ES2313565T3 - Ensayos quinasa y fosfatasa basados en fret. - Google Patents
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Abstract
Un método para la determinación de la actividad quinasa o fosfatasa que comprende la interacción de una pareja de unión, una molécula de detección y una molécula sustrato, en el que dicha molécula de detección está marcada con un donador o aceptor de energía y dicha molécula sustrato está marcada con un donador de energía, si la molécula de detección está marcada con un aceptor de energía, o con un aceptor de energía, si la molécula de detección está marcada con un donador de energía, en el que dicha pareja de unión sólo se une a la molécula sustrato fosforilada y a la molécula de detección, cuyo método comprende los pasos de: a) fosforilar dicha molécula sustrato con una quinasa o defosforilar una molécula sustrato fosforilada con una fosfatasa; y b) hacer interaccionar la molécula sustrato obtenida en el paso a) con dicha pareja de unión y dicha molécula de detección; y c) determinar la actividad quinasa o fosfatasa mediante la medida de la transferencia de energía desde el donador de energía al aceptor de energía de dicha molécula sustrato y dicha molécula de detección unida a dicha pareja de unión.
Description
Ensayos quinasa y fosfatasa basados en FRET.
La presente invención está relacionada con un
método para determinar la actividad quinasa o fosfatasa que
comprende la interacción de una pareja de unión, una molécula de
detección y una molécula sustrato.
La modificación fisiológica de las moléculas y
los ensamblajes supramoleculares tienen un papel importante en la
estructura y regulación de los sistemas biológicos. Estas
modificaciones pueden incluir fosforilación, ciclación,
glucosilación, acilación y/o sulfatación, entre otros, y las
moléculas modificadas pueden incluir polipéptidos, ácidos nucleicos
y/o lípidos, entre otros. La importancia de las modificaciones es
particularmente evidente en las rutas de señalización celular, en
las que las sustancias extracelulares e intracelulares relacionadas
por modificaciones con fosfato como la fosforilación y la ciclación,
influyen en la posición, naturaleza y actividad de las células.
Los compuestos que pueden interferir en la
fosforilación o defosforilación catalizadas por enzimas específicas,
o de sustratos específicos, son de interés ya que pueden interferir
con los eventos de señalización específicos y así ser útiles en el
tratamiento o prevención de enfermedades que aparecen por la
desregulación de dichas rutas.
Por lo tanto, es de interés desarrollar métodos
para la determinación de la actividad quinasa o fosfatasa en la
búsqueda de compuestos que pueden modular rutas de señalización
específicas.
La PE1156329 describe un método para determinar
la actividad quinasa basado en un sistema de dos partes: la pareja
de unión (PU) y la molécula sustrato que se convierte A -> A*. En
general, la pareja de unión es una entidad que se une al producto
enzimático y puede unirse por sí mismo a una fase sólida, por
ejemplo una cuenta, mediante cualquier tipo de interacción,
covalente o no covalente. Para la detección, se une a A o a la PU
un marcaje (fluoróforo, luminóforo, aceptor o bloqueador). La lista
de métodos de detección incluye la medida de la intensidad, la
polarización y transferencia de energía.
La patente WO 00/75167 describe un método para
la detección de la adición o eliminación de un grupo sustrato de un
sustrato, que también está basado en un sistema de dos partes, la
pareja de unión, que es preferiblemente una macromolécula que
contiene atrapados iones metálicos, y un péptido A, en el que la
conversión del péptido fosforilado a no fosforilado o viceversa se
mide, por ejemplo, mediante FRET.
Un inconveniente de los sistemas de dos partes
es que para una transferencia de energía óptima, con una determinada
proporción de PU y A*, es necesaria una cierta proporción de
donador y aceptor. Así, para una generación óptima de FRET, es
necesario titular la PU, A y A*.
No obstante, las proporciones óptimas entre PU,
A y A* generalmente están influenciadas por un lado por la
capacidad de unión de la PU a A* y las respectivas constantes de
unión, y por otro lado también por los parámetros cinéticos de la
reacción enzimática por la diana de interés. Por lo tanto, la
proporción fijada de PU, A y A* que es necesaria para la
optimización de FRET en un sistema de dos partes lleva a un
compromiso entre la señal y calidad del ensayo, y la cinética
enzimática y significado biológico de los resultados, es decir en
el peor de los casos en un sistema de dos partes será imposible
lograr el punto óptimo para todos los componentes: reacción
enzimática para una cinética óptima, PU y A* para una unión óptima
del producto convertido y aceptor-donador para una
FRET óptima.
Una realización del sistema de dos partes
descrita en la patente PE 1156329 y WO 00/75167 comprende unas
cuentas de plástico que están impregnadas con luminóforo o aceptor,
y un recubrimiento de la superficie para unir la A* marcada. En
otras palabras, cuentas de IMAP^{TM} con un marcaje óptico en el
núcleo de las cuentas.
Para lograr una capacidad de unión suficiente,
las cuentas IMAP^{TM} normalmente tienen un diámetro de 100 nm o
superior. Esto es mucho, comparado con la distancia de transferencia
de energía de un par típico donador-aceptor que es
desde 3 hasta un máximo de 9 nm. En consecuencia, la transferencia
de energía entre una cuenta impregnada y un péptido unido es
bastante ineficiente, muchos de los luminóforos del interior de la
cuenta no ven una pareja de FRET pero aún así contribuyen a la
señal de fondo del ensayo. Esto conduce a un rango dinámico reducido
y un descenso de la sensibilidad.
Por lo tanto, el objetivo de la presente
invención es desarrollar un método más eficiente para determinar la
actividad quinasa o fosfatasa mediante la medida de la transferencia
de energía entre un donador de energía y un aceptor de energía.
El ensayo de la presente invención consiste en
tres partes: (i) una "pareja de unión", (ii) una molécula de
detección que está marcada con el donador o aceptor de una pareja de
FRET, (iii) una molécula sustrato (una molécula pequeña, péptido o
proteína) que es convertida por la enzima, así un aminoácido (Ser,
Thr, Tyr) se fosforila si el enzima es una quinasa de proteínas. Se
puede utilizar el mismo esquema para las fosfatasas de proteínas en
la que se defosforilan los respectivos aminoácidos. Así, la presente
invención proporciona un método para determinar la actividad
quinasa o fosfatasa que comprende la interacción de una pareja de
unión, una molécula de detección y un sustrato peptídico, en el que
dicha molécula de detección está marcada con un donador o aceptor
de energía y dicha molécula sustrato está marcada con un donador de
energía, si la molécula de detección está marcada con un aceptor de
energía, o con un aceptor de energía, si la molécula de detección
está marcada con un donador energía, en la que dicha pareja de unión
solo se une a una molécula sustrato fosforilada y a la molécula de
detección, cuyo método comprende los pasos de: a) fosforilar dicha
molécula sustrato con una quinasa o defosforilar una molécula
sustrato fosforilada con una fosfatasa; y b) hacer interaccionar la
molécula sustrato obtenida en el paso a) con dicha pareja de unión y
dicha molécula de detección; y c) determinar la actividad quinasa o
fosfatasa mediante la medida de la transferencia de energía desde el
donador de energía al aceptor de energía de dicha molécula sustrato
y dicha molécula de marcaje unida a dicha pareja de unión.
Preferiblemente, la pareja de unión son iones metálicos que están
preferiblemente asociados a una fase sólida, por ejemplo, una
cuenta, membrana o un soporte de muestras. En una realización
preferible, dicha pareja de unión son iones metálicos en cuentas
IMAP^{TM}. Las cuentas IMAP^{TM} pueden obtenerse en Molecular
Devices Corp. Se ha descrito que las cuentas IMAP^{TM} pueden
utilizarse como plataforma de unión para acercar dos fluoróforos lo
suficiente para que ocurra una transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET), siendo así un sistema de detec
ción universal para los ensayos quinasa y fosfatasa.
En otra realización preferible, la molécula
sustrato es una proteína o un péptido.
Tal como se utiliza aquí, "pareja de unión"
se refiere a una entidad que se une al producto enzimático y puede
unirse por sí misma a una fase sólida, por ejemplo una cuenta,
mediante cualquier tipo de interacción, covalente o no
covalente.
Tal como se utiliza aquí, "molécula de
detección" se refiere a una molécula que es portadora de un
marcaje, por ejemplo un marcaje fluorescente, que permite la
detección de la molécula de detección, y que se une a la pareja de
unión.
Tal como se utiliza aquí, "molécula
sustrato" se refiere a una molécula pequeña, péptido o proteína
que es convertida por una enzima mediante una reacción
enzimática.
Tal como se utiliza aquí, "donador de
energía" se refiere a un marcaje fluorescente que, tras la
excitación, puede transferir su energía al aceptor de energía.
Tal como se utiliza aquí, "aceptor de
energía" se refiere a una molécula que puede recibir energía del
donador de energía.
Tal como se utiliza aquí, "actividad
quinasa" se refiere a la fosforilación de un sustrato por una
enzima (quinasa).
Tal como se utiliza aquí, "actividad
fosfatasa" se refiere a la defosforilación de un sustrato por una
enzima (fosfatasa)
Tal como se utiliza aquí, "molécula sustrato
fosforilada" se refiere a una molécula pequeña, péptido o
proteína que ha sido fosforilada por un enzima (quinasa).
Tal como se utiliza aquí, "vida media de la
emisión" se refiere a la media de tiempo en el que un fluoróforo
permanece en estado de excitación tras la excitación.
En comparación con una lectura de la
polarización de fluorescencia, un sistema con lectura
TR-FRET ofrece las siguientes ventajas:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el sistema de tres partes utilizado en
el método de la presente invención presenta las siguientes ventajas
respecto al sistema de dos partes anterior, incluso si este último
se ha optimizado mediante (TR)-FRET:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, se utiliza un
luminóforo de Ru como donador de energía. En comparación con los
quelatos y criptatos de lantánidos (Eu, Tb, Sm), el luminóforo de Ru
presenta varias ventajas generales
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Una ventaja particular la proporciona el tiempo
medio de microsegundos del estado excitado y la emisión resultante.
El tiempo medio de emisión típico del complejo
Ru(batho)2bpy bajo las condiciones de ensayo es de
2-3 \mus. Este tiempo medio de microsegundos
permite una eficiente supresión de la fluorescencia de ruido de
fondo de otros ingredientes y compuestos fluorescentes del ensayo.
No obstante, el tiempo de emisión de fotones es 100 veces más
rápida que la de los lantánidos, es decir, el detector integra 100
veces menos de señal de fondo elec-
trónica.
trónica.
En una realización de la presente invención, el
método se realiza con un sistema en que la muestra se mueve con
respecto a la vía de detección óptica. Preferiblemente, dicho
sistema es un sistema de material de laboratorio para centrífuga,
más preferiblemente un sistema Lab CD de Tecan o el sistema de
SpinX. En otra realización preferible, dicho sistema es un sistema
de microfluídica o una celda de flujo continuo. En dicho esquema,
la emisión de los lantánidos es demasiado lenta para permitir una
lectura durante el movimiento de la muestra. Para poder utilizar la
lectura de TR-FRET, el material de laboratorio/
disco o el flujo de la muestra, respectivamente, tendrían que pasar
por ciclos de inicio-parada, lo que es prácticamente
imposible y costoso en tiempo. Alternativamente se podría modificar
el instrumento para tener una vía de excitación/ detección diferente
en la que las posiciones de las vías tendrían que ajustarse según
el tiempo de lectura.
El "TR-FRET rápido" con
complejos de Ru y tiempos medios cortos de microsegundos, permite la
lectura en línea mientras la muestra se mueve sin grandes
modificaciones y ofrece una ventaja especial. La tecnología
IMAP^{TM} es un ensayo universal para las quinasas y por lo tanto
de uso preferente. La lectura de PF, no obstante, posee las
desventajas mencionadas anteriormente. El TR-FRET
con lantánidos no puede utilizarse fácilmente en dicho esquema.
En una realización preferible, el aceptor de
energía es un fluoróforo que presenta un solapamiento espectral con
los complejos de Ru, lo que proporciona un R_{0} (Radio Förster)
de al menos 10 \ring{A}, preferiblemente de al menos 20
\ring{A} y más preferiblemente de al menos 50 \ring{A}. La
relación entre el R_{0} y el solapamiento espectral
J(\lambda) viene definida por la siguiente fórmula (de:
Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2ª Ed.,
Kluwer Academin/Plenum Publishers, pág. 369):
\vskip1.000000\baselineskip
(en \ring{A})
\newpage
en la que
En una realización preferible, el aceptor de
energía es Alexa Flúor 700, Atto 700, Dy 701 o Alexa Flúor 750. En
una realización más preferible, dicho aceptor de energía es Alexa
Flúor 700.
En una realización más preferible, el luminóforo
de Ru es Ru(batho)2bpy.
En la presente invención pueden utilizarse pares
de marcaje adicionales para las medidas de transferencia de energía
por resonancia de la fluorescencia entre los complejos de Ru y los
fluoróforos, que se describen en la WO 02/41001. La dilución de la
pareja de unión es de al menos 500 veces, preferiblemente de al
menos 1000 veces o entre 400 veces o 1000 veces y 10.000 veces, en
el que la dilución está entre 2000 veces y 10.000 veces o entre
2000 veces y 8000 veces.
En la siguiente sección se discute una
realización no limitante descrita en los ejemplos:
Como sistema de prueba, se marcó un péptido
sustrato fosforilado y no fosforilado con Alexa Flúor 700 como
aceptor de energía y se marcó un péptido sustrato fosforilado con
Ru(batho)2bpy como donador de energía. El péptido
sustrato de la quinasa marcado con Alexa es fosforilado por la
enzima. Para la detección, se añaden a la mezcla de reacción un
péptido de detección fosforilado Ru(batho)2bpy y
cuentas IMAP^{TM}. Tanto el sustrato fosforilado como los
péptidos de detección se unen a las cuentas, de forma que se sitúan
a una proximidad tal que pueda darse una transferencia de energía
por resonancia de la fluorescencia (FRET) (Figura 1).
Como par de FRET, se utilizó como donador de
energía el complejo ligando metálico Ru(batho)2bpy de
tiempo medio largo (\tau = 3 \mus) y Alexa Flúor 700 como
aceptor de energía. La unión del péptido marcado con Ru a las
cuentas IMAP^{TM} no influye en las medidas de polarización de la
fluorescencia con Alexa Flúor 700 como fluoróforo. En una
comparación de ambas técnicas de lectura (PF y FRET) se ha
demostrado que la FRET es un método más sensible. Sólo un 10% de la
fosforilación proporciona un factor z' por encima de 0,5. Además,
para las medidas de FRET son necesarias diez veces menos cuentas
IMAP^{TM} como mínimo comparado con las de PF. Así, se logra una
reducción significativa del gasto de reactivos sin necesidad de una
manipulación de líquidos y lectura miniaturizados que normalmente
se realiza para ahorrar reactivos caros y que complican la
realización del ensayo, lo que por lo tanto puede resultar en un
procesado inestable y poco reproducible.
En resumen, el ensayo IMAP^{TM} quinasa TR
FRET rápida descrito aquí es robusto, sensible, necesita menos
cuentas IMAP^{TM} y presenta una baja fluorescencia de ruido de
fondo debido a la detección en una ventana de tiempo.
Como se conoce por los experimentos de PF, la
señal se ve afectada por el ATP, debido a que los sitios de unión
libres de las cuentas son ocupados por el ATP lo que evita la unión
del péptido fosforilado. Al contrario que el ATP, el EDTA no tiene
efecto sobre la señal de FRET. El efecto del ATP puede obviarse tras
la titulación de los componentes del ensayo del sistema de tres
partes descrito hasta aquí.
En principio ambos fluoróforos pueden utilizarse
como marcajes para el sustrato. Las ventajas del complejo de Ru
como marcaje del sustrato son la elevada estabilidad química y su
disponibilidad como éster de NHS y maleimida (comparado con Alexa
Flúor 700), lo que potencia la flexibilidad del proceso de
marcaje.
Una alternativa al Alexa Flúor 700 puede ser
Atto 700 que tiene espectros de excitación y emisión comparables y
está disponible como éster de NHS y maleimida. Debido a su menor
coeficiente de absorción (\varepsilon = 120000
M-1 cm-1), R_{0} se reduce en
\sim5 \ring{A} para el par de FRET Ru-Atto 700
comparado con Ru-Alexa Flúor 700 (\varepsilon =
192000 M-1 cm-1, R_{0} = 62
\ring{A}). Pueden utilizarse fosfotirosina, otros aminoácidos
fosforilados u otras moléculas pequeñas con un grupo fosfato, que
estén marcadas con el complejo Ru (o alternativamente Alexa Flúor
700 o Atto 700) como molécula de detección "universal".
Figura 1: Esquema de la reacción quinasa
utilizando cuentas IMAP^{TM} para la lectura de TR FRET
rápida.
Figura 2: Señal de FRET observada (negro) con
péptido Alexa fosforilado 15 nM y con péptido Ru fosforilado 100 nM
y 300 nM respectivamente, dilución de IMAP^{TM}: 1:800. Gris:
péptido Alexa 15 nM y péptido Ru fosforilado y cuentas IMAP^{TM},
blanco: péptido Ru fosforilado y cuentas IMAP^{TM}. Las cuentas se
incubaron a TA durante 30 minutos. Lectura: 730 (30) nm, retraso
100 ns, ventana 100 ns, tiempo de exposición 4 s. La parte (a) a la
izquierda muestra los datos crudos, la parte (b) a la derecha
muestra la señal de FRET efectiva.
Figura 3: Datos crudos del péptido Ru
fosforilado 20 nM y el péptido Alexa fosforilado 100 nM (dilución de
IMAP^{TM} 1:4000) (blanco) y péptido Alexa fosforilado 15 nM y
Fos-PDHK-Ru 100 nM (dilución de
IMAP^{TM} 1:800) (negro). Lectura: 730 (30) nm, retraso 100 ns,
ventana 100 ns, tiempo de exposición 10 s (blanco) y 4 s
(negro).
Figura 4: Señal de FRET con diferentes
diluciones de IMAP^{TM} utilizando péptido Alexa fosforilado 20 nM
y péptido Ru fosforilado 100 nM, incubación 60 minutos, lectura:
730 (30) nm, retraso 100 ns, ventana 100 ns, tiempo de exposición 5
s.
Figura 5: Influencia del ATP sobre la señal de
FRET. Péptido Alexa fosforilado 20 nM, péptido Ru fosforilado 100
nM, incubación 60 minutos a TA, lectura: 730 (39) nm, retraso 100
ns, ventana 100 ns, tiempo de exposición 8 s.
Figura 6: Influencia del EDTA sobre la señal de
FRET. Péptido Alexa fosforilado 20 nM, péptido Ru fosforilado 100
nM, incubación 60 minutos a TA, lectura: 730 (30) nm, retraso 100
ns, ventana 100 ns, tiempo de exposición 8s.
Figura 7: Simulación de un ensayo quinasa con
péptido Alexa (fosforilado) 20 nM y péptido Ru fosforilado 100 nM,
dilución de IMAP^{TM} 1:400 ((a) y (b)) y 1:4000 ((c) y (d)).
Incubación de 60 minutos a TA. Lectura: FRET: 730 (30) nm, retraso
100 ns, ventana 100 ns, tiempo de exposición 10 s, PF: excitación
655 (50) nm, emisión 710 (40) nm.
Figura 8: Cinética del ensayo quinasa. Lectura:
730 (30) nm, retraso 100 ns, ventana 100 ns, tiempo de exposición 7
s.
Figura 9: Curva de dosis respuesta para el ATP,
utilizando péptido Alexa 1 \muM en la reacción quinasa. Las
concentraciones finales en la lectura fueron: péptido Alexa
(fosforilado) 20 nM, péptido Ru fosforilado 100 nM, cuentas
IMAP^{TM} diluidas 1:4000. Lectura: 730 (30) nm, retraso 100 ns,
ventana 100 ns, tiempo de exposición 10 s.
Ejemplo
1
Materiales:
\bullet Péptido sustrato (YHGHSMSAPGVSTAC) de
Biosyntan marcado con Alexa Flúor 700
\bullet Péptido sustrato fosforilado
(YHGHS(H_{2}PO_{4})MSAPGVSTAC) de Biosyntan
marcado con Alexa Flúor 700 y Ru(batho)2bpy
\bullet Enzima quinasa: PDHK2 (piruvato
deshidrogenasa quinasa 2 recombinante, expresada de acuerdo con los
métodos estándar)
\bullet Cuentas IMAP^{TM} de Molecular
Devices (Equipo IMAP^{TM} Explorer (IPP) Producto Nº R8062)
\bullet Tampón: Tampón de unión IMAP^{TM}
diluido 1:5 con H_{2}O dest. + BSA al 0,05%.
\vskip1.000000\baselineskip
Instrumentación:
\bullet Lector Zeiss plate::vision
\bullet Placa: Costar 384,
UV-NBS
\bullet Longitud de onda de excitación: 355
nm
\bullet Filtro de emisión: 730 (30) nm, 615
(10) nm.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer experimento, las cuentas
IMAP^{TM} diluidas 1:800 (dilución recomendada para las medidas de
PF 1:400) se añadieron a una mezcla de péptido sustrato fosforilado
o no fosforilado 15 nM (concentración final) marcado con Alexa
Flúor 700 (en adelante péptido Alexa (fosforilado)) y péptido
sustrato fosforilado 100 nM y 300 nM (concentraciones finales)
marcado con Ru(batho)2bpy (en adelante péptido Ru
fosforilado), respectivamente. La mezcla de reacción entonces se
diluyó 50 veces para la lectura con las cuentas IMAP^{TM} y
péptido Ru fosforilado. La Figura 2a muestra los datos crudos de
esta medida. Sólo la señal de FRET (negro) estaba por encima de la
señal de ruido de fondo del complejo Ru solo (blanco). No se observó
FRET debido a unión inespecífica del péptido Alexa no fosforilado a
las cuentas (gris). La señal de FRET con corrección del ruido de
fondo (Figura 2b) aumentó al aumentar la concentración de péptido Ru
fosforilado, lo que indica que con péptido Ru fosforilado 100 nM y
péptido Alexa fosforilado 15 nM las cuentas IMAP^{TM} no estaban
saturadas.
Ejemplo
2
El experimento se realizó también utilizando
péptido Ru fosforilado 20 nM y péptido Alexa fosforilado 100 nM con
cuentas IMAP^{TM} diluidas 1:4000. La Figura 3 compara los datos
crudos del experimento utilizando el péptido Ru (blanco) o el
péptido Alexa (negro) como sustrato. Como se utilizaron diferentes
parámetros de medida para los dos experimentos, sólo pudo
compararse directamente la proporción de la señal FRET con el fondo
de Ru. Mientras la señal de FRET era del doble que el ruido de fondo
de Ru cuando se utilizaba el sustrato Alexa, esta proporción
aumentaba hasta seis veces cuando se utilizaba el sustrato marcado
con Ru. En ambos experimentos, el Alexa Flúor 700 no contribuye al
ruido de fondo debido a la detección a tiempo controlado de la
señal de FRET (retraso
de 100 ns).
de 100 ns).
Ejemplo
3
Para determinar las condiciones óptimas para la
lectura se analizaron diferentes diluciones de IMAP^{TM} con
péptido Alexa fosforilado 20 nM y péptido Ru fosforilado 100 nM
(Figura 4). La señal de FRET aumentó en un factor de tres al diluir
las cuentas IMAP^{TM} 1:2000 comparado con una dilución 1:400. Con
una mayor dilución la señal decrece de nuevo alcanzando
aproximadamente la misma señal con 1:400 que con 1:10.000. Como se
ha mencionado anteriormente, con una dilución 1:400 las cuentas
IMAP^{TM} no estaban saturadas. Una mayor dilución dio lugar a
más péptido Ru fosforilado por cuenta IMAP^{TM} y resultó en un
aumento de la señal de FRET. Con una dilución superior a 1:2000 el
número de péptido Ru fosforilado por cuenta IMAP^{TM} se redujo
de nuevo.
Ejemplo
4
Los experimentos de PF mostraron que la adición
de ATP reduce la ventana de polarización ya que el ATP se une a las
cuentas, evitando así que el sustrato fosforilado de la quinasa se
una. Por lo tanto, se esperaba que el ATP también influenciara la
señal de FRET. La reacción quinasa se realizó normalmente con ATP
100 \muM y sustrato 1 \muM. Antes de añadir las cuentas
IMAP^{TM} para la lectura de FRET, la mezcla de reacción se
diluyó 50 veces llevando la concentración final de ATP a 2 \muM.
La Figura 5 muestra la disminución de la señal de FRET al aumentar
la concentración de ATP. La señal de FRET se redujo a la mitad con
ATP 2 \muM.
La Figura 6 muestra que la señal de FRET no se
ve influenciada por la adición de EDTA, que se utilizó para detener
la reacción quinasa. El EDTA no tiene efecto sobre la unión del
sustrato fosforilado a la cuenta IMAP^{TM}, ni tampoco afecta al
complejo de Rutenio en modo alguno. Las concentraciones de EDTA
analizadas (hasta 64 \muM) tampoco tuvieron una influencia
mesurable sobre las cuentas IMAP^{TM}. Concentraciones mayores
pueden acomplejarse con el M^{3+} sobre las cuentas e influenciar
así la unión del péptido fosforilado.
Ejemplo
5
Para analizar la sensibilidad del ensayo
IMAP^{TM} quinasa de TR-FRET rápida y compararla
con el ensayo establecido de PF IMAP^{TM} se realizó una
simulación del ensayo quinasa. El nivel de fosforilación del
péptido Alexa 20 nM se aumentó del 0% al 100% mediante la mezcla de
péptido Alexa no fosforilado y fosforilado. Se utilizaron dos
diluciones de IMAP, concretamente 1:400, que es la dilución
recomendada para las medidas de PF y 1:4000, que todavía muestra
una buena señal de FRET con péptido Alexa fosforilado al 100%
(Figura 4). La señal de FRET aumentó al aumentar la fosforilación
en ambas diluciones de IMAP^{TM} (Figura 7 (a) y (c)). Como se
esperaba, la señal de FRET era más intensa para la dilución 1:4000
comparado con la dilución 1:400, con factores z' (rombos sin
relleno) superiores a 0,5 con una fosforilación del 10% al 100%.
Para las medidas de PF, la ventana de detección con una dilución de
IMAP^{TM} de 1:400 era de 200 mP y resultó en factores z' de 0.5
o mejores del 20% al 100% de fosforilación (Figura 7 (b)). Una
dilución de las cuentas IMAP^{TM} de 1:4000 redujo drásticamente
la ventana hasta 70 mP (Figura 7 (d)) y redujo la sensibilidad del
experimento de PF.
Ejemplo
6
Se diluyó 1 \mul de enzima PDHK2 en 11 \mul
de tampón quinasa (Hepes 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 18,7
mM, NH_{4}Ac 0,4 mM, Triton X-100 al 0,025%, DTT
1,87 mM). Entonces se añadieron al enzima 3 \mul de una solución
5 \muM del péptido sustrato marcado con Alexa en tampón sustrato
(Hepes 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al
0,01%). Como control positivo la solución de sustrato contenía ATP
500 mM mientras que en el control negativo no estaba presente el
ATP en la reacción. Esto resultó en concentraciones finales en la
reacción de sustrato 1 \muM y ATP 100 \muM. Tras la incubación
durante 2, 3, 4 y 5 horas a 30ºC, la reacción se detuvo tomando 1
\mul de la mezcla de reacción y añadiendo 24 \mul de péptido Ru
fosforilado 200 nM y 25 \mul de cuentas IMAP en tampón de unión
IMAP, dando lugar a una concentración final de péptido Ru
fosforilado de 100 nM. Se utilizaron tres diluciones diferentes de
cuentas IMAP^{TM}, 1:2000, 1:4000 y 1:8000. Las cuentas se
incubaron durante 60 minutos a TA. Para la lectura, la concentración
final de sustrato fue péptido Alexa 20 nM (fosforilado) y con la
concentración final de ATP de 2 \muM la señal de FRET podía
detectarse fácilmente (Figura 5). La Figura 8 muestra la cinética de
la reacción quinasa de los controles positivo y negativo de las
tres diluciones IMAP (azul 1:2000, rojo 1:4000, verde 1:6000). La
señal de FRET observada fue suficientemente fuerte en las tres
diluciones.
Ejemplo
7
La curva de dosis respuesta al ATP (Figura 9)
muestra que el ATP utilizado en el ensayo (100 \muM) estaba muy
por encima de la CE_{50} de 3,6 \muM. Nótese que estas son las
concentraciones de la reacción quinasa, en la lectura éstas son 50
veces menores. El exceso de ATP evitó que pudiera encontrarse un
inhibidor competitivo del lugar de unión del ATP y aseguró una
máxima fosforilación sin inhibidor. La señal alcanzó su máximo con
ATP 32 \muM. Con concentraciones superiores de ATP la señal se
redujo de nuevo debido al ATP libre en la mezcla de lectura que se
une a las cuentas IMAP^{TM} y reduce así la capacidad de unión de
las cuentas IMAP^{TM}. Este problema de capacidad de unión de las
cuentas IMAP^{TM} es bien conocido y debe ajustarse en el ensayo
mediante una titulación adecuada de los reactivos del ensayo.
La reducción de la señal de FRET debida al
aumento de la concentración de ATP medida aquí (descenso en un
factor de 1,6 y 1,9 de la señal máxima (32 \muM, 0,64 \muM en la
lectura) a 128 \muM (2,56 \muM en la lectura) y 256 \muM
(5,12 \muM en la lectura) era muy comparable a la titulación de
ATP (Figura 5) que resultó en una reducción en un factor de 1,6 y
2,1 para esas concentraciones de ATP.
Claims (16)
1. Un método para la determinación de la
actividad quinasa o fosfatasa que comprende la interacción de una
pareja de unión, una molécula de detección y una molécula sustrato,
en el que dicha molécula de detección está marcada con un donador o
aceptor de energía y dicha molécula sustrato está marcada con un
donador de energía, si la molécula de detección está marcada con un
aceptor de energía, o con un aceptor de energía, si la molécula de
detección está marcada con un donador de energía, en el que dicha
pareja de unión sólo se une a la molécula sustrato fosforilada y a
la molécula de detección, cuyo método comprende los pasos de:
a) fosforilar dicha molécula sustrato con una
quinasa o defosforilar una molécula sustrato fosforilada con una
fosfatasa; y
b) hacer interaccionar la molécula sustrato
obtenida en el paso a) con dicha pareja de unión y dicha molécula
de detección; y
c) determinar la actividad quinasa o fosfatasa
mediante la medida de la transferencia de energía desde el donador
de energía al aceptor de energía de dicha molécula sustrato y dicha
molécula de detección unida a dicha pareja de unión.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha pareja de unión son iones metálicos sobre cuentas de
polarización de la fluorescencia basadas en la afinidad por los
iones metálicos (IMAP) inmovilizadas.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en
el que el donador de energía tiene una vida media de emisión
inferior a 50 microsegundos.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
dicha vida media de emisión es inferior 10 microsegundos.
5. El método de la reivindicación 3, en el que
dicha vida media de emisión es inferior 5 microsegundos.
6. El método de la reivindicación 3, en el que
dicha vida media de emisión es de 2 a 3 microsegundos.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 6, en el que el donador de energía es un
luminóforo de Ru.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 7, en el que el aceptor de energía es un
fluoróforo que muestra un solapamiento espectral con los complejos
de Ru que resulta en un R_{0} de al menos 10 \ring{A}.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
dicho aceptor de energía es Alexa Flúor 700, Atto 700, Dy701 o
Alexa Flúor 750.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
dicho aceptor de energía es es Alexa Flúor 700.
11. El método de las reivindicaciones de 7 a 10,
en el que dicho luminóforo de Ru es Ru(batho)2bpy.
12. El método de las reivindicaciones de 1 a 11,
en el que dicho método se realiza con un sistema en el que la
muestra se mueve respecto a la vía de detección óptica.
13. El método de las reivindicaciones de 1 a 12,
en el que dicho sistema es un sistema de material de laboratorio
para centrífuga.
14. El método de las reivindicaciones de 1 a 12,
en el que dicho sistema es un sistema de microfluídica o una celda
de flujo continuo.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 14, en el que la dilución de la pareja de
unión es de al menos 500 veces.
16. El método de la reivindicación 15, en el que
la dilución está entre 1000 y 10.000 veces.
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