ES2312703T3 - Integrina beta3 como indicador de endometriosis. - Google Patents
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Abstract
Un método para predecir la endometriosis que comprende: a. identificar como nulípara una muestra de endometrio seleccionada del día 20 al 24 o del día 19 al 23 del ciclo menstrual; b. ensayar la muestra para detectar la integrina Beta3 en la muestra. c. correlacionar la ausencia de expresión de integrina Beta3 con endometriosis.
Description
Intregrina \beta_{3} como un indicador de
endometriosis.
En la década pasada, los investigadores han
llegado a reconocer la importancia de la matriz extracelular (ECM)
en la dirección del crecimiento, la diferenciación y la función del
epitelio de revestimiento. Getzenberg et al., "The Tissue
Matrix: Cell Dynamics and Hormone Action", Endocrine Rev.
1990, 11: 399. La interacción entre las células y la
matriz extracelular (o sustrato) está mediada por varias clases de
moléculas de adhesión celular, siendo unas de las más importantes
las integrinas. Albelda et al., "Integrins and Other Cell
Adhesion Molecules", FESEB J. 1990, 4:
2868. Buck et al., "Integrin, a Transmembrane
Glycoprotein Complex Mediating Cell-Substratum
Adhesion", J. Cell Sci. Suppl. 1987, 8: 231.
Esta familia diversa de receptores de glicoproteínas se expresan en
la membrana celular como subunidades de integrina \alpha y \beta
heterodiméricas y están implicadas tanto en la adhesión
célula-célula como célula-sustrato.
El recononocimiento y la unión específica de componentes de la
matriz extracelular (ECM), tales como fibronectina (FN), laminina
(LM) y colágeno (Col), transmiten información a la estructura
citoesquelética, una interacción que puede tener un papel importante
en promover la sensibilidad a hormonas y la activación genómica.
Burridge et al., "Focal Adhesions: Transmembrane Junctions
Between the Extracellular Matrix and the Cytoskeleton", Ann.
Rev. Cell. Biol. 1988, 4: 487 y Getzenberg et
al., anteriormente.
Aunque existe gran cantidad de información
acerca de proteínas integrinas específicas, por ejemplo, Hemler, M.
E. "VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions and
Their Role on Leukocytes", Annu. Rev. Immunol.
1990, 8: 365, se sabe poco respecto a la distribución
de estos receptores en el tracto reproductivo femenino. En el útero,
el endometrio, compuesto por un epitelio glandular y mesénquima
asociado (estroma), mantiene complejas funciones temporales y
espaciales en respuesta al entorno hormonal cíclico. Aunque
Tabibzadeh describía que alteraciones dinámicas en la expresión de
integrinas acompañan a los otros cambios histológicos que marcan
temporalmente el ciclo menstrual, Tabibzadeh, S., "Patterns of
Expression of Integrin Molecules in Human Endometrium Throughout
the Menstrual Cycle", Hum. Reprod. 1992, 7:
876, la búsqueda de marcadores morfológicos o bioquímicos para
la receptividad uterina no ha tenido éxito hasta la fecha, como se
describe en Rogers y Murphy "Uterine Receptivity for
Implantation: Human Studies", in Blastocyst Implantation
1989, Yoshinaga, K. ed., Serono Symposia, pág. 231. Una vez
que se identifiquen dichos marcadores, probablemente también podrá
identificarse su papel en los fenómenos endometriales, incluyendo
la implantación de embriones, la fertilidad, la anticoncepción y la
maduración y receptividad endometrial. Por lo tanto, como algunas
integrinas parecen cumplir los criterios para marcadores de
receptividad, existe una gran necesidad de métodos de detección de
moléculas de adhesión celular integrinas en el endometrio.
Se ha sugerido el asincronismo entre el
desarrollo uterino y el embrionario como una causa de pérdida
gestacional en base a un alineamiento erróneo entre la receptividad
endometrial y embrionaria, véase, Pope et al., "Uterine
Asynchrony: A cause of Embryonic Loss", Biol. Reprod.
1988, 39: 999.
La relación entre la endometriosis mínima y la
nuliparidad e infertilidad continúa siendo controvertida. Aunque
existen muchos argumentos convincentes para apoyar esta asociación,
muchos clínicos no creen todavía que las formas mínimas o leves de
la enfermedad sean perjudiciales para la fertilidad de una pareja.
Varios estudios que comparan mujeres con endometrio normal con
mujeres con endometriosis leve o mínima han demostrado una
disminución en la fecundidad del ciclo, tal como en los índices de
éxito en programas de donación, IVF o GIFT, confirmado por modelos
animales. Una razón para esta falta de aceptación es el
descubrimiento de muchos estudios de que el tratamiento del
embarazo obtiene índices de gestación tan elevados como los
tratamientos usados más actualmente.
De los muchos mecanismos sugeridos para explicar
la disminución en la fecundidad del ciclo de pacientes con
endometriosis, una deficiencia en la receptividad uterina es quizá
la que menos atención ha recibido. Fedele describía cambios
específicos en el endometrio nativo en mujeres con endometriosis
grave, Fedele, L., et al., "Structural and Ultrastructural
Defects in Preovulatory Endometrium of
Normo-Ovulating Infertile Women with Minimal or
Mild Endometriosis", Fertil, Steril. 1990, 53:
989. Yovich sugería que la endometriosis grave estaba asociada
con una deficiencia en la implantación, en base a un experimento de
IVF-ET, véase Yovich et al., "Hormonal
Profiles and Embryo Quality in Women with Severe Endometriosis
Treated by In Vitro Fertilization and Embryo Transfer",
Fertil. Steril. 1988, 50: 308. Existen datos de
estudios en el conejo que sugieren que la implantación se ve
afectada desfavorablemente por una endometriosis inducida
quirúrgicamente, y que el efecto está mediado por el líquido
peritoneal, véase, Hahn et al., "Experimental Evidence for
Failure to Implant as a Mechanism of Infertility Associated with
Endometriosis", Am. J. Obstet. Gynecol. 1986,
155: 1109.
La endometriosis es un trastorno que afecta al
2-5% estimado de la población femenina fértil
general, aunque su prevalencia en mujeres infértiles alcanza el
30-50%, Peterson et al., "Laparoscopy of
the infertile Patient", Obstet. Gynecol. 1970,
36: 667. Aunque muchas mujeres afectadas pueden no tener
síntomas, otras padecen dismenorrea (menstruación difícil y
dolorosa), dispareunia (dolor durante las relaciones sexuales),
alteraciones menstruales e infertilidad. Se ha sugerido que la
endometriosis leve o mínima está asociada con la infertilidad en
númerosos estudios, Hasson H. M., "Incidence of Endometriosis in
Diagnostic Laparoscopy", J. Reprod. Med. 1976,
16: 135 y se ha revisado recientemente, Bancroft, et
al., "Minimal/Mild Endometriosis and Infertility. A
Review", Br. J. Obstet. Gynecol. 1989, 96:
454. Se desconoce todavía el mecanismo por el que una
endometriosis mínima causa infertilidad. Se han postulado efectos
adversos sobre la foliculogénesis, la ovulación, el transporte del
óvulo, la fertilización, la calidad del esperma, los embriones, la
función de la fase lútea y un aumento en los índices de aborto
espontáneo. Estos efectos pueden estar mediados por la elaboración
de factores peritoneales tales como prostaglandinas, citoquinas y
factores de crecimiento; la activación de macrófagos peritoneales o
alteraciones en la función inmune, tales como una actividad
disminuida de células asesinas naturales. Kurzrock et al.,
"LIF: Not Just a Leukemia Inhibitory Factor", Endo. Rev.
1990, 12: 208. Algunos autores han sugerido que la
receptividad uterina para el embrión puede afectarse principalmente
por la presencia de endometriosis, Muscato, et al., "Sperm
Phagocytosis by Human Peritoneal Macrophages: A Possible Cause of
Infertility in Endometriosis", Am. J. Obstet. Gynecol.
1982, 144: 503 y Yovich et al., anteriormente;
y datos limitados de endometriosis inducida quirúrgicamente en
modelos animales confirman esta hipótesis, Hahn, et al.,
anteriormente. Además, se han descrito anomalías estructurales en
el endometrio de mujeres con endometriosis en comparación con
controles fértiles normales, Fedele, et al.,
anteriormente.
Se han investigado númerosas estrategias para
identificar mujeres con endometriosis usando medios no quirúrgicos.
Marcadores séricos tales como OC-125 (Barbieri,
et al. "Evaluation of a Serological Test for the Diagnosis
of Endometriosis using a Monoclonal Antibody
OC-125", SGI Annual Meeting 1985; Marzo:
331P (resumen)) están aumentados en mujeres con endometriosis,
aunque el solapamiento con normales o con otras patologías limita
seriamente su utilidad como un ensayo de diagnóstico, Hornstein,
et al., "Menstrual Cyclicity of CA-125 in
Patients with Endometrosis", Fertil. Steril.. 1992,
58: 279. Además, dada su elevación escalonada con la
gravedad de la enfermedad, el OC-125 tiene escasa
utilidad en casos de endometriosis mínima o leve. Otras
modalidades, tales como MRI o ecografía también tiene su mayor
sensibilidad en presencia de una endometriosis avanzada. Hasta la
fecha, ningún otro método aparte de la laparoscopia ha demostrado
proporcionar una eficacia probada para el diagnóstico de fases
mínimas o leves de endometriosis.
Aunque la receptividad uterina continúa siendo
un fenómeno escasamente conocido, se piensa que la unión inicial
del embrión al revestimiento uterno maternal es una etapa crítica en
el proceso de implantación. Se ha definido una ventana de
implantación mediante estudios descriptivos de los años 50, así como
en estudios más recientes usando tecnologías reproductivas
avanzadas, Hertig et al., 1956 y Navot et al., 1992.
La presencia de una molécula de adhesión celular integrina que
aparece fielmente en las células epiteliales endometriales después
del día 19 del ciclo menstrual normal, se corresponde con este
supuesto tiempo de implantación, Lessey, et al., "Integrin
Adhesion Molecules in the Human Endometrium", J. Clin.
Invest. 1992, 90: 188. La expresión de esta
integrina, el receptor de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3},
también se retrasa en mujeres con retraso de la maduración del
endometrio (en las que histología endometrial se retrasa o retarda
debido a niveles hormonales inadecuados o a una respuesta
disminuida a los niveles de hormonas existentes). Como se ha
sugerido por algunos que la infertilidad debida a endometriosis
puede reflejar una deficiencia en la receptividad uterina, es de
interés investigar la expresión de esta proteína en el endometrio de
mujeres con infertilidad. El uso de integrinas como herramientas de
diagnóstico para investigar la receptividad uterina demuestra ser
de una valor significativo en la identificación de individuos
afectados y ayuda a la comprensión de la etiología de la
infertilidad asociada con formas leves de endometriosis.
La presente invención se refiere a métodos de
predicción de la endometriosis. También están dentro del alcance de
la invención métodos de uso de anticuerpos monoclonales contra la
integrina \beta_{3}.
Los métodos de predicción de la endometriosis
comprenden obtener una muestra de endometrio seleccionada del día
20 al 24 del ciclo menstrual, identificar la muestra endometrial
como nulípara, poner en contacto la muestra con un anticuerpo
monoclonal específico para la integrina \beta_{3}, ensayar para
determinar la integrina \beta_{3} en la muestra y correlacionar
la ausencia de integrina \beta_{3} con endometriosis, donde el
endometrio se identifica como endometriosis leve/mínima. La presente
invención también es útil en la predicción de la endometriosis en
la población femenina infértil general.
Los métodos de uso de anticuerpos monoclonales
contra integrina \beta_{3} para predecir la endometriosis
comprenden obtener una muestra de endometrio seleccionada del día 20
al 24 del ciclo menstrual, poner en contacto la muestra con un
anticuerpo monoclonal específico para la integrina \beta_{3},
ensayar para determinar la \beta_{3} en la muestra,
correlacionar la ausencia de \beta_{3} con endometriosis, donde
el endometrio se identifica como nulíparo o tiene una endometriosis
leve/mínima.
La presente invención depende de la detección de
la ventana óptima de implantación embrionaria en el endometrio por
detección de la subunidad \beta_{3} de la integrina en una
muestra endometrial, preferiblemente con un anticuerpo
monoclonal.
Estos y otros aspectos de la invención se harán
más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada cuando
se tome junto con las siguientes Figuras.
La Figura 1 representa una tinción con
inmunoperoxidasa de un endometrio normal. Las microfotografías
representan el patrón de distribución para seis integrinas
diferentes que no parece cambiar en todo el ciclo menstrual. Las
áreas oscuras representan la tinción positiva, las áreas claras
representan la ausencia de tinción (ausencia de la subunidad de
integrina específica).
La tinción inmunohistoquímica de las subunidades
del receptor de colágeno/laminina: \alpha_{2} (A),
\alpha_{3} (B), \alpha_{6} (C) y \beta_{4} (D) muestran
una tinción marcada del epitelio (\leftarrow) y los microvasos
(\leftarrow) sin una tinción estromal significativa (*) para
\alpha_{2}, \alpha_{3} y \beta_{4}. Observesé tinción
\alpha_{6} basolateral y tinción basal para \beta_{4}. La
tinción para las subunidades del receptor de fibronectina
\alpha_{4} (E) no está presente en la fase proliferativa,
\alpha_{5} (F) muestra una tinción mesenquimal predominante (*)
con tinción epitelial disminuida (\leftarrow). Las
inmunorreacciones (áreas de tinción oscura) se revelaron mediante
complejo avidina-biotina-peroxidasa
usando diaminobenzadina como un cromógeno. Para una mayor
sensibilidad, no se aplicó una contratinción. Aumentos: 125x.
La Figura 2 muestra microfotografías de la
tinción inmunohistoquímica para la subunidad \alpha_{1} de
integrina en endometrio proliferativo frente a secretor. La tinción
estaba en gran medida ausente en el epitelio glandular
(\leftarrow) en la fase proliferativa (A) y era pronunciada en
todas las secciones después del día 14 del ciclo menstrual (B;
endometrio del día 20). La tinción de la microvasculatura
(\leftarrow) también era pronunciada y no cambiaba en todo el
ciclo menstrual. La tinción observada en las glándulas endometriales
secretoras era significativamente superior a la del fondo (C).
Aumentos: 125x.
La Figura 3 presenta la inmunotinción de
\alpha_{v} y \beta_{3} (las dos subunidades de que se
emparejan en la integrina receptor de vitronectina) en el
endometrio de la fase proliferativa frente a la fase secretora. La
intensidad de la tinción de \alpha_{v} en la fase proliferativa
(A) se juzgaba como "+" para las células estromales (*) y
"\pm" para \alpha_{v} glandular (\leftarrow). La
inmunotinción para \alpha_{v} en el endometrio del día 22 (B)
demuestra un aumento significativo en la tinción glandular (ejemplo
de intensidad de tinción "++"). Así mismo, la tinción para
\beta_{3} estaba ausente en el epitelio proliferativo (C;
\leftarrow) y estaba notablemente aumentada en este endometrio
secretor del día 22 (D). Aumentos: 125x.
La Figura 4 muestra una intensidad de tinción
relativa para las subunidades \alpha_{v} y \beta_{3}
epiteliales en 35 muestras endometriales durante todo el ciclo
menstrual. El patrón de expresión para \alpha_{v} se muestra en
A y muestra un aumento gradual en la tinción durante todo el ciclo
menstrual. Por el contrario, el patrón para \beta_{3} en B
muestra un aumento más brusco en esta subunidad de integrina
aproximadamente el día 20 del ciclo menstrual. Las muestran se
clasificaron en fases de acuerdo con el último ciclo menstrual. A
las secciones se les asignó una puntuación de 0 (-; negativa), 1
(\pm; débil), 2 (+; moderada) o 3 (++; intensa) por un observador
a ciegas y se confirmó por un segundo observador.
La Figura 5 representa la intensidad de tinción
de \beta_{3} epitelial en 12 pacientes con infertilidad con
maduración del endometrio retrasada. Se extirpó endometrio de
mujeres que se estaban sometiendo a una evaluación para
infertilidad. Las biopsias se separaron en dos grupos en base a la
correlación entre criterios histológicos y el fechado del ciclo
menstrual en base al momento de ovulación y/o al periodo menstrual
posterior. Pacientes con biopsias endometriales 3 o más días
"fuera de fase" (grupo OOP) se compararon con 25 biopsias
endometriales que estaban "en fase" (normales) y se muestran en
A. A las secciones se les asignó una puntuación de 0 (-; negativa),
1 (\pm; débil), 2 (+; moderada) o 3 (++; intensa), en base a la
intensidad de la tinción de \beta_{3} epitelial. Los ejemplos
de tinción inmunohistoquímica de una biopsia "fuera de fase"
(B) y una muestra "en fase" normal (C) se incluyen para
contrastar la tinción \beta_{3} epitelial en cada grupo.
Aumentos: 400x.
La Figura 6 presenta un análisis de
inmunotransferencia de endometrio proliferativo y secretor teñido
para la subunidad \beta_{3}. (A) La inmunotransferencia de un
extracto de plaquetas (carril 1) comparado con 2 muestras de la
fase proliferativa temprana y media (carriles 2, 3) y de la fase
lútea (carriles 4 y 5; días 23 y 26, respectivamente) demuestra una
banda de aproximadamente 95 kD de peso molecular, que se corresponde
con \beta_{3}. Las muestras de endometrio se digirieron
parcialmente con colagenasa y los elementos glandulares se
obtuvieron (B) usando una modificación de los métodos de
Satyaswaroop et al., "Isolation and Culture of Human
Endometrial Glands", J. Clin. Endocr. Metab. 1979,
48: 639. Las glándulas aparecían como estructuras huecas sin
el estroma circundante. La inmunoflorescencia de muestras de los
carriles 3 y 4 (C y D, respectivamente) se corresponde con la
ausencia o presencia de la banda de 95 kD en A. Aumentos: 400x.
La Figura 7 es un diagrama de dispersión que
muestra la tinción inmunohistoquímica para la subunidad de integrina
\beta_{3} en muestras endometriales de los días 1 a 28 del
ciclo. Todas las muestras tenían un fechado endometrial conocido y
ninguna estaba histológicamente fuera de fase.
La Figura 8 presenta la inmunotinción para la
subunidad \beta_{3} y el receptor de vitronectina
\alpha_{v}\beta_{3}. Las células epiteliales endometriales
(puntas de flecha) experimentaron alteraciones en la expresión de
\beta_{3} durante todo el ciclo menstrual. Se obtuvieron
muestras de la fase proliferativa (A), de la fase secretora
temprana (B; día 18) y de la fase secretora media (C; día 22). Una
biopsia endometrial a partir de un paciente con endometriosis leve
(D) no tenía tinción epitelial para \beta_{3} a pesar de haberse
juzgado como "normal, en fase día 22-23" por
los criterios histológicos. Las inmunorreacciones (áreas de tinción
marrón) se revelaron mediante el complejo de
avidina-biotina-peroxidasa usando
diaminobenzadina como cromógeno. Los elementos vasculares
(asteriscos) se teñían positivos para la subunidad \beta_{3} en
todas las muestras. Para un mejor contraste, las secciones se
contratiñeron con verde de metilo. La tinción verde significa la
ausencia de expresión de \beta_{3}. Los patrones de tinción en
A y B se corresponden con un HSCORE de 0 y en "C" con un HSCORE
de 2,6. Aumentos: 200x.
La Figura 9 es una comparación de los resultados
de inmunotinción para integrina \beta_{3} endometrial en
controles fértiles normales (Control; n = 20), mujeres infértiles
con endometriosis y partos anteriores (con partos; n = 28) y
mujeres infértiles nulíparas con endometriosis (nulíparas; n = 76).
El ensayo t para muestras no relacionadas compara la media de dos
grupos y determina la probabilidad de que la diferencia observada
ocurra por azar; el azar se indica como un valor p. Usando el ensayo
t para muestras no relacionadas, la HSCORE global era
significativamente inferior en el último grupo en comparación con
cualquiera de los otros dos. Se calcula el HSCORE como se
describe.
La Figura 10 presenta la distribución de las
subunidades de integrina \alpha_{4} y \beta_{3} durante el
ciclo menstrual normal. Obsérvese que la coexpresión de ambas
subunidades se corresponde con la supuesta ventana de implantación,
días 6-9 postovulación.
La presente invención se refiere a métodos de
predicción de la endometriosis. También están dentro del alcance de
la invención métodos de uso de anticuerpos monoclonales contra
integrina \beta_{3}.
Los métodos de predicción de la endometriosis
comprenden obtener una muestra de endometrio seleccionada del día
20 al 24 del ciclo menstrual, identificar la muestra endometrial
como nulípara, poner en contacto la muestra con un anticuerpo
monoclonal específico para integrina \beta_{3}, ensayar para
determinar la integrina \beta_{3} en la muestra y correlacionar
la ausencia de integrina \beta_{3} con endometriosis, donde el
endometrio se identifica como endometriosis leve/mínima. La muestra
de endometrio se selecciona preferiblemente de los días 20 a 24 del
ciclo menstrual, más preferiblemente de los días 20 a 23 del ciclo
menstrual, aún más preferiblemente del día 22 del ciclo menstrual.
Los días 20-24 del ciclo se corresponden con los
días 6-10 postovulación. La presente invención
también es útil en la predicción de la endometriosis en la población
femenina infértil general.
Los métodos de uso de anticuerpos monoclonales
contra integrina \beta_{3} para predecir la endometriosis
comprenden obtener una muestra endometrio, poner en contacto la
muestra con un anticuerpo monoclonal específico para integrina
\beta_{3}, ensayar para determinar la \beta_{3} en la
muestra, correlacionar la ausencia de \beta_{3} con
endometriosis, donde el endometrio se identifica como nulíparo o
tiene una endometriosis leve/mínima.
Para los fines de la presente invención, la
subunidad \beta_{3} puede ser \beta_{3} sola o \beta_{3}
en combinación con otra subunidad de integrina, por ejemplo,
\alpha_{v}.
Como se usa la presente memoria, la integrina se
define como una clase diversa de receptores de glicoproteínas
expresados en la membrana celular. Las integrinas son moléculas de
adhesión celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Las
integrinas están compuestas por subunidades \alpha y \beta
heterodiméricas y están implicadas en la adhesión
célula-célula y célula-matriz
extracelular. La familia de las integrinas es un grupo ampliamente
distribuido de receptores compuestos por parejas de heterodímeros
\alpha/\beta asociados de forma no covalente que median en la
adhesión leucocito-leucocito y
leucocito-endotelio celular, así como las
interacciones celulares con los componentes de la matriz
extracelular tales como colágeno, laminina, fibrinógeno y
fibronectina, y la interacción célula-célula en
tejidos organizados.
Aunque se encuentran integrinas en prácticamente
todos los tipos celulares (siendo la excepción los glóbulos rojos),
la expresión de subunidades de integrina varía de un tipo celular a
otro. En el endometrio uterino humano, como se determina la
presente memoria, las células epiteliales glandulares expresan
principalmente las subunidades de integrina \alpha_{2},
\alpha_{3} y \alpha_{6}, que son receptores de colágeno y
laminina. Las células estromales expresan predominantemente
\alpha_{5}, un receptor de fibronectina. La presencia de
\alpha_{1} en células epiteliales glandulares es específica del
ciclo menstrual, encontrándose sólo durante la fase secretora. La
expresión de ambas subunidades del receptor de vitronectina,
\alpha_{v}/\beta_{3}, también experimenta cambios
específicos del ciclo menstrual en las células epiteliales
endometriales. La expresión de \alpha_{v} aumenta durante todo
el ciclo menstrual, mientras que la subunidad \beta_{3} aparece
bruscamente el día 20 del ciclo menstrual en las células epiteliales
luminales y glandulares. Se descubrió también que la expresión de
\alpha_{4} se interrumpía el día 23. El ensayo para la expresión
de \beta_{3} con anticuerpo monoclonal SSA6 reveló expresión de
\beta_{3} desde el día 20 en adelante en el ciclo. La expresión
de \alpha_{4} comienza el día 14 y deja de expresarse después
del día 23, como se terminó por el ensayo de \alpha_{4} con
anticuerpo monoclonal B5G10, suministrado por Martin Hemler, Dana
Farber Cancer Center, Boston, MA. Además, de acuerdo con la
presente invención, se ha descubierto que la expresión de
\alpha_{4} y \beta_{3} se solapa entre los días
19-21, la ventana de implantación.
Como resultado, como se observa en la Figura 10,
las integrinas definen la ventana de implantación en la hembra
fértil en edad reproductiva. Estas moléculas de adhesión celular
están dinámicamente reguladas alrededor del momento de la
implantación y sirven como excelentes proteínas marcadoras para este
momento del ciclo menstrual. Como se muestra en la Figura 10, la
coexpresión de \alpha_{4} y \beta_{3} (que representa dos
especies de integrinas diferentes) coincide exactamente con la
ventana de implantación conocida (días 6-9
postovulación en base a los trabajos de Hertig et al., 1956
y Navot et al.,1992). Al contrario que la integrina
\beta_{3}, que parece estar alterada en númerosas mujeres con
infertilidad, la integrina \alpha_{4} no lo está. Aunque el
proceso de implantación implicará probablemente muchas proteínas o
factores diferentes, tales como la coexpresión de dos integrinas
diferentes como \alpha_{4} y \beta_{3}, la pérdida de una
sola entidad tal como \beta_{3} parece ser suficiente para la
pérdida de la fertilidad observada en estas pacientes con
endometriosis.
La presente invención se refiere al endometrio
del útero de un mamífero. La pared uterina es en su mayor parte
músculo liso o miometrio. El endometrio, una capa glandular de
grosor variable extremadamente sensible a las hormonas
estrógenos/progesterona, reviste el miometrio. El endometrio está
compuesto por varias capas funcionales. La capa más próxima al
miometrio se denomina capa basal y la capa más próxima a la
superficie se conoce como funcional. Este tejido está constituido
por células epiteliales, células estromales (o mesenquimales) y
leucocitos endometriales. Las células epiteliales son glandulares
(formando glándulas por debajo de la superficie del endometrio) o
luminales (revistiendo la superficie del endometrio). Estos tipos
diferentes de epitelio sirven para fines diferentes y los patrones
de tinción para diferentes proteínas marcadoras no son siempre
iguales entre el epitelio glandular y luminal. La superficie
luminal será la primera que se encontrará el embrión humano y se
piensa que está implicada en la unión inicial. El endometrio de
niñas premenopáusicas y mujeres postmenopáusicas está atrófico
debido a la falta de hormonas, estrógenos y progesterona. En las
mujeres en edad reproductiva, el endometrio experimenta cambios
cíclicos de desarrollo basados en el ciclo ovárico de liberación
hormonal. El primer día de la menstruación es el primer día del
ciclo; generalmente la menstruación se termina el día 5. Entonces
se reanuda el crecimiento endometrial bajo la influencia de los
estrógenos y evoluciona hasta el día 14, la fase proliferativa, y
hasta aproximadamente el día 28. Desde el día 14 hasta el día 28,
el endometrio también muestra signos de desarrollo glandular
aumentado y secreción, la fase secretora, debido en su mayor parte
a la influencia de la progesterona. Durante la fase folicular,
mientras los folículos están creciendo en el ovario y el estrógeno
es la hormona dominante, el endometrio se hace más grueso. Con la
ovulación (típicamente del día 14 al día 28 del ciclo) las mujeres
se exponen a estrógenos más progesterona. Esto se denomina la fase
secretora o lútea y se observa por una serie estereotípica de
cambios histológicos que avanzan a medida que continúa el ciclo.
Estos cambios histológicos se usan por los patólogos para fechar el
endometrio, un proceso que continúa siendo controvertido a pesar de
su uso durante los últimos 40 años. No se han descrito marcadores
inmunohistoquímicos fiables que hayan demostrado su utilidad en el
fechado endometrial.
La disfunción de la fase lútea (LPD) es una
expresión para un retraso del desarrollo del endometrio. Es una
causa conocida de infertilidad debido a la falta de sincronía entre
el huevo fertilizado y el endometrio. Si un embrión está listo para
unirse pero el endometrio está retrasado, entonces es poco probable
que se produzca la gestación. Las causas para la LPD incluyen una
producción hormonal inadecuada en el ovario y pueden implicar una
señalización defectuosa desde los centros superiores, tal como una
producción de hormona gonadotrópica inadecuada desde la pituitaria
o el hipotálamo. La LPD es una causa conocida de infertilidad y
aborto espontáneo y puede corregirse con aumento de hormonas.
Las fases de la implantación embrionaria
incluyen: aposición cuando las células epiteliales del embrión se
unen a las células epiteliales externas (luminales) de la superficie
endometrial maternal; adhesión; e invasión del trofoblasto en el
estroma subyacente, donde se establece y comienza a desarrollarse.
Se realiza el contacto con los vasos sanguíneos maternales para
captar nutrientes y sangre oxigenada y desprenderse de productos de
desecho durante la fase de invasión. La fase de desarrollo que
alcanza el embrión en el momento de la implantación es la fase de
blastocisto, que se produce al mismo tiempo que la eclosión. Existen
pruebas de que la eclosión es necesaria antes de que se produzca la
implantación, quizá porque el embrión debe tener sus células
epiteliales expuestas (fuera de la cubierta de la zona pelúcida)
para interaccionar con las capas celulares maternales. Como se
explica en la presente memoria, esta interacción se produce a través
de integrinas.
Para los fines de la invención, la endometriosis
se define como un acontecimiento ectópico de tejido endometrial,
frecuentemente formando quistes que contienen glóbulos rojos
alterados. Las fases de la endometriosis se han establecido por la
American Fertility Society, AFS. American Fertility Society: Revised
American Fertility Society Classification of Endometriosis: 1985.
Fertil Steril 1985; 43:351-352. La AFS define
la endometriosis de fase 1 como leve y la endometriosis de fase 2
como mínima.
Como se explica en la presente invención, la
infertilidad se define como una fertilidad disminuida o ausente de
tal modo que un mamífero femenino tiene estructuras anatómicas
adecuadas y una función equívoca con posibilidad de gestación que
puede no llegar a término. El término nulípara incluye, y no se
limita a, el endometrio de un mamífero hembra que no ha tenido
descendencia. El término nulípara incluye hembras que han concebido
descendencia y que no han llevado la gestación mas allá de las 20
semanas, teniendo en su lugar abortos espontáneos. Las con partos
se definen de acuerdo con la presente invención como que han dado a
luz crías vivas o muertas después de una gestación de 20 semanas y
un peso de 500 gramos para seres humanos. Son aplicables duraciones
de gestación y peso apropiadas para otros mamíferos, de tal modo
que serían comparables con lo expuesto para seres humanos.
Para los fines de la presente invención, los
mamíferos incluyen, pero sin imitación, el orden Rodentia, tal como
ratones; orden Lagomorpha, tal como conejos; más particularmente, el
orden Carnivora, que incluye felinos (gatos) y caninos (perros),
aún más particularmente, el orden Artiodactyla, bovinos (vacas) y
suinos (cerdos); y el orden Perissodactyla, que incluye equinos
(caballos) y, más particularmente, el orden Primates, Ceboidea y
Simoidea (monos) y Anthropoidea (humanos y simios). Los mamíferos de
las realizaciones más preferidas son seres humanos. Los anticuerpos
monoclonales útiles en la práctica de la invención incluyen
cualquier anticuerpo monoclonal que tenga una afinidad por o que se
una a la subunidad \beta_{3} de integrina. Un ejemplo de dicho
anticuerpo monoclonal es SSA6. Puede producirse anticuerpo
monoclonal SSA6 como se describe en Bennett et al., PNAS
1983, 80: 2417 y Brass et al., J. Biol. Chem.
1985, 260: 7876.
También pueden usarse anticuerpos monoclonales
que reconocen \beta_{3} combinada con otra subunidad de
integrina. Una de dichos anticuerpos monoclonales 23C6, que puede
prepararse de acuerdo con el método de Davies et al., J.
Cell Biol. 1989, 109: 1817. La inmunotinción con
anticuerpos monoclonales tales como 23C6 (específico para la
integrina \alpha_{v}/\beta_{3} intacta, es decir, el
receptor de vitronectina) produce un patrón idéntico a SSA6, que
sólo mide la subunidad \beta_{3}. Esto demuestra que mientras
que los anticuerpos específicos de \alpha_{v} miden todas las
integrinas que contienen \alpha_{v}, los anticuerpos que
reconocen la integrina \alpha_{v}/\beta_{3} intacta o la
subunidad \beta_{3} pueden usarse para estudiar esta integrina
("receptor de vitronectina" \alpha_{v}/\beta_{3}).
Podemos usar otros anticuerpos monoclonales. La
preparación de anticuerpos monoclonales se conoce por los
especialistas en la técnica. Particularmente, el método de Kohler y
Milstein, Nature 1975, 256: 495 puede usarse
para producir anticuerpos monoclonales para el uso en la
invención.
Los métodos de obtención de muestras de tejido
endometrial para análisis incluyen cualquier técnica quirúrgica y
no quirúrgica conocida en la técnica. Los métodos quirúrgicos
incluyen, pero sin limitación, biopsia, raspado y legrado. Los
métodos no quirúrgicos incluyen, pero sin limitación, lavados
uterinos y cepillados uterinos con evaluación
inmunocitoquímica.
Los métodos de detección de \beta_{3} en el
endometrio incluyen todos los métodos de identificación de
glicoproteínas conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero
sin limitación, técnicas inmunohistoquímicas tales como
inmunotransferencia o transferencia de Western, tinción con
inmunoperoxidasa, marcaje con fluoresceína, diaminobenzadina y
biotinilación.
Generalmente, la inmunohistoquímica implica la
tinción de muestras tisulares crioseccionadas. Como se usan en la
presente memoria, las muestras de endometrio pueden crioseccionarse
hasta aproximadamente 4-8 \mum de grosor. El
endometrio se pone en contacto un anticuerpo primario, tal como SSA6
seguido de contacto con un anticuerpo secundario, tal como
anticuerpo antirratón de cabra biotinilado. Después, el endometrio
se incuba en el complejo macromolecular de peroxidasa de rábano
rusticano conjugada con avidina, seguido de incubación con
cromógeno, tal como diaminobenzadina. Después puede añadirse
fluoresceína para observar la distribución de integrinas.
La inmunotransferencia implica el análisis de
proteínas, en la presente memoria integrinas, en electroforesis en
gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida
SDS-PAGE. El gel se procesa en condiciones no
reductoras y las muestras se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa, por ejemplo. La membrana se incuba en medios que
contienen anticuerpo primario, tal como SSA6. El filtro se revela
usando un anticuerpo secundario, tal como anticuerpo antirratón de
cabra conjugado con fosfatasa alcalina.
Los métodos de la presente invención que se
refieren a la predicción de la endometriosis comprenden obtener una
muestra de endometrio, identificar la muestra de endometrio como
nulípara, poner en contacto la muestra con un anticuerpo monoclonal
específico para integrina \beta_{3}, ensayar para determinar la
integrina \beta_{3} en la muestra y correlacionar la ausencia
de integrina \beta_{3} con endometriosis, donde la
endometriosis es una endometriosis leve/mínima.
También están dentro del alcance de la invención
métodos de uso de anticuerpos monoclonales contra integrina
\beta_{3} para predecir la endometriosis y comprenden obtener
una muestra de endometrio, identificar la muestra de endometrio
como nulípara, poner en contacto la muestra con un anticuerpo
monoclonal específico para integrina \beta_{3}, ensayar para
determinar la integrina \beta_{3} en la muestra, correlacionar
la ausencia de integrina \beta_{3} con endometriosis, donde el
endometrio se identifica como endometriosis leve/mínima.
Como se proporciona en la presente memoria, la
subunidad \beta_{3} de la integrina aparece el día 20 del ciclo
menstrual. También se proporciona en la presente memoria que
\alpha_{v}/\beta_{3} en el epitelio endometrial se une a
fibronectina, vitronectina y osteopontina. Estas moléculas pueden
proporcionar un puente entre la integrina
\alpha_{v}/\beta_{3} del endometrio y el embrión. Además,
los pacientes con disfunción de la fase lútea tienen una maduración
endometrial retrasada, infertilidad y tinción negativa para
\beta_{3} del día 20 al 24.
Aunque aún no es seguro que exista una señal
reguladora para la inducción de la integrina endometrial del día 19
a 20, como resultado de la presente invención, actualmente se sabe
que el líquido peritoneal contiene agentes bioactivos que parecen
estar relacionados con la expresión deficiente de integrinas en
mujeres con infertilidad y endometriosis. Los componentes
bioactivos, con un entorno peritoneal anormal, pueden conducir a un
fallo en las interacciones paracrinas entre células endometriales
dentro del útero. Los candidatos incluyen antagonista del receptor
de interleuquina 1\beta, aumentado en mujeres con endometriosis
mínima y leve y que recientemente se ha demostrado que interfieren
con la implantación en un modelo de roedor, Simon, C., et
al., Annual Meeting of the American Fertility Society, Montreal,
S2-Abst O-3, 1993. Una trompa de
Falopio abierta o no cerrada puede ser un requisito previo para los
efectos mediados por endometriosis de la integrina \beta_{3}
endometrial.
La presente invención se describirá
adicionalmente en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no deben
interpretarse como limitantes del alcance de las revindicaciones
adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo endometrio de 35 mujeres en edad
reproductiva en el momento de la hicterectomía. Se obtuvo tejido
desde la fase proliferativa temprana (día 5) hasta la fase secretora
tardía (día 28) y todas las hicterectomías se realizaron por
enfermedad benigna. Se realizaron biopsias endometriales en mujeres
como parte de su evaluación para infertilidad. Todas las pacientes
estaban ciclando normalmente y ninguna había recibido hormonas
durante al menos 3 meses antes de la cirugía. Se evaluó el fechado
endometrial de acuerdo con los criterios de Noyes et al.,
"Dating the Endometrium", Fertil. Steril. 1950,
1: 3. Las biopsias endometriales se evaluaron en el contexto
del momento de la ovulación y/o el comienzo del siguiente periodo
menstrual. Las muestras se juzgaron como "fuera de fase" y el
fechado histológico estaba retrasado en 3 o más días con respecto al
día predicho del ciclo menstrual. El endometrio proliferativo se
clasificaba en base a la histología y al último periodo menstrual.
Las muestras se transportaron en hielo al laboratorio y se
congelaron de golpe en nieve carbónica y se almacenaron a
-70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adquirieron anticuerpos monoclonales (Mab)
P1H5, P1B5, P1D6 específicos para las subunidades \alpha_{2},
\alpha_{3}, \alpha_{5}, respectivamente, de los Drs.
Elizabeth Wayner y Willian Carter. Se adquirieron Mab TS2/7 y
B-5H10 dirigidos contra las subunidades
\alpha_{1} y \alpha_{4}, respectivamente, del Dr. Martin
Hemler. Se adquirió GoH3, un Mab específico dirigido contra
\alpha_{6}, del Dr. Arnoud Sonnenberg. Se adquirió Mab SSA6
específico para la subunidad \beta_{3} de los Drs. Joel Bennett
y James Hoxie. Se adquirió Mab LM142 contra \alpha_{v} del Dr.
David Cheresh. El anticuerpo \beta_{4} se adquirió del Dr.
Steven Kennel. El anticuerpo 23C6 que reconoce \beta_{3}unido a
\alpha_{v} se obtuvo de Michael Horton.
\vskip1.000000\baselineskip
La tinción con inmunoproxidasa se realizó en
secciones de criostato de muestras de endometrio de todo el ciclo
menstrual. Se colocaron criosecciones seriadas de
4-8 \mum de grosor en portaobjetos recubiertos con
poly-L-lisina fijadas en acetona a
-20ºC durante 10 minutos y teñidas usando el kit Vectastain Elite®
ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se usó diaminobenzadina
(DAB; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) como el cromógeno. Se
colocó anticuerpo primario en las criosecciones después del bloqueo
con albúmina de suero bovino al 1% en PBS y se dejó que se uniera a
temperatura ambiente durante 1 hora. Un aclarado con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,2 a 7,3 se siguió del
anticuerpo secundario, que consistía en anticuerpo antirratón de
cabra biotinilado durante 30 minutos. Después de un aclarado con
PBS, las peroxidasas endógenas se inactivaron con una incubación de
30 minutos con H_{2}O_{2} al 0,3% en etanol absoluto, seguido de
una rehidratación de 30 minutos en PBS. Después, se incubó complejo
macromolecular de avidina:peroxidasa de rábano rusticano biotinilada
(ABC) en la secciones durante 30 minutos antes de añadir
diaminobenzadina durante 3 minutos para terminar la reacción.
Algunas muestras se trataron con una dilución 1:200 de anticuerpos
antirratón marcados con fluoresceína durante 1 h, para microscopía
inmunofluorescente. Posteriormente, las muestras se lavaron en PBS y
se montaron. La tinción resultante se evaluó en un microscopio
Nikon a bajos aumentos (100x) y a mayores aumentos (400x) con o sin
fluorescencia. La tinción se juzgó como ausente (-), débil (\pm),
moderada (*) o intensa (++). Se presentan ejemplos de cada una en
la Figura 3. Se realizaron microfotografías usando una película
Kodak T-MAX 100 ASA.
\vskip1.000000\baselineskip
La distribución de las subunidades
\alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{6} y \beta_{4}, de
integrinas que reconocen principalmente colágeno (Col) y/o laminina
(LM) se muestra en la Figura 1 A-D. Estas
subunidades estaban presentes en el epitelio glandular
(\leftarrow) durante todo el ciclo menstrual. Su distribución
dentro del endometrio era típica de la observada para la mayoría de
tejidos epiteliales. Las subunidades \alpha_{2} y
\alpha_{3} estaban distribuidas alrededor de la circunferencia
completa de las células, mientras que las subunidades
\alpha_{6} y \beta_{4} parecían estar localizadas en la
superficie basolateral adyacente a la membrana basal (BM) de las
glándulas endometriales. La expresión de estas subunidades por el
mesénquima (*) era menos pronunciada. Mientras que se observaba una
tinción moderada para \alpha_{6} en células estromales (Figura
1C), se observaba una tinción muy ligera para \beta_{4}. La
expresión de las unidades \alpha_{4} y \alpha_{5} de
integrinas que se sabe que se unen a fibronectina (Tabla 1) estaba
muy restringida. La subunidad \alpha_{4} era indetectable por
encima de la tinción de fondo (compárense la Figuras 1E con la
Figura 2C) en el epitelio o el mesénquima. La subunidad
\alpha_{5} (Figura 1F), representativa del receptor de
fibronectina clásico, no se observaba en los componentes
epiteliales, pero se expresaba mucho en el mesénquima que es rico
en fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que la intensidad de la
inmunotinción para otras tres subunidades de integrinas se
modificaba de una forma dependiente del ciclo menstrual. La
inmunotinción para \alpha_{1} en la fase proliferativa (Figura
2A) era sólo ligeramente superior a los niveles de fondo (Figura
2C). La intensidad de la tinción aumentaba durante toda la fase
secretora (Figura 2B). Esta tinción circunferencial intensa se
descubrió en el epitelio glandular y luminal en todas las muestras
desde el día 15 al 28. Así mismo, \alpha_{v} se expresaba
débilmente tanto en el epitelio como en el mesénquima en la fase
proliferativa (Figura 3A) y la tinción aumentaba gradualmente
durante la fase secretora hasta el nivel observado en la Figura 3B.
Durante la fase proliferativa, la tinción de \beta_{3} sólo
estaba presente en las células mesenquimales (Figura 3C). El
aumento de la tinción de \beta_{3} era evidente en el epitelio
endometrial sólo después del día 19 del ciclo menstrual (Figura 3D)
en el epitelio luminal así como glandular y también estaba presente
en una distribución pericelular. Por el contrario, la capa basal no
se teñía significativamente ni para \alpha_{v} ni para
\beta_{3}. Este patrón de cambio de \alpha_{v} y
\beta_{3} epitelial durante todo el ciclo se estudió en 35
muestras endometriales y se representa gráficamente en la Figura
4A
y 4B.
y 4B.
Se expresaron uniformemente durante todo el
ciclo menstrual receptores de colágeno/laminina (col/LM)
caracterizados por \alpha_{2}, \alpha_{3} y \alpha_{6},
véase la Tabla 2. La distribución pericelular de las subunidades
\alpha_{2} y \alpha_{3} era distintivamente diferente de la
de la subunidad \alpha_{6}. Característica de un receptor de
laminina, \alpha_{6} se concentraba en la superficie
basolateral. También se descubrió que la subunidad \beta_{4},
que se empareja con \alpha_{6}, se distribuía en la superficie
basolateral de las células epiteliales y su distribución parecía
aun más restringida al polo basal. La integrina
\alpha_{5}/\beta_{1}, un receptor de fibronectina
principal, también se expresaba uniformemente durante todo el ciclo
menstrual. A diferencia de los receptores de colágeno y laminina,
la distribución de \alpha_{5}/\beta_{1} estaba limitada al
mesénquima.
Se variaba el patrón de distribución temporal de
\alpha_{v}. La inmunotinción se detectaba primero antes de la
fase secretora con un aumento en la intensidad durante todo el
ciclo. Una subunidad que se sabe se empareja con \alpha_{v} es
\beta_{3}. \beta_{3} no está presente de forma
característica en las células epiteliales. La aparición brusca de
la subunidad \beta_{3} después del día 19 sugiere que la
expresión del receptor de fibronectina está regulada en el
endometrio humano. La tinción \alpha_{v}/\beta_{3}
epitelial aumentada en ciclos normales se correlaciona con una
ventana de implantación dentro de la fase secretora. Aunque no se
ha establecido anteriormente la base fisiológica para la ventana de
implantación, un papel propuesto de las integrinas en la
interacción inicial entre las células maternales y embrionarias
indica un periodo de receptividad endometrial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia de la subunidad \beta_{3}
epitelial parecía ser un marcador interno constante de la maduración
de la fase lútea y el momento de la expresión de \beta_{3} se
correlacionaba con el periodo de perimplantación o ventana de
implantación embrionaria. Para investigar si este fenómeno sería
útil en la evaluación clínica de las biopsias endometriales, se
realizó una inmunotinción en muestras endometriales de fase lútea de
ciclos que mostraban pruebas de retraso en la maduración. Se
compararon biopsias endometriales de 25 mujeres que tenían
concordancia entre el fechado menstrual e histológico (grupo
"normal") con 12 biopsias que se identificaron con \geq3
días fuera de fase (OOP) y en base al momento de la ovulación o al
menstruo posterior. Las muestras se inmunotiñeron para las
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{v} y \beta_{3}. Todas
las biopsias se realizaron los días 20 a 24 del ciclo menstrual. En
todos los casos, la inmunotinción para estos tres antígenos estaba
presente en el epitelio endometrial del grupo normal. En biopsias
que estaban retrasadas 3 días o más, la tinción de \alpha_{1} y
\alpha_{v} estaba presente pero la tinción de \beta_{3}
epitelial estaba ausente. La comparación de la intensidad de
tinción de \beta_{3} en los dos grupos se muestra en la Figura
5A. Acompañando a las microfotografías de la inmunotinción de
\beta_{3} de biopsias fuera de fase (OOP; B) se incluyen
biopsias "en fase" normales (C), que demuestran la discrepancia
observada en la tinción de \beta_{3}. En ciclos de tratamiento
posteriores, 2 pacientes de OOP se sometieron a una biopsia repetida
durante un ciclo normalizado en el momento en el que estaba
presente la inmunotinción para \beta_{3} epitelial. Esto
sugiere que la falta de \beta_{3} no es una deficiencia
intrínseca en el grupo OOP. En su lugar las biopsias discordantes
que carecían de \beta_{3} todavía no habían establecido el
fenotipo lúteo medio de endometrio normal del día 20
al 24.
al 24.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar adicionalmente que la tinción
inmunohistoquímica reflejaba con precisión los cambios en la
expresión de la subunidad \beta_{3} en el epitelio endometrial,
se realizaron inmunotransferencias (transferencias de Western) en
muestras de elementos glandulares endometriales enriquecidos de fase
proliferativa y secretora. Se obtuvieron cuatro muestras de
endometrio para la evaluación de la subunidad \beta_{3} en el
epitelio endometrial proliferativo (n = 2) y secretor tardío (n =
2). Cada muestra se colocó en medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DEM; Sigma, St. Louis, MO) suplementado con suero bovino
fetal al 10% (Flow Laboratories, McLean, VA), glucosa (4500 mg/l),
tampón Hepes (25 mM), L-glutamina (584 mg/L) y
bicarbonato de sodio (3,7 g/l). El endometrio se picó en una placa
de petri de plástico antes de la incubación con 6 mg de colagenasa
(tipo 1A, 550 unidades/mg; Sigma, St. Louis, Mo) durante 2 horas a
37ºC utilizando modificaciones de los procedimientos descritos por
Satyaswaroop et al., en "Isolation and Culture of Human
Endometrial Glands", J. Clin. Endocr. Metab. 1979,
48: 639. La suspensión resultante se hizo pasar sucesivamente
a través de un tamiz de 250 \mum y un tamiz de 38 \mum (Newark
Wire Cloth Co, Newark NJ). El tamiz grueso (250 \mum) eliminaba el
material sin digerir mientras que el segundo retenía los elementos
glandulares y excluía las células estromales y sanguíneas
individuales. Después de un aclarado minucioso, los elementos
glandulares se obtuvieron por nuevo lavado con 10 a 20 ml de DMEN.
Después, las estructuras glandulares aisladas se transfirieron a un
tubo de microfuga de 1,5 ml y se centrifugaron 3 veces (82 x g)
durante 2 minutos con lavados intermitentes con PBS. Se prepararon
extractos de membrana por adición de pequeños volúmenes
(100-200 \mul) de Tris-acetato 10
mM, pH 8,0, NP-40 al 0,5%, Ca^{2}^{+} 0,5 mM
(TNC) con PMSF 2 mM (fenil metil-sulfonil fluoruro)
al sedimento final, se pipeteó y se incubó en hielo durante 15
minutos. El lisado se centrifugó durante 5 minutos a 16.000 x g en
una microcentrífuga. El sobrenadante resultante se denominó extracto
de NP-40 y se congeló a
-70ºC hasta el uso. Una porción del tejido original sin digerir se crioseccionó para localización inmunohistoquímica
de \beta_{3}.
-70ºC hasta el uso. Una porción del tejido original sin digerir se crioseccionó para localización inmunohistoquímica
de \beta_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de proteína de cada extracto de
NP-40 y de un extracto de plaquetas (control
positivo) se determinaron usando la técnica descrita por Lowry
et al., "Protein Measurement With Folin Phenol Reagent",
J. Biol. Chem. 1951, 193: 265. Se añadieron
muestras con cantidades equivalentes de proteína a tampón de
muestras de electroforesis (Tris base 62,5 nM, SDS al 2%, glicerol
al 10%, pH 6,8). Se analizaron muestras mediante
SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida al 6%,
usando condiciones no reductoras descritas en Laemmli, U. K.,
"Cleavage of Structural Proteins During Assembly of the Head of
Bacteriophage T4", Nature 1970, 227: 680.
El gel se transfirió a nitrocelulosa usando un aparato de
transferencia de Biorad (Biorad, Richmond, CA) y se bloqueó con BSA
al 4% en PBS con Na Azida al 0,2% durante 1 hora. Después de la
adición del anticuerpo primario (sobrenadante de SSA6) durante 2
horas, los geles se revelaron usando un anticuerpo secundario
conjugado con fosfatasa alcalina (Promega Corp., Madison, WI) de
acuerdo con los métodos descritos por Albelda et al.,
"EndoCAM: A Novel Endothelial Cell-Cell Adhesion
Molecule", J. Cell Biol. 1990, 110:
1227.
Como se muestra en la Figura 6A, las estructuras
epiteliales de la fase proliferativa tenían de escasa a ninguna
inmunotinción a 95KD (carriles 2 y 3), en comparación con el control
positivo (extracto de plaquetas; carril 1) o con muestras de la
fase secretora (carriles 4 y 5) que demostraban una tinción intensa
para \beta_{3}. Las glándulas endometriales aisladas aparecían
como estructuras tubulares sin estroma circundante (Figura 6B). La
tinción inmunofluorescente para \beta_{3} de las muestras que se
corresponden con los carriles 3 y 4 (fase proliferativa media y día
23, respectivamente) se muestra en las Figura 6C y D. Obsérvese la
usencia de tinción glandular en la muestra proliferativa, mientras
que era evidente una inmunotinción tanto glandular como luminal en
la fase secretora. Estos datos confirman que la expresión de
\beta_{3} epitelial en el endometrio humano es un fenómeno
específico de ciclo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron biopsias de todo el ciclo
menstrual de 500 mujeres que se estaban sometiendo a una evaluación
para infertilidad en la Universidad de Pensilvania. Las biopsias
exploraron para la participación en el estudio en base a criterios
que incluían un conocimiento exacto del día de ciclo menstrual o
histología "en fase" y ausencia de alteraciones del ciclo
menstrual (anovulación, suspensión o cese de la ovulación), estado
perimenopáusico (sangrado uterino disfuncional), deficiencia de la
fase lútea (pruebas histológicas de retraso en la maduración del
endometrio), la presencia o uso de un dispositivo intrauterino o
endometritis (inflamación del endometrio debida a agentes
infeciosos o a irritación química). Así mismo, se excluyeron
pacientes con hiperplasia endometrial (un aumento en el número de
células en el endometrio), neoplasia (un proceso patológico que da
como resultado la formación o crecimiento de tejidos anormales o
tumores benignos o malignos) y las que estaban bajo terapia
hormonal (incluyendo anticonceptivos orales, terapia de reemplazo de
estrógenos y progestágenos). Doscientas sesenta y ocho mujeres
cumplían los requisitos para incluirse en este estudio, que variaban
del día 2 del ciclo al 27. El diagnóstico primario más común era de
endometriosis (41,4%), seguido de una infertilidad inexplicable
(23,5%), véase la Tabla 3. Debido al criterio de participación de
histología "en fase" normal, como se ha indicado
anteriormente, se excluyeron todos los casos de deficiencia de la
fase lútea.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron biopsias endometriales de 241
pacientes después del día 19 (día 6 postovulación o posterior) en
base a la hormona luteinizante urinaria LH, al pico o al próximo
periodo menstrual, un momento en el ciclo menstrual cuando se
expresa \beta_{3} epitelial, Lessey, et al.,
anteriormente. Los pacientes restantes (n = 27) se biopsiaron antes
del día 20 y, por lo tanto, no se esperaría que produjeran la
integrina \beta_{3}. En base al trabajo de infertilidad de
rutina que incluye diagnóstico laparoscópico, que implica el examen
del contenido del peritoneo con un laparoscopio pasado a través de
la pared abdominal, 105 (43,6% del grupo) de estas mujeres tenían
endometriosis. Las 105 mujeres se consideraron entonces como los
casos de ensayo. Veinte mujeres con endometriosis también habían
documentado fertilidad anterior, habían dado a luz crías
anteriormente, teniendo un número de parto \geq1, donde cada
mujer había tenido \geq1 parto anterior y se había sometido a una
ligación tubárica bilateral o se había identificado claramente una
infertilidad por factor masculino (o infertilidad del compañero
masculino). Éstas se seleccionaron para servir como controles
fértiles. Las 116 mujeres restantes (48,1% del grupo) se
consideraban los controles
infértiles.
infértiles.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una tinción con inmunopreoxidasa en
las 241 muestras como se describe en Lessey, et al.,
anteriormente. En resumen, se realizó una tinción con
inmunopreoxidasa en secciones de criostato de endometrio de todo el
ciclo menstrual. Se colocaron criosecciones seriadas de
4-8 \mum de grosor sobre portaobjetos recubiertos
con poli-L-lisina, se fijaron en
acetona a -20ºC durante 10 minutos y se tiñeron usando el kit
Vectastain Elite® ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se usó
diaminobenzadina (DAB; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como el
cromógeno. El anticuerpo primario que consistía en SSA6 (específico
para la subunidad \beta_{3} del receptor de vitronectina) se
colocó sobre las criosecciones después del bloqueo con albúmina de
suero bovino al 1% en solución salina tamponada con fosfato, PBS y
se dejó que se uniera a temperatura ambiente durante 1 hora. Un
aclarado con PBS, de pH 7,2 a 7,4, se siguió de un anticuerpo
secundario que consistía en anticuerpo antirratón de cabra
biotinilado durante 30 minutos. Después del aclarado con PBS, las
peroxidasas endógenas se inactivaron con una incubación de 30
minutos con H_{2}O_{2} al 0,3% en etanol absoluto seguido de
una rehidratación de 30 minutos en PBS. Después, se incubó el
complejo macromolecular de avidina:peroxidasa de rábano rusticano
biotinilada (ABC) en las secciones durante 30 minutos antes de
añadir diaminobenzadina durante 3 minutos para terminar la
reacción. Las muestras se lavaron posteriormente en PBS y se
montaron.
La inmunotinción para \beta_{3} endometrial
se realizó en cada una de las 268 biopsias endometriales obtenidas
durante todo el ciclo menstrual (véase la Figura 7). Se muestran
ejemplos de expresión específica de ciclo de subunidad
\beta_{3} usando la tinción inmunohistoquímica en la Figura 8A
(proliferativo), Figura 8 B (día 18), Figura 8C (día 22) y una
muestra del día 23 del ciclo con tinción negativa en un paciente con
endometriosis cuya biopsia "en fase" se leyó como de "día
22-23" en una sección histológica (D). Como se
observa en todos los casos, la inmunotinción del endotelio vascular
continúa presente incluso en las muestras sin tinción epitelial
para esta integrina, sirviendo de este modo como un control interno
positivo para técnica de inmunotinción. En base a la distribución
de \beta_{3} que se muestra en la Figura 7 y a la teoría de que
la subunidad \beta_{3} se expresa normalmente en el endometrio
desde el día 20 en adelante, todas las muestras que se fecharon
histológicamente el día 20 del ciclo o después se incluyeron para
una evaluación adicional (n = 241). Los casos con endometriosis
conocida (102/241; 43,5%) se compararon con los controles
infértiles sin endometriosis (116/241; 48,1%) y con 20 controles
fértiles (20/241; 83%). Como se enumera en la Tabla 4, tanto el
grupo con endometriosis como los controles infértiles eran más
jóvenes que los controles fértiles. La tinción resultante se evaluó
en un microscopio Nikon a bajos aumentos (100x) y mayores aumentos
(400x). El HSCORE, un índice semicuantitativo que estima tanto la
intensidad como la distribución de la tinción positiva para la
integrina \beta_{3}, se calculó usando la siguiente
ecuación:
HSCORE =
\Sigma Pi (i
+1)
donde i = intensidad de la tinción
con un valor de 1, 2 ó 3, débil, moderada o intensa,
respectivamente, y Pi es el porcentaje de células epiteliales
teñidas para cada intensidad, que varía del 0-100%.
Se han descrito valores intraobservador bajos (r = 0,994; p =
0,00001) en tejidos uterinos usando esta técnica por
Budwit-Novotny, D. A., et al.,
"Inmunohistochemical Analyses of Estrogen Receptor in Endometrial
Adenocarcinoma Using a Monoclonal Antibody", Cancer Res.,
1986 46: 5419-5425. Se ilustran en la Figura
8 ejemplos de HSCORE representativos que reflejan niveles
cambiantes de intensidad de tinción y distribución. Se realizaron
microfotografías usando una película Kodak 100
ASA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon pacientes con endometriosis
infértiles con controles infértiles sin endometriosis y controles
fértiles. También se realizaron comparaciones entre pacientes con
endometriosis nulíparas y pacientes con endometriosis con partos en
características seleccionadas tales como edad y HSCORE y se
realizaron usando el ensayo de Wilcoxon no paramétrico. Wilcoxon
F., Individual Comparisons by Ranking Methods. Biometrics
Bull 1945 1: 80-85.
El análisis de las características de operador
receptor (ROC) se usó para determinar el valor de corte óptimo para
el HSCORE en mujeres que se iban a someter a laparoscopia en un
futuro. Metz, C. E., Basic Principles of ROC analysis. Sem Nuclear
Med 1978; 8: 283-298. Se buscaba un valor de corte
de HSCORE como el valor predictivo positivo más elevado de
endometriosis que significaba búsqueda de una elevada especificidad
a costa de una sensibilidad moderada. Un valor predictivo positivo
elevado minimiza el número de mujeres que de otro modo se
someterían a una cirugía innecesaria, usando este ensayo como una
modalidad de diagnóstico para la endometriosis. El valor de corte
de HSCORE era de 0,7 que producía una sensibilidad de 3, una
especificidad del 91% y un valor predictivo positivo del 86% para
la detección de endometriosis.
La asociación entre el HSCORE y la endometriosis
se evaluó primero mediante un ensayo no paramétrico (ensayo de
Wilcoxon) y se evaluó adicionalmente mediante una regresión
logística múltiple en la muestra de 241 mujeres cuyas biopsias eran
histológicamente del día 20 del ciclo o posteriores. Como se observa
en la Tabla 4, el HSCORE medio era significativamente inferior para
el grupo con endometriosis infértil (p < 0,003) en comparación
con controles fértiles (p < 0,002) y los controles infértiles sin
endometriosis p < 0,012); (Tabla 4). De forma interesante, los
controles infértiles sin endometriosis también tenían un HSCORE
límite inferior para tinción de \beta_{3} que el grupo de
control fértil (p = 0,005).
La gravedad de la endometriosis en base a la
clasificación de la AFS parecía estar asociada con la presencia o
ausencia de la inmunotinción de \beta_{3}. Los 115 pacientes con
infertilidad y endometriosis se clasificaron por la gravedad de la
enfermedad. La distribución de casos mediante puntuación de la
gravedad de la AFS se enumera en la Tabla 4. El HSCORE de los dos
grupos basado en la puntuación de la gravedad de AFS, I y II (mínima
y leve; n = 84) frente a III y IV (moderada y grave; n = 21)
demostraba una diferencia significativa usando un ensayo de
Wilcoxon (p = 0,0151). Por lo tanto, la expresión de \beta_{3}
defectuosa se asocia específicamente con las fases de endometriosis
I y II.
Se usó una regresión logística multiple usando
EGRET para evaluar la asociación entre la endometriosis y el HSCORE
después del ajuste para los efectos de la edad y el estado del
número de parto y teniendo en cuenta la interaccion potencial del
estado del número de parto. Mauritisen, R. EGRET. Statistics and
Epidemiology Research Corporation Software. Seattle, WA, 1990.
Mediante análisis logístico múltiple, el riesgo
relativo bruto (RR) y el intervalo de confianza del 95% (CI) basado
en un modelo con sólo HSCORE como la variable independiente y la
presencia o ausencia de endometriosis como la variable dependiente
(resultado) era de 0,6 (0,5-0,8) cuando se calculaba
para un HSCORE de 0,7 (mediante análisis de ROC). Un riesgo
relativo (RR) de 1 significa que no hay efecto, que dos grupos son
iguales con respecto a riesgo para endometriosis. Un RR de 0,6 es
muy significativo, los intervalos de confianza muestran el
intervalo de confianza del ensayo. En su conjunto RR y CI definen un
riesgo aumentado de tener endometriosis en mujeres nulíparas con un
HSCORE de 0,7 o inferior. La adición de la edad al modelo no cambió
el resultado pero había una interación estadísticamente
significativa con el estado de número de parto (p = 0,030). Por
consiguiente, el RR ajustado (CI del 95%) era 0,6
(0,4-0,9) para mujeres nulíparas en comparación con
1,2 (0,8-1,8) para mujeres con partos. Estos
resultados indican que la ausencia de \beta_{3} (como se
indicaba por el HSCORE) en mujeres nulíparas es una predicción
estadísticamente significativa de endometriosis. La restricción de
los análisis a mujeres con sólo enfermedad mínima y leve no variaba
el resultado sustancialmente. El RR ajustado (CI del 95%) en
mujeres nulíparas era de 0,5 (0,4-0,8) en
comparación con 1,2 (0,7-1,8) en mujeres con
partos.
Para examinar adicionalmente esta relación entre
la historia reproductiva y el HSCORE, los 105 pacientes con
endometriosis se clasificaron por el número de parto y se compararon
con el grupo de control fértil (Tabla 5). La población de control
era de mayor edad que los grupos con endometriosis con partos y
nulíparas. El HSCORE en el grupo de nulíparas con endometriosis era
menor que el del grupo de mujeres con partos con endometriosis y el
grupo de controles fértiles (p < 0,0001 para cada grupo), pero no
había diferencias entre el grupo con partos con endometriosis y los
controles fértiles (p = 0,98). La comparación entre estos tres
grupos se representa gráficamente en la Figura 9.
La observación de que hay diferencias en la
expresión de integrinas se correlaciona con el diagnóstico de
endometriosis dio lugar a la evaluación de la utilidad de este
marcador en la predicción de este trastorno en mujeres que se van a
someter a la laparoscopia de diagnóstico. Como un subgrupo de las
241 muestras originales, se obtuvieron 89 biopsias posiblemente
antes de la laparoscopia de diagnóstico. Se estableció el fechado
cronológico mediante la hormona luteinizante urinaria, LH, el pico
y/o el comienzo del siguiente periodo menstrual. Se realizó el
fechado endometrial usando los criterios Noyes et al.,
"Dating the Endometrium", Fertil. Steril. 1950,
1: 3. Todas estas 89 mujeres se sometieron posteriormente a
una laparoscopia de diagnóstico para determinar la presencia o
ausencia de endometriosis. La gravedad de la enfermedad, cuando
estaba presente, se clasificó de acuerdo con los criterios de la
American Fertility Society, AFS, revisados expuestos en American
Fertility Society: Revised American Fertility Society classification
of endometriosis, anteriormente. Los cirujanos que realizaban las
laparoscopias de diagnóstico lo hacían a ciegas con respecto al
resultado de los descubrimientos inmunohistoquímicos. Así mismo, la
interpretación de los resultados de biopsia (estimación de la
expresión de \beta_{3}) se realizó de una forma a ciegas usando
HSCORE, que estima tanto la intensidad como la distribución de la
tinción positiva para \beta_{3} integrina. El valor de HSCORE
0,7, determinado como el corte óptimo, daba una sensibilidad del
38%, una especificidad del 91% y el valor predictivo positivo más
alto de 86% para la detección a futuro de endometriosis. En su
conjunto, se descubrió presuntamente en la laparoscopia que los 50
pacientes tenían endometriosis en una diversidad de fases de la AFS.
La tinción negativa que indicaba que no había expresión de
\beta_{3}, basada en los análisis de ROC, se detectó en 22
muestras. De estos 22 pacientes sin tinción de \beta_{3}, se
descubrió que 19 tenían endometriosis. El análisis de ROC se
realizó para establecer el valor de corte óptimo para muestras
normales. Hasta donde sabe el solicitante, la presente invención es
el primer ensayo no quirúrgico que se ha demostrado que predice la
presencia de una endometriosis mínima o leve.
Todos los pacientes que posteriormente se
descubrió que tenían endometriosis no les faltaba la subunidad
\beta_{3}. La presente invención identifica un subgrupo de
pacientes de infertilidad con un déficit en \beta_{3} que
caracteriza mujeres con una receptividad uterina deficiente. Esta
asociación entre la endometriosis y la expresión de integrina
\beta_{3} defectuosa puede representar la primera deficiencia
específica y ciclo durante la supuesta ventana de implantación. La
detección de la pérdida de \beta_{3} puede significar pacientes
con endometriosis que presentan un riesgo elevado de infertilidad
debido a un factor endometrial. Aunque la implantación puede ser el
resultado de una cascada de diferentes moléculas, la presente
invención revela que la pérdida de un solo componente puede ser
suficiente para explicar un fallo en la implantación.
La presente invención revela que la perdida de
\beta_{3}, que normalmente se expresa en el inicio de la
ventana de implantación, se asocia con mujeres que parecen ser las
más infértiles. El uso a futuro de esta proteína marcadora ha
demostrado que la subunidad de integrina \beta_{3} es un ensayo
útil con una elevada especificidad y una valor predictivo positivo
para el diagnóstico no quirúrgico de la endometriosis mínima o
leve. Como un marcador potencial de la receptividad uterina que
puede predecir el potencial de fertilidad, el estudio de este
subgrupo de pacientes de infertilidad permite un mayor
perfeccionamiento del diagnóstico de esta enfermedad
enigmática.
Se obtendrán biopsias de todo el ciclo menstrual
de mujeres que se están evaluando para infertilidad. Mujeres con
partos y nulíparas se incluirán en el estudio. Las biopsias se
explorarán para la participación en un estudio en base a criterios
que incluyen un conocimiento preciso del día del ciclo menstrual o
histología "en fase" y ausencia de alteraciones del ciclo
menstrual (anovulación, suspensión o cese de la ovulación), estado
perimenopáusico (sangrado uterino disfuncional), deficiencia de la
fase lútea (pruebas histológicas de retraso en la maduración del
endometrio), la presencia o uso de un dispositivo intrauterino o
endometritis (inflamación del endometrio debida a agentes
infecciosos o irritación química). Se excluirán pacientes con
hiperplasia endometrial (un aumento en el número de células en el
endometrio), neoplasia (un proceso patológico que da como resultado
la formación o crecimiento de tejido anormal o tumores benignos o
malignos), las que están bajo terapia hormonal (incluyendo
anticonceptivos orales, terapia de reemplazo de estrógenos y
progestágenos) y las que tienen deficiencia de la fase lútea.
Se obtendrán biopsias endometriales del día 19
(día 6 postovulación o posterior) en base a la hormona luteinizante
urinaria, LH, el pico o al próximo periodo menstrual, un momento en
el ciclo menstrual cuando se expresa \beta_{3} epitelial, Lessey
et al., anteriormente. También se seleccionaran controles
fértiles e infértiles.
Se realizara una tinción con inmunoperoxidasa en
las muestras de pacientes como se describe en Lessey, et
al., anteriormente. En resumen, se realizará una tinción
con inmunoperoxidasa en secciones de criostato del endometrio de
todo el ciclo menstrual. Se colocarán criosecciones seriadas de
4-8 \mum de grosor en portaobjetos recubiertos
con poli-L-lisina, se fijarán en
acetona a -20ºC durante 10 minutos y se teñirán usando el kit
Vectastain Elite® ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se
usará diaminobenzadina (DAB; Sigma Chemical CO., St. Louis, MO)
como el cromógeno. Se colocará un anticuerpo primario que consiste
en SSA6 (específico para la subunidad \beta_{3} del receptor de
vitronectina) en criosecciones después del bloqueo con albúmina de
suero bovino al 1% en solución salina tamponada con fosfato, PBS y
se dejará que se unan a temperatura ambiente durante 1 hora. Un
aclarado con PBS, de pH 7,2 a 7,4, se seguirá de anticuerpo
secundario que consiste en anticuerpo antirratón de cabra
biotinilado durante 30 minutos. Después del aclarado con PBS, las
peroxidasas endógenas se inactivarán con una incubación de 30
minutos con H_{2}O_{2} al 0,3% en etanol absoluto seguida de
una rehidratación de 30 minutos en PBS. Después, se incubará un
complejo macromolecular de avidina:peroxidasa rábano rusticano
biotinilada (ABC) en las secciones durante 30 minutos antes de
añadir diaminobenzadina durante 3 minutos para terminar la
reacción. Las muestras se lavarán posteriormente en PBS y se
montarán.
El HSCORE y el análisis estadístico usando el
ensayo de Wilcoxon, el análisis de ROC y los valores p, para
hembras infértiles se espera que sea similar al de hembras
infértiles nulíparas explicado anteriormente. El valor de corte del
HSCORE, y los valores de sensibilidad y especificidad se
determinarán para la detección de endometriosis en pacientes
infértiles. Los pacientes también se separarán según la gravedad de
la endometriosis en base a la clasificación de la AFS. Se usará
EGRET para evaluar la asociación entre la endometriosis y el HSCORE
después de ajustar para los efectos de la edad y del estado de
número de parto, véase anteriormente. El riesgo relativo bruto y
los intervalos de confianza se calcularán para la endometriosis. En
su conjunto, se espera que la expresión de integrina detectada por
la ausencia de \beta_{3} se correlacionará con el diagnóstico
de endometriosis en hembras infértiles.
Diversas modificaciones de la invención además
de las mostradas y descritas en la presente memoria serán evidentes
para los especialistas en la técnica de la descripción anterior.
Dichas modificaciones también se pretende que estén dentro del
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (8)
1. Un método para predecir la endometriosis que
comprende:
- a.
- identificar como nulípara una muestra de endometrio seleccionada del día 20 al 24 o del día 19 al 23del ciclo menstrual;
- b.
- ensayar la muestra para detectar la integrina \beta_{3} en la muestra.
- c.
- correlacionar la ausencia de expresión de integrina \beta_{3} con endometriosis.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la expresión de la integrina \beta_{3} se controla mediante una
inmunohistoquímica o un método de inmunohistoquímica.
3. Un método de la reivindicación 2, en el que
el método de inmunohistoquímica se selecciona de entre
inmunotransferencia, transferencia de Western, tinción con
inmunoperoxidasa, marcaje con fluoresceína, diaminobenzadina y
biotinilación.
4. Un método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra de endometrio es del
día 20 del ciclo menstrual.
5. Un método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el endometrio es humano.
6. Un método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la \beta_{3} se combina con
otra subunidad de integrina.
7. Un método de la reivindicación 6, en el que
la otra subunidad de integrina es integrina \alpha_{v}.
8. Un método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la endometriosis es una
endometriosis leve/mínima.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US155435 | 1993-11-19 | ||
| US08/155,435 US5478725A (en) | 1992-06-12 | 1993-11-19 | αv β3 integrin as a predictor of endometriosis |
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| ES03020599T Expired - Lifetime ES2312703T3 (es) | 1993-11-19 | 1994-11-18 | Integrina beta3 como indicador de endometriosis. |
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