ES2312944T3 - Procedimiento para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno y fibrinogeno obtenido por dicho procedimiento. - Google Patents
Procedimiento para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno y fibrinogeno obtenido por dicho procedimiento. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la eliminación de virus en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, partiendo de una solución de fibrinógeno procedente de plasma humano previamente purificado, con una pureza igual o superior al 80% de fibrinógeno con respecto al total de proteínas, caracterizado por proceder a la estabilización y congelación de la solución y posterior descongelación de la misma a una temperatura comprendida entre 5 y 20ºC, procediendo después a la separación de los materiales insolubilizados y a la dilución de la proteína y nanofiltración de la solución resultante con filtros hasta un tamaño de poro inferior a 35 nm.
Description
Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno y fibrinógeno obtenido por dicho
procedimiento.
La presente invención se refiere a un
procedimiento destinado a la eliminación de virus en soluciones de
fibrinógeno por nanofiltración y asimismo se refiere al fibrinógeno
de aplicación terapéutica obtenido mediante dicho procedimiento.
El fibrinógeno plasmático, glicoproteína de
340.000 daltons de peso molecular, es el factor de coagulación
activado al final de la cascada de la coagulación, durante la
hemostasis. Este fibrinógeno interviene tanto en la hemostasis
primaria, en la agregación plaquetar, como en la hemostasis
secundaria, en la formación del coágulo de fibrina.
El fibrinógeno como producto terapéutico,
proteína purificada a partir del plasma humano, tiene utilidad como
terapia sustitutiva en situaciones de déficit de esta proteína y,
como componente de adhesivos de fibrina, en hemostasis y sellado de
heridas, reconstrucciones de tejidos, cola biológica y vehículo de
liberación de medicamentos y hormonas, entre otras
aplicaciones.
La preparación del fibrinógeno, para su uso
comercial, se realiza a partir de plasma humano de numerosos
donantes ("pool"). A pesar de los controles realizados sobre
los donantes y las donaciones a nivel de banco de sangre y de
unidades de plasma, minipooles y pooles industriales para
fraccionamiento, no puede excluirse la posibilidad de contaminación
por virus hemáticos. Por tanto, en los procesos de purificación de
proteínas plasmáticas se introducen etapas específicas de
eliminación de virus. Esto es si cabe de mayor importancia en esta
proteína, que puede purificarse a escala industrial a partir de
crioprecipitado o de la FrI (fracción primera) del método de Cohn
[Cohn. J. y otros; J Am Chem Soc (1946) 68, 459-475]
ya que al estar el material de partida situado al principio del
fraccionamiento del plasma se arrastra potencialmente una mayor
carga vírica y además no presenta el efecto reductor del posterior
fraccionamiento con etanol.
Entre los métodos de reducción de la carga viral
utilizados en los procesos de purificación de proteínas plasmáticas
cabe destacar, por su amplia utilización y contrastada
eficiencia:
- Tratamientos térmicos. Presentan un potencial
reductor de la carga viral efectivo tanto para los virus envueltos
como para los no envueltos. Su eficiencia está directamente
relacionada con la estabilidad térmica de la proteína y con el
estabilizante adicionado. Por tanto, presentan el inconveniente de
que pueden darse alteraciones en la molécula proteica que induzcan
la formación de neoantigenicidad [CPMP/Note for guidance on plasma
derived products (CPMP/BWP/269/95rev. 3) Enero 2001].
- Tratamientos con solventes orgánicos (OSD).
Por su gran eficiencia en la inactivación de los virus con cubierta
lipídica es un tratamiento de amplia utilización y que puede
considerarse de referencia para estos tipos de virus. Por el
contrario no tiene ningún efecto sobre los virus sin cubierta
lipídica, como los Parvovirus y Virus de la Hepatitis A [Burnouf T.
Blood Reviews (2000) 14, 94-110; Martinowitz U.
Curr. Opin. Hematol. (1996) 3, 395-402].
Por otra parte la tendencia actual es la
inclusión de al menos dos etapas complementarias de eliminación de
virus.
- La filtración de soluciones a través de
filtros de un tamaño de poro capaz de retener partículas víricas es
un método cuya utilización se ha extendido en los últimos años. Se
trata de un procedimiento físico que en principio no presenta
capacidad de alterar la estructura de las proteínas y si una
eficiente capacidad de eliminación de la carga viral, en función
del tamaño de poro empleado. Este tamaño de poro vendrá
especialmente condicionado por la dimensión espacial de la molécula
de proteína a filtrar (que debe atravesar el filtro). La filtración
por filtros de 20 nm o inferiores puede garantizar una reducción
significativa de los virus no envueltos de pequeño tamaño, como el
virus de la Hepatitis A y el Parvovirus, comprendidos entre los 20
y 30 nm. En cambio la filtración por filtros de mayor tamaño de poro
(35 nm o superior) no garantizaría un suficiente nivel de seguridad
frente a estos virus. Obviamente, la dificultad de esta técnica
parece insalvable cuando las diferencias de tamaño entre virus y
proteína tienden a desaparecer [J. J. Morgenthaler, Vox Sang (2000)
78 (suppl 2), 217-221].
Hasta el momento se ha descrito la aplicación
industrial de la nanofiltración de soluciones de fibrinógeno por
filtros de 35 nm pero no por filtros de tamaño de poro menores. Por
sus características de tamaño molecular y estabilidad, el
fibrinógeno es una proteína que presenta dificultades de filtración,
incluso cuando se pretende la esterilización por filtración a
través de filtros de 0,2 \mum de poro.
En la patente PCT WO 99/23111 se describe y
reivindica la filtración de una solución de fibrinógeno por un
filtro de un tamaño de poro de 35 nm, para lo cual debe adicionarse
un detergente que posibilita dicha filtración evitando una pérdida
sustancial de proteína que haría inviable su aplicación
industrial.
La patente WO 98/37086 constata que la presencia
de proteínas de elevado peso molecular (superior a 150 kD), entre
las que se incluye al fibrinógeno, dificultan la filtración de
proteínas de menor tamaño por nanofiltros de 15 nm. Dicha patente
describe un método para eliminar dichas proteínas de alto peso
molecular (entre ellas el fibrinógeno) con el objeto de permitir la
nanofiltración. Desde luego, este no es el objetivo de la presente
invención pero ejemplifica la dificultad de nanofiltración de
moléculas de elevado peso molecular.
La solicitud de patente EP 1 161 958 A1 describe
un método para inactivar virus en líquidos biológicos. En el
procedimiento descrito, el poro del nanofiltro está condicionado por
el tamaño de la proteína a filtrar, mostrando en los ejemplos la
filtración por 35 nm y reivindicando la cromatografía previa de la
solución a filtrar con el objeto de facilitar dicha nanofiltración.
Esto muestra la dificultad de realización de la nanofiltración,
incluso por 35 nm, cuando el tamaño de la proteína es
considerable.
La solicitud de patente US 2001/0051154 A1 dice
describir la estabilización de proteínas, entre las que se incluye
el fibrinógeno, con objeto de preservarlas frente a la pérdida de
actividad o desnaturalización durante el tratamiento de reducción
de la carga viral, tanto por pasteurización como por nanofiltración.
Para ello se adiciona una cantidad importante de azúcares (= 0,5
g/ml) y uno o mas aminoácidos (> 0,5 mol/l). Sin embargo esta
patente ni describe ni ejemplifica la nanofiltración de fibrinógeno
por lo que no es deducible que pueda realizarse la nanofiltración
del fibrinógeno por filtros de tamaño de poro inferior a 35 nm.
Las preparaciones de fibrinógeno, como
componente de adhesivos de fibrina, comercializadas en la actualidad
[M. R. Jackson, The American Journal of Surgery (2001) 182,
1S-7S], utilizan métodos de reducción de la carga
viral que consisten fundamentalmente en tratamientos térmicos y
tratamientos con OSD. La nanofiltración no parece ser un método de
elección, debido probablemente a que la filtración por 35 nm (o poro
superior) no muestra eficiencia para los virus de pequeño tamaño
que no han sido eliminados por el OSD o el tratamiento térmico.
Por la presente invención se consigue la
filtración de una solución de fibrinógeno por filtros de un tamaño
de poro nominal inferior a 35 nm, a unas condiciones de tiempo de
proceso, superficie filtrante y recuperación proteica que
posibilitan su aplicación industrial en la producción de fibrinógeno
purificado como producto terapéutico. Esta filtración se consigue
en base a una congelación y descongelación previa de la solución de
fibrinógeno purificada, en condiciones controladas. Los inventores
han descubierto que, sorprendentemente, con esta congelación y
descongelación controlada se produce la precipitación de material
insoluble, agregado o parcialmente desnaturalizado que impediría,
en la práctica, la filtración de la solución por tamaños de poro
inferiores a 35 nm. La separación del material precipitado, permite
la nanofiltración hasta un tamaño de poro inferior a 35 nm.
Para la purificación del fibrinógeno procedente
de plasma humano se puede partir de crioprecipitado, de la Fracción
primera (FrI) del método de Cohn o de una fracción equivalente que
contenga fibrinógeno, a partir de la cual y por precipitación,
preferentemente con glicina, se obtiene un precipitado de
fibrinógeno purificado.
La fracción de partida, previa solubilización y
clarificación, puede someterse a un tratamiento con un Solvente
Orgánico y Detergente (OSD), con objeto de inactivar los posibles
virus con cubierta lipídica que pudieran estar presentes. El OSD
puede ser eliminado mediante alguno de los métodos conocidos, como
la cromatografía o, preferentemente en este caso, por precipitación
con glicina.
La fracción purificada rica en fibrinógeno puede
ser solubilizada, clarificada por filtración o centrifugación y
ajustada de estabilizantes, preferentemente aminoácidos (arginina,
glicina o equivalentes) y carbohidratos (sacarosa), pH
preferentemente entre 6,0 y 8,0 y fuerza iónica ajustada
preferentemente con cloruro sódico a concentraciones
fisiológicas.
Sorprendentemente, a partir de la anterior
solución purificada y ajustada de Fibrinógeno, con una pureza
preferentemente mayor o igual al 80%, los inventores han
descubierto que por medio de la congelación y descongelación de la
solución a temperatura controlada entre 5 y 20ºC y preferentemente
entre 8 y 13ºC se produce una insolubilización de los componentes
inestables asociados al fibrinógeno, fácilmente agregables o
desnaturalizables. La separación de estos materiales puede
realizarse sin dificultad por clarificación por una malla de nylon,
metal o mejor aun por decantación o centrifugación o filtración
directa preferentemente con gradiente de filtros, o combinación de
cualquiera de las anteriores técnicas. El material resultante es,
sorprendentemente, nanofiltrable incluso por poros inferiores a 35
nm, con productividades y recuperaciones muy aceptables.
A continuación se describe una forma preferida
de aplicación de la presente invención. El material resultante de
dicha clarificación, diluido a una concentración inferior o igual
1,5 mg/ml en presencia de al menos un aminoácido (preferentemente
arginina), a una concentración comprendida entre el 0,1 y el 8%
(p/v) y a una temperatura comprendida entre 18 y 37ºC,
preferentemente en ambos casos, y previamente clarificado por
filtros de tamaño de poro superior, se filtra por un nanofiltro de
poro inferior a 35 nm (preferentemente en torno a 20 nm), con una
recuperación de proteína superior al 80%. La superficie filtrante
necesaria para la realización de esta nanofiltración está
comprendida entre 10 y 1000 cm^{2} por litro de solución a
filtrar, según concentración de proteína de la solución y tamaño de
poro del nanofiltro empleados. El tiempo de proceso es habitualmente
inferior a 12 horas.
Los datos obtenidos de recuperación de proteína,
superficie filtrante necesaria y tiempo de proceso requerido, junto
con la caracterización del producto obtenido demuestran la
aplicabilidad de la invención en un proceso industrializable.
Se partió de la fracción I precipitada de
acuerdo al método de Cohn con etanol en frío al 8%. Se tomaron 10
kg de dicha fracción I que se suspendió en relación 1:9 con una
solución tampón que contenía cloruro-citrato
sódicos, e incluía un anticoagulante y un antifibrinolítico. La
suspensión se clarificó a 30ºC por filtros de profundidad de
polipropileno y de ésteres celulósicos (ambos de Millipore) hasta un
tamaño de partícula de 0,5 micras, aproximadamente.
Seguidamente se efectuó el tratamiento de
inactivación vírica con solvente-detergente,
utilizando tri-n-butil fosfato al
0,3% y polisorbato 80 al 1%, incubando a 27ºC durante no menos de 6
horas. La solución inactivada se enfrió a 9ºC y se precipitó por
adición de glicina hasta una concentración del 1,7 M. El precipitado
formado se separó por centrifugación a unas 15000 rpm usando una
centrífuga Sharples de 5 kg de capacidad, y luego se suspendió en
una solución de cloruro-citrato sódicos, y se
precipitó de nuevo con glicina hasta 1,5 M. De nuevo, el
precipitado formado se separó por centrifugación y luego se
reprecipitó de la misma forma como se ha indicado en el paso
anterior.
El precipitado obtenido (precipitado 3º de
glicina) representa un 60-80% del peso de fracción I
de partida y esta constituido aproximadamente por un 15% de
proteína seca, con una pureza de aproximadamente el 90% de
fibrinógeno. Este material se solubilizó a 30ºC con una relación 1:3
de una solución de sacarosa 3,4% y una concentración isotónica de
sales cloruro-citrato sódicos, filtrándose
seguidamente por filtros de profundidad y clarificantes (ambos de
Millipore) hasta un tamaño de poro de 1 \mum. Se obtuvieron unos
30 litros de la solución.
El material se diafiltró por membranas de 100
kDa (de Pall-Filtron) frente a arginina 1% para
eliminar el exceso de sales, sacarosa y glicina, y una vez al 1,5%
de fibrinógeno y formulado con albúmina al 0,5%, se clarificó por
0,5 micras y se filtró estérilmente por 0,2 micras.
A partir de la anterior solución estéril se
intentó filtrar por 0,1 micras a través de discos de 47 mm de
diámetro (DVD y DJL de Pall) colapsándose casi inmediatamente (en
unos 5 - 10 minutos) y filtrando menos de unos 5 ml de la solución,
observando una reducción de 2,1 UA de D.O. (de 27,2 UA a 25.1 UA) en
el filtrado. Estos resultados fueron insatisfactorios y muestran la
dificultad de filtración del fibrinógeno, incluso por filtros de
tamaño de poro de 0,1 micras.
La solución filtrada por 0,2 micras se congeló a
-70ºC para llevar a cabo pruebas posteriores de filtración.
Se partió de la solución filtrada por 0,2 micras
del ejemplo 1, descongelada totalmente a 30ºC, para efectuar
pruebas de nanofiltración a diferentes concentraciones de
fibrinógeno, investigándose el posible efecto positivo sobre la
filtrabilidad al efectuar una dilución extrema, como procedimiento
para dispersar las moléculas de fibrinógeno en presencia de una
solución de aminoácido (arginina).
Se tomó una parte alícuota de la solución
filtrada por 0,2 micras y se efectuaron diferentes diluciones con
solución de arginina 0,66%, citrato sódico 2,7 mM y cloruro sódico
62,6 mM, a pH 7,0 y a 30ºC, de forma que las concentraciones
finales de fibrinógeno fueron aproximadamente de: 5, 3, 1, 0,7 y 0,5
mg/ml
Cada solución diluida se filtró por 0,1 micras,
justo antes de proceder a la nanofiltración por cartucho de 35 nm
de poro (BMM-Planova 35N, de
Asahi-Kasei) y 10 cm^{2} de área, Las condiciones
de presión fueron las recomendadas por el fabricante:
0,2-1,0 bar; y la temperatura de
25-30ºC, en todas las filtraciones.
Los resultados de filtrabilidad y recuperación
obtenidos se muestran en la tabla 1.
De los anteriores valores se deduce que la
nanofiltración por 35 nm sólo es factible si la concentración de
fibrinógeno es francamente diluida, preferentemente entre 1 y 0,5
mg/ml o inferior, alcanzándose valores aceptables de capacidad de
filtración (g de fibrinógeno/m^{2}) y recuperación (>50% de
fibrinógeno) dentro de este rango.
Obviamente, uno de los principales
inconvenientes de nanofiltrar en condiciones muy diluidas reside en
el excesivo volumen a filtrar y en la posterior concentración final
del producto antes de dosificar, por lo que el óptimo se situará en
el valor superior del rango establecido.
Incluso en las mejores condiciones de proceso se
pone de manifiesto que el producto es nanofiltrable por 35 nm con
dificultad, si se procede como se ha descrito, descongelando el
producto y solubilizando totalmente el fibrinógeno a 30ºC.
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Se procesó otro lote como se describe en el
ejemplo 1 hasta obtener el precipitado III de glicina solubilizado
y clarificado, una parte del cual se congeló a -70ºC para su
conservación. El resto de la solución se procesó como se indica en
el ejemplo 1 hasta producto final filtrado por 0,2 micras.
Se realizó una prueba comparativa de
nanofiltración por 20 nm (Ultipor-DV20, de Pall) con
discos de 47 mm de diámetro, utilizando material fresco (producto
final filtrado por 0,2 micras sin congelar) y el correspondiente
congelado, ambos a la concentración de 0,73-0,74
mg/ml de fibrinógeno, siendo la presión aplicada la recomendada por
el fabricante de los filtros (Pall) de 2,2-2,8
bar.
En el caso del material congelado, se procedió
previamente a la descongelación total a temperatura ambiente (Tª de
la solución < 20ºC) y se clarificó por 0,5 micras. En ambos
casos, tanto el material fresco como el congelado, se diluyeron
convenientemente con solución de arginina al 2% (p/v), cloruro
sódico 62,6 mM y citrato sódico 2,7 mM, pH 7,0 y a 30ºC, y se
filtraron por 0,1 micras justo antes de nanofiltrar en escalón por
50 nm (DV50) y 20 nm (DV20) a la temperatura de unos 30ºC.
Los resultados de ambos procesos se resumen en
la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La prueba con material fresco (sin congelar) se
obtuvo una recuperación del 99,4% de proteína, sin embargo la
cantidad máxima filtrable hasta el bloqueo del filtro DV20 fue solo
de 23,7 g de fibrinógeno/m^{2}, y el caudal medio de 4,74 g de
fibrinógeno/m^{2}/hora (23,7 dividido por 5,00).
En cambio, con el material congelado la
recuperación fue del 99,7% de proteína y el filtro DV20 no se
bloqueó al aplicar una carga de 30,1 g de fibrinógeno/m^{2},
siendo el caudal medio de 21,20 g de fibrinógeno/m^{2}/hora. Se
observa claramente que con la etapa de congelación descongelación
controlada es posible la nanofiltración de mas de 30,1 g de
proteína, ya que en esta prueba no se detecta disminución anormal
del caudal de filtrado, lo cual indicaría la ausencia de bloqueo del
filtro.
El efecto de congelación/descongelación, ha
quedado reflejado en la nanofiltración final por 20 nm, tanto con
respecto a la cantidad máxima de fibrinógeno filtrable, que podría
ser mucho mayor que 30,1 frente a 23,7 g/m^{2}, como por el
caudal de filtración, de 21,20 frente a 4,74 g de
fibrinógeno/m^{2}/hora, resultando 4,5 veces más alto.
Obviamente, la superficie de nanofiltración por 20 nm puede ser
reducida en la misma proporción, lo cual permite optimizar los
elevados costes de nanofiltración que imposibilitarían en la
práctica su introducción industrial para este tipo de proteínas de
elevado peso molecular.
Como consecuencia del anterior ejemplo 3, se
buscaron las condiciones óptimas para llevar a cabo la
descongelación del producto, con el fin de eliminar la mayor parte
del material insoluble o insolubilizable, formado principalmente
por agregados, y minimizar las pérdidas de fibrinógeno
monodisperso.
Diferentes lotes procesados como en el ejemplo 1
hasta la solución congelada a -70ºC, se descongelaron en
condiciones (temperatura y tiempo de fusión) controladas. Una vez
descongelado el material se procedió a separar el material
insoluble. La separación de dicho material se efectuó por malla de
nylon de 20 micras de poro y a la misma temperatura que se
descongeló el material congelado. Una vez separado el material
insoluble se calentó la solución a 30ºC y se filtró por 0,45 micras
(filtro CHVL de Millipore).
Se determinaron tanto el peso de material
insoluble separado como la concentración de proteína (aproximada por
densidad óptica a 280 nm) de la solución.
Los valores obtenidos se reflejan en la tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los anteriores resultados ponen claramente de
manifiesto que la cantidad de residuo insoluble formado esta
relacionado con la temperatura de descongelación, correspondiéndose
con el descenso de concentración de proteína (densidad óptica) del
filtrado respecto a la solución inicial antes de congelar. Asimismo,
la temperatura de fusión alrededor de 10ºC resulta adecuada para
recuperar suficiente proteína y eliminar el material insoluble.
Entre 9 y 19ºC se separan de 0,5 a 1,0 kg de material insoluble y se
recupera del 83% al 87% de proteína. Es destacable que apenas se
obtiene precipitado a 30,5ºC (0,1 kg) y no se detecta una
disminución relevante de la proteína presente.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de las diferentes condiciones de
descongelación del ejemplo 4 sobre la filtrabilidad del producto
durante la nanofiltración se refleja en la tabla 4.
Los lotes procesados, descongelados y filtrados
como se indica en el ejemplo 4, se diluyeron hasta una densidad
óptica (280 nm) de 1,2-1,3 UA (0,8 mg/ml de
fibrinógeno aproximadamente) con una solución de arginina al 2%
(p/v) que contenía cloruro y citrato sódicos, a pH 7,0 y a 30ºC de
temperatura. Se nanofiltraron en doble etapa, por 0,1 micra (CVVL
de 30'') y 50 nm (DV50, 2 x 30''), y luego por 20 nm (DV20, 3 x
30''), a una presión de 2,2-2,8 bar en cada
etapa.
\newpage
En cada proceso se determinó la capacidad de
filtración (g de fibrinógeno/m^{2}, filtrados), el volumen
enfrentado, la recuperación de fibrinógeno (por densidad óptica a
280 nm) y el tiempo de filtración. Los resultados se muestran en la
tabla 4.
De los valores obtenidos se desprende que es
posible nanofiltrar el fibrinógeno por 20 nm a escala industrial.
Asimismo, los tiempos de filtración (o mejor los caudales) pueden
correlacionarse con la temperatura de descongelación del material
de partida del ejemplo 4, concluyéndose que, en la práctica,
temperaturas inferiores a 20ºC, preferentemente entre 7 y 19ºC,
serían las más convenientes para permitir la nanofiltración por 20
nm con una capacidad de producción y tiempo de proceso razonables,
y sin excesivas mermas de producto por pérdidas durante la
descongelación.
Se observa por lo tanto, que mediante la
aplicación de la presente invención resulta posible efectuar la
purificación de soluciones de fibrinógeno plasmático por
nanofiltración, mediante filtros de un tamaño de poro nominal
inferior a 35 nm en condiciones que posibilitan su aplicación
industrial a la producción de fibrinógeno purificado como producto
terapéutico.
Claims (15)
1. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, partiendo de
una solución de fibrinógeno procedente de plasma humano previamente
purificado, con una pureza igual o superior al 80% de fibrinógeno
con respecto al total de proteínas, caracterizado por
proceder a la estabilización y congelación de la solución y
posterior descongelación de la misma a una temperatura comprendida
entre 5 y 20ºC, procediendo después a la separación de los
materiales insolubilizados y a la dilución de la proteína y
nanofiltración de la solución resultante con filtros hasta un tamaño
de poro inferior a 35 nm.
2. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la congelación,
descongelación y nanofiltración se realiza en presencia de al menos
un aminoácido.
3. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 2, caracterizado porque el aminoácido es
arginina o glicina o combinaciones de ambos.
4. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la separación del
material insolubilizado después de la congelación y descongelación
se realiza por una malla.
5. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la separación del
material insolubilizado después de la congelación y descongelación
se realiza por decantación.
6. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la separación del
material insolubilizado después de la congelación y descongelación
se realiza por centrifugación.
7. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la separación del
material insolubilizado después de la congelación y descongelación
se realiza por filtración directa o por gradiente de filtros.
8. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
separación del material insolubilizado después de la congelación y
descongelación se realiza por combinación de las técnicas de las
reivindicaciones 4 a 7.
9. Procedimiento para la eliminación de virus en
soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la solución resultante
de la separación del material insolubilizado es diluida a una
concentración inferior o igual a 1,5 mg/ml de fibrinógeno.
10. Procedimiento para la eliminación de virus
en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la solución es
ajustada a una temperatura comprendida entre 18 y 37ºC antes de la
nanofiltración.
11. Procedimiento para la eliminación de virus
en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado por proceder a una
prefiltración de la solución de fibrinógeno por filtros de tamaño
de poro superior o igual a 35 nm antes de la nanofiltración por
filtros de poro inferior a 35 nm.
12. Procedimiento para la eliminación de virus
en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la superficie
filtrante necesaria para la nanofiltración por filtros de poro
inferior a 35 nm está comprendida entre 10 y 1000 cm^{2} por litro
de solución a filtrar.
13. Procedimiento para la eliminación de virus
en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de
descongelación está comprendida entre 8 y 13ºC.
14. Procedimiento para la eliminación de virus
en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 3, caracterizado porque la concentración del
aminoácido es superior a 0,1%.
15. Procedimiento para la eliminación de virus
en soluciones de fibrinógeno de aplicación terapéutica, según la
reivindicación 14, caracterizado porque la concentración de
aminoácido está comprendida entre 0,1 y 8%.
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