ES2312418T3 - Polipeptido inductor de apoptosis. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido reconstruido que se une a la proteína asociada a integrina (IAP), induce apoptosis de células sanguíneas nucleadas y no produce hemaglutinación, en el que el polipéptido reconstruido comprende dos regiones V de la cadena H y dos regiones V de la cadena L de un anticuerpo que se une a la IAP e induce apoptosis de células sanguíneas nucleadas, y en el que el polipéptido reconstruido es un dímero de un Fv de cadena sencilla que comprende una región V de la cadena H y una región V de la cadena L o un polipéptido de cadena sencilla que comprende dos regiones V de la cadena H y dos regiones V de la cadena L.
Description
Polipéptido inductor de apoptosis.
Esta invención se refiere a un polipéptido
reconstruido con una propiedad de inducir la apoptosis de células
sanguíneas nucleadas que tienen la proteína asociada a integrina
(IAP) y no causar hemaglutinación. Más específicamente, la presente
invención se refiere al polipéptido reconstruido que comprende dos o
más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L
de un anticuerpo monoclonal que induce la apoptosis de células
sanguíneas nucleadas que tienen IAP. Los polipéptidos reconstruidos
son útiles como un agente terapéutico para la discrasia sanguínea
tal como la leucemia.
La solicitud de patente japonesa
9-67499 describe la preparación de un anticuerpo
monoclonal específico usando una línea de células estromales
esplénicas como un antígeno sensibilizador dirigido al desarrollo de
anticuerpos específicos que pueden reconocer las células estromales
esplénicas mencionadas, y la preparación de nuevos anticuerpos
monoclonales que reconocen la proteína asociada a integrina de ratón
(IAP de ratón) como un antígeno. La solicitud japonesa
9-67499 también describe que los anticuerpos
monoclonales son capaces de inducir apoptosis de células
mieloides.
El documento WO 99/12973 describe anticuerpos
monoclonales cuyo antígeno es la proteína asociada a integrina
humana (en lo sucesivo denominada IAP humana; su secuencia de
aminoácidos y secuencia de nucleótidos están descritas en J.
Cell Biol., 123, 485-496, 1993; véase también
Journal of Cell Science, 108, 3419-3425,
1995) y que son capaces de inducir la apoptosis de células
sanguíneas nucleadas humanas (célula mieloide y linfocito) que
tienen dicha IAP humana. Estos anticuerpos monoclonales se denominan
anticuerpo MABL-1 y anticuerpo
MABL-2, y los hibridomas que producen estos
anticuerpos también se denominan MABL-1 (FERM
BP-6100) y MABL-2 (FERM
BP-6101), respectivamente.
La solicitud de patente japonesa
11-63557 describe la preparación de Fv de cadena
sencilla que tienen regiones de Fv de cadena sencilla de los
anticuerpos monoclonales cuyo antígeno es la IAP humana. Los Fv de
cadena sencilla pueden inducir la apoptosis de células sanguíneas
nucleadas que tienen IAP humana.
El anticuerpo monoclonal que reconoce la IAP
como un antígeno induce la apoptosis de células sanguíneas nucleadas
que tienen IAP humana, pero también produce hemaglutinación in
vitro. Esto indica que la administración de una gran cantidad
del anticuerpo monoclonal que reconoce la IAP como un antígeno,
puede dar como resultado un efecto secundario como la
hemaglutinación.
Un objeto de esta invención es proporcionar
polipéptidos reconstruidos con propiedad mejorada de inducción de
la apoptosis de células sanguíneas nucleadas que tienen la proteína
asociada a integrina (IAP) y con la propiedad de causar
hemaglutinación reducida o completamente eliminada. Otro objeto de
la presente invención es proporcionar agentes terapéuticos para la
discrasia sanguínea, que comprenden la sustancia antes obtenida que
induce la apoptosis de células sanguíneas nucleadas que tienen la
proteína asociada a integrina (IAP).
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
los polipéptidos reconstruidos que se unen a la proteína asociada a
integrina (IAP), inducen la apoptosis de células sanguíneas
nucleadas que tienen IAP y no producen hemaglutinación.
La invención también se refiere a los
polipéptidos reconstruidos, anticuerpos reformados.
El anticuerpo reformado puede incluir cualquier
polipéptido reconstruido que comprenda una región V de la cadena L
y una región V de la cadena H derivadas de un anticuerpo monoclonal,
p. ej. el anticuerpo MABL-1, el anticuerpo
MABL-2 o similares, que induce la apoptosis de
células sanguíneas nucleadas que tienen IAP, preferiblemente IAP
humana, cuyo polipéptido induce la apoptosis de células sanguíneas
nucleadas que tienen IAP, preferiblemente IAP humana y no produce
hemaglutinación. Además, la presente invención también incluye
polipéptidos reconstruidos en los que una secuencia de aminoácidos
de la región V está parcialmente alterada.
La presente invención también se refiere a la
humanización del polipéptido reconstruido. El polipéptido
reconstruido humanizado comprende una región V de la cadena L
humanizada y/o una región V de la cadena H humanizada.
Específicamente, el polipéptido humanizado de la invención consiste
en la región V de la cadena L humanizada que comprende una región
marco (FR) derivada de una región V de la cadena L del anticuerpo
monoclonal humano y una CDR derivada de una región V de la cadena L
de anticuerpo monoclonal de ratón y/o la región V de la cadena H
humanizada que comprende una FR derivada de una región V de la
cadena H de anticuerpo monoclonal humano y una CDR derivada de una
región V de la cadena H de anticuerpo monoclonal de ratón. En este
caso, las secuencias de aminoácidos de la FR o CDR pueden estar
parcialmente alteradas, p. ej., eliminadas, sustituidas o
añadidas.
Además, la presente invención se refiere a
polipéptidos reconstruidos que pueden inducir apoptosis de células
sanguíneas nucleadas que tienen IAP humana, cuyos polipéptidos
comprenden una región C de la cadena L de anticuerpos humanos y una
región V de la cadena L de anticuerpos monoclonales de ratón, y/o
una región C de la cadena H de anticuerpos humanos y una región V
de la cadena H de anticuerpos monoclonales de ratón.
La presente invención también se refiere a
polipéptidos reconstruidos que inducen la apoptosis de células
sanguíneas nucleadas que tienen IAP humana, cuyos polipéptidos
comprenden una CDR derivada de un anticuerpo monoclonal de otros
mamíferos distintos del ratón, tal como un ser humano, rata, animal
bovino, oveja o similares, que corresponde a la CDR de ratón
mencionada, o una región V de la cadena L y una región V de la
cadena H que contiene la CDR mencionada. Dichas CDR, regiones V de
la cadena L y regiones V de la cadena H pueden incluir CDR
derivadas de un anticuerpo monoclonal humano preparado a partir de,
por ejemplo, un ratón transgénico o similar, y regiones V de la
cadena L y regiones V de la cadena H derivadas de un anticuerpo
monoclonal humano que contiene la CDR mencionada.
La invención también se refiere a ADN que
codifican los diferentes polipéptidos reconstruidos mencionados
antes y a técnicas de ingeniería genética para producir vectores
recombinantes que comprenden los ADN.
La invención también se refiere a células
huésped transformadas con los vectores recombinantes. Los ejemplos
de células huésped son células de mamíferos tales como células
humanas, células de ratón o similares, y microorganismos tales como
E. coli, Bacillus subtilis, levaduras o similares.
La invención se refiere a un procedimiento para
producir los polipéptidos reconstruidos, que comprende cultivar los
huéspedes mencionados antes y extraer los polipéptidos reconstruidos
del cultivo de los mismos.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para producir un dímero del Fv de cadena sencilla,
que comprende cultivar células animales huésped que producen el Fv
de cadena sencilla en un medio sin suero para que segreguen el Fv
de cadena sencilla en el medio, y aislar el dímero de Fv de cadena
sencilla formado en el medio.
La presente invención se refiere a agentes
terapéuticos para la discrasia sanguínea que comprenden como un
principio activo el polipéptido reconstruido obtenido antes, que
induce la apoptosis de células sanguíneas nucleadas que tienen la
proteína asociada a integrina (IAP). Los agentes terapéuticos para
la discrasia sanguínea de la invención son útiles para el
tratamiento de la discrasia sanguínea, por ejemplo, leucemia tal
como leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia
linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, leucemia de
células T en adultos, mieloma múltiple, leucemia mixta y leucemia de
células pilosas, linfoma maligno (enfermedad de Hodgkin, linfoma de
no Hodgkin), anemia aplásica, síndrome mielodisplásico y policitemia
vera.
Los polipéptidos reconstruidos de la presente
invención preferiblemente comprenden dos regiones V de la cadena H
y dos regiones V de la cadena L derivadas de anticuerpos
monoclonales. La estructura de los polipéptidos reconstruidos puede
ser un dímero de Fv de cadena sencilla que comprende una región V de
la cadena H y una región V de la cadena L o un polipéptido que
comprende dos regiones V de la cadena H y dos regiones V de la
cadena L. En los polipéptidos reconstruidos de la invención, la
región V de la cadena H y la región V de la cadena L están
preferiblemente unidas por un conector peptídico que consiste en uno
o más aminoácidos. Los polipéptidos reconstruidos resultantes
contienen regiones variables de los anticuerpos originales y
retienen su región determinante de la complementaridad (CDR), y por
lo tanto se unen al antígeno con la misma especificidad que los
anticuerpos monoclonales originales.
En la presente invención, la región V de la
cadena H derivada del anticuerpo monoclonal puede ser la región V
de la cadena H del anticuerpo monoclonal que induce la apoptosis de
células sanguíneas nucleadas que tienen IAP o la región V de la
cadena H cuya secuencia de aminoácidos está parcialmente modificada,
preferiblemente la región V de la cadena H del anticuerpo
monoclonal que reconoce la IAP humana y que induce la apoptosis de
células sanguíneas nucleadas que tienen IAP o la región V de la
cadena H cuya secuencia de aminoácidos está parcialmente
modificada. Preferiblemente, es la región V de la cadena H derivada
del anticuerpo MABL-1 o el anticuerpo
MABL-2, o la región V de la cadena H en la que la
secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H está
parcialmente modificada. Más preferiblemente, es la región V de la
cadena H humanizada que comprende la FR de una región V de la
cadena H de anticuerpo monoclonal humano, y la CDR de la región V
de la cadena H de anticuerpo monoclonal de ratón. La región V de la
cadena H además puede ser una región V de la cadena H derivada de
un anticuerpo monoclonal humano que corresponde a la región V de la
cadena H mencionada del anticuerpo monoclonal de ratón, que se
puede producir por una técnica de recombinación. La región V de la
cadena H de la invención puede ser un fragmento de la región V de la
cadena H mencionada, cuyo fragmento conserva la capacidad de unión
al antígeno.
La región V de la cadena L de la presente
invención puede ser la región V de la cadena L del anticuerpo
monoclonal que induce la apoptosis de células sanguíneas nucleadas
que tienen IAP o la región V de la cadena L en la que la secuencia
de aminoácidos de la región V de la cadena L está parcialmente
modificada, preferiblemente la región V de la cadena L del
anticuerpo monoclonal que reconoce la IAP humana y que induce la
apoptosis de células sanguíneas nucleadas que tienen IAP o la
región V de la cadena L cuya secuencia de aminoácidos está
parcialmente modificada. Preferiblemente, es la región V de la
cadena L derivada del anticuerpo MABL-1 o el
anticuerpo MABL-2, o su región V de la cadena L cuya
secuencia de aminoácidos está parcialmente modificada. Más
preferiblemente, es la región V de la cadena L humanizada que
comprende la FR de una región V de la cadena L de anticuerpo
monoclonal humano, y la CDR de la región V de la cadena L de
anticuerpo monoclonal de ratón. Las regiones V de la cadena L
además pueden ser una región V de la cadena L derivada de anticuerpo
monoclonal humano que corresponde a la región V de la cadena L
mencionada del anticuerpo monoclonal de ratón, que se puede
producir por una técnica de recombinación. Las regiones V de la
cadena L de la invención pueden ser fragmentos de la región V de la
cadena L mencionada, cuyos fragmentos conservan la capacidad de
unión al antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada región V de la cadena L y la cadena H forma
un sitio de unión al antígeno. La región variable de las cadenas L
y H está compuesta de cuatro regiones marco comunes conservadas
comparativamente unidas a tres regiones hipervariables o regiones
determinantes de la complementaridad (Kabat, E.A. y col.,
"Sequences of Protein of Immunological Interest", US Dept.
Health and Human Services, 1983).
Las partes principales en las cuatro regiones
marco (FR) forman estructuras de lámina \beta y así tres CDR
forman un bucle. Las CDR pueden formar una parte de la estructura de
lámina \beta en determinados casos. Las tres CDR se mantienen en
posiciones estéricamente cercanas entre sí mediante las FR, que
contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno junto con
las tres CDR.
Estas CDR se pueden identificar comparando la
secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo obtenido con
las secuencias de aminoácidos de las regiones V de anticuerpos
conocidos de acuerdo con la norma empírica de Kabat E.A. y col.,
"Sequences of Protein of Immunological Interest".
\vskip1.000000\baselineskip
Un Fv de cadena sencilla es un monómero
polipéptido que comprende una región V de la cadena H y una región
V de la cadena L unidas entre sí, que derivan de anticuerpos
monoclonales. Los Fv de cadena sencilla resultantes contienen
regiones variables de los anticuerpos monoclonales originales y
conservan sus regiones determinantes de la complementaridad, y por
lo tanto los Fv de cadena sencilla se unen al antígeno con la misma
especificidad que la de los anticuerpos monoclonales originales
(solicitud japonesa 11-63557). Una parte de la
región variable y/o la CDR del Fv de cadena sencilla de la
invención o una parte de la secuencia de aminoácidos de las mismas
pueden estar parcialmente alterados, por ejemplo, eliminada,
sustituida o añadida. La región V de la cadena H y la región V de
la cadena L que componen el Fv de cadena sencilla de la invención se
han mencionado antes, y pueden estar unidas directamente o por un
conector, preferiblemente un conector peptídico. La constitución
del Fv de cadena sencilla puede ser [región V de la cadena
H]-[región V de la cadena L] o [región V de la cadena L]-[región V
de la cadena H]. En la presente invención, el Fv de cadena sencilla
puede formar un dímero, trímero o puede ser un tetrámero incluido
en el polipéptido reconstruido de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos reconstruidos de cadena
sencilla de la presente invención que comprenden dos o más regiones
V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L, comprenden
dos o más regiones V de la cadena H y regiones V de la cadena L,
como se ha mencionado antes. Cada región del péptido debe estar
dispuesta de modo que el polipéptido reconstruido de cadena
sencilla forme una estructura estérica específica, en concreto que
mimetice una estructura estérica formada por el dímero de Fv de
cadena sencilla. Por ejemplo, las regiones V están dispuestas
ordenadas de la siguiente forma:
[región V de la cadena H]-[región V de la cadena
L]-[región V de la cadena H]-[región V de la cadena L]; o
[región V de la cadena L]-[región V de la cadena
H]-[región V de la cadena L]-[región V de la cadena H];
en las que estas regiones están conectadas por
un conector peptídico, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta invención, los conectores para la
conexión entre la región V de la cadena H y la región V de la cadena
L puede ser cualquier conector peptídico que se pueda introducir
por un procedimiento de ingeniería genética o cualquier conector
químicamente sintetizado. Por ejemplo, se pueden usar los conectores
descritos en la bibliografía, p. ej., Protein Engineering,
9(3), 299-305, 1996. Los ejemplos de los
conectores peptídicos pueden incluir, por ejemplo:
en los que n es un número entero no
menor de 1. La longitud del conector peptídico está en el intervalo
de 1 a 15 aminoácidos, preferiblemente 2 a 12 aminoácidos, más
preferiblemente 3 a 10 aminoácidos. Se mencionan procedimientos
para introducir estos conectores en la explicación del ADN que
codifica el polipéptido reconstruido de la
invención.
Los conectores sintetizados químicamente, es
decir, los agentes químicos de reactividad cruzada, de acuerdo con
la invención pueden ser cualesquiera conectores usados de forma
convencional para la unión de péptidos. Los ejemplos de conectores
pueden incluir N-hidroxi-succinimida
(NHS), suberato de disuccinimidilo (DSS), bis(suberato de
sulfosuccinimidilo) (BS^{3}), ditiobis(propionato de
succinimidilo) (DSP), ditiobis(propionato de
sulfosuccinimidilo) (DTSSP),
etilenglicol-bis(succinato de succinimidilo)
(EGS), etilenglicol-bis(succinato de
sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS), tartrato de
disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo
(sulfo-DST),
bis[2-(succinimido-oxicarboniloxi)etil]sulfona
(BSOCOES),
bis[2-(sulfosuccinimido-oxicarboniloxi)etil]sulfona
(sulfo-BSOCOES) o similares. Estos están
disponibles en el comercio.
Para formar un dímero del Fv de cadena sencilla
se prefiere seleccionar un conector adecuado para que dimerice en
solución tal como un medio de cultivo, más de 20%, preferiblemente
más de 50%, más preferiblemente más de 80%, lo más preferiblemente
más de 90% del Fv de cadena sencilla producido en las células
huésped. Específicamente, se prefiere un conector compuesto de 2 a
12 aminoácidos, preferiblemente de 3 a 10 aminoácidos u otros
conectores que se correspondan con estos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos reconstruidos que se unen a
células con IAP humana se pueden obtener conectando una región V de
la cadena H y una región V de la cadena L derivadas de anticuerpos
monoclonales contra la IAP humana a través del conector mencionado.
Los ejemplos de Fv de cadena sencilla son MABL1-scFv
que comprende la región V de la cadena H y la región V de la cadena
L derivadas del anticuerpo MABL-1, y
MABL2-scFv que comprende la región V de la cadena H
y la región V de la cadena L derivadas del anticuerpo
MABL-2.
Para preparar el polipéptido reconstruido, se
puede unir un péptido señal al extremo N-terminal
del polipéptido si se desea que el polipéptido sea un péptido
secretorio. Se puede unir una secuencia de aminoácidos conocida
útil para la purificación del polipéptido tal como la secuencia
FLAG, para la purificación eficaz del polipéptido. El polipéptido
se puede purificar de forma eficaz con el anticuerpo
anti-FLAG.
Para preparar el polipéptido reconstruido de la
invención hay que obtener un ADN que codifica el polipéptido
reconstruido, es decir un ADN que codifica el Fv de cadena sencilla
o un ADN que codifica el monómero del polipéptido reconstruido.
Estos ADN se pueden obtener a partir de los ADN que codifican la
región V de la cadena H y la región V de la cadena L de
MABL1-scFv y/o MABL2-scFv. También
se pueden obtener por amplificación de una ADN que codifica la
secuencia de aminoácidos deseada dentro de la secuencia mencionada
por PCR usando el ADN como un molde y una pareja de cebadores
correspondientes a ambos extremos de la misma.
En el caso de que se desee que cada región V
tenga la secuencia de aminoácidos parcialmente modificada, las
regiones V en las que se modifican, es decir, eliminan, sustituyen o
añaden, uno o más aminoácidos, se pueden obtener por un
procedimiento conocido en la técnica usando la PCR. Una parte de la
secuencia de aminoácidos en la región V preferiblemente se modifica
por la PCR conocida en la técnica con el fin de preparar el
polipéptido reconstruido que sea suficientemente activo contra el
antígeno específico.
Para determinar los cebadores para la
amplificación por PCR, es necesario decidir el tipo de cadena H y
cadena L del anticuerpo MABL-1 y/o anticuerpo
MABL-2. Sin embargo, se ha publicado que el
anticuerpo MABL-1 tiene cadenas L de tipo \kappa
y cadenas H de tipo \gamma1 y el anticuerpo MABL-2
tiene cadenas L de tipo \kappa y cadenas H de tipo \gamma2a
(solicitud JP 11-63557). Para la amplificación por
PCR del ADN que codifica la cadena H y la cadena L del anticuerpo
MABL-1 y/o el anticuerpo MABL-2, se
pueden usar los cebadores descritos por Jones, S.T. y col.,
Bio/Technology, 9, 88-89, 1991.
Para amplificar las regiones V de la cadena L
del anticuerpo MABL-1 y el anticuerpo
MABL-2 usando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), los cebadores oligonucleótidos del extremo 5' y
extremo 3' se deciden como se ha mencionado antes. De la misma
forma, se deciden los cebadores oligonucleótidos del extremo 5' y
extremo 3' para la amplificación de las regiones V de la cadena H
del anticuerpo MABL-1 y anticuerpo
MABL-2.
En realizaciones de la invención se usan los
cebadores del extremo 5' que contienen una secuencia "GANTC"
que proporciona el sitio de digestión de la enzima de restricción
Hinf I en las proximidades de su extremo 5' y se usan los cebadores
del extremo 3' que contienen una secuencia de nucleótidos
"CCCGGG" que proporciona el sitio de digestión de XmaI en las
proximidades de su extremo 5'. Se pueden usar otros sitios de
digestión de enzimas de restricción en lugar de estos sitios,
siempre que se usen para la subclonación de un fragmento de ADN
deseado en un vector de clonación.
Se usan cebadores específicamente diseñados para
la PCR para que proporcionen las secuencias de nucleótidos
adecuadas en el extremo 5' y el extremo 3' de los ADNc que codifican
las regiones V de los anticuerpos MABL-1 y
MABL-2, de modo que los ADNc se insertan fácilmente
en el vector de expresión y funcionan adecuadamente en el vector de
expresión (p. ej., esta invención planea aumentar la eficacia de la
transcripción insertando la secuencia Kozak). Las regiones V de los
anticuerpos MABL-1 y MABL-2
obtenidas por amplificación por PCR usando estos cebadores se
insertan en el vector de expresión HEF que contiene la región C
humana deseada (véase el documento WO 92/19759). Los ADN clonados
se pueden secuenciar usando cualquier procedimiento convencional
que comprenda, por ejemplo, insertar los ADN en un vector adecuado y
después secuenciar usando un secuenciador de ADN automático
(Applied Biosystems).
Se puede introducir un conector tal como un
conector peptídico en el polipéptido reconstruido de la invención
de la siguiente forma. Se diseñan cebadores que tienen secuencia
parcialmente complementaria con los cebadores para las regiones V
de la cadena H y las regiones V de la cadena L descritas antes y que
codifican el extremo N-terminal y el extremo
C-terminal del conector. Después, se puede llevar a
cabo el procedimiento de la PCR usando estos cebadores para
preparar un ADN que codifica el conector peptídico que tiene la
secuencia y longitud de aminoácidos deseados. Los ADN que codifican
la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se pueden
conectar por el ADN resultante para producir el ADN que codifica el
polipéptido reconstruido de la invención que tiene el conector
peptídico deseado. Una vez que se ha preparado el ADN que codifica
uno de los polipéptidos reconstruidos, los ADN que codifican los
polipéptidos reconstruidos con o sin el conector peptídico deseado
se pueden producir fácilmente diseñando diferentes cebadores para el
conector y después llevando a cabo la PCR usando los cebadores y el
ADN mencionado como molde.
Cada región V del polipéptido reconstruido de la
presente invención se puede humanizar usando técnicas convencionales
(p. ej., Sato, K. y col., Cancer Res., 53,
851-856 (1993)). Una vez que se ha preparado un ADN
que codifica cada uno de los Fv humanizados, se puede producir
fácilmente un Fv de cadena sencilla humanizado, un fragmento del Fv
de cadena sencilla humanizado, un anticuerpo monoclonal humanizado y
un fragmento del anticuerpo monoclonal humanizado, de acuerdo con
procedimientos convencionales. Preferiblemente las secuencias de
aminoácidos de sus regiones V se pueden modificar parcialmente, si
es necesario.
Además, se puede producir un ADN derivado de
otro origen mamífero, por ejemplo, un ADN de ser humano, de la
misma forma usada para producir el ADN que codifica la región V de
la cadena H y la región V de la cadena L derivadas de ratón,
mencionada antes. El ADN resultante se puede usar para preparar una
región V de la cadena H y una región V de la cadena L de otro
mamífero, en especial de origen humano, un Fv de cadena sencilla
derivado de ser humano y un fragmento del mismo, y un anticuerpo
monoclonal de origen humano y un fragmento del
mismo.
mismo.
Como se ha mencionado antes, cuando se preparan
los ADN objetivo que codifican las regiones V de los polipéptidos
reconstruidos y las regiones V de los polipéptidos reconstruidos
humanizados, los vectores de expresión que los contienen y los
huéspedes transformados con los vectores se pueden obtener de
acuerdo con procedimientos convencionales. Además, los huéspedes se
pueden cultivar de acuerdo con un procedimiento convencional para
producir el Fv de cadena sencilla reconstruido, el Fv de cadena
sencilla humanizado reconstruido, los anticuerpos monoclonales
humanizados y los fragmentos de los mismos. Se pueden aislar de
células o un medio y se pueden purificar en una masa homogénea.
Para este propósito, se puede usar cualquier procedimiento de
aislamiento y purificación usados de forma convencional para
proteínas, p. ej., cromatografía, ultrafiltración, precipitación
por adición de sal y diálisis, si es necesario en combinación, sin
limitación.
Cuando el Fv de cadena sencilla reconstruido de
la presente invención se produce por cultivo de una célula animal
tal como células COS7 o células CHO, preferiblemente células CHO, en
un medio sin suero, el Fv de cadena sencilla reconstruido se hace
dimerizar eficazmente en el medio. El dímero del Fv de cadena
sencilla formado antes se puede aislar de forma estable y eficaz y
conservar durante un periodo de tiempo largo en la forma de dímero.
El medio sin suero usado en la invención puede ser cualquier medio
usado de forma convencional para la producción de una proteína
recombinante, sin limitación.
Para producir los polipéptidos reconstruidos que
se unen a células con IAP humana de la presente invención, se puede
usar cualquier sistema de expresión, por ejemplo, células
eucariotas, tales como células animales, p. ej., líneas de células
de mamífero establecidas, hongos filamentosos y levaduras, y células
procariotas tales como células bacterianas, p. ej. E. coli.
Preferiblemente, los polipéptidos reconstruidos de la invención se
expresan en células de mamíferos, por ejemplo células COS7 o células
CHO.
En estos casos, se pueden usar promotores
convencionales útiles para la expresión en células de mamíferos.
Preferiblemente, se usa el promotor temprano inmediato de
citomegalovirus humano (HCMV). Los vectores de expresión que
contienen el promotor de HCMV incluyen
HCMV-VH-HC\gamma 1,
HCMV-VL-HCK y similares que derivan
de pSV2neo (documento WO92/19759).
Además, otros promotores para la expresión de
genes en células de mamíferos que se pueden usar en la invención
incluyen promotores de virus derivados de retrovirus, poliomavirus,
adenovirus y virus de simio 40 (SV40) y promotores derivados de
mamíferos tales como el factor de elongación de la cadena
polipeptídica humano 1\alpha (HEF-1\alpha). El
promotor de SV40 se puede usar fácilmente de acuerdo con el
procedimiento de Mulligan, R.C., y col. (Nature 277,
108-114 (1979)) y el promotor de
HEF-1\alpha también se puede usar de acuerdo con
los procedimientos de Mizushima, S. y col. (Nucleic Acids
Research, 18, 5322 (1990)).
El origen de replicación (ori) que se puede usar
en la invención incluye el ori derivado de SV40, poliomavirus,
adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Para el
propósito de la amplificación del número de copias de genes en el
sistema de células huésped y similares, un vector de expresión puede
contener, como marcador de selección, el gen de la fosfotransferasa
(3') II o I (neo), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la
xantina-guanina fosforribosil transferasa de E.
coli (Ecogpt) o el gen de la dihidrofolato reductasa
(DHFR).
La actividad de unión al antígeno del
polipéptido reconstruido preparado antes, se puede evaluar usando la
capacidad inhibidora de la unión de los anticuerpos de ratón,
MABL-1 y MABL-2, a la IAP humana
como un índice. En concreto, la actividad se evalúa en términos de
la ausencia o presencia de inhibición de la unión del anticuerpo
MABL-2 de ratón al antígeno IAP humano como un
índice.
Más en detalle, se cultivan células animales
transformadas con un vector de expresión que contiene un ADN que
codifica el polipéptido reconstruido de la invención, p. ej.,
células COS7 o células CHO. Las células cultivadas y/o el líquido
sobrenadante del medio o el polipéptido reconstruido purificado de
los mismos, se usan para determinar la unión al antígeno. Como
control se usa un líquido sobrenadante del medio de cultivo en el
que se han cultivado células transformadas sólo con el vector de
expresión. Se añade una muestra de ensayo del polipéptido
reconstruido de la invención o el líquido sobrenadante del control a
la línea de células de leucemia de ratón, células L1210, que
expresan la proteína asociada a integrina (IAP) humana y después se
lleva a cabo un ensayo, tal como citometría de flujo, para evaluar
la actividad de unión al antígeno.
El efecto inductor de apoptosis in vitro
se evalúa de la siguiente forma: se añade una muestra de ensayo del
polipéptido reconstruido anterior a las células en las que se ha
introducido el gen de la IAP humana y se evalúa su capacidad de
inducción de muerte celular específica de IAP humana en las
células.
El efecto inductor de apoptosis in vivo
se evalúa de la siguiente forma: se prepara un moldeo de ratón de
mieloma humano. Se administra al ratón por vía intravenosa el
anticuerpo monoclonal o el polipéptido reconstruido de la invención
que induce apoptosis de células sanguíneas nucleadas que tienen IAP.
A los ratones de un grupo de control se les administra solo PBS. La
inducción de apoptosis se evalúa en términos de efecto antitumoral
basado en el cambio de contenido de IgG humana en el suero del ratón
y en su tiempo de supervivencia.
El efecto de hemaglutinación se ensaya de la
siguiente forma: se prepara una suspensión de eritrocitos de sangre
de donantes sanos. Se añaden muestras de ensayo de diferentes
concentraciones a la suspensión, y después se incuban para
determinar la hemaglutinación.
Los polipéptidos reconstruidos de la invención,
que comprenden dos o más regiones V de la cadena H y dos o más
regiones V de la cadena L, pueden ser un dímero, trímero o tetrámero
del Fv de cadena sencilla que comprende una región V de la cadena H
y una región V de la cadena L, o un polipéptido en el que dos o más
regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L
están conectadas. Se considera que debido a esta construcción, el
péptido imita la estructura tridimensional del sitio de unión al
antígeno del anticuerpo monoclonal original y por lo tanto retiene
una excelente propiedad de unión al antígeno.
El polipéptido de la invención tiene una
movilidad superior a los tejidos o tumores frente a la IgG entera y
un efecto secundario notablemente menor o no tiene efecto de
hemaglutinación. Por lo tanto, se espera que el péptido de la
invención se pueda usar como un agente terapéutico para la discrasia
sanguínea, por ejemplo, leucemia tal como leucemia mieloide aguda,
leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia
linfoblástica crónica, leucemia de células T en adultos, mieloma
múltiple, leucemia mixta y leucemia de células pilosas, linfoma
maligno (enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin), anemia
aplásica, osteomielodisplasia y policitemia vera. Se espera además
que el péptido de la invención se pueda usar como un agente de
contraste por marcaje RI. El efecto del péptido se puede potenciar
por unión de un compuesto RI o una toxina.
La presente invención se ilustrará concretamente
con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no limitan de
ninguna forma el alcance de la invención.
Para ilustrar el procedimiento de producción de
los polipéptidos reconstruidos de la invención, a continuación se
muestran ejemplos de producción de Fv de cadena sencilla. Se usaron
anticuerpos de ratón frente a IAP humana, MABL-1 y
MABL-2, en los ejemplos de producción de
polipéptidos reconstruidos. Los hibridomas MABL-1 y
MABL-2 que los producen respectivamente se
depositaron internacionalmente como FERM BP-6100 y
FERM BP-6101 en el Instituto Nacional de Biociencia
y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología,
Ministerio de Comercio Internacional e Industria
(1-3 Higasi 1-chome,
Tsukuba-shi, Iberaki.ken, Japón), un depositario
para microorganismos autorizado, el 11 de septiembre de 1997.
Los ADN que codifican las regiones variables de
los anticuerpos monoclonales de ratón frente a IAP humana,
MABL-1 y MABl-2, se clonaron como
sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ARNm de los hibridomas
MABL-1 y MABL-2 se obtuvieron usando
el kit de purificación de ARNm (Pharmacia Biotech).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc bicatenario se sintetizó a partir de
aproximadamente 1 \mug del ARNm usando el kit de amplificación de
ADNc Marathon (CLONTECH) y se unió un adaptador al mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
PCR, se llevó a cabo usando un ciclador térmico
(PERKIN ELMER).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores usados para el procedimiento de la
PCR son el cebador adaptador-1 (CLONTECH) mostrado
en el ID SEC Nº 1, que hibrida con una secuencia parcial del
adaptador, y el cebador MKC (región constante kappa de ratón)
(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) mostrado en el ID
SEC Nº 2, que hibrida con la región V de la cadena L de tipo kappa
de ratón.
50 \mul de solución para la PCR contienen 5
\mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,16 mM
(dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 2,5 unidades de una ADN polimerasa,
AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER), 0,2 \muM del cebador adaptador del
ID SEC Nº 1, 0,2 \muM del cebador MKC del ID SEC Nº 2 y 0,1 \mug
del ADNc bicatenario derivado de MABL-1. La
solución se precalentó a 94ºC de temperatura inicial durante 9
minutos y después se calentó a 94ºC durante 1 minuto, a 60ºC
durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto 20 segundos, en este
orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35 veces y después la
mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron el cebador adaptador-1
mostrado en el ID SEC Nº 1, y el cebador
MHC-\gamma1 (región constante de cadena pesada de
ratón) (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) mostrado en
el ID SEC Nº 3, como cebadores para la PCR.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo de
acuerdo con el procedimiento de amplificación del gen de la región
V de la cadena L, que se ha descrito en el Ejemplo 1.3-(1), excepto
que se usó 0,2 \muM del cebador MHC-\gamma1 en
lugar de 0,2 \muM del cebador MKC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron el cebador adaptador-1
del ID SEC Nº 1, y el cebador MKC del ID SEC Nº 2, como cebadores
para la PCR.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo de
acuerdo con el procedimiento de amplificación del gen de la región
V de la cadena L de MABL-1 que se ha descrito en el
Ejemplo 1.3-(1), excepto que se usó 0,1 \mug de ADNc bicatenario
derivado de MABL-2 en lugar de 0,1 \mug de ADNc
bicatenario de MABL-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron el cebador adaptador-1
del ID SEC Nº 1, y el cebador MHC-\gamma2a
(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) mostrado en el ID
SEC Nº 4, como cebadores para la PCR.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo de
acuerdo con el procedimiento de amplificación del gen de la región
V de la cadena L, que se ha descrito en el Ejemplo 1.3-(3), excepto
que se usó 0,2 \muM del cebador MHC-\gamma2a en
lugar de 0,2 \muM del cebador MKC.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN amplificado por la PCR como
se ha descrito antes, se purificó usando el kit de purificación de
la PCR QIAquick (QIAGEN) y se disolvió en Tris-HCl
10 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ligaron aproximadamente 140 ng del fragmento
de ADN que comprendía el gen que codifica la región V de la cadena
L de tipo kappa de ratón derivada de MABL-1 como se
ha preparado antes, con 50 ng del vector pGEM-T
Easy (Promega) en el tampón de reacción que comprendía
Tris-HCl 30 mM (pH 7,8), MgCl_{2} 10 mM,
ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM y 3 unidades de ADN ligasa T4
(Promega) a 15ºC durante 3 horas.
Después, se añadió 1 \mul de la mezcla de
reacción a 50 \mul de células competentes DH\alpha5 de E.
coli (Toyobo Inc.) y las células se almacenaron en hielo durante
30 minutos, se incubaron a 42ºC durante 1 minuto y se almacenaron
en hielo durante 2 minutos otra vez. Se añadieron 100 \mul de
medio SOC (GIBCO BRL). Las células de E. coli se pusieron en
placa en medio agar LB (Molecular Cloning; A Laboratory Manual,
Sambrook y col., Cold Springer Harbor Laboratory Press, 1989) que
contenía ampicilina 100 \mug/ml (SIGMA) y se cultivaron a 37ºC
toda la noche para obtener el transformante de E. coli.
El transformante se cultivó en 3 ml de medio LB
que contenía ampicilina 50 \mug/mol a 37ºC toda la noche y el ADN
plasmídico se preparó a partir del cultivo usando el kit QIAprep
Spin Miniprep (QIAGEN).
El plásmido resultante que comprendía el gen que
codifica la región V de la cadena L de tipo Kappa de ratón derivada
del hibridoma MABL-1 se denominó
pGEM-M1L.
De la misma forma descrita antes, se preparó un
plásmido que comprendía el gen que codifica la región V de la
cadena H de ratón derivada del hibridoma MABL-1, a
partir del fragmento de ADN purificado y se denominó pGEM.M1H.
Se preparó un plásmido que comprendía el gen que
codifica la región V de la cadena L de tipo kappa de ratón derivada
del hibridoma MABL-2, a partir del fragmento de ADN
purificado y se denominó pGEM-M2L.
Se preparó un plásmido que comprendía el gen que
codifica la región V de la cadena H de ratón derivada del hibridoma
MABL-2 a partir del fragmento de ADN purificado y se
denominó pGEM-M2H.
La secuencia de nucleótidos del ADNc que
codifica la región en los plásmidos mencionados antes se determinó
usando el Auto DNA Sequencer (Applied Biosystem) y el kit ABI PRISM
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystem)
de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena L del anticuerpo MABL-1 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M1L,
se muestra en el ID SEC Nº 5.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena H del anticuerpo MABL-1 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M1H,
se muestra en el ID SEC Nº 6.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena L del anticuerpo MABL-2 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M2L,
se muestra en el ID SEC Nº 7.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena H del anticuerpo MABL-2 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M2H,
se muestra en el ID SEC Nº 8.
Las regiones V de la cadena L y la cadena H en
general tienen estructuras similares y cada una de las cuatro
regiones marco en las mismas están unidas por tres regiones
hipervariables, es decir, regiones determinantes de la
complementaridad (CDR). Una secuencia de aminoácidos de la
estructura marco está relativamente bien conservada, mientras que
una secuencia de aminoácidos de la CDR tiene una variación
extremadamente alta (Kabat, E.A., y col., "Sequences of Proteins
of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services,
1983).
Basándose en estos hechos, las secuencias de
aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos
monoclonales de ratón frente a la IAP humana se aplicaron a las
bases de datos de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos
hechos por Kabat y col. para investigar la homología. Las regiones
CDR se determinaron basándose en la homología mostrada en la Tabla
1.
Los clones de ADNc, pGEM-M1L y
pGEM-M1H, que codifican las regiones V de la cadena
L y la cadena H del anticuerpo de ratón MABL-1,
respectivamente, se modificaron por el procedimiento de la PCR y se
introdujeron en el vector de expresión HEF (documento WO92/19759)
para preparar los vectores que expresaban el anticuerpo
MABL-1 quimérico.
Se diseñaron un cebador directo MLS (ID SEC Nº
9) para la región V de la cadena L y un cebador directo MHS (ID SEC
Nº 10) para la región V de la cadena H, para que hibridaran con un
ADN que codifica el inicio de la secuencia líder de cada una de las
regiones V y que contengan la secuencia consenso Kozak (J. Mol.
biol., 196, 647-950, 1987) y el sitio de la
enzima de restricción HindIII. Se diseñaron un cebador inverso MLAS
(ID SEC Nº 11) para la región V de la cadena L y un cebador inverso
MHAS (ID SEC Nº 12) para la región V de la cadena H, para que
hibridaran con un ADN que codifica el extremo de la región J y que
contuvieran la secuencia donadora de empalme y el sitio de la
enzima de restricción BamHI.
100 \mul de una solución para la PCR que
contenía 10 \mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2 mM,
dNTP 0,16 mM (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 unidades de una ADN
polimerasa AmpliTaq Gold, 0,4 \muM de cada uno de los cebadores y
8 ng del ADN molde (pGEM-M1L o
pGEM-M1H) se precalentaron a 94ºC de temperatura
inicial durante 9 minutos y después se calentaron a 94ºC durante 1
minuto, a 60ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto 20
segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35
veces y después la mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante
10 minutos.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación de la PCR QIAquick (QIAGEN) y después se digirió
con HindIII y BamHI. El producto de la región V de la cadena L se
clonó en el vector de expresión HEF, HEF-\kappa,
y el producto de la región V de la cadena H se clonó en el vector de
expresión HEF, HEF-\gamma. Después de la
secuenciación del ADN, los plásmidos que contienen un fragmento de
ADN con una secuencia de ADN correcta se denominan
HEF-M1L y HEF-M1H,
respectivamente.
La modificación y clonación del ADNc se llevaron
a cabo de la misma forma descrita en el Ejemplo 4.1, excepto que se
usaron pGEM-M2L y pGEM-M2H como ADN
molde en lugar de pGEM-M1L y
pGEM-M1H. Después de la secuenciación del ADN, los
plásmidos que contienen fragmentos de ADN con las secuencias de ADN
correctas se denominan HEF-M2L y
HEF-M2H, respectivamente.
Los vectores de expresión mencionados antes se
probaron en células COS7 para observar la expresión transitoria de
los anticuerpos MABL-1 y MABL-2
quiméricos.
Se cotransformaron células COS7 con los vectores
HEF-M1L y HEF-M1H por
electroporación usando el aparato Gene Pulser (BioRad). Se
añadieron cada uno de los ADN (10 \mug) y 0,8 ml de PBS con 1 x
10^{7} células/ml a una cubeta. La mezcla se trató con pulsos a
1,5 kV, 25 \muF de capacidad eléctrica.
Después de restauración durante 10 minutos a
temperatura ambiente, las células electroporadas se transfirieron a
medio de cultivo DMEM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal
sin \gamma-globulina al 10%. Después de cultivo
durante 72 horas, se recogió el líquido sobrenadante, se centrifugó
para separar los fragmentos celulares y se recuperó.
La cotransfección de células COS7 con los genes
que codifican el anticuerpo MABL-2 quimérico se
llevó a cabo de la misma forma descrita en el Ejemplo 4.3-(1)
excepto que se usaron los vectores HEF-M2L y
HEF-M2H en lugar de los vectores
HEF-M1L y HEF-M1H. El líquido
sobrenadante se recuperó de la misma forma.
La citometría de flujo se llevó a cabo usando el
líquido sobrenadante del cultivo de las células COS7 mencionado
antes, para medir la unión al antígeno. Se añadieron el líquido
sobrenadante del cultivo de las células COS7 que expresaban el
anticuerpo MABL-1 quimérico o las células COS7 que
expresaban el anticuerpo MABL-2 quimérico, o el
anticuerpo IgG humano (SIGMA) como un control a 4 x 10^{5} células
de la línea celular de leucemia de ratón L1210 que expresa IAP
humana y se incubaron en hielo. Después de lavar, se le añadió el
anticuerpo anti-IgG humana marcado con FITC
(Cappel). Después de incubar y lavar, se midió su intensidad de
fluorescencia usando el aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Puesto que los anticuerpos
MABL-1 y MABL-2 quiméricos se unían
específicamente a células L1210 que expresan IAP humana, se
confirma que estos anticuerpos quiméricos tienen estructuras
adecuadas de las regiones V de los anticuerpos monoclonales de
ratón MABL-1 y MABL-2,
respectivamente (Figuras 1-3).
El Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-1 se preparó como sigue. La región V
de la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo
MABL-1 y un conector, se amplificaron
respectivamente por el procedimiento de la PCR y se conectaron para
producir el Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-1. El procedimiento de producción se ilustra en
la Figura 4. Se usaron seis cebadores (A-F) para la
producción del Fv de cadena sencilla del anticuerpo
MABL-1. Los cebadores A, C y E tienen una secuencia
homosentido y los cebadores B, D y F tienen una secuencia
antisentido.
Se diseñó el cebador directo VHS para la región
V de la cadena H (cebador A, ID SEC Nº 13) para que hibridara con
un ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena H y que contuviera el sitio de reconocimiento
de la enzima de restricción NcoI. Se diseñó el cebador inverso VHAS
para la región V de la cadena H (cebador B, ID SEC Nº 14) para que
hibridara con un ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H y que se
superpusiera con el conector.
Se diseñó el cebador directo LS para el conector
(cebador C, ID SEC Nº 15) para que hibridara con un ADN que
codifica el extremo N-terminal del conector y para
que se superpusiera con un ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H. Se diseñó
el cebador inverso LAS para el conector (cebador D, ID SEC Nº 16)
para que hibridara con un ADN que codifica el extremo
C-terminal del conector y para que se superpusiera
con un ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena L.
Se diseñó el cebador directo VLS para la región
V de la cadena L (cebador E, ID SEC Nº 17) para que hibridara con
un ADN que codifica el extremo C-terminal del
conector y para que se superpusiera con un ADN que codifica el
extremo N-terminal de la región V de la cadena L. Se
diseñó el cebador inverso VLAS-FLAG para la región
V de la cadena L (cebador F, ID SEC Nº 18) para que hibridara con un
ADN que codifica el extremo C-terminal de la región
V de la cadena L y para que tuviera una secuencia que codifica el
péptido FLAG (Hopp T.P. y col., Bio/Technology, 6,
1204-1210, 1988), dos codones de parada y el sitio
de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI.
En la primera etapa de la PCR se llevaron a cabo
tres reacciones, A-B, C-D y
E-F, y los productos de la PCR de las mismas se
purificaron. Tres productos de la PCR obtenidos de la primera etapa
de la PCR se ensamblaron por su complementaridad. Después, se
añadieron los cebadores A y F y se amplificó el ADN de longitud
completa que codifica el Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-1 (segunda PCR). En la primera PCR,
el plásmido pGEM-M1H que codifica la región V de la
cadena H del anticuerpo MABL-1 (véase el Ejemplo 2),
un plásmido pSC-DP1 que comprende una secuencia de
ADN que codifica una región del conector que comprende: Gly Gly Gly
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (ID SEC Nº 19)
(Huston, J.S., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
5879-5883, 1988) y el plásmido
pGEM-M1L que codifica la región V de la cadena L del
anticuerpo MABL-1 (véase el Ejemplo 2) se usaron
respectivamente como molde.
50 \mul de solución en la primera etapa de la
PCR comprenden 5 \mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2
mM, dNTP 0,16 mM, 2,5 unidades de una ADN polimerasa, AmpliTaq Gold
(PERKIN ELMER), 0,4 \muM de cada uno de los cebadores y 5 ng de
cada ADN molde. La solución de la PCR se precalentó a 94ºC de
temperatura inicial durante 9 minutos y después se calentó a 94ºC
durante 1 minuto, a 65ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto
20 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35
veces y después la mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante
7 minutos.
Los productos de la PCR A-B (371
pb), C-D (63 pb) y E-F (384 pb) se
purificaron usando el kit de purificación de la PCR QIAquick
(QIAGEN) y se ensamblaron en la segunda PCR. En la segunda PCR, 98
\mul de una solución de PCR que comprendía 120 ng del producto
A-B de la primera PCR, 20 ng del producto
C-D de la PCR y 120 ng del producto
E-F de la PCR, 10 \mul de 10 x tampón de la PCR
II, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,16 mM, 5 unidades de ADN polimerasa
AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER), se precalentaron a 94ºC de temperatura
inicial durante 8 minutos y después se calentaron a 94ºC durante 2
minutos, a 65ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 2 minutos, en
este orden. Este ciclo de temperatura se repitió dos veces y después
se añadieron a la reacción respectivamente 0,4 \muM de cada uno
de los cebadores A-F. La mezcla se precalentó a 94ºC
de temperatura inicial durante 1 minuto y después se calentó a 94ºC
durante 1 minuto, a 65ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto
20 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35
veces y después la mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante
7 minutos.
Un fragmento de ADN de 843 pb producido por la
segunda PCR se purificó y se digirió con NcoI y EcoRI. El fragmento
de ADN resultante se clonó en el vector pSCFVT7. El vector de
expresión pSCFVT7 contiene una secuencia señal pelB adecuada para
el sistema de expresión periplásmico de E. coli (Lei, S.P. y
col., J. Bacteriology, 169, 4379-4383,
1987). Después de la secuenciación del ADN, el plásmido que contiene
el fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos
correcta del Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-1 se denomina "pscM1" (véase la Figura
5). La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv
de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-1 contenida en el plásmido pscM1 se muestran en
el ID SEC Nº 20.
El vector pscM1 se modificó por el procedimiento
de la PCR para preparar un vector que expresaba el Fv de cadena
sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-1 en
células de mamífero. El fragmento de ADN resultante se introdujo en
el vector de expresión pCHO1. Este vector de expresión, pCHO1, se
construyó haciendo digerir
DHFR-\DeltaE-rvH-PM1-f
(documento WO92/19759) con EcoRI y SmaI para eliminar el gen de
anticuerpo y conectar el adaptador
EcoRI-NotI-BamHI (Takara Shuzo) al
mismo.
Como cebador directo para la PCR se diseñó el
cebador Sal-VHS mostrado en el ID SEC Nº 21 para que
hibridara con un ADN que codifica el extremo
N-terminal de la región V de la cadena H y para que
contuviera el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
SalI. Como cebador inverso para la PCR, se diseñó el cebador
FRH1anti mostrado en el ID SEC Nº 22 para que hibridara con un ADN
que codifica el extremo de la primera secuencia marco.
100 \mul de solución para la PCR que
comprendía 10 \mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2 mM,
dNTP 0,16 mM, 5 unidades de una ADN polimerasa, AmpliTaq Gold, 0,4
\muM de cada uno de los cebadores y 8 ng del ADN molde (pscM1) se
precalentaron a 95ºC de temperatura inicial durante 9 minutos y
después se calentaron a 95ºC durante 1 minuto, a 60ºC durante 1
minuto y a 72ºC durante 1 minuto 20 segundos, en este orden. Este
ciclo de temperatura se repitió 35 veces y después la mezcla de
reacción se calentó más a 72ºC durante 7 minutos.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación QIAquick (QIAGEN) y se digirió con SalI y MboII
para obtener un fragmento de ADN que codifica el extremo
N-terminal del Fv de cadena sencilla reconstruido
del anticuerpo MABL-1. El vector pscM1 se digirió
con MboII y EcoRI para obtener un fragmento de ADN que codifica el
extremo C-terminal del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-1. El fragmento de
ADN SalI-MboII y el fragmento de ADN
MboII-EcoRI se clonaron en el vector
pCHO1-Igs. Después de secuenciar el ADN, el plásmido
que comprendía la secuencia de ADN deseada se denominó
"pCHOM1" (véase la Figura 6). El vector de expresión
pCHO1-Igs, contiene una secuencia señal IgG1 de
ratón adecuada para el sistema de
expresión-secreción en células de mamífero
(Nature, 322, 323-327, 1988). La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-1 contenida en el
plásmido pCHOM1 se muestran en el ID SEC Nº 23.
El Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-2 se preparó de acuerdo con el
Ejemplo 5.1 mencionado antes. En la etapa de la primera PCR se usó
el plásmido pGEM-M2H que codificaba la región V de
la cadena H de MABL-2 (véase el Ejemplo 2) en lugar
de pGEM-M1H y el plásmido pGEM-M2L
que codifica la región V de la cadena L de MABL-2
(véase el Ejemplo 2) en lugar de pGEM-M1L, para
obtener un plásmido pscM2 que comprende un fragmento de ADN que
codifica la secuencia de aminoácidos deseada del Fv de cadena
sencilla del anticuerpo MABL-2. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 contenida en el
plásmido pscM2 se muestran en el ID SEC Nº 24.
El vector pscM2 se modificó por el procedimiento
de la PCR para preparar un vector, pCHOM2, para la expresión en
células de mamífero, que contiene el fragmento de ADN que codifica
la secuencia correcta de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 contenida en el
plásmido pCHOM2 se muestran en el ID SEC Nº 25.
El vector pCHOM2 se probó en células COS7 para
observar la expresión transitoria del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2.
Las células COS7 se transformaron con el vector
pCHOM2 por electroporación usando el aparato Gene Pulser (BioRad).
Se añadieron el ADN (10 \mug) y 0,8 ml de PBS con 1 x 10^{7}
células/ml a una cubeta. La mezcla se trató con pulsos a 1,5 kV, 25
\muF de capacidad eléctrica.
Después de restauración durante 10 minutos a
temperatura ambiente, las células electroporadas se transfirieron a
medio de cultivo IMDM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal al
10%. Después de cultivo durante 72 horas, se recogió el líquido
sobrenadante, se centrifugó para separar los fragmentos celulares y
se recuperó.
La existencia del Fv de cadena sencilla del
anticuerpo MABL-2 en el líquido sobrenadante del
cultivo de células COS7 que se habían transfectado con el vector
pCHOM2 se confirmó por el procedimiento de transferencia
Western.
El líquido sobrenadante del cultivo de células
COS7 transfectadas con el vector pCHOM2 y el líquido sobrenadante
del cultivo de células COS7 transfectadas con el vector pCHO1 como
control, se sometieron a electroforesis en SDS y se transfirieron a
una membrana REINFORCED NC (Schlecher & Schuell). La membrana se
bloqueó con leche desnatada al 5% (Morinaga
Nyu-gyo), se lavó con Tween 20-PBS
al 0,05% y se mezcló con un anticuerpo anti-FLAG
(SIGMA). La membrana se incubó a temperatura ambiente, se lavó y se
mezcló con anticuerpo IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina
(Zymed). Después de incubar y lavar a temperatura ambiente, se
añadió la solución de sustrato (Kirkegaard Perry Laboratories) para
el revelado de color (Figura 7).
Se detectó una proteína específica del péptido
FLAG solamente en el líquido sobrenadante del cultivo de las
células COS7 en las que se había introducido el vector pCHOM2, y por
lo tanto, se confirma que el Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-2 era segregado en este líquido
sobrenadante de cultivo.
La citometría de flujo se llevó a cabo usando el
líquido sobrenadante del cultivo de células COS7 antes mencionadas
para medir la unión al antígeno. Se añadió el líquido sobrenadante
del cultivo de células COS7 que expresan el Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 o el líquido
sobrenadante del cultivo de células COS7 transformadas con el
vector pCHO1 como control a 2 x 10^{5} células de la línea celular
de leucemia de ratón L1210 que expresa la proteína asociada a
integrina (IAP) humana o de la línea celular L1210 transformada con
pCOS1 como control. Después de incubar sobre hielo y lavar, se
añadió el anticuerpo anti-FLAG de ratón (SIGMA).
Después las células se incubaron y se lavaron. Después se le añadió
el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC
(BECTON DICKINSON) y las células se incubaron y lavaron otra vez.
Posteriormente, se midió la intensidad de la fluorescencia usando
el aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Puesto que el Fv de cadena sencilla del
anticuerpo MABL-2 se unía específicamente a las
células L1210 que expresaban la IAP humana, se confirma que el Fv
de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 tiene una afinidad por la proteína asociada
a la integrina humana (IAP) (Véase las Figuras
8-11).
Se midió la actividad de unión del Fv de cadena
sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-2,
basándose en la actividad inhibidora frente a la unión de
anticuerpos monoclonales de ratón al antígeno.
Se añadió el anticuerpo
anti-FLAG ajustado a 1 \mug/ml a cada uno de los
pocillos de una placa de 96 pocillos y se incubó a 37ºC durante 2
horas. Después de lavar, se llevó a cabo el bloqueo con
BSA-PBS al 1%. Después de incubar y lavar a
temperatura ambiente el líquido sobrenadante del cultivo de las
células COS7 en las que se había introducido el gen del antígeno de
la IAP humana de tipo secreción (ID SEC Nº 26) se diluyó con PBS en
el doble de volumen y se añadió a cada pocillo. Después de incubar y
lavar a temperatura ambiente, se añadió a cada pocillo una mezcla
de 50 \mul del anticuerpo MABL-2 biotinilado
ajustado a 100 ng/ml y 50 \mul del líquido sobrenadante diluido
de forma secuencial de las células COS7 que expresaban el Fv de
cadena sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-2.
Después de incubar y lavar a temperatura ambiente, se añadió a cada
pocillo la estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Zymed).
Después de incubar y lavar a temperatura ambiente, se añadió la
solución de sustrato (SIGMA) y se midió la absorbancia de la mezcla
de reacción en cada pocillo a 405 nm.
Los resultados pusieron de manifiesto que el Fv
de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 (MABL2-scFv) inhibía de
forma evidente de forma dependiente de la concentración la unión del
anticuerpo MABL-2 de ratón al antígeno IAP humano
en comparación con el líquido sobrenadante del cultivo de células
COS7 a las que se había introducido PCHO1 como control (Figura 12).
Por consiguiente, se sugiere que el Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 tiene la
estructura correcta de cada una de las regiones V del anticuerpo
monoclonal de ratón MABL-2.
Se examinó una acción de inducción de apoptosis
del Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 mediante tinción con
Anexina-V (Boehringer Mannheim) usando las células
L1210 transfectadas con el gen de IAP humana, las células L1210
transfectadas con el vector pCOS1 como control y células
CCRF-CEM.
A cada una de 1 x 10^{5} células de las
células anteriores se añadió el líquido sobrenadante del cultivo de
células COS7 que expresaban el Fv de cadena sencilla reconstruido
del anticuerpo MABL-2 o el líquido sobrenadante del
cultivo de células COS7 transfectadas con el vector pCHO1 como
control, con una concentración final de 50% y las mezclas se
cultivaron durante 24 horas. Después se llevó a cabo la tinción con
Anexina-V y se midió la intensidad de la
fluorescencia usando el aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Los resultados de la tinción con
Anexina-V se muestran en las Figuras
13-18, respectivamente. Los puntos en la región
inferior izquierda representan células vivas y los puntos en la
región inferior derecha representan células en la etapa temprana de
apoptosis, y los puntos en la región superior derecha representan
células en la etapa tardía de apoptosis. Los resultados muestran
que el Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 (MBAL2-scFv) inducía
notablemente la muerte celular de células L1210 específicas para el
antígeno IAP humana (Figuras 13-16) y que el Fv de
cadena sencilla reconstruido también inducía notablemente la muerte
celular de células CCRF-CEM en comparación con el
control (Figuras 17-18).
Se transfectaron células CHO con el vector
pCHOM2 para establecer una línea de células CHO que exprese de
forma constante el Fv de cadena sencilla (polipéptido) derivado del
anticuerpo MABL-2.
Se transformaron células CHO con el vector
pCHOM2 por electroporación usando el aparato Gene Pulser (BioRad).
Se añadió una mezcla de ADN (10 \mug) y 0,7 ml de PBS con células
CHO (1 x 10^{7} células/ml) a una cubeta. La mezcla se trató con
pulsos a 1,5 kV, 25 \muF de capacidad eléctrica. Después de
restauración durante 10 minutos a temperatura ambiente, las células
electroporadas se transfirieron a medio \alpha-MEM
sin ácido nucleico (GIBO BRL) que contenía suero bovino fetal al
10% y se cultivaron. La expresión de la proteína deseada en los
clones resultantes se confirmó por SDS-PAGE y se
seleccionó un clon con un nivel de expresión alto como una línea
celular que producía el Fv de cadena sencilla derivado del
anticuerpo MABL-2. La línea celular se cultivó en
medio CHO-S-SFM II sin suero (GIBCO
BRL) que contenía metotrexato 10 nM (SIGMA). Después se recogió el
líquido sobrenadante del cultivo, se centrifugó para separar los
fragmentos celulares y se recuperó.
El líquido sobrenadante del cultivo de la línea
celular CHO que expresaba el Fv de cadena sencilla obtenido en el
Ejemplo 5.8 se concentró hasta veinte veces usando un cartucho para
la diálisis artificial (PAN130SF, ASAHI MEDICALS). La solución
concentrada se almacenó a -20ºC y se descongeló en la
purificación.
La purificación del Fv de cadena sencilla del
líquido sobrenadante del cultivo de células CHO se llevó a cabo
usando tres tipos de cromatografía, es decir, en Sefarosa azul, un
hidroxiapatito y una filtración en gel.
El líquido sobrenadante concentrado se diluyó
diez veces con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) y se centrifugó
para separar los materiales insolubles (10000 x rpm, 30 minutos). El
líquido sobrenadante se aplicó en una columna de Sefarosa azul (20
ml) equilibrada con el mismo tampón. Después de lavar la columna con
el mismo tampón, las proteínas adsorbidas en la columna se eluyeron
por un gradiente gradual de NaCl en el mismo tampón, 0,1, 0,2, 0,3,
0,5 y hasta 1,0 M. La fracción de paso continuo y cada fracción
eluida se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones
en las que se confirmó el Fv de cadena sencilla (las fracciones
eluidas con NaCl 0,1 a 0,3 M) se juntaron y se concentraron hasta
aproximadamente 20 veces usando CentriPrep-10
(AMICON).
La solución concentrada obtenida en (1) se
diluyó hasta 10 veces con tampón de fosfato 10 mM (pH 7,0) y se
aplicó en la columna de hidroxiapatito (20 ml, BIORAD). La columna
se lavó con 60 ml de tampón de fosfato 10 mM (pH 7,0). Después las
proteínas adsorbidas en la columna se eluyeron con un gradiente
lineal de tampón de fosfato sódico hasta 200 mM (véase la Figura
19). El análisis de cada fracción por SDS-PAGE
confirmó el Fv de cadena sencilla en la fracción A y fracción
B.
Cada una de las fracciones A y B en (2) se
concentró por separado con CentriPrep-10 y se aplicó
a la columna TSKgel G3000SWG (21,5 x 600 mm) equilibrada con tampón
de acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 0,15 M. Los
cromatogramas se muestran en la Figura 20. El análisis de las
fracciones por SDS-PAGE confirmó que ambos picos
mayoritarios (AI y BI) son del Fv de cadena sencilla deseado. En el
análisis de la filtración en gel, la fracción A eluyó a 36 kDa de
peso molecular aparente y la fracción B eluyó a 76 kDa. Los Fv de
cadena sencilla purificados (AI, BI) se analizaron en gel de
poliacrilamida con SDS al 15%. Las muestras se trataron en ausencia
o presencia de un reductor y se llevó a cabo la electroforesis de
acuerdo con el procedimiento de Laemmli. Después la proteína se
tiñó con azul brillante de Coomassie. Como se muestra en la Figura
21, tanto AI como BI dieron una sola banda a 35 kDa de peso
molecular aparente, independientemente de la ausencia o presencia
del reductor. A partir de lo anterior, se concluye que AI es un
monómero de Fv de cadena sencilla y BI es un dímero unido no
covalentemente del Fv de cadena sencilla. El análisis de la
filtración en gel de las fracciones AI y BI con la columna TSKgel
G3000SWG (7,5 x 60 mm) puso de manifiesto que se detecta un pico del
monómero sólo en la fracción AI y se detecta un pico del dímero
sólo en la fracción BI (Figura 22). La fracción de dímero (fracción
BI) daba cuenta de 4 por ciento (%) de los Fv de cadena sencilla
totales. Más del 90% del dímero en la fracción de dímero se
conservaba establemente durante más de un mes a 4ºC.
El vector pscM2 se modificó por el procedimiento
de la PCR para preparar un vector que expresara eficazmente el Fv
de cadena sencilla del anticuerpo MABL-2 en células
de E. coli. El fragmento de ADN resultante se introdujo en
el vector de expresión pSCFVT7.
Como cebador directo para la PCR se diseñó el
cebador Nde-VHSm02 mostrado en el ID SEC Nº 27 para
que hibridara con un ADN que codifica el extremo
N-terminal de la región V de la cadena H y para que
contuviera un codón de iniciación y el sitio de reconocimiento de
la enzima de restricción NdeI. Como cebador inverso para la PCR, se
diseñó el cebador VAS mostrado en el ID SEC Nº 28 para que hibridara
con un ADN que codifica el extremo C-terminal de la
región V de la cadena L y para que contuviera dos codones de parada
y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI. El
cebador directo, Nde-VHSm02, comprende cinco
mutaciones puntuales en la parte que hibrida con el ADN que
codifica el extremo N-terminal de la región V de la
cadena H para la expresión eficaz en E. coli.
100 \mul de una solución para la PCR que
comprendía 10 \mul de 10 x tampón de PCR nº 1, MgCl_{2} 1 mM,
dNTP 0,2 mM, 5 unidades de ADN polimerasa KOD (todos de TOYOBO), 1
\muM de cada cebador y 100 ng de un ADN molde (pscM2) se
calentaron a 98ºC durante 15 segundos, a 65ºC durante 2 segundos y a
74ºC durante 30 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura
se repitió 25 veces.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) y se digirió con NdeI y
EcoRI, y después el fragmento de ADN resultante se clonó en el
vector pSCFVT7, del cual se había eliminado la secuencia señal pelB
por digestión con NdeI y EcoRI. Después de secuenciar el ADN, el
plásmido resultante que comprende un fragmento de ADN con la
secuencia de ADN deseada se denomina "pscM2DEm02" (véase la
Figura 23). La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos del Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 contenida en el plásmido pscM2DEm02 se
muestran en el ID SEC Nº 29.
BL21(DE3)pLysS de E. coli
(STRATAGENE) se transformó con el vector pscM2DEm02 para obtener una
cepa de E. coli que expresaba el Fv de cadena sencilla
derivado del anticuerpo MABL-2. Se examinó en los
clones resultantes la expresión de la proteína deseada usando
SDS-PAGE, y se seleccionó un clon con un nivel de
expresión alto como una cepa productora del Fv de cadena sencilla
derivado del anticuerpo MABL-2.
Se cultivó una colonia individual de E.
coli obtenida por la transformación, en 3 ml de medio LB a 28ºC
durante 7 horas y después en 70 ml de medio LB a 28ºC toda la
noche. Este precultivo se trasplantó a 7 litros de medio LB y se
cultivó a 28ºC con agitación a 300 rpm usando el fermentador de
tanque. Cuando la absorbancia del medio alcanzó una DO = 1,5, se
indujeron las bacterias con IPTG 1 mM y después se cultivaron
durante 3 horas.
El medio de cultivo se centrifugó (10000 x g, 10
minutos) y se recuperaron las bacterias precipitadas. Se añadió a
las bacterias tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que
contenía EDTA 5 mM, NaCl 0,1 M y Triton X-100 al 1%
y las bacterias se alteraron por ultrasonidos (salida: 4; ciclo de
trabajo: 70%, 1 minuto x 10 veces). La suspensión de las bacterias
alteradas se centrifugó (12000 x g, 10 minutos) para precipitar el
cuerpo de inclusión. El cuerpo de inclusión aislado se mezcló con
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 5
mM, NaCl 0,1 M y Triton X-100 al 4%, se trató por
ultrasonidos (salida: 4, ciclo de trabajo: 50%, 30 segundos x 2
veces) otra vez y se centrifugó (12000 x g, 10 minutos) para aislar
la proteína deseada como precipitado y separar las proteínas
contenidas en el líquido sobrenadante.
El cuerpo de inclusión que comprendía la
proteína deseada se lisó en tampón Tris-HCl 50 mM
(pH 8,0) que contenía urea 6 M, EDTA 5 mM y NaCl 0,1 M y se aplicó
en columna de filtración en gel Sephacryl S-300 (5 x
90 cm, Amersham Pharmacia) equilibrada con tampón de
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía urea 4 M, EDTA
5 mM, NaCl 0,1 M y mercaptoetanol 10 mM con un caudal de 5
ml/minuto para separar los Fv de cadena sencilla con peso molecular
alto asociados. Las fracciones obtenidas se analizaron con
SDS-PAGE y las fracciones con pureza alta de la
proteína se diluyeron con el tampón usado en la filtración en gel
hasta DO_{280}=0,25. Después, las fracciones se dializaron tres
veces frente a tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que
contenía EDTA 5 mM, NaCl 0,1 M, Arg 0,5 M, glutatión 2 mM en la
forma reducida y glutatión 0,2 mM en la forma oxidada con el fin de
volver a plegar la proteína. Además, la fracción se dializó tres
veces frente a tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl
0,15 M para intercambiar el tampón.
El producto dializado se aplicó en la columna de
filtración en gel Superdex 200 pg (2,6 x 60 cm, Amersham Pharmacia)
equilibrada con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl
0,15 M para separar una pequeña cantidad de proteína de alto peso
molecular que estaba intermolecularmente entrecruzada por enlaces
S-S. Como se muestra en la Figura 24, se eluyeron
dos picos, principal y subpico, después de los picos anchos que
supuestamente se atribuían a un agregado de alto peso molecular. El
análisis por SDS-PAGE (véase la Figura 21) y las
posiciones de elución de los dos picos en el análisis de filtración
en gel sugerían que el pico principal es el del monómero del Fv de
cadena sencilla y el subpico es el del dímero unido no
covalentemente del Fv de cadena sencilla. El dímero unido no
covalentemente daba cuenta del 4 por ciento de los Fv de cadena
sencilla totales.
Se examinó la acción de inducción de apoptosis
del Fv de cadena sencilla del anticuerpo MABL-2
(MABL2-scFv) producido por las células CHO y E.
coli de acuerdo con dos protocolos por tinción con
Anexina-V (Boehringer Mannheim) usando las células
L1210 (hIAP/L1210) en las que se había introducido el gen de IAP
humana.
En el primer protocolo, se añadieron los
anticuerpos de las muestras con una concentración final de 3
\mug/ml a 5 x 10^{4} células de hIAP/L1210 y se cultivaron
durante 24 horas. Se analizaron los anticuerpos de las muestras, es
decir, el monómero y el dímero de Fv de cadena sencilla de
MABL-2 de las células CHO obtenidas en el Ejemplo
5.9, el monómero y el dímero del Fv de cadena sencilla de
MABL-2 de E. coli obtenido en el ejemplo
5.12, y el anticuerpo IgG de ratón como control. Después del
cultivo, se llevó a cabo la tinción con Anexina-V y
se midió la intensidad de fluorescencia usando el aparato FACScan
(BECTON DICKINSON).
En el segundo protocolo, los anticuerpos de las
muestras con una concentración final de 3 \mug/ml se añadieron a
5 x 10^{4} células de la línea celular hIAP/L1210, se cultivaron
durante 2 horas y se mezclaron con anticuerpo
anti-FLAG (SIGMA) con una concentración final de 15
\mug/ml y después se cultivaron durante 22 horas. Se analizaron
los anticuerpos de las muestras del monómero del Fv de cadena
sencilla de MABL-2 de células CHO obtenidos en el
Ejemplo 5.9 y el anticuerpo IgG de ratón como control. Después del
cultivo, se llevó a cabo la tinción con Anexina-V y
se midió la intensidad de fluorescencia usando el aparato
FACScan.
Los resultados de los análisis por tinción con
Anexina-V se muestran en las Figuras
25-31. Los resultados muestran que los dímeros del
polipéptido Fv de cadena sencilla de MABL-2
producidos en las células CHO y E. coli inducían
notablemente la muerte celular (Figuras 26, 27) en comparación con
el control (Figura 25), mientras que no se observó inducción de la
apoptosis en los monómeros del polipéptido Fv de cadena sencilla de
MABL-2 producidos en las células CHO y E.
coli (Figuras 28, 29). Cuando se usó junto con el anticuerpo
anti-FLAG, el monómero del polipéptido Fv de cadena
sencilla derivado del anticuerpo MABL-2 producido en
las células CHO inducía notablemente la muerte celular (Figura 31)
en comparación con el control (Figura 30).
La medición de IgG humana (proteína M) producida
por células de mieloma humano y contenida en el suero de ratón, se
llevó a cabo mediante el siguiente ELISA. Se añadieron 100 \mul de
anticuerpo anti-IgG humana de cabra (BIOSOURCE,
lote nº 7902) diluidos a 1 \mug/ml con tampón de bicarbonato al
0,1% (pH 9,6) a cada pocillo en una placa de 96 pocillos (Nunc) y
se incubó a 4ºC toda la noche de modo que se inmovilizara el
anticuerpo. Después del bloqueo, se añadieron 100 \mul de suero de
ratón diluido gradualmente o de la IgG humana (CAPPEL, lote nº
00915) como patrón a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente. Después de lavar, se añadieron 100 \mul de
anticuerpo anti-IgG humana marcado con fosfatasa
alcalina (BIOSOURCE, lote nº 6202) que se había diluido 5000 veces,
y se llevó a cabo la incubación durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de lavar, se añadió una solución de sustrato.
Después de incubación, se midió la absorbancia a 405 nm usando le
lector MICROPLATE READER Modelo 3550 (BioRad). La concentración de
IgG humana en el suero de ratón se calculó basándose en la curva de
calibración obtenida con los valores de absorbancia de la IgG
humana como patrón.
El monómero y el dímero del polipéptido de
scFv/CHO se diluyeron respectivamente a 0,4 mg/ml o 0,25 mg/ml con
PBS(-) esterilizado por filtración el día de la administración para
preparar las muestras para la administración.
Se preparó un modelo de ratón de mieloma humano
como sigue. Células KPMM2 pasadas in vivo (documento
JP-Appl. 7-236475) por un ratón
SCID (Japan Clare) se suspendieron en medio RPMI1640
(GIBCO-BRL) que contenía suero bovino fetal al 10%
(GIBCO-BRL) y se ajustaron a 3 x 10^{7}
células/ml. Se trasplantaron 200 \mul de la suspensión de células
KPMM2 (6 x 10^{6} células/ratón) al ratón SCID (macho, 6 semanas
de edad) por la vena caudal del mismo, al que se le había inyectado
por vía subcutánea el anticuerpo asialo-GM1 (WAKO
JUNYAKU, 1 vial disuelto en 5 ml) un día antes del trasplante.
Las muestras de los anticuerpos preparadas en
(2), el monómero (250 \mul) y el dímero (400 \mul), se
administraron al ratón modelo de mieloma humano preparado en (3)
por la vena caudal del mismo. La administración se inició tres días
después del trasplante de las células KPMM2 y se llevó a cabo dos
veces al día durante tres días. Como control, se administraron de
la misma forma 200 \mul de PBS(-) esterilizado por filtración, dos
veces al día durante tres días, por la vena caudal. Cada grupo
consistía en 7 ratones.
El efecto antitumoral del monómero y el dímero
del polipéptido scFv/CHO con el ratón modelo de mieloma humano se
evaluó en términos de cambio de la concentración de IgG humana
(proteína M) en el suero de ratón y el tiempo de supervivencia del
ratón. El cambio de concentración de IgG humana se determinó
midiéndola en el suero de ratón recogido 24 días después del
trasplante de células KPMM2, por el ELISA descrito antes en (1). La
cantidad de IgG humana (proteína M) en el suero del grupo al que se
le había administrado PBS(-) (control) aumentó a aproximadamente
8500 \mug/ml, mientras que la cantidad de IgG humana del grupo al
que se le había administrado el dímero de scFv/CHO era notablemente
baja, es decir, tan baja como una décima parte o menos que la del
grupo de control. Por lo tanto, los resultados muestran que el
dímero de scFv/CHO inhibe fuertemente el crecimiento de las células
KPMM2 (Figura 32). Como se muestra en la Figura 33, se observó una
prolongación notable del tiempo de supervivencia en el grupo al que
se le había administrado el dímero de scFv/CHO comparado con el
grupo al que se le había administrado PBS(-).
A partir de lo anterior se confirma que el
dímero de scFv/CHO tiene un efecto antitumoral para el modelo de
ratón de mieloma humano. Se considera que el efecto antitumoral del
dímero de scFv/CHO, el polipéptido reconstruido de la invención,
resulta de la acción inductora de apoptosis del polipéptido
reconstruido.
El ensayo de hemaglutinación y la determinación
de la hemaglutinación se llevaron a cabo de acuerdo con
"Immuno-Biochemical Investigation",
Zoku-Seikagaku Jikken Koza, editado por la Sociedad
Bioquímica de Japón, publicado por Tokyo Kagaku Dojin.
Se tomó sangre de un donante sano usando
jeringuillas tratadas con heparina y se lavó con PBS(-) tres veces,
y después se preparó una suspensión de eritrocitos con una
concentración final de 2% en PBS(-). Las muestras de ensayo eran el
anticuerpo MABL-2, el monómero y el dímero del
polipéptido Fv de cadena sencilla producido por las células CHO, y
el monómero y el dímero del polipéptido Fv de cadena sencilla
producido por E. coli, y el control era IgG de ratón
(ZYMED). Para la investigación del efecto de hemaglutinación, se
usaron placas de 96 pocillos de fondo redondo disponibles en
Falcon. Se añadieron y mezclaron en el pocillo 50 \mul por
pocillo de las muestras de anticuerpos mencionadas antes y 50 \mul
de suspensión de eritrocitos al 2%. Después de incubación durante 2
horas a 37ºC, las mezclas de reacción se almacenaron a 4ºC toda la
noche y se determinó la hemaglutinación de las mismas. Como
control, se usaron 50 \mul por pocillo de PBS(-) y el ensayo de
hemaglutinación se llevó a cabo de la misma manera. La IgG de ratón
y el anticuerpo MABL-2 se usaron con 0,01, 0,1, 1,0,
10,0 ó 100,0 \mug/ml de la concentración final de los
anticuerpos. Los Fv de cadena sencilla se usaron con 0,004, 0,04,
0,4, 4,0, 40,0 ó 80,0 \mug/ml de la concentración final y además a
160 \mug/ml sólo en el caso del dímero del polipéptido producido
por E. coli. Los resultados se muestran en la Tabla 2. En el
caso del anticuerpo MABL-2, la hemaglutinación se
observó con una concentración de más de 0,1 \mug/ml, mientras que
no se observó hemaglutinación para el monómero ni para el dímero
del Fv de cadena sencilla.
Para preparar un plásmido que expresa el
polipéptido reconstruido [sc(Fv)_{2}] que comprende
dos regiones V de la cadena H y dos regiones v de la cadena L
derivadas del anticuerpo MABL-2, el pCHOM2
mencionado antes, que comprende el ADN que codifica el scFv
derivado de MABL-2 descrito antes, se modificó por
el procedimiento de la PCR como se menciona a continuación y el
fragmento de ADN resultante se introdujo en pCHOM2.
Los cebadores usados para la PCR son el cebador
EF1 (ID SEC Nº: 30) como cebador homosentido, que se diseñó para
que hibridara con un ADN que codifica EF1\alpha y un cebador
antisentido (ID SEC Nº: 19) que se diseñó para que hibridara con el
ADN que codifica el extremo C-terminal de la región
V de la cadena L y para que contuviera una secuencia de ADN para
una región conectora, y el cebador VLLAS que contiene el sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción SalI (ID SEC Nº 31).
100 \mul de solución para la PCR comprenden 10
\mul de 10 x tampón de PCR nº 1, MgCl_{2} 1 mM, dNTP 0,2 mM
(dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 unidades de ADN polimerasa KOD (Toyobo,
Inc.), 1 \muM de cada uno de los cebadores y 100 ng del ADN molde
(pCHOM2). La solución de la PCR se calentó a 94ºC durante 30
segundos, a 50ºC durante 30 segundos y a 74ºC durante 1 minuto, en
este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 30 veces.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación QIAquick (QIAGEN) y se digirió con SalI. El
fragmento de ADN resultante se clonó en el vector pBluescript
KS^{+} (Toyobo, Inc.). Después de secuenciación del ADN, se
digirió un plásmido que comprendía la secuencia de ADN deseada con
SalI y el fragmento de ADN obtenido se conectó usando el kit Rapid
DNA Ligation (BOEHRINGER MANNHEIM) a pCHOM2 hecho digerir con SalI.
Después de secuenciación del ADN, el plásmido que comprende la
secuencia de ADN deseada se denomina
"pCHOM2(Fv)_{2}" (véase la Figura 34). La
secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la región
sc(Fv)_{2} del anticuerpo MABL-2
contenida en el plásmido pCHOM2(Fv)_{2} se muestran
en el ID SEC Nº 32.
Los scFv que contienen conectores con diferentes
longitudes y las regiones V que se diseñan en el orden [cadena
H]-[cadena L] (en lo sucesivo "HL") o [cadena L]-[cadena H] (en
lo sucesivo "LH") se prepararon usando como molde ADNc que
codifican la cadena H y la cadena L derivadas de
MABL-2 como se menciona a continuación.
Para la construcción de scFv de tipo HL, el
procedimiento de la PCR se llevó a cabo usando pCHOM2
(Fv)_{2} como molde. En la etapa de la PCR, se usaron una
pareja de cebador CFHL-F1 (ID SEC Nº: 33) y cebador
CFHL-R2 (ID SEC Nº: 34) o una pareja de cebador
CFHL-F2 (ID SEC Nº: 35) y cebador
CFHL-R1 (ID SEC Nº: 36) y polimerasa KOD. El
procedimiento de la PCR se llevó a cabo repitiendo 30 veces un ciclo
de temperatura que consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto con el fin de producir
un ADNc para la cadena H que contenía una secuencia líder en el
extremo 5' o un ADNc para la cadena L que contenía la secuencia
FLAG en su extremo 3'. Los ADNc resultante para la cadena H y la
cadena L se mezclaron y se llevó a cabo la PCR repitiendo 5 veces
el ciclo de temperatura que consistía en 94ºC durante 30 segundos,
60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, en este orden,
usando la mezcla como moldes y la polimerasa KOD. Se añadieron a la
mezcla de reacción los cebadores CFHL-F1 y
CFHL-R1 y después la reacción PCR se llevó a cabo
repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura mencionado antes para
producir el ADNc para el tipo HL-0 sin conector.
Para construir el scFv de tipo LH, la reacción
PCR se llevó a cabo usando, como molde pGEM-M2L y
pGEM-M2H que contienen los ADNc que codifican la
región V de la cadena L y la región V de la cadena H del anticuerpo
MABL-2, respectivamente (véase el documento
JP-Appl. 11-63557). Se usaron una
pareja del cebador T7 (ID SEC Nº: 37) y el cebador
CFLH-R2 (ID SEC Nº: 38) o una pareja del cebador
CFLH-F2 (ID SEC Nº: 39) y CFLH-R1
(ID SEC Nº: 40) y la polimerasa KOD (Toyobo Inc.). La reacción PCR
se llevó a cabo repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto en un orden secuencial para producir un ADNc
de una cadena L que contiene un secuencia líder en el extremo 5' o
un ADNc de una cadena H que contiene la secuencia FLAG en su extremo
3'. Los ADNc resultantes de la cadena L y la cadena H se mezclaron
y se llevó a cabo la PCR usando esta mezcla como moldes y la
polimerasa KOD, repitiendo 5 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, en este orden. A la mezcla de reacción se
añadieron los cebadores T7 y CFLH-R1 y la reacción
se llevó a cabo repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura
mencionado antes. El producto de reacción se usó como molde y la
PCR se llevó a cabo usando una pareja del cebador
CFLH-F4 (ID SEC Nº: 41) y el cebador
CFLH-R1 repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura
que consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos
y 72ºC durante 1 minuto, en este orden, para producir un ADNc de
tipo LH-0 sin conector.
Los ADNc resultantes de los tipos
LH-0 y HL-0 se digirieron con las
enzimas de restricción EcoRI y BamHI (Takara Shuzo) y los ADNc
digeridos se introdujeron en un plásmido de expresión INPEP4 para
células de mamífero usando Ligation High (Toyobo Inc.),
respectivamente. Se transformó JM109 de E. coli competente
(Nippon Gene) con cada uno de los plásmidos, y los plásmidos
deseados se aislaron de E. coli transformada usando el kit
QIAGEN Plasmid Maxi (QUIAGEN). De esta forma se prepararon los
plásmidos pCF2LH-0 y pCF2HL-0.
Para construir los plásmidos de expresión de
tipo HL que contienen conectores con tamaños diferentes, se usaron
pCF2HL-0 como molde y CFHL-X3 (ID
SEC Nº: 42), CFHL-X4 (ID SEC Nº: 43),
CFHL-X5 (ID SEC Nº: 44), CFHL-X6 (ID
SEC Nº: 45) o CFHL-X7 (ID SEC Nº: 46), como un
cebador homosentido, y el cebador BGH-1 (ID SEC
Nº:47) como un cebador antisentido, que es complementario con la
secuencia del vector. La reacción de la PCR se llevó a cabo usando
la polimerasa KOD repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, en este orden, y los productos de reacción
se digirieron con las enzimas de restricción XhoI y BamHI (Takara
Shuzo). Los fragmentos digeridos se introdujeron entre los sitios
XhoI y BamHI en pCF2HL-0 usando Ligation High
(Toyobo Inc.), respectivamente. Se transformó JM109 de E.
coli competente con cada uno de los plásmidos, y los plásmidos
deseados se aislaron de E. coli transformada usando el kit
Qiagen Plasmid Maxi. Así, se prepararon los plásmidos de expresión
pCF2HL-3, pCF2HL-4,
pCF2HL-5, pCF2HL-6 y
pCF2HL-7.
Para construir el plásmido de expresión para la
expresión transitoria en células COS7 los plásmidos
pCF2HL-0, pCF2HL-3,
PCF2HL-4, pCF2HL-5,
pCF2HL-6 y pCF2HL-7 se digirieron
con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (Takara Shuzo) y los
fragmentos resultantes de aproximadamente 800 pb se purificaron con
electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos obtenidos se
introdujeron entre los sitios EcoRI y BamHI en un plásmido de
expresión pCOS1 para la expresión en células de mamífero usando
Ligation High (Toyobo Inc.), respectivamente. Se transformó
DH\alpha5 de E. coli competente (Toyobo Inc.) con cada uno
de los plásmidos, y los plásmidos deseados se aislaron de E.
coli transformada usando el kit Qiagen Plasmid Maxi. Así, se
prepararon los plásmidos CF2HL-0/pCOS1,
CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1,
CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 y
CF2HL-7/pCOS1.
Como ejemplo típico de estos plásmidos, se
ilustra en la Figura 35 la construcción del plásmido
CF2HL-0/pCOS1 y la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos de MABL2-scFv
<HL-0> contenida en el plásmido, se muestran
en el ID SEC Nº 48. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias
de aminoácidos de las regiones del conector en estos plásmidos
también se muestran en la Fig. 36.
Para construir los plásmidos de expresión de
tipo LH que contienen conectores de tamaño diferente, se usaron
pCF2LH-0, como un molde, y CFLH-X3
(ID SEC Nº: 49), CFLH-X4 (ID SEC Nº: 50),
CFLH-X5 (ID SEC Nº: 51), CFLH-X6,
(ID SEC Nº: 52) o CFLH-X7 (ID SEC Nº: 53), como un
cebador homosentido, y el cebador BGH-1 como un
cebador antisentido, que es complementario con la secuencia del
vector usado. La reacción de la PCR se llevó a cabo usando la
polimerasa KOD, repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, en este orden, y los productos de reacción se
digirieron con las enzimas de restricción XhoI y BamHI. Los
fragmentos digeridos se introdujeron en pCF2LH-0
entre los sitios XhoI y BamHI usando Ligation High,
respectivamente. Se transformó DH\alpha5 de E. coli
competente (Toyobo Inc.) con cada uno de los plásmidos, y los
plásmidos deseados se aislaron de E. coli transformada
usando el kit Qiagen Plasmid Maxi. Así, se prepararon los vectores
de expresión pCF2LH-3, pCF2LH-4,
pCF2LH-5, pCF2LH-6 y
pCF2LH-7.
Para construir el plásmido de expresión para la
expresión transitoria en células COS7 los plásmidos
pCF2LH-0, pCF2LH-3,
pCF2LH-4, pCF2LH-5,
pCF2LH-6 y pCF2LH-7 se digirieron
con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (Takara Shuzo) y los
fragmentos resultantes de aproximadamente 800 pb se purificaron por
electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos obtenidos se
introdujeron entre los sitios XhoI y BamHI en un plásmido de
expresión pCOS1 para la expresión en células de mamífero usando
Ligation High, respectivamente. Se transformó DH\alpha5 de E.
coli competente (Toyobo Inc.) con cada uno de los plásmidos y
los plásmidos deseados se aislaron de E. coli transformada
usando el kit Qiagen Plasmid Maxi. Por consiguiente, se prepararon
los plásmidos CF2LH-0/pCOS1,
CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1,
CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 y
CF2LH-7/pCOS1.
Como ejemplo típico de estos plásmidos, en la
Figura 37 se ilustra la construcción del plásmido
CF2LH-0/pCOS1 y la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos de MABL2-scFv
<LH-0> contenida en el plásmido, se muestran
en el ID SEC Nº 54. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias
de aminoácidos de las regiones del conector en estos plásmidos
también se muestran en la Fig. 38.
Los scFv y sc(Fv)_{2} de tipo HL
y tipo LH se expresaron transitoriamente en células COS7 (JCRB9127,
Japan Health Sciences Foundation). Las células COS7 se
subcultivaron en medio DMEM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino
fetal al 10% serum (HyClone) a 37ºC en un incubador en atmósfera de
dióxido de carbono. Las células COS7 se transfectaron con los
vectores CF2HL-0, 3\sim7/pCOS1, o
CF2LH-0/3\sim7/pCOS1 preparados en el Ejemplo 6.2
o los vectores pCHOM2(Fv)_{2} por electroporación
usando el aparato Gene Pulser (BioRad). Se añadieron a la cubeta el
ADN (10 \mug) y 0,25 ml de 2 x 10^{7} células/ml en medio de
cultivo DMEM que contenía FBS al 10% y BES 5 mM (SIGMA). Después de
reposar durante 10 minutos las mezclas se trataron con pulsos a 0,17
kV, 950 \muF de capacidad eléctrica. Después de restauración
durante 10 minutos a temperatura ambiente, las células
electroporadas se transfirieron al medio de cultivo DMEM (FBS al
10%) en un matraz de 75 cm^{3}. Después de cultivar durante 72
horas, se recogió el líquido sobrenadante del cultivo y se
centrifugó para separar los fragmentos celulares. El líquido
sobrenadante del cultivo se sometió a filtración usando un filtro
superior de botella de 0,22 \mum (FALCON) para obtener el líquido
sobrenadante del cultivo (en lo sucesivo "CM").
Las células transfectadas de la misma forma que
en (1) se transfirieron al medio DMEM (FBS al 10%) en un matraz de
75 cm^{3} y se cultivaron toda la noche. Después del cultivo, se
descartó el líquido sobrenadante y las células se lavaron con PBS y
después se añadieron al medio
CHO-S-SFM II (GIBCO BRL). Después de
cultivar durante 72 horas, se recogió el líquido sobrenadante del
cultivo, se centrifugó para separar los fragmentos celulares y se
filtró usando un filtro superior de botella de 0,22 \mum (FALCON)
para obtener el CM.
Los diferentes MABL2-scFv y
sc(Fv)_{2} en el CM de COS7 preparado en el Ejemplo
6.3 (2) mencionado antes, se detectaron por el procedimiento de
transferencia Western.
Cada CM de COS7 se sometió a electroforesis en
SDS-PAGE y se transfirió a una membrana REINFORCED
NC (Schleicher & Schuell). La membrana se bloqueó con leche
desnatada al 5% (Morinaga Nyu-gyo) y se lavó con
TBS. Después se añadió a la misma un anticuerpo
anti-FLAG (SIGMA). La membrana se incubó a
temperatura ambiente y se lavó. Se añadió un anticuerpo IgG de
ratón marcado con peroxidasa (Jackson Immuno Research). Después de
incubar y lavar a temperatura ambiente, se añadió la solución de
sustrato (Kirkegaard Perry Laboratories) para el desarrollo de color
(Fig. 39).
La citometría de flujo se llevó a cabo usando
los líquidos sobrenadantes del cultivo de células COS7 preparadas
en el Ejemplo 6.3 (1), para medir la unión de
MABL2-scFv y sc(Fv)_{2} al antígeno
proteína asociada a integrina (IAP) humana. Se añadieron los
líquidos sobrenadantes del cultivo que se iban a ensayar o un
líquido sobrenadante del cultivo de células COS7 como un control a
2 x 10^{5} células de la línea celular de leucemia de ratón L1210
que expresa la IAP humana. Después de incubar sobre hielo y lavar,
se añadieron 10 \mug/ml del anticuerpo anti-FLAG
de ratón (SIGMA) y después las células se incubaron y se lavaron.
Después, se le añadió el anticuerpo anti-IgG de
ratón marcado con FITC (BECTON DICKINSON) y las células se incubaron
y lavaron otra vez. Se midió la intensidad de la fluorescencia
usando el aparato FACScan (BECTON DICKINSON). Los resultados de la
citometría de flujo muestran que los MABL2-scFv que
tienen conectores con diferente longitud y los
sc(Fv)_{2} en los líquidos sobrenadantes del
cultivo de COS7 tienen una alta afinidad por la IAP humana (Véanse
las Figuras 40a y 40b).
Se examinó la acción de inducción de apoptosis
de los líquidos sobrenadantes del cultivo de COS7 preparados en el
Ejemplo 6.3 (1) por tinción con Anexina-V
(Boehringer Mannheim) usando las células L1210 transfectadas con el
gen de IAP humano (hIAP/L1210).
A 5 x 10^{4} células de las células hIAP/L1210
se añadieron los líquidos sobrenadantes del cultivo de células COS7
transfectadas con cada uno de los vectores o un líquido sobrenadante
del cultivo de células COS7 como control con una concentración
final de 10% y las mezclas se cultivaron durante 24 horas. Después,
se llevó a cabo la tinción con Anexina-V/PI y se
midió la intensidad de la fluorescencia usando el aparato FACScan
(BECTON DICKINSON). Los resultados pusieron de manifiesto que los
scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> y
sc(Fv)_{2} en los CM de COS7 inducían de forma
notable la muerte celular de las células hIAP/L1210. Estos
resultados se muestran en la Figura 41.
Para aislar y purificar
MABL2-scFv y sc(Fv)_{2} del líquido
sobrenadante del cultivo, se construyeron los vectores de expresión
para la expresión en células CHO como sigue.
Los fragmentos EcoRI-BamHI de
pCF2HL-0, 3\sim7, y PCF2LH-0,
3\sim7 preparados en el Ejemplo 6.2 se introdujeron entre los
sitios EcoRI y BamHI en un vector de expresión pCHO1 para células
CHO usando el Ligation High. Se transformaron DH5\alpha de E.
coli competentes con los mismos. Los plásmidos se aislaron de
E. coli transformada usando el kit QIAGEN Plasmid Midi
(QIAGEN) para preparar los plásmidos de expresión
pCHOM2HL-0, 3\sim7, y pCHOM2LH-0,
3\sim7.
Las células CHO se transformaron con cada uno de
los plásmidos de expresión pCHOM2HL-0, 3\sim7, y
pCHOM2
LH-0, 3\sim7, construidos en el Ejemplo 6.7 y el vector pCHOM2(Fv)_{2} para preparar las células CHO que expresan de forma constante cada polipéptido reconstruido. Como un ejemplo típico de las mismas, se ilustra a continuación la producción de células CHO que expresan de forma constante MABL2-scFv <HL-5> o sc(Fv)_{2}.
LH-0, 3\sim7, construidos en el Ejemplo 6.7 y el vector pCHOM2(Fv)_{2} para preparar las células CHO que expresan de forma constante cada polipéptido reconstruido. Como un ejemplo típico de las mismas, se ilustra a continuación la producción de células CHO que expresan de forma constante MABL2-scFv <HL-5> o sc(Fv)_{2}.
Los plásmidos de expresión
pCHOM2HL-5 y pCHOM2(Fv)_{2} se
linealizaron por digestión con una enzima de restricción PvuI y se
sometieron a transfección a células CHO mediante electroporación
usando el aparato Gene Pulser (BioRad). Se añadieron el ADN (10
\mug) y 0,75 ml de PBS con 1 x 10^{7} células/ml a una cubeta y
se trataron con pulsos a 1,5 kV, 25 \muF de capacidad eléctrica.
Después de restauración durante 10 minutos a temperatura ambiente,
las células electroporadas se transfirieron a medio de cultivo
\alpha-MEM que contenía ácido nucleico (GIBCO
BRL) que contenía suero bovino fetal al 10% y se cultivaron. Después
de cultivo durante toda la noche, el líquido sobrenadante se
descartó. Las células se lavaron con PBS y se añadieron a medio de
cultivo \alpha-MEM sin ácido nucleico (GIBCO BRL)
que contenía suero bovino fetal al 10%. Después de cultivo durante
dos semanas, las células se cultivaron en un medio que contenía
metotrexato 10 nM (concentración final) (SIGMA), después
metotrexato 50 nM y 100 nM. Las células resultantes se cultivaron en
el medio CHO-S-SFM II sin suero
(GIBCO BRL) en una botella giratoria. Se recogió el líquido
sobrenadante del cultivo, se centrifugó para separar los fragmentos
celulares y se filtró usando un filtro con un tamaño de poros de
0,22 \mum para obtener el CM, respectivamente.
De acuerdo con lo anterior, se obtuvieron
células CHO que expresan de forma constante
MABL2-scFv <HL-0, -3, -4, -6>
-7> y <LH-0, -3, -4, -5, -6, -7> y los CM
de las mismas.
Los MABL2-scFv
<HL-5> y sc(Fv)_{2} se
purificaron a partir de los CM preparados en el Ejemplo 6.8 por dos
tipos de procedimientos de purificación, como sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
HL-5 y
sc(Fv)_{2} se purificaron por cromatografía en
columna de afinidad de anticuerpo anti-FLAG, usando
la secuencia FLAG localizada en el extremo
C-terminal del polipéptido, y por filtración en gel.
Un litro de CM obtenido en 6.8 se aplicó en una columna (7,9 ml)
preparada con el gel de afinidad anti-FLAG M2
(SIGMA) equilibrada con tampón Tris-HCl 50 mM (TBS,
pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM. Después de lavar la columna con
TBS, el scFv eluyó con tampón de glicina-HCl 0,1 M,
pH 3,5. Las fracciones resultantes se analizaron por
SDS-PAGE y se confirmó la elución del scFv. La
fracción de scFv se mezcló con Tween 20 hasta 0,01% de la
concentración final y se concentró usando el
Centricon-10 (MILIPORE). El concentrado se aplicó en
una columna TSKgel G300SWG (7,5 x 600 mm) equilibrada con tampón de
acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,01%.
Con un caudal de 0,4 ml/minuto, el scFv se detectó por absorción a
280 nm. El HL-5 eluyó como la fracción principal en
la posición del dímero y el sc(Fv)_{2} eluyó en la
posición del monómero.
\vskip1.000000\baselineskip
HL-5 y
sc(Fv)_{2} se purificaron usando tres etapas que
comprendían cromatografía de intercambio iónico, hidroxiapatito y
filtración en gel. En la cromatografía de intercambio iónico se usó
la columna de flujo rápido de sefarosa-Q
(Pharamacia) para HL-5 y la columna de flujo rápido
de sefarosa-SP para sc(Fv)_{2}. En y
después de la segunda etapa, HL-5 y
sc(Fv)_{2} se procesaron por el mismo
procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
El CM de HL-5 se diluyó dos
veces con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0) que
contenía Tween 20 al 0,02% y después el pH se ajustó a 9,0 con Tris
1 M. La solución se aplicó en la columna de flujo rápido de sefarosa
Q equilibrada con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH 8,5)
que contenía Tween 20 al 0,02%. Se eluyó un polipéptido adsorbido en
la columna por un gradiente lineal de NaCl en el mismo tampón, de
0,1 a 0,55 M. Haciendo el seguimiento de las fracciones eluidas por
SDS-PAGE, se recogieron las fracciones que contenían
HL-5 y se sometieron al hidroxiapatito de la
segunda etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
El CM de sc(Fv)_{2} se diluyó
dos veces con tampón de acetato 20 mM (pH 5,5) que contenía Tween 20
al 0,02% y después el pH se ajustó a 5,5 con ácido acético 1 M. La
solución se aplicó en una columna de flujo rápido de
sefarosa-SP equilibrada con tampón de acetato 20 mM
(pH 5,5) que contenía Tween 20 al 0,02%. Eluyó un polipéptido
adsorbido en la columna por un gradiente lineal de NaCl en el
tampón, de 0 a 0,5 M. Haciendo el seguimiento de las fracciones
eluidas por SDS-PAGE, se recogieron las fracciones
que contenían sc(Fv)_{2} y se sometieron al
hidroxiapatito de la segunda etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones de HL-5 y
sc(Fv)_{2} obtenidas en la primera etapa se
aplicaron por separado en la columna de hidroxiapatito (Tipo I,
BIORAD) equilibrada con tampón de fosfato 10 mM que contenía Tween
20 al 0,02%, pH 7,0. Después de lavar la columna con el mismo
tampón, eluyeron los polipéptidos adsorbidos en la columna por un
gradiente lineal de tampón de fosfato hasta 0,5 M. Haciendo el
seguimiento de las fracciones eluidas por SDS-PAGE,
se recogieron las fracciones que contenían los polipéptidos
deseados.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada una de las fracciones obtenidas en la
segunda etapa se concentró por separado con
CentriPrep-10 (MILIPORE) y se aplicó en una columna
Superdex (2,6 x 60 cm, Pharmacia) equilibrada con tampón de acetato
20 mM (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,02% y NaCl 0,15 M.
HL-5 eluyó en la posición del dímero y
sc(Fv)HL-5 y
sc(Fv)_{2} eluyeron en la posición del monómero
como un pico principal, respectivamente.
Puesto que el monómero de HL-5
apenas se detectaba por ambos procedimientos de purificación, se
demuestra que los dímeros de los Fv de cadena sencilla se forman
con rendimientos altos cuando el conector para el Fv de cadena
sencilla contiene alrededor de 5 aminoácidos. Además, el dímero de
HL-5 y sc(Fv)_{2} se conservaban
establemente durante un mes a 4ºC después de purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
La citometría de flujo se llevó a cabo usando el
dímero purificado MABL2-scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2}
purificado con el fin de evaluar la unión al antígeno proteína
asociada a integrina humana (IAP). Se añadieron 10 \mug/ml del
dímero purificado de MABL2-scFv
<HL-5>, el sc(Fv)_{2}
purificado, el anticuerpo MABL-2 como control
positivo o una IgG de ratón (Zymed) como control negativo a 2 x
10^{5} células de la línea celular de leucemia de ratón L1210 que
expresa la IAP humana (hIAP/L1210) o la línea celular L1210
transformada con pCOS1 (pCOS1/L1210) como control. Después de
incubación sobre hielo y lavado, se añadieron 10 \mug/ml del
anticuerpo anti-FLAG de ratón (SIGMA) y después las
células se incubaron y lavaron. Se añadieron a las mismas,
anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC
(BECTON DICKINSON) y las células se incubaron y lavaron otra vez.
Después, se midió la intensidad de la fluorescencia usando el
aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Puesto que el dímero purificado de
MABL2-scFv <HL-5> y el
sc(Fv)_{2} purificado se unían específicamente a
las células hIAP/L1210, se confirma que el dímero de scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2} tienen
una alta afinidad por la IAP humana (véase la Fig. 42).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la acción de inducción de apoptosis
del dímero purificado de MABL2-scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2}
purificado por tinción con Anexina-V (Boehringer
Mannheim) usando las células L1210 en las que se había introducido
el gen de IAP humano y las células de la línea celular de leucemia
humana CCRF-CEM.
Se añadieron diferentes concentraciones del
dímero purificado de MABL2-scFv
<HL-5>, el
MABL2-sc(Fv)_{2} purificado, el
anticuerpo MABL-2 como control positivo o una IgG de
ratón como control negativo, a 5 x 10^{4} células de la línea
celular hIAP/L1210 o 1 x 10^{5} células de la línea celular
CCRF-CEM. Después de cultivar durante 24 horas, se
llevó a cabo la tinción con Anexina-V y se midió su
intensidad de fluorescencia usando el aparato FACScan (BECTON
DICKINSON). Como resultado, el dímero de MABL2-scFv
<HL-5> y el
MABL2-sc(Fv)_{2} inducían
notablemente la muerte celular de hHIAP/L1210 y
CCRF-CEM de una forma dependiente de la
concentración (véase la Fig. 43).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de hemaglutinación se llevó a cabo
usando concentraciones diferentes del dímero purificado de scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2}
purificado de acuerdo con el Ejemplo 5.15.
Se observó hemaglutinación con el anticuerpo
MABL-2 como control positivo, mientras que no se
observó hemaglutinación ni con el anticuerpo de cadena sencilla
MABL2-sc(Fv)_{2} ni el
MABL2-scFv <HL-5>. Además, no
había una diferencia sustancial en la hemaglutinación entre dos
tampones usados con el anticuerpo MABL-2. Estos
resultados se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se ensayaron los efectos antitumorales del
dímero de scFv <HL-5> y
sc(Fv)_{2} preparados y purificados en los Ejemplos
6.8 y 6.9. El ensayo se llevó a cabo usando el modelo de ratón para
el mieloma humano producido en el Ejemplo 5.1 y determinando la
cantidad de proteína M producida por las células de mieloma humano
en el suero de ratón usando ELISA y examinando el tiempo de
supervivencia del ratón. Después, se evaluaron los efectos
antitumorales del dímero scFv <HL-5> y
sc(Fv)_{2} en términos del cambio de la cantidad de
proteína M en el suero de ratón y el tiempo de supervivencia del
ratón.
En el ensayo, se usaron HL-5 y
sc(Fv)_{2} en forma de una solución de 0,01, 0,1 ó 1
mg/ml en vehículo que consistía en NaCl 150 mM, Tween al 0,02% y
tampón de acetato 20 mM, pH 6,0 y se administraron a los ratones
con una dosificación de 0,1, 1 ó 10 mg/kg. Al grupo de ratones de
control se les administró sólo vehículo.
El suero de ratón se recogió 26 días después del
trasplante de las células de mieloma humano y se midió la cantidad
de proteína M en el suero usando ELISA de acuerdo con el Ejemplo
5.14. Como resultado, la cantidad de proteína M en el suero de
ambos grupos de ratones a los que se había administrado
HL-5, el dímero y sc(Fv)_{2},
disminuyó de una forma dependiente de la dosis (véase la Figura 44).
Además, se observó una prolongación significativa del tiempo de
supervivencia en ambos grupos a los que se había administrado
HL-5 (Fig. 45) y el sc(Fv)_{2}
(Fig. 46) en comparación con el grupo de control al que se había
administrado vehículo. Estos resultados muestran que
HL-5 y sc(Fv)_{2} de la invención
tienen un excelente efecto antitumoral in vivo.
la fig. 1 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que el anticuerpo IgG humano no se
une a las células L1210 que expresan la IAP humana (hIAP/L1210);
la fig. 2 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que el anticuerpo
MABL-1 quimérico se une específicamente a las
células L1210 que expresan la IAP humana (hIAP/L1210);
la fig. 3 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que el anticuerpo
MABL-2 quimérico se une específicamente a las
células L1210 que expresan la IAP humana (hIAP/L1210);
la fig. 4 ilustra esquemáticamente el
procedimiento para producir el Fv de cadena sencilla de acuerdo con
la presente invención;
la fig. 5 ilustra una estructura de un plásmido
de expresión que se puede usar para expresar un ADN que codifica el
Fv de cadena sencilla de la invención en E. coli;
la fig. 6 ilustra una estructura de un plásmido
de expresión que se usa para expresar un ADN que codifica el Fv de
cadena sencilla de la invención en células de mamífero;
la fig. 7 muestra una fotografía que muestra el
resultado de la transferencia Western en el Ejemplo 5.4. Desde la
izquierda, un marcador de peso molecular (que indica 97,4, 66, 45,
31, 21,5 y 14,5 kDa desde la parte superior), el líquido
sobrenadante del cultivo de células COS7 en las que se ha
introducido pCHO1 y el líquido sobrenadante del cultivo de células
COS7 en las que se ha introducido pCHOM2. Ilustra que el Fv de
cadena sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-2
(flecha) está contenido en el líquido sobrenadante del cultivo de
las células en las que se ha introducido pCHOM2;
la fig. 8 muestra el resultado de la citometría
de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido sobrenadante
del cultivo de células pCHO1/COS7 como control, no se une a células
pCOS1/L1210 como control;
la fig. 9 muestra el resultado de la citometría
de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido sobrenadante
del cultivo de células MABL2-scFv/COS7 no se une a
células pCOS1/L1210 como control;
la fig. 10 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido
sobrenadante del cultivo de células pCOS1/COS7 como control no se
une a células hIAP/L1210;
la fig. 11 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido
sobrenadante del cultivo de células
MABL-2-scFv/COS7 se une
específicamente a células hIAP/L1210;
la fig.12 muestra el resultado del ELISA
competitivo en el Ejemplo 5.6, en el que se demuestra la actividad
de unión del Fv de cadena sencilla de la invención
(MABL2-scFv) al antígeno, en términos de inhibición
de la unión del anticuerpo MABL-2 monoclonal de
ratón al antígeno como un índice, en comparación con el líquido
sobrenadante del cultivo de células pCHO1/COS7 como control;
la fig. 13 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
pCHO1/COS7 como control no induce la apoptosis de células
pCOS1/L1210 como control;
la fig. 14 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
MABL2-scFv/COS7 no induce la apoptosis de células
pCOS1/L1210 como control;
la fig. 15 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
pCHO1/COS7 como control no induce la apoptosis de células
hIAP/L1210;
la fig. 16 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
MABL2-scFv/COS7 induce específicamente la apoptosis
de células hIAP/L1210;
la fig. 17 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
pCHO1/COS7 como control no induce la apoptosis de células
CCRF-CEM (al 50% de la concentración final);
la fig. 18 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
MABL2-scFv/COS7 induce específicamente la apoptosis
de células CCRF-CEM (al 50% de la concentración
final);
la fig. 19 muestra el cromatograma obtenido en
la purificación del Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por las células CHO en el Ejemplo
5.9, que ilustra que la fracción A y la fracción B se obtuvieron
como picos mayoritarios cuando la fracción de la columna de
sefarosa-azul se purificó con la columna de
hidroxiapatito;
la fig. 20 muestra los resultados de la
purificación por filtración en gel de la fracción A y la fracción B
obtenidas en el Ejemplo 5.9-(2), que ilustra que los picos
principales (AI y BI, respectivamente) eluyeron de la fracción A a
aproximadamente 36 kD de peso molecular aparente y de la fracción B
a aproximadamente 76 kD;
la fig. 21 es el análisis en
SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la
purificación del Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por las células CHO en el Ejemplo
5.9, que ilustra que en ambas fracciones se observaba una sola
banda de aproximadamente 35 kD de peso molecular;
la fig. 22 muestra los resultados del análisis
de las fracciones AI y BI obtenidas por la filtración en gel, en la
purificación de Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por las células CHO, en la que la
fracción AI comprende el monómero y la fracción BI comprende el
dímero.
la fig. 23 ilustra una estructura de un
plásmido de expresión que se puede usar para expresar un ADN que
codifica el Fv de cadena sencilla de la invención, en E.
coli;
la fig. 24 muestra los resultados de la
purificación en la columna de filtración en gel de los productos
brutos del polipéptido Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por E. coli, obtenido en el
Ejemplo 5.12, en la que cada pico indica monómero o dímero,
respectivamente, del Fv de cadena sencilla producido por E.
coli;
la fig. 25 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
anticuerpo IgG de ratón como control no induce la apoptosis de las
células hIAP/L1210 (concentración final de 3 \mug/ml).
la fig. 26 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
dímero de MABL2-scFv producido por las células CHO
induce notablemente la apoptosis de células hIAP/L1210
(concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 27 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
dímero de MABL2-scFv producido por E. coli
induce notablemente la apoptosis de células hIAP/L1210
(concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 28 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que la
inducción de apoptosis en células hIAP/L1210 por el monómero de
MABL2-scFv producido por células CHO es del mismo
nivel que el del control (concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 29 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que la
inducción de apoptosis en células hIAP/L1210 del monómero de
MABL2-scFv producido por E. coli es del
mismo nivel que el del control (concentración final de 3
\mug/ml);
la fig. 30 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
anticuerpo IgG de ratón usado como control no induce la apoptosis en
células hIAP/L1210 incluso cuando se añade el anticuerpo
anti-FLAG (concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 31 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
monómero de MABL2-scFv producido por células CHO
induce notablemente la apoptosis de células hIAP/L1210 cuando se
añade el anticuerpo anti-FLAG (concentración final
de 3 \mug/ml);
la fig. 32 muestra los resultados de la
medición cuantitativa de la IgG humana en el suero de un ratón al
que se ha trasplantado una línea celular de mieloma humano KPMM2,
que indican cantidades de IgG humana producida por las células de
mieloma humano en el ratón. Ilustra que el dímero de scFv/CHO induce
notablemente el crecimiento de células KPMM2;
la fig. 33 muestra el tiempo de supervivencia
del ratón después del trasplante del tumor, que ilustra que el
grupo al que se administró el dímero de scFv/CHO prolongaba
notablemente el tiempo de supervivencia;
la fig. 34 ilustra una estructura de un
plásmido de expresión que expresa un polipéptido reconstruido
[sc(Fv)_{2}] que comprende dos regiones V de la
cadena H y dos regiones V de la cadena L derivadas del anticuerpo
MABL-2;
la fig. 35 ilustra una estructura de un
plásmido que expresa un scFv (tipo HL) en el que las regiones V
están unidas de la forma [cadena H]-[cadena L] sin un péptido
conector;
la fig. 36 ilustra una estructura del
polipéptido de tipo HL y las secuencias de aminoácidos de conectores
peptídicos;
la fig. 37 ilustra una estructura de un
plásmido que expresa un scFv (tipo LH) en el que las regiones V
están unidas de la forma [cadena L]-[cadena H] sin un péptido
conector;
la fig. 38 ilustra una estructura del
polipéptido de tipo LH y las secuencias de aminoácidos de conectores
peptídicos;
la fig. 39 muestra los resultados de la
transferencia Western en el Ejemplo 6.4, que ilustra que se expresan
el polipéptido reconstruido sc(Fv)_{2} que
comprende dos regiones V de la cadena H y dos cadenas V de la
cadena L, y el MABL2-scFv que tiene conectores
peptídicos con diferentes longitudes;
las figs. 40a y 40b muestran los resultados de
la citometría de flujo usando el líquido sobrenadante del cultivo
de células COS7 preparado en el Ejemplo 6.3 (1), que ilustra que
MABL2-scFv y sc(Fv)_{2} que tienen
conectores peptídicos con diferentes longitudes tienen afinidades
altas frente a la IAP humana;
las figs. 41 muestra los resultados del efecto
de inducción de apoptosis en el Ejemplo 6.6, que ilustran que el
scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6 y 7> y el
sc(Fv)_{2} inducen notablemente la muerte celular de
células hIAP/L1210;
la fig. 42 muestra los resultados de la
evaluación de la capacidad de unión al antígeno en el Ejemplo 6.10,
que ilustra que el dímero de scFv <HL5> y
sc(Fv)_{2} tienen afinidades altas frente a la IAP
humana;
la fig. 43 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis in vitro en el Ejemplo 6.11, que
ilustran que el dímero de scFv <HL5> y sc(Fv)2
inducen la apoptosis de células hIAP/L1210 y células
CCRF-CEM de forma dependiente de la
concentración;
la fig.44 muestra los resultados de la medición
cuantitativa de la proteína M producida por una línea celular de
mieloma humano KPMM2 en el suero de ratón al que se ha trasplantado
la línea celular de mieloma humano. Ilustra que el dímero de scFv
<HL5> y sc(Fv)_{2} inhiben notablemente el
crecimiento de las células KPMM2;
la fig. 45 muestra el tiempo de supervivencia
(días) de los ratones después del trasplante del tumor, que ilustra
que el tiempo de supervivencia del grupo al que se había
administrado scFv <HL5> se había prolongado notablemente;
la fig. 46 muestra el tiempo de supervivencia
(días) de los ratones después del trasplante del tumor, que ilustra
que el tiempo de supervivencia del grupo al que se había
administrado sc(Fv)_{2} se había prolongado
notablemente.
Los polipéptidos reconstruidos de la invención
tienen propiedades de inducción de la apoptosis de células
sanguíneas nucleadas que tienen la proteína asociada a integrina
(IAP) y no producen hemaglutinación, y son útiles como un agente
terapéutico para la discrasia sanguínea, por ejemplo, leucemia tal
como leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia
linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, leucemia de
células T en adultos, mieloma múltiple, leucemia mixta y leucemia de
células pilosas, linfoma maligno (enfermedad de Hodgkin, linfoma de
no Hodgkin), anemia aplásica, síndrome mielodisplásico y policitemia
vera.
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptido inductor de
apoptosis
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FOP-415
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
12-3-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/523.095
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-3-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2000-115246
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-04-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2000-321822
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-10-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(393)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M1L. 1\sim57;
péptido señal, 58\sim394; péptido maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M1H.
1-57; péptido señal, 58-409; péptido
maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm10
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(393)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M2L. 1\sim57;
péptido señal, 58\sim394; péptido maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M2H. 1\sim57;
péptido señal, 58\sim409; péptido maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos y secuencia
de nucleótidos del conector
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(826)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pscM1.
MABL1-scFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm27
\hskip1cm28
\hskip1cm29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(813)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHOM1.
MABL1-scFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm32
\hskip1cm33
\hskip1cm34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pscM2.
MABL2-scFv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm35
\hskip1cm36
\hskip1cm37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(813)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHOM2.
MABL2-scFv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
\hskip1cm39
\hskip1cm40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(450)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHO-shIAP. IAP
humana soluble
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm41
\hskip1cm42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(735)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pscM2DEm01.
MABL2-scFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm45
\hskip1cm46
\hskip1cm47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1599)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHOM2(Fv)2.
MABL2-sc(Fv)2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm50
\hskip1cm51
\hskip1cm52
\hskip1cm53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm60
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm61
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm63
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm64
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm65
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm66
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm67
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 46
\hskip1cm68
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<210> 47
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 47
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<210> 48
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<211> 780
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<212> ADN
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<213> Mus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(768)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CF2HL-0/pCOS1.
MABL2-scFv <HL-0>
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<400> 48
\hskip1cm70
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 49
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 50
\hskip1cm73
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<210> 51
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<211> 51
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<220>
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<400> 51
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<400> 52
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<222> (1)...(768)
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<223> CF2HL-0/pCOS1.
MABL2-scFv <LH-0>
\newpage
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<400> 54
\hskip1cm77
\hskip1cm78
\hskip1cm79
Claims (12)
1. Un polipéptido reconstruido que se une a la
proteína asociada a integrina (IAP), induce apoptosis de células
sanguíneas nucleadas y no produce hemaglutinación,
en el que el polipéptido reconstruido comprende
dos regiones V de la cadena H y dos regiones V de la cadena L de un
anticuerpo que se une a la IAP e induce apoptosis de células
sanguíneas nucleadas, y
en el que el polipéptido reconstruido es un
dímero de un Fv de cadena sencilla que comprende una región V de la
cadena H y una región V de la cadena L o un polipéptido de cadena
sencilla que comprende dos regiones V de la cadena H y dos regiones
V de la cadena L.
2. El polipéptido reconstruido de la
reivindicación 1, en el que el polipéptido reconstituido es un
dímero purificado de un Fv de cadena sencilla.
3. El polipéptido reconstruido de la
reivindicación 1 ó 2, en el que la región V de la cadena H y la
región V de la cadena L están unidas con un conector que comprende
al menos un aminoácido.
4. Un ADN que codifica el Fv de cadena sencilla
de las reivindicaciones 1 ó 3.
5. Un ADN que codifica el polipéptido de las
reivindicaciones 1 ó 3.
6. El polipéptido reconstruido de la
reivindicación 1, en el que la región V de la cadena H y/o la región
V de la cadena L están humanizadas.
7. Un ADN que codifica el polipéptido de la
reivindicación 6.
8. Una célula animal que produce el polipéptido
reconstruido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y
6.
9. Un microorganismo que produce el polipéptido
reconstruido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y
6.
10. Un agente terapéutico para la discrasia
sanguínea que comprende el polipéptido reconstruido de una
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 6 como un principio
activo.
11. El agente terapéutico de la reivindicación
10 caracterizado porque la discrasia sanguínea es
leucemia.
12. El agente terapéutico de la reivindicación
10 caracterizado porque el principio activo es el dímero del
Fv de cadena sencilla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3.
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