiltransferasa. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína que posee una actividad de tipo Beta(1-3)glucanosiltransferasa, caracterizada porque presenta, como mínimo, un 85% de identidad con la proteína que tiene una de las secuencias SEC ID nº: 2 o SEC ID nº: 3 siguientes: (Ver secuencias)
Description
Procedimiento de clasificación de moléculas
antifúngicas activas en la actividad glucanosiltransferasa.
La presente invención se refiere a una proteína
que presenta una actividad de tipo glucanosiltransferasa, y más
particularmente, una actividad de tipo
\beta-(1-3)glucanosiltransferasa.
La presente invención describe asimismo unos
oligonucleótidos que codifican para esta proteína que posee una
actividad enzimática.
Asimismo, describe unas moléculas que tienen un
efecto sobre la actividad de esta enzima.
Las infecciones oportunistas fúngicas debidas a
Candida, Aspergillus, Cryptococcus y Pneumocystis son
responsables del crecimiento de la morbilidad y de la mortalidad
entre los pacientes afectados de SIDA y otros pacientes que
presentan una inmunidad comprometida clínicamente. Además, la
levadura Candida y los dermatofitos representan en la
actualidad un problema médico importante entre los pacientes que
presentan una inmunidad suficiente. A pesar del aumento del número
de infecciones debidas a los hongos patógenos y oportunistas, la
terapia contra las micosis no ha mejorado durante estos últimos
años. Se utilizan dos familias de medicamentos: los azoles y la
Anfotericina B. Estos medicamentos adolecen de ciertos
inconvenientes, puesto que el tratamiento a base de la Anfotericina
B se asocia a nefrotoxicidad, y el que es a base de azoles es más
fungistático que fungicida.
Los hongos son unos microorganismos de tipo
eucariota que comparten la mayoría de las vías bioquímicas con su
huésped, con una excepción importante: la biosíntesis de la pared
celular. La pared celular es una envolvente rígida que protege a la
célula contra el entorno y los estrés mecánicos, pero constituye
asimismo una estructura dinámica que está implicada en el
transporte de los iones y de las macromoléculas, y en la
localización de enzimas implicadas en el crecimiento del hongo. Por
consiguiente, la desorganización de la organización de la pared
celular debe ser perjudicial para los hongos.
El esqueleto de la pared celular fúngica está
constituido principalmente por polímeros de tipo polisacárido
(\beta(1-3)glucanos, mananos,
quitina) que no se encuentran en los humanos. Debido a esto, la
biosíntesis de la pared celular ha constituido una diana para la
investigación de nuevos medicamentos antifúngicos. Las penicilinas y
las céfalosporinas que son ambas unos inhibidores de la pared
celular bacteriana y unos antibióticos potenciales, aportan
credibilidad a esta hipótesis. Además, muchas de las moléculas que
inhiben el desarrollo de la pared celular fúngica poseen
propiedades antifúngicas (Debono y Gordee, 1994, Annu. Rev.
Microbiol, 48,471-497). Entre ellas, se pueden
citar:
- 1)
- Las familias de los lipopéptidos de los equinocandinos y de los glicopéptidos de los palulacandinos que son unos inhibidores no competitivos del complejo de la glucano sintetasa.
- 2)
- Las polioxinas y las nikomicinas que son unos análogos de la UDP-GlcNac y unos inhibidores competitivos potenciales de la quitina sintetasa, y
- 3)
- Las pradimicinas que vinculan el manano y las benanomicinas.
La síntesis del
\beta(1-3)glucano y de la quitina
está bajo el control de complejos enzimáticos (Glucano sintetasa y
quitina sintetasa) que se localizan al nivel de la membrana
plasmática. Una vez que los polímeros se liberan en el espacio
periplásmico, se llevan a cabo unas uniones reticulantes entre los
polímeros y son responsables de la rigidez de la pared celular. Las
proteínas y los genes del glucano y de la quitina sintetasas
empiezan a ser más bien compren-
didas.
didas.
Pero la inhibición de la quitina y del glucano
sintetasas para una molécula, necesita tres etapas: el transporte a
través de la pared celular, la travesía de la membrana plasmática y
el transporte al interior de la célula hacia la diana, pudiendo cada
etapa ser responsable del fracaso del inhibidor enzimático para ser
un medicamento antifúngico eficaz, igual que de la selección de las
resistencias contra el medicamento.
Las transferasas que son responsables del
establecimiento de los enlaces covalentes entre los distintos
polímeros de la pared, han sido muy poco estudiadas hasta la
fecha.
Estas enzimas representan una diana mejor que
los complejos de quitina y glucano sintetasas, puesto que
constituyen un acceso más fácil para un supuesto medicamento
antifúngico putativo.
Nuoffer et al. (1991, Mol. Cell. Biol.,
11, 27-37), han descrito una glicoproteína,
denominada Gas1p, expuesta en la superficie de la levadura
Saccharomyces cerevisiae. Los genes que codifican esta
proteína se han clonado. La función de la proteína Gas1p no es
esencial para la viabilidad de la célula, y no se ha
determinado.
Saporito-Irwing et al
(1995, Mol. Cell. Biol., 15, 601-613), aislaron un
gen procedente de la levadura Candida albicans, denominado
PHR1. La secuencia determinada de aminoácidos de la proteína PHR1
era idéntica en un 56% a la de la proteína Gast. El gen está
regulado en respuesta al pH del medio de cultivo. Al igual que para
la proteína gas1p, no se ha determinado ninguna función. Hartland
et al (1991, Proc. R. Soc. Lond., 246,
155-160) han aislado una
\beta-(1,3)glucanosiltransferasa en Candida
albicans.
Se deduce claramente de este análisis de la
técnica anterior que existía un problema en la obtención de
moléculas con una actividad antifúngica eficaz.
Los inventores han resuelto este problema.
Han demostrado que la introducción de mutaciones
en una glucanosiltransferasa procedente de Aspergillus
fumigatus, interfiere con el desarrollo de este
microorganismo.
Han determinado, además, la secuencia de varias
de estas enzimas.
La presente invención se refiere, por tanto, a
una proteína que posee una actividad de tipo
\beta-(1-3)glucanosiltransferasa,
caracterizada porque presenta una homología de por lo menos el 85%
con la proteína que tiene una de las secuencias SEC ID nº:2 o SEC ID
nº:3 siguientes:
Preferentemente, esta proteína presenta un peso
molecular de aproximadamente 44 kD, o de aproximadamente 49 kD si
soporta por lo menos un radical de tipo
N-glicosilo.
La presente invención describe además unas
secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína tal como se
ha descrito anteriormente, y más particularmente unas secuencias de
ADN (ADNc o ADN genómico), o unas secuencias de ARN.
Dicha secuencia de ADN puede ser la que presenta
una homología de por lo menos 50%, preferentemente de 60%, y
todavía más preferentemente del 85% con la secuencia genómica SEC
ID nº:1, o una parte de la secuencia siguiente:
Esta secuencia se ha incluido en un fragmento de
2,2 kb, que ha sido incluido a su vez en el sitio XbaI del vector
pUC19 (Maniatis et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratoires
Press). La cepa E. coli DH_{5}\alpha que transporta el
vector modificado de esta forma, se depositó en la Colección
Nacional del Cultivo de Microorganismos del Instituto Pasteur (CNCM)
el 26 de julio de 1996, con el número I-1763.
Dicha secuencia puede ser asimismo la que
presenta una homología de por lo menos el 50%, preferentemente del
60%, y todavía más preferentemente del 85%, con la secuencia de ADN
complementario comprendida en un fragmento de 1,4 kb que se incluyó
en el vector pCRII (Invitrogen). El conjunto, soportado por la cepa
E. coli DH_{5}\alpha, se depositó en la Colección
Nacional del Cultivo de Microorganismos del Instituto Pasteur (CNCM)
el 26 de julio de 1996, con el número I-1762.
Estas dos cepas constituyen unos objetos de la
presente invención.
La presente invención tiene además por objeto un
procedimiento para la detección de mutaciones en la secuencia SEC
ID n:º1, en una muestra biológica que contiene unas secuencias
nucleótidas, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con los cebadores nucleotídicos P3 y P4, que presentan respectivamente las secuencias SEC ID nº:7 y SEC ID nº:8 siguientes:
| SEC ID nº:7: | |
| GSYTTCTTCK CYGGCAACGA GGTT | |
| SEC ID nº:8: | |
| GTTGCAGCCG WATTCGGASA YGAA |
- habiendo sido eventualmente las secuencias nucleotídicos contenidas en la muestra puesto en una forma que permite su hibridización en unas condiciones que permiten la hibridación de los cebadores con las secuencias nucleótidas
- b)
- amplificar las secuencias nucleotídicas
- c)
- poner en evidencia de los productos de la amplificación y
- d)
- detectar las mutaciones mediante técnicas apropiadas.
Las proteínas según la invención pueden
obtenerse mediante purificación a partir de un autolisado de
Aspergillus fumigatus. La proteína puede purificarse mediante
cuatro etapas de cromatografía de intercambio iónico y una etapa de
filtración en gel.
Dichas proteínas pueden obtenerse asimismo
mediante procedimientos de ingeniería genética. Por ejemplo, la
secuencia SEC ID nº:1, privada si es posible de su parte C
terminal, puede clonarse en un vector apropiado, y expresarse en un
sistema de expresión, tal como el sistema de Pichia
pastoris, comercializado por Invitrogen.
En este sistema, la secuencia del gen que
codifica para la proteína, es clonada en un vector de expresión y
después linearizada. Unos protoplastos que proceden de P.
pastoris son transformados con el vector linearizado.
Los clones, en los que se lleva a cabo una
recombinación y que permite el reemplazo de la secuencia aox1 por
la secuencia del gen de la proteína que se intenta producir, se
seleccionan por su capacidad para crecer en un medio deficiente en
histidina. El experto en la materia puede consultar el "Manual of
methods for expression of recombinant proteins in Pichia
pastoris", editado por Invitrogen.
La proteína, así expresada, y que secretada si
es posible en el medio de cultivo, es recuperada mediante unos
procedimientos conocidos por el experto en la materia.
Dicha proteína puede ser utilizada, en
particular para el cribado de moléculas para identificar su
actividad antifúngica.
De este modo, otro objeto de la presente
invención consiste en un procedimiento para la detección de la
actividad antifúngica de moléculas, por inhibición de la actividad
de la \beta-(1-3)glucanosiltransferasa,
que comprende las etapas siguientes:
- -
- poner en contacto la molécula que se debe detectar y la proteína tal como se ha descrito anteriormente, o codificada por la secuencia SEC ID nº:1, y
- -
- determinar el efecto inhibidor de dicha molécula
sobre dicha proteína, midiendo la actividad de
la p-(1-3)glucanosiltransferasa (BGT2) de
dicha proteína. Dicha actividad puede determinarse poniendo en
contacto dicha proteína con un substrato sobre el cual ella tiene
un efecto, que puede estar compuesto por laminarioligosacáridos que
comprenden como mínimo 10 radicales glucosilo unidos por enlaces
\beta-(1-3). De hecho, cuando la proteína es
activa, escinde una parte de la molécula y une el fragmento
obtenido al extremo no reductor de una molécula substrato no
escindida.
El producto, que resulta de la actividad de la
proteína se encuentra en forma de productos de acoplamiento de dos
laminorioligosacáridos. Este producto puede detectarse mediante
cualquier procedimiento que permita la separación de los
oligosacáridos que tengan grados distintos de polimerización, en
particular mediante unos procedimientos de cromatografía tales como
la cromatografía líquida a alta presión (HPLC) o la cromatografía
en capa fina (CCM). Este procedimiento, aunque menos preciso que el
primero, constituye el procedimiento más fácil de llevar a
cabo.
cabo.
Para llevar a cabo estos procedimientos
cromatográficos, el experto en la materia puede consultar el
siguiente manual: "Carbohydrate analysis: a practical
approach". Chaplin y Kennedy, 1986, IRC Press of Oxford.
Este procedimiento de detección permite
determinar si las moléculas detectadas poseen una actividad
antifúngica.
Estas moléculas que tienen una actividad
antifúngica presentan unos efectos sobre la actividad de la
\beta-(1-3)glucanosiltransferasa de dichas
proteínas. Estos efectos pueden consistir, por ejemplo, en la
inhibición de esta actividad.
La presente invención se ilustra, sin estar por
ello limitada, por los ejemplos siguientes:
La figura 1 muestra un análisis del tipo
SDS-PAGE de la proteína purificada de 49 kDa: línea
a, estándares de pesos moleculares; línea b, proteína purificada de
49 kDa (1,5 \mug); línea c, proteína purificada de 49 kDa (1,5
\mug) después de tratamiento con la N-glicosidasa
F, línea d: sólo N-glicosidasa. Se indica el peso
molecular de las bandas de las proteínas y de la
N-glicosidasa F.
La figura 2 representa el análisis de tipo HPAEC
de los productos que proceden de la incubación de la enzima de 49
kDa con los laminarioligosacáridos reducidos. Se incubó la proteína
purificada de 49 kDa con 8 mM de laminarioligosacáridos reducidos
de tamaño G_{11}, G_{12}, G_{13} o G_{14}
(laminarioligosacáridos reducidos de los residuos respectivos 11,
12, 13 ó 14 de glucosa), y se han representado los perfiles HPAEC
procedentes de muestras en el tiempo cero y 15 minutos, indicando el
tamaño de los productos principales.
La figura 3 representa un análisis de tipo HPAEC
de productos procedentes de la incubación de la enzima de 49 kDa
con 8 mM de rG_{16}. Se han representado los perfiles HPAEC
procedentes de muestras tomadas en el tiempo cero, a los 30 minutos
y a los 120 minutos, indicando el tamaño de los productos
principales.
La figura 4 ilustra la acción de la transferasa
y de los productos formados procedentes de los
laminarioligosacáridos reducidos.
La figura 5 ilustra el efecto de las
concentraciones variables de los substratos. Se incubó la
transferasa de 49 kDa con 3 \muM de
[^{3}H]-rG_{11} (1x10^{6} cpm), más unas
cantidades variables de rG_{11} no marcadas. Se determinó el
porcentaje de transferencia comparando la proporción del marcaje
formado en forma de rG_{6} y rG_{16}. El suplemento presenta
los mismos datos con la concentración de los substratos que se
presenta en forma de una escala lineal.
La figura 6 ilustra los efectos del pH sobre la
velocidad de la transferencia. Se incubó la transferasa de 49 kDa
con 8 mM de [^{3}H]-rG_{11} (1x10^{6} cpm). Se
determinaron las velocidades de las reacciones midiendo la cantidad
de marcaje formado en forma del producto rG_{16}. Los tampones
que se utilizaron eran: \medbullet, citrato de sodio/ácido
cítrico; o, imidazol/ácido cítrico; X, acetato sódico/ácido acético;
\blacksquare, Tris/glicina, \ding{115}, fosfato/NaOH;
\boxempty, Tris/ácido acético; A, glicina/HCl.
La figura 7 representa la secuencia que procede
del gen BGT2 de A. fumigatus (A), comparada con los genes
PHR1 y GAS1 aislados de C. albicans (C) y S.
cerevisiae (S). El aminoácido subrayado corresponde al supuesto
intron.
La figura 8 ilustra la velocidad de crecimiento
del mutante 49 comparado con la cepa salvaje. La indicación de un
valor de pH significa que el cultivo se ha llevado a cabo a un pH
regulado (4 ó 7).
La figura 9 ilustra el crecimiento de la cepa
salvaje y la del mutante A49 y la evolución del pH del medio de
cultivo durante el crecimiento de las dos cepas.
La figura 10 es una comparación de las
secuencias de la proteína de secuencia SEC ID nº:2 y de las cinco
proteínas siguientes: Phr 1p, Gas 2p, Gas 3p, Gas 4p y Gas 5p.
Las figuras 11 y 12 son mapas de restricción de
secuencias de genes homólogos al gen BGT2, denominados
respectivamente BGT4 y BGT3.
Se hizo crecer la cepa CBS
144-89 del tipo A. fumigatus (disponible en
la Colección Centralbureau voor Schimmelculture) en un fermentador
de 15 litros en glucosa al 2%, micopeptona al 1%, (Biokar
Diagnostics) más silicona antiespuma 426R al 0,1% (Rhodorsil) a
25ºC (agitación a 500 rpm, aireación a 0,5
vol.vor^{-1}.min^{-1}) durante 42 horas. Como inóculo, se
utilizó un cultivo que había crecido durante 3 días en un
fermentador de 2 litros, bajo las mismas condiciones (8%
(vol/vol)). Se recuperaron los micelios mediante filtración al
vacío, fragmentándolos mediante el paso a través de un triturador de
tipo Dyno en presencia de bolas de vidrio (W.A. Bachofen, AG,
Basel, Suiza) (0,5-0,75 mm de diámetro). Se siguió
la progresión del desmembramiento de las células mediante el examen
al microscopio. La suspensión del micelio fragmentado se centrifugó
(8.000 g, 15 minutos), lavándose el sedimento que contenía las
paredes celulares 3 veces con agua y una vez en acetato sódico 50
mM, pH 5,6, que contenía azida de sodio 5 mM, antes de volver a
suspenderla en el mismo tampón (250 g de peso húmedo por litro de
tampón), e incubándola (agitación a 200 rpm) a 37ºC. Después de 72
horas, se centrifugó la suspensión (10000 g, 15 minutos),
disponiendo el sobrenadante en una vía para diálisis,
concentrándolo de 5 a 10 veces con polietilenglicol 20000 dializado
contra acetato de sodio 5 mM, pH 5,6, volviéndolo a centrifugar
(10.000 g, 15 minutos) y filtrándolo (filtro de 0,45 \mum). A
esta preparación se hizo referencia como autolisado.
Se ensayaron fracciones que se habían recuperado
durante cada etapa de la cromatografía para la actividad
enzimática, utilizando el ensayo no radioactivo de la transferasa
(véase a continuación). Se aplicó el autolisado dializado y
concentrado en una columna (4 x 18 cm)
DEAE-Sepharosa de flujo rápido (Pharmacia),
equilibrada con acetato de sodio 5 mM, pH 5,6, eluyéndolo con un
gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M (2.000 ml) a una velocidad de
flujo de 240 ml.h^{-1}. Se recuperaron las fracciones que
contenían la actividad de la transferasa, se dializaron contra un
tampón que contenía \beta-mercaptoetanol 10 mM,
EDTA 5 mM, acetato de sodio 10 mM, pH 4,0, aplicándolas en una
columna Mono S (HR 5/5 Pharmacia), y eluyéndolas con un gradiente
lineal de NaCl (0 a 300 mM en 40 minutos), a una velocidad de flujo
de 0,8 ml. min^{-1}. Se recuperó la fracción que contenía la
actividad de la transferasa, se la dializó contra Tris/HCl 10 mM, pH
7,0 y se la depositó en una columna DEAE-5PW (8 x
75 mm, TosoHaas), eluyéndola con un gradiente lineal de NaCl (0 a
300 mM en 60 minutos) con una velocidad de flujo de 0,75
ml.min^{-1}. Se recuperaron las fracciones que contenían la
actividad de la transferasa, se dializaron contra un tampón que
contenía \beta-mercaptoetanol 10 mM, EDTA 5 mM,
acetato de sodio 10 mM, pH 4,0, depositándolas en una columna
CM-5PW (8 X 75 mm, TosoHaas), y eluyéndola con un
gradiente lineal de NaCl (0 a 300 mM en 60 minutos), a una velocidad
de flujo de 0,8 ml. min^{-1}. Se recuperaron las fracciones que
contenían la transferasa, concentrándolas mediante un "speed
vac", y fraccionándolas en una columna superdex HR75 (Pharmacia)
equilibrada con Tris/HCl 10 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 150 mM, a
una velocidad de flujo de 0,75 ml min^{-1}. Se recuperaron las
fracciones que contenían la transferasa purificada, se dializaron
contra citrato de Na 5 mM, pH 5,0, se concentraron mediante
"speed-vac" y se conservaron a -20ºC hasta
utilizarlas.
Se dosificaron las fracciones enzimáticas con
respecto a la presencia de la actividad de la transferasa,
incubando en citrato de sodio 50 mM, pH 5,0, a 37ºC (10 \mul de
volumen de dosificación) con un laminarioligosacárido reducido con
borohidruro (8 mM final) de como mínimo un tamaño G_{10}. Se
tomaron muestras (3 \mul) en tiempos distintos, añadiéndose NaOH
50 mM enfriado en hielo (47 \mul) para finalizar la reacción,
congelándose hasta llevar a cabo el análisis mediante cromatografía
de alto rendimiento de intercambio de aniones (HPAEC). Debido a las
variaciones día a día de la intensidad de los picos con una
detección mediante impulsos electroquímicos ["Pulsed
Electrochemical Detector"] (PED), se cuantificó la actividad de
la transferasa utilizando laminarioligosacáridos reducidos marcados
con ^{3}H como substratos y midiendo la aparición del marcaje en
los productos después de la separación mediante cromatografía
HPAEC, utilizando un dispositivo Radiomatic de análisis 150 TR en
línea, de la velocidad del centelleo (Packard). A menos que se
indique lo contrario, las dosificaciones para los estudios de
caracterización enzimática se llevan a cabo tal como se ha
mencionado anteriormente, con 0,25 \mug de transferasa
purificada.
Se midió la actividad de la
\beta-glucanasa en las fracciones proteicas
mediante un ensayo reductor a base de azúcar, utilizando como
substrato el reactivo hidrazida del ácido hidroxibenzoico con la
laminarina reducida con el borohidruro, en lugar del
carboximetilpachimano (Ram et al, 1988, Life Sci Adv., 7,
379-383). Se midieron las actividades
exo-\beta-glucanasa/\beta-glucosidasa
incubando las fracciones enzimáticas con
p-nitrofenil-\beta-D-glucopiranósido
(Hartland et al, 1991, Proc. R. Soc., London B, 246,
155-160). Se estimó la cantidad de proteínas
utilizando el ensayo Biorad proteico, según las instrucciones del
fabricante, con la albúmina sérica bovina como estándar.
Se analizaron las muestras procedentes de los
ensayos de la transferasa en una columna analítica Dionex CarboPa
PA1 (4 x 250 mm) (con una columna de control PA1) en un sistema
Dionex de tipo HPACE, con una detección mediante impulsos
electroquímicos (célula PED-2), equipado con una
combinación de electrodos de referencia pH-Ag/AgCl,
utilizando un potencial de 0,4 V para la primera 0,5 s de detección.
Se eluyeron los oligosacáridos en las condiciones siguientes:
velocidad de flujo de 1 ml/min, tampón A: NaOH 50 mM; tampón B:
acetato de sodio 500 mM en NaOH 50 mM; gradiente:0 a 2 min, 98% A
2% B (isocrático), 2 a 15 min 75% A 25% B (lineal), 15 a 45 min 60%
A 40% B (lineal).
Los estándares de laminarioligosacáridos se
obtuvieron en Seikagaku (Japón).
Se visualizaron los laminariologosacáridos
mediante una cromatografía en capa fina sobre un gel de sílice 60
(Kieselgel, Merck), utilizando n-butanol/ácido
acético/agua; (2/1/1,5) como eluyente y una coloración a base de
orcinol sulfúrico.
Se determinó asimismo el grado de polimerización
(dp) de los oligosacáridos mediante cromatografía de tipo HPAE
utilizando un detector mediante impulsos electroquímicos y una
columna intercambiadora de aniones (Carbo6 PAC PA1, 4,6 x 250 mm,
Dionex).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los laminarioligosacáridos
mediante una hidrólisis parcial ácida (TFA 6,5 M, 15 min, 100ºC,
seguido por TFA 1M, 45 min, 100ºC) de curdland (Serva). Se eliminó
el TFA mediante una evaporación rotatoria en presencia de metanol.
Se redujeron los oligosacáridos durante toda la noche con NaBH4
(1:0,5 (m/m) en NaOH 0,1 M a temperatura ambiente). Se prepararon
de forma similar los extremos reducidos de los
laminarioligosacáridos marcados con 3H mediante reducción con
NaB^{3}H_{4} (Amersham, 20-40 Ci/mmol, 10 mCi
por mg de oligosacáridos) durante toda la noche, seguido por una
reducción suplementaria con NaBH_{4} como anteriormente. Se
destruyó el exceso de NaBH_{4} añadiendo ácido acético hasta un
pH de 5-6, eliminando las sales de borato mediante
una evaporación rotatoria en presencia de metanol. Se desalaron los
oligosacáridos reducidos por filtración en gel en una columna de
Sephadex G15 (1,2 x 80 cm, 8 ml.h^{-1}, equilibrada en agua),
recuperándolos después de la detección mediante el procedimiento del
orcinol-ácido sulfúrico (Ashwell, 1966, Methods Enzymol, 8,
85-95). Se separaron los laminarioligosacáridos
mediante HPAEC en una columna preparativa CarboPac PA1 (9 x 250 mm)
(Dionex) con un gradiente de acetato de Na 15 a 350 mM en NaOH 50 mM
(45 min) a una velocidad de flujo de 4 ml.min^{-1}. Se
neutralizaron las fracciones recuperadas de los oligosacáridos
mediante el ácido acético, se desalaron por filtración en gel en una
columna Sephadex G 15 como se ha descrito anteriormente, y después
se liofilizaron. Se redujo de la misma forma la laminarina (Sigma),
pero se la desaló mediante diálisis contra el ácido acético al
0,5%, seguido por una diálisis contra agua, liofilizándose después.
Se prepararon gentioligosacáridos como anteriormente (sin
reducción), a partir de pulsatina (Calbiochem), que se desmenuzaron
finalmente mediante un mortero y un mazo. La maltoheptaosa y la
celopentaosa proceden de Boehringer Mannheim y Sigma,
respectivamente. La quitohexaosa fue una donación generosa del Dr.
A. Domard (Universidad Claude Bernard, Villeurbanne, Francia). Se
obtuvo el G,o reducido con borohidruro que contenía un enlace
intercadena \beta-(1-6) en el sexto enlace a
partir del extremo reducido (rG_{10}*), incubando la
laminarihexosa reducida (rG6) con una enzima homóloga a la enzima
BGT1 de Candida, purificada a partir de A. fumigatus.
El producto de la transferasa rG_{10\text{*}} se separó y purificó
como para los laminarioligosacáridos anteriormente
considerados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron muestras de proteínas mediante
SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature, 227,
680-685) utilizando geles de separación al 10% y
geles apilados al 4%. Se visualizaron bandas proteicas coloreando
con azul de Coomassie. Se llevó a cabo la glicosilación de las
glicoproteínas utilizando la N-glucosidasa F
recombinante (Oxford GlycoSystems) según las instrucciones del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron dos muestras: el
laminarioligosacárido reducido G_{10} utilizado como estándar y
un oligosacárido G_{16} reducido que se obtuvo después de
incubación del rG_{10} con la transferasa y de ser purificado
mediante HPAEC. Se reemplazó el deuterio en las muestras secas
mediante liofilización disolviendo en D_{2}O (99,95%, Solvents
Documentation Synthese, Francia). Se registraron los espectros a
300 K y 318 K en un espectrómetro 500 de tipo Variant Unity que
funcionaba a una frecuencia protónica de 500 MHz. La resonancia de
los OH del agua residual se suprimió mediante una radiación
selectiva durante el tiempo de relajación. Se utilizó el ácido
3-trimetilsililpropiónico de sodio como testigo
externo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Con el fin de estudiar las actividades de la
\beta-glucanosiltransferasa asociada a la pared
celular en A. fumigatus, se ha desarrollado un ensayo de
cromatografía intercambiadora de aniones de alto rendimiento
(HPAEC) utilizando laminarioligosacáridos reducidos con borohidruro
como substratos. Se detectó una nueva actividad de la
\beta-(1-3)-glucosiltransferasa en
las fracciones semipurificadas procedentes del autolisado de la
pared celular de A. fumigatus que sigue asociada a una
proteína de 49 kDa durante su purificación.
Se purificó la proteína de una homogeneidad
aparente con cuatro etapas de cromatografía intercambiadora de
iones y una etapa de filtración en gel.
La actividad de la transferasa era claramente
detectable solamente después de la segunda etapa de cromatografía
(Mono S). El análisis mediante SDS-PAGE de la
fracción purificada, mostró una banda principal de 49 kDa (fig 1,
pozo b). Para determinar si contenía un hidrato de carbono unido a
N, se sometió la proteína a digestión con la
N-glucosidasa F. La proteína digerida se hizo pasar
por SDS-PAGE como una proteína de 44 kDa (fig 1,
pozo c), indicando que contiene alrededor de 5 kDa de hidratos de
carbono unidos a N.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El análisis mediante HPAEC de los productos
resultantes de la incubación de la proteína de 49 kDa con un
laminarioligosacárido reducido con el borohidruro (rG_{n}) de
tamaño G_{10} o más grande, permitió la caracterización de una
nueva actividad de tipo glucanosil transferasa.
Los productos iniciales principales procedentes
de la incubación con rG_{11} eran rG_{6} y rG_{16}; rG_{12}
daba rG_{6} + rG_{7} y rG_{17} + rG_{18}, rG_{13} daba
rG_{6} a rG_{8} y rG_{18} a rG_{20}, y rG_{14} resultaba
de la formación de rG_{6} a rG_{9} y rG_{19} a rG_{22}
(figura 2). De forma importante, no se detectaron productos de tipo
laminarioligosacáridos reducidos o no, confirmando la ausencia de
cualquier actividad
endo-\beta-(1-3)-glucanasa.
La presencia de dicha actividad hubiera dado lugar a la formación
de una mezcla de productos de hidrólisis, reducidos o no, teniendo
el último más bien tiempos de retención distintos. Además, no se
detectó glucosa, y junto con la ausencia de la hidrólisis del
p-nitrofenil-\beta-glucopiranósido
y la formación en red de azúcar reductor procedente de la
laminarina reducida mediante el borohidruro en los ensayos
colorimétricos correspondientes, se confirmó la ausencia de la
actividad de la
exo-\beta-(1-3)-glucanasa
y \beta-glucosidasa.
El perfil de los productos obtenidos (figura 2)
está de acuerdo con una actividad de la glucanosil transferasa de
tipo endógeno, en la que la cadena de glucano está fragmentada por
un corte endolftico, que libera la parte del extremo reducido,
transfiriéndose el resto a otra cadena de glucano, formando un
producto de tipo transferasa más voluminoso. Así, con la reacción
más simple con rG_{11}, la enzima corta el substrato liberando
rG_{6} del extremo reducido de la molécula del substrato,
transfiriéndose entonces el G_{5} restante a otra molécula
rG_{11} que actúa como receptor, para formar el producto de tipo
transferasa rG_{16}:
- \quad
- E + rG11 \rightarrow 4 E.G5 + rG6
- \quad
- E.G5+rG11 \rightarrow E + rG16
en las que E representa la enzima.
La transferasa corta rG_{12} en dos sitios distintos dando lugar
a dos productos diferentes de tipo
transferasa:
- \quad
- E = rG12 E.G6 + rG6 E.G5 + rG7
- \quad
- E.G6+rG12 E + rG18
- \quad
- E.G5+rG12 E + rG17
De forma similar, con rG_{13} y rG_{14}, la
transferasa corta en dos o tres sitios distintos, respectivamente,
transfiriendo cada vez la parte del extremo no reducido a otra
molécula aceptora rG_{13} o rG_{14}.
Unos análisis suplementarios de incubaciones de
la transferasa de 49 kDa con laminarioligosacáridos reducidos y más
pequeños, mostraron que la reacción con rG_{10} daba lugar a
rG_{5} + rG_{6} + rG_{14} + rG_{15} como productos iniciales
importantes, mientras que la reacción con rG_{9} era
extremadamente lenta, formando pequeños picos de rG_{5} a rG_{8}
y de rG_{10} a rG_{13}. No se detectaron productos mediante
incubación con laminarioligosacáridos reducidos con un tamaño
G_{8} y más pequeño.
Para determinar la velocidad de reacción de las
enzimas con los laminarioligosacáridos de tamaños variables, se
incubó separadamente la enzima de 49 kDa (0,25 \mug) con 8 mM de
rG_{10} a rG_{15} marcados con ^{3}H' midiendo la velocidad de
formación de los productos marcados. La velocidad con rG_{10}
(328 nmol.min^{-1}) era aproximadamente igual al 50% de aquélla
con los substratos más voluminosos, no apareciendo ninguna
diferencia significativa entre las velocidades de reacción para
rG_{11} a rG_{15} (648 \pm 46 nmol.min^{-1}.mg
proteína^{-1}).
El análisis de incubaciones más largas de
enzimas purificadas con laminarioligosacáridos reducidos con un
tamaño igual a G_{10} como mínimo, mostró que los productos de la
transferasa inicial pueden volver a utilizarse ulteriormente, sea
como donantes o como aceptores, dando lugar a la formación de
productos de tamaño creciente, hasta que se eliminen de la solución
debido a su carácter de insolubles en el tampón acuoso. Una
incubación de 30 minutos con rG_{16} (que contiene ciertos
contaminantes rG_{15}), dio lugar a la formación de productos
iniciales importantes reducidos, con tamaños G_{6} a G_{11} y
G_{21} a G_{26} (figura 3), pero después de 120 minutos,
aparecieron productos de la transferasa más voluminosos,
presentando hasta un tamaño igual, como mínimo, a G_{40} (figura
3). Los productos con un tamaño G_{29} y más voluminosos,
precipitaron en el fondo del tubo de incubación, puesto que no
estaban cuando la mezcla reactiva se centrifugó brevemente, y
cuando se analizó el sobrenadante, la incubación de la enzima
purificada con la laminarina reducida dio lugar a la producción de
productos más pequeños y más voluminosos, indicando que los
oligosacáridos solubles con un tamaño igual a G_{30} y más grande,
pueden actuar como donadores y aceptores en la reacción.
Para determinar el laminarioligosacárido más
pequeño que pudiera actuar como aceptor, se incubó la transferasa
purificada con 4 mM de rG_{11} como donador más 16 mM de rG_{8}
o más pequeño como aceptor. Los análisis de las incubaciones que
contenían rG_{11} más rG_{4} o más pequeño, mostraron la
formación de rG_{6} y rG_{16} como únicos productos iniciales
importantes, indicando que sólo se utilizó rG_{11} como aceptor.
Sin embargo, las incubaciones que contenían rG_{11} más rG_{5}
a rG_{8} mostraron productos adicionales de la transferasa de
acuerdo con los últimos oligosacáridos que se habían utilizado como
aceptores. Por ejemplo, la reacción de rG_{11} más rG_{7} dio
lugar a la formación inicial de rG_{6}, rG_{12} y rG_{16}, de
acuerdo con:
- \quad
- E + rG11 E.G5 + rG6
- \quad
- E.G5 + rG11 E + rG16
- \quad
- E.G5 + rG7 E + rG12
La velocidad relativa de la reacción con estos
aceptores se determinó utilizando 2 mM de rG11 como donador, más 32
mM de aceptor reducido marcado con ^{3}H, y midiendo la formación
del producto marcado de la transferasa (figura 4). En estas
condiciones, la reacción con rG_{11} que se utiliza como aceptor,
es despreciable. La velocidad de la reacción aumentaba cuando lo
hacía la longitud de las cadenas, indicando que la enzima de 49 kDa
prefiere aceptores de laminarioligosacáridos más voluminosos.
La transferasa no mostró ninguna actividad con
respecto a los gentioligosacáridos (tamaño
G_{3-8}), la quitohexaosa, la celopentaosa o la
maltoheptaosa, ni en presencia ni en ausencia de rG_{11},
sugiriendo que se ha demostrado que la enzima que utiliza
exclusivamente el \beta-(1-3)glucano como
donador, utiliza un G_{10} reducido ramificado (rG_{10}*)
similar al de la laminaridecaosa, salvo porque el sexto enlace a
partir del extremo reducido, es un enlace de tipo
\beta-(1-6). La incubación de la enzima de 49 kDa
con 8 mM de rG_{10}*, no ha dado lugar a ningún producto,
indicando que no era un donador. Sin embargo, una incubación similar
en presencia de 2 mM de rG_{11}, dio lugar a la formación de
rG_{6} y un pico eluyente en posición de rG_{15} como productos
iniciales importantes, mostrando que rG_{10}* puede actuar como
aceptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Para determinar si la transferasa de 49 kDa
produjo un nuevo tipo de enlace durante la transferencia, el
producto rG^{16} de la transferasa se purificó del medio de
incubación de la transferasa con rG_{11}. Se analizaron
aproximadamente 300 \mug de producto mediante
RMN-^{1}H. El espectro 1D del producto rG_{16}
de la transferasa presentaba tres desplazamientos químicos en la
región anomérica:
- \delta = 4,68 ppm que corresponde al residuo de glucosa unido al grupo glucitol;
- \delta = 4,75 ppm que corresponde al residuo de glucosa del extremo no reducido;
- \delta = 4,80 ppm que corresponde a los residuos intracadena de glucosa unida en \beta-(1-3).
La intensidad relativa de las señales anoméricas
indicaba 1,1 y 13 protones, respectivamente. Puesto que el glucitol
no da ninguna señal en la región anomérica, esto confirma la
longitud del oligosacárido (16 residuos). Las constantes de
acoplamiento medidas sobre estas señales están de acuerdo con los
residuos de glucosa unidos en \beta(^{3}J_{1,2 \ = \
7,9} Hz). La presencia de un solo motivo de tipo glucosa en el
extremo no reducido indicaba que la proteína de 49 kDa se
transfirió al extremo no reducido del aceptor
\beta-(1-3) glucano.
El espectro 1D del producto rG16 era idéntico,
salvo para la intensidad relativa de la señal de 4,80 ppm con
respecto al del estándar de los laminarioligosacáridos rG_{10}.
Además, no se ha observado ninguna característica de desplazamiento
químico del residuo de glucosa unido en (1-2),
(1-4) o (1-6) confirmando que el
producto rG_{16} era una laminari-hexadecaosa. La
elución conjunta del producto rG_{16} con la referencia de
rG_{16} sobre HPAEC y la insolubilidad del producto más
voluminoso, están de acuerdo con la producción de enlace de tipo
\beta-(1-3) durante la transferencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para determinar si la disminución de la
concentración de los aceptores estimularía las reacciones de
hidrólisis, se incubó la transferasa de 49 kDa con 3 \mul de
[^{3}H]-r-G_{11} más cantidades
decrecientes de rG_{11} no marcado. Se observó un desplazamiento
de la transferencia (i) a la hidrólisis (ii) (figura 5,
suplemento):
| E + [3H]-rG11 E.G5 +[3H]-rG6 | ||
| (i) | ||
| E.G5 + [3H)-rG11 E +[3H]-rG16 | ||
| (ii) | ||
| E.G5 + H_{2}O E + G5 |
Se determinó el porcentaje de transferencia,
midiendo la formación de rG_{16} marcado (solamente
transferencia), comparado con la del rG_{6} marcado (transferencia
más hidrólisis) en la reacción. A una concentración de rG_{11}
igual a 3 mM, sólo se detectó la transferencia. Como la
concentración del substrato descendió a 18 \muM, el porcentaje de
transferencia se igualó a aproximadamente el 35%, y no descendió de
forma importante con una concentración débil del substrato (3
\muM) (figura 5). La disminución de la concentración del tampón a
10 mM no alteró el porcentaje de transferencia a ninguna de las
concentraciones del substrato. Parece que por debajo de las
condiciones dadas, la transferasa de 49 kDa era incapaz de
catalizar más del 65% de la hidrólisis, aproximadamente, reduciendo
simplemente la concentración de los substratos a niveles muy
débiles.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se ensayó la enzima de 49 kDa con distintos
valores de pH, se comprobó la estabilidad durante el almacenamiento
y se ensayó la actividad de la enzima N-glicosilada.
La enzima era activa en un amplio intervalo de pH ácido, mostrando
una actividad superior al 50% del valor máximo entre pH 2,5 y 6. La
enzima manifestó un pH óptimo a alrededor de 5 en un tampón citrato
(figura 6). La enzima era muy estable y se podía almacenar a 4ºC en
un tampón citrato 10 mM, pH 5,0 durante varias semanas, o secarse
mediante un "speed-vac" y volver a suspenderse
a continuación en un tampón, o almacenarse a -20ºC sin pérdida
importante de actividad. La enzima de 44 kDa
de-N-glicosilada, preparada en
condiciones no desnaturalizantes, era tan activa como la enzima
glicosilada original, cuando se incubó con 8 mM de rG_{11}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La enzima de 49 kDa cataliza su reacción de tipo
transferasa mediante un mecanismo de tipo
bi-reactivo (dos etapas) con una hidrólisis inicial
del substrato para liberar la parte del extremo reducido, y una
transferencia ulterior del resto al extremo no reducido de una
molécula de substrato que desempeña la función de molécula
acep-
tora.
tora.
Utilizando rG_{11} como substrato, era
imposible calcular un Km aparente que correspondiera a las dos
etapas de la reacción. Para determinar un Km para el sitio donante,
se utilizó un aceptor que no era un donante. Se utilizó
[^{3}H]-rG_{7}] (1 x 10^{6} cpm) a una
concentración elevada (64 mM) con concentraciones variadas de
rG_{11}, mantenidas por debajo de 8 mM. En estas condiciones, la
reacción se llevó a cabo con rG_{11} como donador, utilizando
como aceptor rG_{7} más que rG_{11}, como se ha determinado por
la ausencia de formación del producto de la transferasa rG_{16},
La velocidad inicial de la reacción se determinó midiendo la
aparición del rG_{12} marcado.
Se obtuvo un Km aparente de 5,3 mM a partir de
las manchas dobles de tipo recíproco (valor de r^{2} =
0,997).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se obtuvieron dos secuencias de aminoácidos de
la proteína BGT2 purificada. La secuencia NH_{2} DVTPITVKG
NAFFKGDERFY terminal era y una secuencia interna era DAPNWDVDNDALP. Un oligonucleótido de 38 unidades poliméricas en la parte N-terminal que presentaba la siguiente secuencia SEC ID nº:4:
NAFFKGDERFY terminal era y una secuencia interna era DAPNWDVDNDALP. Un oligonucleótido de 38 unidades poliméricas en la parte N-terminal que presentaba la siguiente secuencia SEC ID nº:4:
- (AAA GG(T/C) AA(C/T) GC(T/C) TTC TT(C/T) AAG GG(T/C) GA(T/C) GAG CG (T/C) TTC TA)
se utilizó para cribar un banco genómico
construido en el fago EMBL3 después de una digestión parcial
mediante Sau3A del ADN de A. fumigatus como el descrito por
Monod (1994, 33-40. Mol. Biology of pathogenic
fungi, B. Marescay G.S. Kobayashi).
La transferencia se llevó a cabo sobre membranas
de tipo Zetaprobe. Se prehibridizaron e hibridizaron las membranas
a 50ºC en una solución que contenía SSC 5X, Na_{2}HPO_{4} 20
mM, pH 7, SDS al 7%, Denhardt 10X y esperma de salmón al 1%. Se
efectuó el lavado de las membranas a 42ºC dos veces en una solución
que contenía SSC3X, Denhardt 10X, SDS 5%, Na_{2}HPO_{4} 25 mM y
dos veces en una solución de SDS al 1%, SSC 1X.
La clonación y la secuenciación del gen que
codifica la proteína BGT2 mostró homologías importantes con los
genes PHR1 y GAS 1, identificados anteriormente en C.
albicans y S. cerevisiae, respectivamente (Saporito
Irving y Coll, (1995), Mol. Cell. Biol, 15,
601-613) (Nuoffer y Coll, J. Biol. Chem. (1991),
226, 19, 12242-12248) (figura 7). El gen GAS 1 de
S. cerevisiae es también responsable de una actividad
glucanosiltransferasa. En esta especie de hongo, el tamaño mínimo
del substrato óptimo es G10, en vez de G11 para A.
fumigatus.
El desmembramiento del gen BGT2 se llevó a cabo
utilizando el vector pAN7-1 (Punt et al
(1987) Gene 56, 117-124), proporcionado por P. Punt
(TNO, Rijinsik). Este vector se modificó como pN4 (Paris et
al, (1993) FEMS Microbiol. Lett 111, 31-36)
mediante el reemplazamiento de un sitio de restricción HindIII por
un sitio SmaI. Alrededor del 50% del marco de lectura abierto de
BGT2 se reemplazó por pN4 en un sitio de restricción EcoRV. Se
llevó a cabo una transformación integral, tal como se ha descrito
anteriormente (Paris,(1994): Isolation of protease negative mutants
of Aspergillus fumigatus by insertion of a disrupted gene,
pág 49-55, Mol. Biology of pathogenic fungi,
Maresca et G.S. Kobayashi) utilizando protoplastos producidos por
Novozyme y el plásmido linearizado en presencia de
PEG.
PEG.
El mutante \Delta49 de A. fumigatus
obtenido, se depositó el 30 de julio de 1996 en la CNCM con el
número de registro I-1764.
No presenta ningún fenotipo distinto de la cepa
salvaje, con excepción de una inhibición total del crecimiento en
fermentador, después de 24 horas de crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se obtuvo ADNc de BGT2 mediante amplificación
con dos cebadores de tipo ADNc 5' GAATTCGACGACGT
TACTCCCATCACT 3' de P1 y 5'TCTAGAGGGTATGAGAAGAACAAATCA 3' de P2 procedente de 10 ng de ADNc, 1U de taq polimerasa, 200 mM de cada uno de los cebadores. Se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación, compuestos por un minuto a 95ºC, un minuto a 55ºC y un minuto a 72ºC.
TACTCCCATCACT 3' de P1 y 5'TCTAGAGGGTATGAGAAGAACAAATCA 3' de P2 procedente de 10 ng de ADNc, 1U de taq polimerasa, 200 mM de cada uno de los cebadores. Se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación, compuestos por un minuto a 95ºC, un minuto a 55ºC y un minuto a 72ºC.
A continuación, se clonó la preparación
amplificada en un vector mediante un equipo de Clonación TA
(Invitrogen).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Unos experimentos que utilizan porciones de
Triton X114 tratadas o no con la GPI-fosfolipasa C,
han demostrado que la proteína BGT2 de A. fumigatus está
anclada por un residuo GPI a la membrana plásmica.
El anclaje de la proteína a la membrana no es
necesario para conservar la actividad enzimática. Se ha demostrado
que en A. fumigatus se encontraba la misma actividad cuando
la proteína estaba libre en el medio de cultivo (en ausencia del
enlace GPI) o anclada a la membrana plasmática.
Estos resultados sugieren que la expresión de la
glucanosiltransferasa puede llevarse a cabo en vectores mediante
una expresión secretada. Se ha seleccionado el sistema de expresión
de Pichia pastoris por Invitrogen. Se ha utilizado este
sistema anteriormente con otra proteína de A. fumigatus de
88 kDa y se ha confirmado que Pichia conservaba muy bien el sitio
de glicosilación de la proteína original.
El vector utilizado es pPICZ\alpha
(Invitrogen) para la secreción con un epítopo myc y seis residuos
histidina en tándem para una purificación fácil. La secuencia
C-terminal responsable del anclaje por GPI, es
eliminada antes de la subclonación en pPICZ\alpha, con el fin de
obtener una proteína secretada truncada, activa desde el punto de
vista enzimá-
tico.
tico.
Esta proteína recombinante se utilizó para la
detección de medicamentos antifúngicos. La inhibición de la
actividad enzimática puede medirse mediante una detección de tipo
HPLC en ausencia de fragmentación y un alargamiento suplementario de
cualesquiera \beta-(1-3) laminarioligosacáridos
de dp >= 10 en presencia de p49 de A. fumiga-
tus.
La ausencia de motilidad del substrato
laminariologosacárido medida mediante cromatografía en capa fina,
visualizada por técnicas clásicas o directamente después del
marcaje del extremo reducido con un radical cromógeno o fluorógeno,
puede ser una técnica de base para efectuar una detección
automatizada.
Puesto que el producto de la
\beta-(1-3)glucanosiltransferasa se
convierte en insoluble en un medio acuoso debido a la elongación de
la cadena \beta-glucano, puede utilizarse
asimismo la ausencia de precipitación de cualquier producto después
de una incubación prolongada utilizando un substrato marcado de
forma radioactiva, para la detección de medicamentos.
\newpage
Ejemplo
10
Unos cebadores oligonucleótidos degenerados que
correspondían a regiones conservadas de la secuencia de la figura
10 fueron sintetizados por la sociedad GENSET. Presentan las
secuencias siguientes:
| SEC ID nº7 (P3): | 5' GSYTTCTTCKCYGGCAACGAGGTT 3' |
| SEC ID nº8 (P4'): | 5' GTTGCAGCCGWATTCGGASAYGAA 3' |
en las
que
Y es C o T
K es T o G
Ses CoG
W es A o T
Las reacciones PCR se han puesto en marcha en un
volumen de 100 \mul que contenían 1,5 mM MgC12, 50 mM KCl, 10 mM
TrisCl (pH 8), 250 \muM de dATP, dGTP, dCTP y dTTP (Pharmacia),
1 \muM de cada cebador, 2,5 unidades de Amplitaq ADN polimerasa
(Pharmacia) y 50 ng de ADN genómico. La amplificación se llevó a
cabo en un dispositivo (Omn/Gene), en primer lugar durante 5
minutos a 93ºC, a continuación durante 30 ciclos de 1 min a 93ºC,
después de 1 minuto a 50ºC y de 1 minuto a 72ºC. Los productos de la
reacción PCR se analizaron mediante electroforesis sobre un gel de
agarosa, y después se visualizaron mediante rayos ultravioleta
después de coloración por bromuro de etidio.
Los fragmentos resultantes de la reacción PCR se
unieron a pCR2.1 (Equipo de clonación TA, Invitrogen). Las
inserciones de los plásmidos recombinantes se secuenciaron mediante
el procedimiento de finalización de la cadena didedoxi (Sanger et
al, 1977), utilizando la Sequanasa, Versión 2 (US
Biochemicals), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se amplificaron de este modo dos secuencias
nucleotídicas: las secuencias SEC ID nº:9 y SEC ID nº:11. Las
secuencias aminoácidas que se dedujeron de las secuencias
nucleotídicas son las secuencias SEC ID nº:10 y SEC ID nº:12, que
corresponden a los genes denominados BGT4 y BGT3.
Estas secuencias se describen particularmente en
el listado adjunto. Presentan porcentajes de identidad con BGT2 del
41% y 37% respectivamente.
Los mapas de restricción de las dos secuencias
SEC ID nº:10 y SEC ID nº:12 se representan respectivamente en las
figuras 12 y 11.
Las secuencias SEC ID nº:9 y nº:11 se insertaron
en el plásmido PCRII que se introdujo en E. coli. Estas
bacterias se han depositado el 22 de agosto de 1997 en la CNCM, con
los números de registro, respectivamente, de nº:
I-1914 y nº1-1913.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT PASTEUR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 25 RUE DU DOCTEUR ROUX
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCE
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75724
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: BETA(1-3)GLUCANOSILTRANSFERASA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1359 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1357
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 452 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 426 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION POUR LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 394 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTIQUES DE LA SECUENCE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 339 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPO DE MOLECULAR: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 12:
Claims (12)
1. Proteína que posee una actividad de tipo
\beta(1-3)glucanosiltransferasa,
caracterizada porque presenta, como mínimo, un 85% de
identidad con la proteína que tiene una de las secuencias SEC ID
nº: 2 o SEC ID nº: 3 siguientes:
2. Proteína no glicosilada de secuencia SEC ID
nº: 2 según la reivindicación 1, caracterizada porque
presenta un peso molecular de 44 kD.
3. Proteína según la reivindicación 1,
caracterizada porque contiene un radical
N-glicosilo.
4. Proteína glicosilada de secuencia SEC ID nº:
3, caracterizada porque presenta un peso molecular de 49
kD.
5. Proteína según una de las reivindicaciones 3
y 4, caracterizada porque está anclada en la membrana
mediante un radical glicosilfosfatidilinoskol.
6. Cepa de E. coli depositada en la CNCM
con el número de depósito I-1762 que contiene la
secuencia SEC ID nº:1.
7. Cepa de E. coli depositada en la CNCM
con el número de serie 1-1763 que contiene la
secuencia complementaria de ADN capaz de codificar para una proteína
de secuencia SEC ID nº:2.
8. Procedimiento para la detección de mutaciones
en la secuencia SEC ID nº:1, en una muestra biológica que contiene
unas secuencias nucleotídicas, que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con los cebadores nucleotídicos P3 y P4, que presentan, respectivamente, las secuencias SEC ID nº:7 y SEC ID nº:8 siguientes:
- habiendo sido eventualmente las secuencias nucleotídicas contenidas en la muestra puestas en una forma que permite su hibridización en unas condiciones que permiten la hibridación de los cebadores con las secuencias nucleotídicas;
- b)
- amplificar las secuencias nucleotídicas
- c)
- poner en evidencia los productos de amplificación, y
- d)
- detectar las mutaciones con respecto a la secuencia SEC ID nº:1, mediante unas técnicas apropiadas.
9. Procedimiento para la detección de la
actividad antifúngica de moléculas, mediante la inhibición de la
actividad de la
\beta-(1-3)glucanosiltranferasa, que
comprende las etapas siguientes:
- -
- poner en contacto la molécula a detectar y una proteína según la reivindicación 4, o codificada por la SEC ID nº:1, y
- -
- determinar el efecto inhibidor de dicha molécula sobre dicha proteína, midiendo la actividad de tipo \beta(1-3)glucanosiltransferasa de dicha proteína.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la
\beta(1-3)glucanosiltransferasa se
determina poniendo en contacto dicha proteína y un substrato de
\beta(1-3)glucanosiltransferasa.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque dicho substrato está compuesto por lo
menos por un laminarioligosacárido que comprende por lo menos 10
radicales glucosilo.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la actividad de la proteína sobre su
substrato se pone en evidencia mediante cromatografía, en particular
mediante HPLC o CCM, o mediante cualquier procedimiento que permita
la separación de oligosacáridos que tengan distintos grados de
polimerización.
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