ES2312218T3 - Metodo para determinar una secuencia mimotopo. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar una secuencia mimotopo para un receptor que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una biblioteca de secuencias de prueba compuesta por bloques de construcción elegidos dentro del grupo de los aminoácidos, monosacáridos y nucleótidos; b) determinar la actividad de cada secuencia de prueba de la biblioteca respecto del receptor; c) identificar una secuencia de prueba que contiene en cierta posición un bloque de construcción, que, según los resultados de la etapa b, muestra una actividad de fijación respecto del receptor; d) obtener otra biblioteca de secuencias de prueba, basada en la secuencia de prueba identificada en la etapa c, sustituyendo un bloque de construcción en posiciones elegidas de la secuencia de prueba identificada, por bloques de construcción elegidos; e) determinar la actividad de cada secuencia de prueba de la biblioteca obtenida en la etapa d) respecto del receptor; f) identificar una secuencia de prueba que contiene en cierta posición un bloque de construcción que, según los resultados de la etapa e), muestra una actividad de fijación respecto del receptor; g) repetir las etapas de d)-f) para la biblioteca de secuencias de prueba obtenida en la etapa d), durante cierto número de ciclos hasta que se encuentra en la etapa f) una secuencia mimotopo que presenta una actividad de umbral respecto del receptor, reduciéndose en cada ciclo la cantidad de receptor utilizado para determinar la actividad de las secuencias de prueba respecto de dicho receptor; cada secuencia de prueba se sitúa en una mini tarjeta o medio de soporte plano.
Description
Método para determinar una secuencia
mimotopo.
La invención se refiere a un método para
determinar una secuencia mimotopo.
En la actualidad se utilizan en gran medida
bibliotecas de diversidad aleatoria para identificar molecular
"lead" para diagnóstico, fármacos y vacunas. Cuando la molécula
"lead" es un péptido, los métodos utilizados para identificar
las moléculas "lead" suelen recibir el nombre de métodos
pepscan.
Los métodos pepscan se conocen ya desde los años
80. La teoría en la que se basan estos métodos se describen en los
documentos EP-A-0 138 855 y
EP-A-0 190 205.
Los aspectos fundamentales del examen de
bibliotecas de diversidad aleatoria son su tamaño, es decir,
cuántos compuestos diferentes se necesitan para identificar una
molécula "lead", y el método de optimización de la estructura o
secuencia de la molécula "lead". Muchos de los métodos
descritos en la literatura parecen basarse en la idea de que cuanto
mayor es la biblioteca de diversidad aleatoria, tanto mayor es la
probabilidad de encontrar una buena molécula "lead".
El aspecto respecto del cual más difieren los
métodos conocidos es el método de optimización de la molécula
"lead". Una vez sintetizada la molécula de diversidad
aleatoria, se puede comprobar su actividad deseada. Es posible, por
supuesto, elegir como molécula "lead" el elemento de la
biblioteca de diversidad aleatoria que obtiene el valor más elevado
para dicha actividad deseada. Sin embargo, muchos de los métodos
comprenden etapas para optimizar la estructura de dicho elemento que
presenta la actividad más elevada, con el fin de llegar a una
molécula "lead" que presenta una actividad incluso
superior.
Las bibliotecas minipepscan, que constan
solamente de unos pocos millares de péptidos, se han utilizado para
identificar moléculas "lead" que se optimizaron rápidamente a
moléculas que tenían una actividad similar a la de moléculas
conseguidas partiendo de bibliotecas constituidas por millones de
compuestos. Esto se describe en Slootstra et al., Molecular
Diversity, 1 (1995b) 87-96 y en Slootstra et
al., J. Mol. Recogn., 10, 217-224. Otras
técnicas de referencia se describen p. ej. en los documentos US
5,814,74 A, US 5,645,996 A, US 5,582,897 A, US 5,565,325 A, US
5,556, 762 A, Immnotechnology (1995) 1 175-187 y J.
Immunol. Mtds (1995) 187 179-188 (1997). En estos
artículos, se ha mostrado que las pequeñas bibliotecas, combinadas
con métodos de optimización basados en pepscan son herramientas
valiosas para identificar y optimizar moléculas "lead".
La presente invención pretende ofrecer un método
mejorado para identificar y optimizar una molécula "lead".
Se ha observado que se obtiene una mejora
objetiva partiendo de una biblioteca de moléculas de prueba
conocidas, evaluando la actividad de dicha biblioteca y optimizando
la estructura de unas pocas moléculas de prueba que muestran la
mayor actividad, sustituyendo de forma metódica cada bloque de
construcción de la estructura de las moléculas de prueba por otros
bloques de construcción posibles. Por consiguiente, la invención se
refiere a un método para determinar una secuencia mimotopo para un
receptor que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una biblioteca de secuencias de
prueba compuesta por bloques de construcción elegidos dentro del
grupo de los aminoácidos, monosacáridos y nucleótidos;
b) determinar la actividad de cada secuencia de
prueba de la biblioteca respecto del receptor;
c) identificar una secuencia de prueba que
contiene en cierta posición un bloque de construcción, que, según
los resultados de la etapa b, muestra una actividad de fijación
respecto del receptor;
d) obtener otra biblioteca de secuencias de
prueba, basada en la secuencia de prueba identificada en la etapa
c, sustituyendo un bloque de construcción en posiciones elegidas de
la secuencia de prueba identificada, por bloques de construcción
elegidos;
e) determinar la actividad de cada secuencia de
prueba de la biblioteca obtenida en la etapa d) respecto del
recep-
tor;
tor;
f) identificar una secuencia de prueba que
contiene en cierta posición un bloque de construcción que, según
los resultados de la etapa e), muestra una actividad de fijación
respecto del receptor;
g) repetir las etapas de d)-f)
para la biblioteca de secuencias de prueba obtenida en la etapa d),
durante cierto número de ciclos hasta que se encuentra en la etapa
f) una secuencia mimotopo que presenta una actividad de umbral
respecto del receptor, reduciéndose en cada ciclo la cantidad de
receptor utilizado para determinar la actividad de las secuencias
de prueba respecto de dicho receptor; cada secuencia de prueba se
sitúa en una mini tarjeta o medio de soporte plano.
\newpage
Se ha visto que el presente método conduce, de
forma adecuada, a una secuencia mimotopo que tiene una fuerza de
fijación muy elevada al receptor deseado. En algunos casos, en los
que se conoce el epítope exacto (es decir la secuencia parcial de un
antígeno que proporciona fijación a un anticuerpo), se ha visto que
el presente método conduce a la estructura exacta del epítope en
unas pocas etapas sólo.
Según la invención se determina una secuencia
mimotopo para un receptor. En este contexto, una secuencia de
mimotopo se define como una molécula que muestra cierta actividad
mínima, deseada en presencia de un receptor dado. Un ejemplo de ello
es la determinación de la secuencia de epítope de un antígeno para
cierto anticuerpo. Sin embargo, en algunos casos, puede ser
suficiente que se mimetice el epítope exacto y que baste una fuerza
de fijación ligeramente inferior de la molécula hallada con el
receptor.
La secuencia de mimotopo será una molécula
compuesto por cierto número de bloques de construcción, donde el
número y orden de los bloques de construcción controlan las
propiedades de la molécula. Como ejemplos de tipos de secuencias de
mimotopo que se pueden determinar según la invención, se pueden
citar los péptidos, que tienen posiblemente estructuras esteroides o
similares a sacáridos conectados a los mismos, sacáridos, ADN
(oligonucleótidos) y APN (ácidos nucleicos similares a los
péptidos). Por consiguiente, los bloques de construcción se eligen
dentro de los grupos de aminoácidos (tanto los aminoácidos
naturales como los no naturales) monosacáridos y
nucleótidos.
nucleótidos.
El receptor para el cual se determina una
secuencia de mimotopo según la invención puede ser cualquier
compuesto, composición, microorganismo o muestra de tejido respecto
del cual uno de los tipos de secuencias de mimotopo puede mostrar
cierta actividad que se puede medir, como actividad de fijación.
Como ejemplos adecuados de receptores se pueden mencionar los
anticuerpos (tanto los monoclonales como los policlonales),
proteínas, como enzimas, células, receptores de hormonas y
microorganismos.
La primera etapa en un método según la invención
es disponer de una biblioteca de secuencias de prueba. Por
supuesto, estas secuencias de prueba están compuestas por el mismo
tipo o clase de bloques de construcción que la secuencia de mimotopo
objetivo. De preferencia, las secuencias de prueba se conocen porque
aunque se pueden elegir aleatoriamente, su composición y estructura
es conocida.
Esto realizar generando, p. ej. a mano o
mediante ordenador, cierto número de secuencias y sintetizando las
secuencias así obtenidas. También es posible derivar la biblioteca
de secuencias de prueba de un compuesto se sabe que tiene una
actividad favorable respecto del receptor. En principio, cualquier
forma de elección de secuencia de prueba para realizar la
biblioteca resulta adecuada.
La longitud de las secuencias de prueba depende
de la naturaleza de los lotes de construcción que constituyen las
secuencias y de la naturaleza del receptor así como de la actividad
deseada respecto de dicho receptor. Para muchos casos, resultará
adecuada una longitud de 3 a 20 bloques de construcción.
El número de secuencias de prueba que constituye
la biblioteca será lo suficientemente grande para proporcionar
datos suficientes para llegar a una buena secuencia de mimotopo en
un número aceptable de etapas/ciclos. Por otra parte, dicho número
será lo suficientemente pequeño para garantizar que los datos
obtenidos se pueden manipular de forma adecuada. Por lo general, el
número de secuencias de prueba en la biblioteca oscilará entre 500
y 100.000 de preferencia entre 1000 y 10000.
Una vez que se ha generado el número deseado de
secuencias de prueba, se pueden sintetizar dichas secuencias de
prueba. Estos se pueden realizar de cualquier forma conocida, p. ej.
en la forma descrita por Slootstra et al. en Molecular
Diversity, 1 (1995b) 87-96. También es posible, por
su puesto, utilizar una biblioteca ya disponible, p. ej. porque se
ha utilizado en una aplicación anterior del presente método. En
este caso, las secuencias de prueba no se tendrán que
sintetizar.
Las secuencias de prueba se sintetizan
utilizando una mini tarjeta o un medio de soporte plano.
La etapa siguiente de un método según la
invención es la determinación de la actividad de cada secuencia de
prueba de la biblioteca respecto del receptor. La forma en la que
se realiza esta determinación dependerá de la interacción específica
entre la secuencia del mimotopo y el receptor que se pretende y de
la naturaleza del receptor y los bloques de construcción de la
secuencia de mimotopo. Por ejemplo, si la actividad deseada es la
fijación de la secuencia de mimotopo al receptor y la secuencia de
mimotopo es un péptido y el receptor es un anticuerpo monoclonal,
la determinación puede realizarse convenientemente en una prueba
ELISA en solución o sobre soporte sólido. Otros métodos adecuados
para determinar la actividad son: BIACORE y AFM (Atomic Force
Microscope). El experto en la materia podrá elegir una forma
adecuada de determinar la actividad, dado cierto receptor y la
naturaleza de la secuencia de mimotopo.
Entre los resultados de la determinación de las
actividades de las secuencias de prueba de la biblioteca, se
elegirá por lo menos una secuencia de prueba para formar una base
para las etapas restantes del presente método. Dicha secuencia de
prueba (al menos una) se elige, según la invención, identificando en
cierta posición un bloque de construcción que, según se aprecia por
los resultados de la determinación de la actividad queda favorecido
en dicha posición. En este respecto, la expresión "en cierta
posición un bloque de construcción que queda favorecido en dicha
posición" significa que las secuencias de prueba que tienen en
la citada posición, el mencionado bloque de construcción muestran
una actividad elevada respecto del receptor, comparado con las demás
actividades
halladas.
halladas.
Es posible que la al menos una secuencia de
prueba que se identifique haya sido sometida a prueba para
determinar su actividad respecto del receptor y muestre una
actividad elevada en comparación con las demás actividades
halladas.
halladas.
También es posible que la, al menos una,
secuencia de prueba que se identifica no haya sido probada en sí
misma. Esto se puede explicar del siguiente modo. Por ejemplo,
puede haberse visto que una secuencia de prueba que tiene en la
posición 2 un bloque de construcción A muestre una actividad muy
elevada respecto del receptor. Puede haberse visto además que una
secuencia de prueba que tiene en la posición 4 un bloque de
construcción B muestre también una actividad muy elevada respecto
del receptor. La, al menos una, secuencia de prueba que se va a
identificar puede ser por tanto una secuencia que comprende el
bloque de construcción A en la posición 2 y el bloque de
construcción B en la posición 4. No obstante, puede muy bien ser
que esta secuencia misma no haya sido evaluada todavía en lo que
respecta su actividad para con el receptor. Por lo general, el
número de secuencias de prueba identificado para tomarlo como base
de las etapas restantes de un método según la invención oscilará
entre 1 y 150. Un número de secuencias de prueba más elevado
conducirá a mejores resultados pero resultará relativamente incómodo
de manejar. De preferencia dicho número oscilará entre 1 y 25. El
experto en la materia podrá decidir el número de secuencias de
prueba elegido en función de la calidad deseada del resultado del
método y de las facilidades disponibles para llevarlo a
cabo.
cabo.
Sobre la base de las secuencias de prueba
identificadas se proporciona, en un análisis denominado de
sustitución, otra biblioteca de secuencias de prueba. Esto se hace
variando los bloques de construcción en las posiciones de las
secuencias de prueba identificadas, es decir sustituyendo un bloque
de construcción en unas posiciones elegidas de la secuencia de
prueba identificada por unos bloques de construcción elegidos.
Por ejemplo, en su forma más sencilla el
análisis de sustitución se realiza del siguiente modo. En el caso
de que las secuencias de prueba sean dodecapéptidos de aminoácidos
naturales, en primer lugar, se puede cambiar el bloque de
construcción en la posición 1 de uno de los dodecapéptidos elegidos
en cada uno de los 20 aminoácidos que se presentan de forma
natural, obteniéndose 20 nuevas secuencias de prueba. Esto se repite
para cada posición del dodecapéptido, obteniéndose 20 * 12 = 240
secuencias de prueba. Entre estas 240 secuencias de prueba, el
dodecapéptido original está presente 12 veces. Este procedimiento se
repite para cada dodecapéptido elegido. Por tanto se obtiene una
nueva biblioteca que comprende 240 a 3600 nuevas secuencias de
prueba.
Se pueden realizar pruebas más complejas de este
análisis de sustitución, p. ej. haciendo que nuevos bloques de
construcción sean sustituidos por grupos de bloques de construcción
(p. ej. la sustitución de un aminoácido por dos o más aminoácidos).
Por lo general, dicha sustitución por bloques de construcción
múltiples se hará con moderación. De preferencia, en al menos un
análisis de sustitución de los diferentes ciclos del presente
método, se sustituye al menos un bloque de construcción por un grupo
de bloques de construcción. Habrá que tener cuidado para que en
cada análisis de sustitución no se introduzcan demasiados bloques de
construcción múltiples ya que de otro modo pueden surgir problemas
relativos a la construcción de la secuencia. Por igual motivo, el
grupo de bloques de construcción múltiple no será demasiado largo,
de preferencia.
El experto en la materia, sobre la base de su
experiencia en el campo, podrá decidir el tamaño y el número de
bloques de construcción múltiples que se pueden introducir.
Es también posible sustituir un bloque de
construcción por un hueco en el análisis de sustitución. Así, la
secuencia tendrá un bloque de construcción menos. Es evidente que
no se pueden sustituir demasiados bloques de construcción por un
hueco al mismo tiempo ya que esto daría como resultado una secuencia
de prueba demasiado corta o ninguna. El experto podrá decidir
cuándo y en que posición resulta útil introducir un hueco en una
secuencia de
prueba.
prueba.
Además, es posible permitir únicamente la
introducción de bloques de construcción elegidos en el análisis de
sustitución, o sustituir únicamente bloques de construcción en
posiciones elegidas en las secuencias de prueba. Algunas veces se
prefiere mantener ciertos bloques de construcción en ciertas
posiciones, p. ej. a fin de mantener una estructura tridimensional
deseada de la secuencia de prueba. Una ventaja de esta forma de
realizar el análisis de sustitución es que el número total de
secuencias de prueba que se obtiene es limitado. Por lo general sin
embargo si los bloques de construcción en todas las posiciones de la
secuencia de prueba se sustituyen por todos los bloques de
construcción posibles, se obtendrán también las secuencias de
prueba que tiene la estructura tridimensional deseada. Será,
nuevamente, el experto en la materia el que decida en qué casos
puede resultar útil realizar una sustitución en posiciones elegidas
únicamente. También estará en condiciones de decidir en qué
posiciones se puede realizar y que bloques de construcción pueden
usarse para la sustitución y qué bloques de construcción pueden, de
preferencia, dejarse sin usar en la sustitución (en ciertas
posiciones).
Se comprueba la actividad respecto del receptor
de las secuencias de prueba de la próxima biblioteca obtenida sobre
la base del análisis de sustitución de la, al menos una, secuencia
de prueba identificada. En el caso de que entre las secuencias de
prueba de esta biblioteca se encuentre presente una secuencia de
prueba que presente una actividad suficiente respecto del receptor,
el método se completa y se obtiene la secuencia de mimotopo deseada.
Es evidente que dependerá del tipo de actividad, del receptor, de
la secuencia de mimotopo y de la aplicación objetiva de la
secuencia de mimotopo para considerar si cierta actividad es
suficiente. Dadas las circunstancias, el experto podrá elegir un
umbral para una actividad deseada.
En el caso de que ninguna de las secuencias de
prueba muestre una actividad suficiente respecto del receptor, se
realizará otro ciclo. Según la invención, se realizan de
preferencia al menos dos ciclos y por tanto dos análisis de
sustitución. Por lo tanto, se proporciona otra biblioteca de
secuencias de prueba, basadas en las 10 a 15 secuencias de prueba
de la biblioteca anterior que mostraron la actividad máxima tal
como se ha indicado anteriormente. Las secuencias de prueba en esta
nueva biblioteca se evaluarán para determinar su actividad, y así
sucesiva-
mente.
mente.
El número de ciclos que se tiene que realizar
dependerá del grado deseado de actividad de la secuencia de mimotopo
a encontrar para el receptor. Partiendo de aprox. 4500
dodecapéptidos elegidos aletoriamente, se ha comprobado que es
posible llegar a la secuencia de epítope exacta para un anticuerpo
monoclonal en menos de tres
ciclos.
ciclos.
En una realización preferida de la invención, la
cantidad de receptor utilizada para determinar la actividad de las
secuencias de prueba respecto de dicho receptor, se reduce en cada
ciclo. Se ha comprobado que los bloques de construcción que parecen
ser esenciales en el primer ciclo pueden no serlo en los ciclos
siguientes. En otras palabras, en dicho primer ciclo se pueden
encontrar óptimos locales que pueden resultar superados en un ciclo
ulterior o en ciclos ulteriores. La reducción de la cantidad de
receptor en la determinación de la actividad de las secuencias de
prueba contribuye, como se ha visto, a superar estos óptimos
locales. De preferencia, la cantidad de receptor utilizada en la
determinación de las actividades de secuencias de prueba en una
biblioteca se reduce en un factor de 50 a 1000, de preferencia de
10 a 100.
La invención se aclarará ahora a la vista de los
siguientes ejemplos no restrictivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos descritos ilustran seis variaciones
del presente método de optimización que se ha aplicado con éxito a
péptidos "lead", identificados con anticuerpos (monoclonales y
policlonales) cultivados con péptidos, proteínas, virus, bacterias,
azucares y esteroides de vario tipos de bibliotecas de repetidos.
Se puede pensar que son posibles otras variaciones. El concepto que
rige estas variaciones es la repetición de los análisis de
sustitución en uno o más péptidos "lead". Se superan los
mínimos locales y se identifican epítopes y mimotopos.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando los 20 aminoácidos L naturales se
generaron 4550 dodecapéptidos aleatorios (12-meros)
con un generador aleatorio programado en Quick Basic utilizado en
un sistema informático 486 DX2 (66 MHz). En esta biblioteca la
frecuencia de cada residuo es de aprox. 5%. Este conjunto de
secuencias se utilizó para diseñar bibliotecas adicionales. Una en
la que todas las secuencias están en forma de
D-aminoácido, una en la que la 2ª y 11ª posición
están ocupadas por una cisteína y una en la que la 3ª y 10ª
posición están ocupadas por una cisteína. La finalidad de las dos
últimas es introducir un puente disulfuro en el péptido que
presentará los péptidos como bucles. Es muy importante aquí que la
secuencia de los aminoácidos dentro y fuera de las cisteínas sea
idéntica a la del primer conjunto de 450 dodecapéptidos. Así, la
actividad de estos conjuntos de dodecapéptidos puede compararse. El
ej. 1 describe resultados obtenidos con la biblioteca de péptidos
sintética, en la que las posiciones 3ª y 10ª están ocupadas por
una
cisterna.
cisterna.
El ej. 2 describe los resultados obtenidos con
una biblioteca de péptidos sintética compuesta por 4550
dodecapéptidos aleatorios (12-meros), es decir que
no se utilizó ninguna cisteína ni otro motivo.
Las bibliotecas se sintetizaron con y detectaron
utilizando tarjetas mini-PEPSCAN de formato tarjeta
de crédito (455 péptidos/tarjeta) según lo antes descrito
(Slooststra et al., 1995b). En el ej. 1, la fijación del
anticuerpo monoclonal 26/9 a cada péptido se probó en un
inmunoensayo ligado a enzima basado en PEPSCAN (ELISA). El
anticuerpo monoclonal 26/9 se ha descrito anteriormente (Wilson
et al., 1984; Rini et al., 1992; Churchill et
al., 1994). Se cultivó anticuerpo monoclonal 26/9 con el
péptido HA175-110 de la proteína hemaglutinina del
virus de la gripe (X47: HA1) (Wilson et al., 1984).
En el ej. 1 se incubaron las tarjetas de
polietileno de formato tarjeta de crédito de 455 pocillos, que
contenían los péptidos ligados de forma covalente con anticuerpo
26/9 (100 \mug/ml). Después de lavar los péptidos se incubaron
peroxidasa antiratón-conejo (rampo dilución 1/1000)
(Dakopats) (1 h, 25°C) y ulteriormente después de lavar el sustrato
de peroxidasa se añadió
2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina
sulfonato (ABTS) y 2 \mul/ml 3% H_{2}O_{2}. Al cabo de una
hora, se midió el desarrollo del color. El desarrollo del color de
ELISA se cuantificó con una cámara CCD y un sistema de procesamiento
de imagen. La configuración consiste en una cámara CCD y una lente
de 55 mm (Sony CCD Vídeo cámara XC-77RR, Nikon
micronikkor 55 mm lente f/2,8) un adaptador de cámara (Sony Cámara
adaptor DC-77RR) y el software de procesamiento de
imagen TIM, versión 3.36 (Difa Measuring Systems, Países Bajos) que
funciona en un sistema informático 486 DX2 (50 MHz).
La biblioteca de dodecapéptidos, compuesta por
4550 dodecapéptidos aleatorios, se examina con una concentración
relativamente elevada de anticuerpo (100 \mug/ml, mejor 10
\mum/ml, ver ejs. 2-6). Esta concentración es
aprox. 2 orden de magnitud por encima de la concentración requerida
para obtener una fijación de actividad máxima en ELISA con péptido
epítope nativo (no mostrado). La concentración de 100 \mug/ml se
utilizó para obtener muchos repetidos de fijación del pequeño
conjunto de 4550 dodecapéptidos aleatorios. En estudios previos se
ha mostrado que esta estrategia, sin obtener un radio desfavorable
señal/ruido, puede dar como resultado centenares de péptidos de
fijación que se parecen a partes pequeñas lineales o no lineales
del epítope nativo (Slootstra et al., 1995b; Slootstra et
al.,
1997).
1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Además de las bibliotecas minipepscan aleatorias
los mimotopos se pueden identificar también a partir de bibliotecas
pepscan standard. Estas bibliotecas contienen los
12-meros de superposición (o más cortos/más largos)
que cubren la secuencia lineal de una proteína conocida (Slootstra
et al., 1995a).
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos "lead" se pueden derivar
también de otro tipo de bibliotecas, como p. ej. de expresión en
fago.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clasificaron los 4550 dodecapéptidos según su
actividad de fijación. Según su clasificación se identificaron
secuencias de consenso y motivos. Se han descrito métodos iniciales
de optimización "lead" que utilizan solamente la secuencia de
las 50 moléculas superiores, en Slootstra et al. (1995b;
1997). El presente método utiliza la totalidad de las 4550
secuencias. En primer lugar, la frecuencia y/o distribución de
aminoácidos individuales y los motivos de dipéptido OO motivos de
dipéptido OXO y motivos de dipéptido OXXO se determina utilizando
Microsoft Excel 4.0 (O, uno de los 20 aminoácidos L naturales X,
cualquier residuo). En segundo lugar se incluyen en el análisis
propiedades de los aminoácidos (carácter hidrófobo, carga, etc.).
En tercer lugar todos estos datos se utilizan para optimizar la
actividad de las 10-50 moléculas "lead"
superiores. Esto se hace sustituyendo bloques de construcción que
inhiben la actividad e incluyen bloques de construcción que mejoran
la actividad de
fijación.
fijación.
El presente método de análisis de secuencia
mejora la actividad de moléculas "lead" mediante análisis de
todas las partes en las secuencias de la biblioteca.
\vskip1.000000\baselineskip
En un análisis de sustitución se investiga de
forma detallada la actividad de fijación de series completas de
análogos de sustitución de péptidos "lead", donde cada posición
se sustituye por cada uno de los demás 19 aminoácidos L naturales.
Además, es posible utilizar los 20 aminoácidos D así como otros
aminoácidos no naturales disponibles. Las sustituciones que mejoran
la fijación se combinan en nuevas secuencias de bloques de
construcción. Estas nuevas secuencias se vuelven a probar en un
segundo análisis de sustitución. Se realizarán más rondas de
análisis de sustitución si es preciso. Tras cada ronda de análisis
de sustitución la concentración de anticuerpos (o de otro receptor
soluble) se puede reducir para obtener una actividad de sustitución
máxima (p. ej. de 100 \mug/ml a 0,01 \mug/ml después de dos
rondas de análisis de sustitución, tal como se muestra en el ej.
1).
\vskip1.000000\baselineskip
- Churchill M. E. A., Stura E. A.,
Pinilla C., Appel J. R., Houghten R. A.,
Kono D. H., Balderas R. S., Fieser G. G.,
Schulze-Gahmen U. and Wilson I. A.
(1994). Crystal structure of a peptide complex of
anti-influenza peptide antibody Fab 26/9. J.
Mol. Biol. 241, 534-556.
- Rini J. M.,
Schulze-Gahmen U. and Wilson I. A.
(1992). Structural evidence for induced fit as a mechanism
for antibody-antigen interaction. Science,
255, 959-965.
- Slootstra J. W., De Geus P.,
Haas H., Verrips, C. T. and Meloen R. H.
(1995a). Possible active site of the
sweet-tasting protein thaumatin. Chemical
Senses, 20, 535-543.
- Slootstra J. W., Puijk W. C.,
Ligtvoet G. J., Langeveld J. P. M. and Meloen
R. H. (1995b). Structural aspects of
antibody-antigen interaction revealed through small
random peptide libraries. Molecular Diversity 1, 87-
96.
96.
- Slootstra J. W., Kuperus D.,
Plückthun, A. and Meloen R. H. (1996).
Identification of new tag sequences with differential and selective
recognition properties for the anti-FLAG monoclonal
antibodies M1, M2 and M5. Molecular Diversity 2,
156-164.
- Slootstra J. W., Puijk W. C.,
Ligtvoet G. J., Kuperus D., W. M. M. Schaaper
and Meloen R. H. (1997). Screening of a small set of
random peptides: A new strategy to identify peptides that mimic
epitopes. J. Mol. Recog. 10, 219-224.
- Wilson I. A., Niman H. L.,
Houghten R A., Cherenson A.R., Connolly M. L.
and Lerner R. A. (1984). The structure of an
antigenic determinant in a protein. Cell, 37,
767-778.
\vskip1.000000\baselineskip
Notas a los
ejemplos:
- -
- los 10 \mug/ml, 1 \mug/ml etc. indican la concentración de anticuerpos.
- -
- la línea "posición-0,1 mejorada" etc. significa que este cambio de aminoácido (subrayar) mejora la actividad de fijación en pepscan elisa con una concentración de anticuerpos dada. Las posiciones que no pueden mejorar no se mencionan (p. ej. posición -08 en la primera red de sustitución del ej. 1, es decir el original I en la posición 8 da la actividad máxima).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Título: Identificación de un epítope por
medio de un péptido "lead" elegido de entre 4550
dodecapéptidos aleatorios (biblioteca minipepscan con motivo
XXCXXXXXXCXX, X aminoácido elegido aleatoriamente, ver Materiales y
Método).
Herramientas: péptido "lead"
CGCAAMNIRCYA.
Metodología: dos rondas de análisis de
sustitución .
\vskip1.000000\baselineskip
En el ej. 1, el péptido "lead" CGCAAMNIRCYA
se derivó (con anticuerpo 26/9) de la biblioteca aleatoria en la
que la 3ª y 10ª a posición están ocupadas por una cisteína (ver
más arriba en Materiales y Métodos). Todos los posibles análogos de
sustitución individuales del péptido aleatorio CGCAAMNIRCYA probado
en pepscan para determinar la fijación de anticuerpo 26/9 en 100
\mug/ml. Estos resultados se describen más abajo en detalle.
El análisis de sustitución del péptido
"lead" CGCAAMNIRCYA dio como resultado la identificación de
bloques de construcción que no se pueden sustituir por otros
bloques de construcción (p. ej. Y y A), y la identificación de
residuos que se pueden sustituir por uno o dos bloques de
construcción (p. ej. N) y residuos que se pueden sustituir por
muchos otros bloques de construcción (p. ej. M). Algunas
sustituciones mejoran considerablemente la actividad de fijación
(p. ej. N en D).
Todas estas sustituciones se utilizaron para
diseñar el péptido mejorado EMDEEEDIMNYA. Hay que señalar que este
péptido fija anticuerpo 26/9 a una concentración muy inferior, o sea
que ha mejorado la actividad de fijación (100 \mug/ml para
CGCAAMNIRCYA y 1,0 \mug/ml para EMDEEEDIMNYA).
El péptido EMDEEEDIMNYA se sometió a un segundo
análisis de sustitución. Se puede observar otra vez que algunas
sustituciones mejoran considerablemente la actividad de fijación.
Estas sustituciones se utilizaron para diseñar el péptido mejorado
EMDEEEDVPDYA. Lo esencial es que la primera parte de EMDEEEDIMNYA,
EMDEEE, no contiene residuos críticos mientras que la última,
DIMNYA, sí lo hace. La combinación de los residuos mejorados en esta
última parte da como resultado la secuencia DVPDYA. La secuencia
DVPDYA es idéntica al epítope lineal del anticuerpo 26/9. Por
tanto, el péptido "lead" CGCAAMNIRCYA derivado de unos pocos
millares de dodecapéptidos aleatorios se convirtió en una secuencia
de epítope nativo a lo largo de los análisis de
sustitución.
sustitución.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Título: identificación de un mimotopo
mediante un péptido lead seleccionado a partir de 4550
dodecapéptidos aleatorios (biblioteca minipepscan aleatoria).
Herramientas: péptido lead
ANWPSAGAFGL.
Metodología: Rondas de análisis de
sustitución.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ej. 2, se identificaron péptidos lead a
través de una biblioteca minipepscan aleatoria. La diferencia del
ej. 2 respecto del ej. 1 es que el anticuerpo utilizado en el ej. 1
fija un epítope lineal mientras que el anticuerpo utilizado en el
ejemplo 2 fija un epítope no lineal. Los siguientes análisis de
sustitución múltiples se realizaron en la forma indicada en el ej.
1. El mimotopo identificado no se parece a ninguna región de la
secuencia lineal de la proteína
nativa.
nativa.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Título: Identificación de un mimotopo a
través de "lead" derivado de una biblioteca de expresión en
fago compuesta por > 1.000.000 de hexapéptidos aleatorios.
Herramientas: péptido "lead"
SDTRKG*.
Metodología: Alargamiento hacia la
izquierda y la derecha de SDTRKG con cisteinas/glicinas seguidos de
tres rondas de análisis de sustitución.
\newpage
En el ej. 3, se identificaron péptidos
"lead" por medio de expresión en fago. Se añadieron
cisteinas/glicinas adyacentes para mejorar la actividad de
fijación. Tras obtener la actividad se realizaron múltiples
análisis de sustitución en la forma indicada en el ej. 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Título: Identificación de un mimotopo a
través de un lead derivado de un análisis pepscan standard.
Herramienta: Péptido lead RVMIKLILVNFR* y
secuencia completa de proteína nativa (la parte que se utilizó en
KIYRNMIKLILVNFRMQP).
Metodología: Dos rondas de análisis de
sustitución, seguido de alargamiento a la izquierda y a la derecha,
seguido nuevamente de dos rondas más de análisis de sustitución,
finalmente seguido de alargamiento hasta un mimotopo
18-mero.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ej. 4 se identificó un péptido lead por
medio de análisis pepscan standard, es decir el anticuerpo se probó
sobre los 12-meros superpuestos que cubren la
secuencia lineal de la proteína. Las dos rondas siguientes de
análisis de sustitución se realizaron en la forma indicada en el
ej. 1. Además, el mimotopo se alargó a la izquierda y a la derecha
(3 aminoácidos, se puede seguir alargando, mediante análisis de
sustitución adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Título: identificación de un mimotopo
mediante un conjunto de "leads" similares elegidos de 4550
dodecapéptidos aleatorios (biblioteca minipepscan aleatoria).
Herramientas: conjunto de 6 péptidos lead
QNNMKLFRGCVP, RGIKWNEMTDQW, KLQQNPTFYPPV, TNNCKEFAGIVP,
RGILTNIMKDQW, IVQNNPKFFRGA (potencialmente hasta todos los 4550
péptidos, véase material y métodos, en este caso también se quitan
de los "leads" los aminoácidos "negativos".
Metodología: Determinación de secuencia
de consenso seguida de dos rondas de análisis de sustitución de la
secuencia de consenso.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ej. 5, se utilizó un conjunto de péptidos
"leads" similares para identificar una secuencia de consenso.
Las secuencias de consenso se identificaron en la forma indicada en
materiales y métodos. Esta secuencia se utilizó en los análisis de
sustitución.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
6
Título: identificación de mimotopo
mediante un conjunto de "leads" diferentes elegidos de una
biblioteca de expresión en fago compuesta por > 1.000.000 de
hexapéptidos aleatorios.
Herramientas: conjunto de 3 péptidos
"lead" (ANWPSA, KLITRW, NVCSWS).
Metodología: Dos rondas de análisis de
sustitución (para cada péptido leads), seguido de determinación de
secuencia consenso global.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ej. 6 se utilizaron péptidos leads
diferentes para identificar una secuencia de consenso. Cada péptido
leads se utilizó en análisis de sustitución múltiples (dos
rondas). Los tres mimotopos resultantes se alinearon dando como
resultado un mimotopo alargado con actividad mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Claims (10)
1. Método para determinar una secuencia mimotopo
para un receptor que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una biblioteca de secuencias de
prueba compuesta por bloques de construcción elegidos dentro del
grupo de los aminoácidos, monosacáridos y nucleótidos;
b) determinar la actividad de cada secuencia de
prueba de la biblioteca respecto del receptor;
c) identificar una secuencia de prueba que
contiene en cierta posición un bloque de construcción, que, según
los resultados de la etapa b, muestra una actividad de fijación
respecto del receptor;
d) obtener otra biblioteca de secuencias de
prueba, basada en la secuencia de prueba identificada en la etapa
c, sustituyendo un bloque de construcción en posiciones elegidas de
la secuencia de prueba identificada, por bloques de construcción
elegidos;
e) determinar la actividad de cada secuencia de
prueba de la biblioteca obtenida en la etapa d) respecto del
receptor;
f) identificar una secuencia de prueba que
contiene en cierta posición un bloque de construcción que, según
los resultados de la etapa e), muestra una actividad de fijación
respecto del receptor;
g) repetir las etapas de d)-f)
para la biblioteca de secuencias de prueba obtenida en la etapa d),
durante cierto número de ciclos hasta que se encuentra en la etapa
f) una secuencia mimotopo que presenta una actividad de umbral
respecto del receptor, reduciéndose en cada ciclo la cantidad de
receptor utilizado para determinar la actividad de las secuencias
de prueba respecto de dicho receptor; cada secuencia de prueba se
sitúa en una mini tarjeta o medio de soporte plano.
2. Método según la reivindicación 1, donde la
composición química de las secuencias de prueba proporcionadas en
la etapa A es conocida.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde
en la etapa e) la cantidad de receptor utilizada para determinar la
actividad es de 50 a 1000 veces menor que la cantidad utilizada en
la etapa b) y donde dicha cantidad en la etapa g) es de 50 a 1000
veces menor que la cantidad en la etapa e) del ciclo que precede
directamente la etapa g) mencionada.
4. Método según la reivindicación 3, donde en la
etapa e) la cantidad de receptor utilizada para determinar la
actividad es de 100 a 100 veces menor que la cantidad utilizada en
la etapa b) y donde dicha cantidad en la etapa g) es de 10 a 100
veces menor que la cantidad en la etapa e) del ciclo que precede
directamente la etapa g) mencionada.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende por lo menos una etapa d)
en la que al menos un bloque de construcción se sustituye por un
grupo de bloques de construcción.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde las secuencias de prueba
comprenden de 3 a 20 bloques de construcción.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la biblioteca de secuencias de
prueba de la etapa a) comprende de 500 a 100.000 secuencias de
prueba.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el receptor se elige dentro del
grupo formado por anticuerpos monoclonales, proteínas, como
enzimas, células, receptores de hormonas y microorganismos.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la actividad se determina
utilizando un inmunoensayo, BIACORE o AFM.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde cada secuencia de prueba de un
biblioteca se separa físicamente de las demás secuencias de prueba
de dicha biblioteca.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98203830 | 1998-11-13 | ||
| EP98203830 | 1998-11-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2312218T3 true ES2312218T3 (es) | 2009-02-16 |
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