ES2312441T3 - Bacteriocina anti-listeria. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido aislado, caracterizado porque se trata de una bacteriocina, denominada sakacina G de secuencia ID Nº 12, procedente de la cepa Lactobacillus sakei 2512 depositada en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM) bajo el número I-2479.
Description
Bacteriocina anti-listeria.
La presente invención se refiere a una
bacteriocina de Lactobacillus sakei y más particularmente de
Lactobacillus sakei 2512, a un secuencia nucleotídica que
codifica esta bacteriocina, y a la utilización industrial de esta
bacteriocina como agente activo contra floras patógenas o
indeseables en la preparación de productos alimentarios.
Las bacterias lácticas se utilizan
intensivamente en las fermentaciones alimentarias con el fin, no
solamente de mejorar el sabor y la textura de los alimentos, sino
sobre todo de prolongar su duración de conservación. Numerosas
bacterias lácticas tiene en efecto la facultad de inhibir el
crecimiento de ciertas bacterias gram-positivas,
entres ellas cepas patógenas como Listeria monocytogenes,
gracias a la secreción de moléculas antagonistas, entre las cuales
se encuentran compuestos peptídicos. Estos compuestos peptídicos,
denominados bacteriocinas, presentan pues un potencial interesante
para la conservación cualitativa y sanitaria de productos
alimentarios fermentados.
Como representativas de estas bacteriocinas, se
pueden citas principalmente la que forman la subclase de
polipéptidos denominados bacteriocinas
anti-Listeria, bacteriocinas de la clase IIa
(Ennahar S. y al., 2000, FEMS Microbiol. Rev.,
24:85-106) y cistibióticos (Jack R. y al., 1995,
Microbiol. Rev., 59(2):171-200).
Recientemente ha habido constancia de la utilización potencial de
una de estas bacteriocinas de la clase IIa, la divercina V41, para
impedir el crecimiento de Listeria monocytogenes en el salmón
ahumado (Duffes F. y al., 1999, J. Food Prot.,
62(12):1394-1403).
Las secuencias de estos polipéptidos presentan
fuertes similitudes en sus extremos N-terminales, en
particular con la presencia de un puente disulfuro. El extremo
C-terminal hidrófobo es mucho más variable, sin
embargo algunas de estas bacteriocinas, denominadas de tipo
pediocina (pediocina PA-1, enterocina A y divercina
V41), se caracterizan por un tamaño superior a 40 residuos y la
presencia de un segundo puente disulfuro en el extremo
C-terminal.
Los autores de la presente invención han puesto
de manifiesto una nueva bacteriocina de clase IIa producida a
partir de una cepa específica de Lactobacillus sakei, que se
ha revelado particularmente eficaz para inhibir el crecimiento de
Listeria, más particularmente de Listeria
monocytogenes.
De acuerdo con Tagg J.R, y al., Bacteriol.
Rev., 40; 722-756 (1976), el término
"Bacteriocina" en el sentido de la invención se refiere a un
polipéptido producido, por síntesis ribosómica, a partir de
microorganismos, capaces de inhibir específicamente el crecimiento
de otras bacterias.
Hugas et al., Food Microbiol, vol.
15, 1998, páginas 639-650 describen el aislamiento
de la sakacina K de Lactobacillus Sakei CTC 494 y su
utilización para impedir el crecimiento y la propagación de
Listeria monocytogenes en productos alimentarios.
La presente invención tiene pues por primer
objeto un polipéptido procedente de la cepa Lactobacillus
sakei 2512, dotado de una actividad de bacteriocina.
La cepa Lactobacillus sakei 2512 ha sido
depositada el 25 de mayo de 2000 en la Collection Nationale des
Cultures des Microorganismes donde fue registrada con el número
de depósito I-2479.
La bacteriocina objeto de la presente invención
se denominó sakacina G. Se trata de un polipéptido que posee una
masa molecular del orden de 3700 a 3900 y preferiblemente de
aproximadamente 3834 Da determinada par espectrometría de masas.
Posee un espectro de inhibición bacteriana muy emparentado con el de
las bacteriocinas de clase IIa. Es por esto por lo que se ha
revelado particularmente eficaz contra las cepas de Lactobacillus
sakei distintas de Lactobacillus sakei 2512,
Pediococcus cerevisiae, conjunto de cepas Listeria y
contra los Enterococcus faecalis y durans. Por el
contrario, se ha revelado inactiva contra otras especies de
Lactobacillus como por ejemplo Lactobacillus debrueckii,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus
casei, y una cepa de Enterococcus faecium.
Igual que las bacteriocinas
anti-Listeria de tipo pediocina, la sakacina
G posee en su estructura peptídica ventajosamente dos puentes
disulfuros.
Un análisis de los determinantes genéticos de
varias bacteriocinas de clase IIa ha mostrado que los genes
implicados en su producción, transporte e inmunidad están
organizados en una o varias estructuras de tipo operón. Estos
operones tienen una localización frecuentemente plasmídica y poseen
generalmente al menos dos genes que codifican proteínas, homologas
a un transportador de ABC y una proteína accesoria, probablemente
implicada la exportación de bacteriocinas.
La clonación del fragmento nucleotídico que
contiene el gen de la sakacina G ha revelado la existencia de tres
marcos abiertos de lectura skgA1 (SEQ ID Nº 1), skgA2
(SEQ ID Nº 3) y skgDc (SEQ ID Nº 13) (que incluye el cuadro
de lectura truncado skgD (SEQ ID Nº 7)) y un cuadro truncado
skgl (SEQ ID Nº 5) cuya representación esquemática está
recogida en la Figura 1. El fragmento nucleotídico es una doble
cadena cuya monocadena 5'-3' está representada en
la secuencia ID Nº 15.
Los productos génicos skgA1 y skgA2,
denominados pre-bacteriocinas, pueden sufrir una
maduración en el curso de la cual sus péptidos delanteros
(leaders) respectivos son escindidos entre les residuos 18 y
19, liberando así la sakacina G activa (residuos
19-55).
El fragmento nucleotídico monocadena
5'-3' que comprende skgA1, skgA2, skgD y skgl
figura en la SEQ ID Nº 9.
La presente invención tiene pues igualmente por
objeto un polipéptido aislado correspondiente a una bacteriocina,
caracterizado porque comprende la secuencia ID Nº 2 y/o la secuencia
ID Nº 4. La secuencia de la bacteriocina madura corresponde a la
secuencia ID Nº 12 y está comprendida en las secuencias ID Nº 2 y ID
Nº 4.
El marco de lectura denominado skgl
codifica una proteína de 52 residuos. La comparación de esta
secuencia con las de los bancos de datos muestra fuertes
similitudes de Skgl con las proteínas denominada de inmunidad.
Codifica verdaderamente la proteína de inmunidad que protege la
bacteria productora de la sakacina G.
La presente invención se extiende igualmente a
un polipéptido aislado que comprende la secuencia ID Nº6
correspondiente al marco de lectura skgl.
En lo que se refiere al último gen skgDc,
codifica una proteína que presenta una homología con proteínas de
la familia de los transportadores de ABC, y más particularmente del
transportador de la pediocina PA-1. El gen
skgDc codifica verdaderamente el transportador ABC específico
de la sakacina G.
La presente invención se extiende igualmente al
polipéptido aislado que comprende la secuencia ID Nº 8
correspondiente al gen denominado skgD y al polipéptido
aislado que comprende la secuencia ID Nº 14 correspondiente al gen
denominado skgDc.
Ha de entenderse que están igualmente
comprendidas las secuencias homólogas, definidas como:
- i)
- Las secuencias similares a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº 2, Nº 4, Nº 6, Nº 8, Nº 12 o Nº 14; o
- ii)
- las secuencias codificadas por una secuencia de ácido nucleico homóloga, tal como la definida a continuación, es decir una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia SEQ ID Nº 1, Nº 3, Nº 5, Nº 7, Nº 9, Nº 13 o Nº 15 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación.
Más aún, el término "similares" se refiere
a la perfecta semejanza o identidad entre los aminoácidos de las
secuencias homólogas comparadas pero también a la semejanza no
perfecta que se califica de similitud. Esta búsqueda de similitudes
en una secuencia polipeptídica tiene en cuenta las sustituciones
conservativas que son sustituciones de aminoácidos de la misma
clase, tales como sustituciones de aminoácidos en las cadenas
laterales no cargadas (tales como asparagina, glutamina, serina,
treonina, y tirosina), de aminoácidos con cadenas laterales básicas
(tales como lisina, arginina e histidina), aminoácidos con cadenas
laterales ácidas (tales como ácido aspártico y ácido glutámico);
aminoácidos con cadenas laterales apolares (tales como glicina,
alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina, triptófano y cisteína).
Más generalmente, por "secuencia de
aminoácidos homóloga", se entiende pues cualquier secuencia de
aminoácidos que difiere de la secuencia SEQ ID Nº 2, Nº 4, Nº 6, Nº
18, Nº 12 o Nº 14 por sustitución, deleción y/o inserción de un
aminoácido o de un número reducido de aminoácidos, principalmente
por sustitución de aminoácidos por aminoácidos no naturales o
pseudo-aminoácidos en posiciones tales que estas
modificaciones no llegan significativamente a alcanzar la actividad
biológica del polipéptido aislado y de preferencia de la sakacina
G.
De preferencia, tal secuencia de aminoácidos
homóloga es similar a al menos 85% de la secuencia SEQ ID Nº 2, Nº
4, Nº 6, Nº 8, Nº 12 o Nº 14, de preferencia al menos 95%.
La homología se determina generalmente
utilizando un programa informático de análisis de secuencias (por
ejemplo, el Sequence Analysis Software Package of the Genetics
Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center,
1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Secuencias de
aminoácidos similares se alinean para obtener el máximo grado de
homología (es decir, identidad o similitud, como se ha definido
anteriormente). Para este fin puede ser necesario introducir de
manera artificial espacios ("huecos") en la secuencia. Una vez
que se consigue el alineamiento óptimo, el grado de homología se
establece por el registro de todas las posiciones para las cuales
los aminoácidos de dos secuencias comparadas son idénticos, con
respecto al número total de posiciones.
La actividad biológica del polipéptido aislado y
principalmente de la sakacina G se refiere a su capacidad de
inhibir el crecimiento de cepas bacterianas indeseables y/o
patógenas, de preferencia de bacterias Listeria más
particularmente de bacterias Listeria monocytogenes.
La presente invención tiene igualmente por
objeto un ácido nucleico aislado, que codifica un polipéptido, tal
como se ha definido precedentemente.
Más precisamente, la presente invención tiene
por objeto un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia ID
Nº 1 y/o la secuencia ID Nº 3.
Se determinó la secuencia nucleotídica completa
de la región implicada en la expresión de la sakacina G (3055 pb).
Se trata de un ADN de doble cadena cuya cadena 5'-3'
se representa en la secuencia ID Nº 15. La cadena
3'-5' se presenta en la Figura 2. La presente
invención se refiere igualmente a un ácido nucleico que comprende
dicha secuencia.
Como se ha descrito precedentemente, esta
secuencia posee tres marcos abiertos de lectura completos
skgA1, skgA2 y skgDc y uno truncado,
skgl. Los genes supuestos skgA1 (SEQ ID Nº 1),
skgA2 (SEQ ID Nº 3) y skgl (SEQ ID Nº 5) están
orientados en sentido inverso con respecto a skgDc (SEQ ID
Nº 13).
Se reivindican igualmente en el marco de la
presente invención, el ácido nucleico de la secuencia ID Nº 5, el
ácido nucleico de secuencia ID Nº 13 y el ácido nucleico de
secuencia ID Nº 7.
Ha de entenderse que están igualmente
comprendidas las secuencias homólogas, definidas como:
- i)
- secuencias similares a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº1, Nº3, Nº5, Nº7, Nº9, Nº13 o Nº15; o
- ii)
- secuencias que se hibridan con la secuencia SEQ ID Nº 1, Nº 3, Nº 5, Nº 7, Nº 9, Nº 13 o Nº 15 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación, o
- iii)
- secuencias que codifican el polipéptido denominado sakacina G, tal como se ha definido precedentemente.
Preferentemente una secuencia nucleotídica
homóloga según la invención es similar a al menos 75% de las
secuencias SEQ ID Nº 1, Nº 3, Nº 5, Nº 7, Nº 9, Nº 13 o Nº 15,
preferiblemente incluso a al menos 85%, o al menos 90%.
De manera preferente, dicha secuencia
nucleotídica homóloga se hibrida específicamente con las secuencias
complementarias de las secuencias SEQ ID Nº 1, Nº 3, Nº 5, Nº 7, Nº
9, Nº 13 o Nº 15 en condiciones rigurosas. Los parámetros que
definen las condiciones de rigurosidad dependen de la temperatura
(Tm) a la cual se separan 50% de las cadenas apareadas.
Para las secuencias que comprenden como máximo
30 bases. Tm se define por la relación (Sambrook et al.,
1989, NY.: Cold Spring Harbor Laboratory):
Tm = 81,5 +
0,41(% de G+C) + 16,6 Log(concentración en cationes) -0,63%(%
de formamida)-(600/número de
bases)
Para las secuencias de longitud inferior a 30
bases. Tm está definida por la relación:
Tm =
4(C+G)+2(A+T)
En las condiciones de rigurosidad apropiadas, en
las cuales las secuencias específicas no se hibridad, la
temperatura de hibridación puede ser de preferencia de 5 a 10ºC por
debajo de Tm, y los tampones de hibridación utilizados son de
preferencia soluciones de fuerza iónica elevada, tal como, por
ejemplo, una solución 6xSSC.
La expresión "secuencias similares"
empleada anteriormente se refiere a la semejanza perfecta o
identidad entre los nucleótidos comparados, pero también a la
semejanza no perfecta que se califica de similitud. Esta búsqueda
de similitudes en las secuencias nucleicas distingue por ejemplo las
purinas y las pirimidinas.
Una secuencia nucleotídica homóloga a los marcos
abiertos de lectura representados en SEQ ID Nº 1, Nº 3, Nº 5, Nº 7,
Nº 9, Nº 13 o Nº 15 incluye cualquier secuencia nucleotídica que
difiere de las secuencias SEQ ID Nº 1, Nº 3,
Nº 5, Nº 7, Nº 9, Nº 13 o Nº 15 por mutación, inserción, deleción o sustitución de una o varias bases, o por la degeneración del código genético, en tanto que codifica un polipéptido que presenta actividad biológica de la sakacina G, como se define más adelante.
Nº 5, Nº 7, Nº 9, Nº 13 o Nº 15 por mutación, inserción, deleción o sustitución de una o varias bases, o por la degeneración del código genético, en tanto que codifica un polipéptido que presenta actividad biológica de la sakacina G, como se define más adelante.
Entre tales secuencias homólogas, están
comprendidas las secuencias de genes de bacterias distintas de
Lactobacillus, que codifican la sakacina G.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser sintetizados por cualquiera de los métodos conocidos por el
experto en la técnica. Los polipéptidos de la invención pueden por
ejemplo ser sintetizados por las técnicas de la química de
síntesis, tales como la síntesis de Merrifield que es ventajosa por
razones de pureza, de especificidad antigénica, de ausencia de
productos secundarios no deseados y por su facilidad de
producción.
La presente invención tiene igualmente por
objeto un procedimiento de producción de un polipéptido recombinante
en el cual un vector que comprende un ácido nucleico conforme a la
presente invención se transfiere a una célula hospedante que se
cultiva en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido
conforme a la presente invención o de un polipéptido codificado por
una secuencia de ácido nucleico conforme a la presente
invención.
La bacteriocina recombinante puede ser producida
igualmente por un procedimiento, en el cual un vector que contiene
un ácido nucleico que comprende une secuencia nucleotídica conforme
a la invención y de preferencia las secuencias SEQ ID Nº 1 y/o Nº 3
o una secuencia homóloga se transfiere a una célula hospedante que
se cultiva en condiciones que permitan la expresión del polipéptido
correspondiente. La proteína producida puede ser recuperada y
purificada a continuación. Los procedimientos de purificación
utilizados son conocidos por los expertos en la técnica. El
polipéptido recombinante obtenido puede ser purificado a partir de
lisados y extractos celulares, del líquido sobrenadante del medio
de cultivo, por métodos utilizados individualmente o en combinación,
tales como fraccionamiento, los métodos de cromatografía, las
técnicas de inmunoafinidad con ayuda de anticuerpos mono- o
poli-clonales específicos, etc.
La secuencia de ácido nucleico de interés, que
codifica la sakacina G, puede ser insertada en un vector de
expresión, en el cual está unida de manera operativa a elementos que
permiten la regulación de su expresión, tales como principalmente
promotores, activadores y/o terminadores de la transcripción. Las
señales que controlan la expresión de las secuencias nucleotídicas
(promotores, activadores, secuencias de terminación) se eligen en
función del hospedante celular utilizado. A este efecto, las
secuencias nucleotídicas según la invención pueden ser insertadas
en vectores de replicación autónoma en el seno del hospedante
elegido o en vectores que integran el hospedante elegido. Tales
vectores se preparan según los métodos corrientemente utilizados
por los expertos en la técnica, y los clones que resultan pueden ser
introducidos en un hospedante adecuado por métodos estándares,
tales como por ejemplo electroporación o la precipitación con
fosfato de calcio.
Los vectores de clonación y/o de expresión,
tales como los descritos anteriormente, que contienen una secuencia
nucleotídica definida según la invención forman igualmente parte de
la presente invención.
La invención comprende además células
hospedantes transformadas, de manera transitoria o estable, por
estos vectores de expresión. Estas células puede ser obtenidas por
introducción en células hospedantes, de preferencia procariotas, de
una secuencia nucleotídica insertada en un vector tal como se que
define anteriormente para el cultivo de dichas células en
condiciones que permitan la replicación y/o la expresión de la
secuencia nucleotídica transferida.
Ejemplos de células hospedantes incluyen
principalmente bacterias, tales como Lactococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Escherichia y
levaduras.
Las secuencias nucleotídicas de la invención
pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de secuencias
de ADN o ARN, obtenidas por escrutinio de bancos de secuencias por
medio de sondas elaboradas sobre la base de las secuencias SEQ ID
Nº 1, Nº 3, Nº 5, Nº 7, Nº 9, Nº 13 y/o Nº 15. Tales bancos pueden
ser preparados por técnicas clásicas de biología molecular,
conocidas por los expertos en la técnica.
Las secuencias nucleotídicas según la invención
pueden ser preparadas igualmente por síntesis química, o incluso
por métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática
de secuencias obtenidas por escrutinio de bancos.
La presente invención se refiere igualmente a un
procedimiento para inhibir el crecimiento de Listeria, más
particularmente de Listeria monocytogenes en un ambiente que
puede ser alimentario o no y que es susceptible de ser contaminado
con las Listeria monocytogenes.
Las Listeria monocytogenes son
microorganismos patógenos que son el origen de graves enfermedades
en seres humanos y animales y que pueden principalmente ser
fácilmente transmisibles por alimentos contaminados, más
especialmente por medio de carne, productos cárnicos, productos
marinos, leche y de productos derivados. La presente invención
propone pues un procedimiento para inhibir el crecimiento de
Listeria monocytogenes en un alimento susceptible de
contener Listeria monocytogenes como contaminante,
comprendiendo dicho procedimiento la adición de un polipéptido
conforme a la invención a dicho alimento en una cantidad suficiente
para inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes.
Las bacteriocinas conforme a la invención son de
preferencia utilizadas en cualquier sistema alimentario en una
cantidad comprendida entre 1 y 100000 unidades arbitrarias (UA) de
bacteriocinas par gramo de alimento.
Una UA de bacteriocinas se define como 5 \mul
de la dilución más elevada de líquido sobrenadante de cultivo que
conduce a una zona definida de inhibición del crecimiento con
respecto a una cepa testigo de una bacteria
gram-positiva en un medio de agar.
Aunque los alimentos sean los más implicados por
la contaminación por Listeria monocytogenes, los productos
veterinarios y médicos pueden estar contaminados igualmente por este
tipo de bacterias, incluso los productos cosméticos o productos
relacionados.
Las bacteriocinas conforme a la presente
invención, y principalmente la sakacina G, son por tanto igualmente
útiles para inhibir el crecimiento de este tipo agentes patógenos en
estos productos.
La presente invención tiene por tanto por objeto
la utilización de una bacteriocina conforme a la presente invención
como agente activo contra floras patógenas o indeseables
principalmente en la preparación de productos alimentarios y más
precisamente para inhibir el crecimiento y la propagación de
Listeria, más particularmente de Listeria
monocytogenes, en los productos alimentarios.
El polipéptido puede ser incorporado tal cual en
el producto alimentario considerado o incluso puede ser introducido
en él a partir de la cepa Lactobacillus Sakei 2512.
La presente invención tiene así igualmente por
objeto la utilización de la cepa Lactobacillus Sakei 2512 en
un producto alimentario para generar un polipéptido bacteriocina
conforme a la invención.
La invención se refiere también a una
composición de bacteriocina, caracterizada porque comprende al menos
un polipéptido conforme a la presente invención, es decir,
procedente de la cepa Lactobacillus Sakei 2512 o que
comprende la secuencia SEQ ID Nº 2, o Nº 4, o Nº 12, o Nº 14 o la
cepa Lactobacillus Sakei 2512.
La invención se extiende igualmente a la
utilización de la cepa Lactobacillus sakei 2512 destinada a
producir un polipéptido, tal como se ha definido anteriormente,
para inhibir el crecimiento y la propagación de Listeria,
más particularmente de Listeria monocytogenes, en productos
alimentarios así como las composiciones que comprende dicha
cepa.
Los Ejemplos y las Figuras que siguen se
presentan como ilustrativos del objeto de la presente invención.
Figura 1: Representación esquemática del
locus genético implicado en la producción de la sakacina
G.
Figura 2: Cadena complementaria
3'-5' correspondiente a la secuencia nucleotídica
completa de la región implicada en la expresión de la sakacina G
cuya la cadena 5'-3' está presente en la SEQ ID Nº
15.
- \bullet
- Cepas bacterianas y medio de cultivo. Lactobacillus sakei 2512 se cultiva a 30ºC en medio MRS (DIFCO Laboratories) esterilizado 12 minutos a 110ºC. Las cepas indicadoras se cultivan en medio BHI ("brain-heart infusión"; DlFCO Laboratories) a 37ºC.
- \bullet
- Ensayo de actividad. Medio BHI, de agar-agar a 10 g/l, y sembrado al 1% para un pre-cultivo de cepa indicadora en fase estacionaria antes de ser vertido en cápsula de Petri. Cincuenta microlitros de solución de sakacina G se depositan en pocillos hondos recortados con sacacorchos en el agar-agar enfriado. La actividad de bacteriocina se traduce por la aparición de zonas de inhibición alrededor de los pocillos después de incubación una noche a 37ºC.
- \bullet
- Análisis proteico. La sakacina G se analiza por espectrometría de masas en un aparato Perkin-Elmer Sciex API 165 equipado con una fuente de ionización por pulverización iónica. Después de liofilización, la fracción de HPLC activa se recoge con una solución de acetonitrilo/agua (1:1) que contiene 0,1% de ácido fórmico, después se inyecta por infusión a un caudal 5 \mul/min. La concentración proteica se determina por el método con ácido bizinc-conínico por medio del kit BCA (Sigma) según las instrucciones del fabricante.
- Las comparaciones de secuencias proteicas se realizan gracias al programa BLAST (1), accesible a partir del servidor ExPASy del "Swis Institute of Bioinformatics".
- \bullet
- Clonación molecular y transformación. Los plásmidos se extraen y purifican a partir de cepas de Escherichia coli y de Lactobacillus sakei 2512 según los métodos descritos precedentemente por Sambrook et al., 1989, NY: Cold Spring Harbor Laboratory y Muriana y Klaenhammer, 1987, Appl. Environ. Microbiol., 53:553-560 respectivamente.
Las enzimas de restricción y las modificaciones
del ADN se utilizan según las indicaciones del proveedor (GibeDBRL).
Las electroforesis en gel de agarosa, analítica y preparativa, se
realizan en tampón Tris/borato/EDTA (pH 8,3) según los métodos
descritos por Sambrook et al., 1989, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory. Los fragmentos de ADN digeridos se purifican a partir
de geles de agarosa utilizando el kit
"Prep-a-Gene"
(Bio-Rad). Las clonaciones en los plásmidos
pGEM-T (Promega) y pZER02 (Invitragen) se realizan
según las recomendaciones de los proveedores. La transferencia
Southern se realiza en una membrana de nilón
(Hybond-N+, Amersham) según Sambrook et al.,
1989, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. La transferencia va
seguida por una hibridación con una sonda radioactiva obtenida por
marcado con ^{32}P con ayuda del kit "Random primers DNA
labelling system" (Gibco-BRL). Las bacterias
E. coli se hacen competentes y se transforman según el método
de Hanahan, 1983. J. Mol. Biol.
166:557-80.
La Taq-polimerasa
(Gibco-BRL) se utiliza según las recomendaciones del
proveedor. La amplificación del fragmento de ADN que codifica la
sakacina G se realizó con ayuda de un aparato "Geneamp
9700®" (Perkin-Elmer) según las condiciones
siguientes: 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 s,
hibridación a 45ºC durante 30 s y prolongación (elongación) a 72ºC
durante 1 min seguido de un ciclo suplementario de prolongación a
72ºC durante 5 min.
El fragmento de ADN que lleva el locus de
sakacina G se secuencia con ayuda de un secuenciador automático ASI
Prism 310® (Perkin-Elmer) utilizando el kit de
secuenciación "Big-dye terminator®"
(Perkin-Elmer) y los cebadores nucleotídicos
apropiados.
Ejemplo
1
Un cultivo de 16 horas de Lactobacillus
sakei2512 (100 ml) se centrifugó a 6000 g durante 15 minutos.
El líquido sobrenadante del cultivo se calentó a continuación a 70ºC
durante 20 minutos. El líquido sobrenadante enfriado se diluyó a
continuación con 1 volumen de agua (el pH de la solución diluida
debe ser inferior a 6, por adición de HCl 1M si es necesario) antes
de ser hecho pasar a través de una columna (2,5 x 18 cm) que
contenía una resina cambiadora de cationes
(carboxi-metil-celulosa; Cellufine
C-200, Amicon) equilibrada con agua. Después de
lavados sucesivos con agua (100 ml) y luego con una solución de NaCl
0,1M (150 ml), la sakacina G se eluyó con una solución de NaCl 0,5M
(200 ml). El pH de todas las soluciones debe ser inferior a 6. La
fracción activa se depositó a continuación en un cartucho de
extracción en fase sólida (Sep-pak plus C18,
Waters) equilibrado en agua. Después de lavados sucesivos con 5 ml
de soluciones de acetato de amonio 20 mM que contenía 0, 10, 20 y
30% de acetonitrilo, la sakacina G se diluyó con 10 ml de acetato de
amonio 20 mM que contenía 80% de acetonitrilo. Después de
liofilización el extracto se solubilizó en 1 ml de solución acuosa
de acetonitrilo al 40% y después se inyectó en una columna HPLC
analítica de fase inversa de tipo C8 (Kromasil, 5 \mum, 100
\ring{A}, 4,6 x 250 mm, A.I.T.). La HPLC se realizó en un aparato
que comprendía una bomba Perkin-Elmer serie 200 LC
conectada a un detector Perkin-Elmer 785A. El
cromatograma en absorción se registró a 220 nm. La separación se
realizó, a un caudal de 0,8 ml/min según el gradiente siguiente:
Disolvente A = agua/ácido trifluoroacético al 0,1%; disolvente B =
acetonitrilo/agua/ácido trifluoroacético al 0,07%. Después de un
lavado de 5 minutos con 20% de disolvente B, la elución se realizó
por un gradiente de 20 de 40% de disolvente B en 10 minutos y
después por 40 a 55% de disolvente B en 20 minutos.
La fracción correspondiente al pico de 23
minutos que se había revelado activa contra Listeria ivanovii
BUG 496 se analizó por espectrometría de masas en ionización por
"pulverización iónica". La molécula parecía pura en al menos
95% y poseía una masa molecular de 3834,32 \pm 0,31 Da. La
cantidad de sakacina G así purificada se estimó en 120 \mug a
partir de 100 ml de cultivo. El rendimiento de la purificación se
estimó en 55% de actividad encontrada. Una parte de la secuencia
primaria de la sakacina G se determinó por microsecuenciación y se
establecieron dos oligonucleótidos degenerados a partir de esta
secuencia.
Ejemplo
2
Por genética inversa, se eligieron dos
oligonucleótidos degenerados SakG01 (5' AARTATTATGGNAAYGGNGT 3')
(SEQ ID Nº 10) y SakG02S (5' ACATGATGNCCNCCRTTNGC 3') (SEQ ID Nº 11)
con el fin de amplificar el fragmento de ADN correspondiente al gen
estructural de la sakacina G madura (SEQ ID Nº 15) por reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). El producto amplificado así
obtenido, de un tamaño aproximado de 100 pb se clonó en el plásmido
pGEM-T para formar el plásmido pJMBYC01. El
fragmento de restricción PvuII de 560 pb procedente de pJMBYC01, que
incluía el fragmento insertado, sirvió de sonda de hibridación, en
una transferencia Southern, para localizar el gen estructural en el
genoma de Lactobacillus sakei 2512. A partir de un extracto
plasmídico de Lb. sakei 2512 digerido por las enzimas de
restricción HindIII y EcoRI, la sonda reveló fragmentos de tamaños
respectivos de aproximadamente 2,1 y 9 kpb. El fragmento HindIII de
2,1 kpb se purificó y después se insertó en el vector pZERO2 para
dar el plásmido pJMBYC02. La presencia del gen estructural de la
sakacina G en pJMBYC02 se demostró por amplificación por PCR con
los cebadores SakG01 y SakG02 y posterior secuenciación nucleotídica
del fragmento insertado en pJMBYC02. Se utilizó una estrategia
próxima con el fin de determinar la secuencia completa del gen
skgD. El extracto plasmídico de Lb. sakei 2512 se digerió por
XbaI. El producto de digestión se insertó en el plásmido
pBluescript SK+. Los clones portadores de la secuencia de interés se
revelaron por medio de una sonda radioactiva preparada por PCR
realizada en el plásmido pJMBYC02 con ayuda de los oligonucleótidos
SakG03 (5' CCTTGGTCAGGCTATCG 3') (SEQ ID Nº 16) y SakG04 (5'
ATCACCTTTTTGAATTACCC 3') (SEQ ID Nº 17).
El análisis de la secuencia nucleotídica
completa de la región (de 3051 pb) reveló la existencia de tres
marcos abiertos de lectura completos skgA1 y skgA2 y
skgDc y uno truncado, skgl. Los genes supuestos
skgA1 skgA2 y skgl están orientados en sentido inverso con
relación a skgD.
Cada uno de los marcos de lectura abiertos va
precedido de un sitio potencial de fijación de ribosomas. Los genes
skgA1 y skgA2 codifican ambas dos proteínas de 55
residuos de aminoácidos cuyas secuencias 19-55 son
totalmente idénticas. La secuencia 19-52
correspondiente a la secuencia de la sakacina G obtenida por
microsecuenciación. Hay que destacar la presencia de 4 residuos de
cisteína en las posiciones 9, 14 y 24 y C-terminal.
Además, la masa molecular calculada de este péptido, de 3838,2 Da
que difiere de la masa molecular medida (3834,32 Da) de 4 Da
muestra la presencia de dos puentes disulfuros en la sakacina G,
como ya se demostró para otras bacteriocinas
anti-Listeria.
Las secuencias 1-18 de las
proteínas SkgA1 y SkgA2 no difieren más que en 3 residuos y
presentan grandes homologías con los péptidos "leader"
de las bacteriocinas de clase II, que están implicadas en el
transporte de estos péptidos por los transportadores de ABC
específicos. En particular el resto GG terminal es característico
de estas secuencias leader y constituye el sitio de
maduración de estas bacteriocinas. La comparación de las secuencias
nucleotídicas de los genes skgA1 y skgA2 muestra
igualmente una identidad de secuencia de más de 95% para la parte
de los genes que codifica la bacteriocina madura.
El marco abierto de lectura incompleto
denominado skgl codifica una proteína de 52 residuos. La
comparación de esta secuencia con las de los bancos de datos
muestra grandes homologías de Skgl con las proteínas denominadas de
inmunidad Lccl y Mesl. Se demostró la implicación de Mesl en la
protección frente a la mesentericina Y105. Se puede suponer que
skgl codifica la proteína de inmunidad para la sakacina
G.
El último gen skgDc codifica una proteína
de 727 aminoácidos. Según los bancos de datos, SkgDc es muy
homólogo de las proteínas de la familia de los transportadores de
ABC y más particularmente de los transportadores de la pediocina
PA-1: PedD o PapD (Marugg et al., Appl.
Environ Microbiol. 58, 2360-7; Motiagh et
al., 1994, Lett Appl. Microbiol. 18,
305-12), de la sakacina P: SppT (Huhne et
al., 1996, Microbiology, 142, 1437-48), de la
sakacina A: SapT (Axelsson and Holck, 1995, J. Bacteriol. 177,
2125-37) y de la mesentericina Y105: MesD (Fremaux
et al., 1995, Microbiology 141, 1637-45).
Ejemplo
3
La sensibilidad a la sakacina G de 17 cepas
bacterianas ha sido ensayada por el método de ensayo en pocillos
(véase Materiales y Métodos). Los resultados se presentan en la
Tabla 1 siguiente:
El espectro de inhibición de esta bacteriocina
parece bastante estrecho y limitado a las cepas de Lactobacillus
sakei y Pediococus cerevisiae para las bacterias
lácticas. Este péptido parece como las otras bacteriocinas de la
clase IIa, activo contra todas las cepas de Listeria
ensayadas, así como contra las Enterococus faecalis y
durans, pero no contra Enterococcus faecium.
<110> RHODIA CHIMIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> BACTERIOCINA
ANTI-LISTERIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(187)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(187)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(179)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(1201)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2042
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaartattatg gnaayggngt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacatgatgnc cnccrttngc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(2200)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 727
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3055
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttggtcag gctatcg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sake
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcacctttt tgaattaccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Polipéptido aislado, caracterizado
porque se trata de una bacteriocina, denominada sakacina G de
secuencia ID Nº 12, procedente de la cepa Lactobacillus sakei
2512 depositada en la Collection Nationale des Cultures de
Microorganismes (CNCM) bajo el número
I-2479.
2. Polipéptido aislado según la reivindicación
1, caracterizado porque se trata de una bacteriocina de la
clase IIa.
3. Pre-bacteriocina aislada,
caracterizada porque comprende la secuencia ID Nº 2 y/ola
secuencia ID Nº 4 o la pre-bacteriocina homóloga de
secuencia similar a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº 2 o Nº
4.
4. Bacteriocina aislada, caracterizada
porque comprende la secuencia ID Nº 12 o la bacteriocina homóloga de
secuencia similar a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº 12.
5. Ácido nucleico de secuencia nucleotídica que
codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a
4.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 5, de
secuencia ID Nº 1 y/o de secuencia ID Nº 3 o ácido nucleico homólogo
de secuencia similar a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº 1 o
Nº 3.
7. Ácido nucleico según la reivindicación 5, de
secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº 15 o ácido nucleico homólogo
de secuencia similar a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº
15.
8. Ácido nucleico según la reivindicación 5, de
secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº 9 o ácido nucleico homólogo
de secuencia similar a al menos 70% de la secuencia SEQ ID Nº 9.
9. Proteína de inmunidad aislada,
caracterizada porque comprende la secuencia ID Nº 6 o la
proteína de inmunidad homóloga de secuencia similar a al menos 70%
de la secuencia SEQ ID Nº 6.
10. Transportador de ABC aislado,
caracterizado porque comprende la secuencia ID Nº 14 o el
transportador de ABC homólogo de secuencia similar a al menos 70%
de la secuencia SEQ ID Nº 14.
11. Ácido nucleico de secuencia ID Nº 5 o ácido
nucleico homólogo de secuencia similar a al menos 70% de la
secuencia SEQ ID Nº 5, que codifica un polipéptido según la
reivindicación 9.
12. Ácido nucleico de secuencia ID Nº 13 o ácido
nucleico homólogo de secuencia similar a al menos 70% de la
secuencia SEQ ID Nº 13, que codifica un polipéptido según la
reivindicación 10.
13. Vector de clonación y/o de expresión que
comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, 11, 12.
14. Célula hospedante transformada por un vector
según la reivindicación 13.
15. Célula hospedante según la reivindicación
14, caracterizada porque se trata de un microorganismo
elegido entre los Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Streptococcus, Pediococcus, Eschericchia o de una levadura.
16. Procedimiento de producción de un
polipéptido recombinante en el cual un vector que comprende un ácido
nucleico según una de las reivindicaciones 5 a 8, 11, 12 se
transfiere a une célula hospedante que se cultiva en condiciones
que permiten la expresión de un polipéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 4 y 9 a 10.
17. Utilización de un polipéptido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como agente activo contra
floras patógenas o indeseables en la preparación de productos
alimentarios.
18. Utilización según la reivindicación 17,
caracterizada porque dicho polipéptido se emplea para inhibir
el crecimiento y la propagación de Listeria en los productos
alimentarios.
19. Utilización según la reivindicación 18,
caracterizada porque dicho polipéptido se emplea para inhibir
el crecimiento y la propagación de Listeria monocytogenes en
los productos alimentarios.
20. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque dicho
polipéptido se produce en el producto alimentario a partir de la
cepa Lactobacillus Sakei 2512 depositada en el CNCM con el
número I-2479.
21. Utilización de la cepa Lactobacillus
Sakei 2512 depositada en el CNCM con el número
I-2479, en productos alimentarios para producir en
él un polipéptido bacteriocina según una de las reivindicaciones 1 a
4.
22. Composición de bacteriocina,
caracterizada porque comprende al menos un polipéptido según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la cepa de
Lactobacillus Sakei 2512 depositada en la CNCM con el número
I-2479.
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|---|---|---|---|
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