ES2313748T3 - Polinucleotidos y su utilizacion para detectar resistencia a la estreptogramina a. - Google Patents
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Abstract
La presente invención pertenece a los polinucleótidos derivados de genes estafilocóccicos codificantes de resistencia a la estreptogramina A o a la estreptogramina B, y a compuestos químicamente relacionados. Esta invención se refiere también al uso de los polinucleótidos como cebadores o sondas oligonucleotídicos para detectar cepas estafilocóccicas que son resistentes a la estreptogramina A o a la estreptogramina B y a compuestos relacionados en una muestra biológica. En otra realización, la presente invención está dirigida a las secuencias codificantes completas de los genes estafilocóccicos codificantes de la resistencia a la estreptogramina A o a la estreptogramina B de Staphylococcus, y a los polipéptidos expresados por estas secuencias codificantes completas. Además, esta invención se refiere al uso de los polipéptidos expresados para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales específicos que sirven como medio de detección para caracterizar cualquier cepa estafilocóccica que lleve genes codificantes de la reistencia a la estreptogramina A o a la estreptogramina B.
Description
Polinucleótidos y su utilización para detectar
resistencia a la estreptogramina A.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos derivados de genes de estafilococos que codifican
para la resistencia a la estreptogramina A. La presente invención
se refiere asimismo a la utilización de los polinucleótidos como
sondas o cebadores de oligonucleótido para detectar cepas de
estafilococos que son resistentes a estreptogramina A en una muestra
biológica.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a las secuencias codificantes de longitud
completa de los genes de estafilococos que codifican para la
resistencia a la estreptogramina A de Staphylococcus y a los
polipéptidos expresados mediante estas secuencias de longitud
completa.
Además, la presente invención se refiere a la
utilización de los polipéptidos expresados para producir anticuerpos
monoclonales o policlonales específicos que sirven como medios de
detección con el fin de caracterizar cualquier cepa de
estafilococos que porte genes que codifican para la resistencia a la
estreptogramina A.
La presente invención se refiere asimismo a los
procedimientos de diagnóstico para detectar cepas específicas de
Staphylococcus que se espera que estén contenidas en una
muestra biológica. Los procedimientos de diagnóstico utilizan las
sondas y cebadores de oligonucleótido así como los anticuerpos de la
invención.
Las estreptograminas y compuestos relacionados
(antibióticos) producidos por estreptomicetos pueden clasificarse
como compuestos A y B según sus estructuras primarias básicas
(Cocito, 1979). Los compuestos del grupo A, incluyendo la
estreptogramina A (SgA), pristinamicina IIA (PIIA), virginiamicina
M, micamicina A o sinergistina A, son macrolactonas cíclicas
poliinsaturadas. Los compuestos del grupo B, que incluyen
estreptogramina B (SgB), pristinamicina B (PIB), virginiamicina S,
micamicina B y sinergistina B, son macrolactonas peptídicas
cíclicas (Cocito, 1979). Los compuestos de ambos grupos, A y B, se
unen a diferentes dianas en el dominio peptidiltransferasa de la
subunidad ribosómica 50S e inhiben la elongación de la proteína en
diferentes etapas (Aumercier et al., 1992; Di Giambattista
et al., 1989).
Se observa una disminución en la constante de
disociación de PIB en presencia de PIIA porque este último
antibiótico provoca una modificación conformacional del ribosoma
bacteriano en los sitios de unión de estas moléculas. Por tanto,
los compuestos A y B, que son bacteriostáticos cuando se utilizan
por separado, actúan de manera sinérgica cuando se combinan y se
convierten en bactericidas, principalmente contra bacterias Gram
positivas.
Se utilizan mezclas naturales tales como
pristinamicina (Pt), sinergistina, virginiamicina y mikamicina por
vía oral y por vía tópica. En la actualidad, se está sometiendo una
estreptogramina inyectable semisintética, RP59500, que consiste en
una mezcla de derivados de compuestos A y B (dalfopristina y
quinupristina, respectivamente), a ensayos clínicos y
experimentales in vivo (J. Antimicrob. Agents Chemother. 30
(supl. A), volumen completo, 1992; Entenza et al., 1995;
Fantin et al., 1995; Griswold et al., 1996; Torralba
et al., 1995). La resistencia de estafilococos a mezclas
sinérgicas de compuestos A y B (Pt MIC \geq 2 \mug/ml) está
siempre asociada con resistencia a compuestos A (PIIA MIC \geq 8
\mug/ml), pero no necesariamente con resistencia a compuestos B
(Allignet et al., 1996).
Hasta la fecha, se han aislado cuatro genes que
codifican para la resistencia a compuestos A a partir de plásmidos
de estafilococos y enterococos. Los genes vat (Allignet et
al., 1993), vatB (Allignet y El Solh, 1995) y
satA (Rende-Fournier et al., 1993)
codifican para acetiltransferasas relacionadas
(50,4-58,3% de aminoácidos), que inactivan a la
estreptogramina A y compuestos similares. El gen de estafilococos
vga (Allignet et al., 1992) codifica para una
proteína de unión a ATP implicada probablemente en la salida activa
de compuestos A. No obstante, continúa existiendo una necesidad en
la técnica de polinucleótidos específicos para la resistencia de
Staphylococcus a estreptogramina A y/o B y compuestos
relacionados.
Por consiguiente, la presente invención ayuda a
satisfacer esta necesidad de la técnica. En particular, la presente
invención proporciona un péptido purificado que comprende una
secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 4 que corresponde a la
secuencia de aminoácidos completa de Vga B. También se dan a conocer
en la descripción las siguientes secuencias:
- a)
- SEC ID nº: 5 que corresponde a la secuencia de aminoácidos completa de Vat C o fragmentos derivados de SEC ID nº: 5 que contienen por lo menos 10 aminoácidos;
- b)
- SEC ID nº: 6 que corresponde a la secuencia de aminoácidos completa de Vgb B o fragmentos derivados de SEC ID nº: 6 que contienen por lo menos 10 aminoácidos;
- c)
- SEC ID nº: 7 que corresponde a la secuencia de aminoácidos completa de Vgb B;
- d)
- SEC ID nº: 8 que corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos de Vga B;
- e)
- SEC ID nº: 9 que corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos de Vat C; y
- f)
- SEC ID nº: 10 que corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos de Vat C.
La presente invención proporciona además un
polinucleótido purificado que comprende la secuencia de nucleótidos
SEC ID nº: 1 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico
completa de vga B. También se dan a conocer los siguientes sistemas
en la presente descripción:
- a)
- SEC ID nº: 2 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico completa de vat C o fragmentos derivados de SEC ID nº: 2 que contienen de 15 a 40 nucleótidos;
- b)
- SEC ID nº: 3 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico completa de vgb B o fragmentos derivados de SEC ID nº: 3 que contienen de 15 a 40 nucleótidos;
- c)
- SEC ID nº: 11 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de SEC ID nº: 7;
- d)
- SEC ID nº: 12 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de SEC ID nº: 8;
- e)
- SEC ID nº: 13 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de SEC ID nº: 9; y
- f)
- SEC ID nº: 14 que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de SEC ID nº: 10.
Además, la presente invención incluye un péptido
purificado que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1.
La presente invención da a conocer asimismo una
composición que comprende secuencias de polinucleótido purificadas
que incluyen por lo menos una secuencia de nucleótidos seleccionada
de entre el grupo constituido por polinucleótidos, genes o ADNc de
vgaB, vatC y vgbB, que son útiles para la detección de
resistencia a la estreptogramina A y/o a estreptogramina B y
compuestos relacionados. La presente invención da a conocer además
una composición que comprende secuencias de aminoácidos purificadas
que incluyen por lo menos una secuencia de aminoácidos de un
polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado de entre
el grupo constituido por polinucleótidos, genes o ADNc de vgaB,
vatC y vgbB, que son útiles para la detección de
resistencia a la estreptogramina A y/o a estreptogramina B y
compuestos relacionados.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona una composición de secuencias de
polinucleótido que codifican para la resistencia a las
estreptograminas, o que inducen esta resistencia en bacterias Gram
positivas, comprendiendo la composición una combinación de por lo
menos dos de las siguientes secuencias de nucleótidos: a) una
secuencia de nucleótidos que codifica para una acetiltransferasa que
confiere resistencia a la estreptogramina A, b) una secuencia de
nucleótidos que codifica para una molécula que contiene motivos de
unión a ATP que confiere resistencia a la estreptogramina A; y c)
una secuencia de nucleótidos que codifica para una lactonasa que
confiere resistencia a la estreptogramina B, en la que la secuencia
que codifica para una molécula que contiene motivos de unión a ATP
confiere resistencia a estafilococosy en particular a S.
aureus, y en la que la secuencia de polinucleótido corresponde a
una secuencia de nucleótidos de vgaB representada por SEC ID
nº: 1 o una secuencia que presenta por lo menos el 70% de homología
con la secuencia de nucleótidos completa de vgaB, o en la
que la secuencia de polinucleótido codifica para un polinucleótido
que presenta la secuencia SEC ID nº: 4
Además, la presente invención da a conocer una
composición de secuencias de polinucleótido, en la que la secuencia
que codifica una acetiltransferasa confiere resistencia a la
estreptogramina A y compuestos relacionados en
staphylococci, y en particular en S. cohnii, y en la
que la secuencia de polinucleótido corresponde a una secuencia de
nucleótidos de vatC representada por SEC ID nº: 2 o una
secuencia que presenta por lo menos el 70% de homología con la
secuencia de nucleótidos completa de vatC, o con un
polinucleótido que se hibrida con la SEC ID nº: 2 en condiciones
rigurosas, o con un fragmento que contiene entre 20 y 30
nucleótidos de SEC ID nº: 13 o SEC ID nº: 14, o en la que la
secuencia de polinucleótido codifica para un polipéptido que
presenta por lo menos el 60% de homología con la SEC ID nº: 5
completa o con SEC ID nº: 9 o SEC ID nº: 10.
La presente invención da a conocer asimismo una
composición de secuencias de polinucleótido, en la que la secuencia
que codifica para una lactonasa confiere resistencia a la
estreptogramina B y compuestos relacionados en Staphylococci
y en particular en S. cohnii, y en la que la secuencia de
polinucleótido corresponde a una secuencia de nucleótidos de
vgbB representada en SEC ID nº: 3 o una secuencia que
presenta por lo menos el 70% de homología con la secuencia de
nucleótidos completa de vgbB, o con un polinucleótido que se
hibrida con la SEC ID nº: 3 en condiciones rigurosas, o con un
fragmento que contiene entre 20 y 40 nucleótidos de SEC ID nº: 3, o
en la que la secuencia de polinucleótido codifica para un
polipéptido que presenta por lo menos el 60% de homología con la SEC
ID nº: 6 completa.
La invención da a conocer asimismo una
composición de secuencias de polinucleótido, en la que se incluye
por lo menos una secuencia de nucleótidos de vatB que
codifica para una acetiltransferasa que confiere resistencia a la
estreptogramina A y compuestos relacionados además de una secuencia
de nucleótidos de vgaB que codifica para una molécula que
contiene motivos de unión a ATP que confiere resistencia a la
estreptogramina A.
Además, la invención da a conocer un
polinucleótido purificado que se hibrida específicamente en
condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótido
seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID
nº: 2, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13 y
SEC ID nº: 14.
La invención da a conocer además fragmentos de
polinucleótido que comprenden por lo menos 10 nucleótidos que se
pueden hibridar en condiciones rigurosas con una cualquiera de las
secuencias de nucleótidos enumeradas anteriormente.
En otra forma de realización de la invención, se
proporciona una secuencia de ADN recombinante que comprende por lo
menos una secuencia de nucleótidos según la invención y bajo el
control de elementos reguladores que regulan la expresión de la
resistencia a antibióticos de la familia de estreptogramina en un
huésped definido.
Además, la invención se refiere a un vector
recombinante que comprende la secuencia de ADN recombinante indicada
anteriormente, en la que el vector comprende el plásmido pIP1633 o
el plásmido pIP1714.
La invención se refiere asimismo a una célula
huésped recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido
de la presente invención o el vector recombinante definido
anteriormente.
Todavía en una forma de realización adicional de
la invención, un procedimiento de detección de cepas bacterianas
que contienen las secuencias de polinucleótido de la presente
invención y secuencias complementarias de las mismas.
Además, la invención se refiere a kits para la
detección de la presencia de cepas bacterianas que contienen las
secuencias de polinucleótido de la invención y sistemas
complementarios de las mismas.
La invención contempla asimismo anticuerpos que
reconocen polipéptidos codificados por las secuencias de
polinucleótido de la presente invención.
Además, la invención proporciona un
procedimiento de selección de moléculas y/o antibióticos activos
para el tratamiento de infecciones debidas a bacterias
Gram-positivas, particularmente estafilococos
basándose en la detección de la actividad de estos antibióticos y/o
moléculas en bacterias que contienen un polinucleótido de la
invención y que presentan el fenotipo de resistencia a las
estreptograminas A.
Debe entenderse que tanto la descripción general
anterior como la siguiente descripción detallada son a modo de
ejemplo y explicación y no son limitativas de la invención, según se
reivindica.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto haciendo referencia a los dibujos, en los que:
las figuras 1A y 1B son los mapas de restricción
del fragmento BglII de 5,5 kb y del fragmento
HindIII-HaeIII de 2,4 kb de pIP1633, respectivamente.
Ambos fragmentos confieren resistencia a la estreptogramina A y
compuestos relacionados. La estrategia para la secuenciación del
fragmento HindIII-HaeIII de 2,4 kb se facilita en la
figura 1B. Abreviaturas de las enzimas de restricción: Ba,
BamHI, Bg, BglII; E, EcoRI; H, HindIII;
X, XbaI.
La figura 2 es la secuencia de nucleótidos y
secuencia de aminoácidos deducida de 2411 nucleótidos de pIP1633,
que contiene el gen vgaB de S. aureus que confiere
resistencia a la estreptogramina A y compuestos relacionados. El
sitio de unión a ribosomas supuesto (RBS) está subrayado. Los
aminoácidos están alineados con el segundo nucleótido de cada codón.
Los asteriscos indican los codones de parada en marco. Los motivos
de unión a ATP A y B descritos por Walker et al. (1982) y
detectados dentro de cada uno de los dos dominios de ATP están en un
recuadro. El motivo SGG conservado de las dos copias del bucle 3
descrito por Hyde et al. (1990) está subrayado. Se muestran
sitios de restricción relevantes.
La figura 3 es la alineación de la secuencia de
aminoácidos de las proteínas de 60 y 61 kDa pronosticadas
codificadas por Vga (Allignet et al., 1992, número de
registro: m90056) y VgaB (figura 2), respectivamente. Se indican
residuos idénticos mediante asteriscos y se muestran cambios
conservativos mediante puntos individuales. Los motivos A y B de
Walker et al. (1982) están en negrita (WA, WB). El motivo SGG
conservado de las dos copias del bucle 3 descrito por Hyde et
al. (1990) está subrayado.
La figura 4 es un mapa de restricción del
plásmido pIP1714 que porta los genes vatC y vgbB así
como los genes pre y repB de la cepa BM10711 de S.
cohnii resistente a las mezclas sinérgicas de estreptograminas A
y B.
La figura 5 es la secuencia de nucleótidos y
secuencia de aminoácidos deducida de 1727 nucleótidos de pIP1714,
que contiene el gen vgbB y vatC de S. cohnii.
Se muestran sitios de restricción relevantes.
Las figuras 6A, 6B y 6C representan cebadores de
oligonucleótido para la hibridación en condiciones rigurosas con
vatC, vgbB y vgaB respectivamente.
La figura 7 representa SEC ID nº:
1-14.
Se ha determinado ahora que las bacterias del
género Staphylococcus portan un gen vgaB, que codifica
para una proteína de unión a ATP supuesta que confiere resistencia
a la estreptogramina A y compuestos estructuralmente similares.
También se ha determinado ahora que las bacterias del género
Staphylococcus portan un gen vgbB, que codifica para
una lactonasa que confiere resistencia a la estreptogramina B y
compuestos estructuralmente similares, y un gen vatC gene,
que codifica para una acetiltransferasa que confiere resistencia a
la estreptogramina A y compuestos estructuralmente similares.
Se han aislado y secuenciado polinucleótidos
novedosos que corresponden a los genes vgaB, vgbB y
vatC de diversas cepas de Staphylococcus, y se ha
demostrado de manera sorprendente que estos nuevos polinucleótidos
hacen posible diseñar sondas o cebadores de oligonucleótido. Estos
polinucleótidos incluyen los siguientes:
- a)
- SEC ID nº: 1,
- b)
- SEC ID nº: 2,
- c)
- SEC ID nº: 3,
- d)
- SEC ID nº: 11,
- e)
- SEC ID nº: 12,
- f)
- SEC ID nº: 13, y
- g)
- SEC ID nº: 14.
La presente invención proporciona asimismo la
utilización de pares específicos de oligonucleótidos como cebadores
o sondas que se hibridan específicamente, en condiciones de
hibridación rigurosas tal como se ha definido anteriormente en la
presente memoria, con el ácido nucleico (ARN o ADN) para la
detección de la presencia de vgaB en una muestra. Estos cebadores de
oligonucleótido son los siguientes:
- oligo I 5'-AAGTCGACTGACAATATGAGTGGTGG-3'
- oligo II 5'-CTGCAGATGCCTCAACAGCATCGATATCC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores también se dan a
conocer en la presente invención:
- a)
- oligo III 5'-ATGAATTCGCAAATCAGCAAGG-3'
- oligo IV 5'-TCGTCTCGAGCTCTAGGTCC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
- b)
- oligo V 5'-CAGCAGTCTAGATCAGAGTGG-3'
- oligo VI 5'-CATACGGATCCACCTTTTCC-3'.
Los oligonucleótidos purificados de la invención
también son útiles como cebadores para su utilización en reacciones
de amplificación o como sondas de ácido nucleico.
Por "polinucleótidos" según la invención se
entiende las secuencias a las que se hace referencia como SEC ID
nº: 1 y las secuencias complementarias y/o las secuencias de
polinucleótidos que se hibridan con las secuencias a las que se
hace referencia en condiciones de alta rigurosidad y que se utilizan
para detectar cepas de estafilococos que portan un gen que codifica
para la resistencia a la estreptogramina A.
Por "molécula activa" según la invención se
entiende una molécula que puede inhibir la actividad del polipéptido
purificado tal como se define en la presente invención o que puede
inhibir el cultivo bacteriano de cepas de estafilococos.
Por tanto, los polinucleótidos de SEC ID nº: 1 y
sus fragmentos que presentan por lo menos el 20% de 30 nucleótidos
pueden utilizarse para seleccionar cebadores de nucleótidos de
manera notable para una reacción de amplificación, tal como las
reacciones de amplificación descritas además.
La PCR se describe en la patente US nº 4.683.202
concedida a Cetus Corp. Los fragmentos amplificados pueden
identificarse mediante electroforesis en gel de agarosa o
poliacrilamida, o mediante electroforesis capilar, o
alternativamente mediante una técnica de cromatografía (filtración
en gel, cromatografría hidrófoba o cromatografía de intercambio
iónico). La especificidad de la amplificación puede garantizarse
mediante una hibridación molecular utilizando como sondas nucleicas
los polinucleótidos de SEC ID nº: 1-3 y
11-14 y sus fragmentos, oligonucleótidos que son
complementarios a estos polinucleótidos o fragmentos de los mismos,
o sus propios productos de amplificación.
Los fragmentos de nucleótidos amplificados son
útiles como sondas en reacciones de hibridación con el fin de
detectar la presencia de un polinucleótido según la presente
invención o con el fin de detectar la presencia de una bacteria de
una cepa de estafilococos que porta genes que codifican para la
resistencia a la estreptogramina A o estreptogramina B, en una
muestra biológica. La presente invención también proporciona los
fragmentos de ácido nucleico amplificados ("amplicones")
definidos en la presente memoria anteriormente. Estas sondas y
amplicones pueden marcarse de manera radiactiva o no radiactiva,
utilizando por ejemplo enzimas o compuestos fluorescentes.
Fragmentos de ácido nucleico preferidos que
pueden servir como cebadores según la presente invención son los
siguientes:
fragmento de polinucleótidos de SEC ID nº: 1 que
presenta una longitud de desde 20 hasta 30 nucleótidos
consecutivos.
Los cebadores también pueden utilizarse como
sondas de oligonucleótido para detectar específicamente un
polinucleótido según la invención.
También pueden utilizarse otras técnicas
relacionadas con la amplificación de ácido nucleico y generalmente
se prefieren a la técnica de PCR. Una técnica de amplificación por
desplazamiento de la cadena (SDA) (Walker et al., 1992) es
una técnica de amplificación isotérmica basada en la capacidad de
una enzima de restricción de escindir una de las cadenas en un
sitio de reconocimiento (que está en forma de hemifosforotioato), y
en la propiedad de una ADN polimerasa de iniciar la síntesis de una
nueva cadena a partir del extremo OH en 3' generado por la enzima
de restricción y en la propiedad de esta ADN polimerasa de desplazar
la cadena anteriormente sintetizada que se ubica corriente
abajo.
La técnica de amplificación SDA se realiza más
fácilmente que la PCR (se necesita un único dispositivo de baño de
agua termostatizado), y es más rápida que los otros procedimientos
de amplificación. Por tanto, la presente invención también
comprende la utilización de fragmentos de ácido nucleico según la
invención (cebadores) en un procedimiento de amplificación de ADN o
ARN según la técnica SDA. Los polinucleótidos de SEC ID nº:
1-3 y 11-14 y sus fragmentos,
especialmente los cebadores según la invención, son útiles como
medios técnicos para realizar diferentes procedimientos de
amplificación de ácido nucleico diana tales como:
- -
- TAS (sistema de amplificación basado en transcripción), descrito por Kwoh et al. en 1989;
- -
- SR (replicación de secuencia autosostenida), descrito por Guatelli et al. en 1990;
- -
- NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico), descrito por Kievitis et al. en 1991; y
- -
- TMA (amplificación mediada por transcripción).
\vskip1.000000\baselineskip
Los polinucleótidos de SEC ID nº:
1-3 y 11-14 y sus fragmentos,
especialmente los cebadores según la invención, también son útiles
como medios técnicos para realizar procedimientos para la
amplificación o modificación de un ácido nucleico utilizado como una
sonda, tal como:
- -
- LCR (reacción en cadena de la ligasa), descrito por Landegren et al. en 1988 y mejorado por Barany et al. en 1991, que empleó una ligasa termoestable;
- -
- RCR (reacción en cadena de reparación), descrito por Segev et al. en 1992;
- -
- CPR (reacción de sonda cíclica), descrito por Duck et al. en 1990; y
- -
- reacción de la replicasa Q-beta, descrito por Miele et al. en 1983 y mejorado por Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988 y por Burg et al. y Stone et al. en 1996.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el polinucleótido diana que va a
detectarse es ARN, por ejemplo ARNm, puede utilizarse una enzima
transcriptasa inversa antes de la reacción de amplificación con el
fin de obtener un ADNc a partir del ARN contenido en la muestra
biológica. El ADNc generado puede utilizarse posteriormente como
ácido nucleico diana para los cebadores o las sondas utilizados en
un procedimiento de amplificación o un procedimiento de detección
según la presente invención.
Las sondas nucleicas según la presente invención
son específicas para detectar un polinucleótido de la invención.
Por "sondas específicas" según la invención se entiende
cualquier oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido de
SEC ID nº: 1-3 y 11-14 y que no se
hibrida con secuencias no relacionadas. Sondas de oligonucleótido
preferidas según la invención son los oligonucleótidos
I-VI.
La presente invención da a conocer
polinucleótidos que presentan por lo menos el 80% de homología en
sus secuencias de ácido nucleico con polinucleótidos de SEC ID nº:
11 a SEC ID nº: 14, por lo menos el 70% de identidad con SEC ID nº:
1 a 3. Por porcentaje de homología de nucleótidos según la presente
invención está previsto un porcentaje de identidad entre las bases
correspondientes de dos polinucleótidos homólogos, siendo este
porcentaje de identidad puramente estadístico y estando ubicadas
las diferencias entre dos polinucleótidos homólogos al azar y en la
longitud completa de dichos polinucleótidos.
Las sondas de oligonucleótido según la presente
invención se hibridan específicamente con una molécula de ADN o ARN
que comprende todo o parte de un polinucleótido entre SEC ID nº: 1
en condiciones rigurosas. Como forma de realización ilustrativa,
las condiciones de hibridación rigurosas utilizadas con el fin de
detectar específicamente un polinucleótido según la presente
invención son ventajosamente las siguientes:
La prehibridación e hibridación se realizan a
68ºC en una mezcla que contiene:
- -
- 5X SSPE (1X SSPE es NaCl 0,3 M, citrato de tri-sodio 30 mM
- -
- 5X disolución de Denhardt
- -
- dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,5% (p/v); y
- -
- ADN de esperma de salmón 100 \mug ml^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los lavados se realizaron tal como sigue:
- -
- dos lavados a temperatura de laboratorio durante 10 min. en presencia de 2 x SSPE y SDS al 0,1%;
- -
- un lavado a 68ºC durante 15 min. en presencia de 1 x SSPE, SDS al 0,1%; y
- -
- un lavado a 68ºC durante 15 min. en presencia de 0,1 x SSPE y SDS al 0,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polinucleótidos u oligonucleótidos no
marcados de la invención pueden utilizarse directamente como sondas.
No obstante, los polinucleótidos u oligonucleótidos se marcan
generalmente con un elemento radiactivo (^{32}P, ^{35}S,
^{3}H, ^{125}I) o mediante una molécula no isotópica (por
ejemplo, biotina, acetilaminofluoreno, digoxigenina,
5-bromodesoxiuridina, fluoresceína) con el fin de
generar sondas que son útiles para numerosas aplicaciones. Se
describen ejemplos de marcaje no radiactivo de fragmentos de ácido
nucleico en la patente francesa FR 78 10975 o por Urdea et
al. o Sanchez-Pescador et al. 1988.
También pueden utilizarse otras técnicas de
marcaje, tales como las descritas en las patentes francesas 2 422
956 y 2 518 755. La etapa de hibridación puede realizarse de
diferentes formas (Mathews et al. 1988). Un procedimiento
general comprende inmovilizar el ácido nucleico que se ha extraído
de la muestra biológica sobre un sustrato (nitrocelulosa, nailon,
poliestireno) e incubar luego, en condiciones definidas, el ácido
nucleico con la sonda. Posteriormente a la etapa de hibridación, se
desecha la cantidad en exceso de la sonda específica y se detectan
las moléculas híbridas formadas mediante un procedimiento apropiado
(medición de la radiactividad, fluorescencia o actividad
enzimática).
enzimática).
Ventajosamente, las sondas según la presente
invención pueden presentar características estructurales tales que
permitan una amplificación de la señal, siendo tales características
estructurales, por ejemplo, sondas de ADN ramificado como las
descritas por Urdea et al. en 1991 o en la patente europea nº
0 225 807 (Chiron).
En otra forma de realización ventajosa de la
presente invención, las sondas descritas en la presente memoria
pueden utilizarse como "sondas de captura", y para este fin se
inmovilizan sobre un sustrato con el fin de capturar el ácido
nucleico diana contenido en una muestra biológica. Posteriormente,
se detecta el ácido nucleico diana capturado con una segunda sonda,
que reconoce una secuencia del ácido nucleico diana que es diferente
de la secuencia reconocida por la sonda de captura.
Los fragmentos de oligonucleótido útiles como
sondas o cebadores según la presente invención pueden prepararse
mediante escisión de los polinucleótidos de SEC ID nº: 1 mediante
enzimas de restricción, tal como se describe en Sambrook et
al. en 1989. Otro procedimiento de preparación apropiado de los
ácidos nucleicos de la invención que contienen como máximo 200
nucleótidos (o 200 pb si estas moléculas son bicatenarias) comprende
las siguientes etapas:
- -
- sintetizar ADN utilizando el procedimiento automatizado de beta-cianetilfosforamidita descrito en 1986;
- -
- clonar los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado; y
- -
- purificar el ácido nucleico que se hibrida con una sonda apropiada según la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento químico para producir los
ácidos nucleicos según la invención, que presentan una longitud de
más de 200 nucleótidos (o 200 pb si estas moléculas son
bicatenarias), comprende las siguientes etapas:
- -
- ensamblar los oligonucleótidos sintetizados químicamente que presentan diferentes sitios de restricción en cada extremo;
- -
- clonar los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado; y
- -
- purificar el ácido nucleico que se hibrida con una sonda apropiada según la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe que las sondas de oligonucleótido
según la presente invención también pueden utilizarse en un
dispositivo de detección que comprende una biblioteca de matriz de
sondas inmovilizadas sobre un sustrato, estando ubicada la
secuencia de cada sonda de una longitud dada en un desplazamiento de
una o varias bases, entre sí, siendo por tanto cada sonda de la
biblioteca de matriz complementaria a una secuencia distinta del
ácido nucleico diana. Opcionalmente, el sustrato de la matriz puede
ser un material que puede actuar como donador de electrones,
determinándose posteriormente la detección de las posiciones de la
matriz en las que se ha producido hibridación mediante un
dispositivo electrónico. Tales bibliotecas de matriz de sondas y
procedimientos de detección específica de un ácido nucleico diana
se describen en la solicitud de patente europea nº 0 713 016, o la
solicitud PCT nº WO 95 33846, o también la solicitud PCT nº WO 95
11995 (Affymax Technologies), la solicitud PCT nº WO 97 02357
(Affymetrix Inc.) y también en la patente US número 5.202.231
(Drmanac), incorporándose dichas patentes y solicitudes de patentes
a la presente memoria como referencia.
La presente invención también se refiere a una
familia de plásmidos recombinantes que contienen por lo menos un
ácido nucleico según la invención seleccionado del grupo de
plásmidos que consisten en pIP1633 y pIP1714.
También se describe en la presente memoria las
secuencias codificantes de longitud completa de los genes vgaB,
vgbB y vatC de Staphylococci que están disponibles
utilizando los polinucleótidos purificados según la presente
invención, así como las enzimas polipeptídicas codificadas por estas
secuencias codificantes de longitud completa. En una forma de
realización específica de la presente invención, se aíslan las
secuencias codificantes de longitud completa de los genes vgaB,
vgbB y vatC a partir de una biblioteca de cósmidos o
plásmidos del genoma de Staphylococci que se han explorado
con las sondas de oligonucleótido según la presente invención. Los
clones de plásmidos o cósmidos positivos seleccionados que se
hibridan con las sondas de oligonucleótido de la invención se
secuencian entonces con el fin de caracterizar la secuencia
codificante de longitud completa correspondiente, y el inserto de
ADN de interés se clona entonces en un vector de expresión con el
fin de producir el motivo de unión a ATP correspondiente que
confiere resistencia a la estreptogramina A y compuestos
relacionados, acetiltransferasa que confiere resistencia a la
estreptogramina A y compuestos relacionados, o lactonasa que
confiere resistencia a la estreptogramina B y compuestos
relacionados.
Un vector adecuado para la expresión en
bacterias y en particular en E. coli es el vector
pQE-30 (QIAexpress) que permite la producción de
una proteína recombinante que contiene una etiqueta de afinidad de
6xHis. La etiqueta de 6xHis se coloca en el extremo
C-terminal del motivo de unión a ATP del polipéptido
recombinante que confiere resistencia a la estreptogramina A y
compuestos relacionados, acetiltransferasa que confiere resistencia
a la estreptogramina A y compuestos relacionados o lactonasa que
confiere resistencia a la estreptogramina B y compuestos
relacionados, lo que permite una posterior purificación eficaz del
motivo de unión a ATP del polipéptido recombinante que confiere
resistencia a la estreptogramina A y compuestos relacionados,
acetiltransferasa que confiere resistencia a la estreptogramina A y
compuestos relacionados o lactonasa que confiere resistencia a la
estreptogramina B y compuestos relacionados mediante el pase sobre
una columna de cromatografía de afinidad de níquel o cobre. La
columna de cromatografía de níquel puede contener la resina
Ni-NTA (Porah et al. 1975).
Los polipéptidos según la invención también
pueden prepararse mediante procedimientos convencionales de síntesis
química, o bien en una disolución homogénea o bien en fase sólida.
Como forma de realización ilustrativa de tales técnicas de síntesis
química de polipéptidos, puede citarse la técnica de disolución
homogénea descrita por Houbenweyl en 1974.
Los polipéptidos según la invención pueden
caracterizarse por su unión sobre una columna de cromatografía de
inmunoafinidad en la que se han inmovilizado anteriormente
anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos frente a un
polipéptido entre el motivo de unión a ATP que confiere resistencia
a la estreptogramina A y compuestos relacionados, acetiltransferasa
que confiere resistencia a la estreptogramina A y compuestos
relacionados, o lactonasa que confiere resistencia a la
estreptogramina B y compuestos relacionados de la invención.
El polipéptido que presenta la secuencia SEC ID
nº: 4 que confiere resistencia a la estreptogramina A según la
presente invención es útil para la preparación de anticuerpos
policlonales o monoclonales que reconocen los polipéptidos o
fragmentos de los mismos. Los anticuerpos monoclonales pueden
prepararse a partir de hibridomas según la técnica descrita por
Kohler y Milstein en 1975. Los anticuerpos policlonales pueden
prepararse mediante inmunización de un mamífero, especialmente un
ratón o un conejo, con un polipéptido según la invención que se
combina con un adyuvante, y luego purificando anticuerpos
específicos contenidos en el suero del animal inmunizado sobre una
columna de cromatografía de afinidad en la que se ha inmovilizado
anteriormente el polipéptido que se ha utilizado como antígeno.
En consecuencia, la invención se refiere
asimismo a un procedimiento para detectar específicamente la
presencia de un polipéptido según la invención en una muestra
biológica. El procedimiento comprende:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo según la invención; y
- b)
- detectar el complejo antígeno-anticuerpo formado.
También forma parte de la invención un kit de
diagnóstico para detectar in vitro la presencia de un
polipéptido según la presente invención en una muestra biológica. El
kit comprende:
- -
- un anticuerpo policlonal o monoclonal tal como se describió anteriormente, opcionalmente marcado; y
- -
- un reactivo que permite la detección de los complejos antígeno-anticuerpo formados, en el que el reactivo porta opcionalmente un marcador, o que puede reconocerse por sí mismo mediante un reactivo marcado, más particularmente en el caso cuando el anticuerpo monoclonal o policlonal mencionado anteriormente no está marcado por sí mismo.
De hecho, los anticuerpos monoclonales o
policlonales según la presente invención son útiles como medios de
detección con el fin de identificar o caracterizar una cepa de
estafilococos que porta genes que codifican para la resistencia a la
estreptogramina A.
La invención también da a conocer:
- -
- un polipéptido o un fragmento de péptido purificado que presenta por lo menos 10 aminoácidos, que se reconoce mediante anticuerpos dirigidos contra una secuencia de polinucleótido que confiere resistencia a la estreptogramina y compuestos relacionados, que corresponde a una secuencia de polinucleótido según la invención; y
- -
- un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de longitud completa de un gen de estafilococos resistente a estreptogramina A y/o B que contiene una secuencia de polinucleótido según la invención.
La presente invención se refiere asimismo a un
anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra un polipéptido o
un péptido codificado por las secuencias de polinucleótido según la
invención.
Un procedimiento de detección de la presencia de
una bacteria que contiene las secuencias de polinucleótido según la
invención en una muestra biológica que comprende:
- a)
- poner en contacto ADN bacteriano de la muestra biológica con un cebador o una sonda según la invención, que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica para la resistencia a las estreptograminas;
- b)
- amplificar la secuencia de nucleótidos utilizando dicho cebador o dicha sonda; y
- c)
- detectar el complejo hibridado formado entre dicho cebador o sonda con el ADN.
Un kit para detectar la presencia de una
bacteria que presenta resistencia a la estreptogramina A y/o
estreptogramina B y que contiene las secuencias de polinucleótido
según la invención en una muestra biológica, comprendiendo dicho
kit:
- a)
- una sonda de polinucleótido según la invención; y
- b)
- reactivos necesarios para realizar una reacción de hibridación de ácidos nucleicos.
Un kit para detectar la presencia de una
bacteria que presenta resistencia a la estreptogramina A y que
contiene las secuencias de polinucleótido según la invención en una
muestra biológica, comprendiendo dicho kit:
- a)
- una sonda de polinucleótido según la invención; y
- b)
- reactivos necesarios para realizar una reacción de hibridación de ácidos nucleicos.
Un procedimiento de selección de anticuerpos
activos para el tratamiento de las infecciones debidas a bacterias
Gram positivas, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto bacterias Gram positivas que presentan una resistencia a la estreptogramina A o estreptogramina B y compuestos relacionados y que contienen las secuencias de polinucleótido según la invención con el antibiótico; y
- b)
- medir la actividad del antibiótico sobre las bacterias que presentan una resistencia a las estreptograminas y compuestos relacionados.
Un procedimiento de selección de moléculas
sintéticas activas que pueden penetrar en una bacteria de la familia
de los estafilococos, en el que se somete a prueba la actividad
inhibidora de estas moléculas sobre por lo menos un polipéptido
codificado por las secuencias de polinucleótido según la invención
que comprende las etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto una muestra de dichas moléculas activas con las bacterias;
- b)
- someter a prueba la capacidad de las moléculas activas de penetrar en las bacterias y la capacidad de inhibir un cultivo bacteriano a diversas concentraciones de las moléculas; y
- c)
- elegir la molécula activa que proporciona un efecto inhibidor de por lo menos el 80% sobre el cultivo bacteriano en comparación con un cultivo sin tratar.
Un procedimiento in vitro de selección de
moléculas activas que pueden inhibir un polipéptido codificado por
las secuencias de polinucleótido según la invención, en el que se
somete a prueba la actividad inhibidora de estas moléculas sobre
por lo menos dicho polipéptido, comprendiendo dicho procedimiento
las etapas siguientes:
- a)
- extraer un polipéptido purificado según la invención;
- b)
- poner en contacto las moléculas activas con dicho polipéptido purificado;
- c)
- someter a prueba la capacidad de las moléculas activas, a diversas concentraciones, de inhibir la actividad del polipéptido purificado; y
- d)
- elegir la molécula activa que proporciona un efecto inhibidor de por lo menos el 80% sobre la actividad de dicho polipéptido purificado.
La invención da a conocer asimismo una
composición de una secuencia de polinucleótido que codifica para la
resistencia a las estreptograminas y compuestos relacionados, o que
induce resistencia en bacterias Gram positivas, en la que dicha
composición comprende una secuencia de polinucleótido que
corresponde al fenotipo de resistencia del plásmido pIP1633
depositado en la C.N.C.M. con el número de registro
I-1768 y del plásmido pIP1680 depositado en la
C.N.C.M. con el número de registro I-1767 y del
plásmido pIP1714 depositado en la C.N.C.M. con el número
I-1877 el 18 de junio de 1997.
Un procedimiento de detección de la presencia de
una bacteria que contiene las secuencias de polinucleótido según la
invención en una muestra biológica, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo según la invención que reconoce un polipéptido codificado por dichas secuencias de polinucleótido; y
- b)
- detectar dicho complejo.
Un kit de diagnóstico para detectar in
vitro la presencia de una bacteria que contiene las secuencias
de polinucleótido según la invención en una muestra biológica,
comprendiendo dicho kit:
- a)
- una cantidad predeterminada de anticuerpos monoclonales o policlonales según la invención;
- b)
- reactivos necesarios para realizar una reacción inmunológica entre los anticuerpos y un polipéptido codificado por dichas secuencias de polinucleótido; y
- c)
- reactivos necesarios para detectar dicho complejo entre los anticuerpos y el polipéptido codificado por dichas secuencias de polinucleótido.
La actividad inhibidora de las moléculas puede
evaluarse fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo,
puede someterse a prueba la actividad inhibidora de Vga B detectando
su hidrólisis de ATP tal como se describe en J.I. Ross et
al. (1990), Mol. Microbiol.
4(7):1207-1214 que se refiere a la evaluación
de la tasa de la salida activa de antibióticos de una célula. Ross
et al. utilizan un gen diferente, pero su producto génico
funciona como una bomba de salida de fármaco de la misma forma que
lo hace Vga B.
Puede someterse a prueba la actividad inhibidora
de Vat C visualizando la reacción de acetilación tal como se
describe en Allignet et al. (1993) que se refiere al
mecanismo de inactivación de compuestos de tipo A conferido por los
plásmidos pIP680 y pIP1156 mediante cromatografía en capa gruesa y
RMN.
Puede someterse a prueba la actividad inhibidora
de Vgb B detectando la degradación de estreptogramina B o un
compuesto relacionado mediante una prueba microbiológica tal como se
describe en Allignet et al. (1988).
La invención comprende asimismo los plásmidos
que contienen las secuencias de polinucleótido de la invención a
partir de Staphylococci, que confieren resistencia a la
estreptogramina A, a los que se hace referencia en la presente
memoria mediante los siguientes números de registro:
Estos plásmidos se han insertado en vectores que
se han depositado en la Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos ("C.N.C.M.") Instituto Pasteur, 28, rue du
Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Francia el 18
de junio de 1997 y el 7 de agosto de 1996, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló pIP1633 a partir de una cepa
transconjugante de S. aureus, BM12235, obtenida a partir de
la cepa de S. aureus de tipo natural donador, BM3385
(Allignet y EI Solh, 1995). Este plásmido portaba el gen
vatB ubicado en un fragmento BglII de 5,5, pero los
otros genes de resistencia a la estreptogramina A (SgA^{r})
descritos no se detectaron o bien mediante experimentos de
hibridación o bien mediante PCR (Allignet y EI Solh, 1995). Dado
que el gen vga lo portaban todos los plásmidos de
estafilococos sometidos a prueba que contenían el gen vat
(Allignet et al., 1996), se sospechó la presencia de un gen
relacionado con vga en pIP1633. Por tanto, se buscó este gen
en el plásmido recombinante, pIP1675 (figura 1A), que contenía el
fragmento BglII de 5.5 de vatB de pIP1633.
En primer lugar, se insertó el fragmento
HindIII-HaeIII de 2,4 kb de pIP1675, que contiene sólo
10 nucleótidos de vatB, en el plásmido pOX300, y se
introdujo el plásmido recombinante, pIP1717 (figura 1B), mediante
electroporación en el receptor de S. aureus, RN4220
(Kreiswirth et al., 1983). El plásmido pOX300, también
denominado pOX7, (Dyke y Curnock, 1989), es un híbrido de pUC18 y
pE194ts y se replica en E. coli en la que confiere
resistencia a ampicilina y a eritromicina, y en S. aureus en
la que sólo se expresa resistencia a eritromicina. Los
transformantes de S. aureus seleccionados sobre eritromicina
10 \mug/ml eran resistentes a estreptogramina A y compuestos
relacionados (PIIA MIC = 8-16 \mug/ml). Por
tanto, el inserto HindIII-HaeIII de
2,4-kb de pIP1717 (figura 1B) portaba probablemente
un gen de resistencia a la estreptogramina A y se secuenció. Se
determinó la secuencia de nucleótidos (nucleótidos) de este
fragmento mediante el procedimiento de didesoxi (Sanger et
al., 1977) con los reactivos y el procedimiento recomendado por
los proveedores del kit de secuenciación de T^{7} (Pharmacia
International). Las flechas indican la dirección y extensión de
cada reacción de secuenciación de didesoxi (figura 1B).
\vskip1.000000\baselineskip
La estrategia de secuenciación sobre ambas
cadenas se explica resumidamente en la figura 1 y la secuencia del
inserto HindIII-HaeIII de 2411-pb se
facilita en la figura 2. Se detectó un marco de lectura abierto
(ORF) de 1674 nucleótidos que se extendía desde el nucleótido 682
hasta el 2356 en la misma cadena que vatB (figura 2). El ORF
de 1674 nucleótidos contenía un codón de iniciación ATG en los
nucleótidos 700 a 702 y estaba precedido por un RBS supuesto de 8
nucleótidos. La \DeltaG (energía libre de asociación) de
interacción de la estructura más estable entre este RBS supuesto y
el extremo 3' terminal del ARNr 165 (MacLaughlin et al.,
1981; Moran et al., 1982) calculada según Tinoco et
al. (1973) era de -79,4 kJ/mol. La secuencia ubicada entre el
codón ATG y el codón de parada TAA en los nucleótidos 2356 a 2358
puede codificar para una proteína de 552 aminoácidos de 61.327
daltons (Da). Este gen supuesto, denominado vgaB, presentada
un 58,8% de identidad de nucleótidos con el gen de 1572 pb,
vga (Allignet et al., 1992). El contenido en G+C de
vgaB (27,2%) es similar al de vga (29%), pero ambos
valores son ligeramente inferiores a los del genoma de
estafilococos (del 32 al 36%) (Kloos y Schleifer, 1986). La
secuencia de nucleótidos de vgaB se ha presentado al banco
de datos GenBank/EMBL con el número de registro u82085.
El producto de traducción pronosticado del gen
vgaB, VgaB, presenta un punto isoeléctrico (pI) de 9,60. El
gráfico de hidropatía de la secuencia de VgaB según el algoritmo de
Kyte y Doolittle (1982) indica que la proteína es hidrófila. No se
observó similitud con secuencias señal conocidas de proteínas
secretadas (von Heijne, 1986; Watson, 1984).
Se comparó la secuencia de aminoácidos de VgaB
con las secuencias disponibles en las bases de datos (GenBank,
versión 97.0; EMBL, versión 48; SwissProt, versión 34). Se encontró
similitud significativa con los dominios de unión a ATP de
numerosas proteínas con casete de unión a ATP (ABC). La proteína que
daba el mejor apareamiento fue Vga (48,3% de aminoácidos idénticos,
70,4% de aminoácidos similares). VgaB y Vga contienen cada una dos
dominios de unión a ATP que comparten el 38,8% y el 39,1% de
aminoácidos idénticos, respectivamente. Cada uno de estos dominios
incluye los dos motivos de unión a ATP descritos por Walker et
al. (1982) (figura 2). Además, la secuencia SGG sumamente
conservada del bucle 3 encontrada entre los dos motivos de unión a
ATP de todas las proteínas de unión a ATP investigadas (Barrasa
et al., 1995; Hyde et al., 1990) se detectó en Vga
(Allignet et al., 1992) y VgaB (figura 2). Según la
estructura terciaria pronosticada del casete modelo ABC, este bucle
se ubicaría de manera conveniente para interaccionar con la membrana
celular (Hyde et al., 1990). El dominio de unión entre ATP
de VgaB es más rico en glutamina (11 Q en 155 aminoácidos totales)
que el resto de la secuencia de la proteína (11 Q/397 aminoácidos).
En cambio, la proporción de glutamina en el dominio de unión entre
ATP de Vga es similar a la de la otra parte de la proteína (4 Q/156
aminoácidos y 14 Q/366 aminoácidos, respectivamente). Ni Vga ni VgaB
contienen dominios transmembrana hidrófobos.
La proteína ABC MsrA (Ross et al., 1990)
es la más similar a Vga y VgaB (35,2% y 34,4% de aminoácidos,
respectivamente). MsrA confiere resistencia a eritromicina
aumentando la salida de este antibiótico y a estreptogramina B
mediante un mecanismo no aclarado todavía. MsrA contiene dos
dominios de unión a ATP con el 31,8% de identidad de aminoácidos y
están separados por un conector Q, pero no por tramos hidrófobos que
podrían ser posibles dominios que se extienden por la membrana. Las
proteínas hidrófobas, que se espera que interaccionen con MsrA, son
las codificadas por genes similares que se mapean cerca de MsrA en
dos cepas de estafilococos (smpA, smpB) y también
aquéllas en el cromosoma de la cepa receptora de S. aureus,
RN4220 (smpC), que no porta msrA (Ross et al.,
1995). Ross et al. (1996) han notificado recientemente que
SmpC encontrado en el cromosoma de RN4220 no es esencial para la
expresión de la resistencia a eritromicina conferida por MsrA. Por
tanto, se requieren experimentos adicionales para aclarar los
mecanismos de resistencia conferida por lo genes msrA, vga o
vgaB.
Varios transportadores ABC, que no presentan
dominios hidrófobos alternantes, se han agrupado en una subfamilia
con el fin de distinguirlos de los miembros de la subfamilia de
transportadores ABC_{2}, cuyos miembros contienen dominios
transmembrana hidrófobos (Barrasa et al., 1995; Olano et
al., 1995; Peschke et al., 1995). Por tanto, VgaB puede
considerarse como un nuevo miembro de la antigua subfamilia de
transportadores ABC. Excluyendo VgaB, Vga y MsrA, la mayoría de los
transportadores ABC conocidos que contienen dos casetes de unión a
ATP pero no dominio(s) hidrófobo(s) se encontraron en
microorganismos que producen lantibióticos o antibióticos en los
que están implicados en la excreción activa de estas moléculas.
Estos transportadores están codificados por los siguientes genes:
ard l, un gen de resistencia a antibiótico
amino-acilnucleósido de Streptomyces
capreolus (Barrasa et al., 1995); carA, un gen de
resistencia a carbomicina de Streptomyces thermotolerans
(Schoner et al., 1992); ImrC, un gen de resistencia a
lincomicina de Streptomyces lincolnensis (Peschke et
al., 1995); oleB, un gen de resistencia a oleandomicina
de Streptomyces antibioticus (Olano et al., 1995);
srmB, un gen de resistencia a espiramicina de
Streptomyces ambofaciens (Geistlich et al., 1992);
tlrC, un gen de resistencia a tilosina de Streptomyces
fradiae (Rosteck et al., 1991); y petT, un gen de
resistencia a pep5 epidermina de Staphylococcus epidermidis
(Meyer et al., 1995). La identidad de aminoácidos entre cada
uno de estos últimos transportadores ABC y VgaB es de entre
el
23,6% y el 28,7%.
23,6% y el 28,7%.
Cebadores degenerados diseñados a partir de un
análisis de la alineación de la secuencia de aminoácidos de Vga y
VgaB pueden ser útiles para detectar tales genes supuestos mediante
experimentos de PCR. En los productores de estreptograminas, la
resistencia descrita a estos antibióticos consiste en la
inactivación de la estreptogramina A mediante un mecanismo todavía
desconocido (Fierro et al., 1989), la inactivación de la
estreptogramina B mediante una lactonasa (Kim et al., 1974)
y el supuesto aumento de la exportación de estreptogramina A y
estreptogramina B mediante una proteína integral de la membrana,
Ptr, que explota gradientes de protones transmembrana (Blanc et
al., 1995). Pueden analizarse los espectros de RMN de los
compuestos A modificados para verificar si su inactivación en los
productores de antibióticos es similar a la debida a las proteínas
Vat o VatB, que transfieren un grupo o-acetilo a la
posición C14 de PIIA (Allignet et al., 1993). De manera
interesante, el gen de estafilococos vgb (Allignet et
al., 1988) encontrado en la mayoría de los plásmidos que portan
vga y vat (Allignet et al., 1996), codifica
para una proteína que inactiva estreptogramina B y compuestos
relacionados mediante escisión del anillo
de lactona.
de lactona.
\newpage
Se construyó un plásmido recombinante que
contenía un fragmento de vgaB, pIP1705, para que sirviese
como sonda en experimentos de hibridación en condiciones rigurosas
tal como se describió anteriormente (Allignet et al., 1996).
pIP1705 consiste en pUC19 escindido con SalI y PstI, y
un inserto de 1051 pb amplificado a partir de vgaB mediante
los siguientes cebadores, que introducen sitios PstI o
SalI:
Los 52 estafilococos SgA^{r} investigador
(Allignet et al., 1996; El Solh et al., 1980; Loncle
et al., 1993) incluían 10 cepas (7 S. aureus, 1 S.
simulans, 1 S. haemolyticus y 1 S. cohnii
urealyticum), que contenían plásmidos de 26 a 45 kb que
contenían vga, vat y vgb; 21 cepas (20 S.
aureus y una S. epidermidis), que contenían plásmidos de
50 a 90 kb que contenían vatB; 16 cepas (12 S.
epidermidis, tres S. haemolyticus y una S. aureus)
con plásmidos de 6 a 15 kb que contenían vga; una cepa de
S. epidermidis que contenía un plásmido de aproximadamente
20 kb que contenía vga-vat y cuatro cepas de
S. aureus, que no portaban secuencias de nucleótidos que se
hibridan con vat, vatB, vga o vgb. Las secuencias de
nucleótidos que se hibridaban con pIP1705 se encontraron sólo en
los 21 plásmidos grandes que contenían vatB. En todos estos
21 plásmidos que incluían pIP1633, se detectaron secuencias de
nucleótidos hibridantes en un fragmento EcoRI de 1,5 kb, que
también se hibridaba con vatB, lo que sugiere que vgaB
y vatB presentan posiciones relativas conservadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la cepa de Staphylococcus
cohnii, BM10711, resistente a las mezclas sinérgicas de
estreptogramina A y estreptogramina B y compuestos relacionados
(pristinamicina, virginiamicina, sinergistina, micamicina,
quinupristina-dalfopristina). Esta cepa se aisló en
el hospital de Douera (Algeria) en el que se utilizaba
frecuentemente pristinamicina por vía tópica. La cepa se aisló
(Liassin et al., 1997) a partir de una muestra proporcionada
a partir de un armario ubicado en una habitación ocupada por
pacientes que padecían osteomielitis crónica.
La cepa BM10711 contenía varios plásmidos
incluyendo pIP1714 (5 kb). Este plásmido se aisló mediante
electroporación en una cepa receptora de S. aureus, RN4220.
El transformante, que contenía pIP1714, se seleccionó sobre BHIA
que contenía pristinamicina IIA 10 \mug/ml. El plásmido pIP1714
confería resistencias a la estreptogramina A y estreptogramina B y
compuestos relacionados.
Se linearizó el plásmido pIP1714 mediante
escisión con HindIII y se clonó en el sitio HindIII
del vector pOX7 también denominado pOX300 (Dyke et al.,
1989, FEMS Microbiol. Lett. 58:209-216). pOX7
resulta de la cointegración del vector de E. coli, pUC18, y
el plásmido de S. aureus, pE194. Se utilizó el plásmido
recombinante pIP1715 que consistía en pOX7 y pIP1714 para secuenciar
pIP1714 en su totalidad. Se encontró que el gen vatC (636
nucleótidos) que codificaba para una acetiltransferasa que inactiva
la estreptogramina A y compuestos relacionados y el gen vgbB (885
nucleótidos) que codificaba para una lactonasa que inactiva la
estreptogramina B y compuestos relacionados eran portados por este
plásmido. El gen vatC presentaba el 71,7, 62,2 y 64,1% de
identidad de nucleótidos con el gen relacionado con vat, vatB
y satA respectivamente y el gen vgbB presenta el 69,5%
de identidad de nucleótidos con el gen vgb.
La acetiltransferasa VatC presenta similitud
significativa con acetiltransferasas que presentan la misma
actividad enzimática y que están codificadas por los genes vatC,
vatB, y sat (respectivamente el 69,8, 58,2 y 66,0% de
identidad de aminoácidos). Estas proteínas pertenecen a una familia
de acetiltransferasas xenobióticas que modifican diversos sustratos
incluyendo estreptogramina A y antibióticos relacionados. La
lactonasa VgbB presenta también similitud significativa con Vgb que
inactiva estreptogramina B y compuestos relacionados (el 67,0% de
identidad de aminoácidos).
Los otros dos genes portados por pIP1714 son
pre y repB, que codifican para proteínas implicadas en
la movilización y replicación, respectivamente. Estos dos genes son
homólogos a los portados por el plásmido de estafilococos, pUB110
(McKenzie et al., 1986, Plasmid 15:93-103).
Además, tal como se notifica en la figura 5, las secuencias
intergénicas de pIP1714 delimitadas por vatC y repB
también presentaron similitudes significativas con pUB 110.
Se hicieron crecer los estafilococos tras
incubación durante la noche a 37ºC en 200 ml de BHI que contenía 10
\mug/mI de PIIA. Tras centrifugación de 15 min. a 8000 rpm, se
resuspendió el sedimento en 25 ml de TES (Tris 50 mM, EDTA 1 mM,
sacarosa al 7%). Tras añadir 150 \mug de lisostafina, se incubó la
mezcla 30 min. a 37ºC. Entonces, se añadieron 2 ml de SDS al 20% y
6 ml de EDTA 0,25 M y se incubó la suspensión 15 min. a 37ºC. Se
añadieron 8 ml de NaCl 5 M y se mantuvo la mezcla durante 90 min. a
+4ºC. Tras centrifugación de 30 min. a 8.000 rpm, se incubó el
sobrenadante durante 15 min. a 37ºC con 5 \mug de de ARNasa
(Boehringer). Se añadieron 10 \mug de proteinasa K y se incubó la
suspensión durante 15 min. a 65ºC. Se precipitó el ADN utilizando
isopropanol (0,6 V para 1 V de disolución de ADN). Tras
centrifugación de 30 min. a 8.000 rpm, se lavó el sedimento con 10
ml de etanol al 70%. Se secó el ADN lavado a 56ºC, se disolvió en 10
ml de agua y se purificó mediante centrifugación en densidad de
flotación-colorante (bromuro de etidio - cloruro de
cesio). Se recogió la banda extracromosómica. Tras eliminar el
bromuro de etidio, se dializó la disolución de ADN de plásmido
utilizando tampón TE (Tris, 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7).
Véase el protocolo maxi del plásmido QIAfilter
para preparaciones a gran escala y el protocolo del kit del plásmido
QIAprep Spin para minipreparaciones. Quiagen GmbH y Quiagen Inc.
(Hilden, Alemania)
- -
- Kit maxi del plásmido ref.: 12262
- -
- Kit miniprep ref.: 27104
Se inocularon 200 ml de BHI con 20 ml de un
cultivo durante la noche de RN4220 (Kreiswirth et al.,
Nature 1983, 306: 709-712) y se incubó a 37ºC
con agitación. Cuando la DO alcanzó 0,4 a 600 nm, se mantuvo la
suspensión en hielo. Se lavó el sedimento tres veces con 20 ml de
tampón Hepes frío (sacarosa al 9,31% - Hepes al 0,19% - pH 7,4). Se
resuspendió el sedimento en 2,5 ml de tampón Hepes que contenía el
10% de glicerol. Se almacenaron alícuotas de 100 \mul suspensión
de células (3,10^{10}/ml) a -80ºC.
Tras descongelar a temperatura ambiente, se
mantuvo la alícuota de 100 \mul de las células en hielo. Tras
añadir 10 \mul de una disolución que contenía 1 \mug de ADN de
plásmido, se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación
de 0,2 cm fría. Se fijó el pulsador génico (BioRad) a 25 uF y 2,5 KV
y el controlador del pulso a 100 \Omega. Esto produjo un pulso
con un tiempo constante de 2,3 a 2,5 ms. Se retiró la cubeta de la
cámara y se añadió 1 ml de SOC (bactotriptona al 2%, extracto de
levadura Bacto al 0,5%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM,
MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM). Se transfirió la suspensión de
células en un tubo de propileno y se incubó con agitación a 37ºC
durante 1 h. Entonces se sembró en placa la suspensión sobre medio
selectivo, que consistía en BHIA que contenía eritromicina 10
\mug/mI o 10 \mug/ml de PIIA. Se incubaron las placas durante
48 h a 37ºC y se aislaron los transformantes sobre medio selectivo.
Se llevaron a cabo estudios adicionales sobre una única colonia
aislada.
Se amplificó el ADN mediante PCR en un
termociclador Crocodile II (Appligène) con aproximadamente 10 ng de
ADN celular o 1 ng de ADN de plásmido. La mezcla de reacción
contenía 0,6 \muM de cada oligonucleótido que servía como
cebador, 200 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato, 2,5 U de
ADN polimerasa Taq (Amersham, Int.) y 1 x tampón (Amersham,
Int.). Se ajustó el volumen de reacción final hasta 100 \mul con
H_{2}O y entonces se recuperó la muestra mediante 50 \mul de
aceite mineral blanco pesado (Sigma Chemical Co, St. Louis,
Missouri).
Se llevaron a cabo experimentos de PCR a alta o
baja rigurosidad, dependiendo de los cebadores utilizados. A alta
rigurosidad, se realizó la PCR con un preciclo de 3 min. a 95ºC y 2
min. a 60ºC, 30 ciclos de 20 s a 72ºC, 20 s a 95ºC, 20 s a 60ºC
seguido por un ciclo de 1 min. a 72ºC. A baja rigurosidad, se
realizó la PCR con un preciclo de 5 min. a 95ºC, 35 ciclos de 2
min. a 40ºC, 1 min. 30 s a 72ºC, 30 s a 95ºC seguido por un ciclo
de 4 min. a 40ºC y 12 min. a 72ºC. Los oligonucleótidos utilizados a
alta rigurosidad se indican en la tabla a continuación.
Se marcó el ADN de plásmido con
[\alpha-^{32}P]dCTP (110 Tbq mmol^{-1})
mediante la técnica de huella genética al azar utilizando el sistema
de marcaje de ADN Megaprime (Amersham).
Se utilizaron membranas
Hybond-N+ (Amersham) para la transferencia. Se
transfirió ADN desde geles de agarosa hasta las membranas mediante
el procedimiento de transferencia capilar de transferencia de tipo
Southern. Se desnaturalizó el ADN y se fijó a las membranas según
el protocolo descrito en el manual de usuario de membranas
Hybond-N+.
Se realizaron la prehibridación e hibridación a
68ºC en una mezcla que contenía 5X SSPE (1X SSPE es NaCl 0,3 M,
citrato de trisodio 30 m), 5X disolución de Denhardt, SDS al 0,5%
(p/v) y ADN de esperma de salmón 100 \mug ml^{-1}. Se trataron
las membranas que contenían ADN transferidos desde los geles de
agarosa con sonda de ADN radiomarcada 10 ng ml^{-1}. Se inició el
lavado con dos inmersiones sucesivas en 2X SSPE, SDS al 0,1% a
temperatura ambiente durante 10 min., seguido por una inmersión en
1X SSPE, SDS al 0,1% a 68ºC durante 15 min., y finalmente por una
inmersión en 0,1 X SSPE, SDS al 0,1% a 68ºC durante 15 min. Las
transferencias lavadas tratadas con la sonda radiomarcada se
expusieron a película Fuji RX a -70ºC.
Para vatC y vgbB, se realizó la
secuenciación mediante amplificación por PCR en un volumen final de
20 \mul utilizando 500 ng de ADN de plásmido, 5-10
pmoles de cebador y 9,5 \mul de premezcla de terminadores
marcados con colorante según el protocolo de Applied Biosystems.
Tras calentar a 94ºC durante 2 min., se sometió a ciclado la
reacción tal como sigue: 25 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 55ºC y 4
min. a 60ºC (termociclador 9600 de Perkin Elmer). Se realizó la
eliminación del exceso de terminadores marcados con colorante
utilizando columnas Quick Spin (Boehringer Mannheim). Se secaron
las muestras en una centrífuga a vacío y se disolvieron con 4
\mul de formamida desionizada EDTA pH 8,0 (5/1). Se cargaron las
muestras sobre un secuenciador 373A de Applied Biosystems y se
hicieron correr durante 12 h sobre un gel de acrilamida
denaturalizante al 4,5%.
- Cebadores utilizados para secuenciar los
siguientes genes:
\bullet vgbB
Para vgaB se secuenció el ADN según las
instrucciones proporcionadas por el kit T7SequencingTm de Pharmacia
Biotech (Uppsala, Suecia), procedimientos C y D.
\vskip1.000000\baselineskip
- Cebadores utilizados para secuenciar los
siguientes genes:
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguió un protocolo convencional para clonar
en el vector p0X7, también denominado pOX300, el fragmento
Hindffl-HaeIII de 2,4 kb de pIP1633 que porta
vgaB (figura 1) y el plásmido pIP1714 que porta vatC
y vgbB (figura 4), linearizado mediante escisión con
HindIII. El ADN del vector (10-20 \mug) y
los plásmidos utilizados en experimentos de clonación se escindieron
con las enzimas de restricción apropiadas (30 unidades) y se
purificaron mediante el kit GeneClean (Bio 101, La Jolla, Calif.).
Para evitar que se volviera a ligar, se desfosforiló el vector
escindido con una única enzima mediante incubación de 30 min. a 37ºC
con 5 unidades de fosfatasa alcalina. Se llevó a cabo la ligación
en un volumen de reacción total de 10 \mul que contenía 0,1
\mug del vector, 0,1 \mug del plásmido, ATP 0,5 mM, 1 X tampón
de ADN ligasa de T4 y 0,1 unidades Weiss de ADN ligasa de T4. Tras
incubación durante la noche a 16ºC, se utilizaron de 1 a 2 \mul
de la mezcla de ligación para transformar E. coli competente
y se seleccionaron los transformantes sobre medios sólidos que
contenían 100 \mug/ml de ampicilina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la susceptibilidad a agentes
antimicrobianos con un ensayo de difusión en disco (Diagnostic
Pasteur). Se prepararon discos adicionales en el laboratorio que
contenían estreptogramina A (20 \mug) o estreptogramina B
(40 \mug).
(40 \mug).
- -
- NCCLS: Performance standards for antimicrobial disk susceptibility test, 1984, Approved standard M2-A3, 4: 369-402.
- -
- ECCLS: Standard for antimicrobial susceptibility testing by diffusion methods, 1985, ECCLS Document, 5:4-14.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las concentraciones inhibidoras
mínimas (MIC) de antibióticos mediante diluciones seriales de dos
veces de antibióticos MHA (Ericson H.M. y S.C. Sherris, Acta Pathol.
Microbiol. Scand., 1971, supl. 217: sección B).
A pesar de la frecuencia relativamente baja de
estafilococos SgA^{R} (1-10%) (Loncle et
al., 1993; Allignet et al., 1996), se han detectado
cuatro genes que codifican para la resistencia a la estreptogramina
A y se sospecha que los Staphylococci portan otro(s)
gen(es) de resistencia. De manera sorprendente, los
presentes estudios y anteriores (Allignet et al., 1996)
indican que los plásmidos de estafilococos que portan dos genes que
codifican para la resistencia estreptogramina A mediante dos
mecanismos distintos (inactivación por acetiltransferasas y aumento
de la salida) están extendidos entre estafilococos (32 de los 48
plásmidos investigados).
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes publicaciones se han citado en la
presente memoria.
Allignet, J., Loncle, V.,
Mazodier, P. y El Solh, N. (1988) Nucleotide
sequence of a staphylococcal plasmid gene, vgb, encoding a
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Claims (22)
1. Polinucleótido purificado que comprende la
secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido
por SEC ID nº: 1 y su secuencia complementaria.
2. Péptido purificado que comprende la secuencia
de aminoácidos codificada por el polinucleótido según la
reivindicación 1.
3. Péptido purificado según la reivindicación 2,
que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 4.
4. Utilización de una composición de secuencias
de polinucleótido para la detección de resistencia a las
estreptograminas A que comprende el polinucleótido según la
reivindicación 1 o un fragmento del mismo que presenta de 20 a 30
nucleótidos.
5. Utilización de un polinucleótido como cebador
o sonda para detectar la presencia del gen vgaB en una muestra, en
la que dicho polinucleótido se selecciona de entre el grupo
constituido por:
- -
- un polinucleótido según la reivindicación 1; y
- -
- un fragmento de polinucleótido que se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con la secuencia de polinucleótido según la reivindicación 1 y que corresponde a por lo menos una de las siguientes secuencias:
- -
- oligo I 5'-AAGTCGACTGACAATATGAGTGGTGG-3'
- -
- oligo II 5'-CTGCAGATGCCTCAACAGCATCGATATCC-3'.
6. Utilización de una composición de secuencias
de aminoácidos para la detección de la resistencia a la
estreptogramina A que comprende por lo menos una secuencia de
aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido según
la reivindicación 1.
7. Composición de secuencias de polinucleótido
que codifican para la resistencia a las estreptograminas o que
inducen resistencia a la estreptogramina en bacterias Gram
positivas, comprendiendo dicha composición por lo menos una
secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula que contiene
motivos de unión a ATP que confieren resistencia a la
estreptogramina A y por lo menos una secuencia de nucleótidos
seleccionada de entre las siguientes secuencias:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una acetiltransferasa que confiere resistencia a la estreptogramina A seleccionada del grupo de acetiltransferasas vat, vatB y satA; y
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una lactonasa que confiere resistencia a la estreptogramina B,
en la que la secuencia de polinucleótido que
codifica para una molécula que contiene motivos de unión a ATP
confiere resistencia a la estreptogramina A en
Staphylococcus, y en la que el polinucleótido corresponde a
una secuencia de nucleótidos de vgaB representada en la SEC ID nº: 1
o a una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos el 70% de
identidad con la secuencia de nucleótidos completa de vgaB y que
confiere resistencia a la estreptogramina A, o en la que la
secuencia de polinucleótido codifica para un polipéptido que
presenta la secuencia SEC ID nº: 4.
8. Composición según la reivindicación 7, en la
que la secuencia de polinucleótido que codifica para una molécula
que contiene motivos de unión a ATP confiere resistencia a la
estreptogramina A en Staphylococcus aureus.
9. Composición de secuencias de polinucleótido
según la reivindicación 7, en la que dicha composición comprende por
lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula
que contiene motivos de unión a ATP que confiere resistencia a la
estreptogramina A y por lo menos una secuencia de nucleótidos que
codifica para una acetiltransferasa que confiere resistencia a la
estreptogramina A.
10. Composición de secuencias de polinucleótido
según la reivindicación 9, en la que dicha por lo menos una
secuencia de nucleótidos que codifica para una acetiltransferasa es
una secuencia de nucleótidos de vatB que codifica para una
acetiltransferasa que confiere resistencia a la estreptogramina
A.
11. Secuencia de ADN recombinante que comprende
por lo menos una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1,
bajo el control de elementos reguladores que regulan la expresión de
resistencia a antibióticos de la familia de estreptogramina en un
huésped definido.
12. Vector recombinante que comprende la
secuencia de ADN según la reivindicación 11, comprendiendo el vector
un plásmido pIP1633 depositado en la C.N.C.M. con el número de
registro I-1768 o un plásmido pIP1714 depositado en
la C.N.C.M. con el número I-1877 el 18 de junio de
1997.
13. Célula huésped recombinante que comprende
una secuencia de polinucleótido seleccionada de entre el grupo
constituido por SEC ID nº: 1 o el vector recombinante según la
reivindicación 12.
14. Polinucleótido que comprende la secuencia
codificante de longitud completa de un gen de resistencia a la
estreptogramina A de Staphylococcus que contiene una
secuencia de polinucleótido según la reivindicación 1.
15. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido
contra un polipéptido codificado por las secuencias de
polinucleótido según la reivindicación 1.
16. Procedimiento de detección de la presencia
de una bacteria que contiene las secuencias de polinucleótido según
la reivindicación 1 y que presentan resistencia a la estreptogramina
A en una muestra biológica, que comprende:
- a)
- poner en contacto ADN bacteriano de la muestra biológica con un cebador o una sonda tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5, o una secuencia complementaria de la misma, que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica para la resistencia a la estreptogramina A;
- b)
- amplificar la secuencia de nucleótidos utilizando dicho cebador o dicha sonda; y
- c)
- detectar el complejo hibridado formado entre dicho cebador o sonda con el ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Kit para detectar la presencia de una
bacteria que presenta resistencia a la estreptogramina A y que
contiene una secuencia de polinucleótido según la reivindicación 1
en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:
- a)
- una sonda de polinucleótido tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5, o una secuencia complementaria de la misma; y
- b)
- los reactivos necesarios para realizar una reacción de hibridación de ácidos nucleicos.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Procedimiento de selección de antibióticos
activos para el tratamiento de infecciones debidas a bacterias Gram
positivas, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto bacterias Gram positivas que presentan una resistencia a la estreptogramina A y que contienen una secuencia de polinucleótido según la reivindicación 1 con el antibiótico; y
- b)
- medir una actividad del antibiótico sobre las bacterias que presentan una resistencia a las estreptograminas.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Procedimiento de selección de moléculas
sintéticas activas que pueden penetrar en bacterias de la familia de
estafilococos, en el que se somete a prueba la actividad inhibidora
de estas moléculas sobre por lo menos un polipéptido codificado por
las secuencias de polinucleótido según la reivindicación 1, que
comprende las etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto una muestra de dichas moléculas activas con las bacterias;
- b)
- someter a prueba la capacidad de las moléculas activas de penetrar en las bacterias y la capacidad de inhibir un cultivo bacteriano a diversas concentraciones de las moléculas; y
- c)
- elegir la molécula activa que proporciona un efecto inhibidor de por lo menos el 80% sobre el cultivo bacteriano en comparación con un cultivo sin tratar.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Procedimiento in vitro de selección
de moléculas activas que pueden inhibir un polipéptido codificado
por las secuencias de polinucleótido según la reivindicación 1, en
el que se somete a prueba la actividad inhibidora de estas moléculas
sobre por lo menos dicho polipéptido, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas siguientes:
- a)
- extraer un polipéptido purificado según la reivindicación 2;
- b)
- poner en contacto las moléculas activas con dicho polipéptido purificado;
- c)
- someter a prueba la capacidad de las moléculas activas, a diversas concentraciones, de inhibir la actividad del polipéptido purificado; y
- d)
- elegir la molécula activa que proporciona un efecto inhibidor de por lo menos el 80% sobre la actividad de dicho polipéptido purificado.
\newpage
21. Procedimiento de detección de la presencia
de una bacteria que contiene una secuencia de polinucleótido según
la reivindicación 1 y que presenta resistencia a la estreptogramina
A en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo según la reivindicación 15 que reconoce un polipéptido codificado por dicha secuencia de polinucleótido; y
- b)
- detectar dicho complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Kit de diagnóstico para detectar in
vitro la presencia de una bacteria que contiene las secuencias
de polinucleótido según la reivindicación 1 y que presenta
resistencia a la estreptogramina A en una muestra biológica,
comprendiendo dicho kit:
- a)
- una cantidad predeterminada de anticuerpos monoclonales o policlonales según la reivindicación 15;
- b)
- los reactivos necesarios para realizar una reacción inmunológica entre los anticuerpos y un polipéptido codificado por dichas secuencias de polinucleótido; y
- c)
- los reactivos necesarios para detectar dicho complejo entre los anticuerpos y el polipéptido codificado por dichas secuencias de polinucleótido.
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