ES2313785T3 - Ensayo para predecir el exito de la maduracion in-vivo (miv). - Google Patents
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Abstract
Uso de un ensayo para detectar la concentración de al menos una hormona en una muestra de un mamífero para la predicción de si la probabilidad de maduración in vitro satisfactoria y posterior fecundación es alta o baja en un ciclo dado.
Description
Ensayo para predecir el éxito de la maduración
in-vivo (MIV).
La mujer con ovulación normal reclutará
aproximadamente 300 ovocitos inmaduros (óvulos) en cada ciclo
menstrual. Normalmente, durante un proceso de apoptosis, todos los
ovocitos excepto uno morirán antes de la ovulación. La fecundación
in vitro (FIV) convencional, tratamiento para casos
especiales de infertilidad masculina y femenina grave, se basa en
la recuperación de óvulos humanos maduros seguido por la fecundación
de los ovocitos maduros con espermatozoides. El reclutamiento de
ovocitos maduros humanos se lleva a cabo mediante varias formas
complicadas de pautas de tratamiento hormonal, frecuentemente con
molestias o riesgo para la mujer implicada. Estas pautas de
tratamiento hormonal serán especialmente un problema en el futuro ya
que la FIV se ofrece cada vez más a mujeres perfectamente normales
en estos programas debido a la pobre calidad del esperma de sus
maridos. Además, este tipo de tratamiento proporcionará normalmente
una tasa de embarazo del 20% por ciclo iniciado.
Debido al riesgo, molestias y el coste de la
estimulación hormonal, durante años se han probado varias otras
soluciones. En animales, la maduración in vitro (MIV) se ha
convertido en un procedimiento eficaz para producir ovocitos para
FIV, pero hasta la fecha las tasas de éxito registradas en la MIV
clínica humana han sido bajas (Cha, Trounson, Barnes, Russel). Una
de las formas más simples para evitar la estimulación hormonal ha
sido no estimular en absoluto con hormonas. Sin embargo, esta pauta
de tratamiento sólo ha proporcionado un número limitado de
embarazos y la tasa de embarazo calculada nunca es superior al 5%
por ciclo iniciado.
La presente invención se refiere al uso de un
ensayo y un procedimiento para ensayar como se define en las
reivindicaciones. En particular, la capacidad de un sistema de
prueba para predecir el momento adecuado y el desarrollo de óvulos
sanos de profase activada específicos para desarrollarse
posteriormente in vitro hasta MF-II sin
tratamiento hormonal exógeno de la mujer, y evitando de esta manera
la degeneración de la mayoría de los óvulos, aún cuando la mujer no
se trate con hormonas. A diferencia de todos los demás ensayos
hormonales previos que siempre se basan en fases tardías del
desarrollo de óvulos, normalmente óvulos en la fase
MF-II, las mediciones van dirigidas al momento
adecuado de aspiración de óvulos no fecundables, que pueden madurar
in vitro para ser fecundados. Mediante este procedimiento se
logran tasas de embarazo superiores al 15%.
El desarrollo nuclear de los óvulos se detiene
en la fase de diploteno como vesículas germinales. Ésta se denomina
en lo sucesivo la etapa de dicitato. Esta etapa se caracteriza por
cromosomas sumamente difusos, cuyo ADN tiene poca afinidad por
tales cepas nucleares como reactivo de Feulgen. Los cromosomas de
óvulos en la etapa de dicitato llevan proyecciones laterales en
forma de ramas y bucles que replican activamente ácido ribonucleico
(ARN). Se parecen mucho a los cromosomas "plumosos" que se
encuentran casi universalmente en huevos de vertebrados inferiores
y algunos invertebrados. El ARN puede actuar como el mensajero que
dirige la síntesis de proteínas dentro de los propios óvulos.
Pruebas circunstanciales de estudios de óvulos en ranas y sapos
sugieren que parte del ARN puede actuar como el organizador temprano
del desarrollo de mamíferos. Cualquiera que sea el resultado de los
estudios adicionales requeridos para aclarar estos complejos
problemas, la etapa de dicitato no debe denominarse claramente en
lo sucesivo como fase de reposo ya que los ovocitos muestran un
alto grado de actividad metabólica y sintética en el momento en el
que la envoltura folicular está constituida por sólo unas pocas
células epiteliales pavimentosas.
El desarrollo de ovocitos/folículos humanos es
un mecanismo controlado tanto en el tiempo como en los procesos
biológicos. El 99% de todos los óvulos se detiene en la profase
meiótica (es decir, la etapa de dicitato) incluso antes del
nacimiento. De este conjunto, un par de cientos de óvulos se
seleccionan y se activan cada mes (el ciclo menstrual) para
posterior desarrollo que es la reanudación de la meiosis mediante la
rotura de la vesícula germinal (GVB) y metafase I
(MF-I) a metafase II (MF-II) y
crecimiento del folículo.
El estado reproductor de la hembra humana es
cíclico con una compleja interacción entre el hipotálamo, la
adenohipófisis y los ovarios que eventualmente conduce al proceso de
ovulación. El ciclo se repite con un periodo promedio de
28-30 días (intervalo de 25-35
días). La primera fase, la menstruación, dura 4-5
días. El primer día de un ciclo es el primer día de la primera
fase, es decir, el primer día del sangrado menstrual. La segunda
fase folicular del ovario se corresponde con la fase proliferativa
del endometrio y dura 10-16 días (es decir, muy
variable). Entonces sigue una fase ovulatoria (36 horas) y
finalmente una fase luteínica que se corresponde con la fase
secretora del endometrio y es normalmente constante a 14 días. Tres
componentes críticos para el entendimiento del ciclo menstrual:
1. Control de GnRH hipotalámica de la liberación
de HEF/HL,
2. desarrollo folicular ovárico para la
ovulación y posterior formación del cuerpo lúteo y
3. el control de retroalimentación de secreción
de HEF/HL por hormonas ováricas.
Durante la segunda mitad del ciclo reproductor,
el cuerpo lúteo se desarrolla y secreta tanto estrógeno como
progesterona. El estrógeno continúa estimulando la actividad
proliferativa en el endometrio. La progesterona, por otra parte,
hace que las glándulas endometriales se dilaten con productos de
secreción que incluyen glicógeno (importante para que se produzca
la implantación del embrión en desarrollo). El flujo de sangre
endometrial aumenta y las arterias espirales se enrollan y se
retuercen. La segunda mitad del ciclo se llama fase luteínica
(ovarios) o fase secretora (útero). Si la implantación no se
produce, entonces el cuerpo lúteo revierte, hay una rápida
disminución de la secreción de estrógeno y progesterona, el
endometrio experimenta encogimiento debido a la pérdida de fluido
extracelular, las arterias espirales se estrechan, el flujo de
sangre endometrial disminuye con muerte celular y destrucción de
vasos sanguíneos. Estos cambios conducen eventualmente a una fase
de sangrado menstrual en la que se pierden todas las capas del
endometrio excepto la basal. El primer día del sangrado menstrual
es, por razones prácticas, el primer día del ciclo menstrual.
La maduración del óvulo es la etapa final del
desarrollo del óvulo que se prepara para la fecundación y el
de-
sarrollo embrionario. Puede dividirse en dos procesos generales: maduración nuclear y maduración citoplasmática. La maduración nuclear se define como la reanudación de la meiosis y la progresión hasta la MF-II, mientras que la maduración citoplasmática se define como los cambios extragenómicos que preparan el huevo para la activación, formación pronuclear y embriogénesis temprana.
sarrollo embrionario. Puede dividirse en dos procesos generales: maduración nuclear y maduración citoplasmática. La maduración nuclear se define como la reanudación de la meiosis y la progresión hasta la MF-II, mientras que la maduración citoplasmática se define como los cambios extragenómicos que preparan el huevo para la activación, formación pronuclear y embriogénesis temprana.
El folículo que rodea los óvulos en la etapa de
dicitato comprende una única capa de células granulosas
pavimentosas. Los indicios de desarrollo posterior de los óvulos y
el folículo implican posterior multiplicación del número de células
granulosas y además el paso de fluido a los intersticios entre las
células granulosas. A medida que aumenta la cantidad de fluido, las
cavidades que ocupa aumentan en tamaño y confluyen para formar un
antro. Ahora se indica que el folículo es de tipo de De Graaf. Con
la posterior expansión del antro, el óvulo ocupa una posición en un
lado del folículo y está rodeado por dos o más capas de células
granulosas. La capa más interna de estas células se vuelve de forma
cilíndrica y constituye la corona radiante que, como la parte más
interna del cúmulo prolígero, persiste alrededor del huevo durante
un periodo después de la ovulación.
La maduración nuclear sucede en paralelo con el
desarrollo folicular. Por tanto, la GVB y los óvulos en
MF-I se observan durante la formación del antro que
está en el folículo antral y preantral. En el momento en que el
antro se desarrolla completamente, la división meiótica se completa
y se ve la primera extrusión del cuerpo polar.
Unos pocos cientos de óvulos llegan a esta etapa
durante cada ciclo menstrual. Sin embargo, debido a factores
actualmente no explicados, la mayoría de éstos entran en atresia,
experimentado los óvulos un proceso apoptótico y de muerte. La
disolución de la parte más interna de las células granulosas
mientras que el huevo está todavía en el folículo, o precozmente
después de su salida, es un claro indicio de que se están
produciendo cambios degenerativos que darán como resultado la
muerte de los óvulos. Sólo unos pocos, normalmente sólo 1,
continuarán el desarrollo.
Si la mujer recibe HEF, más de un folículo
continuará el desarrollo a MF-II evitando
atresia.
Por MF-II se entiende un ovocito
con 1 cuerpo polar, y complejo del cúmulo expandido y que finalmente
ha experimentado una rotura de la vesícula germinal. Estos ovocitos
son fácilmente reconocidos por un técnico de manera rutinaria que
normalmente manipula ovocitos para FIV. Los óvulos en
MF-II son el tipo de óvulos que se preparan y que
pueden ser fecundados por el espermatozoide. Actualmente ésto no es
posible en una etapa más temprana en el desarrollo de los
óvulos.
Los tratamientos de fecundación in vitro
(FIV) convencional están dirigidos a obtener tantos óvulos como sea
posible en MF-II. Esto se ha conseguido mediante
tratamiento hormonal exógeno de la mujer, que incluye hormona de
estimulación folicular (HEF). La HEFr, u HEF derivada de orina, se
administra en la dosis de 100 a 250 UI/día. Este tratamiento
continúa frecuentemente durante 8-10 días. Al
tratamiento se añade tratamiento adicional con agonistas de GNRH
tales como buserelina diaria. Mediante este tratamiento se evita la
degeneración de la mayoría de estos óvulos activados. Este tipo de
tratamiento hormonal siempre incluye el riesgo de síndrome de
hiperestimulación y otros efectos secundarios tales como el aumento
de riesgo de cáncer de ovario, náuseas, molestias, edema, dolor,
reacción alérgica a la medicación, depresión y aumento de peso,
siendo todos difíciles de justificar específicamente si la mujer
está sana y la razón para el tratamiento de FIV se debe a un
problema de infertilidad masculina grave. Por tanto, por el
momento, más del 30% de todos los ciclos de FIV en el mundo se
inician con fuerte medicación de las mujeres, aunque el problema sea
un factor masculino.
Con el fin de obtener óvulos
MF-II sanos, el tratamiento hormonal de la mujer se
complementa con el control de los niveles hormonales en suero de
estradiol, HEF, HL, progesterona, PP14 y/o PP12. El momento adecuado
de la aspiración de óvulos en MF-II sanos se ha
ayudado adicionalmente por ecografía del desarrollo folicular.
Todas estas pruebas clínicas se han creado para aumentar la salud y
el número de óvulos en MF-II reclutables.
La MIV empieza preferentemente con gametos
inmaduros o no completamente maduros. En la mujer, los óvulos se
reconocerán como ovocitos con una escasa masa de cúmulo, cuerpos no
polares o vesículas germinales visibles. Estos óvulos son
fácilmente reconocidos por una persona que participa en tratamientos
de FIV rutinarios como óvulos inmaduros.
Si no se administran hormonas, sólo madurará un
ovocito como se ve en mujeres con ovulación normal. Mediante la
liberación de ovocitos inmaduros del ovario antes de iniciarse los
procesos apoptóticos por los que los óvulos entran en atresia, y
posterior maduración de los óvulos in vitro, las mujeres
pueden evitar el riesgo y las molestias asociadas con el
tratamiento hormonal y todavía estará disponible un número
suficiente de óvulos en metafase II (MF-II) maduros
para posterior fecundación in vitro.
Ha sido posible producir ovocitos cuya
maduración nuclear ha progresado a MF-II, pero que
son incompetentes para completar el desarrollo de preimplantación.
La importancia del control citoplasmático respecto a la competencia
para el desarrollo se ha descrito en el ovocito inmaduro de mono.
Usando micromanipulación se extrajo ovoplasma de ovocitos en
MF-II y se inyectó en ovocitos en profase I. Los
monos que recibieron los ovocitos con transfusión citoplasmática
tuvieron un aumento de siete veces en la tasa de embarazo en
comparación con los ovocitos sin inyección de ovoplasma (Flood).
Hasta la fecha, los protocolos de MIV publicados
han usado bien un día fijo del ciclo menstrual, calculado a partir
de la ovulación previa o la aparición de menstruos, o bien
precisamente han usado un día conveniente antes del desarrollo
final de los folículos antrales. Esto ha obtenido tasas de embarazo
del 0%-10%.
Ambos Goudet, Biology of Reproduction, vol. 58,
pág. 760-768 (1998) y Goudet, Biology of
Reproduction, vol. 60. pág. 1120-1127 (1999)
desvelan que los niveles de hormonas en menstruos son indicativos
del éxito de MIV.
La presente invención se basa en el hallazgo de
que la medición de hormonas de señalización específicas será
indicativa del momento adecuado apropiado de aspiración de óvulos
para un procedimiento de MIV. Esta medición que es indicativa del
momento adecuado de aspiración de óvulos optimizará el número de
óvulos específicamente capaces de maduración posterior in
vitro, fecundación y posterior desarrollo. La identificación de
hormonas de señalización específicas como marcadores predictivos de
cuándo los óvulos no fecundables capaces de maduración in
vitro y posterior fecundación, segmentación, implantación y
embarazo están presentes en el mamífero aumenta enormemente la tasa
de éxito en ciclos de MIV.
Un óvulo no fecundable en esta solicitud de
patente es un óvulo inmaduro (= ovocito) que en contacto con un
espermatozoide maduro no completará la división meiótica y aceptará
el material genético del espermatozoide y formará una célula
fecundada. Actualmente se anticipa que la regulación endocrina e
intraovárica de la maduración de óvulos dejará los óvulos con una
composición precisa, pero compleja, de sustancias con
concentraciones o relaciones de concentración específicas de forma
que los óvulos no fecundables después de la maduración in
vitro a MF-II podrán fecundarse, posteriormente
segmentarse y luego dar lugar al embarazo tras implantación en el
mamífero hembra.
Por tanto, un aspecto de la invención se refiere
al uso de un ensayo como se define en la reivindicación 1.
El ensayo para la al menos una hormona
predictiva se basa en una muestra de un mamífero hembra. En una
realización de la invención la muestra es una muestra seleccionada
del grupo que está constituido por, por ejemplo, secreción
corporal, fluido corporal, nutrientes celulares, contenido de
folículo, esputo, sangre, orina, heces, secreciones y componentes
uterinos o vaginales, productos de menstruación, epitelios y
componentes derivados de epitelios, componentes de la piel y
células muertas o vivas. Un experto en el estado de la técnica
entenderá fácilmente cómo se obtiene cada una de estas
muestras.
En una realización de la presente invención, la
muestra se origina en un mamífero, tal como una mascota, por
ejemplo gato, perro o cobaya; o un animal de zoológico, por ejemplo
un primate. En otra realización de la invención, el mamífero es un
animal de laboratorio tal como una rata o un ratón. En otras
realizaciones preferidas, el mamífero es parte de la industria,
preferentemente un animal de granja tal como ganado, un caballo,
cerdo, visón, cabra u oveja. En la realización actualmente más
preferida el mamífero es un ser humano.
En un aspecto de la invención, el mamífero
hembra se prueba antes de la aspiración de óvulos. Posiblemente se
realiza más de una prueba. O bien un nivel de corte absoluto o una
medida relativa tal como una meseta, un aumento o una disminución
del marcador selectivo anteriormente mencionado puede predecir el
momento adecuado de la aspiración de óvulos para MIV.
En este contexto, un marcador de hormona
predictiva debe entenderse como cualquier hormona que cambiará la
concentración, color, estructura, confirmación y/o modelo de
reacción en una prueba biológica, física o química. Debe entenderse
que existen muchos posibles marcadores predictivos. En una
realización de la invención, el ensayo es un ensayo en el que el al
menos un marcador predictivo es una hormona seleccionada del grupo
que está constituido por gonadotropinas (tales como HEF, HL,
prolactina y HCG), hormonas tiroideas (tales como HET, T3 y T4) y
hormonas esteroides (tales como hormonas sexuales: estradiol,
estrógeno, estratriol, progesterona y testosterona; andrógenos:
cortisona o cortisol). En otra realización de la invención el ensayo
es un ensayo en el que el al menos un marcador predictivo es una
hormona de péptido pequeño (tal como GIP o VIP). En otra
realización de la invención el ensayo es un ensayo en el que el al
menos un marcador predictivo es una hormona peptídica (tal como
PP12, PP14, una inhibina: inhibina A o inhibina B: activina, o
globulinas \alpha 1 o \alpha 2). Fuera del alcance de la
invención, el ensayo es un ensayo en el que el al menos un marcador
predictivo es un lípido seleccionado del grupo que está constituido
por lípidos y prostaglandinas de esteroles que activan la meiosis
(MAS) o un ácido nucleico seleccionado del grupo que está
constituido por fragmentos de ADN, ARNm y ARNt o el al menos un
marcador predictivo es un marcador seleccionado del grupo que está
constituido por LFN1, LFN2, LFN3, glucoconjugados, carbohidratos,
nutrientes celulares, integrinas tales como integrina 1, y epítopes
de carbohidrato o en el que el al menos un marcador predictivo es un
mensajero intra o intercelular tal como AMPc o en el que el al
menos un marcador predictivo es una enzima, tal como fosfodiesterasa
o un inhibidor de fosfodiesterasa.
Debido a la elevada complejidad de la
interacción entre y entre medias de proteínas, hormonas, lípidos,
ácidos nucleicos, mensajeros intercelulares y enzimas, actualmente
se anticipa que el momento adecuado de la aspiración de óvulos no
fecundables debe depender de combinaciones de niveles de corte de
ciertos marcadores predictivos y/o mediciones relativas en uno o
más marcadores predictivos, es decir, mediciones relativas del mismo
marcador cuando las muestras se han tomado en momentos diferentes,
o mediciones relativas de dos o más marcadores presentes en una
muestra en el mismo momento.
El ensayo comprende al menos un marcador
predictivo. Es decir, dos marcadores predictivos tales como tres,
cuatro, cinco o seis marcadores predictivos.
Es más que probable que el valor predictivo del
ensayo aumente notablemente si se combina la evaluación de dos o
más marcadores predictivos.
Basado en la descripción en los ejemplos 1 y 2
sobre cómo la correlación entre los dos marcadores predictivos
inhibina A y estradiol guarda relación con el resultado del ciclo de
MIV, el experto en el estado de la técnica podrá determinar tales
correlaciones entre otros marcadores predictivos. En una
realización, hay una correlación significativa entre la
probabilidad de embarazo en ese ciclo y el aumento relativo, o
disminución relativa, en la concentración del marcador predictivo
sujeto a investigación en la muestra del día 1, día 2, día 3, día
4, día 5, día 6, día 7, día 8, o incluso el día 9 antes del día de
la aspiración de óvulos. En otra realización hay una correlación
significativa entre la probabilidad de embarazo en ese ciclo y el
aumento absoluto, la disminución absoluta, o la meseta en la
concentración del marcador predictivo sujeto a investigación en la
muestra del día 1, día 2, día 3, día 4, día 5, día 6, día 7, día 8,
o incluso el día 9 antes del día de la aspiración de óvulos. En
otra realización más hay una correlación significativa entre la
concentración del marcador predictivo sujeto a investigación en la
muestra en el día 1, día 2, día 3, día 4, día 5, día 6, día 7, día
8, o incluso el día 9 y la probabilidad de embarazo en ese ciclo. En
un aspecto de esta realización, la correlación significativa entre
la concentración del marcador predictivo sujeto a investigación en
la muestra y la probabilidad de embarazo en ese ciclo se reduce a
una correlación binaria de forma que se fija un nivel de corte, y
la probabilidad de embarazo en ese ciclo guarda relación con si la
concentración del marcador predictivo sujeto a investigación es
superior o inferior al nivel de corte.
En una realización de la invención, la tasa de
embarazo en un estudio de ciclos de MIV en el que el momento para
la aspiración de óvulos se ha fijado mediante un ensayo como se
describe en la presente invención es superior al 10%, tal como
superior al 13%, 15%, 18%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%,
28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35% o incluso superior al
40%.
En una realización actualmente preferida de la
presente invención se eligen dos marcadores predictivos. Es decir,
inhibina A y estradiol. Como se ilustra en los ejemplos 1 y 2, un
aumento en estradiol e inhibina A predice el éxito del ciclo de
MIV.
Algunas veces se observará que el aumento en
estradiol se ve antes del aumento en inhibina A. En ese caso, la
concentración de estradiol puede disminuir, o alcanzar una meseta,
en el momento en que se observa el aumento en inhibina A. En este
caso se sigue considerando que se ha alcanzado un aumento en
estradiol de forma que la probabilidad de éxito es alta debido al
hecho de que el aumento en inhibina A es el factor principal. Esto
es especialmente el caso cuando se realiza cebado con HEF (véase el
ejemplo 3).
En la realización actualmente más preferida de
la presente invención, el ensayo comprende tres reacciones
específicas y resultados de dos marcadores selectivos. La primera
reacción específica es una medición de la concentración de inhibina
A inferior a 10 pg/ml en una muestra de sangre en el día 3 del ciclo
menstrual. La segunda reacción específica y el resultado es un
aumento en la concentración de inhibina A superior al 80% desde el
día 3 hasta el día de la aspiración de óvulos. La tercera reacción
específica y el resultado es un aumento en la concentración de
estradiol superior al 87% desde el día 3 hasta el día de la
aspiración de óvulos. Por tanto, en un aspecto de la realización, a
la mujer se le tomará una muestra de sangre en el día 3 del ciclo
menstrual y se determinan las concentraciones de inhibina A y
estradiol en la muestra de sangre. Si la concentración de inhibina
A es inferior a 10 pg/ml en dicha muestra de sangre, este ciclo no
será un ciclo de MIV. Sin embargo, si la concentración de inhibina
A es superior a o igual a 10 pg/ml en dicha muestra de sangre, se
tomará una nueva muestra de sangre en el día 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15 y 16, a menos que se hayan observado la segunda
reacción específica y la tercera reacción específica. Si se observan
la segunda reacción específica y/o la tercera reacción específica,
el día de la observación debe ser el día en el que se aspiren los
óvulos. Se contempla, basado en los resultados del ejemplo 2, que
los ciclos de MIV en los que el momento para la aspiración de
óvulos ha cumplido estas tres reacciones específicas tendrán tasas
de embarazo superiores al 12%, tales como superiores al 16%, 22%,
25%, 26% o incluso superiores al 28%.
Como apreciará el experto en el estado de la
técnica, las mediciones de marcadores predictivos en muestras de
mamíferos son medidas rutinarias. En un aspecto de la invención, el
ensayo se prepara de tal forma que la reacción específica puede
compararse y compilarse sin la ayuda de médicos o equipo médico
avanzado. Sin embargo, como entenderá el experto en el estado de la
técnica, unos cuantos de los marcadores predictivos no pueden
medirse actualmente sin equipo caro haciendo necesario transferir la
muestra a un ámbito de laboratorio, en el que el resultado del
ensayo guiará el momento adecuado de aspiración de óvulos en el
mamífero.
Debido a la complejidad de las concentraciones,
aumentos relativos, disminuciones relativas, aumentos absolutos,
disminuciones absolutas, valores de meseta y de corte, durante la
producción del ciclo menstrual puede rellenarse un esquema en el
que se contemple el tratamiento de MIV. En una realización el
esquema comprende columnas para cada día del ciclo menstrual y
filas para cada uno de los marcadores predictivos, de forma que cada
celda pueda rellenarse cuando se obtengan las mediciones de los
marcadores predictivos. Los cálculos automatizados,
semiautomatizados y manuales guiados de las alteraciones en los
marcadores predictivos facilitarán la interpretación de los
resultados de las reacciones específicas.
En una realización, el ensayo para marcadores
predictivos se usa como un primer criterio de selección. Si este
criterio se satisface, la mujer se someterá a mediciones
ultrasónicas del útero y los ovarios. Si la evaluación de las
mediciones ultrasónicas determina:
- un gran número de folículos antrales,
- el tamaño del folículo principal es
aproximadamente 10 mm,
- la cohorte de folículos es uniforme,
- el espesor endometrial es superior a
aproximadamente 3 mm, y
- inicio de estructuras trilaminares del
revestimiento endometrial
la probabilidad de haber encontrado el momento
adecuado para la aspiración satisfactoria de óvulos, maduración
in vitro a MF-II, fecundación, implantación y
embarazo es muy alta.
En una realización actualmente preferida de la
presente invención, el óvulo deriva de una hembra humana que tiene
un folículo ovárico con un diámetro de 8-12 mm. La
ventaja de folículos tan pequeños es que están presentes en números
sustanciales en este momento en el ciclo menstrual sin previo
tratamiento hormonalmente fuerte, pueden verse por ultrasonidos y
es posible realizar una punción transvaginal guiada por ultrasonidos
de los folículos con el fin de recuperar los ovocitos.
El experto en el estado de la técnica entenderá
qué otros tamaños de óvulos deben aspirarse en otros mamíferos.
En una realización de la invención, el
conocimiento general del ciclo menstrual de las mujeres se incorpora
en el momento adecuado de la aspiración de óvulos. Por tanto,
normalmente la aspiración se realiza entre el día 6 y 17, es decir,
normalmente entre el día 9 y 11.
Por tanto, un procedimiento para determinar el
momento adecuado de aspiración de óvulos puede comprender las
siguientes etapas:
a) ensayar al menos un marcador predictivo en
una muestra de un mamífero;
en el momento en que el resultado de la reacción
específica en el ensayo en la etapa a) predice la presencia de
óvulos no fecundables capaces de maduración in vitro y
posterior fecundación en el mamífero
b) evaluar el tiempo respecto al primer día del
sangrado menstrual;
si el día está entre el día 6 y día 17 del ciclo
menstrual, entonces
c) evaluar una ecografía de los ovarios del
mamífero;
si el tamaño de los folículos está entre 8 mm y
12 mm y la cohorte de folículos es uniforme, entonces
d) evaluar una ecografía del útero del
mamífero;
si el espesor endometrial es superior a
aproximadamente 3 mm y se observa que se inician estructuras
trilaminares del revestimiento endometrial, el momento para la
aspiración de óvulos es adecuado. Sin embargo, si falla alguna de
las etapas anteriormente mencionadas, el ciclo probablemente es no
adecuado para MIV y la aspiración de óvulos debe posponerse hasta
el siguiente ciclo, cuando se repite el procedimiento.
La capacidad de los ovocitos MIV para completar
la meiosis y llegar a ser competentes para el desarrollo puede
potenciarse por cebado con HEF antes de la aspiración de ovocitos.
En MIV humana, una estimulación corta con HEF duplica el número de
ovocitos recuperados por paciente, además de aumentar la proporción
de ovocitos que logran MF-II después de 48 horas.
En una realización del presente procedimiento, la mujer se trata en
los días 3 y/o 4 y/o 5 del ciclo menstrual con hormonas tales como
HEF seguido por una retirada del tratamiento. En el ejemplo 3 se
observó un aumento de la tasa de maduración y tasa de segmentación
en el grupo de cebado con HEF con retraso entre la última inyección
y la aspiración en comparación con el cebado con HEF sin retraso.
En el grupo de cebado con HEF con retraso entre la última inyección
y la aspiración se observó un aumento de la tasa de maduración en
comparación con ovocitos sin estimular, pero no se afectó la tasa de
segmentación de los ovocitos en MF-II madurados.
Fue alta en ambos grupos. Una fase apoptótica temprana o una fase de
meseta artificial en el crecimiento folicular pueden imitar la
maduración folicular preovulatoria final en términos de competencia
para el desarrollo. De esta forma se obtiene una meseta artificial o
disminución del nivel de estradiol causando un proceso apoptótico
en el ovario que lleva a la señalización anteriormente mencionada
en el ovocito inmaduro. Se espera dicha disminución en el nivel de
estradiol aproximadamente el día 10 del ciclo de la menstruación.
La recuperación de ovocitos en mujeres sin estimulación hormonal
debe hacerse preferentemente en el día 10 del ciclo de la
menstruación ya que ese día está asociado estadísticamente con
numerosos ovocitos en profase.
La mujer se puede beneficiar de un tratamiento
inicial en los días 3, 4 y 5 en el ciclo menstrual con una hormona
tal como HEF seguido por una retirada del tratamiento. En esta pauta
de tratamiento, el nivel en sangre de estradiol en la mujer puede
controlarse con el objeto de seleccionar ovocitos en maduración,
medidos indirectamente por ningún folículo en crecimiento (pausa
del crecimiento). Los ovocitos apoptóticos precoces destinados a
ser apoptóticos se caracterizan porque se desprenden fácilmente del
ovario durante la punción de los folículos y tienen una masa de
cúmulo compacta. Entonces, en el momento en que se observa una
meseta o disminución en el nivel de estradiol, se realiza la
recuperación de ovocitos. Una meseta observada o disminución en la
concentración de estradiol se debe a un aumento previo en la
concentración de estradiol entre el día 3 del ciclo menstrual y el
día de la aspiración de óvulos. En una realización, el momento para
la aspiración de óvulos es el momento de un aumento en la
concentración de estradiol, es decir, antes de la meseta o
disminución en la concentración de estradiol. En otra realización
preferida, el control de la concentración de estradiol se
complementa adicionalmente con un control de la concentración
de
inhibina A.
inhibina A.
\vskip1.000000\baselineskip
Flood J, Chillik CF, van Uem
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\newpage
Debe entenderse que las cifras y ejemplos
descritos a continuación son ilustrativos de realizaciones de la
presente invención y la invención no pretende limitarse así.
\vskip1.000000\baselineskip
Un total de 83 mujeres con ciclo regular
derivadas a FIV/ICSI debido a que en el estudio se incluyeron factor
masculino y/o enfermedad tubárica. El estudio fue autorizado por el
comité ético local. Todas las mujeres participaron en el estudio
después de consentimiento por escrito.
Se controlaron los perfiles de hormonas
(gonadotropinas, inhibina A, inhibina B, estradiol y progesterona).
Los perfiles de hormonas se determinaron mediante RIA (Immuno 1,
Bayer), excepto los perfiles de inhibina A e inhibina B que se
determinaron mediante el procedimiento descrito por Groome
(1996).
La recogida de óvulos inmaduros se realizó el
día después de que pudiera detectarse un folículo de 10 mm mediante
ultrasonidos. Los inventores usaron una aguja de aspiración de Cook
Ltd descrita por Carl Wood. La presión de aspiración se redujo a
100 mmHg (13,33 KPa), suponiendo que el cúmulo inmaduro o huevo
pueda ser más susceptible a lesión mecánica, o la aguja en un
pequeño folículo pueda lesionar directamente el huevo si el huevo es
succionado enérgicamente de un pequeño volumen de fluido al extremo
de la aguja.
Los folículos se pincharon. Después de la
aspiración, la aguja se lavó con solución salina equilibrada de
Earl con Hepes y tampones de bicarbonato más heparina (100 UI/ml)
como se describe por Trounson y col.
Los aspirados foliculares se transfirieron en
tubos hasta el laboratorio y se lavaron en un filtro para embriones
con un tamaño de poro de 70 \mum. Los eritrocitos y otras células
pequeñas pasaron a través del filtro y los ovocitos y fragmentos
mayores de células se recogieron en placas de cultivo de Petri. Los
ovocitos inmaduros se identificaron y se clasificaron basándose en
la presencia o ausencia de células de cúmulo como o completamente
multilaminados, escasos o desnudos.
Los ovocitos se maduraron en medio de cultivo de
tejido 199 (TCM 199; Sigma) o BBEM (Medicult, Dinamarca)
complementado con piruvato de sodio 0,3 mM, HEF-rec
0,075 UI/ml (Gonal-F; Serono), hCG 0,05 UI/ml
(Profasi; Serono) y 1% de albúmina. Posteriormente, el medio se
complementó con estradiol 1 \mug/ml y un aumento de la
concentración de HSA (5%) o suero del paciente (10%) en lugar de
albúmina.
Los ovocitos se desnudaron con hialuronidasa
(IVF Science, Suecia) y pipeteado mecánico. El esperma móvil se
preparó mediante separación en gradiente de Puresperm^{TM} (Cryos,
Dinamarca) o mediante recuperación de espermatozoides móviles
"swim-up". Para ICSI, los ovocitos desnudados
se colocaron individualmente en gotas de 5 \mul de medio
Sperm-prep (Medicult, Dinamarca) y se colocaron 2
\mul de suspensión de esperma en una gota de 10 \mul de PVP
(IVF Science, Suecia). Todos los ovocitos en MF-II
se inseminaron mediante ICSI y luego se colocaron en gotas de 10
\mul de BBEM y se cultivaron en 5% de CO_{2} y aire humidificado
a 37ºC. Aproximadamente 10-20 h después de la
inseminación, los ovocitos se examinaron a 300X para la presencia
de pronúcleos como una medida de fecundación satisfactoria. Los
embriones se cultivaron hasta el día 2 o 3 (día 0 = día de la
inseminación), momento en el que los embriones adecuados (máximo de
2) se implantaron en las mujeres. Embriones adecuados son aquellos
que se segmentan.
\vskip1.000000\baselineskip
Las estadísticas descriptivas de los datos de 83
ciclos de tratamiento cuando los parámetros endocrinológicos
relevantes estaban disponibles se presentan en la tabla 1. Estos 83
ciclos de tratamiento resultaron en 10 embarazos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 1 muestra que el aumento en inhibina A
desde el día 3 es superior en ciclos en los que se produjeron
embarazos, que el aumento en estradiol no es significativo y que el
aumento en inhibina A multiplicado por el aumento en estradiol es
significativamente superior en ciclos en los que se produjeron
embarazos.
\newpage
Posteriormente se analizó la capacidad de
análisis de inhibina A en suero y estradiol solo para discriminar
entre ciclos de tratamiento productivos y no productivos. Para ese
fin se aplicaron diversos discriminantes y se determinó la
correlación estadística entre los datos y la probabilidad de
embarazo.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de una combinación de análisis de
inhibina A y Estradiol en suero para discriminar entre ciclos de
tratamiento productivos y no productivos.
-
100
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\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados anteriormente muestran que
el nivel de inhibina A en suero es un fuerte factor pronóstico de
éxito en ciclos de MIV. Estos datos muestran que no se produjeron
embarazos en ciclos en los que el nivel de inhibina A era superior
a 10 pg/ml en el día 3 del ciclo menstrual (tabla 2). Además, sólo
se produjo un embarazo en el grupo con inhibina A superior a 9
pg/ml en el día 3 del ciclo menstrual (tabla 3).
No sólo el nivel absoluto de inhibina A en el
día 3 es predictivo del éxito en el ciclo de MIV, sino también el
aumento de inhibina A en suero desde el día 3 hasta el día de la
recuperación de óvulos (OPU). Por tanto, un ciclo productivo guarda
una fuerte relación con un aumento de inhibina A en suero desde el
día 3 hasta el día de OPU de al menos el 80% (tabla 4 y tabla
5).
Los datos respecto a estradiol muestran que un
ciclo productivo guarda relación con un aumento en estradiol en
suero de al menos el 87% desde el día 3 hasta el día de OPU (tabla 6
y tabla 7).
El aumento concomitante de inhibina A y
estradiol en suero parece ser un factor pronóstico incluso mejor
para el éxito de MIV. Una combinación de un aumento en inhibina A y
estradiol desde el día 3 hasta el día de OPU es un factor
pronóstico muy bueno de un ciclo productivo (tabla 8, tabla 9 y
tabla 10). Por tanto, la predicción dirá la falta de éxito como
embarazos no producidos en ciclos sin un aumento de inhibina A
superior al 80% desde el día 3 hasta el día de OPU (tabla 11) y
embarazos no producidos en ciclos con un aumento en inhibina A y
sin aumento en estradiol (tabla 12).
El efecto predictivo de los parámetros
determinados en el ejemplo 1 usando un análisis de inhibina A y
estradiol para determinar que ciclos deben continuar a aspiración
de óvulos.
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Estos datos indican que los ciclos destinados a
ser no productivos pueden cancelarse basándose en mediciones de
inhibina A temprana en el ciclo de tratamiento e inhibina A y
estradiol tardío en el ciclo (tabla 13, tabla 14, tabla 15, tabla
16, tabla 17). Estas mediciones aumentarán enormemente la eficiencia
de un ciclo de MIV. Los datos recogidos hasta este punto indican
que cada paciente puede alternar entre ciclos con alta inhibina A
temprana en el ciclo (no se produce embarazo) y ciclos con baja
inhibina A temprana en el ciclo (embarazo).
La capacidad de ovocitos inmaduros para reanudar
espontáneamente la meiosis cuando se extraen del folículo se
demostró primero por Pincus y Enzman en 1935 Human oocytes from
small follicles can resume and complete meiosis in vitro,
but to a lesser extent than in others mammals (Edwards, 1965). Se ha
notificado maduración satisfactoria de ovocitos sin estimular (Cha
y col., 1991; Trounson y col., 1994; Barnes y col., 1996; Russell y
col., 1997) y pueden lograrse altas tasas de fecundación cuando
estos ovocitos se someten a inyección intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI) (Russell y col., 1997), pero se ha notificado
que el potencial de desarrollo es bajo (Cha y Chian, 1998; Barnes y
col. 1996). El protocolo de MIV es relativamente simple, con un
periodo de tratamiento más corto y costes reducidos en comparación
con la FIV convencional. Además, se eliminan los efectos
secundarios de la superovulación ovárica, especialmente el síndrome
de hiperestimulación. A pesar de la baja tasa de embarazo vista
hasta ahora en ensayos humanos, se ha intensificado el récord de
éxito en animales de laboratorio. En monos se ha mostrado que el
cebado con HEF potencia la maduración nuclear y citoplasmática de
ovocitos in vitro (Schramm y Bavister, 1994). El aumento de
niveles de HEF dentro del folículo coincide con la generación de
una señal positiva necesaria para completar la maduración de
ovocitos in vivo en seres humanos (Gomez y col., 1993) y se
ha demostrado que una corta estimulación con HEF aumenta el
porcentaje de ovocitos que llega a la metafase II (Wynn y col.,
1998) después de la maduración in vitro.
En este estudio piloto aleatorizado prospectivo
los inventores investigaron si el potencial de desarrollo de
ovocitos inmaduros madurados in vitro puede mejorarse
mediante cebado con HEF antes de la aspiración.
En el estudio se incluyeron parejas derivadas a
FIV/ICSI debido a factor masculino y/o enfermedad tubárica. Las
mujeres tenían al menos 18 y como máximo 38 años y tenían ciclos
ovulatorios normales con una duración media de entre 24 y 35 días y
un índice de masa corporal (IMC) entre 18 y 29 kg/m^{2}. Se
excluyeron todas las pacientes con infertilidad producida por
anomalías endocrinas tales como hiperprolactinemia, síndrome del
ovario poliquístico y ciclos de hiperestimulación ovárica controlada
previa en los que se recuperaron menos de tres ovocitos. También se
excluyeron todas las mujeres con elevado valor de HEF (>15 UI) en
el día del ciclo 3.
El estudio fue autorizado por el comité ético
local. Todas las parejas participaron en el estudio después de
consentimiento por escrito. El primer experimento fue un estudio
prospectivo aleatorizado que incluyó veinte pacientes reclutadas
entre parejas que tenían programada ICSI debido a factor masculino.
Las mujeres se asignaron aleatoriamente a dos grupos. El grupo I (n
= 10 ciclos) no recibió estimulación, el grupo II (n = 10 ciclos)
recibió HEF-rec (Gonal-F, Serono)
150 UI/día durante 3 días a partir del día 3. La aspiración se
realizó el día después de observarse un folículo principal de 10 mm
por ultrasonidos. Todos los ovocitos maduraron in vitro
durante 36 horas antes de ICSI.
En el segundo experimento consecutivo se
incluyeron doce parejas. Todas las mujeres recibieron cebado con
HEF-rec (Gonal F, Serono) antes de la aspiración y
diariamente se les administró 150 UI desde el día 3. Cinco
pacientes recibieron la misma estimulación que el grupo 2 del primer
experimento con una dosis fijada de 150 UI/día durante 3 días y la
aspiración el día después de observarse un folículo principal de 10
mm. Las siete pacientes restantes continuaron la estimulación hasta
que el folículo principal tuvo 10 mm y la aspiración se realizó 72
horas después. Todos los ovocitos se cultivaron durante 48 horas
hasta la fecundación con ICSI.
En todas las pacientes se realizó un examen por
ultrasonidos transvaginal en el día 3 del ciclo y se obtuvo una
HEF, HL, estradiol, inhibina A e inhibina B de referencia. Los
perfiles de hormonas se siguieron desde el día tres hasta el día de
la aspiración. En caso de quiste ovárico, el ciclo se canceló. El
segundo examen por ultrasonidos se realizó el día
6-7 y los siguientes días se realizaron ultrasonidos
diariamente o con un intervalo de 2-3 días
dependiendo del tamaño de los folículos.
En ambos experimentos, el cebado endometrial
estuvo constituido por
17-\beta-estradiol iniciado el día
de la recuperación de ovocitos y las mujeres recibieron 2 mg por
vía oral tres veces por día. No se aceptó un espesor endometrial
<6 mm en ultrasonidos el día de la aspiración. Dos días después
de la aspiración se inició tratamiento con supositorios de
progesterona intravaginal y se continuó hasta la prueba del
embarazo. Se continuó con estrógeno y progesterona si la prueba de
embarazo era positiva hasta 50 días de gestación.
La recuperación de ovocitos se realizó
transvaginalmente con una aguja Cook 17-G con una
presión de aspiración reducida como describen Trounson y col.
(1994). Los aspirados foliculares se transfirieron en tubos hasta
el laboratorio y se lavaron en un filtro para embriones con un
tamaño de poro de 70 \mum. La maduración y fecundación se
describe en detalle por Smith y col. (1998), pero en resumen los
ovocitos maduraron en medio de cultivo de tejido 199 (TCM 199;
Sigma, Roedovre, Dinamarca) complementado con piruvato de Na 0,3 mM,
1500 UI/ml de penicilina G, 50 mg/ml de sulfato de estreptomicina,
1 \mug/ml de estradiol (todos de Sigma), 0,075 UI/ml de
HEF-rec (Gonal-F; Serono), 0,5 UI/ml
de hCG (Profasi; Serono) y suero del paciente (10%). El suero de
las pacientes se obtuvo el día de la aspiración. Los ovocitos se
cultivaron por separado en gotas de 25 \mul de medio de MIV en
aceite de parafina a 37ºC en 5% de CO_{2}. Un ovocito se clasificó
como que había sufrido rotura de la vesícula germinal cuando la
membrana nuclear estaba ausente y se clasificó como un ovocito en
metafase II (MII) maduro cuando se extruyó el primer cuerpo
polar.
polar.
La fecundación con ICSI se realizó en todos los
ovocitos en metafase II. A continuación, los ovocitos se colocaron
en gotitas de 10 \mul de medio de FIV (Medicult, Copenhague,
Dinamarca) y se cultivaron en aceite en placas de Petri Falcon
hasta el día 2 después de la fecundación. Los embriones se puntuaron
en una escala de 1-4 en la que los tipos 1 y 2
(<10% de fragmentación) se consideraron que eran transferibles
(Deschacht y col. 1988). Se transfirieron un máximo de dos
embriones. La tasa de desarrollo embrionario se definió como el
número de embriones transferibles del número total de ovocitos
inyectados. La tasa de implantación se definió como el número de
sacos gestacionales vistos en examen por ultrasonidos del número
total de embriones implantados.
\vskip1.000000\baselineskip
El mismo observador midió los diámetros
foliculares durante el barrido por ultrasonidos transvaginal usando
un transductor transvaginal de 7,5 Mhz (Brüel & Kjaer). El
diámetro folicular se calculó como la media del eje folicular más
largo y el eje perpendicular a él en el mismo plano de barrido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis estadísticos se hicieron mediante
la prueba de la t de Student. Como ninguna de las variables de las
hormonas mostró una distribución normal, se usó la prueba de U de
Mann-Whitney no paramétrica para analizar
diferencias estadísticamente significativas entre datos
independientes y la prueba de Pratts para datos dependientes. Los
valores se consideraron significativos cuando p<0,05.
En el experimento 1, la mediana de edad de las
mujeres era 31 años (intervalo 28-36 años) en el
grupo sin cebado con HEF y 32 años (intervalo 28-36
años) en el grupo que recibió HEF. Esto no se diferenció de la edad
de las mujeres en el experimento 2 (mediana de 32 años (intervalo
27-37 años). Otras características clínicas,
incluyendo la duración de la infertilidad, causa de la infertilidad
y número de ciclos de FIV previos, fueron similares en todos los
grupos.
\vskip1.000000\baselineskip
En el primer experimento que incluyó 20 mujeres
pudieron usarse 77 ovocitos para MIV y 62 (81%) maduraron a
MF-II tras 36 horas. Después de la fecundación con
ICSI, la fecundación de 2PN se observó en 49 (79%) y de éstos se
segmentaron 45 (72%). La tasa de desarrollo embrionario fue 40/62
(65%) y la tasa de implantación 5/33 (15%). La tasa de embarazo
clínica por ciclo iniciado fue 5/20 (25%). Una paciente tuvo un
aborto en la octava semana de gestación, el resto siguieron. El
cebado con HEF no mostró tener ningún efecto en la maduración de
ovocitos, tasa de fecundación, tasa de segmentación ni en el
desarrollo embrionario (tabla 18). En total se obtuvieron cinco
embarazos. Una dio a luz un niño sano, una tuvo un aborto en la
octava semana de gestación, el resto siguieron más allá de 32
semanas de gestación.
\vskip1.000000\baselineskip
No hubo diferencias entre los dos grupos
respecto de los niveles de estradiol, HEF, HL, inhibina A e inhibina
B en el día tres y el día de la aspiración, respectivamente (tabla
19). En el grupo no estimulado, los niveles de HEF durante la fase
folicular no se diferenciaron de los valores del grupo estimulado,
aunque se observó una gran variación interindividual. El nivel de
estradiol en suero permaneció al mismo nivel desde el día tres
hasta el día 6-7 en el grupo sin estimulación. El
día de la aspiración se vio un aumento significativo. En el grupo
estimulado, la concentración de estradiol aumento antes (día
6-7) con una fase de meseta antes de la aspiración.
No se observó pico de HL prematuro en los dos grupos.
Los niveles de inhibina A mostraron el mismo
modelo que el nivel de estradiol con un aumento temprano en el
grupo estimulado y un aumento tardío en el grupo no estimulado. En
el grupo no estimulado, el nivel de inhibina B aumentó antes que la
inhibina A (día 6-7). En este momento también se
observó un aumento en el grupo estimulado, pero el nivel fue 3
veces el grupo no estimulado y se observó una disminución
significativa en inhibina B desde el día 6-7 hasta
la aspiración.
\vskip1.000000\baselineskip
En el segundo experimento que incluyó 12 mujeres
pudieron usarse 38 ovocitos para MIV, y después de 48 horas habían
madurado 27 (71%) y se fecundaron mediante ICSI. La tasa de
fecundación y la tasa de segmentación fueron del 61% y del 53%,
respectivamente, y ésta no se diferenció de la tasa de fecundación y
la tasa de segmentación obtenidas en el experimento 1. Se
transfirieron quince embriones a 10 pacientes, ninguno se
crioconservó. Se obtuvo un embarazo con parto de una niña sana. El
desarrollo embrionario en este grupo fue del 56% y la tasa de
implantación del 7%. Mediante la prolongación del periodo de
estimulación a partir de una dosis fijada de 150 UI/día durante
tres días hasta 6 días hasta que los folículos fueron de 10 mm, los
inventores obtuvieron un aumento de tamaño de los folículos el día
de la aspiración y un aumento de nivel de estradiol en suero, pero
el número de ovocitos obtenidos por aspiración no aumentó (tabla
20).
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio no se observó hospitalización
debido a infección, hemorragia o dolor abdominal aludido como
ginecológico. No se observó embarazo extrauterino.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el conocimiento de los inventores, este es
el primer estudio que notifica una tasa de embarazo del 25% por
aspiración con una tasa de implantación del 15% después de
maduración in vitro de ovocitos. Aparentemente, los ovocitos
inmaduros en este estudio se comportaban casi tan bien como aquellos
recuperados después de la superovulación y maduración in
vivo (Meldrum y col., 1998).
El número de ovocitos recuperados de mujeres con
ciclo regular no estimulado no se diferenció del rendimiento de
ovocitos recuperados y madurados en el estudio de Barnes y col.
(1996). El pretratamiento de pacientes con HEF recombinante no
aumentó el número de ovocitos recuperados. Estudios previos habían
dado resultados contradictorios. Wynn y col. (1998) notificaron un
aumento del número de ovocitos recuperados en mujeres con
menstruaciones regulares con cebado con HEF en comparación con
mujeres sin cebado con HEF, mientras que Trounson y col. (1998) no
demostraron ninguna diferencia en el número de ovocitos obtenidos.
Observaciones previas habían sugerido que el número de folículos
reclutables se fija ya en la fase luteínica precedente (Gougeon y
Testart, 1990) y una corta estimulación de HEF temprana no altera el
número de ovocitos inmaduros reclutables. Esto está de acuerdo con
los resultados del presente estudio. Con cantidad creciente de HEF y
tamaño creciente de los folículos en el experimento 2, los
inventores observaron que no aumentó la probabilidad de obtener
ovocitos en la aspiración. Esto está en concordancia con
publicaciones previas (Templeton y col.), en las que la
probabilidad de obtener ovocitos a partir de estos folículos grandes
en ausencia de hCG era muy baja.
Las tasas de maduración, fecundación y
segmentación observadas en el presente estudio concuerdan con los
hallazgos de estudios previos, pero los inventores observaron una
mayor tasa de embarazo y una mayor tasa de implantación que indican
una mejora del desarrollo embrionario de los ovocitos. Varios
factores pueden explicar esto. El desarrollo embrionario de
ovocitos de MIV puede mejorarse mediante previo cebado con HEF. En
monos Rhesus, un corto cebado con HEF mejoró la tasa de maduración
y segmentación (Schram y Bavister, 1994). En seres humanos se han
obtenido embarazos tras la transferencia de ovocitos inmaduros de
ciclos estimulados (Nagy y col., 1996, Liu y col., 1997; Jaroudi y
col., 1997; Edirisinghe y col. 1997).
Recientemente, Wynn y col. (1998) han notificado
un aumento de la tasa de maduración de ovocitos después del
pretratamiento con HEF. Sin embargo, en el primer experimento, el
cebado con HEF de las mujeres antes de la recogida de ovocitos no
mejoró la tasa de maduración in vitro. Hay dos posibles
explicaciones para la diferencia observada: (1) las condiciones de
cultivo usadas o (2) el momento adecuado de aspiración. El momento
adecuado de fecundación y las condiciones de cultivo son factores
importantes, y éstos han sido tratados por Smith y col., 1999. La
aspiración de ovocitos se realizó en un día fijo (día 7 del ciclo
menstrual) en el estudio de Wynn y col., mientras que el día de la
aspiración en el presente estudio dependió del tamaño de los
folículos. En el grupo estimulado el día de la aspiración se realizó
antes (día medio 9) en comparación con el grupo no estimulado (día
medio 10) (tabla 19), pero el día de la aspiración se fijó del mismo
modo en los dos grupos. El tamaño de los folículos se controló por
ultrasonidos y la recogida de ovocitos se realizó el día después de
demostrarse un folículo principal de 10 mm.
No se realizó fecundación de ovocitos de MII en
el estudio de Wynn y col. (1998). En el presente estudio, el cebado
con HEF no tuvo ningún efecto en la tasa de fecundación ni en la
tasa de segmentación. Esto concuerda con los datos de Trounson y
col. (1998). Han notificado que el tratamiento de mujeres con ciclo
natural con HEF recombinante durante 3 días no tuvo efecto en la
tasa de maduración y la tasa de fecundación in vitro. El
presente grupo de mujeres con menstruación regular, su propia
estimulación con HEF pareció ser suficiente para obtener ovocitos
que eran competentes para madurar in vitro. Los inventores
conocen estudios previos en los que se ha demostrado una amplia
diferencia interindividual en HEF de fase folicular en el día 3 y
marcada variación interindividual de la concentración máxima de HEF
(Schipper, y col., 1998). Esta variación interindividual en los
niveles de HEF puede reflejar diferencias en el umbral de HEF y
diferencias en la sensibilidad ovárica a HEF y esto puede ser una
de las posibles razones de la falta de diferencia en la tasa de
maduración y la tasa de fecundación aunque se diferencie el nivel
de HEF.
En el grupo no estimulado los inventores
observaron un aumento en las concentraciones de estradiol e inhibina
A en suero el día de la aspiración y se sabe que esto es
concomitante con la selección del folículo dominante (Schipper y
col., 1998). La concentración de inhibina B aumentó antes que la
inhibina A y el nivel de ambas hormonas se mantuvo hasta el día de
la aspiración. Esto es según estudios previos (Schipper y col.;
1998, Groome y col., 1996) y según las imágenes de ultrasonidos de
los inventores ya que el día de aspiración era justamente después
de que se hubiera demostrado el folículo dominante a 10 mm. Esto
implica que los ovocitos seleccionados para MIV en estos casos se
obtuvieron de folículos destinados a entrar en atresia y los
inventores observaron que el desarrollo embrionario de ovocitos no
estaba afectado adversamente por fases tempranas de atresia. Esto
se ha demostrado previamente en ganado (Smith y col., 1996).
La producción tanto de inhibina A como de
inhibina B depende de la gonadotropina (Lockwood y col., 1996) y en
el grupo estimulado con gonadotropina en el presente estudio se
observó un aumento de tres veces en los niveles tanto de inhibina A
como de inhibina B durante la estimulación con HEF. A partir del día
6-7 hasta la aspiración, los niveles tanto de
inhibina A como de inhibina B disminuyeron significativamente y esta
observación es según folículos que no están crecimiento (Price y
col., 1995).
El momento adecuado de aspiración y la selección
de ovocitos para MIV se basa en la experiencia con otras especies
de mamíferos (Eppig y col.; 1992; Edwards 1965), pero también parece
que los ovocitos humanos tienen un tamaño dependiente de la
capacidad para reanudar la meiosis y completar la maduración
(Durenzi y col., 1995). Tsuji y col., 1985 encontraron una tasa de
maduración disminuida de ovocitos a partir de folículos pequeños
(3-4 mm) en comparación con ovocitos de folículos
mayores (9-15 mm). Dubey y col. (1995) también
observaron un descenso en las tasas de fecundación de ovocitos a
partir de folículos de superovulación de tamaño decreciente.
Mientras que se fecundó el 58% de los ovocitos de folículos de
10-14 mm, lo hizo el 74% de ovocitos de folículos
de 22-26 mm. En el presente estudio los inventores
observaron que los ovocitos de folículos grandes en el segundo
experimento con estimulación con gonadotropina a alta dosis fueron
competentes para madurar y segmentarse (tabla 20), pero también los
ovocitos de folículos en el tamaño de 8-10 mm fueron
competentes para el desarrollo cuando la aspiración se realizó
después de que se demostrara el folículo principal en ultrasonidos.
Russell y col. (1998) han experimentado una espectacular disminución
en las tasas de maduración y fecundación cuando los ovocitos
inmaduros se aspiraron cuando el tamaño del folículo dominante
excedía 14 m. Esto indica que puede haber un punto crítico en el
que el proceso de selección pueda tener un efecto negativo en los
folículos existentes. El control del diámetro de los folículos puede
demostrar ser útil como un medio práctico para seleccionar ovocitos
competentes para maduración in vitro. Factores distintos del
tamaño del folículo parecen limitar la eficiencia del sistema de
MIV. El cebado del endometrio es otro factor importante. En un
ciclo de ovocitos inmaduros falta estradiol endógeno adecuado del
folículo dominante. Por tanto, se necesita cebado exógeno y debe
sincronizarse la ventana de implantación con el desarrollo
embrionario (Russell y col., 1997) encontraron un aumento de la
tasa de maduración y la tasa de fecundación cuando se inició cebado
folicular medio con estradiol en comparación con cebado endometrial
temprano. Los inventores conocen del reemplazo con hormonas en
receptores de ovocitos de donantes que embriones de dos días se
transfieren mejor a la cavidad endometrial en el día 3º ó 4º de
exposición a progesterona (Rosenwaks y col., 1987). Los inventores
aspiraron a imitar el cebado normal tan fielmente como fuera
posible e iniciaron el estradiol el día de la aspiración y lo
complementaron con progesterona dos días después. Puede esperarse
que en ciclos con cebado con HEF la elevada concentración de
estradiol desde el día 6-7 pueda preparar mejor el
endometrio que en ciclos no estimulados en los que el estradiol
aumentó justo antes de la aspiración. Los inventores no pudieron
demostrar ninguna diferencia en la tasa de implantaciones entre los
dos grupos y esto es según estudios previos debido a que no se ha
encontrado correlación entre la concentración de estradiol en suero
en la fase folicular y la tasa de implantación (Younis y col.;
1996, Remohi y col., 1997).
Estos resultados necesitan confirmarse en un
mayor número de pacientes. Podrían llevar a una atractiva
alternativa a la hiperestimulación ovárica controlada para la
fecundación in vitro. Además de los beneficios clínicos de
disminuir los efectos secundarios, especialmente la eliminación de
síndrome de hiperestimulación, este tratamiento puede reducir
costes de FIV. Edwards y col., 1997 han cuestionado recientemente el
frecuente uso de fármacos para estimulación ovárica. Se han hecho
muchos intentos por realizar la FIV en el ciclo natural sin el uso
de gonadotropinas exógenas. La combinación de recuperación de
ovocitos inmaduros y MIV puede potenciar el éxito de la FIV en el
ciclo natural. En FIV/ICSI, debido al factor masculino, la mayoría
de las mujeres están produciendo su propia HEF para ayudar la
estimulación de folículos ováricos, y esto puede utilizarse en MIV.
En este estudio no pudo demostrarse el beneficio de cebado con HEF a
baja dosis en comparación con el ciclo natural en el desarrollo
embrionario. Sin embargo, se necesitan más estudios para aclarar
este tópico.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (12)
1. Uso de un ensayo para detectar la
concentración de al menos una hormona en una muestra de un mamífero
para la predicción de si la probabilidad de maduración in
vitro satisfactoria y posterior fecundación es alta o baja en
un ciclo dado.
2. Uso según la reivindicación 1, que comprende
determinar el aumento o la disminución relativa en la concentración
de una hormona en muestras tomadas en diferentes momentos.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que la
predicción incluye cuando óvulos no fecundables capaces de
maduración in vitro y posterior fecundación, segmentación,
implantación y embarazo están presentes en el mamífero.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que la muestra es una muestra seleccionada del
grupo que está constituido por secreciones corporales, esputo,
sangre, orina y secreciones uterinas.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que el mamífero es un primate, tal como un ser
humano.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que el aumento o la disminución relativa se
determina mediante un inmunoensayo y/o una reacción de PCR.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que se determina el aumento o la disminución
relativa de inhibina A.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que se determina el aumento o la disminución
relativa de estradiol.
9. Un procedimiento para determinar la
probabilidad de maduración in vitro satisfactoria y posterior
fecundación en un ciclo dado ensayando la concentración de al menos
una hormona en una muestra de un mamífero, comprendiendo el
procedimiento;
- probar una muestra para la presencia y
concentración de al menos una hormona; y correlacionar la
concentración con la capacidad de maduración in vitro y
posterior fecundación.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
que comprende determinar el aumento o la disminución relativa en la
concentración de una hormona en muestras tomadas en diferentes
momentos.
11. Un procedimiento según la reivindicación 9 ó
10, en el que la muestra es una muestra seleccionada del grupo que
está constituido por secreción corporal, esputo, sangre, orina y
secreciones uterinas.
12. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 - 11, en el que el mamífero es un primate, tal
como un ser humano.
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