ES2312360T3 - Proteinas de reproduccion en plantas. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene el efecto de alterar la formación de endospermo, que comprende al menos 250 aminoácidos, donde: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido y el SEQ ID NO: 2 tienen una identidad de al menos 80% basándose en el método de alineamiento Clustal; o (b) la secuencia de nucleótidos del polinucleótido y el SEQ ID NO: 1 tienen una identidad de al menos 80% basándose en el método de alineamiento Clustal.
Description
Proteínas de reproducción en plantas.
Esta invención se encuentra en el campo de la
biología molecular vegetal. Más específicamente, esta invención se
refiere a fragmentos de ácido nucleico que codifican proteínas de la
reproducción en plantas y semillas.
La apomixis es la formación de semillas sin
fertilización. La mayor parte de la formación de semillas en las
plantas implica intercambio de gametos sexuales entre diferentes
plantas o dentro de la misma planta, no obstante, la apomixis no se
produce naturalmente especialmente en especies/variedades de plantas
poliploides.
Se prevé que el control de la formación de
semillas por medio de la apomixis tenga un impacto enorme en la
agricultura. Generalmente la apomixis no ha sido explotada en la
agricultura, sin embargo, si se pudiera controlar la apomixis en
diversos cultivos se revolucionaría la agricultura debido a que se
podrían producir semillas genéticamente idénticas sin la necesidad
de fertilización de los gametos. Se podría hacer visible fácilmente
la inmortalización de variedades de plantas de cultivo de alto
rendimiento y se podría explotar la apomixis por medio de la
industria de las semillas para reducir los costes de mantenimiento
de líneas endogámicas puras. Asimismo, la formación de semillas sin
fertilización evita factores que podrían afectar la eficacia del
ajuste de las semillas, tales como el recuento de polen y la
viabilidad del polen, y la emergencia o viabilidad del estigma o la
inflorescencia masculina. La apomixis también permitiría la
incorporación estable inmediata de transgenes sin la necesidad de
autofertilización para producir homozigotos.
El uso de genes de endospermo independientes de
la fertilización y otros genes relacionados podría ser para formar
endospermos independientes de la fertilización sin formar
necesariamente embriones viables. Semejante semilla no germinaría
porque no tiene un embrión. Los endospermos, si están
suficientemente formados, se podrían utilizar no obstante para
alimento humano y animal y para molienda y extracción comercial.
Tales semillas sin embrión tendrían la ventaja añadida de permitir
la contención de organismos modificados genéticamente para
satisfacer intereses medioambientales y reguladores. Tales semillas
también podrían ser modificadas independientemente para producir
productos novedosos en el endospermo tales como fármacos, productos
nutracéuticos, y compuestos y polímeros industriales.
La identificación de genes específicos
implicados en la apomixis, tales como los genes del endospermo
independientes de la fertilización, debería ofrecer nuevas formas
de producción de plantas apomícticas. Tales enfoques pueden
implicar la mutagénesis selectiva de genes del endospermo
independientes de la fertilización y después el rastreo de los
alelos mutantes en un programa de mejoramiento genético (molecular),
o mediante métodos transgénicos. Por consiguiente, la
disponibilidad de secuencias de ácido nucleico que codifican toda o
una parte de una proteína del endospermo independiente de la
fertilización facilitaría estudios para comprender mejor la
regulación del desarrollo en las plantas, proporcionando
herramientas genéticas para controlar la apomixis.
La presente invención proporciona un
polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene el
efecto de alterar la formación de endospermo, que comprende al
menos 250 aminoácidos, donde:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido y el SEQ ID NO: 2 tienen una identidad de al menos 80% basándose en el método de alineamiento Clustal; o
- (b)
- la secuencia de nucleótidos del polinucleótido y el SEQ ID NO: I tienen una identidad de al menos 80% basándose en el método de alineamiento Clustal.
Preferiblemente:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido y el SEQ ID NO: 2 tienen una identidad de al menos 85% o 95% basándose en el método de alineamiento Clustal; o
- (b)
- la secuencia de nucleótidos y el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 29 tienen una identidad de al menos 85% o 95% basándose en el método de alineamiento Clustal.
En una realización, el polipéptido comprende el
SEQ ID NO: 2.
En otra realización, el polinucleótido comprende
el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 29.
Preferiblemente, el polipéptido es una proteína
del endospermo independiente de la fertilización (FIE).
La invención también proporciona un complemento
del polinucleótido de la invención, donde el complemento y el
polinucleótido contienen el mismo número de nucleótidos y son
complementarios en 100%.
La invención también proporciona un método para
transformar una célula que comprende introducir en una célula el
polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido como se
ha definido antes que tiene el efecto de alterar la formación de
endospermo.
La invención también proporciona un método para
transformar una célula que comprende introducir el complemento
definido antes en una célula.
Preferiblemente, en cualquiera de estos métodos,
la célula es una célula vegetal. La célula vegetal puede ser una
célula de una planta monocotiledónea o dicotiledónea.
La invención también proporciona el polipéptido
aislado codificado por el polinucleótido de la invención.
Preferiblemente, dicho polinucleótido es una proteína del endospermo
independiente de la fertilización (FIE).
La invención también proporciona un gen
quimérico en el cual el polinucleótido de la invención está
conectado operablemente a un promotor.
La invención también proporciona un vector
plasmídico que comprende un polinucleótido aislado de la invención
o un gen quimérico de la invención.
La invención también proporciona un vector de
expresión en plantas que comprende un polinucleótido de la invención
bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y
un marcador seleccionable dominante.
La invención también proporciona una célula
anfitriona que comprende un polinucleótido o un gen quimérico de la
invención. Preferiblemente, la célula anfitriona es una célula
vegetal. La célula vegetal puede ser una célula de una planta
monocotiledónea o una célula de una planta dicotiledónea.
La invención también proporciona un método para
transformar una planta que comprende la transferencia de un
polinucleótido de la invención a dicha planta dando como resultado
una herencia estable. La planta puede ser una monocotiledónea o una
dicotiledónea.
La invención también proporciona una planta
anfitriona transgénica transformada establemente con un
polinucleótido de la invención. Preferiblemente, dicha planta
anfitriona es una planta anfitriona en la cual un polipéptido de la
invención está presente a niveles superiores a los normales o en
tipos de células o con un desarrollo o en fases en los cuales no se
encuentra normalmente; y donde dicho polipéptido tiene un efecto de
alteración de la función del endospermo. Dicha planta puede ser una
planta monocotiledónea o dicotiledónea.
La invención también proporciona una planta en
la cual la expresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido
de la invención es reducida o eliminada, de manera que dicho
polipéptido está presente a niveles inferiores a los normales y la
formación de endospermo es alterada. En algunas realizaciones, dicha
reducción para la eliminación puede ser por medio de inhibición
antisentido o co-supresión. Dicha planta puede ser
una planta monocotiledónea o dicotiledónea.
Cuando la presente invención se refiere a una
célula anfitriona aislada que comprende un gen quimérico de la
presente invención o un polinucleótido aislado de la presente
invención, la célula anfitriona puede ser eucariótica, tal como una
levadura o una célula vegetal, o procariótica, tal como una célula
bacteriana. La presente invención también hace referencia a un
virus, preferiblemente un baculovirus, que comprende un
polinucleótido de la presente invención aislado o un gen quimérico
de la presente invención.
La invención también se refiere a un
procedimiento para producir una célula anfitriona aislada que
comprende un gen quimérico de la presente invención o un
polinucleótido aislado de la presente invención, comprendiendo el
procedimiento transformar o transfectar una célula compatible
aislada con un gen quimérico o un polinucleótido aislado de la
presente invención.
La invención también se refiere a un método de
selección de un polinucleótido aislado que afecta al nivel de
expresión de un polipéptido o actividad enzimática de una proteína
del endospermo independiente de la fertilización en una célula
anfitriona, preferiblemente una célula vegetal, comprendiendo el
método las etapas de: (a) construir un polinucleótido aislado de la
presente invención o un gen quimérico aislado de la presente
invención; (b) introducir el polinucleótido aislado o el gen
quimérico aislado en una célula anfitriona; (c) medir el nivel de
polipéptido o actividad enzimática de la proteína del endospermo
independiente de la fertilización en la célula anfitriona que
contiene el polinucleótido aislado; y (d) comparar el nivel de
polipéptido o actividad enzimática de la proteína del endospermo
independiente de la fertilización en una célula anfitriona que
contiene el polinucleótido aislado con el nivel de polipéptido o
actividad enzimática de la proteína del endospermo independiente de
la fertilización en la célula anfitriona que no contiene el
polinucleótido aislado.
\newpage
La invención también se refiere a un método para
obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción
sustancial de un polipéptido de endospermo independiente de la
fertilización, preferiblemente un polipéptido de endospermo
independiente de la fertilización de una planta, que comprende las
etapas de: sintetizar un cebador oligonucleotídico que comprende
una secuencia de nucleótidos de al menos uno de 60 (preferiblemente
al menos uno de 40, muy preferiblemente al menos uno de 30)
nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre los SEQ ID NO: 1, 29 o 39, 41, 43, 45, 47, y el
complemento de tales secuencias de nucleótidos; y amplificar un
fragmento de ácido nucleico (preferiblemente un ADNc insertado en un
vector de clonación) utilizando el cebador oligonucleotídico. El
fragmento de ácido nucleico amplificado codificará preferiblemente
una porción sustancial de una secuencia de aminoácidos de la
proteína del endospermo independiente de la fertiliza-
ción.
ción.
Esta invención también se refiere a un método de
obtención de un fragmento de ácido nucleico que codifica todo o una
parte sustancial de la secuencia de aminoácidos que codifica un
polipéptido del endospermo independiente de la fertilización que
comprende las etapas de: sondear una genoteca de ADNc o genómica con
un polinucleótido aislado de la presente invención; identificar un
clon de ADN que hibrida con un polinucleótido aislado de la
presente invención; aislar el clon de ADN identificado; y secuenciar
el fragmento de ADNc o genómico que comprende el clon de ADN
aislado.
Esta invención también se refiere a una
composición, tal como una mezcla de hibridación, que comprende un
polinucleótido aislado de la presente invención.
Esta invención también se refiere a un método
para la selección positiva de una célula transformada que comprende:
(a) transformar una célula anfitriona con el gen quimérico de la
presente invención o una casete de expresión de la presente
invención; y (b) hacer crecer la célula anfitriona transformada,
preferiblemente una célula vegetal, tal como una monocotiledónea o
una dicotiledónea, en condiciones que permiten la expresión del
polinucleótido del endospermo independiente de la fertilización en
una cantidad suficiente para complementar un mutante nulo para
proporcionar un medio de selección positivo.
Esta invención también se refiere a un método de
alteración del nivel de expresión de una proteína de la reproducción
en una célula anfitriona que comprende: (a) transformar una célula
anfitriona con un gen quimérico de la presente invención; y (b)
hacer crecer la célula anfitriona transformada en condiciones que
son adecuadas para la expresión del gen quimérico donde la
expresión del gen quimérico da como resultado la producción de
niveles alterados de la proteína de la reproducción en la célula
anfitriona transformada.
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La invención se puede comprender más
completamente a partir de la siguiente descripción detallada y de la
Lista de Secuencias adjunta que forma parte de esta solicitud.
La Tabla I enumera los polipéptidos que se
describen en la presente memoria, la designación de los clones de
ADNc y de las secuencias cromosómicas que comprenden los fragmentos
de ácido nucleico que codifican los polipéptidos que representan
todos o una parte sustancial de estos polipéptidos, y el
correspondiente identificador (SEQ ID NO:) según se utilizan en la
Lista de Secuencias adjunta.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los SEQ ID NO: 71 y 72 representan dos genes
diferentes.
La Lista de Secuencias contiene el código de una
letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los
códigos de tres letras para los aminoácidos como se define en
conformidad con las normas de la IUPAC-IUBMB
descritas en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985)
y en Biochemical J. 219 (No. 2):345-373 (1984).
En el contexto de esta descripción, se
utilizarán numerosos términos. Los términos "polinucleótido",
"secuencia de polinucleótidos", "secuencia de ácido
nucleico", y "fragmento de ácido nucleico"/"fragmento de
ácido nucleico aislado" se utilizan en la presente memoria
indistintamente. Estos términos abarcan secuencias de nucleótidos y
similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o ADN que
tiene cadena sencilla o doble, que contiene opcionalmente bases
nucleotídicas no naturales o alteradas, sintéticas. Un
polinucleótido en forma de un polímero de ADN puede estar formado
por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético, o
mezclas de los mismos.
El término polinucleótido "aislado" hace
referencia a un polinucleótido que se encuentra sustancialmente
libre de otras secuencias de ácido nucleico, tal como pero no
limitadas a otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico. Los
polinucleótidos aislados pueden ser purificados a partir de una
célula anfitriona en la cual se encuentran naturalmente. Se pueden
utilizar los métodos de purificación de ácido nucleico
convencionales conocidos por los artesanos expertos para obtener
polinucleótidos aislados. El término también abarca los
polinucleótidos recombinantes y los polinucleótidos sintetizados
químicamente.
El término "recombinante" significa, por
ejemplo, que una secuencia de ácido nucleico está elaborada mediante
una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados
de otro modo, p. ej., mediante síntesis química o mediante
manipulación de ácidos nucleicos aislados mediante técnicas de
ingeniería genética.
Según se utiliza en la presente memoria,
"cóntigo" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que
está ensamblada a partir de dos o más secuencias nucleotídicas
constitutivas que comparten regiones comunes o solapantes de
homología de secuencia. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos
de dos o más fragmentos de ácido nucleico se pueden comparar y
alinear con el fin de identificar secuencias comunes o solapantes.
Cuando existen secuencias comunes o solapantes entre dos o más
fragmentos de ácido nucleico, las secuencias (y en ese caso sus
correspondientes fragmentos de ácido nucleico) pueden ser
ensambladas en una única secuencia de nucleótidos contiguos.
Según se utiliza en la presente memoria,
"sustancialmente similar" hace referencia a fragmentos de ácido
nucleico donde los cambios en una o más bases oligonucleotídicas
dan como resultado una sustitución de uno o más aminoácidos, pero
no afectan a las propiedades funcionales del polipéptido codificado
por la secuencia de nucleótidos. "Sustancialmente similar"
también hace referencia a fragmentos de ácido nucleico donde los
cambios en una o más bases nucleotídicas no afectan a la capacidad
del fragmento de ácido nucleico para mediar la alteración de la
expresión génica mediante silenciamiento de genes por ejemplo a
través de la tecnología antisentido o de
co-supresión. "Sustancialmente similar" también
hace referencia a las modificaciones de los fragmentos de ácido
nucleico de la presente invención tales como la deleción o la
inserción de uno o más nucleótidos que no afectan sustancialmente a
las propiedades funcionales del transcrito resultante frente a la
capacidad para mediar el silenciamiento génico o la alteración de
las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante.
Por lo tanto se entiende que la invención abarca más de las
secuencias de nucleótidos o aminoácidos ilustrativas específicas e
incluye equivalentes funcionales de las mismas. Los términos
"sustancialmente similar" y "sustancialmente
correspondiente" se utilizan indistintamente en la presente
memoria.
Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente
similares se pueden seleccionar escrutando fragmentos de ácido
nucleico que representan subfragmentos o modificaciones de los
fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, donde uno o
más nucleótidos son sustituidos, suprimidos y/o insertados, por su
capacidad para afectar el nivel del polipéptido codificado por el
fragmento de ácido nucleico no modificado en una planta o célula
vegetal. Por ejemplo, se puede construir un fragmento de ácido
nucleico sustancialmente similar que representa al menos uno de 30
nucleótidos contiguos derivados del presente fragmento de ácido
nucleico e introducir en una planta o célula vegetal. El nivel del
polipéptido codificado por el fragmento de ácido nucleico no
modificado presente en una planta o célula vegetal expuesta al
fragmento de ácido nucleico sustancialmente similar se puede
comparar después con el nivel del polipéptido en la planta o célula
vegetal que no está expuesta al fragmento de ácido nucleico
sustancialmente similar.
Por ejemplo, es bien sabido en la técnica que se
puede lograr la supresión antisentido y la
co-supresión de la expresión génica utilizando
fragmentos de ácido nucleico que representan menos que la región
codificadora completa de un gen, y utilizando fragmentos de ácido
nucleico que no comparten una identidad de secuencia del 100% con
el gen que se va a suprimir. Por otra parte, las alteraciones en el
fragmento de ácido nucleico que dan como resultado la producción de
un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado, pero no
afectan las propiedades funcionales del polipéptido codificado, son
bien conocidas en la técnica. De este modo, un codón para el
aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido
por un codón que codifica otro resto menos hidrofóbico, tal como
glicina, o un resto más hidrofóbico, tal como valina, leucina; o
isoleucina. De un modo similar, también se pueden esperar que los
cambios que dan como resultado la sustitución de un resto cargado
negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido
glutámico, o un resto cargado positivamente por otro, tal como
lisina por arginina, produzcan un producto funcionalmente
equivalente. Tampoco se esperaría que los cambios de nucleótidos
que dan como resultado la alteración de las porciones
N-terminal y C-terminal de la
molécula de polipéptido alteren la actividad del polipéptido. Cada
una de las modificaciones propuestas está dentro de la experiencia
rutinaria en la técnica, como lo está la determinación de la
conservación de la actividad biológica de los productos
codificados. Por consiguiente, se pueden utilizar un polinucleótido
aislado que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos uno
de los 60 (preferiblemente al menos uno de los 40, muy
preferiblemente al menos uno de los 30) nucleótidos contiguos
derivados de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
que consiste en los SEQ ID NO:1, 29 y 39, y el complemento de tales
secuencias de nucleótidos en los métodos para seleccionar un
polinucleótido aislado que afecte la expresión de un polipéptido
del endospermo independiente de la fertilización en una célula
anfitriona. Un método de selección de un polinucleótido aislado que
afecta el nivel de expresión de un polipéptido en un virus o en una
célula anfitriona (eucariótica, tal como vegetal o de levadura,
procariótica tal como bacteriana) puede comprender las etapas de:
construir un polinucleótido o un gen quimérico aislado que
comprende la secuencia deseada introduciendo el polinucleótido
aislado o el gen quimérico aislado en una célula anfitriona; medir
el nivel de polipéptido o actividad enzimática en la célula
anfitriona que contiene el polinucleótido aislado; y comparar el
nivel de polipéptido o actividad enzimática en la célula anfitriona
que contiene el polinucleótido aislado con el nivel de polipéptido o
actividad enzimática en una célula anfitriona que no contiene el
polinucleótido aislado.
Por otra parte, los fragmentos de ácido nucleico
sustancialmente similares también se pueden caracterizar por su
capacidad para hibridar. Se proporcionan estimaciones de semejante
homología mediante la hibridación ADN-ADN o
ADN-ARN en condiciones de restricción como es bien
sabido por los expertos en la técnica (Hames y Higgins, Eds. (1985)
Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.). Las
condiciones de restricción se pueden ajustar para escrutar
fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas
de organismos distantemente relacionados, a fragmentos muy
similares, tales como genes que duplican las enzimas funcionales de
organismos íntimamente relacionados. Los lavados
post-hibridación determinan las condiciones
restrictivas. Un grupo de condiciones preferidas utiliza una serie
de lavados partiendo de 6X SSC, SDS al 0,5% a la temperatura
ambiente durante 15 minutos, después se repite con 2X SSC, SDS al
0,5% a 45ºC durante 30 minutos, y después se repite dos veces con
0,2X SSC, SDS al 0,5% a 50ºC durante 30 minutos. Un grupo más
preferido de condiciones restrictivas utiliza temperaturas más
altas en las cuales los lavados son idénticos a los anteriores
excepto que la temperatura de los dos lavados de 30 minutos finales
en 0,2X SSC, SDS al 0,5% se incrementó a 60ºC. Otro grupo preferido
de condiciones muy restrictivas utiliza dos lavados finales en 0,1X
SSC, SDS al 0,1% a 65ºC.
Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente
similares de la presente invención también se pueden caracterizar
por el porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos que
codifican con las secuencias de aminoácidos descritas en la
presente memoria, como se determina mediante los algoritmos
comúnmente empleados por los expertos en esta técnica. Los
fragmentos de ácido nucleico adecuados (polinucleótidos aislados de
la presente invención) codifican polipéptidos que son idénticos al
menos en un 80%, preferiblemente aproximadamente 85%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 90% a la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Los más preferidos son los fragmentos
de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que son
idénticas al menos en aproximadamente un 95% a la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Los fragmentos de ácido nucleico
adecuados no solamente tienen las identidades anteriores si no que
típicamente codifican un polipéptido que tiene al menos 250
aminoácidos. Los alineamientos de secuencias y los cálculos del
porcentaje de identidad se realizaron utilizando el programa
Megalign del paquete d computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR
Inc., Madison, WI). El alineamiento múltiple de las secuencias se
realizó utilizando el método de alineamiento Clustal (Higgins y
Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los
parámetros por defecto (PENALIZACIÓN DEL ESPACIO =10, PENALIZACIÓN
DE LA LONGITUD DEL ESPACIO =10). Los parámetros por defecto para
los alineamientos por pares utilizando el método Clustal fueron
KTUPLE 1, PENALIZACIÓN DEL ESPACIO=3, VENTANA=5 Y DIAGONALES
SALVADAS=5.
Una "porción sustancial" de una secuencia
de aminoácidos o nucleótidos comprende una secuencia de aminoácidos
o nucleótidos que es suficiente para proporcionar la supuesta
identificación de la proteína o el gen que comprende la secuencia
de aminoácidos o nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos y
nucleótidos pueden ser evaluadas manualmente por un experto en la
técnica, o utilizando las herramientas de comparación e
identificación de secuencias por ordenador que emplean algoritmos
tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et
al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; véase
también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, es necesaria una
secuencia de diez o más aminoácidos o treinta o más nucleótidos
contiguos para identificar supuestamente una secuencia de
polipéptido o ácido nucleico como homóloga para una proteína o gen
conocidos. Por otra parte, con respecto a las secuencias de
nucleótidos, se pueden utilizar sondas oligonucleotídicas
específicas del gen que comprenden: 30 o más nucleótidos contiguos
en métodos de identificación de genes dependientes de la secuencia
(p. ej., hibridación Southern) y aislamiento (p. ej., en la
hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de
bacteriófagos). Además, se pueden utilizar oligonucleótidos cortos
de 12 o más nucleótidos como cebadores de amplificación en la PCR
con el fin de obtener un fragmento de ácido nucleico concreto que
comprenda los cebadores. Por consiguiente, una "porción
sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una
secuencia de nucleótidos que proporcionará la identificación y/o el
aislamiento específicos de un fragmento de ácido nucleico que
comprenda la secuencia. La presente memoria ilustra secuencias de
aminoácidos y nucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden
una o más proteínas vegetales concretas. El experto en la técnica,
que tiene la ventaja de las secuencias referidas en la presente
memoria, puede utilizar ahora toda o una porción sustancial de las
secuencias descritas para los fines conocidos por los expertos en
esta técnica. Por consiguiente, la presente invención comprende las
secuencias completas referidas en la Lista de Secuencias adjunta,
así como porciones sustanciales de aquellas secuencias definidas
antes.
La "degeneración de codones" hace
referencia a la divergencia en el código genético que permite la
variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia
de aminoácidos de un polipéptido codificado. Por consiguiente, la
presente invención hace referencia a cualquiera fragmento de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
todas o una parte sustancial de las secuencias de aminoácidos
mostradas en la presente memoria. El experto está al tanto de la
"preferencia codónica" mostrada por una célula anfitriona
específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un
aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un fragmento de
ácido nucleico para su expresión mejorada en una célula anfitriona,
es deseable diseñar el fragmento de ácido nucleico de manera que su
frecuencia en el uso de codones se aproxime a la frecuencia del uso
de codones preferido de la célula anfitriona.
Los "fragmentos de ácido nucleico
sintéticos" se pueden ensamblar a partir de elementos esenciales
oligonucleotídicos que son sintetizados químicamente utilizando
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos
elementos esenciales se ligan y se hibridan para formar fragmentos
de ácido nucleico más grandes que después se pueden ensamblar
enzimáticamente para construir el fragmento de ácido nucleico
completo deseado. "Sintetizado químicamente", por lo que se
refiere a un fragmento de ácido nucleico, significa que los
nucleótidos componentes fueron ensamblados in vitro. La
síntesis química manual de los fragmentos de ácido nucleico se puede
completar utilizado procedimientos bien establecidos, o se puede
realizar la síntesis química automatizada utilizando una de las
numerosas máquinas disponibles en el mercado. Por consiguiente, los
fragmentos de ácido nucleico se pueden adaptar para una expresión
génica óptima basándose en la optimización de la secuencia de
nucleótidos para reflejar la preferencia codónica de la célula
anfitriona. El experto en la técnica aprecia la probabilidad de un
expresión génica acertada si hay una tendencia al uso de codones
favorecidos por el anfitrión. La determinación de los codones
preferidos puede basarse en un examen de los genes derivados de la
célula anfitriona cuando la información de la secuencia se
encuentra disponible.
"Gen" hace referencia a un fragmento de
ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo
secuencias reguladoras anteriores (secuencias 5' no codificadoras)
y siguientes (secuencias 3' no codificadoras) a la secuencia
codificadora. "Gen nativo" hace referencia a un gen según se
encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.
"Gen quimérico" hace referencia a cualquier gen que no es un
gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras
que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un
gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias
codificadoras que derivan de diferentes fuentes, o secuencias
reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente,
pero dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en la
naturaleza. "Gen endógeno" hace referencia a un gen nativo en
su localización natural en el genoma de un organismo. Un "gen
foráneo" hace referencia a un gen que no se encuentra
normalmente en el organismo anfitrión, si no que es introducido en
el organismo anfitrión mediante transferencia génica. Los genes
foráneos pueden comprender genes nativos insertado en un organismo
no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha
sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de
transformación.
"Secuencia codificadora" hace referencia a
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
aminoácidos específica. Las "secuencias reguladoras" hacen
referencia a secuencias de nucleótidos localizadas aguas arriba
(secuencias no codificadoras 5'), en, o aguas abajo (secuencias no
codificadoras 3') de una secuencia codificadora, y que influyen en
la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la
traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias
reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de la
traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de la
poliadenilación.
"Promotor" hace referencia a una secuencia
de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia
codificadora o un ARN funcional. En general, una secuencia
codificadora está localizada 3' con respecto a una secuencia
promotora. La secuencia promotora consiste en elementos aguas arriba
proximales y más distales, los últimos elementos a menudo son
referidos como intensificadores. Por consiguiente, un
"intensificador" es una secuencia de nucleótidos que puede
estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato
del promotor o un elemento heterólogo insertado para intensificar el
nivel o la especificidad por un tejido de un promotor. Los
promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, pueden
estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes
promotores encontrados en la naturaleza, o pueden incluso comprender
segmentos de nucleótidos sintéticos. Los expertos en la técnica
entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de
un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes
fases de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones
medioambientales. Los promotores que hacen que un fragmento de ácido
nucleico sea expresado en la mayoría de los tipos celulares la
mayoría de las veces son referidos comúnmente como "promotores
constitutivos". Constantemente se están descubriendo nuevos
promotores de diversos tipos útiles en células vegetales; se pueden
encontrar numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg
(1989) Biochemistry de Plants 15:1-82.
Adicionalmente se reconoce que puesto que en la mayoría de los casos
los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido
definidos completamente, los fragmentos de ácido nucleico de
diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora
idéntica.
"Secuencia líder de la traducción" hace
referencia a una secuencia de nucleótidos localizada entre la
secuencia del promotor de un gen y la secuencia codificadora. La
secuencia líder de la traducción está presente en el ARNm
completamente procesado aguas arriba de la secuencia de inicio de la
traducción. La secuencia líder de la traducción puede afectar al
procesamiento del transcrito primario hasta ARNm, a la estabilidad
del ARNm o a la eficacia de traducción. Los ejemplos de las
secuencias líder de la traducción han sido descritos (Turner y
Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236).
Las "secuencias no codificadoras 3'" hacen
referencia a secuencias de nucleótidos localizadas aguas abajo de
una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento
de la poliadenilación y otras secuencias que codifican señales
reguladoras capaces de afectar a la maduración del ARNm o a la
expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza
normalmente por afectar a la adición de tramos de ácido
poliadenílico al extremo 3' del precursor del ARNm. El uso de
secuencias no codificadoras 3' diferentes es ilustrado por
Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell
1:671-680.
"Transcrito de ARN" hace referencia al
producto resultante de la transcripción catalizada por ARN
polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es
una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, éste es
referido como transcrito primario o puede ser una secuencia de ARN
derivada del procesamiento post-transcripcional del
transcrito primario y es referido como ARN maduro. "ARN mensajero
(ARNm)" hace referencia al ARN que no tiene intrones y que puede
ser traducido a polipéptidos por la célula. "ADNc" hace
referencia a un ADN que es complementario a y derivado de un molde
de ARNm. El ADNc puede ser de hebra sencilla o puede ser convertido
en una forma de doble hebra utilizando, por ejemplo, el fragmento de
Klenow de la ADN polimerasa I. "ARN efector" hace referencia a
un transcrito de ARN que incluye el ARNm y por lo tanto puede ser
traducido a polipéptido por la célula. "ARN antisentido" hace
referencia a un transcrito de ARN que es complementario a todo o a
una parte de un transcrito primario o ARNm diana y que bloquea la
expresión de un gen diana (véase la Patente de los Estados Unidos
Núm. 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede
ser con cualquier parte de la secuencia de nucleótidos específica,
esto es, la secuencia no codificadora 5', la secuencia no
codificadora 3', los intrones, o la secuencia codificadora. "ARN
funcional" hace referencia a ARN efector, ARN antisentido, ARN
de ribozima, o otro ARN que no puede ser traducido pero todavía
tiene un efecto sobre los procedimientos celulares.
El término "conectado operablemente" hace
referencia a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico
en un único polinucleótido de manera que la función de uno resulta
afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está conectado
operablemente con una secuencia codificadora cuando es capaz de
afectar a la expresión de esa secuencia codificadora (esto es, que
la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del
promotor). Las secuencias codificadoras pueden estar conectadas
operablemente en orientación efectora o antisentido.
El término "expresión", según se utiliza en
la presente memoria, hace referencia a la transcripción y a la
acumulación estable de ARN efector (ARNm) o antisentido derivado del
fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también
puede hacer referencia a la traducción de ARNm a un polipéptido.
"Inhibición antisentido" hace referencia a la producción de
transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de
la proteína diana. "Expresión excesiva" hace referencia a la
producción de un producto génico en organismos transgénicos que
supera los niveles de producción en organismos normales o no
transformados. "Co-supresión" hace referencia
a la producción de transcritos de ARN efectores capaces de suprimir
la expresión de genes foráneos o endógenos idénticos o
sustancialmente similares (Patente de los Estados Unidos Núm.
5.231.020).
Una "proteína" o "polipéptido" es una
cadena de aminoácidos dispuestos en un orden específico determinado
por la secuencia codificadora del polinucleótido que codifica el
polipéptido. Cada proteína o polipéptido tiene una función
única.
"Niveles alterados" o "expresión
alterada" hace referencia a la producción de productos génicos en
organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren
de la de los organismos normales o no transformados.
"Mutante nulo" hace referencia a una célula
anfitriona que o bien carece de la expresión de un cierto
polipéptido o bien expresa un polipéptido que es inactivo o no
tiene ninguna función enzimática esperada detectable.
"Proteína madura" o el término
"maduro" cuando se utiliza al describir una proteína hace
referencia a un polipéptido procesado
post-traduccionalmente; esto es, uno del cual se ha
separado cualquiera de los pre- o propéptidos presentes en el
producto de traducción primario. "Proteína precursora" o el
término "precursor" cuando se utiliza al describir una
proteína hace referencia al producto primario de la traducción del
ARNm; esto es, con pre- y propéptidos todavía presentes. Los pre- y
propéptidos pueden ser, pero no están limitados a señales de
localización intracelular.
Un "péptido de tránsito a cloroplasto" es
una secuencia de aminoácidos que es traducida junto con una proteína
y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos
presentes en la célula en la cual se elabora la proteína.
"Secuencia de tránsito a cloroplasto" hace referencia a una
secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito a
cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos
que es traducida junto con una proteína y dirige la proteína al
sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant
Mol. Biol. 42:21-53). Si la proteína va a ser
dirigida a una vacuola, se puede añadir además una señal de
redireccionamiento vacuolar (supra), o si va a ser dirigida
al retículo endoplásmico, se puede añadir una señal de retención
del retículo endoplásmico (supra). Si la proteína se va a
dirigir al núcleo, se debe separar cualquier péptido señal presente
e incluir en su lugar una señal de localización nuclear (Raikhel
(1992) Plant Phys. 100:1627-1632).
"Transformación" hace referencia a la
transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un
organismo anfitrión, dando como resultado una herencia
genéticamente estable. Los organismos anfitriones que contienen los
fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como
organismos "transgénicos". Los ejemplos de los métodos de
transformación de plantas incluyen la transformación mediada por
Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol.
143:277) y la tecnología de transformación de "pistola génica"
o acelerada por partículas (Klein et al. (1987) Nature
(Londres) 327:70-73; Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.945.050). De este modo, los polinucleótidos aislados de la
presente invención pueden ser incorporados a constructos
recombinantes, típicamente constructos de ADN, susceptibles de
introducción o replicación en una célula anfitriona. Semejante
constructo puede ser un vector que incluye un sistema de replicación
y secuencias que son susceptibles de transcripción y traducción de
una secuencia codificadora de un polipéptido en una célula
anfitriona dada. Se han descrito numerosos vectores adecuados para
la transfección estable de células vegetales o para el
establecimiento de plantas transgénicas, p. ej., Pouwels et
al., en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987;
Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic
Press, 1989; y Flevin et al., Plant Molecular Biology
Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores
de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes
vegetales clonados bajo el control transcripcional de secuencias
reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Tales
vectores de expresión en plantas también pueden contener una región
reguladora del promotor (p. ej., una región reguladora que controla
la expresión inducible o constitutiva, regulada medioambientalmente
o evolutivamente, o específica de una célula o tejido), un sitio de
inicio para el comienzo de la transcripción, un sitio de unión al
ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de
terminación de la transcripción, y/o una señal de
poliadenilación.
Las técnicas de ADN recombinante y de clonación
molecular convencionales utilizadas en la presente memoria son bien
conocidas en la técnica y son descritas más completamente por
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold
Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (en
adelante "Maniatis").
La "PCR" o "reacción en cadena de la
polimerasa" es bien conocida por los expertos en la técnica como
mecanismo para la amplificación de segmentos de ADN específicos
(Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195 y 4.800.159).
Se han aislado fragmentos de ácido nucleico que
codifican al menos una porción de varias proteínas de la
reproducción y se han identificado mediante comparación de
secuencias de ADNc vegetal al azar con bases de datos públicas que
contienen secuencias de nucleótidos y proteínas utilizando los
algoritmos BLAST bien conocidos por los expertos en la técnica. Los
fragmentos de ácido nucleico de la presente invención se pueden
utilizar para aislar ADNc y genes que codifican proteínas homólogas
de la misma especie vegetal o de otra. El aislamiento de genes
homólogos utilizando protocolos dependientes de la secuencia es bien
conocido en la técnica. Los ejemplos de los protocolos dependientes
de la secuencia incluyen, pero no están limitados a, métodos de
hibridación de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ADN
y ARN como se ilustra por medio de diversos usos de tecnologías de
amplificación de ácidos nucleicos (p. ej., reacción en cadena de la
polimerasa, reacción en cadena de la ligasa).
Por ejemplo, los genes que codifican otras
proteínas del endospermo independientes de la fertilización, ya sea
en forma de ADNc o de ADN genómico, podrían ser aislados
directamente utilizando todos o una porción de los presentes
fragmentos de ácido nucleico en forma de sondas de hibridación de
ADN para escrutar las genotecas de cualquier planta deseada
empleando metodología bien conocida por los expertos en la técnica.
Las sondas oligonucleotídicas específicas basadas en las presentes
secuencias de ácido nucleico pueden ser diseñadas y sintetizadas
mediante métodos conocidos en la técnica (Maniatis). Por otra parte,
se puede utilizar una secuencia completa directamente para
sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por el experto
en la técnica tales como el marcaje de ADN con cebador al azar, el
traslado de muescas, las técnicas de marcaje de los extremos, o
sondas de ARN utilizando los sistemas de transcripción in
vitro disponibles. Además, se pueden diseñar cebadores
específicos y utilizarlos para amplificar una parte o todas las
presentes secuencias. Los productos resultantes de la amplificación
pueden ser marcados directamente durante las reacciones de
amplificación o marcados después de las reacciones de
amplificación, y utilizados como sondas para aislar fragmentos de
ADNc o genómicos completos en condiciones de restricción
apropiadas.
Además, se pueden utilizar dos segmentos cortos
de los presentes fragmentos de ácido nucleico en protocolos de
reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de
ácido nucleico más largos que codifican genes homólogos a partir de
ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también se puede
realizar en una genoteca de fragmentos de ácido nucleico clonados
donde la secuencia de un cebador deriva de los presentes fragmentos
de ácido nucleico, y la secuencia del otro cebador saca provecho de
la presencia de tramos de ácido poliadenílico hacia el extremo 3'
del precursor de ARNm que codifica los genes de la planta.
Alternativamente, la segunda secuencia cebadora puede estar basada
en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el
experto en la técnica puede seguir el protocolo RACE (Frohman et
al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA
85:8998-9002) para generar ADNc utilizando la PCR
para amplificar copias de la región entre un único punto del
transcrito y el extremo 3' o 5'. Los cebadores orientados en las
direcciones 3' y 5' pueden ser diseñados a partir de las presentes
secuencias. Utilizando los sistemas RACE 3' o RACE 5' (BRL)
disponibles en el mercado, se pueden aislar fragmentos de ADNc 3' o
5' específicos (Ohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA
86:5673-5677; Loh et al. (1989) Science
243:217-220). Los productos generados por los
procedimientos RACE 3' y 5' se pueden combinar para generar ADNc
completos (Frohman y Martin (1989) Techniques 1:165). Por
consiguiente, se puede utilizar un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos de al menos uno de 60 (preferiblemente uno
de al menos 40, muy preferiblemente uno de al menos 30) nucleótidos
contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos seleccionada
del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 29 y 39, y el
complemento de tales secuencias de nucleótidos en tales métodos
para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción
sustancial de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido.
La presente invención se refiere a un método de
obtención de un fragmento de ácido nucleico que codifica una
porción sustancial de un polipéptido del endospermo independiente de
la fertilización, preferiblemente una porción sustancial de un
polipéptido del endospermo independiente de la fertilización de una
planta, que comprende las etapas de: sintetizar un cebador
oligonucleotídico que comprende una secuencia de nucleótidos de al
menos uno de 60 (preferiblemente al menos uno de 40, muy
preferiblemente al menos uno de 30) nucleótidos contiguos derivada
de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste
en los SEQ ID NO: 1, 29 y 39, y el complemento de tales secuencias
de nucleótidos; y amplificar un fragmento de ácido nucleico
(preferiblemente un ADNc insertado en un vector de clonación)
utilizando el cebador oligonucleotídico. El fragmento de ácido
nucleico amplificado codificará preferiblemente una porción de un
polipéptido del endospermo independiente de la fertilización.
La disponibilidad del presente nucleótido y de
las secuencias de aminoácidos deducidas facilita el escrutinio
inmunológico de las genotecas de expresión del ADNc. Se pueden
sintetizar péptidos sintéticos que representan porciones de las
presentes secuencias de aminoácidos. Estos péptidos se pueden
utilizar para inmunizar animales para producir anticuerpos
policlonales o monoclonales con especificidad para los péptidos o
proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos. Estos
anticuerpos se pueden utilizar después para escrutar genotecas de
expresión de ADNc para aislar clones de ADNc completos de interés
(Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1-34;
Maniatis).
En otra realización, esta invención se refiere a
virus y células anfitrionas que comprenden o bien los genes
quiméricos de la invención descritos en la presente memoria o bien
un polinucleótido aislado de la invención descrito en la presente
memoria. Los ejemplos de las células anfitrionas que se pueden
utilizar para poner en práctica la invención incluyen, pero no
están limitados a, levaduras, bacterias, y plantas.
Como se ha observado antes, los fragmentos de
ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para
crear plantas transgénicas en las cuales se encuentran presentes los
polipéptidos descritos a niveles superiores o inferiores a los
normales o en tipos de células o fases de desarrollo en los que no
se encuentran normalmente. Esto tendría el efecto de alterar la
formación de endospermo en esas células.
La expresión en exceso de las proteínas de la
presente invención se puede completar construyendo primero un gen
quimérico en el cual la región codificadora está conectada
operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen
en los tejidos deseados en la fase de desarrollo deseada. El gen
quimérico puede comprender secuencias promotoras y secuencias líder
de la traducción derivadas de los mismos genes. También se pueden
proporcionar secuencias no codificadoras 3' que codifican señales de
terminación de la transcripción. El presente gen quimérico también
puede comprender uno o más intrones con el fin de facilitar la
expresión génica.
Se pueden construir vectores plasmídicos que
comprenden el presente polinucleótido aislado (o gen quimérico). La
elección del vector plasmídico depende del método que se utilice
para transformar las plantas anfitrionas. El experto en la técnica
estará al tanto de los elementos genéticos que deben estar presentes
en el vector plasmídico con el fin de transformar, seleccionar y
propagar con éxito las células anfitrionas que contienen el gen
quimérico. El experto en la técnica también reconocerá que
diferentes eventos de transformación independientes darán como
resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et
al. (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et
al. (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), y de
este modo que se pueden escrutar múltiples eventos con el fin de
obtener líneas que presenten el nivel y patrón de expresión deseado.
Semejante escrutinio puede ser completado mediante análisis
Southern del ADN, análisis Northern de la expresión del ARNm,
análisis Western de la expresión de la proteína, o análisis
fenotípico.
Para algunas aplicaciones puede ser útil dirigir
los presentes polipéptidos a diferentes compartimentos celulares, o
facilitar su secreción desde la célula. De este modo se prevé que se
pueda añadir al gen quimérico descrito antes un suplemento
adicional dirigiendo la secuencia codificadora para codificar los
presentes polipéptidos con secuencias de redireccionamiento
intracelulares apropiadas tales como secuencias de tránsito
(Keegstra (1989) Cell 56:247-253), secuencias señal
o secuencias que codifican la localización en el retículo
endoplásmico (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol.
Biol. 42:21-53), o señales de localización nuclear
(Raikhel (1992) Plant Phys.100:1627-1632) con o sin
separar secuencias de redireccionamiento que ya están presentes. Si
bien las referencias citadas proporcionan ejemplos de estas, la
lista no es exhaustiva y en el futuro se pueden descubrir más
señales de redireccionamiento para su uso.
También puede ser deseable reducir o eliminar la
expresión de genes que codifican los presentes polipéptidos en
plantas para algunas aplicaciones. Con el fin de completar esto, se
puede construir un gen quimérico diseñado para la
co-supresión del presente polipéptido conectando un
gen o fragmento génico que codifica ese polipéptido a secuencias
promotoras de la planta. Alternativamente, se puede construir un gen
quimérico diseñado para expresar ARN antisentido para todo o parte
del presente fragmento de ácido nucleico conectando el gen o
fragmento génico en orientación inversa a las secuencias promotoras
de la planta. Los genes quiméricos de co-supresión
o antisentido podrían ser introducidos en las plantas por medio de
transformación donde la expresión de los correspondientes genes
endógenos es reducida o eliminada.
Las soluciones de la genética molecular a la
generación de plantas con la expresión génica alterada tienen una
decidida ventaja sobre los enfoques de mejoramiento genético de
plantas más tradicionales. Los cambios en los fenotipos de las
plantas se pueden producir inhibiendo específicamente la expresión
de uno o más genes mediante inhibición antisentido o
co-supresión (Patentes de los Estados Unidos Núms.
5.190.931, 5.107.065 y 5.283.323). Un constructo antisentido o de
co-supresión actuaría como un regulador negativo
dominante de la actividad génica. Si bien las mutaciones
convencionales pueden producir una regulación negativa de la
actividad génica, estos efectos son muy probablemente recesivos. La
regulación negativa dominante disponible con un enfoque transgénico
puede ser ventajosa desde la perspectiva del mejoramiento genético.
Además, la capacidad para restringir la expresión de un fenotipo
específico a los tejidos reproductores de la planta mediante el uso
de promotores específicos de los tejidos puede conferir ventajas
agronómicas con respecto a las mutaciones convencionales que pueden
tener efecto en todos los tejidos en los que se expresa normalmente
un gen mutante.
El experto en la técnica sabrá qué
consideraciones especiales están asociadas con el uso de tecnologías
antisentido o de co-supresión con el fin de reducir
la expresión de genes concretos. Por ejemplo, el nivel apropiado de
expresión de los genes efectores o antisentido puede requerir el uso
de diferentes genes quiméricos utilizando diferentes elementos
reguladores conocidos por los expertos en la técnica. Una vez que se
obtienen plantas transgénicas por medio de uno de los métodos
descritos antes, será necesario escrutar los transgénicos
individuales en cuanto a aquellos que presentan más eficazmente el
fenotipo deseado. Por consiguiente, el experto en la técnica
desarrollará métodos para escrutar un gran número de transformantes.
La naturaleza de estos escrutinios se elegirá generalmente en el
terreno práctico. Por ejemplo, se puede escrutar buscando cambios en
la expresión génica utilizando anticuerpos específicos para la
proteína codificada por el gen que está siendo suprimido, o se
pueden establecer análisis que midan específicamente la actividad
enzimática. Un método preferido será el que permita tratar
rápidamente un gran número de muestras, puesto que se esperará que
un gran número de transformantes sea negativo para el fenotipo
deseado.
Los presentes polipéptidos (o porciones de los
mismos) pueden ser producidos en células anfitrionas heterólogas,
concretamente en células de anfitriones microbianos, y pueden ser
utilizados para preparar anticuerpos para estas proteínas mediante
métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los
anticuerpos son útiles para detectar los polipéptidos de la
presente invención in situ en células o in vitro en
extractos de células. Las células anfitrionas heterólogas
preferidas para la producción de los presentes polipéptidos son los
anfitriones microbianos. Los sistemas de expresión microbianos y los
vectores de expresión que contienen las secuencias reguladoras que
dirigen el elevado nivel de expresión de las proteínas foráneas son
bien conocidos por los expertos en la técnica. Se podría utilizar
cualquiera de estos para construir un gen quimérico para la
producción de los presentes polipéptidos. Este gen quimérico podría
ser introducido en microorganismos apropiados por medio de
transformación para proporcionar un elevado nivel de expresión de
las proteínas de la reproducción codificadas. Un ejemplo de un
vector para un elevado nivel de expresión de los presentes
polipéptidos en un anfitrión bacteriano se proporciona en el
(Ejemplo 6).
También se pueden utilizar todos o una porción
sustancial de los polinucleótidos de la presente invención como
sondas para mapear genéticamente y físicamente los genes que son
parte y se utilizan como marcadores para los rasgos ligados a esos
genes. Semejante información puede ser útil en el mejoramiento
genético de plantas con el fin de desarrollar líneas con fenotipos
deseados. Por ejemplo, se pueden utilizar los presentes fragmentos
de ácido nucleico como marcadores de los polimorfismos en la
longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Se pueden sondear
las transferencias Southern (Maniatis) de ADN genómico de plantas
digerido con enzimas de restricción con los fragmentos de ácido
nucleico de la presente invención. Los patrones de bandas
resultantes se pueden someter después a análisis genéticos
utilizando programas de ordenador tales como MapMaker (Lander et
al. (1987) Genomics 1:174-181) con el fin de
construir un mapa genético. Además, los fragmentos de ácido
nucleico de la presente invención se pueden utilizar para sondear
transferencias Southern que contienen ADN genómicos tratados con
endonucleasas de restricción de un grupo de individuos que
representan los parentales y la progenie de un cruce genético
definido. La segregación de los polimorfismos de ADN se observa y se
utiliza para calcular la posición de la presente secuencia de ácido
nucleico en el mapa genético obtenido previamente utilizando esta
población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet.
32:314-331).
La producción y uso de sondas derivadas de genes
vegetales para su utilización en el mapeo genético es descrita por
Bematzky y Tanksley (1986) en Plant Mol. Biol. Reporter
4:37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo
genético de clones de ADNc específicos utilizando la metodología
esbozada antes o variaciones de la misma. Por ejemplo, se pueden
utilizar las poblaciones de entrecruzamiento F2, las poblaciones de
retrocruzamiento, las poblaciones cruzadas al azar, las líneas
isogénicas próximas, y otros grupos de individuos para el mapeo.
Tales metodologías son bien conocidas por los expertos en la
técnica.
También se pueden utilizar sondas de ácido
nucleico derivadas de las presentes secuencias de ácido nucleico
para el mapeo físico (esto es, situación de secuencias sobre mapas
físicos; véase Hoheisel et al. En: Nonmammalian Genomic
Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, págs.
319-346, y referencias allí citadas).
En otra realización, se pueden utilizar sondas
de ácido nucleico derivadas de las presentes secuencias de ácido
nucleico en el mapeo de hibridación fluorescente in situ
directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet.
7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo
FISH favorecen el uso de clones grandes (de varios a varios cientos
de KB; véase Laan et al. (1995) Genome Res.
5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden
permitir el funcionamiento del mapeo FISH utilizando sondas más
cortas.
Se pueden llevar a cabo una variedad de métodos
basados en la amplificación de ácidos nucleicos de mapeo genético
y físico empleando las presentes secuencias de ácido nucleico. Los
ejemplos incluyen la amplificación alelo-específica
(Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), el
polimorfismo de los fragmentos amplificados mediante PCR (CAPS;
Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332),
la ligación alelo-específica (Landegren et
al. (1988) Science 241:1077-1080), las reacción
de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res.
18:3671), el Mapeo Híbrido por Radiación (Walter et al.
(1997) Nat. Genet. 7:22-28) Happy Mapping (Dear y
Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807).
Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un fragmento de
ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su
uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de
cebadores. El diseño de tales cebadores es bien conocido para los
expertos en la técnica. En los métodos que emplean el mapeo
genético basado en la PCR, puede ser necesario identificar las
diferencias en la secuencia de ADN entre los parentales del cruce
del mapeo en la región correspondiente a la presente secuencia de
ácido nucleico. No obstante, esto no es necesario generalmente para
los métodos de mapeo.
La pérdida de fenotipos con función mutante
puede ser identificada para los presentes clones de ADNc o bien
mediante protocolos de desorganización de genes elegidos como diana
o bien mediante identificación de mutantes específicos para estos
genes contenidos en una población de maíz que porta mutaciones en
todos los genes posibles (Ballinger y Benzer (1989) Proc. Natl.
Acad Sci USA 86:9402-9406; Koes et al. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:8149-8153; Bensen
et al. (1995) Plant Cell 7:75-84). El último
enfoque se puede completar de dos maneras. Primero, se pueden
utilizar segmentos cortos de los presentes fragmentos de ácido
nucleico en protocolos de reacción en cadena de la polimerasa junto
con un cebador de la secuencia etiqueta de la mutación en los ADN
preparados a partir de una población de plantas en las cuales se han
introducido transposones Mutator o algún otro elemento de ADN
causante de mutación (véase Bensen, supra). La amplificación
de un fragmento de ADN específico con estos cebadores indica la
inserción del elemento etiqueta de la mutación en o cerca del gen
de la planta que codifica los presentes polipéptidos.
Alternativamente, se puede utilizar el presente fragmento de ácido
nucleico como sonda de hibridación frente a los productos de
amplificación por PCR generados de la población con la mutación
utilizando el cebador con la secuencia etiqueta de la mutación junto
con un cebador arbitrario del sitio genómico, tal como el de un
adaptador sintético anclado al sitio de la enzima de restricción.
Con cualquier método, se puede identificar y obtener una planta que
contiene una mutación en el gen endógeno que codifica los presentes
polipéptidos. Después se puede utilizar esta planta mutante para
determinar o confirmar la función natural de los presentes
polipéptidos descritos en la presente memoria.
La presente invención se define adicionalmente
en los siguientes Ejemplos, en los que las partes y los porcentajes
son en peso y grados Celsius, a menos que se establezca de otro
modo. Se debe entender que estos Ejemplos, si bien indican las
realizaciones preferidas de la invención, se dan solamente a modo de
ilustración. A partir del estudio anterior y de estos Ejemplos, un
experto en la técnica puede averiguar las características esenciales
de esta invención, y sin apartarse del espíritu y el alcance de la
misma, puede realizar diversos cambios y modificaciones en la
invención para adaptarla a diversos usos y condiciones.
De este modo, las diversas modificaciones de la
invención además de aquellas mostradas en la presente memoria serán
evidentes para el experto en la técnica a partir de la descripción
anterior. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La descripción de cada referencia mostrada en la
presente memoria se incorpora en la presente memoria como
referencia en su totalidad.
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Ejemplo
I
Se prepararon genotecas de ADNc que representan
ARNm de diversos tejidos de catalpa, maíz, eucalipto, arroz, soja,
girasol y trigo. Las características de las genotecas se describen
más abajo.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden preparar genotecas de ADNc por medio
de uno cualquiera de los muchos métodos disponibles. Por ejemplo,
los ADNc se pueden introducir en vectores plasmídicos preparando
primero las genotecas de ADNc en vectores Uni-ZAP®
XR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning
Systems, La Jolla, CA). Las genotecas Uni-ZAP® XR
se convirtieron en genotecas plasmídicas de acuerdo con el protocolo
proporcionado por Stratagene. Tras la conversión, los insertos de
ADNc estarán contenidos en el vector plasmídico pBluescript. Además,
se pueden introducir los ADNc directamente en vectores Bluescript
II SK(+) precortados (Stratagene) utilizando ADN ligasa de T4 (New
England Biolabs), seguido de transfección en células DH10B de
acuerdo con el protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products). Una
vez que los insertos de ADNc están en vectores plasmídicos, se
preparan ADN plasmídicos a partir de colonias bacterianas escogidas
al azar que contienen plásmidos pBluescript recombinantes, o las
secuencias de ADNc insertadas se amplifican por medio de la reacción
en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos para
las secuencias del vector que flanquean las secuencias de ADNc
insertadas. Los ADN insertados amplificados o los ADN plasmídicos
se secuencian en reacciones de secuenciación mediante colorantes
acoplados al cebador para generar secuencias de ADNc parciales
(etiquetas de secuencia expresada o "EST"; véase Adams et
al., (1991) Science 252:1651-1656). Las EST
resultantes se analizan utilizando un secuenciador fluorescente
Perkin Elmer Modelo 377.
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Ejemplo
2
Se identificaron los clones de ADNc que
codificaban las proteínas de la reproducción realizando BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol.
Biol. 215:403-410; véase también
www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/searches para la similitud de las secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones de CDS de GenBank no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, la principal publicación reciente de la base se datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT, bases de datos EMBL, y DDBJ). Las secuencias de ADNc obtenidas en el Ejemplo 1 se analizaron en cuanto a la similitud con todas las secuencias de ADN disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Las secuencias de ADN fueron traducidas en todos los marcos de lectura y comparadas en cuanto a su similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) proporcionado por el NCBI. Por conveniencia, el valor de P (probabilidad) de la observación de un emparejamiento de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos investigadas por casualidad calculado por BLAST es referido en la presente memoria como valores "pLog", lo que representa el negativo del logaritmo del valor P referido. Por consiguiente, a mayor valor de pLog, mayor probabilidad de que la secuencia del ADNc y, el "éxito" de BLAST representen proteínas homólogas.
BLAST/searches para la similitud de las secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones de CDS de GenBank no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, la principal publicación reciente de la base se datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT, bases de datos EMBL, y DDBJ). Las secuencias de ADNc obtenidas en el Ejemplo 1 se analizaron en cuanto a la similitud con todas las secuencias de ADN disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Las secuencias de ADN fueron traducidas en todos los marcos de lectura y comparadas en cuanto a su similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) proporcionado por el NCBI. Por conveniencia, el valor de P (probabilidad) de la observación de un emparejamiento de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos investigadas por casualidad calculado por BLAST es referido en la presente memoria como valores "pLog", lo que representa el negativo del logaritmo del valor P referido. Por consiguiente, a mayor valor de pLog, mayor probabilidad de que la secuencia del ADNc y, el "éxito" de BLAST representen proteínas homólogas.
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Ejemplo
3
La búsqueda BLASTX utilizando secuencias EST de
los clones enumerados en la Tabla 3 reveló la similitud de los
polipéptidos codificados por los ADNc con la proteína del endospermo
independiente de la fertilización de Arabidopsis thaliana
NCBI Identificador Núm. gi 4567095). En la Tabla 3 se muestran los
resultados de BLAST para las EST individuales ("EST"), las
secuencias de los insertos de ADNc completos que comprenden los
clones de ADNc indicados ("FIS"), las secuencias de los
cóntigos ensamblados de dos o más EST ("Cóntigo"), las
secuencias de los cóntigos ensamblados a partir de FIS y una o más
EST ("Cóntigo*"), o las secuencias que codifican una proteína
completa derivada de un FIS, un cóntigo, o un FIS y PCR
("CGS"):
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se determinó la secuencia del inserto de ADNc
completo de los clones enumerados en la Tabla 3. La secuenciación y
la búsqueda adicionales de la base de datos patentada por DuPont
permitieron la identificación de otros clones de maíz, arroz, soja,
y/o trigo que codificaban proteínas del endospermo independientes de
la fertilización. La búsqueda BLASTX utilizando las secuencias EST
de los clones enumerados en la Tabla 4 reveló una similitud de los
polipéptidos codificados por los ADNc de la proteína del endospermo
independiente de la fertilización de Arabidopsis thaliana
NCBI Identificador Núm. gi 4567095). En la Tabla 4 se muestran los
resultados de BLAST para las EST individuales ("EST"), las
secuencias de los insertos de ADNc completos que comprenden los
clones de ADNc indicados ("FIS"), las secuencias de los
cóntigos ensamblados a partir de dos más EST ("Cóntigo"), las
secuencias de cóntigos ensamblados a partir de una FIS y una o más
EST ("Cóntigo*"), o las secuencias que codifican la proteína
completa derivada de una FIS, un cóntigo, o una FIS y PCR
("CGS"):
\newpage
Los datos de la Tabla 5 representan un cálculo
del porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos
mostradas en los SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24, 26, 28; 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56,
58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70 la secuencia de Arabidopsis
thaliana.
Los cálculos de los alineamientos de secuencia y
el porcentaje de identidad se realizaron utilizando el programa
Megalign del paquete de computación bioinformática LASERGENE
(DNASTAR Inc., Madison, WI). Se realizaron múltiples alineamientos
de las secuencias utilizando el método de alineamiento Clustal
(Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los
parámetros por defecto (PENALIZACIÓN DEL ESPACIO=10, LONGITUD DEL
ESPACIO=10). Los parámetros por defecto para los alineamientos por
pares utilizando el método Clustal fueron KTUPLE 1, PENALIZACIÓN DEL
ESPACIO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5. Los alineamientos de
secuencia y las puntuaciones y probabilidades BLAST indican que los
fragmentos de ácido nucleico que comprende los presentes clones de
ADNc codifican una porción sustancial de una proteína del
endospermo independiente de la fertilización. Estas secuencias
representan las primeras secuencias de Catalpa, eucalipto,
maíz, arroz, soja, girasol y trigo que codifican proteínas del
endospermo independientes de la fertilización conocidas por el
Solicitante.
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Ejemplo
4
Se puede construir un gen quimérico que
comprende un ADNc que codifica los presentes polipéptidos en
orientación efectora con respecto al promotor de zeína de 27 kD de
maíz que está localizado 5' con respecto al fragmento de ADNc, y el
extremo 3' de zeína de 10 kD que está localizado 3' con respecto al
fragmento de ADNc. El fragmento de ADNc de este gen puede ser
generado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del clon
de ADNc utilizando cebadores oligonucleotídicos apropiados. Se
pueden incorporar sitios de clonación (NcoI o SmaI) en los
oligonucleótidos para proporcionar la orientación apropiada del
fragmento de ADN cuando se inserta en el vector pML103 digerido
como se describe más abajo. La amplificación se realiza después en
una PCR convencional. El ADN amplificado se digiere después con las
enzimas de restricción NcoI y SmaI y se fracciona sobre gel de
agarosa. Se puede aislar la banda apropiada del gel y combinarla con
un fragmento NcoI-SmaI de 4,9 kb del plásmido
pML103. El plásmido pML103 ha sido depositado bajo los términos del
Tratado de Budapest en la ATCC (Colección de Cultivos Tipo
Americana, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110-2209), y tiene el número de acceso ATCC
97366. El segmento de ADN de pML103 contiene un fragmento del
promotor SalI-NcoI de 1,05 kb del gen de la zeína
de 27 kD de maíz y un fragmento SmaI-SalI de 0,96 kD
desde el extremo 3' del gen de zeína de 10 kD de maíz en el vector
pGem9Zf(+) (Promega). El ADN del vector y del inserto se pueden
ligar a 15ºC durante la noche, esencialmente como se ha descrito
(Maniatis). El ADN ligado se puede utilizar después para
transformar E. coli XL1-Blue
(Epicurian Coli XL-1 Blue®; Stratagene). Se pueden
escrutar los transformantes bacterianos mediante digestión con
enzimas de restricción del ADN plasmídico y análisis de la secuencia
de nucleótidos limitado utilizando el método de terminación de la
cadena didesoxi (Sequenase® DNA Sequencing Kit; U.S. Biochemical).
El constructo plasmídico resultante podría comprender un gen
quimérico que codificara, en dirección 5' a 3', el promotor de
zeína de 27 kD de maíz, un fragmento de ADNc que codificara los
presentes polipéptidos; y la región 3' de la zeína de 10 kD.
El gen quimérico descrito antes puede ser
introducido después en células de maíz mediante el siguiente
procedimiento. Se pueden diseccionar embriones de maíz inmaduros de
cariópsides en desarrollo derivados de cruces de las líneas de maíz
engendradas por endogamia H99 y LH132. Los embriones se aíslan 10 a
11 días después de la polinización cuando tienen 1,0 a 1,5 mm de
longitud. Después se colocan los embriones con el lado axial hacia
abajo y en contacto con medio N6 solidificado con agarosa (Chu
et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18:659-668).
Los embriones se mantienen en la oscuridad a 27ºC. Los callos
embriogénicos desmenuzables que consisten en masas no diferenciadas
de células portadas sobre estructuras suspensoras proliferan desde
el escutelo de estos embriones inmaduros. Los callos embriogénicos
aislados del explante primario pueden ser cultivados en medio N6 y
subcultivados en este medio cada 2 a 3 semanas.
El plásmido, p35S/Ac (obtenido del Dr. Peter
Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) puede ser utilizado en
experimentos de transformación con el fin de proporcionar un
marcador seleccionable. Este plásmido contiene el gen Pat
(véase la Publicación de Patente Europea 0.242.236) que codifica la
fosfinotricin acetil transferasa (PAT). La enzima PAT confiere
resistencia a los inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas
tales como la fosfinotricina. El gen pat de p35S/Ac está
bajo el control del promotor 35S del Virus del Mosaico de la
Coliflor (Odell et al. (1985) Nature
313:810-812) y la región 3' del gen de la nopalina
sintasa del ADN-T del plásmido Ti de
Agrobacterium tumefaciens.
Se puede utilizar el método del bombardeo de
partículas (Klein et al. (1987) Nature
327:70-73) para transferir genes a las células del
cultivos de callos. De acuerdo con este método, se recubren
partículas de oro (1 \mum de diámetro) con ADN utilizando la
siguiente técnica. Después se añaden 10 \mug de ADN plasmídicos a
50 \muL de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mL). Se
añaden a las partículas cloruro de calcio (50 \muL de una
solución 2,5 M) y base sin espermidina (20 \muL de una solución
1,0 M). La suspensión se somete a vórtice durante la adición de
estas soluciones. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugan
brevemente (5 seg a 15.000 rpm) y el sobrenadante se separa. Las
partículas se resuspenden en 200 \mul de etanol absoluto, se
centrifugan de nuevo y el sobrenadante se separa. Se realiza de
nuevo un enjuagado con etanol y las partículas se resuspenden en un
volumen final de 30 \mul de etanol. Se puede colocar una alícuota
(5 \muL) de las partículas de oro recubiertas con ADN en el centro
de un disco volador de Klapton® (Bio-Rad Labs). Las
partículas son aceleradas después en el tejido de maíz con un
Biolistic® PDS-1000/He (Bio-Rad
Instruments, Hercules CA), utilizando una presión de helio de 70,32
kg/cm^{2}, una distancia de espacio de 0,5 cm y una distancia de
vuelo de 1,0 cm.
Para el bombardeo, el tejido embriogénico se
coloca sobre papel de filtro en medio N6 solidificado con agarosa.
El tejido se dispone en un césped fino y se cubre una zona circular
de aproximadamente 5 cm de diámetro. La placa de petri que contiene
el tejido se puede colocar en la cámara de
PDS-1000/He a aproximadamente 8 cm de la pantalla
de parada. El aire de la cámara se evacúa después a un vacío de
71,12 cm de Hg. El macroportador se acelera con una onda de choque
de helio utilizando una membrana de ruptura que explota cuando la
presión de He del tubo de choque alcanza 70,32 kg/cm^{2}.
Siete días después del bombardeo el tejido se
puede transferir a medio N6 que contiene glufosinato (2 mg por
litro) y carece de caseína o prolina. El tejido continúa creciendo
lentamente en este medio. Después de 2 semanas más el tejido se
puede transferir a medio N6 de nueva aportación que contiene
glufosinato. Al cabo de 6 semanas se pueden identificar zonas de
aproximadamente 1 cm de diámetro de callos creciendo activamente en
algunas de las placas que contienen el medio con un suplemento de
glufosinato. Estos callos pueden continuar creciendo cuando se
subcultivan en medio selectivo.
Se pueden regenerar plantas a partir de callo
transgénico transfiriendo primero agrupaciones de tejido a medio N6
con un suplemento de 0,2 mg por litro de 2,4-D.
Después de dos semanas el tejido se puede transferir a medio de
regeneración (Fromm et al. (1990) Bio/Techonology
8:833-839).
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Ejemplo
5
Se puede utilizar una casete de expresión
específica de la semilla compuesta por el promotor y el terminador
de la transcripción del gen que codifica la subunidad \beta de la
proteína de almacenamiento de la semilla faseolina de la judía
Phaseolus vulgaris (Doyle et al. (1986) J. Biol: Chem.
261:9228-9238) para la expresión de los presentes
polipéptidos en soja transformada. La casete de faseolina incluye
aproximadamente 500 nucleótidos aguas arriba (5') del codón de
inicio de la traducción y aproximadamente 1.650 nucleótidos aguas
abajo (3') del codón de terminación de la traducción de faseolina.
Entre las regiones 5' y 3' están los únicos sitios para las
endonucleasas de restricción NcoI (que incluye el codón de inicio de
la traducción ATG), SmaI, Kpn I y Xba I. La casete completa está
flanqueada por sitios Hind III.
El fragmento de ADNc de este gen puede ser
generado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del
clon de ADNc utilizando los cebadores oligonucleotídicos apropiados.
Se pueden incorporar sitios de clonación en los oligonucleótidos
para proporcionar la orientación apropiada del fragmento de ADN
cuando se inserta en el vector de expresión. Después se realiza la
amplificación como se ha descrito antes, y el fragmento aislado se
inserta en un vector pUC 18 que porta la casete de expresión de la
semilla.
Después se pueden transformar embriones de soja
con el vector de expresión que comprende las secuencias que
codifican los presentes polipéptidos. Para inducir embriones
somáticos, se pueden cultivar cotiledones, 3-5 mm
de longitud seccionados de semillas inmaduras, de superficie
esterilizada del cultivar A2872 de soja, en luz u oscuridad a 26ºC
sobre un medio de agar apropiado durante 6-10
semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios
se escinden después y se colocan en un medio líquido adecuado. Tras
la selección repetida de agrupaciones de embriones somáticos que se
multiplicaban en forma de embriones en fase globular, tempranos, se
mantienen las suspensiones como se describe más abajo.
Se pueden mantener cultivos embriogénicos de
soja en suspensión en 35 mL de medio líquido en un aparato de
sacudimiento giratorio, 150 rpm, a 26ºC con luces fluorescentes con
un programa de día/noche de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan
cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 25 mL
de medio líquido.
Después se pueden transformar los cultivos
embriogénicos de soja en suspensión mediante el método del bombardeo
con pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature
(Londres) 327:70-73, Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.945.050). Se puede utilizar un aparato Biolistic® PDS1000/HE
de DuPont (con retroajuste de helio) para estas
transformaciones.
Un gen marcador seleccionable que se puede
utilizar para facilitar la transformación de la soja es un gen
quimérico compuesto por el promotor 35S del Virus del Mosaico de la
Coliflor (Odell et al. (1985) Nature
313:810-812), el gen de la higromicin
fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli;
Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188) y la
región 3' del gen de la nopalina sintetasa del ADN-T
del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. La casete de
expresión de semillas que comprende la región 5' de la faseolina, el
fragmento que codifica los presentes polipéptidos y la región 3' de
la faseolina se puede aislar en forma de un fragmento de
restricción. Este fragmento se puede insertar después en un sitio
de restricción único del vector que porta el gen marcador.
A 50 \mul de una suspensión de 60 mg/mL de
partículas de oro de 1 \mum se añaden (por orden): 5 \muL de
ADN (1 \mug/\muL), 20 \mul de espermidina (0,1 M), y 50 \muL
de CaCl_{2} (2,5 M). La preparación de partículas se agita
después durante tres minutos, se centrifuga en una microcentrífuga
durante 10 segundos y se separa el sobrenadante. Las partículas
recubiertas de ADN se lavan después una vez en 400 \muL de etanol
del 70% y se resuspenden en 40 \muL de etanol anhidro. La
suspensión de ADN/partículas se puede someter a sonicación tres
veces durante un segundo cada vez. Después se cargan 5 \muL de las
partículas de oro recubiertas de ADN en cada disco
macroportador.
Aproximadamente 300-400 mg de un
cultivo en suspensión de dos semanas se colocan en una placa de
petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual se separa del tejido
con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se
bombardean normalmente alrededor de 5-10 placas de
tejido. La presión de ruptura de la membrana se ajusta a 77,31
kg/cm^{2} y la cámara se evacúa a un vacío de 0,96 kg/cm^{2}. El
tejido se coloca a aproximadamente 76,2 mm de la pantalla de
retención y se bombardea tres veces. Tras el bombardeo, el tejido se
puede dividir por la mitad y colocar de nuevo en líquido y
cultivarlo como se ha descrito antes.
Cinco a siete días después del bombardeo, se
puede cambiar el medio líquido por medio de nueva aportación, y
once a doce días después del bombardeo con medio de nueva aportación
que contiene 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo puede
ser renovado semanalmente. Siete a ocho semanas después del
bombardeo, se puede observar tejido transformado, verde creciendo
de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El
tejido verde aislado se separa y se inocula en matraces individuales
para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos
transformados, propagados clónicamente. Cada nueva línea se puede
tratar como un evento de transformación independiente. Estas
suspensiones se pueden subcultivar después y mantener en forma de
agrupaciones de embriones inmaduros o se pueden regenerar en
plantas completas mediante maduración y germinación de embriones
somáticos individuales.
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Ejemplo
6
Los ADNc que codifican los presentes
polipéptidos pueden ser insertados en el vector de expresión en
E. coli pBT430 de T7. Este vector es un derivado de
pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene
56:125-135) que emplea el sistema ARN polimerasa
del bacteriófago T7/promotor de T7. El plásmido pBT430 fue
construido destruyendo primero los sitios EcoR I y Hind III de
pET-3a en sus posiciones originales. Se insertó un
adaptador oligonucleotídico que contenía los sitios EcoRI y HindIII
en el sitio BamHI de pET-3a. Esto creó
pET-3aM con sitios de clonación únicos adicionales
para la inserción de genes en el vector de expresión. Después, se
convirtió el sitio NdeI de la posición de inicio de la traducción
en un sitio NcoI utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. La
secuencia de ADN de pET-3aM en esta región,
5'-CATATGG, se convirtió en
5'-CCCATGG en pBT430.
El ADN plasmídico que contiene un ADNc puede ser
apropiadamente digerido para liberar un fragmento de ácido nucleico
que codifica la proteína. Este fragmento puede ser purificado
después en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1%. El
tampón y la agarosa contienen 10 \mug/ml de bromuro de etidio para
la visualización del fragmento de ADN. El fragmento se puede
purificar después del gel de agarosa mediante digestión con GELase®
(Epicentre Technologies, Madison, WI) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, se precipita con etanol, se seca y se
resuspende en 20 \muL de agua. Se pueden ligar adaptadores
oligonucleotídicos apropiados al fragmento utilizando ADN ligasa de
T4 (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA). El fragmento que
contiene los adaptadores ligados puede ser purificado del exceso de
adaptadores utilizando agarosa de bajo punto de fusión como se ha
descrito antes. El vector pBT430 es digerido, desfosforilado con
fosfatasa alcalina (NEB) y desproteinizado con fenol/cloroformo
como se ha descrito antes. El vector pBT430 y el fragmento
preparados se pueden ligar después a 16ºC durante 15 horas mediante
transformación en células electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL). Se
pueden seleccionar los transformantes sobre placas de agar que
contienen medio LB y 100 \mug/mL de ampicilina. Los
transformantes que contienen el gen que codifica los presentes
polipéptidos se escrutan después en cuanto a la correcta
orientación con respecto al promotor de T7 mediante análisis con
enzimas de restricción.
Para la expresión de elevado nivel, se puede
transformar un clon plasmídico con el inserto de ADNc en la
orientación correcta con respecto al promotor de T7 en la cepa BL21
de E. coli (DE3) (Studier et al. (1986) J.
Mol. Biol. 189:113-130). Los cultivos se desarrollan
en medio LB que contiene ampicilina (100 mg/L) a 25ºC. A una
densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 1, se puede añadir IPTG
(isopropiltio-\beta-galactósido,
el inductor) a una concentración final de 0,4 mM y se puede
continuar la incubación durante 3 horas a 25ºC. Después se cosechan
las células mediante centrifugación y se resuspenden en 50 \muL de
Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 que contiene DTT 0,1 mM y
fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM. Se puede añadir una pequeña
cantidad de cuentas de vidrio de 1 mm y someter la mezcla a
sonicación 3 veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con
una sonda de ultrasonido Microprobe. La mezcla se centrifuga y se
determina la concentración de proteína del sobrenadante. Se puede
separar un \mug de proteína de la fracción soluble del cultivo
mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida. Se pueden observar en los geles
bandas de proteína que migran al peso molecular esperado.
<110> E.I. du Pont de Nemours and
Company
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<120> Proteínas de Reproducción de
Plantas
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<130> BB1388 PCT
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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<150> 60/151,575
\hskip1cm1999-08-31
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Microsoft Office 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1643
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 348
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<212> ADN
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<213> Zea mays
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 1749
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Zea mays
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<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<210> 7
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<211> 765
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<212> ADN
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<213> Zea mays
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<400> 7
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 155
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<212> PRT
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<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
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<211> 1626
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<212> ADN
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<213> Eucalyptus grandis
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<400> 9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 372
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<212> PRT
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<213> Eucalyptus grandis
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 620
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<212> ADN
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<213> Helianthus sp.
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<400> 11
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<211> 125
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<212> PRT
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<213> Helianthus sp.
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<400> 12
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<212> ADN
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<213> Catalpa speciosa
\newpage
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<211> 370
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<212> PRT
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<213> Catalpa speciosa
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<211> 831
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<212> ADN
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<213> Zea mays
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (578)
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<220>
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<221> incierto
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<222> (611)
\newpage
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (630)
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<220>
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<221> incierto
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<222> (641)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (660)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (682)
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<220>
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<221> incierto
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<222> (685)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (703)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (743)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (752)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (761)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (784)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (794)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (802)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (825)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1486
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
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<212> ADN
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<213> Zea mays
\newpage
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<400> 21
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 65
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<212> PRT
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<213> Zea mays
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<400> 22
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 1763
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<212> ADN
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<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 430
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
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<211> 1803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1729)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (1752)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (1760)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (1765)
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<400> 25
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
\newpage
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<400> 26
\newpage
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Zea mays
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<400> 27
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 461
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<212> PRT
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<213> Zea mays
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<400> 28
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1686
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<212> ADN
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<213> Zea mays
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<400> 29
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 595
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
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<400> 31
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
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<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (839)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (279)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (475)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (488)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
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<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (454)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (462)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (471)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 460
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucalyptus grandis
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (319)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (331)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (355)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (387)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (426)..(427)..(428)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (437)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (447)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
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<222> (451)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucalyptus grandis
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helianthus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (390)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (517)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (519)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helianthus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (87)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 658
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Catalpa speciosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (367)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (445)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (456)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (483)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (492)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (509)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (549)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (554)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (563)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (579)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (584)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (602)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (611)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (648)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (657)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Catalpa speciosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 631
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (466)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (564)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (601)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (603)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (607)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (597)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (611)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (639)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (657)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (681)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (692)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (699)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (702)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (710)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (718)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (798)..(749)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (753)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (772)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (305)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (441)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (145)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (369)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (447)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (203)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (270)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (223)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (259)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (263)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (267)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (288)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (385)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (390)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (428)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (432)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (434)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (297)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (323)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (351)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (354)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (390)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (404)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (427)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (450)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (473)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (481)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (486)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 513
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (364)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (452)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (480)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (499)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (121)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 534
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (350)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (366)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (429)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (440)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (469)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (476)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (493)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (496)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (511)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (555)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (562)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4735
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5878)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5975)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene el efecto de alterar la formación de
endospermo, que comprende al menos 250 aminoácidos, donde:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido y el SEQ ID NO: 2 tienen una identidad de al menos 80% basándose en el método de alineamiento Clustal; o
- (b)
- la secuencia de nucleótidos del polinucleótido y el SEQ ID NO: 1 tienen una identidad de al menos 80% basándose en el método de alineamiento Clustal.
2. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, donde:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido y el SEQ ID NO: 2 tienen una identidad de al menos 85% basándose en el método de alineamiento Clustal; o
- (b)
- la secuencia de nucleótidos y el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 29 tienen una identidad del al menos 85% basándose en el método de alineamiento Clustal.
3. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, donde:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido y el SEQ ID NO: 2 tienen una identidad de al menos 95% basándose en el método de alineamiento Clustal; o
- (b)
- la secuencia de nucleótidos y el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 29 tienen una identidad de al menos 95% basándose en el método de alineamiento Clustal.
4. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, donde el polipéptido comprende el SEQ ID NO:
2.
5. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, que comprende el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO:
29.
6. El polinucleótido aislado de una cualquiera
de las Reivindicaciones 1-5, donde el polipéptido es
una proteína del endospermo independiente de la fertilización.
7. El complemento del polinucleótido de
cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, donde el
complemento y el polinucleótido contienen el mismo número de
nucleótidos y son complementarios en 100%.
8. Un método de transformación de una célula que
comprende introducir el polinucleótido de una cualquiera de las
Reivindicaciones 1-5 en una célula.
9. Un método de transformación de una célula que
comprende introducir el complemento de la reivindicación 7 en una
célula.
10. Un método de la reivindicación 8 o 9, donde
dicha célula es una célula vegetal.
11. Un método de la reivindicación 10, donde
dicha célula vegetal es una célula de una planta
monocotiledónea.
12. Un método de la reivindicación 10, donde
dicha célula vegetal es una célula de una planta dicotiledónea.
13. El polipéptido aislado codificado por el
polinucleótido de cualquiera de las Reivindicaciones
1-6.
14. Un polipéptido de la reivindicación 13 que
es una proteína del Endospermo independiente de la
fertilización.
15. Un gen quimérico en el que el polinucleótido
de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 está
conectado operablemente a un promotor.
16. Un vector plasmídico que comprende un
polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones
1-6 o un gen quimérico de la Reivindicación 15.
17. Un vector de expresión en plantas que
comprende un polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 bajo el control
transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador
seleccionable dominante.
18. Una célula anfitriona que comprende un
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones
1-6 o un gen quimérico de la Reivindicación 15.
19. Una célula anfitriona de la reivindicación
18 que es una célula vegetal.
20. Una célula vegetal anfitriona de la
reivindicación 19 que es:
- (a)
- una célula de una planta monocotiledónea; o
- (b)
- una célula de una planta dicotiledónea.
21. Un método para transformar una planta
anfitriona que comprende la transferencia de un polinucleótido de
una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 a dicha
planta anfitriona, dando como resultado una herencia estable.
22. Un método de la reivindicación 21 donde
dicha planta es:
- (a)
- una monocotiledónea; o
- (b)
- una dicotiledónea.
23. Una planta transgénica transformada
establemente con un polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6.
24. Una planta transgénica de la reivindicación
23 en la cual está presente un polipéptido de la Reivindicación 13
o 14 a niveles superiores a los normales o en tipos celulares o
fases del desarrollo en los cuales no se encuentra normalmente; y
donde dicho polipéptido tiene un efecto de alteración de la
formación de endospermo.
25. Una planta en la cual la expresión de un gen
endógeno que codifica un polipéptido definido en la reivindicación
13 o 14 es reducida o eliminada, de manera que dicho polipéptido
está presente a niveles inferiores a los normales y la formación de
endospermo es alterada; donde dicha reducción o eliminación es por
medio de inhibición anti-sentido o
co-supresión.
26. Una planta de la reivindicación 24 o 25 que
es una planta monocotiledónea.
27. Una planta de la reivindicación 24 o 25 que
es una planta dicotiledónea.
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