ES2313799T3

ES2313799T3 - Anticuerpo monoclonal anti alfa-d(itgad) para su uso en el tratamiento de lesiones del snc causadas por traumatismo.

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Publication number: ES2313799T3
Application number: ES99960388T
Authority: ES
Inventors: Michael W. Gallatin; Monica Van Der Vieren
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2019-11-16
Also published as: JP2003534766A; WO2000029446A1; US20020062008A1; DK1131356T3; EP1131356A1; AU775300B2; DE69939551D1; PT1131356E; AU1727900A; HK1048478A1; ATE407953T1; CN1352651A; US6620915B2; EP1131356B1; CA2350391A1

Abstract

Uso de un anticuerpo monoclonal anti-alfa d ITGAD para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de déficit crónicos como resultado de inflamación en el sitio de una lesión del sistema nervioso central (SNC) causada por traumatismo.

Description

Anticuerpo monoclonal anti \alpha_{d}(ITGAD) para su uso en el tratamiento de lesiones del SNC causadas por traumatismo.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una clase de moléculas asociadas a membrana que participan activamente en la adhesión celular. Las integrinas son heterodímeros transmembrana que comprenden una subunidad \alpha en asociación no covalente con una subunidad \beta. Hasta la fecha, se han identificado al menos catorce subunidades \alpha y ocho subunidades \beta [revisado en Springer, Nature 346:425-434 (1990)]. Las subunidades \beta generalmente son capaces de asociarse con más de una subunidad \alpha y los heterodímeros que comparten una subunidad \beta común se han clasificado como subfamilias dentro de la población de integrinas.

Una clase de integrinas humanas, restringida a la expresión en glóbulos blancos, se caracteriza por una subunidad \beta_{2} común. Como resultado de esta expresión específica de células, estas integrinas se conocen comúnmente como la integrinas de leucocitos, Leu-CAM o leucointegrinas. A causa de la subunidad \beta_{2} común, una designación alternativa de esta clase es las integrinas \beta_{2}. La subunidad \beta_{2} (CD18) se ha aislado previamente en asociación con una de tres distintas subunidades \alpha, CD11a, CD11b o CD11c. El aislamiento de un ADNc que codifica CD18 humana se describe en Kishimoto, y col., Cell 48:681-690 (1987). En la nomenclatura WHO oficial, las proteínas heterodiméricas se conocen como CD11a/CD18, CD11b/CD18, y CD11c/CD18; en la nomenclatura común se conocen como LFA-1, Mac-1 o Mol y p150,95 o LeuM5, respectivamente [Cobbold, y col., en Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, pág. 788 (1987)]. Las subunidades \alpha CD11a, CD11b y CD11c de la integrina \beta_{2} humana han demostrado migrar en condiciones reductoras en electroforesis con pesos moleculares aparentes de aproximadamente 180 kD, 155 kD y 150 kD, respectivamente, y se han clonado los ADN que codifican estas subunidades [CD11a Larson, y col., J. Cell Biol. 108:703-712 (1989); CD11b, Corbi, y col., J. Biol. Chem. 263: 12403-12411 (1988) y CD11c, Corbi, y col. EMBO J. 6: 4023-4028 (1987)]. Se han identificado homólogos putativos de las cadenas \alpha y \beta de la integrina \beta_{2} humana, definidas por la similitud aproximada en el peso molecular, de forma variada en otras especies incluyendo monos y otros primates [Letvin, y col., Blood 61:408-410 (1983)], ratones [Sanchez-Madrid, y col., J. Exp. Med. 154: 1517 (1981)], y perros [Moore, y col., Tissue Antigens 36: 211-220 (1990)].

Los pesos moleculares absolutos de supuestos homólogos de otras especies han demostrado variar significativamente [véase, por ejemplo,Danilenko y col., Tissue Antigens 40: 13-21 (1992)], y en ausencia de información de secuencia, no ha sido posible una correlación definitiva entre las subunidades de integrina humana y las identificadas en otras especies. Además, se ha observado la variación en la cantidad de miembros en una familia de proteínas entre diferentes especies. Considérese, por ejemplo, que se han aislado más isotipos IgA en conejos que en seres humanos [Burnett, y col., EMBO J. 8: 4041-4047 (1989) y Schneiderman, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 7561-7565 (1989)]. Asimismo, en seres humanos, se han identificado previamente al menos seis variantes de la proteína metalotionina [Karin y Richards, Nature 299: 797-802 (1982) y Varshney, y col., Mol. Cell. Biol. 6: 26-37, (1986)], mientras que en ratones, solamente dos de dichas variantes están en evidencia [Searle, y col., Mol. Cell. Biol. 4: 1221-1230 (1984)]. Por lo tanto, la existencia de múltiples miembros de una familia de proteínas en una especie no implica necesariamente que existan los miembros de la familia correspondiente en otra especie.

En el contexto específico de las integrinas \beta_{2}, en perros se ha observado que el supuesto equivalente \beta_{2} canino a CD18 humana es capaz de formar dímeros con tantos como cuatro subunidades \alpha potencialmente distintas [Danilenko, y col., supra]. Los anticuerpos generados inmunizando ratones con esplenocitos caninos produjeron anticuerpos monoclonales que inmunoprecipitaban proteínas designadas no definitivamente como homólogos caninos de CD18, CD11a, CD11b y CD11c humanas en base, principalmente en los pesos moleculares similares, pero no idénticos. Otro anticuerpo anti-esplenocito canino, Ca11.8H2, reconocía e inmunoprecipitaba una cuarte subunidad tipo \alpha canina también capaz de asociarse con la subunidad \beta_{2}, pero que tenía un único peso molecular y su expresión restringida a un subconjunto de macrófagos titulares diferenciados.

Los anticuerpos generados por inmunización de hámster con células dendríticas murinas produjeron dos anticuerpos anti-integrina [Metlay, y col., J. Exp. Med. 171: 1753-1771 (1990)]. Un anticuerpo, 2E6, inmunoprecipitaba un heterodímero predominante con subunidades que tienen pesos moleculares aproximados de 180 kD y 90 kD además de bandas minoritarias en el intervalo de peso molecular de 150-160 kD. El segundo anticuerpo, N418, precipitaba otro heterodímero aparente con subunidades que tienen pesos moleculares aproximados de 150 kD y 90 kD. En base a estudios de bloqueo de la adhesión celular, se formuló la hipótesis de que el anticuerpo 2E6 reconocía un equivalente murino de CD18 humana. Aunque el peso molecular del antígeno N418 sugería el reconocimiento de un homólogo murino de CAD11c/CD18 humana, el análisis adicional indicaba que el antígeno murino mostraba un patrón de distribución tisular que era incoherente con el observado para CD11c/CD18 humana.

Los antígenos reconocidos por el anticuerpo Ca 11.8H2 canino y el anticuerpo N418 murino podrían representar una especie variante (por ejemplo, una variante de glicosilación o ayuste) de una subunidad \alpha canina o murina previamente identificada. Como alternativa, estos antígenos pueden presentar subunidades \alpha de integrina canina y murina únicas. En ausencia de información específica con respecto a la estructura primaria, estas alternativas no pueden distinguirse.

En seres humanos, CD11a/CD18 se expresa en todos los leucocitos. CD11b/CD18 y CD11c/CD18 están esencialmente restringidos a la expresión en monocitos, granulocitos, macrófagos y células asesinas naturales (NK), pero CD11c/CD18 también se detecta en algunos tipos de células B. En general, CD11a/CD18 predomina en linfocitos, CD11b/CD18 en granulocitos y CD11c/CD18 en macrófagos [véase la revisión, Arnaout, Blood 75: 1037-1050 (1990)]. La expresión de las cadenas \alpha, sin embargo, es variable con respecto al estado de activación y diferenciación de los tipos celulares individuales [Véase la revisión de Larson y Springer, Immunol. Rev. 114: 181-217 (1990).]

La implicación de las integrinas \beta_{2} en las respuestas inmunes e inflamatorias humanas se ha demostrado usando anticuerpos monoclonales que son capaces de bloquear la adhesión celular asociada a integrina \beta_{2}. Por ejemplo, CD11a/CD18, CD11b/CD18 y CD11c/CD18 participan activamente en la unión de las células asesinas naturales (NK) a células de linfoma y adenocarcinoma [Patarroyo, y col., Immunol. Rev. 114: 67-108 (1990)], la acumulación de granulocitos [Nourshargh, y col., J. Immunol. 142: 3193-3198 (1989)], la filtración plasmática independiente de granulocitos [Arfors, y col., Blood 69: 338-340 (1987)], la respuesta quimiotáctica de leucocitos estimulados [Arfors, y col., supra] y la adhesión de leucocitos al endotelio vascular [Price, y col., J. Immunol. 139: 4174-4177 (1987) y Smith, y col., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)]. La tarea fundamental de las integrinas \beta_{2} en las respuestas inmunes e inflamatorias es hace evidente en el síndrome clínico conocido como deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD), donde las manifestaciones clínicas incluyen infecciones bacterianas recurrentes y a menudo amenazantes para la vida, LAD es el resultado de mutaciones heterogéneas en la subunidad \beta_{2} (Kishimoto, y col., Cell 50: 193-202 (1987)] y la gravedad de la patología es proporcional al grado de deficiencia en la expresión de la subunidad \beta_{2}. La formación del heterodímero de integrina completo está alterado por la mutación de \beta_{2} [Kishimoto, y col., supra]. Es interesante observar que, al menos un anticuerpo específico para CD18 ha demostrado inhibir la formación de sincitios por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIH-1) in vitro, aunque el mecanismo exacto de esta inhibición no está clara [Hildreth y Orentas, Science 244: 1075-1078 (1989)]. Esta observación es coherente con el descubrimiento de que un contrarreceptor de CD11a/CD18, ICAM-1, también es un receptor superficial para el grupo principal de serotipos de rinovirus [Greve, y col., Cell 56: 839 (1989)].

El significado de la actividad de unión de la integrina \beta_{2} en las respuestas inmunes e inflamatorias humanas subraya la necesidad de desarrollar un entendimiento más completo de esta clase de proteínas superficiales. La identificación de miembros aún desconocidos de esta subfamilia, así como sus contrarreceptores, y la generación de anticuerpos monoclonales u otros factores solubles que puedan alterar la actividad biológica de las integrinas \beta_{2} proporcionará un medio práctico para la intervención terapéutica en respuestas inmunes e inflamatorias relacionadas con integrina \beta_{2}.

En un primer aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una cantidad eficaz de una anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} para la preparación de un medicamento para el tratamiento de déficit crónicos resultantes de la inflamación en el sitio de una lesión del sistema nervioso central causada por traumatismo. La subunidad \alpha de la integrina \beta_{2} humana, \alpha_{d}, ITGAD tiene la SEC ID Nº 2 y, está codificada por el ADN expuesto en la SEC ID Nº 1. También se proporcionan construcciones de ADN plasmídico y viral recombinantes (construcciones de expresión) que incluyen secuencias que codifican \alpha_{d}, donde la secuencia que codifica \alpha_{d} está unida de forma funcional a un elemento o elementos reguladores de la transcripción homólogos o heterólogos.

La presente descripción también proporciona polinucleótidos aislados y purificados de ratón y rata que muestran homología con polinucleótidos que codifican \alpha_{d} humana. Un polinucleótido de ratón preferido se expone en la SEC ID Nº 52; un polinucleótido de rata preferido se expone en la SEC ID Nº 54.

Como otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan células huésped procariotas o eucariotas transformadas o transfectadas con secuencias de ADN de la invención que expresan el polipéptido \alpha_{d} o variantes del mismo. Las células huésped de la descripción son particularmente útiles para la producción a gran escala del polipéptido \alpha_{d}, que puede aislarse de la propia célula huésped o del medio en que se cultiva la célula huésped. Las células huésped que expresan el polipéptido \alpha_{d} en su superficie de membrana extracelular también son útiles como inmunógenos en la producción de anticuerpos específicos para \alpha_{d}. Preferiblemente, las células huésped transfectadas con \alpha_{d} se co-transfectarán para expresar una subunidad de integrina \beta_{2} para permitir la expresión superficial del heterodímero.

La presente descripción también proporciona polipéptidos \alpha_{d} purificados y aislados, fragmentos y variantes de los mismos. Los polipéptidos \alpha_{d} preferidos son como se expone en la SEC ID Nº 2. Pueden obtenerse nuevos productos de \alpha_{d} de la descripción como aislados de fuentes naturales, pero, junto con los productos variantes de \alpha_{d}, se producen preferiblemente por procedimientos recombinante que implican las células huésped de la invención. Pueden generarse formas completamente glicosiladas, parcialmente glicosiladas y totalmente desglicosiladas del polipéptido \alpha_{d} variando la célula huésped seleccionada para la producción recombinante y/o por procesamiento después del aislamiento. Los polipéptidos de \alpha_{d} variantes de la descripción pueden comprender polipéptidos \alpha_{d} solubles e insolubles en agua que incluyen análogos donde uno o más de los aminoácidos están delecionados o remplazados: (1) sin pérdida, y preferiblemente con potenciación, de una o más actividades biológicas o características inmunológicas específicas para \alpha_{d}; o (2) con incapacitación específica de una función particular de unión ligando/receptor o señalización. También se proporcionan polipéptidos de fusión, donde las secuencias de aminoácidos de \alpha_{d} se expresan de forma contigua con secuencias de aminoácidos de otros polipéptidos. Dichos polipéptidos de fusión pueden tener propiedades biológicas, bioquímicas y/o inmunológicas modificadas en comparación con \alpha_{d} de tipo silvestre. Se contemplan polipéptidos análogos que incluyen restos aminoacídicos adicionales (por ejemplo, lisina o cisteína) que facilitan la formación de multímeros.

La presente descripción también comprende polipéptidos y otras moléculas no peptídicas que se unen específicamente a \alpha_{d}. Las moléculas de unión preferidas incluyen anticuerpos (por ejemplo,anticuerpos monoclonales y policlonales), contrarreceptores (por ejemplo,formas asociadas a membrana y solubles) y otros ligandos (por ejemplo, moléculas de origen natural o sintéticas), incluyendo aquellos que se unen competitivamente a \alpha_{d} en presencia de anticuerpos monoclonales y/o contrarreceptores específicos de \alpha_{d}. Las moléculas de unión son útiles para la purificación de polipéptidos \alpha_{d} y para identificar los tipos celulares que expresan \alpha_{d}. Las moléculas de unión también son útiles para modular (es decir, inhibir, bloquear o estimular) las actividades de unión y/o transducción de señales in vivo de \alpha_{d}.

También se describen ensayos para identificar moléculas de unión a \alpha_{d}, incluyendo ensayos in vitro tales como ensayos de unión a ligando inmovilizado, ensayos de unión en solución, y ensayos de proximidad por centelleo, así como ensayos basados en células tales como ensayos de exploración de di-híbridos, ensayos de exploración de híbrido dividido, y similares. Los ensayos basados en células proporcionan un cambio fenotípico en una célula huésped como resultado de la interacción de unión específica o alteración de una interacción de unión específica, permitiendo de este modo la cuantificación indirecta o medición de alguna interacción de unión específica.

Los ensayos in vitro para identificar anticuerpos u otros compuestos que modulen la actividad de \alpha_{d} pueden implicar, por ejemplo, inmovilizar \alpha_{d} o un ligando natural al que se une \alpha_{d}, marcar de forma detectable el compañero de unión no inmovilizado, incubar los compañeros de unión juntos y determinar el efecto de un compuesto de ensayo sobre la cantidad de marcador unido donde una reducción en el marcador unido en presencia del compuesto de ensayo en comparación con la cantidad de marcador unido en ausencia del compuesto de ensayo indica que el agente de ensayo es un inhibidor de la unión de \alpha_{d}.

Otro tipo de ensayo in vitro para identificar compuestos que modulen la interacción entre \alpha_{d} y un ligando implica inmovilizar \alpha_{d} o un fragmento del mismo en un soporte sólido revestido (o impregnado con) un agente fluorescente, marcar el ligando con un compuesto capaz de excitar el agente fluorescente, poner en contacto el \alpha_{d} inmovilizado con el ligando marcado en presencia y ausencia de un compuesto modulador putativo, detectar la emisión de luz por el agente fluorescente, e identificar los compuestos moduladores como los compuestos que afectan a la emisión de luz del agente fluorescente en comparación con la emisión de luz del agente fluorescente en ausencia de un compuesto modulador. Como alternativa, el ligando de \alpha_{d} puede inmovilizarse y \alpha_{d} puede marcarse en el ensayo.

Un procedimiento de ensayo basado en células contemplado por la descripción para identificar compuestos que modulen la interacción entre \alpha_{d} y un ligando implica transformar o transfectar células huésped apropiadas con una construcción de ADN que comprende un gen informador bajo en control de un promotor regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de unión a ADN y un dominio activador, expresar en las células huésped una primera secuencia de ADN híbrida que codifica una primera fusión de parte o todo el \alpha_{d} y el dominio de unión a ADN o el dominio activador del factor de transcripción, expresar en las células huésped una segunda secuencia de ADN híbrida que codifica parte o todo el ligando y el dominio de unión a ADN o el dominio activador del factor de transcripción que no está incorporado en la primera fusión, evaluar el efecto de un compuesto modulador putativo sobre la interacción de \alpha_{d} y el ligando detectando la unión del ligando a \alpha_{d} en una célula huésped particular midiendo la producción del producto del gen informador en la célula huésped en presencia o ausencia del modulador putativo, e identificar compuestos moduladores como aquellos compuestos que alteran la producción del producto del gen informador en comparación con la producción del producto del gen informador en ausencia del compuesto modulador. Actualmente se prefieren para su uso en el ensayo el promotor lexA, el dominio de unión a ADN de lexA, el dominio de transactivación de GAL4, el gen informador lacZ, y una célula huésped de levaduras.

Puede usarse una versión modificada del ensayo anterior para aislar un polinucleótido que codifica una proteína que se une a \alpha_{d} transformando o transfectando células huésped apropiadas con una construcción de ADN que comprende un gen informador bajo el control de un promotor regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de unión a ADN y un dominio activador, expresando en las células huésped la primera secuencia de ADN híbrida que codifica una primera fusión de parte o todo el \alpha_{d} y el dominio de unión a ADN o el dominio activador del factor de transcripción, expresando en las células huésped una biblioteca de las segundas secuencias de ADN híbridas que codifican segundas fusiones de parte o todo de las proteínas de unión a \alpha_{d} putativas y el dominio de unión a ADN o el dominio activador del factor de transcripción que no está incorporado en la primera fusión, detectando la unión de una proteína de unión a \alpha_{d}, a \alpha_{d} en una célula huésped particular detectando la producción del producto del gen informador en la célula huésped, y aislando las segundas secuencias de ADN híbridas que codifican la proteína de unión a \alpha_{d} a partir de la célula huésped particular.

En una realización preferida que utiliza el ensayo de híbrido dividido, la descripción proporciona un procedimiento para identificar un inhibidor de la unión entre una proteína \alpha_{d} o fragmento de la misma y una proteína de unión a \alpha_{d} o fragmento de unión de la misma que comprende las etapas de: (a) transformar o transfectar una célula huésped con una primera construcción de expresión de ADN que comprende un primer gen marcador de selección que codifica una primera proteína marcadora de selección y un gen represor que codifica una proteína represora, estando dicho gen represor bajo el control transcripcional de un promotor; (b) transformar o transfectar dicha célula huésped con una segunda construcción de expresión de ADN que comprende un segundo gen marcador de selección que codifica una segunda proteína marcadora de selección y un tercer gen marcador de selección que codifica una tercera proteína marcadora de selección, estando dicho tercer gen marcador de selección bajo el control transcripcional de un operador, funcionando dicho operador específicamente sobre el mismo por dicha proteína represora de modo que la interacción de dicha proteína represora con dicho operador disminuye la expresión de dicha tercera proteína marcadora de selección; (c) transformar o transfectar dicha célula huésped con una tercera construcción de expresión de ADN que comprende un cuarto gen marcador de selección que codifica una cuarta proteína marcadora de selección y un gen de la proteína de fusión de \alpha_{d} que codifica una proteína \alpha_{d} o un fragmento de la misma en fase con un dominio de unión a ADN de una proteína de activación transcripcional o un dominio de transactivación de dicha proteína de activación transcripcional; (d) transformar o transfectar dicha célula huésped con una cuarta construcción de expresión de ADN que comprende un quinto gen marcador de selección que codifica una quinta proteína marcadora de selección y un segundo gen de proteína de fusión que codifica una proteína de unión a \alpha_{d} o fragmento de unión de la misma en fase con el dominio de unión a ADN de dicha proteína de activación transcripcional o el dominio de transactivación de dicha proteína de activación transcripcional, cualquiera que no esté incluido en el primer gen de proteína de fusión; (e) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína \alpha_{d} o fragmento de la misma y dicha proteína de unión a \alpha_{d} o fragmento de la misma de modo que dicha proteína \alpha_{d} o fragmento de la misma y la proteína de unión a \alpha_{d} o fragmento de unión de la misma interaccionen poniendo en proximidad dicho dominio de unión a ADN y dicho dominio de transactivación reconstituyendo dicha proteína de activación transcripcional; funcionando dicha proteína de activación transcripcional sobre dicho promotor para aumentar la expresión de dicha proteína represora; interaccionando dicha proteína represora con dicho operador de modo que dicha tercera proteína marcadora de selección no se exprese; (f) detectar la ausencia de expresión de dicho gen de selección; (g) cultivar dicha célula huésped en presencia de un inhibidor de ensayo de la unión entre dicha proteína \alpha_{d} o fragmento de la misma y dicha proteína de unión a \alpha_{d} o fragmento de la misma; y (h) comparar la expresión de dicha proteína marcadora de selección en presencia y ausencia de dicho inhibidor de ensayo donde la expresión disminuida de dicha proteína marcadora de selección es indicativa de una capacidad del inhibidor de ensayo de inhibir la unión entre dicha proteína \alpha_{d} o fragmento de la misma y dicha proteína de unión a \alpha_{d} o fragmento de unión de la misma de modo que dicha proteína de activación transcripcional no se reconstituya, no aumente la expresión de dicha proteína represora, y dicho operador aumente la expresión de dicha proteína marcadora de selección.

La descripción comprende células huésped donde los diversos genes y secuencias reguladoras están codificados en una única molécula de ADN así como células huésped donde uno o más del gen represor, el gen marcador de selección, el gen de proteína de fusión de \alpha_{d}, y la el gen de la proteína de unión a \alpha_{d} están codificados en distintas construcciones de expresión de ADN. En una realización preferida, las células huésped están transformadas o transfectadas con ADN que codifica el gen represor, el gen marcador de selección, el gen de proteína de fusión de \alpha_{d}, y el den de la proteína de unión de fusión de \alpha_{d}, cada uno codificado en una construcción de expresión distinta. Independientemente de la cantidad de construcciones de expresión de ADN introducida, cada construcción de expresión de ADN introducida por transformación o transfección comprende adicionalmente una secuencia del gen marcador de selección, cuya expresión se usa para confirmar que la transfección o transformación se consiguió, de hecho. Los genes marcadores de selección codificados en construcciones de expresión de ADN introducidas individualmente por transformación o transfección son distinguibles del marcador de selección bajo la regulación transcripcional del operador tet porque la expresión del gen marcador de selección regulada por el operador tet es fundamental para la realización preferida; es decir, la expresión regulada del gen marcador de selección por el operador tet proporciona un cambio fenotípico medible en la célula huésped que se usa para identificar un inhibidor de la proteína de unión. Los genes marcadores de selección codificados en construcciones de expresión de ADN introducidas individualmente por transformación o transfección se proporcionan como determinantes de la transfección o transformación exitosa de las construcciones de expresión de ADN individuales. Las células huésped preferidas de la invención incluyen cepas de S. cerevisiae transformadas denominadas YI596 e YI584 que se depositaron el 13 de agosto de 1996 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mariland 20852, y con los Números de Acceso asignados ATCC 74384 y ATCC 74385, respectivamente.

Las células huésped de la descripción incluyen cualquier tipo celular capaz de expresar \alpha_{d} y las proteínas de unión a \alpha_{d} necesarias como se ha descrito anteriormente y que sean capaces de transformarse o transfectarse con secuencias promotoras y operadoras funcionales que regulen la expresión de las proteínas heterólogas también como se ha descrito. En una realización preferida, las células huésped son de origen de mamífero, insecto o levaduras. Actualmente, la célula huésped más preferida es una célula de levadura. Las células de levadura preferidas de la descripción pueden seleccionarse entre diversas cepas, incluyendo los transformantes de levadura S. cerevisiae descritos en la Tabla 1. Los ejemplares de levaduras alternativos incluyen S. pombe, K. lactis, P. pastoris, S. carlsbergensis y C. albicans. Las células huésped de mamífero preferidas de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), COS, HeLa, 3T3, CV1, LTK, 293T3, Rat1, PC12 o cualquier otra línea celular transfectable de origen humano o de roedores. Las líneas celulares de insecto preferidas incluyen células SF9.

En una realización preferida, el gen marcador de selección está regulado por un operador y codifica una enzima en una vía para la síntesis de un requisito nutricional para dicha célula huésped de modo que la expresión de dicha proteína marcadora de selección es necesaria para el crecimiento de dicha célula huésped en medios que carecen de dichos requisito nutricional. Por tanto, como en una realización preferida donde una proteína represora interacciona con el operador, la transcripción del gen marcador de selección está regulado negativamente y las células huésped se identifican por la capacidad de crecer en medios que carecen del requisito nutricional y la capacidad de crecer en medios que contienen el requisito nutricional. En una realización más preferida, el gen marcador de selección codifica la proteína HIS3, y las células huésped transformadas o transfectadas con una construcción de expresión de ADN que codifica HIS3 se seleccionan después del cultivo en medios en presencia y ausencia de histidina. La descripción, sin embargo, comprende cualquiera de varios genes marcadores de selección alternativos regulados por un operador. Las alternativas génicas incluyen, por ejemplo, URA3, LEU2, LYS2 o aquellas que codifican cualquiera de la multitud de enzimas necesarias en diversas vías para la producción de un requisito nutricional que puede excluirse definitivamente de los medios de cultivo. Además, pueden utilizarse genes informadores convencionales tales como cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasas de luciérnaga, \beta-galactosidasa (\beta-gal), fosfatasa alcalina secretada (SEAP), proteína fluorescente verde (GFP), hormona del crecimiento humana (hGH), \beta-glucuronidasa, neomicina, higromicina, timidina quinasa (TK) y similares en la invención.

En la realización preferida, las células huésped incluyen un gen de proteína represora que codifica la proteína de resistencia a tetraciclina que funciona sobre el operador tet para disminuir la expresión del gen marcador de selección. La descripción, sin embargo, también abarca alternativas al represor y operador tet, por ejemplo, el represor y operador trp de E. coli, el represor y operador his, y el represor y operador del operón lac.

Los componentes dominio de unión a ADN y dominio de transactivación de las proteínas de fusión pueden obtenerse del mismo factor de transcripción o de diferentes factores de transcripción siempre que pongan los dos dominios en proximidad a través de la unión entre \alpha_{d} y la proteína de unión a \alpha_{d} que permite la formación de una proteína de activación transcripcional funcional que aumenta la expresión de la proteína represora con elevada eficacia. Una proteína de activación transcripcional de elevada eficacia se defina como una que tiene tanto un dominio de unión a ADN que muestra elevada afinidad de unión por la secuencia promotora reconocida como un dominio de transactivación que tiene elevada afinidad de unión por las proteínas de la maquinaria transcripcional necesarias para expresar el ARNm del gen represor. El componente dominio de unión a ADN de una proteína de fusión de la invención puede obtenerse de cualquiera de varias proteínas diferentes incluyendo, por ejemplo, LexA o Gal4. Asimismo, el componente de transactivación de las proteínas de fusión de la invención puede obtenerse de varias proteínas de activación transcripcional diferentes, incluyendo, por ejemplo, Gal4 o VP16.

La secuencia promotora de la descripción que regula la transcripción de la proteína represora puede ser cualquier secuencia capaz de dirigir la transcripción en la célula huésped elegida. El promotor puede ser una secuencia de ADN reconocida específicamente por el dominio de unión a ADN elegido de la invención, o cualquier otra secuencia de ADN con que el dominio de unión a ADN de la proteína de fusión sea capaz de una interacción de elevada afinidad. En una realización preferida de la descripción, la secuencia promotora de la invención es un promotor de HIS3 o alcohol deshidrogenasa (ADH). En una realización actualmente más preferida, se emplea el promotor de ADH en la descripción. La descripción, sin embargo, abarca numerosos promotores alternativos, incluyendo, por ejemplo, los derivados de genes que codifican HIS3, ADH, URA3, LEU2 y similares.

Los procedimientos de la descripción abarcan todas y cada una de las variaciones en células huésped como se ha descrito anteriormente. En particular, la descripción abarca un procedimiento donde: la célula huésped es una célula de levadura; el gen marcador de selección codifica HIS3; la transcripción del gen marcador de selección está regulada por el operador tet; el gen de la proteína represora codifica la proteína de resistencia a tetraciclina; la transcripción de la proteína de resistencia a tetraciclina está regulada por el promotor de HIS3; el dominio de unión a ADN se obtiene de LexA; y el dominio de transactivación se obtiene de VP16. En otra realización, la descripción abarca un procedimiento donde: la célula huésped es una célula de levadura; el gen marcador de selección codifica HIS3; la transcripción del gen marcador de selección está regulada por el operador tet, el gen de la proteína represora codifica la proteína de resistencia a tetraciclina; la transcripción de la proteína de resistencia a tetraciclina está regulada por el promotor de la alcohol deshidrogenasa; el dominio de unión a ADN se obtiene de LexA; y el dominio de transactivación se obtiene de VP16.

En realizaciones alternativas de la descripción donde la célula huésped es una célula de mamífero, las variaciones incluyen el uso de construcciones de expresión de ADN de mamífero para codificar \alpha_{d} y los genes de fusión de unión a \alpha_{d}, el gen represor, y el gen marcador de selección, y el uso de genes marcadores de selección que codifican marcadores de resistencia antibióticos o fármacos (es decir, neomicina, higromicina, timidina quinasa).

Hay al menos tres diferentes tipos de bibliotecas usadas para la identificación de moduladores de molécula pequeña. Estos incluyen: (1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de productos naturales, y (3) bibliotecas combinatorias compuestas por péptidos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas aleatorios.

Las bibliotecas químicas constan de análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos que están identificados como "éxitos" mediante exploración de productos naturales. Las bibliotecas de productos naturales son colecciones de microorganismos, animales, plantas, u organismos marinos que se usan para crear mezclas para la exploración por: (1) fermentación y extracción de caldos de microorganismos del suelo, vegetales o marinos o (2) extracción de organismos vegetales o marinos. Las bibliotecas combinatorias están compuestas por grandes cantidades de péptidos, oligonucleótidos o compuestos orgánicos como una mezcla. Son relativamente fáciles de preparar por procedimientos de síntesis automatizada tradicional, PCR, clonación o procedimientos sintéticos propios. Son de particular interés las bibliotecas combinatorias de péptidos y oligonucleótidos. Otras bibliotecas más de interés incluyen bibliotecas de péptidos, proteínas, peptidomiméticos, colección sintética multiparalela, recombinatorias, y de polipéptidos.

La descripción también comprende líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos de \alpha_{d}. Las técnicas para producir hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales son bien conocidas en la técnica. Las líneas celulares de hibridoma puede generarse después de inmunizar un animal con \alpha_{d} purificado, variantes de \alpha_{d} o células que expresan \alpha_{d} o una variante del mismo sobre la superficie de la membrana extracelular. Los tipos celulares inmunogénicos incluyen células que expresan \alpha_{d} in vivo, o líneas celulares procariotas o eucariotas transfectadas que normalmente no expresan \alpha_{d} in vivo. Los anticuerpos de la invención actualmente preferidos se secretan por hibridomas denominados 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 188I, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3, 197A-4, 199A, 199H, 199M, 205A, 205C, 205E, 212A, 212D, 217G, 217H, 217I, 217K, 217L, 217M, 226A, 226B, 226C, 226D, 226E, 226F, 226G, 226H, 226I, 236A, 236B, 236C, 236F, 236G, 236H, 236I, 236K, 237L, 236M, 240F, 240G, 240H, y 236L.

El valor de la información aportada a través de la descripción de las secuencias de ADN y aminoácidos de \alpha_{d} es manifiesto. En una serie de ejemplos, la secuencia de ADNc de \alpha_{d} hace posible el aislamiento de la secuencia de ADN genómica de \alpha_{d} humana, incluyendo los elementos de control transcripcional para la secuencia genómica. También está comprendida la identificación de ADN de variantes alélicas de \alpha_{d} y especies heterólogas (por ejemplo, rata o ratón). El aislamiento del ADN genómico de \alpha_{d} humana y ADN de especies heterólogas puede realizarse por técnicas de hibridación ADN/ADN convencional, en condiciones apropiadamente rigurosas, usando todo o parte de la secuencia de ADNc de \alpha_{d} como sonda para explorar una biblioteca apropiada. Como alternativa, puede usarse la reacción en cadena la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos que están diseñados en base a la secuencia de ADNc conocida para amplificar e identificar las secuencias de ADN genómico de \alpha_{d}. Pueden producirse ADN sintéticos que codifiquen el polipéptido \alpha_{d}, incluyendo fragmentos y otras variantes del mismo, por procedimientos de síntesis convencionales.

La información de la secuencia de ADN de la descripción también hace posible el desarrollo, por recombinación homóloga o estrategias de "knockout" [véase, por ejemplo, Kapecchi, Science 244: 1288-1292 (1989)], para producir roedores que no logren expresar un polipéptido \alpha_{d} funcional o que exprese un polipéptido \alpha_{d} variante. Dichos roedores son útiles como modelos para estudiar las actividades de \alpha_{d} y moduladores de \alpha_{d} in vivo.

Las secuencias de ADN y aminoácidos de la descripción también hacer posible el análisis de epítopes de \alpha_{d} que participen activamente en la unión de contrarreceptores así como epítopes que pueden regular, en lugar de participar activamente en, la unión. La descripción también comprende la identificación de epítopes que pueden participar en la transducción de señales transmembrana.

El ADN de la descripción también es útil para la detección de tipos celulares que expresan el polipéptido \alpha_{d}. Pueden usarse técnicas de hibridación ADN/ADN convencionales que utilizan el ADN de \alpha_{d} para detectar el ARN de \alpha_{d} para determinar el nivel constitutivo de la transcripción de \alpha_{d} dentro de una célula, así como cambios en el nivel de transcripción en respuesta a agentes internos o externos. La identificación de agentes que modifican la transcripción y/o traducción de \alpha_{d} puede, a su vez, evaluarse para su valor terapéutico o profiláctico potencial. El ADN de la invención también hace posible la hibridación in situ del AADN de \alpha_{d} DNA con ARN celular para determinar la localización celular de mensajeros específicos de \alpha_{d} dentro de las poblaciones celulares complejas y tejidos.

El ADN de la descripción también es útil para la identificación de secuencias polinucleotídicas no humanas que presenten homología con secuencias de \alpha_{d} humanas. La posesión de secuencias de ADN de \alpha_{d} no humanas permite el desarrollo de modelos animales (incluyendo, por ejemplo, modelos transgénicos) del sistema humano.

Como otro aspecto de la descripción, pueden emplearse anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para \alpha_{d} en análisis inmunohistoquímico para localizar \alpha_{d} en compartimientos subcelulares o células individuales dentro de tejidos. Los análisis inmunohistoquímicos de este tipo son particularmente útiles cuando se usan en combinación con hibridación in situ para localizar tanto ARNm de \alpha_{d} como productos polipeptídicos del gen de \alpha_{d}.

Por ejemplo, se usaron anticuerpos policlonales y monoclonales que bloquean \alpha_{D} para investigar la función de \alpha_{D} en un modelo animal de lesión pulmonar. Véase, Shonley y col., J. Immunology, pág. 1014-1020 (1998), vol. 160. También se describen anticuerpos específicos para \alpha_{D} en las patentes de Estados Unidos 5.831.020 y 5.817.515.

La identificación de tipos celulares que expresan \alpha_{d} puede tener ramificaciones significativas para el desarrollo de agentes terapéuticos y profilácticos. Se prevé que los productos de la invención relacionados con \alpha_{d} pueden emplearse en el tratamiento de enfermedades donde los macrófagos son un elemento esencial de la patología. Se han descrito modelos animales para muchas afecciones patológicas asociadas con la actividad de los macrófagos en la técnica. Por ejemplo, en ratones, el reclutamiento de macrófagos a sitios de inflamación tanto crónica como aguda está presentado por Jutila, y col., J. Leukocyte Biol. 54: 30-39 (1993). En ratas, Adams, y col., [Transplantation 53: 1115-1119 (1992) y Transplantation 56: 794-799 (1993)] describe un modelo para arteriosclerosis por injerto después de transplante de aloinjerto cardiaco abdominal heterotrópico. Rosenfeld, y col., [Arteriosclerosis 7: 9-23 (1987) y Arteriosclerosis 7:24-34 (1987)] describe aterosclerosis inducida en conejos alimentados con una dieta suplementada con colesterol. Hanenberg, y col., [Diabetologia 32: 126-134 (1989)] informa del desarrollo espontáneo de diabetes insulinodependiente en ratas BB. Yamada y col., [Gastroenterology 104: 759-771 (1993)] describe una enfermedad inflamatoria del intestino inducida, colitis granulomatosa crónica, en ratas después de inyecciones de polímeros de peptidoglicano-polisacárido de estreptococos. Cromartie, y col., [J. Exp. Med. 146: 1585-1602 (1977)] y Schwab, y col., [Infection and Immunity 59: 4436-4442 (1991)] informan de que la inyección de la proteína de parece celular de estreptococos en ratas provoca una afección artrítica caracterizada por inflamación de las articulaciones periféricas y las destrucción posterior de las articulaciones. Finalmente, Huitinga, y col., [Eur. J. Immunol 23: 709-715 (1993)] describe la encefalomielitis alérgica experimental, un modelo de esclerosis múltiple, en ratas Lewis. En cada uno de estos modelos, se utilizan anticuerpos contra \alpha_{d}, otras proteínas de unión a \alpha_{d}, o formas solubles de \alpha_{d} para atenuar la patología, supuestamente a través de la inactivación de la activación de los macrófagos.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento de éstas y otras patologías. Las composiciones farmacéuticas están diseñadas para el propósito de inhibir la interacción entre \alpha_{d} y su(s) ligando(s) e incluyen diversas formas solubles y asociadas a membrana de \alpha_{d} (que comprende el polipéptido \alpha_{d} completo, o fragmentos del mismo que participan activamente en la unión de \alpha_{d}), formas solubles y asociadas a membrana de proteínas de unión a \alpha_{d} (incluyendo anticuerpos, ligandos, y similares), moduladores intracelulares o extracelulares de la actividad de unión de \alpha_{d}, y/o moduladores de la expresión del polipéptido \alpha_{d} y/o polipéptido ligado de \alpha_{d}, incluyendo moduladores de la transcripción, traducción, procesamiento post-traduccional y/o transporte intracelular.

La descripción también comprende procedimientos para el tratamiento de patologías en que está implicada la unión de \alpha_{d}, o la acumulación localizada de células que expresan \alpha_{d}, donde a un paciente que padece dicha patología se le proporciona una cantidad de una composición farmacéutica de la invención suficiente para modular los niveles de unión de \alpha_{d} o para modular la acumulación de los tipos celulares que expresan \alpha_{d}. El procedimiento de tratamiento de la invención es aplicable a patologías tales como, aunque sin limitación, diabetes Tipo I, aterosclerosis, esclerosis múltiple, asma, psoriasis, inflamación pulmonar, síndrome de distrés respiratorio agudo y artritis reumatoide.

La invención también proporciona el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} en procedimientos para inhibir la infiltración de macrófagos en el sitio de una lesión del sistema nervioso central que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d}. En un aspecto, los procedimientos comprenden el uso de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} que bloquea la unión entre \alpha_{d} y un compañero de unión. En una realización, el compañero de unión es VCAM-1. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} se selecciona entre el grupo constituido por el anticuerpo monoclonal secretado por hibridoma 226H y el anticuerpo monoclonal secretado por hibridoma 236L. En una realización más preferida, los procedimientos de la invención son para una lesión del sistema nervioso central que es una lesión de la médula espinal.

La invención proporciona adicionalmente el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} en procedimientos para reducir la inflamación en el sitio de una lesión del sistema nervioso central que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d}. En un aspecto, los procedimientos comprenden el uso de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} que bloquea la unión entre \alpha_{d} y un compañero de unión. En una realización, el compañero de unión es VCAM-1. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} se selecciona entre el grupo constituido por el anticuerpo monoclonal secretado por hibridoma 226H y el anticuerpo monoclonal secretado por hibridoma 236L. En una realización más preferida, los procedimientos de la invención son para una lesión del sistema nervioso central que es una lesión de la médula espinal.

Los hibridomas 226H y 236L se recibieron el 19 de noviembre de 1998 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Masassas, VA 20110-2209 según los términos del Tratado de Budapest y con los Nº de Acceso asignados: HB 12592 y HB 12593, respectivamente.

La descripción también proporciona procedimientos para modular la liberación de TNF\alpha desde macrófagos o fagocitos esplénicos que comprende la etapa de poner en contacto dicho fagotitos con una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal \alpha_{d} inmunoespecífico. En un aspecto preferido, los procedimientos comprenden un anti-anticuerpo monoclonal que inhibe la liberación de TNF\alpha. En una realización preferida, los procedimientos comprenden el uso de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} inmunoespecífico que se selecciona entre el grupo constituido por el anticuerpo monoclonal secretado por hibridoma 205C y el anticuerpo monoclonal secretado por hibridoma 205E.

Se contemplan procedimientos donde los anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d}, incluyendo, por ejemplo, fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Los procedimientos que utilizan anticuerpos modificados también están incluidos por la descripción. Los anticuerpos modificados incluyen, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos de CDR injertada, incluyendo compuestos que incluyen secuencias de CDR que reconocen específicamente un polipéptido, así como anticuerpos humanizados. Los procedimientos que comprende el uso de anticuerpos humanos también se contemplan. Las técnicas para identificar y aislar anticuerpos humanos se describen infra.

La descripción también proporciona procedimientos para inhibir la infiltración de macrófagos en el sitio de una lesión del sistema nervioso central que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad eficaz de una molécula pequeña que inhibe la unión de \alpha_{d}. En particular, los procedimientos de la invención comprenden una lesión del sistema nervioso central que es una lesión de la médula espinal. Las moléculas pequeñas específicas para la unión de \alpha_{d} se identifican y aíslan de bibliotecas como se ha analizado anteriormente.

La descripción proporciona adicionalmente procedimientos para reducir la inflamación en el sitio de una lesión del sistema nervioso central que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad eficaz de una molécula pequeña que inhibe la unión de \alpha_{d}. En particular, los procedimientos de la invención comprenden una lesión del sistema nervioso central que es una lesión de la médula espinal. Las moléculas pequeñas específicas para la unión de \alpha_{d} se identifican y aíslan de bibliotecas como se ha analizado anteriormente.

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La descripción abarca adicionalmente procedimientos para detectar y diagnosticar la enfermedad de Crohn que comprende las etapas de obtener muestras tisulares de un paciente; teñir la muestra con anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d}, y comparar el patrón de tinción con el de tejido obtenido de un donante normal conocido. En casos en los que pueden detectarse diferencias de tinción entre las dos muestras tisulares, el paciente puede ensayarse adicionalmente para posible enfermedad de Crohn.

La descripción también contempla el uso de \alpha_{d} como diana para la retirada de poblaciones celulares patogénicas que expresan \alpha_{d} en la superficie celular. En un aspecto, se clona la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal \alpha_{d} y se expresa en el contexto de un isotipo humano de fijación del complemento. La clonación de la región hipervariable de este modo proporcionará un compañero de unión para \alpha_{d}, que después de la unión in vivo, conducirá a la unión del complemento y posterior muerte celular. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} se conjuga con un compuesto citotóxico y la unión del anticuerpo a \alpha_{d} en el tipo celular patogénico conduce a muerte celular.

Breve descripción del dibujo

Serán evidentes muchos otros aspectos y ventajas de la presente invención después de considerar la siguiente descripción de la misma, haciendo referencia al dibujo donde:

la Figura 1A a 1D comprende una alineación de las secuencias de aminoácido humanas de CD11b (SEC ID Nº 3), CD11c (SEC ID Nº 4) y \alpha_{d} (SEC ID Nº 2).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se ilustra por los siguientes ejemplos de los que solamente el ejemplo 38 está dentro del alcance de las reivindicaciones. Más particularmente, el Ejemplo 1 ilustra el uso de anticuerpo anti-\alpha_{TM1} canina en un intento de detectar una proteína humana homóloga. El Ejemplo 2 detalla la purificación de \alpha_{TM1} canina y la secuenciación N-terminal del polipéptido para diseñar cebadores oligonucleotídicos para la amplificación por PCR del gen de \alpha_{TM1} canina. El Ejemplo 3 aborda la purificación a gran escala de \alpha_{TM1} canina para la secuenciación interna para diseñar cebadores de PCR adicionales. El Ejemplo 4 describe el use de los cebadores de PCR y de secuencia interna para amplificar un fragmento del gen de \alpha_{TM1} canina. El Ejemplo 5 aborda la clonación de la secuencia de ADNc que codifica \alpha_{d} humana. El Ejemplo 6 describe el análisis de hibridación por transferencia de Northern de tejidos y células humanos para la expresión de ARNm de \alpha_{d}. El Ejemplo 7 detalla la construcción de plásmidos de expresión de \alpha_{d} humana y la transfección de células COS con los plásmidos resultantes. El Ejemplo 8 aborda el análisis de ELISA de la expresión de \alpha_{d} en células COS transfectadas. El Ejemplo 9 describe el análisis de FACS de células COS transfectadas con plásmidos de expresión de \alpha_{d} humana. El Ejemplo 10 aborda la inmunoprecipitación de CD18 en asociación con \alpha_{d} en células COS co-transfectadas. El Ejemplo 11 se refiere a la introducción por transfección estable de construcciones de expresión de \alpha_{d} en células de ovario de hámster chino. El Ejemplo 12 aborda la unión dependiente de CD18 de \alpha_{d} a la molécula de adhesión intercelular ICAM-R, una proteína mutante de ICAM-R, y el factor del complemento iC3b. El Ejemplo 13 describe ensayos de exploración por proximidad de centelleo para identificar inhibidores o potenciadores (es decir, moduladores) de las interacciones de unión ligando de \alpha_{d}/anti-ligando. El Ejemplo 14 aborda la construcción de plásmidos de expresión que codifican formas solubles de \alpha_{d}, y ensayos de unión de los productos de expresión. El Ejemplo 15 se refiere a la producción de sueros policlonales específicos de \alpha_{d} y anticuerpos monoclonales. El Ejemplo 16 describe el análisis por citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales \alpha_{d}. El Ejemplo 17 aborda la expresión de \alpha_{d} en monocitos humanos. El Ejemplo 18 describe el análisis de la distribución tisular de \alpha_{d}, la expresión de \alpha_{d} en leucocitos de sangre periférica, la expresión en sinovio inflamatorio y no inflamatorio usando suero policlonal anti-\alpha_{d}, la expresión en pulmón e hígado enfermo, médula ósea humana, y PBMC de pacientes con cáncer de mama. El Ejemplo 19 aborda la regulación positiva de la expresión de \alpha_{d} in vitro e in vivo. El Ejemplo 20 describes el aislamiento de secuencias de ADNc de rata que muestran homología con secuencias génicas de \alpha_{d} humana. El Ejemplo 21 aborda la expresión específica de tejido de ARNm de \alpha_{d} de rata. El Ejemplo 22 se refiere a la construcción de plásmidos de expresión de \alpha_{d} de rata de longitud completa, plásmidos de expresión del dominio I de \alpha_{d} de rata, incluyendo proteínas de fusión dominio I/IgG, la producción de anticuerpos monoclonales contra proteína de longitud completa y de fusión del dominio I, y la producción de antisueros policlonales contra secuencias del dominio I de \alpha_{d} de rata fusionadas a IgG4 humana. El Ejemplo 23 describe la especificidad del anticuerpo monoclonal 199M. El Ejemplo 24 presenta resultados de un ensayo de proliferación de células T usando macrófagos que expresan \alpha_{d} de rata. El Ejemplo 25 describe la inmunoprecipitación de \alpha_{d} de rata a partir de médula ósea. El Ejemplo 26 describes la expresión de \alpha_{d} de rata en diversos modelos animales. El Ejemplo 27 se refiere a un ensayo para la inhibición de lisis celular diana indicada por NK-células tumorales usando anticuerpos monoclonales \alpha_{d}. El Ejemplo 28 aborda el aislamiento de secuencias de ADNc de ratón que muestran homología con secuencias génicas de \alpha_{d} humana. El Ejemplo 29 describe el aislamiento de clones de ADNc de \alpha_{d} de ratón adicionales usados para confirmar el análisis de secuencia. El Ejemplo 30 se refiere al análisis de hibridación in situ de diversos tejidos de ratón para determinar la expresión específica de tejido y célula del homólogo de ratón putativo de \alpha_{d} humana. El Ejemplo 31 describe la generación de construcciones de expresión que codifican el homólogo de ratón putativo de \alpha_{d} humana. El Ejemplo 32 aborda el diseño de un ratón "knock-out" donde el gen que codifica el homólogo de ratón putativo de \alpha_{d} humana está alterado. El Ejemplo 33 describe el aislamiento de clones de ADNc de conejo que muestran homología con secuencias codificantes de \alpha_{d} humana. El Ejemplo 34 describe el aislamiento de \alpha_{d} de mono. El Ejemplo 35 se refiere a la caracterización del antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal 217L. El Ejemplo 36 describe modelos animales de patologías humanas donde se ensaya la modulación de \alpha_{d} para capacidades terapéuticas. El Ejemplo 37 describe la expresión de \alpha_{d} en patologías de modelo animal. El Ejemplo 38 aborda la función de \alpha_{d} en lesión de médula espinal. El Ejemplo 39 describe la expresión de \alpha_{d} en enfermedad de Crohn. El Ejemplo 40 se refiere a la liberación de TNF\alpha de células esplénicas que expresan \alpha_{d}. El Ejemplo 41 describe el procedimiento para modular la liberación de TNF\alpha de células esplénicas usando anticuerpos monoclonales \alpha_{d}. El Ejemplo 42 caracteriza la expresión de \alpha_{d} en eosinófilos. El Ejemplo 43 se refiere a la caracterización adicional de la unión de \alpha_{d} a VCAM-1. El Ejemplo 44 describe el uso de \alpha_{d} como diana para la retirada de poblaciones de células patogénicas.

Ejemplo 1 Intento para Detectar un Homólogo Humano de \alpha_{TM1} Canina

Se ensayó el anticuerpo monoclonal Ca11.8H2 [Moore, y col., supra] específico para \alpha_{TM1} canina para la reactividad cruzada en leucocitos de sangre periférica humana en un intento de identificar un homólogo humano de \alpha_{TM1} canina. Se incubaron preparaciones celulares (típicamente 1 x 10^{6} células) con sobrenadante de hibridoma no diluido o un anticuerpo de control negativo de IgG de ratón purificado (10 \mug/ml) en hielo en presencia de azida sódica al 0,1%. La unión del anticuerpo monoclonal se detectó por incubación posterior con anticuerpo de caballo anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a 6 \mug/ml. Las células teñidas se fijaron con paraformaldehído al 2% p/v en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se analizaron con un clasificador celular activado por fluorescencia Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Típicamente, se analizaron 10.000 células usando amplificación logarítmica para la intensidad de fluorescencia.

Los resultados indicaron que Ca11.8H2 no reaccionaba de forma cruzada con proteínas superficiales expresadas en leucocitos de sangre periférica humana, mientras que las células de control, linfocitos de sangre periférica canina neoplásica, eran esencialmente todas positivas para \alpha_{TM1}.

Como el anticuerpo monoclonal Ca11.8H2 específico para la subunidad \alpha canina no reaccionaba de forma cruzada con un homólogo humano, el aislamiento del ADN de \alpha_{TM1} canina se consideró un pre-requisito necesario para aislar un gen humano equivalente si existe.

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Ejemplo 2 Purificación por Afinidad de \alpha_{TM1} Canina para Secuenciación N-Terminal

La \alpha_{TM1} canina se purificó por afinidad para determinar las secuencias de aminoácido N-terminales para el diseño de sonda oligonucleotídica/cebador. En resumen, se acopló el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{TM1} Ca11.8H2 a la resina cromatográfica Affigel® 10 (BioRad, Hercules, CA) y se aisló la proteína por interacción específica anticuerpo-proteína. El anticuerpo se conjugó con la resina, de acuerdo con el protocolo sugerido por BioRad, a una concentración de aproximadamente 5 mg de anticuerpo por ml de resina. Después de la reacción de conjugación, se retiró el exceso de anticuerpo y se bloqueó la resina con tres volúmenes de etanolamina 0,1 M. La resina después se lavó con treinta volúmenes de columna de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Se homogeneizaron veinticinco gramos de un único bazo de perro en 250 ml de tampón que contenía sacarosa 0,32 M en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, con inhibidores de proteasa. Se sedimentaron los núcleos y desechos celulares con centrifugación a 1.000 g durante 15 minutos. Las membranas se sedimentaron del sobrenadante con centrifugación a 100.000 g durante 30 minutos. El sedimento de membrana se resuspendió en 200 ml de tampón de lisis (NaCl 50 mM, borato 50 mM, pH 8,0, con NP-40 al 2%) y se incubó durante 1 hora en hielo. Después se sedimentó el material insoluble por centrifugación a 100.000 g durante 60 minutos. Se transfirieron diez mililitros del lisado aclarado a un tubo de polipropileno de 15 ml con 0,5 ml de resina Affigel® 10 conjugada con Ca11.8H2 descrita anteriormente. El tubo se incubó durante una noche a 4ºC con rotación y la resina se lavó posteriormente con 50 volúmenes de columna de D-PBS. La resina después se transfirió a un tubo de microfuga y se hirvió durante diez minutos en 1 ml de tampón de muestra de Laemmli (no reductor) que contenía Tris-HCl 0,1 M, pH 6, SDS al 8,2%, glicerol al 20% y azul de bromofenol al 0,002%. La resina se sedimentó por centrifugación y se desechó; el sobrenadante se trató con 1/15 volúmenes de \beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) y se procesó en un gel de poliacrilamida al 7%. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF Immobilon (Millipore, Bedford, MA) del siguiente
modo.

Los geles se lavaron una vez en agua filtrada en Millipore® desionizada y se equilibraron durante 15-45 minutos en tampón de transferencia de ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico (CAPS) 10 mM, pH 10,5, con metanol al 10%. Las membranas Immobilon se humedecieron con metanol, se aclararon con agua filtrada, y se equilibraron durante 15-30 minutos en tampón de transferencia CAPS. La transferencia inicial se realizó usando un aparato de transferencia Biorad a 70 voltios durante 3 horas. La membrana Immobilon se retiró después de la transferencia y se tiñó en tinción de Coomassie R250 al 0,1% filtrado durante 10 minutos. Las membranas se destiñeron en metanol al 50%/ácido acético al 10% tres veces, diez minutos cada vez. Después de desteñir, las membranas se lavaron en agua filtrada y secaron al aire.

Se detectaron bandas de proteínas de aproximadamente 150 kD, 95 kD, 50 kD y 30 kD. Supuestamente las bandas de 50 kD y 30 kD eran el resultado de contaminación con anticuerpo. Después se intentó la secuenciación N-terminal sobre la banda tanto de 150 kD como de 95 kD, pero se bloqueó la proteína de 95 kD, evitando la secuenciación. La banda de proteína de 150 kD se escindió de la membrana y se secuenció directamente con un secuenciador de proteínas Applied Biosystems (Foster City, CA) Modelo 473A de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de aminoácidos resultante se expone en la SEC ID Nº 5 usando designaciones de aminoácidos de una letra.

FNLDVEEPMVFQ

(SEC ID Nº 5)

La secuencia identificada incluía en la secuencia FNLD característica de subunidades \alpha de la familia de integrinas [Tamura, y col., J. Cel./Biol. 111: 1593-1604 (1990)].

Diseño de Cebador e Intento de Amplificar Secuencias de \alpha_{TM}1 Canina

A partir de la información de la secuencia N-terminal, se diseñaron tres sondas oligonucleotídicas para la hibridación: a) "Tommer", un oligonucleótido completamente degenerado; b) "Patmer", un oligonucleótido parcialmente degenerado; y c) "Guessmer", un oligonucleótido no degenerado basado en el uso de codones de mamífero. Estas sondas se exponen a continuación como SEC ID Nº 6, 7 y 8, respectivamente. Los símbolos de ácido nucleico son de acuerdo con 37 C.F.R. \NAK1.882 para éstas y todas las demás secuencias de nucleótidos de este documento.

5'-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3'	(SEC ID Nº 6)

5'-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3'	(SEC ID Nº 7)

5'-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3'	(SEC ID Nº 8)

En base a los datos de secuenciación, no se detectaron clones relevantes usando estos oligonucleótidos en varias hibridaciones de baja rigurosidad con una biblioteca de ADNc de bazo/macrófagos de sangre periférica caninos clonada en XZAP® (Stratagene La Jolla, CA).

Posteriormente se diseñaron otros cuatro cebadores oligonucleotídicos, denominados 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg y 3'Spec (como se expone en las SEC ID Nº 9, 10, 11 y 12, respectivamente, donde Deg indica degenerado y Spec indica no degenerado) en base a la secuencia N-terminal deducida para intentar amplificar la secuencias de \alpha_{TM1} canina por PCR a partir del ADN de una biblioteca fágica purificada a partir de lisados de placa de la biblioteca de Stratagene descrita anteriormente.

5'-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3'	(SEC ID Nº 9)

5'-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3'	(SEC ID Nº 10)

5'-TGRAANACCATNGGYTC-3'	(SEC ID Nº 11)

5'-TTGGAAGACCATNGGYTC-3'	(SEC ID Nº 12)

Los cebadores oligonucleotídicos de \alpha_{TM1} se aparearon con cebadores del vector T3 o T7, que se exponen en las SEC ID Nº 13 y 14, respectivamente, que hibridan con secuencias que flanquean la región polienlazadora en el fagómido Bluescript® encontrado en XZAP®.

5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'	(SEC ID Nº 13)

5'-AATACGACTCACTATAG-3'	(SEC ID Nº 14)

La amplificación por PCR se realizó en tampón Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) que contenía magnesio con 150 ng de ADN de biblioteca, 1 \mug de cada cebador, dNTP 200 \muM y 2,5 unidades de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim) y los productos se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en tampón Tris-Acetato-EDTA (TAE) con 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio. El ADN se transfirió a una membrana Hybond® (Amersham, Arlington Heights, IL) por transferencia durante una noche en 10X SSPE. Después de la transferencia, el ADN inmovilizado se desnaturalizó con NaOH 0,5 M con NaCl 0,6 M, se neutralizó con Tris-HCl 1,0 M, pH 8,0, en NaCl 1,5 M, y se lavó con 2X SSPE antes del entrecruzamiento con UV con un aparato de entrecruzamiento Stratalinker (Stratagene). La membrana se incubó en tampón de prehibridación (5X SSPE, 4X Denhardt, SDS al 0,8%, formamida al 30%) durante 2 h a 50ºC con agitación.

Se marcaron las sondas oligonucleotídicas 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg y 3'Spec (SEC ID Nº 9, 10, 11 y 12, respectivamente) usando un tampón de quinasa Boehringer Mannheim con 100-300 \muCi de \gammaP^{32}-dATP y 1-3 unidades de polinucleótido quinasa durante 1-3 h a 37ºC. El marcador no incorporado se retiró con cromatografía fina Sephadex® G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) usando Tris-HCl 10 mM, pH 8, tampón EDTA(TE) 0,1 mM y el flujo continuo se añadió directamente a la solución de prehibridación. Las membranas se sondearon durante 16 h a 42ºC con agitación y se lavaron repetidamente, con un lavado de rigurosidad final de 1X SSPE/SDS al 0,1% a 50º durante 15 min. La mancha de transferencia después se expuso a una película Kodak X-Omat AR durante 1-4 horas a -80ºC.

Los oligonucleótidos 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg y 3'Spec solamente hibridaron con productos de PCR de las reacciones en que se usaron como cebadores y no lograron hibridar como se esperaba con productos de PCR de las reacciones en que no se usaron como cebadores. Por tanto, se concluyó que ninguno de los productos de PCR era específico para \alpha_{TM1} porque ningún producto hibridaba con ninguna de las sondas apropiadas.

Ejemplo 3 Purificación por Afinidad a Gran Escala De \alpha_{TM1} Canina Para Secuenciación Interna

Para proporcionar una secuencia de aminoácidos adicional para el diseño de cebadores, se purificó \alpha_{TM1} canina para secuenciación interna. Se usaron tres secciones de bazo congelado (aproximadamente 50 g cada una) y células congeladas de dos bazos parciales de perros adultos para generar proteína para secuenciación interna. Se homogeneizaron cincuenta gramos de bazo en 200-300 ml de tampón borato con un mezclador Waring. El material homogeneizado se diluyó con 1 volumen de tampón que contenía NP-40 al 4%, y la mezcla después se agitó suavemente durante al menos una hora. El lisado resultante se aclaró de desechos grandes por centrifugación a 2.000 g durante 20 min, y después se filtró a través de un prefiltro Coming (Coming, NY) o un filtro Coming de 0,8 micrómetros. El lisado se aclaró adicionalmente por filtración a través del sistema de filtro Coming de 0,4 micrómetros.

El lisado esplénico y la resina Affigel® 10 conjugada con anticuerpo descrita en el Ejemplo 2 se combinaron a una proporción de volumen de 150:1 en alícuotas de 100 ml y se incubaron durante una noche a 4ºC con balanceo. El lisado se retiró después de centrifugación a 1.000 g durante 5 minutos, se combinó con más resina Affigel® 10 conjugada con anticuerpo y se incubó durante una noche como anteriormente. Las alícuotas de resina absorbidas después se combinaron y se lavaron con 50 volúmenes de D-PBS/Tween® 20 al 0,1% y la resina se transfirió a una columna Biorad de 50 ml. La proteína adsorbida se eluyó de la resina con 3-5 volúmenes de glicina 0,1 M (pH 2,5); se recogieron fracciones de aproximadamente 900 \mul y se neutralizaron con 100 \mul de tampón Tris 1 M, pH 8,0. Se retiraron alícuotas de 15 \mul de cada fracción y se hirvieron en un volumen igual de tampón de muestra Laemmli 2X con 1/15 volúmenes de ditiotreitol (DTT) 1 M. Estas muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 8% Novex (San Diego, CA) y se visualizaron por tinción de Coomassie o por tinción con plata usando un kit Daiichi (Enprotech, Natick, MA) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las fracciones que contenían las mayores cantidades de proteína se combinaron y se concentraron al vacío. La solución restante se diluyó al 50% con tampón de muestra Laemmli reductor y se proceso en geles de poliacrilamida al 7% de 1,5 mm en tampón Tris-glicina/SDS. La proteína se transfirió desde los geles a membrana Immobilon por el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 usando el aparato de transferencia de Hoefer.

Las bandas de proteína correspondientes a \alpha_{TM1} canina se escindieron de 10 membranas de PVDF y produjeron aproximadamente 47 \mug de proteína total. Las bandas se destiñeron en 4 ml de metanol al 50% durante 5 minutos, se secaron al aire y se cortaron en trozos de 1 x 2 mm. Los trozos de membrana se sumergieron en 2 ml de acetona al 95% a 4ºC durante 30 minutos con agitación con vórtice ocasional y después se secaron al aire.

Antes de la escisión proteolítica de la proteína unida a membrana, se disolvieron 3 mg de bromuro de cianógeno (CNBr) (Pierce, Rockford, IL) en 1,25 ml de ácido fórmico al 70%. Esta solución después se añadió a un tubo que contenía los trozos de membrana de PVDF y el tubo se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas. El sobrenadante (S1) después se retiró a otro tuvo y los trozos de membrana se lavaron con 0,25 ml de ácido fórmico al 70%. Este sobrenadante (S2) se retiró y se añadió al sobrenadante previo (S1). Se añadieron dos mililitros de agua Milli Q a los sobrenadantes combinados (S1 y S2) y se liofilizó la solución. Los trozos de membrana de PVDF se secaron en atmósfera de nitrógeno y se extrajeron de nuevo con 1,25 ml de acetonitrilo al 60%, ácido tetrafluoroacético (TFA) al 0,1% a 42ºC durante 17 horas. Este sobrenadante (S3) se retiró y los trozos de membrana se extrajeron de nuevo con 1,0 ml de acetonitrilo al 80% con TFA al 0,08% a 42ºC durante 1 hora. Este sobrenadante (S4) se combinó con los sobrenadantes previos (S1, S2 y S3) y se secó al vacío.

Los fragmentos de CNBr secados después se disolvieron en 63 \mul de urea 8 M, NH_{4}HCO_{3} 0,4 M. Los fragmentos se redujeron en 5 \mul de ditiotreitol (DTT) 45 mM y posteriormente se incubaron a 50ºC durante 15 minutos. La solución después se enfrió a temperatura ambiente y se hicieron alícuotas de los fragmentos añadiendo 5 \mul de yodoacetamida 100 mM (Sigma, St. Louis, MO). Después de incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente, la muestra se diluyó con 187 \mul de agua Milli Q a una concentración final de urea de 2,0 M. Después se añadió tripsina (Worthington, Freehold, NJ) a una proporción de 1:25 (p:p) de enzima a proteína y se digirió la proteína durante 24 horas a 37ºC. La digestión se terminó con la adición de 30 \mul de TFA.

Los fragmentos de proteína después se separaron con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en un sistema Waters 625 LC (Millipore, Milford, MA) usando una columna Vydac C-18 de 5 micrómetros de 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) equilibrada en TFA al 0,05% y agua de HPLC (tampón A). Los péptidos se eluyeron con una concentración creciente de acetonitrilo al 80% en TFA al 0,04% (tampón B) con un gradiente del 38-75% de tampón B durante 65-95 minutos y del 75-98% de tampón B durante 95-105 minutos. Los péptidos se fraccionaron a un caudal de 0,2 ml/minuto y se detectaron a 210 nm.

Después del fraccionamiento, se analizó la secuencia de aminoácidos de los péptidos por degradación de Edman automatizada realizada en un secuenciador de proteínas Applied Biosystems Modelo 437A usando los ciclos convencionales del fabricante y el programa de software Modelo 610A Data Analysis, Versión 1.2.1. Todos los reactivos de secuenciación se suministraron por Applied Biosystems. Las secuencias de aminoácidos de siete de los ocho fragmentos internos se exponen a continuación donde "X" indica que la identidad del aminoácido era incierta.

VFQEXGAGFGQ	(SEC ID Nº 15)

LYDXVAATGLXQPI	(SEC ID Nº 16)

PLEYXDVIPQAE	(SEC ID Nº 17)

FQEGFSXVLX	(SEC ID Nº 18)

TSPTFIXMSQENVD	(SEC ID Nº 19)

LVVGAPLEVVAVXQTGR	(SEC ID Nº 20)

LDXKPXDTA	(SEC ID Nº 21)

Diseño de Cebador

Después se usó una secuencia de aminoácidos interna (expuesta en la SEC ID Nº 22) obtenida para diseñar un cebador oligonucleotídico completamente degenerado, denominado p4(R) que se expone en la SEC ID Nº 23.

FGEQFSE	(SEC ID Nº 22)

5'-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3'	(SEC ID Nº 23)

Ejemplo 4 Clonación por PCR De Un Fragmento de \alpha_{TM1} Canina

La parte 5' del gen de \alpha_{TM1} canina se amplificó a partir del ADNc esplénico canino bicatenario por PCR.

Generación de ADNc Esplénico Canino Bicatenario

Se molió un gramo de material congelado de un bazo de perro juvenil en nitrógeno líquido sobre hielo seco y se homogeneizó en 20 ml de tampón RNA-Sta 60 (Tel-Test B, Inc, Friendswood, TX). Se añadieron cuatro ml de cloroformo, y la solución se extrajo por centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos. El ARN se precipitó de la fase acuosa con 10 ml de etanol. Después se selección el ARN Poli A^{+} en Dynal Oligo dT Dynabeads® (Dynal, Oslo, Norway). Se combinaron cinco alícuotas de 100 \mug de ARN total y se diluyeron con un volumen igual de tampón de unión 2X (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, Lic. 1,0 M, EDTA 1 mM, SDS al 0,1%). Después se incubó el ARN 5 minutos con las Oligo dT Dynabeads® (1,0 ml o 5 mg de perlas para todas las muestras). Las perlas se lavaron con tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, Lic. 0,15 M, EDTA 1 mM y SDS al 0,1%, de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante antes de la elución del ARNm poli A^{+} con EDTA 2 mM, pH 7,5. Después se generó ADNc bicatenario usando el ARNm poli A^{+} eluido y el Boehringer Mannheim cDNA Synthesis Kit de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

Aislamiento de un ADNc Parcial de \alpha_{TM1} Canina

Se emplearon los cebadores oligonucleotídicos 5'Deg (SEC ID Nº 9) y p4(R) (SEC ID Nº 23) en una reacción de PCR convencional usando 150 ng de ADNc bicatenario, 500 ng de cada cebador, dNTP 200 mM y 1,5 unidades de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim) en tampón Taq (Boehringer Mannheim) con magnesio. Los productos resultantes (1 \mul de la reacción original) se sometieron a una segunda ronda de PCR con los mismos cebadores para aumentar el rendimiento de producto. Esta banda se eluyó de un gel de agarosa al 1% sobre un papel Schleicher & Schuell (Keene, NH) NA45 en un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 1,5 M a 65ºC, se precipitó, y se ligó en el vector pCR^{tm}II (Invitrogen, San Diego, CA) usando el kit de clonación TA (Invitrogen) y el protocolo sugerido por el fabricante. La mezcla de ligamiento se introdujo por transformación mediante electroporación en bacterias XL-1 Blue (Stratagene). Se determinó que un clon, 2.7, contenía secuencias correspondientes a secuencias del péptido \alpha_{TM1} que no se utilizaron en el diseño de los cebadores.

La secuenciación se realizó con un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) con un kit de secuencia de ciclo terminador con Colorante-desoxi (ABI) en que se incorporaron los dNTP marcados con fluorescencia en un reacción de PCR asimétrica [McCabe, "Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR", en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, y col. (eds.) pág. 76-83 Academic Press: Nueva York (1990)] del siguiente modo. Las muestras se mantuvieron a 96ºC durante 4 minutos y se sometieron a 25 ciclos de la secuencia de etapas: 96ºC, durante 15 segundos; 50ºC durante 1 segundo; 60ºC durante 4 minutos. Los datos de secuencia se descargaron automáticamente en archivos de muestra en el ordenador que incluía cromatogramas y archivos de texto. La secuencia del inserto completo del clon 2.7 se expone en la SEC ID Nº 24.

Los intentos de aislar el ADNc de longitud completa de \alpha_{TM1} canina de la biblioteca Stratagene (que se ha descrito en el Ejemplo 2) fueron fallidos. Se exploraron aproximadamente 1 x 10^{6} placas fágicas por hibridación en condiciones de baja rigurosidad usando formamida al 30% con el clon 2.7 como sonda, pero no resultaron clones positivos. Los intentos por amplificar secuencias relevantes cadena debajo de las representadas en el clon 2.7 usando oligonucleótidos específicos derivados del clon 2.7 o cebadores degenerados basados en la secuencia de aminoácidos de otros fragmentos peptídicos apareados con un oligonucleótido degenerado basado en el motivo aminoacídico GFFKR conservado de la subunidad \alpha [Tamura, y col., supra] también fueron fallidos.

Ejemplo 5 Clonación De Un Homólogo Humano Putativo De \alpha_{TM1} Canina

Para intentar el aislamiento de una secuencia humana homóloga a \alpha_{TM1} canina se usó el fragmento de aproximadamente 1 kb de \alpha_{TM1} canina del clon 2.7 como sonda. Las sonda se generó por PCR en las condiciones descritas en el Ejemplo 2 usando los cebadores NT2 (que se expone en la SEC ID Nº 25) y p4(R) (SEC ID Nº 23).

5'-GTNTTYCARGARGAYGG-3'

(SEC ID Nº 25)

El producto de PCR se purificó usando el kit Quick Spin de Qiagen (Chatsworth, GA) y el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN purificado (200 ng) se marcó con 200 \muCi de \alpha^{32}PdCTP usando el kit Boehringer Mannheim Random Prime Labelling y el protocolo sugerido por el fabricante. El isótopo no incorporado se retiró con cromatografía por gravedad de Sephadex® G25 (fina). La sonda se desnaturalizó con NaOH 0,2 N y se neutralizó con Tris-HCl 0,4 M, pH 8,0, antes de su uso.

Se prepararon réplicas de colonias en filtros Hybond® (Amersham) de una biblioteca de ADNc de bazo humano en pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Los filtros se desnaturalizaron inicialmente y se neutralizaron como se ha descrito en el Ejemplo2 y posteriormente se incubaron en una solución de prehibridación (8 ml/filtro) con formamida al 30% a 50ºC con agitación suave durante 2 horas. La sonda marcada como se ha descrito anteriormente se añadió a esta solución y se incubó con los filtros durante 14 horas a 42ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a 37ºC y dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC. Los lavados de rigurosidad final fueron 1X SSC/SDS al 0,1%, dos veces a 65ºC (1X SSC es NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7,0). Los filtros se expusieron a película Kodak X-Omat AR durante seis horas con un filtro intensificador. Las colonias que daban señales en las réplicas duplicadas se sembraron en estrías en medio LB con magnesio (LBM)/placas de carbenicilina y se incubaron durante una noche a 37ºC. Las colonias estriadas resultantes se replicaron con filtros Hybond® y estos filtros se trataron como anteriormente. Los filtros se hibridaron en condiciones más rigurosas con la sonda de 1 kb del clon 2.7, marcado como se ha descrito previamente, en una solución de hibridación de formamida al 50% a 50ºC durante 3 horas. Los filtros sondeados se lavaron con una rigurosidad final de 0,1 X SSC/SDS al 0,1% a 65ºC y se expusieron a película Kodak X-Omat AR durante 2,5 horas a -80ºC con un filtro intensificador. Se identificaron las colonias positivas y se cultivaron en LBM/medio de carbenicilina durante una noche. El ADN de los cultivos se preparó usando el kit miniprep de Promega Wizard® de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante y se secuenció el ADN resultante.

La exploración inicial produjo 18 clones positivos, mientras que la exploración secundaria en condiciones de hibridación más rigurosas produjo un clon positivo que de denominó 19A2. Las secuencias de ADN y de aminoácidos deducida del clon de \alpha_{d} humana 19A2 se exponen en las SEC ID Nº 1 y 2, respectivamente.

Características Del ADNc de \alpha_{d} Humana y Polipéptido Predicho

El clon 19A2 abarca la región codificante completa de la proteína madura, más 48 bases (16 restos aminoacídicos) de la secuencia señal cadena arriba 5' y 241 bases de la secuencia no traducida 3' que no termina en una secuencia de poliadenilación. Se predice que el peso molecular central de la proteína madura es aproximadamente 125 kD. Se predice que el dominio extracelular abarca aproximadamente los restos aminoacídicos 17 a 1.108 de la SEC ID Nº 2. Esta región extracelular es contigua a la región de aproximadamente 20 aminoácidos homóloga a la región transmembrana de CD11c humana (restos 1.109 a 1.128 de la SEC ID Nº 2). El dominio citoplasmático comprende aproximadamente 30 aminoácidos (aproximadamente los restos 1.129 a 1.161 de la SEC ID Nº 2). La proteína también contiene una región (aproximadamente los restos 150 a 352) de aproximadamente 202 aminoácidos homóloga al dominio I (inserción) común a CD11a, CD11b y CD11c [Larson y Springer, supra], \alpha_{E} [Shaw, y col., J. Biol. Chem. 269: 6016-6025 (1994)] y en VLA-1 y VLA-2, [Tamura, y col., supra]. El dominio I en otras integrinas ha demostrado participar en la unión a ICAM [Landis, y col., J. Cell. Biol. 120: 1519-1527 (1993); Diamond, y col., J. Cell. Biol. 120: 1031-1043 (1993)], lo que sugiere que \alpha_{d} también puede unirse a miembros de la familia de ICAM de moléculas superficiales. No se ha demostrado que esta región exista en cualquier otra subunidad de integrina.

La secuencia de aminoácidos deducida de \alpha_{d} muestra aproximadamente un 36% de identidad con la de CD11a, aproximadamente un 60% de identidad con CD11b y aproximadamente un 66% de identidad con CD11c. Se presenta un alineamiento de las secuencias de aminoácidos para CD11b (SEC ID Nº 3), CD11c (SEC ID Nº 4) y \alpha_{d} (SEC ID Nº 2) en la Figura 1.

Los dominios citoplasmáticos de las subunidades \alpha en las integrinas \beta_{2} son típicamente distintos entre sí dentro de la misma especie, aunque las subunidades \alpha individuales muestran elevados grados de homología a través de los límites de especie. Coherente con estas observaciones, la región citoplasmática de \alpha_{d} difiere marcadamente de CD11a, CD11b, y CD11c excepto para una secuencia de aminoácidos GFFKR proximal a la membrana que ha demostrado estar conservada entre todas las integrinas \alpha [Rojiani, y col., Biochemistry 30: 9859-9866 (1991)]. Como la región de cola citoplasmática de las integrinas se ha implicado en la señalización "de dentro hacia fuera" y en la regulación de la avidez [Landis y col., supra], es posible que \alpha_{d} interaccione con moléculas citosólicas distintas de las que interaccionan con CD11a, CD11b, y CD11c, y, como resultado, que participe en las vías de señalización distintas de las que implican otras integrinas \beta_{2}.

El dominio extracelular de \alpha_{d} contiene una secuencia de aminoácidos DGSGS conservada adyacente al dominio I; en CD11b, la secuencia DGSGS es una región de unión a metales necesaria para la interacción del ligando [Michishita, y col. Cell 72: 857-867 (1993)]. Tres sitios de unión a cationes putativos adicionales en CD11b y CD11c están conservados en la secuencia de \alpha_{d} en los aminoácidos 465-474, 518-527, y 592-600 en el clon 19A2 (SEC ID Nº 1). El dominio I de \alpha_{d} es un 36%, 62%, y 57% idéntico a las regiones correspondientes en CD11a, CD11b, y CD11c, respectivamente, y la homología de secuencia relativamente baja en esta región sugiere que \alpha_{d} puede interaccionar con un conjunto de proteínas extracelulares distintas de proteínas con que interaccionan otras integrinas \beta_{2} conocidas. Como alternativa, la afinidad de \alpha_{d} por ligandos de integrina \beta_{2} conocidos, por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 y/o ICAM-R, puede ser distinta de la demostrada por otras interacciones integrina \beta_{2}/ICAM. [Véase el Ejemplo 12.]

Aislamiento de clones de ADNc de \alpha_{d} humana adicionales para la verificación de secuencia

Para confirmar la secuencia de ADN que codifica \alpha_{d} humana, se aislaron ADNc humanos adicionales por hibridación a partir de una biblioteca de ADNc cebada con oligo dt esplénica humana (Invitrogen) en pcDNA/Amp (descrito en el Ejemplo 5) que se seleccionó por tamaño por electroforesis en gel de agarosa para ADNc mayor de 3 kb de longitud. La sonda para hibridación se obtuvo de una región 5' de \alpha_{d} como se describe a continuación. Las condiciones de hibridación fueron las mismas que las descritas anteriormente para el aislamiento del clon de \alpha_{d} humana inicial, excepto en que después de la hibridación, los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente y una vez en 2X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC. Los filtros se expusieron a película Kodak X-Omat AR durante una noche.

La sonda de hibridación de \alpha_{d} 5' se generó por PCR a partir del clon 19A2 usando los cebadores CD11c 5' For (SEC ID Nº 94) y CD11c 5' Rev (SEC ID Nº 95) en las siguientes condiciones. Las muestras se mantuvieron a 94ºC durante cuatro minutos y se sometieron a 30 ciclos de la secuencia de etapas de temperatura i) 94ºC, durante 15 segundos; ii) 5ºC, durante 30 segundos; y iii) 72ºC, durante 1 minuto en un termociclador Perkin-Elmer 9600.

CD11c 5' For:	(5')CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3')	(SEC ID Nº 94)

CD11c 5' Rev:	(5')CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3')	(SEC ID Nº 95)

El producto de amplificación se purificó usando el kit Prep-A-Gene de BioRad (Hercules, CA) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. La sonda de \alpha_{d} 5' resultante era de aproximadamente 720 bases de longitud, correspondiente a la región desde el nucleótido 1.121 hasta el nucleótido 1.839 de la SEC ID Nº 1. El ADN purificado (aproximadamente 50 ng) se marcó con ^{32}P-dCTP usando un kit Random Prime Labeling de Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El isótopo no incorporado se retiró usando Columnas de Centrifugación Centrisep® (Princeton Separations, Adelphia, NJ) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. La sonda marcada se añadió a los filtros en una solución de prehibridación que contenía formamida al 45% y se permitió que procediera la incubación durante una noche a 50ºC. Después de la incubación, se lavaron los filtros como se ha descrito anteriormente.

Trece colonias dieron señales en réplicas duplicadas. Las colonias positivas se cogieron de placas maestras, se diluyeron en LBM y carbenicilina (100 \mug/ml) y se sembraron en placas a diluciones variables en filtros Hybond® (Amersham). Los filtros duplicados se hibridaron con la misma solución de la hibridación primaria y después de la hibridación, se lavaron los filtros a una rigurosidad final de 2X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC y se expusieron a la película.

Se confirman diez de las trece colonias positivas originalmente identificadas en la exploración secundaria. De estos diez clones, dos (denominados A7.Q y A8.Q) se secuenciaron y se determinó que codificaban \alpha_{d} humana. Se descubrió que el clon A7.Q era de aproximadamente 2,5 kb de longitud, incluyendo un líder 5', parte de una región codificante, y 60 bases adicionales de la secuencia no traducida 5'. Se determinó que la región codificante incompleta se había producido por una región intrónica con ayuste aberrante en el nucleótido 2.152 correspondiente de la SEC ID Nº 1. Se determinó que el clon A8.Q era de aproximadamente 4 kb de longitud, que abarca la región codificante de \alpha_{d} completa y que también incluye una secuencia intrónica en la base 305 correspondiente de la SEC ID Nº 1. En comparación con el clon de \alpha_{d} originalmente aislado (SEC ID Nº 1), se observó una diferencia porque se determinó que tanto el clon A7.Q y como el clon A8.Q tenían una inserción de codón de tres bases CAG que existe en la base 1.495. Las secuencias de los clones A7.Q y A8.Q se exponen en las SEC ID Nº 96 y 97, respectivamente, y una secuencia humana compuesta derivada de los clones A7.Q y A8.Q, y su secuencia de aminoácidos deducida correspondiente, se exponen en las SEC ID Nº 98 y 99, respectivamente.

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Ejemplo 6 Análisis de Northern de la Expresión de \alpha_{d} Humana en Tejidos

Para determinar el nivel relativo de expresión y especificidad tisular de \alpha_{d}, se realizó análisis de Northern usando fragmentos del clon 19A2 como sondas. Se cargaron aproximadamente 10 \mug de ARN total de cada uno de los varios tejidos humanos o líneas celulares cultivadas en un gel de formaldehído agarosa en presencia de 1 \mug de bromuro de etidio. Después de la electroforesis a 100 V durante 4 h, el ARN se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) por transferencia en 10X SSC durante una noche. La membrana se coció 1,5 h a 80ºC al vacío. Se usó solución de prehibridación que contenía formamida al 50% en tampón de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) para bloquear la membrana durante 3 h a 42ºC. Los fragmentos del clon 19A2 se marcaron con el kit Boehringer Mannheim Random Prime de acuerdo con las instrucciones del fabricante que incluye tanto \alphaP^{32}dCTP como \alphaP^{32}dTTP. El marcador no incorporado se retiró en una columna Sephadex® G25 en tampón TE. La membrana se sondeó con 1,5 x 10^{6} cuentas por ml de tampón de prehibridación. La mancha de transferencia después se lavó sucesivamente con 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente, 2X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC, 2X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC, 1X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC, 0,5X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC y 0,1X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC. La mancha de transferencia después se expuso a la película durante 19 h.

La hibridación usando un fragmento BstXI del clon 19A2 (correspondiente a los nucleótidos 2.011 a 3.388 de la SEC ID Nº 1) reveló una señal débil en el intervalo de aproximadamente 5 kb de ARN total en el hígado, placenta, timo, y amígdala. No se detectó señal en muestras de riñón, cerebro o corazón. La cantidad de ARN presente en el carril de riñón era mínima, determinada por tinción con bromuro de etidio.

Cuando se usa un segundo fragmento del clon 19A2 (que abarca la región de las bases 500 a 2.100 en la SEC ID Nº 1), se detectaron dos transcritos de ARN de dos tamaños diferentes en una transferencia de Northern de múltiples tejidos humanos (MTN) usando ARN poliA^{+} (Clontech). Se observó una banda de aproximadamente 6,5 kb en el bazo y músculo esquelético, mientras que se detectó una banda de 4,5 kb en pulmón y leucocitos de sangre periférica. La variación en los tamaños observados podría estar causada por poliadenilación específico de tejido, reactividad cruzada de la sonda con otros miembros de la familia de integrinas, o hibridación con ARNm con ayuste alternativo.

El análisis de Northern usando un tercer fragmento del clon 19A2, que abarca los nucleótidos 2.000 a 3.100 de la SEC ID Nº 1, dio resultados coherentes con aquellos usando los otros fragmentos del clon 19A2.

También se sondeó el ARN de tres líneas celulares de linaje mieloide usando los fragmentos correspondientes a los nucleótidos 500 a 2.100 y 2.000 a 3.100 de la SEC ID Nº 1. La línea celular THP-1, previamente estimulada con PMA, dio una señal difusa en el mismo intervalo de tamaño (aproximadamente 5,0 kb), con una intensidad ligeramente más fuerte que las señales tisulares. El ARN de células HL-60 no estimuladas y estimuladas con DMSO hibridó con la sonda de \alpha_{d} a la misma intensidad que las muestras tisulares, sin embargo, pareció que el tratamiento con PMA aumentaba la intensidad de señal. Como PMA y DMSO dirigen la diferenciación de las células HL-60 hacia las vías de monocitos/macrófagos y granulocitos, respectivamente, este resultado sugiere la expresión potenciada de \alpha_{d} en tipos celulares de monocitos/macrófagos. Las células U937 expresaron el mensaje de \alpha_{d} y esta señal no aumentó con la estimulación con PMA. No se detectó ninguna banda en células Molt, Daudi, H9, JY, o Jurkat.

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Ejemplo 7 Expresión Transitoria de Construcciones de \alpha_{d} Humana

El clon humano 19A2 carece de un codón de metionina de inicio y posiblemente alguna secuencia señal 5'. Por lo tanto, para generar un plásmido de expresión humano que contenga secuencias de 19A2, se usaron dos estrategias diferentes. En la primera, se construyeron dos plásmidos en los que se cortaron y empalmaron secuencias peptídicas señal derivadas de genes que codifican CD11b o CD11c en el clon 19A2 para generar una secuencia de \alpha_{d} quimérica. En el segundo enfoque, se construyó un tercer plásmido en el que se añadió una base de adenosina en la posición 0 del clon 19A2 para codificar una metionina de inicio.

Los tres plásmidos contenían diferentes regiones que codificaban la parte 5' de la secuencia de \alpha_{d} o la secuencia de \alpha_{d} quimérica. La región \alpha_{d} se amplificó por PCR (véanse las condiciones del Ejemplo 2) con un cebador 3' específico BamRev (expuesto a continuación en la SEC ID Nº 26) y uno de tres cebadores 5'. Los tres cebadores 5' contenían en secuencia: (1) bases no específicas idénticas en las posiciones 1-6 que permiten la digestión, un sitio EcoRI en las posiciones 7-12 y una secuencia Kozak consenso en las 13-18; (2) una parte de la secuencia señal de CD11b (cebador ER1B) o CD11c (cebador ER1C), o una adenosina (cebador ER1D); y (3) 15-17 bases adicionales que solapan específicamente las secuencias 5' del clon 19A2 para permitir la hibridación del cebador. Los cebadores ER1B, ER1C o ER1D se exponen en las SEC ID Nº 27, 28 ó 29, respectivamente, donde el codón de metionina de inicio está subrayado y el sitio EcoRI está doblemente subrayado.

5'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3'	(SEC ID Nº 26)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3'	(SEC ID Nº 27)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3'	(SEC ID Nº 28)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3'	(SEC ID Nº 29)

El producto de PCR resultante se digirió con EcoRI y BamHI.

Los tres plásmidos contenían una segunda región \alpha_{d} común (a insertar inmediatamente cadena debajo de la región 5' descrita en el párrafo previo) incluyendo el extremo 3' del clon \alpha_{d}. La segunda región \alpha_{d}, que se extiende desde el nucleótido 625 en el sitio XbaI en la región polienlazadora 3' del vector del clon 19A2, se aisló por digestión del clon 19A2 con BamHI y XbaI.

Se prepararon tres reacciones de ligamiento en que el fragmento BamHI/XbaI 3' de \alpha_{d} se ligó a uno de los tres fragmentos EcoRI/BamHI 5' de \alpha_{d} usando tampón de ligasa de Boehringer Mannheim y ligasa T4 (1 unidad por reacción). Después de incubación durante 4 horas a 14ºC, se añadió una cantidad apropiada de vector pcDNA.3 (Invitrogen) digerido con EcoRI y XbaI a cada reacción con una unidad adicional de ligase. Las reacciones se dejaron continuar durante otras 14 horas. Una décima parte de la mezcla de reacción después se introdujo por transformación en células XL-1 Blue competentes. Las colonias resultantes se cultivaron y se aisló el ADN como en el Ejemplo 5. La digestión con EcoRI identificó tres clones que eran positivos para ese sitio de restricción, y por tanto, las secuencias señal diseñadas. Los clones se denominaron pATM.B1 (CD11b/\alpha_{d}, a partir del cebador ER1B), pATM.C10 (CD11c/\alpha_{d}, a partir del cebador ER1C) y pATM.D12 (adenosina/\alpha_{d} a partir del cebador ER1d). La presencia de las secuencias señal apropiadas en cada clon se verificó por secuenciación de ácido nucleico.

La expresión a partir de los plásmidos de \alpha_{d} analizados anteriormente se realizó por cotransfección de células COS con los plásmidos individuales y un plásmido de expresión de CD18, pRC.CD18. Como control positivo, también se co-transfectaron células COS con el plásmido pRC.CD18 y un plásmido de expresión de CD11a, pDC.CD11A.

Las células se pasaron en medio de cultivo (DMEM/10%FBS/pen-estrep) en placas petri tratadas con cultivo tisular Coming de 10 cm a una confluencia del 50% 16 horas antes de la transfección. Las células se retiraron de las placas con tampón Versene (NaEDTA 0,5 mM en PBS) sin tripsina para todos los procedimientos. Antes de la transfección, las placas se lavaron una vez con DMEM libre de suero. Se añadieron quince microgramos de cada plásmido a 5 ml de tampón de transfección (DMEM con 20 \mug/ml de DEAE-Dextrano y cloroquina 0,5 mM) en cada placa. Después de 1,5 horas de incubación a 37ºC, las células se sacudieron durante 1 minuto con 5 ml de DMEM/DMSO al 10%. Esta solución de DMSO después se remplazó con 10 ml/placa de medio de cultivo.

Los transfectantes resultantes se analizaron por ELISA, FACS, e inmunoprecipitación como se describe en los Ejemplos 8, 9, y 10.

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Ejemplo 8 Análisis ELISA de Transfectantes COS

Para determinar si las células COS co-transfectadas con el plásmido de expresión de CD18 pRC.CD18 y un plásmido de \alpha_{d} expresaba \alpha_{d} en la superficie celular en asociación con CD18, se realizaron ELISA usando anticuerpos primarios creados contra CD18 (por ejemplo, TS1/18 purificado de ATCC HB203). Como control positivo, también se realizaron ELISA en células co-transfectadas con el plásmido de expresión de CD18 y un plásmido de expresión de CD11a, pDC.CD11A. Los anticuerpos primarios en este control incluían anticuerpos anti-CD18 y anticuerpos anti-CD11a (por ejemplo, TS1/22 purificado de ATCC HB202).

Para ELISA, se retiraron células de cada placa con tampón Versene y se transfirieron a una única placa de cultivo tisular Coming de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se dejaron incubar en medios de cultivo 2 días antes del ensayo. Las placas después se lavaron dos veces con 150 \mul/pocillo de D-PBS/solución de gelatina de piel de teleosteo (Sigma) al 0,5%. Este tampón se usó en todas las etapas excepto durante el revelado. Todos los lavados e incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Los pocillos se bloquearon con solución de gelatina durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se diluyeron a 10 \mug/ml en solución de gelatina y después se añadieron 50 \mul a cada pocillo. Se establecieron pocillos triplicados para cada anticuerpo primario. Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron 3X con 150 \mul/pocillo de solución de gelatina. Se añadió anticuerpo secundario (de cabra anti-Ig de ratón/HRP-Fc específico [Jackson, West Grove, PA]) a una dilución 1:3.500 a 50 \mul/pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora. Después de tres lavados, las placas se revelaron durante 20 minutos con 100 \mul/pocillo de solución de o-fenildiamina (OPD) (Sigma) (1 mg/ml de OPD en tampón citrato) antes de la adición de 50 \mul/pocillo de ácido sulfúrico al 15%.

El análisis de los transfectantes en el formato ELISA con anticuerpos anti-CD18 específicos no reveló expresión significativa por encima del fondo en células transfectadas solamente con el plásmido que codifica CD18. Las células co-transfectadas con plásmidos que contenía CD11a y CD18 mostraron un aumento en la expresión sobre el fondo cuando se analizaron con anticuerpos específicos de CD18 o con reactivos específicos para CD11a. El análisis adicional de células co-transfectadas con plásmidos que codifican CD18 y una de las construcciones de expresión de \alpha_{d} (pATM.C10 o pATM.D12) reveló que la expresión en la superficie celular de CD18 se rescataba por la expresión concomitante de \alpha_{d}. El aumento en la expresión detectable de CD18 en células COS transfectadas con pATM.C10 o pATM.D12 era comparable al observado en células de control positivo CD11a/CD18 co-transfectadas.

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Ejemplo 9 Análisis FACS de Transfectantes COS

Para el análisis FACS, se alimentaron las células en placas petri con medio de cultivo fresco el día después de la transfección y se dejaron incubar 2 días antes del ensayo. Las células transfectantes se retiraron de las placas con 3 ml de Versene, se lavaron una vez con 5 ml de tampón FACS (DMEM/FBS al 2%/azida sódica al 0,2%) y se diluyeron a 500.000 células/muestra en 0,1 ml de tampón FACS. Se añadieron diez microlitros de 1 mg/ml de anticuerpos específicos para CD18, CD11a, o CD11b conjugados con FITC (Becton Dickinson) o 800 \mug/ml de 23F2G murino conjugado con CFSE (anti-CD18) (ATCC HB11081) a cada muestra. Las muestras después se incubaron en hielo durante 45 minutos, se lavaron 3X con 5 ml/lavado de tampón FACS y se resuspendieron en 0,2 ml de tampón FACS. Las muestras se procesaron en un Becton Dickinson FACscan y los datos se analizaron usando el software Lysys II (Becton Dickinson).

Las células COS transfectadas con secuencias de CD18 solamente no se tiñeron para CD18, CD11a o CD11b. Cuando se co-transfectaron con CD11a/CD18, aproximadamente el 15% de las células se tiñeron con anticuerpos contra CD11a o CD18. Todas las células transfectadas con CD18 y cualquier construcción de \alpha_{d} no produjeron tinción detectable para CD11a y CD11b. Los grupos pATM.B1, pATM.C10 y pATM.D12 se tiñeron al 4%, 13% y 8% positivos para CD18, respectivamente. La fluorescencia de la población positiva en el grupo CD11a/CD18 fue 4 veces mayor que el fondo. En comparación, la co-transfección de construcciones de \alpha_{d} con la construcción de CD18 produjo una población positiva que mostró un aumento de 4 a 7 veces en la intensidad de la fluorescencia sobre el fondo.

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Ejemplo 10 Inmunoprecipitación Marcada con Biotina de Complejos de \alpha_{d} Humana/CD18 de Células COS Co-transfectadas

Se intentó la inmunoprecipitación sobre células co-transfectadas con CD18 y cada uno de los plásmidos de expresión de \alpha_{d} por separado descritos en el Ejemplo 7 para determinar si \alpha_{d} podía aislarse como parte del complejo heterodimérico \alpha\beta característico de las integrinas.

Las células transfectadas (1-3 x 10^{8} células/grupo) se retiraron de las placas petri con tampón Versene y se lavaron 3 veces en 50 ml/grupo de D-PBS. Cada muestra se marcó con 2 mg de Sulfo-NHS Biotina (Pierce, Rockford, IL) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió lavando 3 veces en 50 ml/muestra de D-PBS frío. Las células lavadas se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis (NP40 al 1%, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,2 M, Ca^{++} 2 mM, Mg^{++} 2 mM, e inhibidores de proteasa) y se incubaron 15 minutos en hielo. El material insoluble se sedimentó por centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos, y el sobrenadante se retiró a tubos frescos. Para retirar material no específicamente reactivo con inmunoglobulina de ratón, se realizó inicialmente una etapa de pre-aclarado. Se incubaron veinticinco microgramos de inmunoglobulina de ratón (Cappel, West Chester, PA) con los sobrenadantes a 4ºC. Después de 2,5 h, se añadieron 100 \mul (25 \mug) de anticuerpos de conejos anti-Ig de ratón conjugados con Sepharose® (preparados a partir de Proteína A Sepharose® 4B y anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón, ambos de Zymed, San Francisco, CA) a cada muestra; se continuó la incubación a 4ºC con balanceo durante 16 horas. Las perlas de Sepharose® se retiraron de los sobrenadantes por centrifugación. Después del pre-aclarado, los sobrenadantes después se trataron con 20 \mug de anticuerpo anti-CD18 (TS1.18) durante 2 horas a 4ºC. Se aislaron los complejos anticuerpo/antígeno de los sobrenadantes por incubación con 100 \mul/muestra de la preparación de conejo anti-ratón/Proteína A-Sepharose® descrita anteriormente. Las perlas se lavaron 4 veces con HEPES 10 mM, NaCl 0,2 M, y Triton-X 100® al 1%. Las perlas lavadas se sedimentaron y se hirvieron durante 10 minutos en 20 \mul de tampón de muestra Laemmli 2X con \beta-mercaptoetanol al 2%. Las muestras se centrifugaron y se procesaron en un gel de poliacrilamida Novex al 8% prevertido (Novex) a 100 V durante 30 minutos. La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) en tampón TBS-T a 200 mAmp durante 1 hora. Las membranas se bloquearon durante 2 h con BSA al 3% en TBS-T. Las membranas se trataron con una dilución 1:6.000 de estreptavidina:peroxidasa de rábano rusticano (POD) (Boehringer Mannheim) durante 1 hora, seguido de 3 lavados en TBS-T. Después se usó el kit Amersham Enhanced Chemiluminescence de acuerdo con las instrucciones del fabricante para revelar la mancha de transferencia. La membrana se expuso a Hyperfilm® MP (Amersham) durante 0,5 a 2 minutos.

La inmunoprecipitación de los complejos CD18 de células transfectadas con pRC.CD18 y pATM.B1, pATM.C10 o pATM.D12 reveló la expresión superficial de una especie heterodimérica constituida por una cadena \beta de aproximadamente 100 kD, coherente con el tamaño predicho de CD18, y una cadena \alpha de aproximadamente 150 kD, correspondiente a \alpha_{d}.

Ejemplo 11 Transfección Estable de \alpha_{d} Humana en Células de Ovario de Hámster Chino

Para determinar si \alpha_{d} se expresa en la superficie celular en forma de un heterodímero en asociación con CD18, se introdujeron por transfección tanto transitoria como estable ADNc que codifican cada cadena en una línea celular que carece tanto de \alpha_{d} como de CD18.

Para estos experimentos, el ADNc de \alpha_{d} se aumentó con secuencias líder adicionales y una secuencia Kozak consenso, como se ha descrito en el Ejemplo 7, y se subclonó en el vector de expresión pcDNA3. La construcción final, denominada pATM.D12, se introdujo por co-transfección con un vector comercial codificado, pDC1.CD18 que codifica CD18 humana en células de ovario de hámster chino (CHO) dihidrofolato reductasa (DHFR)^{-}. El plásmido pDC1.CD18 codifica un marcador DHFR^{+} y los transfectantes pueden seleccionarse usando un medio deficiente en nucleósidos apropiado. Las modificaciones que se produjeron en pDC1.CD18 son las siguientes.

El plásmido pRC/CMV (Invitrogen) es un vector de expresión de mamífero con un promotor de citomegalovirus y un gen marcador de resistencia a ampicilina. Se insertó un gen DHFR del plásmido pSC1190-DHFR en pRC/CMV 5' del origen de replicación de SV40. Además, se ligó un polienlazador desde la región 5' del plásmido pHF2G-DHF en la construcción pRC/CMV/DHFR, 3' al gen DHFR. Las secuencias que codifican CD18 posteriormente se clonan en el plásmido resultante entre la región polienlazadora flanqueante 5' y la región codificante poli A de la hormona del crecimiento bovina.

La expresión superficial de CD 18 se analizó por citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal TS1/18. La formación de heterodímeros detectada entre \alpha_{d} y CD18 en esta línea celular fue coherente con la inmunoprecipitación descrita en el Ejemplo 10 con expresión transitoria en células COS.

Ejemplo 12 \alpha_{d} Humana Se Une a ICAM-R de un Modo dependiente de CD18

En vista de los informes que demuestran las interacciones entre las integrinas de leucocitos y las moléculas de adhesión intercelular (ICAM) que median el contacto célula-célula [Hynes, Cell 69: 11-25 (1992)], se evaluó la capacidad de células CHO que expresan \alpha_{d}/CD18 de unirse a ICAM-1, ICAM-R, o VCAM-1 por dos procedimientos.

En ensayos duplicados, se inmovilizaron proteínas de fusión ICAM-1, ICAM-R, o VCAM-1 IgG1 solubles en plástico y se determinó la capacidad de células transfectadas CHO con \alpha_{d}/CD18 de unirse al ligando inmovilizado. Las células transfectadas se marcaron internamente con calceína, se lavaron en tampón de unión (RPMI con BSA al 1%), y se incubaron en tampón solamente (con o sin 10 ng/ml de PMA) o tampón con anticuerpos monoclonales anti-CD18 a 10 \mug/ml. Las células transfectadas se añadieron a placas de microtitulación Immulon® 4 de 96 pocillos previamente revestidos con la proteína de fusión ICAM-1/IgG1, ICAM-R/IgG1 o VCAM-1/IgG1 soluble, o albúmina de suero bovino (BSA) como control negativo. El diseño de las formas solubles de estas moléculas de adhesión se describe y se muestra completamente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente y del mismo propietario que la presente Nº de Serie 08/102.852, presentada el 5 de agosto de 1993. Los pocillos se bloquearon con BSA al 1% en PBS antes de la adición de células marcadas. Después de lavar las placas por inmersión en PBS con BSA al 0,1% durante 20 minutos, se midió la fluorescencia total restante en cada pocillo usando un Cytofluor® 2300 (Millipore, Milford, MA).

En experimentos con ICAM inmovilizadas, los co-transfectantes \alpha_{d}/CD18 mostraron de forma coherente un aumento de 3-5 veces en la unión a pocillos ICAM-R/IgG1 sobre los pocillos revestidos con BSA. La especificidad y dependencia de CD18 de esta unión se demostró por los efectos inhibidores del anticuerpo anti-CD18 TS1/18. La unión de las células transfectadas con CD11a/CD18 a pocillos ICAM-1/IgG1 fue comparable a la unión observada con pocillos revestidos con BSA. Las células transfectadas con CD11a/CD18 mostraron un aumento de 2-3 veces en la unión a pocillos ICAM-1/IgG1 solamente después del pretratamiento con PMA. El tratamiento con PMA de transfectantes \alpha_{d}/CD18 no afectó a la unión a pocillos ICAM-I/IgG1 o ICAM-R/IgG1. No se observó unión detectable de transfectantes \alpha_{d}/CD18 a pocillos VCAM-1/IgG1.

La unión de células transfectadas con \alpha_{d}/CD18 a proteínas de fusión ICAM-1/IgG1, ICAM-R/IgG1, o VCAM-I/IgG1 solubles se determinó por citometría de flujo. Se suspendieron aproximadamente un millón de células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18 (cultivadas en matraces en matraces rotativos para mayor expresión) por medición 100 \mul de tampón de unión (RPMI y BSA al 1%) con o sin 10 \mug/ml de anticuerpo anti-CD18. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron en tampón de unión y se añadió proteína de fusión ICAM-1/IgG1 o ICAM-R/IgG1 soluble a una concentración final de 5 \mug/ml. La unión se dejó proceder durante 30 minutos a 37ºC, después de lo cual las células se lavaron tres veces y se resuspendieron en 100 \mul de tampón de unión que contenía anticuerpo de oveja anti-IgG1 humana conjugado con FITC a una dilución 1:100. Después de una incubación de 30 minutos, las muestras se lavaron tres veces y se suspendieron en 200 \mul de tampón de unión para el análisis con un Becton Dickinson FACScan.

Aproximadamente el 40-50% de los transfectantes \alpha_{d}/CD18 indicaba unión a ICAM-R/IgG1, pero no unión a las proteínas ICAM-1/IgG1 o VCAM-1/IgG1. El pretratamiento de células transfectadas con PMA no tuvo efecto sobre la unión de \alpha_{d}/CD18 a ICAM-1/IgG1, ICAM-R/IgG1 o VCAM-1/IgG1, que era coherente con el ensayo de adhesión inmovilizado. La unión por ICAM-R se redujo a niveles de fondo después del tratamiento de los transfectantes \alpha_{d}/CD18 con anticuerpo anti-CD18 TS1/18.

Los datos colectivos de estos dos ensayos de unión ilustran que \alpha_{d}/CD18 se une a ICAM-R y lo hace con preferencia en comparación con ICAM-1 y VCAM-1. La preferencia de unión de \alpha_{d}/CD18 por ICAM-R sobre ICAM-1 es opuesta a lo observado con CD11a/CD18 y CD11b/CD18. Por tanto puede esperarse que la modulación de la unión de \alpha_{d}/CD18 afecte selectivamente a la función inmune normal y patológica donde ICAM-R desempeña una función destacada. Además, los resultados de ensayos similares, en que se ensayaron anticuerpos inmunoespecíficos para diversos dominios extracelulares de ICAM-R para su capacidad de inhibir la unión de ICAM-R a transfectantes \alpha_{d}/CD18, indicaron que \alpha_{d}/CD18 y CD11a/CD18 interaccionan con diferentes dominios de ICAM-R.

El fracaso de CD11a/CD18 de unirse a ICAM-1/IgG1 o ICAM-R/IgG1 en solución sugiere que la afinidad de unión entre CD11a/CD18 e ICAM-1 o ICAM-R es demasiado baja para permitir la unión en solución. La detección de la unión de \alpha_{d}/CD18 a ICAM-R/IgG1, sin embargo, sugiere una afinidad de unión inusualmente elevada.

En los ensayos descritos anteriormente, la proteína de fusión VCAM-1/Ig comprendía los siete dominios tipo inmunoglobulina extracelulares. La proteína de fusión se produjo en células CHO transfectadas y la producción de proteína se determinó por ELISA tipo sándwich. La proteína de fusión VCAM-1 de siete dominios del sobrenadante de células CHO se empleó sin purificación y se descubrió que el rendimiento de proteína era extremadamente bajo. A causa del bajo rendimiento de proteína en las preparaciones de VCAM-1, se re-examinó la unión de \alpha_{d}/CD18 a VCAM-1 usando una preparación de VCAM-1 comercial (® & D Systems, Minneapolis, MN) para determinar si la baja concentración de VCAM-1 producía la unión de \alpha_{d} indetectable.

Como anteriormente, se utilizaron células CHO que expresan \alpha_{d} y CD18 en ensayos de adhesión que emplean moléculas de adhesión recombinantes inmovilizadas. Usando citometría de flujo, se demostró que las células CHO transfectadas con \alpha_{d} expresaban tanto \alpha_{d} como CD18 y ninguna de las otras integrinas \beta_{2}. Las células CHO transfectadas también demostraron no expresar ninguna de las dos proteínas compañeras de unión de VCAM-1 conocidas, \alpha_{4}\beta_{1} y \alpha_{4}\beta_{7}. La línea celular CHO parental demostró no expresar las integrinas \alpha_{4} o \beta_{2}. Los experimentos de unión se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente.

Los resultados indicaron que células CHO transfectadas con \alpha_{d} se unían a VCAM-1 inmovilizada a un índice de aproximadamente el 14,2% en comparación con la unión a BSA inmovilizada a un índice del 7,5% y a selectina E a un índice del 2,8%. Además, la unión a VCAM-1 inmovilizada se bloqueó esencialmente (unión del 3,0%) en presencia de un anticuerpo monoclonal específico para el primer dominio de VCAM-1. Las células CHO parentales no se unieron a VCAM-1, selectina E o BSA (todos los índices de unión fueron menores del 2%). La unión de las células CHO transfectadas también disminuyó con pases seriados de las células que era coherente con la disminución observada en la expresión superficial de \alpha_{d} durante el mismo periodo de tiempo.

Para determinar si las células que expresan de forma natural \alpha_{d}/CD18 utilizan VCAM-1 como compañero de unión, se aislaron eosinófilos de sangre periférica y se cultivaron de cinco a siete días en presencia de 10 ng/ml de IL-5 para aumentar la expresión de \alpha_{d}. La citometría de flujo indicó que la incubación con IL-5 aumentaba la expresión de \alpha_{d} de dos a cuatro veces, pero no tenía efecto sobre la expresión de \alpha_{4}.

Los resultados indicaron que los eosinófilos cultivados se unían a VCAM-1 inmovilizada a un índice de aproximadamente el 28,8% y que la unión estaba parcialmente inhibida tanto por un anticuerpo monoclonal anti-CD18 (índice de unión del 17,1%) como por un anticuerpo monoclonal contra \alpha_{4} (índice de unión del 18,1%). Contrario a los resultados preliminares anteriores con bajos niveles y/o VCAM-1 impura, estos datos sugieren que \alpha_{d}\beta_{2} es un ligando de VCAM-1.

Se usó el ensayo de adhesión FACS descrito anteriormente para ensayar la unión de un mutante de ICAM-R E37A/Ig a células CHO que expresan \alpha_{d}/CD18. E37A/Ig ha demostrado obviar la unión a una quimera LFA-1/Ig [Sadhu, y col., Cell Adhesion and Communication 2: 429-440 (1994)]. La proteína mutante se expresó en una forma soluble a partir de la línea celular CHO transfectada de forma estable y se purificó en una columna Prose® A como se describe por Sadhu, y col., supra.

La unión de E37A/Ig con los transfectantes \alpha_{d}/CD18 no se detectó en ensayos repetidos. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de la quimera E37A/Ig detectada por anticuerpo anti-humano conjugado con FITC fue idéntica a la MFI del anticuerpo de detección solo, lo que indica que no había señal detectable por encima del fondo usando la proteína mutante E37A/Ig en el ensayo. Asimismo, en un ELISA, realizado como se describe en el Ejemplo 14, el mutante E37A/Ig no parecía unirse a \alpha_{d}/CD18 inmovilizado.

Unión de \alpha_{d} a iC3b

El componente del complemento C3 puede escindirse proteolíticamente para formar el complejo iC3b, que inicia la vía alternativa de activación del complemento y conduce finalmente a la destrucción mediada por células de una diana. Tanto CD11b como CD11c se han implicado en la unión a iC3b y posterior fagocitosis de partículas recubiertas con iC3b. Recientemente se ha identificado un fragmento peptídico en el dominio I de CD11b como el sitio de interacción de iC3b [Ueda, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 10680-10684 (1994)]. La región de unión de iC3b está altamente conservada en CD11b, CD11c, y \alpha_{d}, lo que sugiere una interacción de unión \alpha_{d}/iC3b.

La unión de \alpha_{d} a iC3b se realiza usando transfectantes o líneas celulares que expresan de forma natural \alpha_{d} (por ejemplo, células HL60 estimuladas con PMA) y glóbulos rojos de oveja recubiertos de iC3b (sRBC) en un ensayo de roseta [Dana, y col. J. Clin. Invest. 73: 153-159 (1984)]. Se comparan las capacidades de transfectantes CHO \alpha_{d}/CD18, transfectantes CHO VLA4 (control negativo) y células HL60 estimuladas con PMA (control positivo) de formar rosetas en presencia y ausencia de un anticuerpo monoclonal anti-CD18 (por ejemplo TS1/18.1).

Ejemplo 13 Exploración por Ensayo de Proximidad de Centelleo ID de Moduladores de la Unión de \alpha_{d}

Pueden determinarse inhibidores específicos de la unión entre los ligandos de \alpha_{d} de la presente invención y sus compañeros de unión (par ligando de \alpha_{d}/anti-ligando) por una diversidad de medios, tales como técnicas de ensayo de proximidad de centelleo que se describen en líneas generales en la Patente de Estados Unidos Nº 4.271.139, Hart y Greenwald, Mol. Immunol. 12: 265-267 (1979), y Hart y Greenwald, J. Nuc. Med. 20: 1062-1065 (1979), cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia.

En resumen, un miembro del par ligando de \alpha_{d}/anti-ligando se une a un soporte sólido directa o indirectamente. La captura indirecta implicaría un anticuerpo monoclonal, directamente unido al soporte, que reconozca un epítope específico en el extremo C-terminal de la proteína de la cadena \beta de la integrina soluble. Este epítope sería la proteína hemaglutinina o el epítope IIIE9 micobacteriano [Anderson, y col., J. Immunol. 141:607-613 (1988)]. Se une un agente fluorescente al soporte. Como alternativa, el agente fluorescente puede estar integrado en el soporte sólido como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.568.649, incorporada en este documento como referencia. El miembro no unido al soporte del par ligando de \alpha_{d}/anti-ligando se marca con un compuesto radiactivo que emite radiación capaz de excitar el agente fluorescente. Cuando el ligando se une al anti-ligando radiomarcado, el marcador se sitúa suficientemente cerca del agente fluorescente unido al soporte para excitar el agente fluorescente y causar emisión de luz. Cuando no está unido, el marcador generalmente está demasiado distante del soporte sólido para excitar el agente fluorescente, y las emisiones de luz son bajas. La luz emitida se mide y se correlaciona con la unión entre el ligando y el anti-ligando. La adición de un inhibidor de unión a la muestra disminuirá la emisión fluorescente evitando que el marcador radiactivo sea capturado en la proximidad del soporte sólido. Por lo tanto, los inhibidores de unión pueden identificarse por su efecto sobre emisiones fluorescentes de las muestras. También pueden identificarse anti-ligandos potenciales para \alpha_{d} por medios similares.

La construcción de \alpha_{d} recombinante/cremallera de leucina de CD18 soluble (véase el Ejemplo 14) se usa en un ensayo de proximidad de centelleo para seleccionar moduladores de la unión de CAM por el siguiente procedimiento. La integrina recombinante se inmoviliza con un anticuerpo anti-subunidad \alpha o anti-subunidad \beta no bloqueante previamente depositado sobre una placa impregnada de líquido de centelleo. Se añaden compuestos de una biblioteca química y una quimera CAM/Ig biotilinada específica a la placa simultáneamente. La unión de la quimera CAM/Ig se detecta por estreptavidina marcada. En el ensayo, ICAM-1/Ig y ICAM-R/Ig están biotiniladas con NHS-Sulfobiotina LC (cadena larga, Pierce) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las proteínas marcadas aún son reactivas con anticuerpos específicos para CAM y pueden demostrar reaccionar con LFA-1 inmovilizada por ELISA, con detección por Estreptavidina-HRP y posterior revelado con OPD.

Como alternativa, la proteína de cremallera de leucina recombinante se purifica, o se purifica parcialmente y se deposita directamente sobre la placa impregnada de líquido de centelleo. Se añaden la quimera CAM/Ig no marcada y compuestos de una biblioteca química simultáneamente. CAM/Ig unido se detecta con anticuerpo anti-Ig humana marcado con ^{125}I.

Como otra alternativa más, se inmoviliza la proteína CAM/Ig purificada sobre la placa de centelleo. Se añaden compuestos de una biblioteca química y el sobrenadante concentrado de células que expresan la integrina de cremallera de leucina recombinante a la placa. La unión de la integrina recombinante se detecta con un anticuerpo contra la subunidad \alpha o \beta no bloqueante, marcado.

Selección de Moduladores de Molécula Pequeña

Como un ensayo de proximidad de centello alternativo, se pueden identificar compañeros de unión de \alpha_{d} e inhibidores de los mismos usando ensayos tipo ELISA como se describe a continuación.

Se capturó la construcción de \alpha_{d}/cremallera de leucina (LZ) de CD18 soluble (véase el Ejemplo 14) de los sobrenadantes de cultivo tisular usando el anticuerpo anti-\alpha_{d} 212D (véase el Ejemplo 15). El anticuerpo 212D se inmovilizó en placas de 96 pocillos Immulon® IV (Costar) en tampón de revestimiento bicarbonato (pH 9,5) durante una noche a 4ºC. Se usó el mismo protocolo para inmovilizar el anticuerpo anti-CD11a TS2/4.1 para la inmovilización de una proteína de fusión de cremallera de leucina de LFA-1 (LFA-1 LZ); LFA-1 se usó como control negativo para la unión de VCAM-1 y control positivo para la unión de ICAM-1. Las placas se bloquearon con 300 \mul/pocillo de albúmina de suero bovino al 3% durante una hora y se lavaron en D-PBS. Los sobrenadantes de cultivo tisular de transfectantes CHO estables que expresan \alpha_{d}/CD18LZ o LFA-1LZ se añadieron a 100 \mul/pocillo y se dejaron incubar durante 6 a 8 horas a 4ºC. Las placas se lavaron dos veces con solución salina tamponada con Tris con Tween® 20 (TBS-T), seguido de un lavado con TBS (sin Tween®) que contenía 2 mM de cloruro cálcico, cloruro de magnesio, y cloruro de manganeso. Este último sirvió como tampón de ensayo y lavado durante el resto del ensayo.

Después de la captura de integrina, las placas se lavaron tres veces con 250 \mul/pocillo de TBS. Se añadió CAM/Ig purificada (véase el Ejemplo 12) a cada pocillo siguiendo diluciones 2:3 seriadas partiendo a una concentración de 10 a 20 \mug/ml. Se dejó que CAM/Ig se unieran durante dos horas a temperatura ambiente antes de que se lavaran las placas como anteriormente. La proteína de fusión unida se detectó con anticuerpo de cabra anti-Ig humana conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Jackson Labs) seguido de revelado con o-fenildiamina (OPD).

Los resultados indicaron que aunque ICAM-1/Ig causaba un aumento de 5 a 7 veces de la señal cuando está unida a LFA-1 LZ, no lograba unirse a \alpha_{d}/CD18LZ. En contraste, VCAM-1/Ig mostraba un aumento de 5 veces en la señal por encima del fondo en pocillos que contenían \alpha_{d}/CD18LZ, pero no en pocillos con LFA-1LZ. Un mutante de ICAM-R E37A/lg (véase el Ejemplo 12) no se unía a ninguna integrina.

Los anticuerpos monoclonales específicos de \alpha_{d} 212D, 217L, 217I, 217H, 217G, 217K, y 217M se ensayaron para la capacidad de inhibir la unión de VCAM-1 a \alpha_{d}/CD18 inmovilizada. Además, se usaron los anticuerpos monoclonales anti-VCAM-1 130K, 130P y IG11B1 (Caltag) para determinar la especificidad de reacción. Los anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d} se usaron a 5 \mug/ml y los anticuerpos anti-VCAM-1 a 25 \mug/ml; se usó la mayor concentración de anticuerpo anti-VCAM-1 en vista del hecho de que VCAM-1 está en solución en el sistema de ensayo.

Se provoca un bloqueo parcial (50%) en los pocillos tratados con 217I o 130K y 130P usados juntos. La combinación de 130K/130P también inhibe completamente la interacción de VLA-4 y VCAM-1 que sugería que \alpha_{d} y VLA-4 se unen a distintos sitios en VCAM-1 y la posibilidad de desarrollar antagonistas que impiden selectivamente la unión de \alpha_{d}/VCAM-1.

Este ensayo puede adaptarse del siguiente modo para realizar ensayos de exploración de alta producción para inhibidores de la unión de \alpha_{d}. VCAM-1/Ig se biotinila y se usa como anteriormente en presencia de compuestos químicos combinados previamente solubilizados en DMSO; después se detecta VCAM-1/Ig unida con un complejo estreptavidina-europio (Eu). El complejo estreptavidina-Eu se activa por quelación que produce una emisión de luz medible. Cambios, o más particularmente una disminución, en la emisión es indicativa de inhibición de la unión de VCAM-1/\alpha_{d}, supuestamente como resultado de la acción de uno o más compuestos en la combinación de moléculas pequeñas, que después se ensayan individualmente o en agrupaciones más pequeñas.

Ejemplo 14 Construcciones de Expresión de \alpha_{d} Humana Solubles

La expresión de la proteína heterodimérica \alpha_{d}/CD18 humana soluble de longitud completa proporciona fácilmente material purificado para ensayos de inmunización y unión. La ventaja de generar proteína soluble es que puede purificarse a partir de sobrenadantes en lugar de a partir de lisados celular (como con \alpha_{d}/CD18 unida a membrana de longitud completa); por lo tanto la recuperación se mejora y se reducen las impurezas.

El plásmido de expresión de \alpha_{d} soluble se construyó del siguiente modo. Se aisló un fragmento de nucleótidos correspondiente a la región de las bases 0 a 3.161 en la SEC ID Nº 1, clonado en el plásmido pATM.D12, por digestión con HindIII y AatII. Se amplificó un fragmento de PCR correspondiente a las bases 3.130 a 3.390 en la SEC ID Nº 1, que solapa el fragmento HindIII/AatII y que contiene un sitio de restricción MluI adicional en el extremo 3', a partir de pATM.D12 con los cebadores sHAD.5 y sHAD.3 expuestos en la SEC ID Nº 30 y 31, respectivamente.

5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3'	(SEC ID Nº 30)

5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3'	(SEC ID Nº 31)

El producto de amplificación por PCR se digirió con AatII y MluI y se ligó al fragmento HindIII/AatII. El producto resultante se ligó en el plásmido pDCI.s digerido con HindIII/MluI.

Esta construcción se co-expresa con CD18 soluble en células CHO transfectadas de forma estable, y la expresión se detecta por visualización autorradiográfica de complejos de CD18 inmunoprecipitados derivados de células marcadas con ^{35}S-metionina. La construcción también se co-expresa con CD18 en células 293 [Berman, y col., J. Cell. Biochem. 52:183-195 (1993)].

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Construcción de \alpha_{d} de longitud completa soluble

La in también contempla construcciones de expresión de \alpha_{d} alternativas. Para facilitar la expresión y purificación de un heterodímero \alpha_{d}/CD18 intacto, se construirán plásmidos de expresión de \alpha_{d} soluble y CD18 para que incluyan una secuencia de fusión de "cremallera de leucina" que debe estabilizar el heterodímero durante la purificación [Chang, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 91: 11408-11412 (1994)]. En resumen, se ha generado ADN que codifica las cadenas ácida y básica de aminoácidos de la cremallera por hibridación de cebadores usando los oligonucleótidos descritos en Chang, y col. Las secuencias de ADN se han modificado adicionalmente para incluir sitios de restricción MluI y XbaI adicionales en los extremos 5' y 3', respectivamente, del ADN para facilitar la subclonación en las construcciones de expresión de \alpha_{d} o CD18 previamente descritas. Además, se han añadido secuencias que representan la proteína hemaglutinina o una secuencia polihistidina, así como un codón de parada insertado después del sitio XbaI. Las secuencias de hemaglutinina o polihistidina se incorporan para facilitar la purificación por afinidad de la proteína expresada. Las secuencias que codifican la cadena básica de la cremallera se incorporan en el vector plasmídico que expresa CD18; la cadena ácida se inserta en la construcción de la cadena \alpha. Después de la expresión de las proteínas \alpha_{d} y CD18 modificadas en una célula huésped, se cree que la interacción entre las cadenas ácida y básica de la estructura de cremallera estabilizará el heterodímero y permitirá el aislamiento de la molécula \alpha_{d}/CD18 intacta por purificación por afinidad como se ha descrito anteriormente.

Se construyeron plásmidos para la expresión de \alpha_{d} soluble y CD18 con secuencias de "cremallera de leucina" ácidas y básicas y se introdujeron por transfección en células COS por el procedimiento de DEAE/Dextrano descrito en el Ejemplo 7. La proteína resultante se menciona como \alpha_{d}/CD18LZ. Las marcas de hemaglutinina y polihistidina no se incorporaron en \alpha_{d}/CD18LZ. Las células transfectadas se cultivaron durante 14 días en condiciones de suero reducido (2%). Los sobrenadantes recogidos cada cinco días de las células transfectadas se analizaron para la producción de proteína por ELISA como se ha descrito en el Ejemplo 8. En resumen, el heterodímero \alpha_{d}/CD18LZ se inmovilizó en placas revestidas con anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} 169B (véase el Ejemplo 15). El complejo \alpha_{d}/CD18LZ se detectó por la adición de un anticuerpo monoclonal anti-CD18 biotinilado, TS1/18.1 (véase el Ejemplo 8), seguido de la adición de conjugado estreptavidina/peroxidasa de rábano rusticano (HRP) y o-fenildiamina (OPD). La proteína era claramente detectable en los sobrenadantes.

Ensayo de Unión Usando Productos de Expresión de \alpha_{d} de Longitud Completa Solubles

Se realizaron ensayos de unión funcional usando el heterodímero \alpha_{d} de longitud completa/CD18LZ soluble descrito anteriormente inmovilizando el heterodímero en placas revestidas con anticuerpo monoclonal 169B o un anticuerpo monoclonal anti-CD18 no bloqueante (véase el Ejemplo 15). Los pocillos se bloquearon con gelatina de piel de pez para evitar la unión no específica antes de la adición de quimeras CAM/Ig (véase el Ejemplo 12) a una concentración de partida de 10 \mug/ml. La unión de las quimeras a \alpha_{d}/CD18 se detectó con un conjugado de cabra con HRP anti-Ig humana (Jackson Labs) y posterior revelado con OPD.

Se observó que VCAM-1/Ig se unía a \alpha_{d}/CD18LZ capturada a un nivel 3-5 veces mayor que a CD11a/CD18 capturado. ICAM-1/Ig e ICAM-2/Ig se unían al heterodímero CD11a/CD18 soluble aproximadamente 15 y 10 veces por encima del fondo, respectivamente, pero no se unían a \alpha_{d}/CD18. La unión de VCAM-1 se redujo aproximadamente un 50% en presencia de los anticuerpos 130K y 130P específicos de VCAM-1 usados en combinación.

El ensayo de unión también se realizó con la proteína ICAM/Ig inmovilizada en placas de 96 pocillos seguido de la adición de integrina soluble recombinante en sobrenadante celular. La unión de las integrinas solubles se detectó con un anticuerpo murino específicos de la subunidad \alpha o \beta no bloqueante no marcado, seguido de incubación con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con HRP y revelado con OPD.

Los resultados indicaron que un anticuerpo no bloqueante detectaba una unión de \alpha_{d}/CD18LZ a ICAM-R/Ig 10 veces mayor que la unión detectada en pocillos de control que no contienen anticuerpo. La unión de \alpha_{d}/CD18 soluble no se detectó con ICAM-1/Ig inmovilizada, sin embargo se detectó unión entre \alpha_{d}/CD18 y CD11b/CD18 inmovilizada y CD11a/CD18 15 y 5 veces, respectivamente, mayor que la unión de fondo.

Como estudios previos han demostrado que CD11b y CD11c se unen a lipopolisacáridos (LPS) [Wright, Curr. Opin. Immunol. 3: 83-90 (1991); Ingalls y Golenbock, J. Exp. Med. 181: 1473-1479 (1995)], también se evaluó la unión de LPS a \alpha_{d}/CD18 usando citometría de flujo y ensayos basados en placa. Los resultados indicaron que LPS marcado con FITC aislado de S. Minnesota y S. typhosa (ambas obtenidas de Sigma) a 20 \mug/ml era capaz de unirse débilmente a células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18. No se observó unión con células CHO de control no transfectadas. En ensayos de formato ELISA, LPS biotinilado [Luk, y col., Alan. Biochem. 232: 217-224 (1995)] a 0,5-3,0 \mug se unía a \alpha_{d}/CD18LZ inmovilizado con una señal cuatro veces mayor que el anticuerpo de captura y reactivo de bloqueo solo. La unión aparecerte de LPS a CD11a/CD18 se descontó restando de cada valor experimental la unión de fondo a anticuerpo anti-CD11a TS2/4.

Para identificar otros ligandos para \alpha_{d}/CD18, la proteína \alpha_{d}/CD18LZ recombinante se usa en un estudio de dos niveles. Se usa la unión de diversos tipos celulares a proteína inmovilizada para determinar qué células expresan ligandos de \alpha_{d} en la superficie celular. Después se usa la inhibición de anticuerpo para determinar si la unión celular observada está provocada por la interacción con moléculas de adhesión superficial. Si no se produce inhibición, se usa la coinmunoprecipitación con \alpha_{d}/CD18LZ unida a proteínas de lisados de células que se unirán a \alpha_{d} para intentar identificar el ligando.

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Construcciones de Expresión del Dominio I de \alpha_{d} Humana Soluble

Se ha informado previamente de que el dominio I en CD11a puede expresarse como una unidad estructural independiente que mantiene las capacidades de unión a ligando y el reconocimiento de anticuerpo [Randi y Hogg, J. Biol. Chem. 269: 12395-12398 (1994); Zhout, y col., J. Biol. Chem. 269: 17075-17079 (1994); Michishita, y col., Cell 72: 857-867 (1993)]. Para generar una proteína de fusión soluble que comprenda el dominio I de \alpha_{d} e IgG4 humana, se amplifica el dominio I de \alpha_{d} por PCR usando los cebadores diseñados para añadir los sitios de restricción BamHI y XhoI flanqueantes para facilitar la subclonación. Estos cebadores se exponen en las SEC ID Nº 32 y 33 con los sitios de restricción subrayados.

5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3'	(SEC ID Nº 32)

5'-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3'	(SEC ID Nº 33)

El nucleótido C inmediatamente 3' al sitio BamHI en la SEC ID Nº 32 corresponde al nucleótido 435 en la SEC ID Nº 1; el nucleótido G 3' al sitio XhoI en la SEC ID Nº 33 es complementario al nucleótido 1.067 en la SEC ID Nº 1. El dominio I amplificado se digiere con las enzimas apropiadas, el fragmento purificado se liga en el vector de expresión de mamífero pDCs y el vector de expresión procariota pGEX-4T-3 (Pharmacia) y se secuencia el fragmento del dominio I. La proteína de fusión después se expresa en células COS, CHO o E. coli transfectadas o transformadas con una construcción de expresión apropiada.

Dada la afinidad de \alpha_{d} por ICAM-R, la expresión del dominio I de \alpha_{d} puede ser de suficiente afinidad para que sea un inhibidor útil de la adhesión celular en que participa \alpha_{d}.

Análisis de Proteínas de Fusión del Dominio I de \alpha_{d} Humana/IgG4

La proteína se resolvió por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y se visualizó por tinción con plata o tinción de Coomassie. La proteína después se transfirió a membranas de PVDF Immobilon y se sometió a análisis de transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales anti-IgG humana o anticuerpos monoclonales anti-Ig bovina.

Se determinó que la proteína detectada migraba a aproximadamente 120 kD en condiciones no reductoras y a aproximadamente 45 kD en condiciones reductoras. También se detectaron bandas minoritarias en geles no reductores a aproximadamente 40-50 kD que eran reactivas con los anticuerpos anti-humano, pero no anti-bovino. Se determinó que una banda minoritaria de 200 kD era Ig bovina por transferencia de Western.

Ensayos de Unión Usando Productos de Expresión del Dominio I

Se ensayó la capacidad del dominio I de reconocer específicamente la proteína quimérica ICAM-R/IgG en un formato ELISA. Se incubaron diluciones seriadas de la proteína de fusión dominio I de \alpha_{d} IgG4 (I\alpha_{d}/IgG4) en TBS con ICAM-1/IgG, ICAM-R/IgG, VCAM-1/IgG, o una proteína de mieloma IgG1 no relevante inmovilizada en placas RIA/EIA Immulon® IV. Se usaron CD11, una proteína quimérica dominio I/IgG y proteína de mieloma IgG4 humana/kappa como controles negativos. Se detectó IgG4 unida con el anticuerpo monoclonal anti-IgG4 biotinilado HP6023 seguido de la adición de conjugado estreptavidina-peroxidasa y revelado con sustrato o-fenildiamina.

En ensayos repetidos, no se detectó unión de la proteína CD11a/IgG4 o la proteína de mieloma IgG4 con ninguna proteína inmovilizada. La proteína I\alpha_{d}/IgG4 no se unió a los agentes bloqueantes gelatina de piel de pez o albúmina de suero bovino, IgG1 humana, o ICAM-1/IgG. Se detectó un aumento de tres veces en la señal de unión sobre el fondo en los pocillos revestidos con proteína ICAM-R/IgG usando concentraciones de 1-5 \mug/ml de proteína I\alpha_{d}/IgG4. La señal en los pocillos revestidos con la proteína VCAM-1/IgG era 7-10 veces mayor que la de fondo. En ensayos previos, células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18 no se unieron a la proteína VCAM-1/IgG, lo que sugiere que la unión a VCAM-1 puede ser característica de las secuencias de aminoácidos del dominio I aislado.

Construcciones adicionales del dominio I de \alpha_{d}

Se generan construcciones adicionales del dominio I de \alpha_{d} del mismo modo que la construcción previa, pero incorporando más aminoácidos alrededor del dominio I de \alpha_{d}. Las construcciones específicas incluyen: i) secuencias desde el exón 5 (aminoácidos 127-353 en la SEC ID Nº 2), que preceden la construcción actual, ii) las repeticiones de mano EF (aminoácidos 17-603 en la SEC ID Nº 2) después del dominio I, y iii) la cadena alfa truncada en la región transmembrana (aminoácidos 17-1.029 en la SEC ID Nº 2), con una cola IgG4 para propósitos de purificación y detección. Estas construcciones se ligan en el vector de expresión de mamífero pDCS1 o el vector de expresión procariota vector pGEX-4T-3 (Pharmacia) y el dominio I secuenciado. Las proteínas de fusión después se expresan en células COS, CHO, o E. coli transformadas o transfectadas con una construcción de expresión apropiada. Las proteínas se purifican en una columna ProSepA® (Bioprocessing Limited, Durham, Inglaterra), se ensayan para la reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-IgG4 HP6023 y se visualizan en geles de poliacrilamida con tinción de
Coomassie.

Para construir un plásmido de expresión para el polipéptido \alpha_{d} completo, se modifica pATM.D12, descrito supra, para expresar una proteína de fusión \alpha_{d}-IgG4 por el siguiente procedimiento. Se aísla el ADN codificante de IgG4 del vector pDCS1 por PCR usando cebadores que incorporan individualmente un sitio de restricción AatII 5' (SEC ID Nº 89) y un sitio de restricción XbaI 3' (SEC ID Nº 90).

5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3'	(SEC ID Nº 89)

5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3'	(SEC ID Nº 90)

El plásmido pATM.D12 se digiere con AatII y XbaI, y el producto de PCR de IgG4 apropiadamente digerido y purificado se liga en el vector lineal.

Ejemplo 15 Producción de Anticuerpos Monoclonales Específicos de \alpha_{d} Humana

1. Se lavaron las células transfectadas de forma transitoria del Ejemplo 7 tres veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) y se inyectaron a 5 x 10^{6} células/ratón en ratones Balb/c con 50 \mug/ratón de muramil dipeptidasa (Sigma) en PBS. A los ratones se les inyectó dos veces más del mismo modo a intervalos de dos semanas. Se exploraron los sueros antes de la extracción de sangre e inmunizados de los ratones por análisis FACS como se ha mostrado en el Ejemplo 9 y se fusionó el bazo del ratón con la mayor reactividad a células transfectadas con \alpha_{d}/CD18. Después se exploraron por separado los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para la ausencia de reactividad contra células COS transfectadas con CD11a/CD18 y para la reactividad con células co-transfectadas con un plásmido de expresión de \alpha_{d} y CD18.

Este procedimiento no produjo anticuerpos monoclonales.

2. Como alternativa para la producción de anticuerpos monoclonales, se purificó por afinidad la proteína de fusión soluble del dominio I de \alpha_{d}/IgG4 del sobrenadante de células CHO transfectadas de forma estable y se usaron para inmunizar ratones Balb/c como se ha descrito anteriormente. Se establecieron hibridomas y se exploraron los sobrenadantes de estos hibridomas por ELISA para la reactividad contra la proteína de fusión del dominio I de \alpha_{d}. Después se analizaron los cultivos positivos para la reactividad con complejos \alpha_{d} de longitud completa/CD18 expresados en transfectantes CHO.

El ratón 1908 recibió tres inmunizaciones iniciales de células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18 y dos refuerzos posteriores con heterodímero \alpha_{d}/CD18 soluble. Dos inmunizaciones finales incluyeron 50 \mug/ratón de la proteína de fusión del dominio I de \alpha_{d}/IgG4. La fusión produjo 270 pocillos productores de IgG. El sobrenadante de 45 pocillos mostró una unión al menos 7 veces mayor a la proteína de fusión I\alpha_{d}/IgG4 que a IgG4 human por ELISA. Ninguno de los sobrenadantes reaccionó contra células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18 determinado por análisis FACS.

Para determinar si los sobrenadantes eran capaces de reconocer proteínas de la subunidad alfa de integrina en otro contexto, se tiñeron secciones esplénicas congeladas frescas con sobrenadantes de 24 de los 45 pocillos. Se determinó que tres sobrenadantes era positivos: un tiñó células grandes en la pulpa roja, mientras que otros dos tiñeron células dispersadas en la pulpa roja y también las trabéculas.

Estos sobrenadantes se analizaron adicionalmente por su capacidad de inmunoprecipitar complejos de CD18 biotinilados de células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18 o células HL60 estimuladas con PMA. Los pocillos de fusión con sobrenadantes que reconocían proteína en lisados detergentes (que no deben estar tan limitados conformacionalmente como la proteína expresada como heterodímeros) se seleccionaron para subclonación adicional. Los anticuerpos monoclonales que reconocen la proteína en detergente pueden ser más útiles en inmunoprecipitación de complejos heterodiméricos de transfectantes, tejidos, y líneas celulares.

3. Como otra alternativa para la producción de anticuerpo monoclonal, se inmunoprecipitaron complejos CD18 de lisados esplénicos humanos con el anticuerpo monoclonal anti-CD18 23F2G después del preaclarado de CD11a/CD18 (usando anticuerpo monoclonal TS2/4) y CD11b/CD18 (usando anticuerpo monoclonal Mo-1). Se inmunizaron cinco ratones Balb/c, de diez a doce semanas de edad, por inyección subcutánea con aproximadamente 30 \mug de proteína resultante en adyuvante completo de Freund en el día 0, seguido de dos refuerzos de 30 \mug de inmunógeno/ratón en los días 28 y 43 en adyuvante incompleto de Freund. Se extrajeron sueros de ensayo diez días después del refuerzo final y se evaluó la reactividad usando dilución 1:500 de cada suero para detectar 1 \mug/carril de inmunógeno en una transferencia de Western. Los sueros de tres ratones detectaron bandas de aproximadamente 95 y 150 kD; no se observó señal en carriles tratados con una dilución 1:50 de sueros preinmune. Se supuso que la banda de 150 kD representaba \alpha_{d} en un estado de glicosilación in vivo. Además, todos los sueros post-inmunes inmunoprecipitaron proteína de los lisados de células CHO \alpha_{d}/CD18 biotiniladas que migraron a pesos moleculares apropiados en SDS-PAGE que representan el heterodímero. A partir de estos resultados, se seleccionó el ratón nº 2212 y se inmunizó adicionalmente por inyección intraperitoneal en el día 64 con 30 \mug de inmunógeno en PBS. El ratón se sacrificó cuatro días después, y el bazo se retiró en esterilizada.

Se formó una suspensión celular única moliendo el bazo entre los extremos congelados de dos portaobjetos de microscopio sumergidos en RPMI 1640 libre de suero suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina (RPMI) (Gibco, Canadá). La suspensión celular se filtró a través de un tamiz celular Nitex de malla 70 estéril (Becton Dickinson, Parsippany, Nueva Jersey), y el filtrado se lavó dos veces por centrifugación a 200 x g durante 5 minutos. El sedimento resultante se resuspendió en 20 ml de RPMI libre de suero. Se prepararon timocitos obtenidos de tres ratones Balb/c vírgenes de una manera similar.

Antes de la fusión, se sedimentaron células de mieloma NS-1, mantenidas en fase log en RPMI con suero Fetalclone (FCS) al 10% (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) durante tres días prior antes de la fusión, por centrifugación a 200 x g durante 5 minutos, se lavaron dos veces como se ha descrito en el párrafo anterior, y se contaron. Se combinaron aproximadamente 2 x 10^{8} células esplénicas con 4 x 10^{7} células NS-1, y la mezcla resultante se sedimentó por centrifugación a 200 x g. Se desechó el sobrenadante. El sedimento celular disgregado por golpeteo del tubo y 2 ml de PEG 1500 al 50% en Hepes 75 mM (pH 8,0, 37ºC) (Boehringer Mannheim) se añadió durante un minuto con agitación. Posteriormente se añadieron 14 ml adicionales de RPMI libre de suero durante los siguientes siete minutos, seguido de adición inmediata a 16 ml de RPMI. La mezcla resultante se centrifugó a 200 x g durante 10 minutos y se desechó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 200 ml de RPMI que contenía FBS al 15%, hipoxantina sódica 100 mM, aminopterina 0,4 mM, timidita 16 mM (HAT) (Gibco), 25 unidades/ml de IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ml, y se dosificaron en diez placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos (Corning, Reino Unido) a 200 \mul/pocillo. Las células se alimentaron en los días 2, 4, y 6 días después de la fusión aspirando aproximadamente 100 \mul de cada pocillo con una guja 18 G (Becton Dickinson), y añadiendo 100 \mul/pocillo de medio de siembra descrito anteriormente, excepto que contenía 10 unidades/ml de IL-6 y carecía de timocitos. En el día 7-10 después de la fusión, se exploró el sobrenadante de cada pocillo por ELISA de captura de anticuerpo, ensayando la presencia de IgG de ratón. Se revistieron placas Immulon® 4 (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) con 50 \mul/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgA, IgG, o IgM de ratón (Organon Teknika) diluido 1:5.000 en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4ºC. Las placas se lavaron 3X con PBS que contenía Tween® 20 al 0,5% (PBST) y se añadieron 50 \mul de sobrenadante de cultivo de cada pocillo. Después de incubación a 37ºC durante 30 minutos, los pocillos se lavaron con PBST como anteriormente, y se añadieron 50 \mul de anticuerpo de cabra anti-IgG(fc) de ratón conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) diluido 1:3.500 en PBST a cada pocillo. Las placas se incubaron como anteriormente, se lavaron 4X con PBST y se añadieron 100 \mul de sustrato, que consta de 1 mg/ml de o-fenilendiamina (Sigma) y 0,1 \mul/ml de H_{2}O_{2} al 30% en Citrato 100 mM, pH 4,5. La reacción de color se detuvo después de cinco minutos con adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} al 15%. La absorbancia a 490 nm se determinó para cada pocillo usando un lector de placa (Dynatech).

Los hibridomas se caracterizaron adicionalmente del siguiente modo. Se analizaron los sobrenadantes de cultivos productores de IgG por citometría de flujo para la reactividad contra células CHO transformadas con \alpha_{d}/CD18 pero no contra células JY (una línea de células B positiva para LFA-1, pero no otras integrinas \beta_{2} como se ha observado en experimentos de tinción internos previos). En resumen, se suspendieron 5 x 10^{5} células CHO transformadas con \alpha_{d}/CD18 o células JY \alpha_{d}/CD18^{-} en 50 \mul de RPMI que contenía FBS al 2% y NaN_{3} 10 mM (tampón FACS). Se añadieron suspensiones celulares individuales a 50 \mul de sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma IgG positivo en pocillos de placas de fondo redondo de 96 pocillos (Corning). Después de incubación de 30 minutos en hielo, las células se lavaron dos veces sedimentando en una centrífuga clínica, se desechó el sobrenadante de cada pocillo, y los sedimentos se resuspendieron en 200-300 \mul de tampón FACS. El último lavado se remplazó con 50 \mul/pocillo de una dilución 1:100 de un conjugado de fragmento F(ab')_{2} de oveja anti-IgG de ratón (H + L)-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) preparado en Tampón FACS. Después de incubación como se ha descrito anteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS de Dulbecco (D-PBS) suplementado con NaN_{3} 10 mM, y finalmente se resuspendieron en D-PBS que contenía paraformaldehído al 1%. Las muestras después se transfirieron a tubos de poliestireno para el análisis de citometría de flujo (FACS) con un analizador Becton Dickinson FACscan.

La fusión produjo cuatro cultivos considerados positivos por ambos criterios. Cuando la exploración secundaria se repitió sobre sobrenadantes expandidos aproximadamente cuatro días después, tres de los cuatro cultivos permanecieron positivos. Los tres pocillos, denominados 169A, 169B, 169D se clonaron de dos a tres veces, sucesivamente, doblando la dilución en RPMI, FBS al 15%, hipoxantina sódica 100 mM, timidina 16 mM, y 10 unidades/ml de IL-6. Los pocillos de placas de clones se valoraron visualmente después de cuatro días y se registró la cantidad de colonias en los pocillos menos densos. Los pocillos seleccionados de cada clonación se ensayaron por FACS después de 7-10 días. Se encontró actividad en dos de los cultivos, 169A y 169B. En la clonación final, se expandieron pocillos positivos que contenían colonias sencillas en RPMI con FBS al 11%. Se isotiparon los anticuerpos de los sobrenadantes clonal de 169A y 169B usando el kit IsoStrip (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se descubrió que eran el isotipo IgG1.

Se usó la inmunoprecipitación de complejos \alpha_{d}/CD18 de transfectantes CHO y células HL60 estimuladas con PMA como una exploración terciaria para la especificidad. Los hibridomas 169A y 169B precipitaron bandas apropiadas de líneas CHO, y una única especie de cadena \alpha de 150-160 kD de células HL60 determinada por SDS-PAGE. Los hibridomas 169A y 169B se depositaron el 31 de mayo de 1995 en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mariland 20852 y con los Números de Acceso asignados HB11907 y HB11906, respectivamente.

Para caracterizar más completamente las propiedades de unión de 169A y 169B, se ensayó la capacidad de cada anticuerpo de inhibir la unión del otro o el anticuerpo anti-CD18 TS1/18.1 contra \alpha_{d}/CD18 soluble. Se inmovilizó \alpha_{d} de longitud completa/CD18 soluble por cada anticuerpo no marcado por separado en un formato de placa de 96 pocillos, y se usaron anticuerpos biotinilados para detectar proteína unida por los mismos o diferentes anticuerpos no marcados. La unión se detectó usando un conjugado de cabra anti-Ig de ratón/HRP seguido de la adición de sustrato OPD. Los resultados indicaron que el anticuerpo 169A era capaz de bloquear la unión de 169A y TS1/18.1 biotinilados, mientras que el anticuerpo 169B bloqueaba solamente su propia unión.

4. Otro ratón (nº 2214), inmunizado por el mismo protocolo que el ratón nº 2212, se seleccionó y se inmunizó adicionalmente por un refuerzo pre-fusión en el día 70 con 30 \mug de \alpha_{d} purificado de lisados esplénicos en PBS. El ratón se sacrificó cuatro días después, y el bazo se retiró de forma estéril.

La fusión y clonación de células positivas se realizó como se ha descrito anteriormente. La fusión produjo cinco hibridomas monoclonal anti-\alpha_{d} denominados 170D, 170F, 170E, 170X, y 170H que se isotiparon como IgG_{1} usando el kit IsoStrip (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Otro ratón más, nº 2211, inmunizado por el mismo protocolo inicial que el ratón nº 2212 y el ratón nº 2214, se seleccionó y se inmunizó adicionalmente en el día 88 con 30 \mug de inmunógeno y un refuerzo pre-fusión de 30 \mug inmunógeno en el día 203. El ratón se sacrificó cuatro días después, y se retiró el bazo y se realizó la fusión como se ha descrito anteriormente. El sobrenadante de hibridoma se exploró por ELISA de captura de anticuerpo y por citometría de flujo como se ha detallado en los párrafos anteriores.

Se identificaron quince hibridomas positivos, denominados 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 188I, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R y 188T, y se isotiparon en un ensayo ELISA. En resumen, se revistieron placas Immulon® 4 (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) a 4ºC con 50 \mul/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgA,G,M de ratón (Organon Teknika) diluido 1:5.000 en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Las placas se bloquearon durante 30 minutos a 37ºC con BSA al 1% en PBS, se lavaron tres veces con PBS/Tween® 20 al 0,05% (PBST) y se añadieron 50 \mul de sobrenadante de cultivo (diluido 1:10 en PBST). Después de incubación y lavado como anteriormente, se añadieron 50 \mul de anticuerpo de conejo anti-IgG_{1}, G_{2a}, o G_{3} de ratón conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Zymed, San Francisco, California), diluido 1:1.000 en PBST con suero de cabra normal al 1%. Las placas se incubaron como anteriormente, se lavaron cuatro veces con PBST, después de lo cual se añadieron 100 \mul de sustrato, que consta de 1 mg/ml de o-fenilendiamina (Sigma) y 0,1 \mul/ml de H_{2}O_{2} al 30% en citrato 100 mM, pH 4,5. La reacción de color se detuvo en 5 minutos con la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} al 15%. La A_{490} se leyó en un lector de placa (Dynatech) y se determinó que los quince anticuerpos eran IgG1.

El exceso de células esplénicas del ratón nº 2211 se congeló en un criovial y se almacenó en nitrógeno líquido. El criovial se descongeló rápidamente colocándolo en un baño de agua a 37ºC, y moviéndolo de un modo circular justo hasta que se fundieron los contenidos. Las células se transfirieron a un tuvo de centrífuga de 15 ml donde se añadido lentamente RPMI caliente que contenía FBS al 11% 1 ml cada vez, dejando de tres a cinco minutos entre las adiciones. Se añadieron otros 5 ml de RPMI caliente y después de una espera de cinco minutos, el tubo se centrifugó a 200 x g durante cinco minutos y se aspiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron en RPMI y se realizó una fusión como se ha descrito anteriormente. El sobrenadante de hibridoma se exploró por captura de anticuerpo y citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.

La fusión produjo cinco clones denominados 195A, 195C, 195D, 195E y 195H. Los clones se isotiparon por el procedimiento de ELISA como se ha descrito anteriormente; se determinó que los anticuerpos monoclonales 195A, 195C, 195D y 195E eran IgG_{1} y se determinó que 195H era IgG_{2a}.

6. En otro intento de generar anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d}, se inmunizó el ratón nº 2213 usando el mismo protocolo que para los ratones 2214, 2211, y 2212, pero también se inmunizó adicionalmente en el día 414 y 441 con 30 \mug de \alpha_{d} humana/cremallera de leucina (LZ) de CD18 unido a perlas de Sepharose®. El inmunógeno para el ratón nº 2213 se preparó inmunoprecipitando \alpha_{d} humana/CD18LZ (Ejemplo 14) con un anticuerpo monoclonal anti-CD18 y proteína A Sepharose®. El complejo precipitado se resuspendió en forma de una suspensión a una proporción 1:1 con PBS antes de la inyección. El ratón se sacrificó cuatro días después de la inmunización de refuerzo. Se retiró el bazo y se realizó una fusión como se ha descrito previamente con anterioridad.

Los hibridomas positivos se identificaron por ELISA usando \alpha_{d} humana/CD18LZ inmovilizado con el fragmento F(ab)'_{2} de un anticuerpo anti-CD18 no bloqueante. En resumen, los fragmentos F(ab)'_{2} se depositaron a 100 ng/pocillo sobre placas ELISA Immulon® 4 durante una noche a 4ºC. Después de que se aspirara el tampón, los pocillos se bloquearon durante 30 minutos a 37ºC con gelatina de piel de pez al 0,5% (Sigma). Después de lavar tres veces en PBST, se añadieron 50 \mul/pocillo de sobrenadante de células CHO, previamente transformadas con un plásmido que codifica \alpha_{d}/CD18LZ soluble, y las placas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Las etapas de lavado se repitieron y se añadieron 50 \mul/pocillo de sobrenadante de hibridoma. La detección del anticuerpo monoclonal se realizó como se ha descrito anteriormente. Los pocillos positivos se ensayaron por citometría de flujo usando células CHO transformadas con ADN que codifica \alpha_{d}/CD18 como se ha descrito anteriormente y se identificaron dos hibridomas positivos denominados 212A y 212D. Los anticuerpos secretados por los hibridomas se isotiparon como IgG1 usando el procedimiento de ELISA de isotipo descrito anteriormente.

7. En otro procedimiento más para generar anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d} humana, se inmunizaron ratones con perlas Sepharose® de \alpha_{d}/CD18LZ, preparadas como se ha descrito anteriormente, y cada ratón recibió 30 \mug de inmunógeno en el día 0, día 36, y día 66. El ratón nº 2477 se seleccionó para la fusión después de explorar los sueros de ratón por el formato de ELISA de proteína recombinante como se ha descrito anteriormente. Los procedimientos de fusión, selección, y clonación se realizaron usando los procedimientos descritos anteriormente para la fusión 212. Se identificaron siete hibridomas positivos, 217F, 217G, 217H, 217I, 217K, 217L, y 217M, pero el hibridoma 217F perdió reactividad determinada por citometría de flujo durante la última ronda de clonación. Se isotiparon anticuerpos de las seis líneas de hibridoma restantes como se ha descrito previamente y se descubrió que todas eran IgG1.

8. En otro procedimiento para generar anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d}, el ratón nº 2480 se inmunizó por el mismo protocolo que el ratón nº 2477 pero se inmunizó adicionalmente por inyección intraperitoneal en los días 217 y 218 con 30 \mug de \alpha_{d}/CD18LZ. El ratón se sacrificó en el día 221, se retiró el bazo y se realizó la fusión como se ha descrito anteriormente. Se exploró el sobrenadante de hibridoma por ELISA como se ha descrito y por citometría de flujo para determinar la reactividad a células JY previamente transfectadas con ADN que codifica \alpha_{d}/CD18. Los procedimientos de exploración se realizaron como se ha descrito anteriormente. La fusión produjo tres hibridomas positivos 240F, 240G, y 240H, que secretaban anticuerpos isotipados por el procedimiento de ELISA todos como IgG1. Un cuarto hibridoma, 240I, se caracterizó después también como el isotipo IgG1.

9. Para identificar anticuerpos capaces de inhibir la unión de \alpha_{d} funcional, se use \alpha_{d}/CD18LZ soluble (véase el Ejemplo 14) para la inmunización. La proteína se aísla en una resina de cromatografía de afinidad del sobrenadante de células COS transfectadas de forma transitoria y se usa \alpha_{d} unido a la resina como inmunógeno. Se inmuniza un ratón seleccionado como se ha descrito anteriormente y se le da un refuerzo final dos semanas después de la inmunización inicial. La inmunización por esta técnica evita posibles cambios en la conformación proteica a menudo asociada con lisis detergente de las células. Se inmunizan ratones adicionales con proteína recombinante, también unida a resina, pero no se inmunizaron inicialmente con proteína purificada de lisado celular.

Los hibridomas, preparados como se ha descrito anteriormente, producidos por la inmunización se exploran por ELISA sobre la proteína recombinante inmovilizada de un sobrenadante celular usando el fragmento Fab de un anticuerpo no bloqueante. Como alternativa, se usa citometría de flujo para ensayar la reactividad contra células JY previamente transfectadas con ADNc de \alpha_{d}.

10. Como otra alternativa, se generan anticuerpos monoclonales del siguiente modo. Se usa la proteína heterodimérica \alpha_{d}/CD18 purificada por afinidad de lisados detergentes de células CHO transfectadas de forma estable con 50 \mug/ml de muramil dipeptidasa para inmunizar ratones Balb/c como se ha descrito anteriormente. Los ratones reciben tres inmunizaciones antes de determinar la reactividad sérica contra \alpha_{d}/CD18 por inmunoprecipitación de complejos biotinilados en los transfectantes CHO. Se establecen hibridomas de animales positivos de acuerdo con protocolos convencionales, después de lo cual se seleccionan cultivos de hibridoma por citometría de flujo usando transfectantes \alpha_{d}/CD18. Se utilizan transfectantes CD11a/CD18 para controlar la reactividad solamente CD18.

11. Como otra alternativa para la producción de anticuerpos monoclonales, ratones Balb/c experimentan un protocolo de inmunización/inmunosupresión diseñado para reducir la reactividad contra determinantes de células CHO sobre transfectantes usados para inmunización. Este protocolo implica la inmunización con células CHO no transfectadas y posterior eliminación de los blastocitos B CHO-reactivos con tratamiento con ciclofosfamida. Después de realizar tres rondas de inmunización y tratamiento con ciclofosfamida, los ratones se inmunizan con células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18 como se ha descrito anteriormente.

12. Como otra alternativa, se enriquecen complejos CD18 de lisados detergentes de células HL60 estimuladas con PMA por preaclarado como se ha descrito anteriormente. Se eliminan otras integrinas \beta2 en las mismas columnas. La inmunización con los complejos resultantes, la producción de hibridoma, y los protocolos de exploración se realizan como se ha descrito supra.

Producción de Sueros Policlonales

Se usó la quimera dominio I de \alpha_{d}/IgG4 purificada (Ejemplo 14) para generar anti-suero policlonal en conejos. El antígeno dominio I de \alpha_{d}/IgG4 se inyectó a 100 \mug/conejo inicialmente en adyuvante completo de Freund, seguido de tres refuerzos con la misma cantidad de proteína en adyuvante incompleto de Freund. Se ensayaron las extracciones de sangre de ensayo después de la tercera y cuarta inyecciones. Se purificó inmunoglobulina (Ig) de conejo a partir del suero en una columna de proteína A-Sepharose® y se preaclaró de reactividad anti-IgG humana sobre una columna de IgG humana/Affigel® 10. Se usó la reactividad por ELISA contra la quimera del dominio I, pero no contra IgG humana, para confirmar el preaclarado completo.

Los sueros policlonales preaclarados se usaron para inmunoprecipitar proteína de lisados detergentes de células CHO biotiniladas en la superficie previamente transfectadas con vectores de expresión de \alpha_{d} y CD18. La inmunoprecipitación se realizó por el procedimiento descrito previamente en el Ejemplo 10. Los sueros preaclarados reconocieron un complejo proteico del miso peso molecular que el precipitado por anticuerpo monoclonal anti-CD18 TS 1.18. Además, los sueros reconocieron una única banda de tamaño apropiado en una transferencia de Western de complejos CD18 de células CHO transfectadas con \alpha_{d}/CD18. Las integrinas CD11a/CD18, CD11b/CD18, y VLA4 purificadas por afinidad de bazo humano no se reconocieron por los sueros policlonales de conejo. Los sueros no lograron reaccionar con células CHO transfectadas con \alpha_{d} en solución, como se determina por citometría de flujo. Por lo tanto se concluyó que los sueros policlonales de conejo eran solamente capaces de reconocer proteínas del domino I de \alpha_{d} desnaturalizado/IgG4.

En un intento de producir antisueros policlonales contra \alpha_{d}/CD18, se inmunizó un ratón 3 veces con células CHO transfectadas con \alpha_{d} (D6.CHO, \alpha_{d}/CD18) con péptido adyuvante y una vez con heterodímero \alpha_{d}/CD18 purificado. Un refuerzo final incluyó solamente heterodímero \alpha_{d}/CD18. Se preaclararon aproximadamente 100 \mul de suero inmunizado por la adición de aproximadamente 10^{8} células CHO transfectadas con LFA-1 durante 2 horas a 4ºC. El suero resultante se ensayó para la reactividad de \alpha_{d} a diluciones de 1/5.000, 1/10.000, 1/20.000 y 1/40.000 en bazo humano normal. El anticuerpo policlonal era reactivo a una dilución de 1/20.000, mientras que una dilución de 1/40.000 producía tinción muy débil.

Ejemplo 16 Análisis de Citometría de Flujo Usando Anticuerpos Monoclonales Anti-\alpha_{d}

Se usaron varias líneas celulares primarias e inmortalizadas en una inspección con los anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d} 212D, 217K, y 217L. Se realizó tinción celular y se analizó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 17. Las líneas celulares primarias CD8^{+}/CD56^{-} y CD4^{-}/CD8^{-}/CD56^{+} específicas para péptidos MAGE-3 (proteínas asociadas a melanoma) eran fuertemente positivas para CD11b y CD11c, pero no se tenían por ninguno de los anticuerpos contra \alpha_{d}. Las células específicas para péptidos MAGE-3 se expanden a partir de poblaciones de células mononucleadas de sangre periférica usando células presentadoras de antígeno cargadas de péptido (APC, células dendríticas o monocitos). Estimulaciones repetidas en condiciones de dilución limitante, combinadas con selección fenotípica, produjeron líneas citolíticas clonales que eliminarán específicamente células diana que albergan la proteína nativa de la que derivan los péptidos.

Células dendríticas de sangre periférica, cultivadas durante siete días en presencia de citoquinas IL-4 y GM-CSF, se tiñeron fuertemente por anticuerpos contra CD11a, CD11b, y CD11c, así como el anticuerpo anti-\alpha_{d} 217L. Los anticuerpos 212D, 217K, 217I, 217H, y 217M no reaccionaron con estas células ni con células dendríticas, obtenidas a partir de una diversidad de donantes, en experimentos repetidos. En el día 14 de cultivo, la expresión superficial del antígeno 217L había disminuido y la tinción desapareció completamente en el día 21. Durante el periodo de cultivo, la expresión de CD11b y CD11c permaneció a un elevado nivel (2 a 3 log sobre la tinción de fondo).

Ejemplo 17 Expresión de Monocitos Humanos de La Purificación de \alpha_{d} de Monocitos Humanos de Sangre Periférica

Se extrajeron aproximadamente 300 ml de sangre de un donante voluntario en tampón citrato sódico al 3,8% (Sigma). La sangre se diluyó a 480 ml con PBS libre de endotoxina (Sigma), y se estratificaron cuidadosamente 30 ml de la sangre diluida sobre 17 ml de Histopaque en un tubo de centrífuga de 50 ml. Los gradientes se centrifugaron durante 30 minutos a 1.500 rpm en una Centrífuga de Sobremesa Beckman. La fase celular, que representa células mononucleadas, se recogió de cada gradiente y se transfirió a un tubo de 50 ml nuevo. El volumen se aumentó a 50 ml con PBS libre de endotoxina, BSA al 0,1% (libre de endotoxina), y los tubos se centrifugaron durante 15 minutos a 1.500 rpm en una Centrífuga de Sobremesa Beckman. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en un pequeño volumen de PBS/BSA y posteriormente se combinaron.

Se requirió un segundo gradiente (que usa Percoll [Denholm y Wolber, J. Immunol. Meth. 144:247-25 (1991)]) para purificar monocitos de la población mixta de células obtenida como se ha descrito anteriormente. En resumen, se mezclaron 10 ml de tampón de Hank 10X (Gibco) con 600 \mul de HCl 1,0 N. A esta mezcla, se añadieron 60 ml de Percoll (Pharmacia, Piscataway NJ) y la mezcla se agitó lentamente hasta que todo el Percoll estuvo en solución. El pH de la solución de Percoll se ajustó a 7,0, después de lo cual se añadieron 8,0 ml de mezcla de gradiente a seis tubos de poliestireno de fondo redondo de 15 ml. Se añadieron exactamente 4,0 ml de suspensión celular a cada gradiente y se invirtieron los tubos varias veces para mezclar minuciosamente. Los gradientes se centrifugaron durante 25 minutos en un rotor de ángulo fijo a 1.690 rpm a temperatura ambiente. La fracción de monocitos, que apareció como una fina banda blanca en los gradientes, se recogió y se transfirió a tubos de centrífuga de 50 nuevos. El volumen se ajustó a 50 ml con PBS/BSA al 0,1% y las células se sedimentaron por centrifugación. Los sedimentos celulares se resuspendieron en un pequeño volumen y se combinaron y se determinó la cantidad de células usando un hemacitómetro. Las células se resuspendieron en tampón FACS (RPMI 1640, FBS al 2,0%, azida sódica al 0,2%) y se ajustaron a un millón de células/condición, es decir,se usaron un millón de células para cada condición de tinción FACS para ensayar diversos marcadores celulares.

Tinción y análisis FACS

Se realizó tinción celular de un único anticuerpo usando anticuerpos inmunoespecíficos para \alpha_{d} o marcadores celulares directamente conjugados con un marcador detectable de marca fluorescente. Se añadieron anticuerpos de ratón anti-\alpha_{d} humana 212D o 217L a las células a 10 \mug/ml después de lo cual la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos y se lavó tres veces. Se añadieron diez microlitros de marcadores celulares conjugados directamente, CD3-FITC (Becton-Dickinson) (específico para células T) o CD33-FITC (Becton-Dickinson) (específico para monocitos) a muestras celulares adicionales, mientras que se añadieron 10 \mul de un anticuerpo secundario, anti-ratón FITC (Sigma), a las células teñidas con 212D y 217L. Todas las muestras se incubaron en hielo durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron tres veces, y se resuspendieron en 300 \mul de paraformaldehído al 2,0%. Las muestras se procesaron en un Becton Dickinson FACScan y los datos se analizaron usando el software Lysys II (Becton Dickinson).

En el primer experimento, los monocitos representaban el 68% y las células T el 18% de las células totales purificadas usando el procedimiento de gradiente doble. Hubo una cantidad significativa de tinción de ambos tipos celulares para \alpha_{d} por 212D y 217L, el 55% y el 65% de las células respectivamente. En base a los últimos experimentos, parece que había alguna variación entre donantes en la cantidad relativa de tinción \alpha_{d} sobre monocitos humanos recién aislados, aunque los monocitos aislados siempre se tiñen positivos. Cuando se añadió IgG humana (usada a 1 mg/ml durante 10 minutos en hielo antes de la adición de anticuerpo primario) a las células para bloquear cualquier problema potencial de unión al receptor Fc, no hubo cambios en la tinción \alpha_{d}. Cuando estas células se cultivaron en suspensión usando placas revestidas con Hydron (Interferon Sciences) en FBS al 10%/RPMI-1640 y se analizaron para la expresión de \alpha_{d}, hubo pérdida de expresión superficial en las 24 horas que continuó disminuyendo durante un transcurso de tiempo de siete días. Relativa a la expresión de otras integrinas en monocitos humanos recién aislados, incluyendo CD11a, CD11b, y CD11c, la tinción \alpha_{d} fue inferior.

Tinción FACS de 2 colores de monocitos humanos para \alpha_{d}

Para la tinción FACS de 2 colores, se biotinilaron los dos anticuerpos 212D y 217L usando NHS-LC-biotina (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En un experimento diferente, las células se aislaron como se ha descrito anteriormente y se tiñeron usando anticuerpos 212D y 217L biotinilados y un anticuerpo IgG1 de control biotinilado a 10 \mug/ml en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces en tampón FACS (modificado para incluir D-PBS, FBS al 2%, y azida sódica al 0,2%), y se resuspendieron en 1,0 ml de tampón FACS. Se añadieron tanto 10 \mul de CD33 conjugado con FITC (específico para monocitos) como 5 ml de estreptavidina PE (PharMingen) a las suspensiones celulares. Las muestras se incubaron en hielo durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron 3 veces en tampón FACS, y se resuspendieron en 300 \mul de paraformaldehído al 1%. Las muestras se procesaron por FACS como se ha descrito anteriormente.

De los dos anticuerpos, 217L mostró tinción significativa sobre células CD33^{+} en comparación con el control. El anticuerpo 212D también tiñó este tipo celular, pero la cantidad de tinción de células CD33^{+} fue significativamente menor que el observado con anticuerpo 217L. Este resultado era coherente en dos experimentos diferentes. En experimentos relacionados usando anticuerpos biotinilados 212D y 217L, 217L-biotina tiñó coherentemente más células que 212D-biotina.

También se examinaron las células mononucleadas que representan una mezcla de linfocitos y monocitos antes de la separación en gradiente de Percoll por análisis de 2 colores como anteriormente, y se tiñeron doblemente para 212D y 217L-biotina en combinación con anticuerpos conjugados con FITC inmunoespecíficos para CD3 (células T), CD4 (células T auxiliares), CD5 (timocitos, células T maduras, sub-poblaciones de células B), CD8 (células T citotóxicas/supresoras), CD14 (monocitos, neutrófilos, células del retículo dendrítico folicular), CD20 (células B), y CD56 (células NK, subconjuntos de células T) (Becton Dickinson). Poblaciones \alpha_{d} positivas no discernibles de células se co-expresaron con estos marcadores celulares.

Ejemplo 18 Análisis de la Distribución de \alpha_{d}

La distribución tisular de \alpha_{d}/CD18 se determinó usando anti-suero policlonal generado como se ha descrito en el Ejemplo 15.

Se usó anticuerpo policlonal de conejo purificado a concentraciones que variaban entre 120 ng/ml y 60 \mug/ml para el análisis inmunocitoquímico de secciones de bazo humano congelado. Se estratificaron secciones de 6 micrómetros de grosor sobre Portaobjetos Superfrost Plus (VWR) y se almacenaron a -70ºC. Antes de su uso, los portaobjetos se retiraron de -70ºC y se colocaron a 55ºC durante 5 minutos. Después las secciones se fijaron en acetona fría durante 2 minutos y se secaron al aire. Las secciones se bloquearon en una solución que contenía BSA al 1%, suero humano normal al 30% y suero de conejo normal al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se aplicó el anticuerpo primario a cada sección durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo no unido se retiró lavando los portaobjetos 3 veces en tampón TBS durante 5 minutos por lavado. A continuación, se aplicó un anticuerpo de conejo de unión anti-IgG de ratón a cada sección en el mismo tampón TBS. Se usó un anticuerpo de ratón anti-fosfatasa alcalina conjugado con fosfatasa alcalina (APAAP), incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente, para detectar el anticuerpo secundario. Los portaobjetos después se lavaron 3 veces en tampón TBS. Se aplicó sustrato Fast Blue (Vector Labs) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Los portaobjetos se contratiñeron en Rojo Nuclear Fast (Sigma) y se aclararon en agua antes de montarlos con Aqua Mount (Baxter). La tinción se detectó en la pulpa roja esplénica con este reactivo, pero no con una preparación de Ig policlonal de conejo irrelevante o el suero preinmune sin purificar del mismo animal.

Una vez que se determinó que el suero de ratón tenía reactividad \alpha_{d} específica, se usó para teñir diversos tejidos linfoides y no linfoides. Se usaron anticuerpos monoclonales que reconocían CD18, CD11a, CD11b, y CD11c en el mismo experimento como controles. La tinción de secciones esplénicas normales con sueros policlonales contra \alpha_{d}, y anticuerpos monoclonales contra CD11a, CD11b, CD11c, y CD18 reveló los siguientes resultados. El patrón observado con sueros policlonales contra \alpha_{d} no presentó el mismo patrón de marcaje que CD11a, CD11b, CD11c, o CD18. Hay un patrón distinto de marcaje con algunas células localizadas en la zona marginal de la pulpa blanca y un marcaje distinto de células periféricas a la zona marginal. Este patrón no se observó con los otros anticuerpos. Las células individuales dispersadas en toda le pulpa roja también se marcaron que pueden ser o no la misma población o subconjunto observado con CD11a y CD 18.

El marcaje con CD11c presentó algunas células que se tiñen en la zona marginal, pero el anticuerpo no mostró el patrón de anillo distinto alrededor de la pulpa blanca cuando se compara con los sueros policlonales contra \alpha_{d}, ni el marcaje en la pulpa roja dio el mismo patrón de tinción que los sueros policlonales contra \alpha_{d}.

Por lo tanto, el patrón de marcaje observado con suero policlonal contra \alpha_{d} era único en comparación con el observado usando anticuerpos contra las otras integrinas \beta_{2} (CD11a, CD11b, CD11c, y CD18), y sugiere que la distribución in vivo de \alpha_{d} en el ser humano es distinta que la de otras integrinas \beta_{2}.

Caracterización de la Expresión de \alpha_{d} Humana Con Anticuerpos Monoclonales

Se usaron anticuerpos secretados por los hibridomas 169A y 169B para analizar la expresión de \alpha_{d} humana en secciones tisulares congeladas por inmunocitoquímica y sobre líneas celulares y leucocitos de sangre periférica por citometría de flujo. Los sobrenadantes de hibridoma usados en ambos conjuntos de experimentos estaban sin diluir.

Tinción Tisular

Todas las tinciones se realizaron como se ha descrito anteriormente, excepto para secciones hepáticas que se tiñeron de la siguiente manera. Después de fijación con acetona, las secciones se inactivaron en H_{2}O_{2} al 1% y azida sódica al 1% en TBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción con anticuerpo primario, se aplicó un anticuerpo de conejo anti-ratón directamente conjugado con peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron 3 veces en tampón TBS. Se incubó un anticuerpo de cerdo anti-conejo, directamente conjugado con peroxidasa, durante 30 minutos a temperatura ambiente para detectar el anticuerpo secundario. Los portaobjetos después se lavaron 3 veces en tampón TBS y se aplicó sustrato AEC (Vector Labs) y se permitió el desarrollo de color. Los portaobjetos se contratiñeron con Hematoxilina de Gill Nº 2 (Sigma), y posteriormente se aclararon en agua antes de la deshidratación y montaje.

En secciones esplénicas, la mayoría de la expresión se localizó en la pulpa roja esplénica en células identificadas por morfología como granulocitos y macrófagos. Se tiñó una gran cantidad de granulocitos, aunque solamente un subconjunto de macrófagos dio señal. Una pequeña cantidad de células dendríticas foliculares en la pulpa blanca también se tiñó débilmente por los anticuerpos contra \alpha_{d}. La tinción de CD11a y CD18 se detectó en toda la pulpa roja y la pulpa blanca. La tinción de CD11c fue más pronunciada en células grandes que se supone que son macrófagos en la pulpa blanca esplénica y en la zona marginal que rodea la pulpa blanca; también se observó tinción difusa en la pulpa roja. Parecía que CD11b tenía una distribución solapante con, aunque no idéntica, a \alpha_{d} en la pulpa roja, sin implicación de pulpa blanca.

Se comparó la expresión de integrina en tejido sinovial normal y artrítico (reumatoide). Se observó tinción mínima con todos los anticuerpos anti-integrina (incluyendo anticuerpos específicamente inmunorreactivos con CD11a, CD11b, CD11c, CD18, así como \alpha_{d}) en tejido normal, con una distribución extendida en células residentes, supuestamente macrófagos. En el sinovio inflamado, la expresión de todas las integrinas era más localizada en células agrupadas alrededor de vasos linfáticos. Aunque los patrones de expresión de \alpha_{d} y CD11b era similares, no parecía que CD11c se expresara fuertemente y estaba restringida a un subconjunto de leucocitos.

En perros, se observó expresión de CD11b, pero no de \alpha_{d}, en macrófagos hepáticos, o células de Kuppfer. La tinción de secciones hepáticas humanas normales (como se ha descrito previamente para la tinción de sección hepática de perro, supra) confirmó la conservación de este patrón de tinción en seres humanos. Además, se detectó CD11c a bajos niveles. En secciones de un paciente con hepatitis, la tinción de leucointegrina fue mayor que la observada en hígado normal, mientras que la expresión de \alpha_{d} se detectó en macrófagos y granulocitos en estas muestras.

Se observó tinción mínima de secciones de colon humano normal con anticuerpos anti-\alpha_{d}; se observó débil tinción de músculo liso y tinción de leucocitos. Todas las leucointegrinas se detectaron a niveles mayores en secciones de pacientes con enfermedad de Crohn.

El pulmón normal mostró una cantidad limitada de células débilmente positivas a \alpha_{d}; se determinó por morfología que éstas eran macrófagos y neutrófilos. En tejido pulmonar de un paciente con enfisema, se observó tinción de \alpha_{d} en neutrófilos y en macrófagos que contenían hemosiderina, un pigmento que contiene hierro, que indica el envolvimiento de células rojas por estas células.

Se examinaron secciones de cerebro normal y lesiones de placas de pacientes con esclerosis múltiple (MS) para la expresión de integrinas. En cerebro normal, la tinción de \alpha_{d} era menos intensa que la de CD11a, CD11b, y CD11c, y se restringía a células tipadas como células microgliales por morfología y tinción de CD68. Las células CD11b positivas se localizaban alrededor de vasos y en todo el tejido. Las células CD11c^{+} parecían estar localizadas dentro de los vasos, mientras que las células \alpha_{d}^{+} rodeaban los vasos. En secciones de tejido MS, la expresión de \alpha_{d} se encontró tanto en células microgliales como en un subconjunto de leucocitos no macrófagos; las células \alpha_{d}^{+} se localizaron dentro de lesiones de placa, así como en toda la corteza. La señal \alpha_{d} era equivalente en intensidad a CD11c, pero inferior que a la de CD11b.

Se analizaron muestras tisulares tanto de aorta torácica como de aorta abdominal de PDAY (Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth, LSU Medical Center) con anticuerpos anti-leucointegrina y anti-CAM. Las lesiones examinadas eran coherentes con las estrías grasas aórticas que constaban de agregados subintimales de células espumosas grandes (principalmente macrófagos con lípido ingerido) e infiltrados de leucocitos más pequeños. Estudios de único marcador con anticuerpos monoclonales específicos para \alpha_{d} y las otras cadenas \alpha de integrina \beta_{2} (CD11a, CD11b, y CD11c), más un marcador de macrófagos (CD68) revelaron que la mayoría de macrófagos cargados de lípido expresaban un nivel moderado de \alpha_{d} y CD18, mientras que expresaban CD11a y CD11c a niveles débiles o de débiles a moderados, respectivamente. CD11b apenas se expresaba, y además solamente por un subconjunto de macrófagos.

Se realizaron estudios de marcaje doble para determinar la localización relativa de antígeno \alpha_{d} e ICAM-R en las secciones aórticas. Como las células espumosas en estas secciones se teñían con el anticuerpo Ham 56, específico para un marcador de macrófagos, pero no con anticuerpos contra actina de músculo liso, se determinó que las células espumosas no derivaban de células de músculo liso subintimales. Los macrófagos CD68 positivos que expresan \alpha_{d} estaban rodeados por e intercalados con leucocitos ICAM-R positivos pequeños. Parece que había una cantidad limitada de leucocitos pequeños que eran CD68 negativos pero que se teñían con anticuerpos tanto contra \alpha_{d} como contra ICAM-R.

Parece que la distribución de \alpha_{d} en tejidos normales era en leucocitos residentes en un patrón solapante con, pero no idéntico, al del CD11b y CD11c, otras dos cadenas \alpha de leucointegrina que se han caracterizado previamente como que tienen distribución restringida a leucocitos. La morfología celular indicaba que la tinción de \alpha_{d} está confinada en gran medida a macrófagos y granulocitos, con tinción limitada de linfocitos. Generalmente, parece que la inflamación tisular aumentaba la cantidad y tipos de leucocitos observados en un tejido particular, junto con tinción aumentada de leucointegrinas, incluyendo \alpha_{d}. Como la distribución celular y espacial de las leucointegrinas no era idéntica en tejidos patológicos, se dedujo que existen distintas funciones y ligandos para cada miembro de la familia, incluyendo \alpha_{d}, en contextos específicos.

Es interesante observar que parecía que la expresión de \alpha_{d} en lesiones ateroscleróticas tempranas era más pronunciada que la de CD11a, CD11b, y CD11c, lo que sugiere que \alpha_{d} puede desempeñar una tarea central en el establecimiento de estas lesiones. La distribución opuesta de células \alpha_{d} e ICAM-R positivas, apoyada por evidencias que sugieren una interacción entre \alpha_{d} y ICAM-R, sugiere que \alpha_{d} puede estar implicado en el reclutamiento de leucocitos o la activación en fases tempranas en estas lesiones.

Línea Celular y Tinción de Leucocitos de Sangre Periférica

Los anticuerpos 169A y 169B teñían una línea celular promielomonocítica, HL60, por FACS. La expresión superficial de \alpha_{d} en estas células está negativamente afectada por estimulación con PMA, que se ha informado que induce diferenciación a través de la vía de los macrófagos, pero no está afectada por DMSO, que induce diferenciación de granulocitos [Collins, y col., Blood 70: 1233-1244 (1987)]. Los perfiles FACS de 169A y 169B eran antitéticos con estimulación con PMA a los observados con anticuerpos monoclonales anti-CD11b y anti-CD11c. Una línea celular de monocitos, THP-1, también mostró débil tinción con 169A y 169B. Además, parece que un subconjunto de células en las selecciones de linfocitos y monocitos de leucocitos de sangre periférica era débilmente positivo por FACS. Un subconjunto de monocitos de sangre periférica se teñía débilmente con 169A y 169B, mientras que se descubrió que los linfocitos B no tenían expresión superficial de \alpha_{d}. El subconjunto CD8^{+} de linfocitos T era \alpha_{d}^{+}. Además, los anticuerpos 169A y 169B no lograban detectar antígeno en las líneas de células B, JY, Ramos, un línea basófila, KU812, y líneas de células T, Jurkat, SKW, y Molt 16.

A la luz de los resultados con células HL60, se aislaron granulocitos de sangre periférica por centrifugación en gradiente de ficoll/hypaque y posterior lisis de los glóbulos rojos. Se descubrió que todas las preparaciones eran >90% PMN por visualización de morfología nuclear en ácido acético. Se estimularon poblaciones diferentes durante 30 minutos con 50 ng/ml de PMA o formil péptido (fMLP) 10^{-8} M para liberar los almacenes potenciales de integrina intracelular. Las poblaciones no estimuladas mostraron baja, aunque significativa, expresión de antígenos 169A y 169B en un control de IgG1, con un aumento detectable observado después de la estimulación. En PMN, los niveles de expresión superficial de \alpha_{d} y CD11c eran más similares que los observados en células HL60. Posteriormente se usó el anticuerpo 169B para precipitar una molécula heterodimérica de un lisado detergente de PMN biotiniladas con tamaños de subunidad de aproximadamente 150 y 95 kD apropiados para \alpha_{d} y CD18, respectivamente.

La presencia de \alpha_{d} en PMN no podía esperarse de la información conocida acerca de la expresión de \alpha_{d} canina. Los neutrófilos caninos, a diferencia de sus equivalentes humanos, expresan el marcador de células T auxiliares CD4, y también la integrina VLA-4, y por lo tanto en perros pueden tener diferentes ligandos y funciones que en seres humanos.

Tinción de subgrupos de PBL

El presente estudio se emprendió para determinar la distribución de esta integrina \beta_{2} en leucocitos de sangre periférica humana. Además, se comparó la densidad en la superficie celular de \alpha_{d} relativa a otras integrinas \beta_{2}. Finalmente, también se evaluó la regulación aguda de la expresión de \alpha_{d} en eosinófilos humanos purificados.

Se separaron leucocitos de sangre periférica humana por centrifugación en gradiente de densidad en una fracción de células mononucleadas (que contiene monocitos, linfocitos, y basófilos) y granulocitos (neutrófilos y eosinófilos) [Warner, y col., J. Immunol. Meth. 105: 107-110 (1987)]. Para algunos experimentos, se purificaron eosinófilos usando selección inmunomagnética de CD16 a purezas mayores del 95% [Hansel, y col., J. Immunol. Meth. 122: 97-103 (1989)]. Se dispersaron enzimáticamente mastocitos cutáneos de piel humana y se enriquecieron como se ha descrito previamente [Lawrence, y col., J. Immunol. 139: 3062-3069 (1987)].

Las células se marcaron con diluciones apropiadas de anticuerpo monoclonal específico para CD11a (MHM24), CD11b (H5A4), CD11c (BU-15), o \alpha_{d} (169A). También se empleó una IgG_{1} de control murino. Las células se lavaron y después se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con ficoeritrina. En algunos experimentos, las células se incubaron con exceso de IgG murina y anticuerpo monoclonal murino marcado con FITC o anticuerpo policlonal de cabra específico para una célula particular (por ejemplo, CD3, CD4, o CD8 para células T; linfocitos CD16+ para células NK; anti-IgE para basófilos) [Bochner, y col., J. Immunol. Meth. 125: 265-271 (1989)]. Las muestras después se examinaron por citometría de flujo (Coulter EPICS Profile) usando sensibilización apropiada para identificar subconjuntos celulares.

Para estudios con eosinófilos humanos en que se examinó la regulación positiva aguda de la expresión de \alpha_{d}, las células se estimularon durante 15 minutos a 37ºC con éster de forbol (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) [Schall, Cytokine 3: 165-183 (1991)], o IL-5 (10 ng/ml) antes del marcaje con los diversos anticuerpos monoclonales como se ha descrito anteriormente.

Los resultados mostraron que \alpha_{d} estaba presente en todos los eosinófilos de sangre periférica, basófilos, neutrófilos, monocitos, y células NK. También se descubrió que un pequeño subconjunto (aproximadamente el 30%) de linfocitos CD8^{+} expresaba \alpha_{d}. Los mastocitos cutáneos y linfocitos CD4^{-} no expresaban \alpha_{d}. En general, CD11a y CD11b están presentes a una densidad mayor en leucocitos que \alpha_{d}, expresándose éste último a niveles relativamente bajos similares a CD11c. Entre los leucocitos, los monocitos y células CD8^{+} tienen la mayor densidad de \alpha_{d}, mientras que los eosinófilos tienen el nivel más bajo de expresión de \alpha_{d}. La expresión en neutrófilos, basófilos, y células NK era intermedia.

La estimulación de eosinófilos periféricos con la quimioquina CC RANTES no causaba cambios en la expresión de ninguna de las integrinas \beta_{2}. El tratamiento con éster de forbol, sin embargo, producía un aumento de dos a tres veces en la expresión tanto de CD11b como de \alpha_{d}, pero no afectaba a la expresión de CD11a o CD11c. El tratamiento con IL-5 provocaba la regulación positiva selectiva de la expresión de CD11b sin afectar a los niveles de las otras subunidades de integrina.

Combinados, estos resultados indican que en leucocitos de sangre periférica, \alpha_{d} se expresa generalmente a un nivel comparable con CD11c. Los mayores niveles se encuentran en monocitos y un subconjunto de linfocitos CD8^{+}. Los mastocitos cutáneos humanos no expresan \alpha_{d}. Parece que los eosinófilos purificados tienen combinaciones de almacenamientos intracitoplasmáticos pre-formados de CD11b y \alpha_{d}. Sin embargo, la regulación positiva diferencial mostrada por IL-5 frente a PMA sugiere que estas combinaciones de almacenamientos están separadas entre sí.

Los patrones de tinción para subgrupos de leucocitos de sangre periférica (PBL) también se determinaron por citometría de flujo usando una combinación de sensibilización y marcadores superficiales, como se ha descrito anteriormente, en un intento de definir de forma más precisa el grupo de linfocitos 169 A/B negativos. Se aislaron PBL en Ficoll como se ha descrito anteriormente y se tiñeron por separado con 169A, 169B y anticuerpos monoclonales contra CD14 (marcador de monocitos/macrófagos), CD20 (células B), CD56 (células NK), receptor de células T \alpha/\beta (células T), CD16 (neutrófilos, NK), y \alpha4 (un marcador negativo para neutrófilos). Las selecciones se definieron por tamaño y distribución de marcador. Los resultados indicaron que las células en la selección de monocitos CD14+ mostraban bajos niveles de tinción con 169A y 169B. Se resolvió un patrón de expresión bimodal observado en experimentos anteriores en la selección de linfocitos aumentando la dispersión directa. Parece que la población TCR^{+}/CD20^{+} mixta, tenía niveles bajos, aunque homogéneos, de expresión de 169A/B, mientras que una población mapeada a dispersión lateral ligeramente mayor (complejidad celular), que se tenía al 50% positiva para CD56, parece que tenía una población claramente 169A/B negativa. La población negativa tampoco se reconocía por anticuerpos contra TCR, CD20, CD14, o CD16.

Distribución Sinovial de \alpha_{d}

Para determinar la distribución celular de \alpha_{d}, se usaron otras integrinas \beta_{2} y sus contrarreceptores en sinovio inflamatorio y no inflamatorio, anticuerpos monoclonal contra las diversas integrinas \beta_{2} y superfamilias del gen de inmunoglobulina en estudios inmunohistológicos. Se determinó la expresión proteica en muestras de tejido sinovial normal, osteoartrítico y reumatoide.

Los resultados indicaron que la capa celular de revestimiento sinovial expresaba elevados niveles de VCAM-1, CD11b/CD18 y \alpha_{d}/CD18. En estas células, la expresión de CD11c/CD18 está restringida y CD11a/CD18 generalmente no se detecta. En sinovitis por artritis reumatoide, la expresión de integrinas \beta_{2} en la capa celular sinovial aumenta en proporción al grado de hiperplasia. La proporción de células que expresa CD11c aumenta significativamente, acercándose a la de CD11b y \alpha_{d}, pero no hay aumento en la expresión de CD11a.

En las áreas por debajo del revestimiento del tejido, se intercalan agregados e infiltrados difusos de linfocitos CD3/CD11a/ICAM-R^{+} entre macrófagos CD68/CD11b/\alpha_{d}^{+}. Una cantidad significativa de agregados muestra intensa tinción \alpha_{d}, particularmente en áreas ricas en células T.

El endotelio sinovial expresaba de forma variable ICAM-1 e ICAM-2 con evidencias mínimas de expresión de ICAM-R.

Combinados, estos resultados indican que los macrófagos sinoviales y células sinoviales tipo macrófago expresan de forma constitutiva elevados niveles de las integrinas \beta_{2} CD11b y \alpha_{d}. En sinovitis, hay una expansión de este subconjunto de células en áreas tanto de revestimiento como por debajo del revestimiento, junto con un aumento aparente en la expresión de CD11c. Poblaciones específicas de linfocitos T sinoviales reumatoides, además de expresar CD11a y ICAM-R, también expresan elevados niveles de \alpha_{d}, habiéndose demostrado anteriormente que la última molécula se expresa a bajos niveles por linfocitos de sangre periférica.

Expresión de \alpha_{d} en Tejido Pulmonar y Hepático Enfermo

Se hicieron secciones de tejido pulmonar de un individuo con sarcoidosis y tejido hepático de dos individuos con cirrosis a 6 \mum de grosor y se secaron al aire en portaobjetos Superfrost Plus (VWR Scientific) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Antes de su uso, los portaobjetos se incubaron a 50ºC durante aproximadamente 5 minutos. Las secciones se fijaron en acetona fría (4ºC) (EM Science) durante 2 minutos a temperatura ambiente y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente. Las secciones se colocaron en una solución de 100 ml de TBS 1X, 1,1 ml de H_{2}O_{2} al 30% (Sigma), 1,0 ml de NaN_{3} al 10% (Sigma), durante 15 minutos a temperatura ambiente para retirar la actividad peroxidasa endógena. Cada sección se bloqueó con 150 \mul de una solución que contenía suero humano normal al 20% (Boston Biomedica), suero de rata normal al 5% (Harlan), y BSA al 2% (Sigma) en TBS 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de incubación, la solución se transfirió suavemente desde las secciones. Se preparó anticuerpo monoclonal primario a una concentración proteica de 10 \mug/ml en solución de bloqueo y se aplicaron 75 \mul a cada sección tisular durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de incubación, las secciones se lavaron tres veces en TBS 1X durante 5 minutos cada lavado para retirar el anticuerpo no unido. Se retiró el exceso de TBS aspirando alrededor del tejido seguido de un lavado final. Se diluyó anticuerpo de rata anti-ratón biotinilado (Jackson Laboratories) 1:400 en solución de bloqueo y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces con TBS 1X durante 5 minutos cada lavado. Se diluyó anticuerpo de cabra anti-biotina conjugado con peroxidasa (Vector Laboratories) 1:200 en solución de bloqueo y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces en TBS 1X durante 5 minutos cada lavado. Se aplicó sustrato 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) (Vector Laboratories) o sustrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina de Gill nº 2 (Sigma) y se aclararon en agua antes de montarlos con Aquamount (Baxter) o Cytoseal (VWR).

En el pulmón con sarcoidosis, solamente el anticuerpo monoclonal 217L tiñó las células y la mayoría de la expresión del epítope 217L se localizó en granulomas. Parece que las células gigantes dentro de los granulomas eran negativas para el antígeno 217L. La expresión del epítope 217L se localizó en células que morfológicamente parecía que eran histiocitos epitelioides, células fagocíticas altamente diferenciadas del linaje de macrófagos. Se observó que la distribución de otras integrinas solapaba con la del epítope 217L en el pulmón con sarcoidosis, pero los patrones de expresión no eran idénticos. Por ejemplo, los anticuerpos inmunoespecíficos para todas las demás integrinas marcaban células en los granulomas así como las células gigantes que eran negativas para tinción 217L.

Las secciones de un segundo paciente diagnosticado con sarcoidosis eran negativas para la expresión del epítope 217L, sin embargo no está claro a partir de otros informes de patología si este paciente había recibido inmunosupresores esteroideos, la forma más común de tratamiento.

En secciones del tejido hepático cirrótico, los anticuerpos anti-\alpha_{d} marcaron células espumosas en el tejido conectivo entre nódulos hepáticos así como un subconjunto de linfocitos. La distribución de CD11c solapaba con la expresión de \alpha_{d} pero no era idéntica; el anticuerpo anti-CD11c también marcaba un subconjunto de células espumosas pero marcaba más macrófagos y linfocitos que el anticuerpo anti-\alpha_{d}. No había solapamiento aparente en la distribución de la expresión de CD11a y CD11b con la expresión de \alpha_{d}.

El anticuerpo 217L también tiñó células tipo fagocito que estaban agrupadas y aisladas de las poblaciones identificadas tanto por 212D como por 217L. Los anticuerpos contra CD11b y CD11c tiñeron los grupos 217L^{+} de un modo diferente.

En experimentos relacionados, se usaron los anticuerpos 212D y 217L para teñir secciones tisulares esplénicas humanas así como secciones seriadas de bazos del primate no humano M. nemestrina. También se evaluaron esplenocitos aislados de tejido esplénico humano y de mono fresco por citometría de flujo para la expresión de \alpha_{d}. Ambos anticuerpos 212D y 217L reconocieron los esplenocitos humanos y de mono. Tanto por ICC como FACS, la población \alpha_{d}^{+} representaba aproximadamente el 20% de las células totales, a diferencia de los roedores que muestran un porcentaje mayor de células \alpha_{d}^{+}. La población positiva parecía ser morfológicamente idéntica a macrófagos.

Tinción de Médula Ósea Humana

Se obtuvieron muestras de médula ósea humana del hueso ilíaco de donantes de médula ósea sanos de acuerdo con técnicas convencionales. La muestra original se diluyó 1:3 en medio de Iscove y se centrifugó durante 20 minutos a 2.000 RPM. La capa leuco-plaquetaria se recogió cuidadosamente, se lavó una vez, y se hemolisó usando tampón hemolítico (cloruro de amonio al 0,83%, bicarbonato sódico al 0,1%, sin EDTA). Las células se resuspendieron en PBS con FBS al 15%, se hicieron alícuotas a 100.000 células/tubo en 100 \mul, y se pusieron en hielo. Se realizó inmunotinción como se ha descrito anteriormente. En resumen, se añadió individualmente anticuerpo monoclonal de ratón anti-\alpha_{d} humana 212D o 217L o anticuerpo de ratón anti-CD18 humana o de ratón anti-CD50 humana (específico de ICAM-R) a cada muestra celular a una concentración final de 10 \mug/ml y la mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. Las células se lavaron dos veces y se incubaron durante 20 minutos adicionales con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FITC. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en paraformaldehído al 1%. La fluorescencia se midió usando un Clasificador de Células Activadas por Fluorescencia FACSCAN (Becton Dickinson). Los resultados de cuatro experimentos indicaron que la expresión de \alpha_{d} determinada usando anticuerpo 212D se encontraba en el 13 al 43% de las células (media 27%) y en el 6 al 55% de las células (media 21%) usando anticuerpo 217L. La expresión de CD18 se observó en el 60-96% de las células (media 71%) y CD50 en el 86-99% de las células (media 94%).

Expresión de \alpha_{d} en Células Mononucleadas de Sangre Periférica de Pacientes con Cáncer de Mama

Se aislaron células mononucleadas de sangre periférica usando separación con Ficoll de muestras sanguíneas de pacientes con cáncer de mama de elevado riesgo, es decir, aquellos pacientes que tienen cáncer de mama con mañas características de pronóstico, que habían experimentado transplante de médula ósea. Las células se exploraron por inmunotinción para la expresión de \alpha_{d} como se ha descrito anteriormente.

Los resultados indicaron que la expresión de \alpha_{d} determinada usando anticuerpo 212D se encontraba en el 20% de las células y en el 13% de las células usando anticuerpo 217L. El anticuerpo 212D también teñía una subpoblación de células pequeñas que parece muy probable que fueran linfocitos. El porcentaje de células que expresan \alpha_{d} era comparable con el observado generalmente en un donante de sangre normal.

Además, parece que el anticuerpo 212D teñía no solamente células grandes que eran CD14^{+}, sino también células mucho más pequeñas que se identificaron de forma indecisa como CD3^{+}. Este resultado se observó tanto en sangre como en médula ósea.

La variación de la cantidad de células que expresan \alpha_{d} puede explicarse por una variación en la composición celular del aspirado de médula ósea de un donante a otro (por ejemplo, la cantidad de médula ósea en comparación con la cantidad de sangre en circulación).

Ejemplo 19 Regulación Positiva de la Expresión \alpha_{d}

Como las integrinas de leucocitos generalmente se regulan positivamente durante la hemodiálisis y contribuyen a las alteraciones inmunes observadas en fallo renal crónico [Rabb, y col., J. Am. Soc. Nephrol. 6: 1445-1450 (1995) y Rabb, y col., Am. J. Kidnet Dis. 23:155-166 (1994)], se examinó la expresión superficial de \alpha_{d}/CD18 durante hemodiálisis y fallo renal crónico. Además, también se investigó la expresión de \alpha_{d}/CD18 in vitro después de estimulación con PKC.

Se obtuvieron muestras de sangre completa de cinco pacientes hospitalarios elegidos aleatoriamente con afecciones no renales. Las muestras sanguíneas se incubaron con PMA a 50 ng/ml durante 30 minutos a 37ºC antes de la tinción superficial y citometría de flujo. También se recogieron muestras sanguíneas de pacientes con fallo renal crónico. Los pacientes eran estable, no diabéticos que estaban experimentando diálisis tres veces a la semana. Se obtuvieron muestras iniciales antes de comenzar la diálisis, y se extrajeron muestras posteriores a 15 minutos y 180 minutos durante la diálisis con una membrana de cuprophan. Se usaron muestras sanguíneas de sujetos normales que no tienen enfermedades conocidas como controles negativos.

Para la tinción celular, se incubaron 5 \mug de anticuerpos 169A y 169B (y un control negativo 1B7) con 100 \mul de sangre completa en la oscuridad durante 15 minutos. Se añadió reactivo de lisis Becton Dickinson (2 ml) a cada mezcla y la incubación se continuó durante 10 minutos en la oscuridad. Las células después se sedimentaron y se suspendieron en PBS. Las células se sedimentaron de nuevo por centrifugación y se mezclaron con un anticuerpo secundario conjugado con FITC y se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad. Las células después se lavaron con PBS, se centrifugaron, se aspiraron, y se resuspendieron en formalina al 1,0%.

Se realizó citometría de flujo usando el procedimiento de Rabb, y col. [J. Am. Soc. Nephrol. 6: 1445-450 (1995)]. Las muestras se analizaron usando el Software Simulset (Becton Dickinson) en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Se analizó un mínimo de 22.000 células para cada muestra. Se seleccionaron subconjuntos de granulocitos, monocitos, y linfocitos por dispersión de luz directa y dispersión de luz lateral. La pureza del subconjunto celular se evaluó por tinción de CD45 y CD14.

Los resultados indicaron que puede detectarse la expresión de \alpha_{d}/CD18 en muestras extraídas de sujetos humanos normales; la expresión fue mayor en monocitos e inferior en linfocitos. La expresión en neutrófilos fue intermedia entre monocitos y linfocitos. La tinción con anticuerpo 169B fue más débil que con anticuerpo 169A. El tratamiento con PMA regulaba positivamente la expresión de \alpha_{d}/CD18, particularmente en neutrófilos y monocitos.

En muestras de pacientes con fallo renal, la expresión de \alpha_{d}/CD18 era detectable en neutrófilos, monocitos, y linfocitos antes del comienzo de diálisis. Después de 15 minutos de diálisis usando la membrana activadora de leucocitos, se detectó un aumento minoritario en la expresión de \alpha_{d}/CD18. La expresión en monocitos y linfocitos realmente disminuyó al final del tratamiento. Este resultado indica que la expresión de \alpha_{d}/CD18 es distinta de la observada para CD11a/CD18, CD11b/CD18, y expresión de -selectina L después de diálisis.

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Ejemplo 20 Aislamiento de Clones de ADNc de Rata

En vista de la existencia de subunidades \alpha_{d} tanto caninas como humanas, se hicieron intentos de aislar genes homólogos en otras especies, incluyendo rata (este ejemplo) y ratón (Ejemplo 20, infra).

Se obtuvo una secuencia parcial de un ADNc de rata que muestra homología con el gen de \alpha_{d} humana a partir de un biblioteca \lambdagt10 esplénica de rata (Clontech). La biblioteca se sembró a 2 x 10^{4} pfu/placa en placas de LBM/agar de 150 mm. La biblioteca se cambió a membranas Hybond® (Amersham), se desnaturalizó 3 minutos, se neutralizó 3 minutos y se lavó 5 minutos con tampones descritos en protocolos convencionales [Sambrook, y col., Molecular Cloning: a laboratory manual, pág. 2.110]. Las membranas se colocaron inmediatamente en un Stratalinker (Stratagene) y el ADN se entrecruzó usando el ajuste de autocruzamiento. Las membranas se prehibridaron e hibridaron en formamida al 30% o 50%, para condiciones de baja y elevada rigurosidad, respectivamente. Las membranas se exploraron inicialmente con una sonda marcada con ^{32}P generada a partir del ADNc de \alpha_{d} humana, correspondiente a las bases 500 a 2.100 en el clon 19A2 (SEC ID Nº 1). La sonda se marcó usando el Random Prime Kit de Boehringer Mannheim de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Los filtros se lavaron con 2X SSC a
55ºC.

Se identificaron dos clones, denominados 684.3 y 705.1, que mostraron homología de secuencia con \alpha_{d} humana, CD11b humana, y CD11c humana. Ambos clones se alineaban con el gen de \alpha_{d} humana en la región 3' del gen, comenzando en la base 1.871 y extendiéndose hasta la base 3.012 para el clon 684.3, y las bases 1.551 a 3.367 para el clon 705.1.

Para aislar una secuencia de rata más completa que incluyera la región 5', se volvió a explorar la misma biblioteca usando el mismo protocolo que el empleado para la exploración inicial, pero usando una sonda de ratón generada a partir del clon A1160 (Véase el Ejemplo 20, infra). Se seleccionaron placas sencillas, aisladas de la segunda exploración y se mantuvieron como clones sencillos en placas de LBM/agar. Se usaron los cebadores de secuenciación 434FL y 434FR (SEC ID Nº 34 y 35, respectivamente) en un protocolo de PCR convencional para generar el ADN para la secuenciación.

5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3'	(SEC ID Nº 34)

5'-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3'	(SEC ID Nº 35)

El ADN de la PCR se purificó usando una Columna Quick Spin (Qiagen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

Se identificaron dos clones, denominados 741.4 y 741.11, que solapaban los clones 684.3 y 705.1; en las regiones solapantes, los clones 741.1 y 741.11 eran 100% homólogos a los clones 684.3 y 705.1. Se expone un ADNc de rata compuesto que tiene homología con el gen de \alpha_{d} humana en la SEC ID Nº 36; la secuencia de aminoácidos predicha se expone en la SEC ID Nº 37.

Clonación del extremo 5' de \alpha_{d} de Rata

Se obtuvo un fragmento de ADNc 5' para el gen de \alpha_{d} de rata usando un kit de clonación RACE de bazo de rata de Clonetech de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Los oligonucleótidos específicos de gen usados se denominaban 741.11#2R y 741.2#1R (SEC ID Nº 59 y 58, respectivamente).

5'-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3'	(SEC ID Nº 59)

5'-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3'	(SEC ID Nº 58)

\newpage

El oligo 741.11#2R abarca los pares de bases 131-152 en la SEC ID Nº 36, en la orientación inversa y 741.2#1R abarca los pares de bases 696-715 en la SEC ID Nº 36, también en la orientación inversa. Se realizó una PCR primaria usando el oligo más 3', 741.2#1R. Siguió una segunda PCR usando el oligo 741.11#2R y el ADN generado de la reacción primaria. Se detectó una banda de aproximadamente 300 pares de bases en un gel de agarosa al 1%.

El producto de la PCR secundaria se ligó en el plásmido pCRTAII (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las colonias blancas (positivas) se recogieron y se añadieron a 100 \mul de LBM que contenía 1 \mul de una solución madre de 50 mg/ml de carbenicilina y 1 \mul de cultivo de fago M13 K07 en pocillos individuales en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo. La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos hasta una hora. Después del periodo de incubación inicial, se añadieron 100 \mul de LBM (que contenía 1 \mul de 50 mg/ml de carbenicilina y una dilución 1:250 de una solución madre de 10 mg/ml de kanamicina) y la incubación se continuó durante una noche a 37ºC.

Usando una punta de transferencia de metal de 96 pocillos estéril, se transfirió el sobrenadante de la placa de 96 pocillos a cuatro filtros de nylon Amersham Hybond®. Los filtros se desnaturalizaron, se neutralizaron y se entrecruzaron por protocolos convencionales. Los filtros se prehibridaron en 20 ml de tampón de prehibridación (5X SSPE; 5X Denhardt; SDS al 1%; 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado) a 50ºC durante varias horas con agitación.

Las sondas oligo 741.11#1 y 741.11#1R (SEC ID Nº 56 y 57, respectivamente), que abarcan los pares de bases 86-105 (SEC ID Nº 36) en la orientación directa e inversa respectivamente, se marcaron del siguiente modo.

5'-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3'	(SEC ID Nº 56)

5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3'	(SEC ID Nº 57)

Se calentaron aproximadamente 65 WP de ADN oligo en 12 \mul de dH_{2}O a 65ºC durante dos minutos. Se añadieron tres \mul de 10 mCi/ml de \gamma-^{32}P-ATP al tubo junto con 4 \mul de Tampón Quinasa 5x (Gibco) y 1 \mul de ADN Quinasa T4 (Gibco). La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 16 \mul de cada sonda oligo marcada al tampón de prehibridación y los filtros y la hibridación se continuó durante una noche a 42ºC. Los filtros se lavaron tres veces en 5X SSPE; SDS al 0,1% durante 5 minutos por lavado a temperatura ambiente, y se autorradiografiaron durante 6 horas. Los clones positivos se expandieron y se purificó el ADN usando el Magic Mini Prep Kit (Promega) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El clon 2F7 se seleccionó para secuenciación y mostró una homología del 100% con el clon 741.11 en la región solapante. La secuencia de ácido nucleico de \alpha_{d} de rata completo se expone en la SEC ID Nº 54; la secuencia de aminoácidos se expone en la SEC ID Nº 55.

Características del ADNc de Rata y Secuencias de Aminoácidos

Ni las secuencias de ácido nucleico ni de aminoácidos se han presentado previamente para las subunidades \alpha de rata en integrinas \beta_{2}. Sin embargo, comparaciones de secuencia con subunidades \alpha de integrina \beta_{2} humana presentadas sugiere que el clon de rata aislado y su secuencia de aminoácidos predicha están muy estrechamente relacionadas con las secuencias nucleótidos y de aminoácidos de \alpha_{d}.

A nivel de ácido nucleico, el clon de ADNc de rata aislado muestra una identidad del 80% en comparación con el ADNc de \alpha_{d} humana; una identidad del 68% en comparación con CD11b humana; una identidad del 70% en comparación con CD11c humana; y una identidad del 65% en comparación con CD11b de ratón. No se encuentra identidad significativa en comparación con CD11a humana y con CD11a de ratón.

A nivel aminoácidos, el polipéptido de rata predicho codificado por el ADNc aislado muestra una identidad del 70% en comparación con el polipéptido \alpha_{d} humana; una identidad del 28% en comparación con CD11a humana; una identidad del 58% en comparación con CD11b humana; una identidad del 61% en comparación con CD11c humana; una identidad del 28% en comparación con CD11a de ratón; y una identidad del 55% en comparación con CD11b de ratón.

Ejemplo 21 Análisis de Northern de Tejido de Rata Para la Expresión de \alpha_{d}

Se obtuvo el ARN de un panel de tejidos de rata Lewis para realizar el análisis de Northern usando una sonda de \alpha_{d} de rata. Las muestras incluían el ARN total de bazo, riñón, hígado, pulmón y médula ósea normales, además del ARN poli(A+) de bazo, cerebro, médula espinal, timo, piel, intestino delgado normales, y células T activadas con antígeno de rata y bazo enfermo EAE (encefalomielitis alérgica experimental) y ganglio linfático. Los experimentos se realizaron usando las técnicas descritas en el Ejemplo 6.

La sonda de \alpha_{d} se seleccionó de una región del ADNc de rata que abarca los nucleótidos 1.184 a 3.008 de la SEC ID Nº 54 que representa el área que tiene el grado menor de homología con CD11c de rata y CD11b de rata. La sonda de 1.124 pb se generó por una digestión con enzimas de restricción con EcoR1 de 10 \mug del clon de ADNc de \alpha_{d} de rata 684.3. El fragmento se purificó en gel y se usó en una reacción de marcaje de cebado aleatorio como se ha descrito en el Ejemplo 6. La transferencia de Northern se prehibridó, se hibridó y se lavó como se ha descrito en el Ejemplo 6 excepto en que la sonda se añadió al tampón de hibridación a 5,5 x 10^{5} cpm/ml.

Después de autorradiografía durante cinco días, se detectaron bandas en los carriles que contenían el ARN de bazo total así como el ARN poli (A+) de una rata normal así como un bazo de una rata con EAE activa, donde la cantidad de ARN era significativamente mayor que la de bazo normal. El tamaño del transcrito detectado era coherente con el tamaño del clon de ADNc de rata de longitud completa.

Ejemplo 22 Producción y Caracterización de Anticuerpos Específicos de \alpha_{d} de Roedor-Anticuerpos contra Proteínas de Fusión de Dominio I de \alpha_{d} de Rata/Hu IgG4

En vista del hecho que se ha demostrado que el dominio I de integrinas \beta_{2} humanas participa en la unión de ligando, se supuso que los mismo sería cierto para la proteína \alpha_{d} de rata. Anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para el dominio I de \alpha_{d} de rata, por lo tanto, pueden ser útiles en modelos de rata de patologías humana donde está implicada la unión de \alpha_{d}.

Se generaron los oligos "alfa-DI5 de rata" (SEC ID Nº 87) y "alfa-DI3 de rata" (SEC ID Nº 88) a partir de la secuencia de \alpha_{d} de rata que corresponde a las pares de bases 469-493 y las pares de bases 1.101-1.125 (en la orientación inversa), respectivamente, de la SEC ID Nº 54. Los oligos se usaron en una reacción de PCR convencional para generar un fragmento de ADN de \alpha_{d} de rata que contenía el dominio I que abarca los pares de bases 459-1.125 de la SEC ID Nº 54. El producto de PCR se ligó en el vector pCRTAII (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se seleccionó una colonia positiva y se expandió para la purificación de ADN usando un kit Midi Prep de Qiagen (Chatswoth, GA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se digirió con XhoI y BgIII en una digestión con enzimas de restricción convencional y se purificó en gel una banda de 600 pares de bases que se ligó posteriormente en el vector de expresión pDCS1/HuIgG4. Se seleccionó una colonia positiva, se expandió y se purificó el ADN con un Kit Quiagen Maxi Prep.

Se sembraron células COS a media confluencia en placas de cultivo de 100 mm y se cultivaron durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 7%. Las células se aclararon una vez con 5 ml de DMEM. A 5 ml de DMEM, se añadieron 50 \mul de DEAE-Dextrano, 2 \mul de cloroquina y 15 \mug de ADN de dominio I de \alpha_{d} de rata/HuIgG4 descrito anteriormente. La mezcla se añadió a las células COS y se incubó a 37ºC durante 3 horas. Después se retiró el medio y se añadieron 5 ml de DMSO al 10% en CMF-PBS durante exactamente un minuto. Las células se aclararon suavemente una vez con DMEM. Se añadieron diez ml de DMEM que contenía FBS al 10% a las células y la incubación se continuó durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 7%. El siguiente día, el medio se remplazó con medio fresco y la incubación se continuó durante tres días adicionales. El medio se recogió y se añadió medio fresco a la placa. Después de tres días, el medio se recogió de nuevo y se desecharon las placas. El procedimiento se repitió hasta que se recogieron 2 litros de sobrenadante de cultivo.

El sobrenadante recogido como se ha descrito anteriormente se cargó en una columna ProsepA® (Bioprocessing Limited) y la proteína se purificó como se describe a continuación.

La columna se lavó inicialmente con 15 volúmenes de columna de Tampón de Lavado que contenía Tris 35 mM y NaCl 150 mM, pH 7,5. El sobrenadante se cargó a una velocidad lenta de menos de aproximadamente 60 volúmenes de columna por hora. Después de cargar, la columna se lavó con 15 volúmenes de columna de Tampón de Lavado, 15 volúmenes de columna de dietanolamina 0,55 M, pH 8,5, y 15 volúmenes de columna de ácido cítrico 50 mM, pH 5,0. La proteína se eluyó con ácido cítrico 50 mM, pH 3,0. La proteína se neutralizó con Tris 1,0 M, pH 8,0, y se dializó en PBS estéril.

La proteína del dominio I de \alpha_{d} de rata se analizó como se ha descrito en el Ejemplo 14. La proteína detectada migró del mismo modo que el observado con proteína del dominio I humano.

Producción de Anticuerpos Monoclonales contra Proteínas e Fusión de Dominio I de \alpha_{d} de Rata/HuIgG4

Se inmunizaron individualmente ratones con 50 \mug de proteína de fusión purificada del dominio I de \alpha_{d} de rata/HuIgG4 previamente emulsionada en un volumen igual de Adyuvante Completo de Freund (FCA) (Sigma). Se inyectaron aproximadamente 200 \mul de la preparación de antígeno/adyuvante en 4 sitios en el lomo y las ijadas de cada uno de los ratones. Los ratones se reforzaron dos semanas después con una inyección de 100 \mul de antígeno dominio I de \alpha_{d} de rata/HuIgG4 (50 \mug/ratón) previamente emulsionado en un volumen igual de Adyuvante Incompleto de Freund (FIA). Después de dos semanas adicionales, se reforzó a los ratones con 50 \mug de antígeno en 200 \mul de PBS inyectado por vía intravenosa.

Para evaluar los títulos séricos en los ratones inmunizados, se realizaron extracciones de sangre retro-orbitales en los animales diez días después de la tercera inmunización. Se dejó que la sangre coagulara y se aisló el suero por centrifugación. El suero se usó en una inmunoprecipitación en esplenocitos de rata biotinilados (BIP). El suero de cada ratón inmunoprecipitó bandas de proteína de peso molecular esperado para \alpha_{d} de rata y CD18 de rata. Se seleccionó un ratón para la fusión y se reforzó una cuarta vez como se ha descrito anteriormente para el tercer refuerzo.

Los sobrenadantes de hibridoma se exploraron por captura de anticuerpo, descrito del siguiente modo. Se revistieron placas Immulon® 4 (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) a 4ºC con 50 \mul/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgA, IgG o IgM de ratón (Organon Teknika) diluido 1:5.000 en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Las placas se lavaron 3X con PBS que contenía Tween® 20 al 0,05% (PBST) y se añadieron 50 \mul de sobrenadante de cultivo. Después de incubación a 37ºC durante 30 minutos, y de lavado como se ha descrito anteriormente, se añadieron 50 \mul de anticuerpo de cabra anti-IgG9(Fc) de ratón conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) diluido 1:3.500 en PBST. Las placas se incubaron como se ha descrito anteriormente y se lavaron 4X con PBST. Inmediatamente después de ello, se añadieron 100 \mul de sustrato, que contenía 1 mg/ml de o-fenilendiamina (Sigma) y 0,1 \mul/ml de H_{2}O_{2} al 30% en citrato 100 mM, pH 4,5. La reacción de color se detuvo después de 5 minutos con la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} al 15%. La absorbancia a 490 nm se leyó en un lector de placa Dynatech.

El sobrenadante de los pocillos que contienen anticuerpo también se analizó por ELISA con proteína de fusión dominio I de \alpha_{d} de rata/HuIgG4 inmovilizada. Un ELISA con placas revestidas de anticuerpo contra HuIgG4 sirvió como control para la reactividad contra el compañero de fusión de IgG. Los pocillos positivos se seleccionaron para exploración adicional por BIP en lisados de esplenocitos de rata usando técnicas descritas a continuación.

Producción de Sueros Policlonales Contra la Proteína de Fusión Dominio I de \alpha_{d} de Rata/HuIgG4

Se extrajo sangre a dos conejos antes de la inmunización con 100 \mug de proteína de fusión dominio I de \alpha_{d} de rata/HuIgG4 purificada en adyuvante completo de Freund. Las inyecciones se repitieron a la misma dosis cada tres semanas en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Después de tres inyecciones, se extrajo sangre a los conejos para el ensayo y los sueros recogidos se usaron en una inmunoprecipitación convencional en lisados de esplenocitos de rata. Se determinó que los sueros de ambos conejos eran inmunorreactivos con \alpha_{d} de rata. Los conejos se reforzaron de nuevo con 100 \mug de antígeno en IFA, y los sueros recogidos se ensayaron para inmunorreactividad aumentada con \alpha_{d} de rata por inmunoprecipitación. A los animales se les dio un refuerzo final y 10 días después, se les extrajo sangre y se recogieron los sueros.

Histología de \alpha_{d} de Rata

Los sueros policlonales de conejo generados contra el dominio "I" de \alpha_{d} de rata se usaron en tinción inmunohistoquímica de secciones tisulares de rata por la técnica descrita en el Ejemplo 18. El patrón de tinción detectado en secciones de plazo de rata congeladas e impregnadas en parafina era esencialmente idéntico al observado con los anticuerpos contra \alpha_{d} humana, con tinción de células individuales en toda la pulpa roja. El patrón de tinción difería del observado con anticuerpos monoclonales contra CD11a, CD11b y CD18 de rata. Además, se observó un patrón de tinción positiva en el timo en células individuales en toda la corteza. Ninguno de estos tejidos dio ninguna señal cuando se tiñeron con los sueros preinmunes de conejo.

Análisis de Especificidad de Anticuerpo

Las ratas se sacrificaron por asfixia con CO_{2} y los bazos se retiraron usando técnicas quirúrgicas convencionales. Los esplenocitos se recogieron empujando suavemente el bazo a través de una malla de alambre con un émbolo de jeringa de 3 cc en 20 ml de RPMI. Las células se recogieron en un tubo cónico de 50 ml y se lavaron en el tampón apropiado.

Las células se lavaron tres veces en D-PBS frío y se resuspendieron a una densidad de 10^{8} a 10^{9} células en 40 ml de PBS. Se añadieron cuatro mg de NHS-Biotina (Pierce) a la suspensión celular y se dejó que la reacción continuara durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se sedimentaron y se lavaron tres veces en D-PBS frío.

Las células se resuspendieron a una densidad de 10^{8} células/ml en Tampón de lisis frió (NP40 al 1%; Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; CaCl 2 mM; MgCl 2 mM; solución 1:100 de pepstatina, leupeptina, y aprotinina, añadida justo antes de añadir a las células; y 0,0001 g de cristales PMSF, añadidos justo antes de añadir a las células). Los lisados se agitaron con vórtice durante aproximadamente 30 segundos, se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se incubaron adicionalmente durante 15 minutos en hielo. Los lisados se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 xg para sedimentar el material insoluble. El sobrenadante se recogió en un tubo nuevo y se almacenó a entre 4ºC y -20ºC.

Se preaclaró un ml de lisado celular por incubación con 200 \mul de una suspensión de proteína A Sepharose® (Zymed) durante una noche a 4ºC. Se hicieron alícuotas del lisado preaclarado en tubos Eppendorf a 50 \mul/tubo para cada anticuerpo a ensayar. Se añadieron veinticinco ml de suero policlonal o de 100 a 500 \mul de sobrenadante de anticuerpo monoclonal a los lisados preaclarados y la mezcla resultante se incubó durante 2 horas a 4ºC con rotación. Después se añadieron cien \mul de anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón (Jackson) unido a perlas de proteína A Sepharose® en una suspensión de PBS y la incubación se continuó durante 30 minutos a temperatura ambiente con rotación. Las perlas se sedimentaron con centrifugación suave, y se lavaron tres veces con Tampón de Lavado frío (HEPES 10 mM; NaCl 0,2 M; Triton X-100 al 1%). El sobrenadante se retiró por aspiración, y se añadieron 20 \mul de tampón de muestra SDS 2X que contenía \beta-mercaptoetanol al 10%. La muestra se hirvió durante 2 minutos en un baño de agua, y la muestra se cargó en un gel SDS PAGE al 5%. Después de la separación, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa a corriente constante durante una noche. Los filtros de nitrocelulosa se bloquearon con BSA al 3% en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente y se retiró el tampón de bloqueo. Se añadió una dilución 1:6.000 de conjugado Estreptavidina-HRP (Jackson) en BSA al 0,1% en TBS-T y la incubación se continuó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los filtros se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez con TBS-T y se autorradiografiaron usando el kit ECL de Amersham de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

Producción de Anticuerpos Monoclonales Contra la Proteína \alpha_{d} de Rata de Longitud Completa

Se purificó \alpha_{d} de rata de esplenocitos de rata para preparar un inmunógeno para generar anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d} de rata. Se recogieron los bazos de aproximadamente 50 ratas Lewis hembra normales, de 12-20 semanas de edad, y se hizo una única suspensión celular a partir del tejido forzándolo a través de un tamiz de alambra fino. Los glóbulos rojos se retiraron por lisis en tampón que contenía NH_{4}Cl 150 mM, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4, y los leucocitos restantes se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los esplenocitos se sedimentaron por centrifugación y se lisaron en tampón que contenía Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, PMSF 10 mM, leupeptina, pepstatina y Triton X-100® al 1%. La lisis de los esplenocitos se realizó en hielo durante 30 minutos con un ml de tampón de lisis por 5 x 10^{8} esplenocitos. El material insoluble se retiró por centrifugación.

Se retiraron CD11a, CD11b y CD11c del lisado esplénico por inmunoprecipitación del siguiente modo. Se incubó un volumen de 750 \mul de una suspensión de Proteína A-Sepharose® con 2 mg de anticuerpo de conejo anti-inmunoglobulina de ratón a 4ºC durante 30 minutos. El anticuerpo de conejo anti-ratón-Proteína A-Sepharose® se lavó tres veces con tampón de lisis y se suspendió en un volumen final de 1,5 ml de tampón de lisis. Se añadieron aproximadamente 200 \mug de cada uno de los anticuerpos monoclonales específicos de integrina \beta_{2} de rata, 515F (específico para CD11a de rata), OX-42 (específico para CD11b de rata) y 100 g (específico para CD11c de rata) a 50 ml del lisado esplénico de rata. Después de incubación de 30 minutos a 4ºC, se añadieron 500 \mul del anticuerpo de conejo anti-ratón-Proteína A-Sepharose® a los lisados esplénicos y se mezclaron con rotación continua durante 30 minutos a 4ºC. El lisado se centrifugó a 2.500 x g durante 10 minutos para sedimentar CD11a, CD11b, y CD11c unidas al anticuerpo de conejo anti-ratón-Proteína A-Sepharose®, y el sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml limpio. La inmunoprecipitación con los anticuerpos 515F, OX-42, y 100 g se repitió dos veces adicionales para asegurar la retirada completa de CD11a, CD11b, y CD11c.

Las integrinas \beta_{2} restantes en el lisado se aislaron usando purificación por afinidad. Se añadieron aproximadamente 250 \mul de una suspensión de anticuerpo monoclonal anti-CD18 de rata 20C5B conjugado con CNBr-Sepharose® a los lisados y se mezclaron con rotación continua durante 30 minutos a 4ºC. Los complejos anticuerpo/antígeno se sedimentaron por centrifugación a 2.500 x g durante diez minutos y el sedimento se lavó tres veces con tampón de lisis antes de almacenarse a 4ºC.

Inmunización de Hámsteres Armenios

1. Se inmunizaron inicialmente hámsteres armenios, de seis a ocho semanas de edad, con aproximadamente 50 \mug de una proteína recombinante que consta del dominio I de \alpha_{d} de rata fusionado a la cadena pesada de IgG_{4} humana emulsionada en adyuvante completo de Freund. La inmunización primaria estuvo seguida de posteriores inmunizaciones con dominio I de \alpha_{d} de rata/HuIgG_{4} emulsionada en adyuvante incompleto de Freund en los Días 14, 33, y 95. Dos fusiones distintas, denominadas 197 y 199, se realizaron posteriormente.

Cuatro días antes de la fusión 197 (día 306), se administró a un hámster una combinación de proteína \alpha_{d} de rata purificada a partir de esplenocitos y células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata. El refuerzo de fusión se dio tres días antes de la fusión (día 307) con proteína \alpha_{d} de rata y células CHO transfectadas con \alpha_{d}. Las células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata se prepararon como se describe a continuación.

Se insertó un segmento génico que codifica la proteína \alpha_{d} de rata de longitud completa en el vector pDC1 y se introdujo por transfección por electroporación en células CHO junto con una construcción CD18-pRC humana. Las células transfectadas se cultivaron en presencia de hipoxantina para seleccionar células transfectadas satisfactoriamente con la construcción pRC y en presencia de g418 para seleccionar células transfectadas con la construcción pDC1. Después de 3 semanas, las células se tiñeron con los sueros policlonales de conejo específicos para \alpha_{d} de rata y clasificaron por FACS. Un pequeño porcentaje de las células que expresaban los mayores niveles de \alpha_{d} superficial (aproximadamente el 3% de la población total) se recogió y se expandió adicionalmente. La selección por FACS se repitió varias veces para proporcionar una población de células con elevados niveles de expresión superficial de \alpha_{d}.

Las células transfectadas con \alpha_{d} también se caracterizaron por citometría de flujo usando un suero policlonal específico de \alpha_{d} de rata y un anticuerpo monoclonal específico de CD18 humana, TS1.18.1. Los resultados confirmaron que las células CHO transfectadas expresaban elevados niveles tanto de \alpha_{d} de rata como de CD 18 humana.

Finalmente, se evaluó la expresión de \alpha_{d} y CD18 en las células por inmunoprecipitación. Se encontró un suero policlonal de conejo específico para \alpha_{d} de rata que inmunoprecipitaba proteínas con dos pesos moleculares distintos: la(s) proteína(s) de mayor peso molecular era(n) de aproximadamente 170 kD, y la(s) proteína(s) de menor peso molecular 95 kD. Estos descubrimientos eran coherentes con la expresión de un complejo heterodimérico \alpha_{d} de rata/CD18 humana en la superficie de las células CHO transfectadas.

En el día de la fusión, se retiró el bazo y se formó una única suspensión celular moliendo el tejido entre extremos congelados de dos portaobjetos de microscopio de vidrio sumergidos en RPMI 1640 libre de suero suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 100 unidades/ml penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina (RPMI) (Gibco, Canadá). La suspensión celular se filtró a través de un tamiz celular Nitex de malla 70 estéril (Becton Dickinson, Parsippany, Nueva Jersey), y se lavó dos veces centrifugando a 200 x g durante cinco minutos y resuspendiendo el sedimento en 20 ml de RPMI libre de suero. Se prepararon timocitos tomados de tres ratones Balb/c vírgenes de una manera similar. Se centrifugaron células de mieloma NS-1, se mantuvieron en fase log en RPMI con suero Fetaclone al 10% (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc. Logan, Utah) durante tres días antes de la fusión, se centrifugaron a 200 x g durante cinco minutos, y el sedimento se lavó dos veces como se ha descrito anteriormente.

Se combinaron aproximadamente 1,15 x 10^{8} células esplénicas con 5,8 x 10^{7} células NS-1, se centrifugaron y el sobrenadante se retiró por aspiración. El sedimento celular se soltó dando golpecitos al tuvo y se añadieron siete ml de PEG 1500 a 37ºC (50% en Hepes 75 mM, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) con agitación durante el transcurso de un minuto, seguido de la adición de 14 ml de RPMI libre de suero durante siete minutos. Se añadieron ocho ml adicionales de RPMI y las células se centrifugaron a 200 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se resuspendió en 200 ml de RPMI que contenía FBS al 15%, hipoxantina sódica 100 mM, aminopterina 0,4 mM, timidina (HAT) 16 mM (Gibco), 25 unidades/ml de IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ml. La suspensión se distribuyó en diez placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos (Coming, Reino Unido) a 200 \mul/pocillo y las células se suministraron en los días 4, 5, 6, y 7 después de la fusión aspirando aproximadamente 100 \mul de cada pocillo con una aguja 18 G (Becton Dickinson) y añadiendo 100 \mul de medio de siembra descrito anteriormente excepto que carece de timocitos.

En el día 10, se exploraron los sobrenadantes de los pocillos de fusión por citometría de flujo para la reactividad contra células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata/CD18 humana. Se suspendieron aproximadamente 5 x 10^{5} células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata en 50 \mul de RPMI que contenía FBS al 2,0% y azida sódica al 0,05% y se añadieron a aproximadamente 100 \mul de sobrenadante de cultivo de hibridoma en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Los controles positivos para la tinción incluían sueros policlonales de conejo anti-\alpha_{d} y TS1/18 (anti-CD18 humana). Las células se incubaron durante 30 minutos en hielo, se lavaron tres veces en tampón FACS (RPMI, FBS al 2,0%, AzidaNa al 0,05%), y se incubaron durante 30 minutos en hielo con un anticuerpo de cabra anti-hámster conjugado con FITC (Jackson ImmunolResearch Labs) a una dilución final de 1:200 en tampón FACS. Las células se lavaron tres veces en tampón FACS y se resuspendieron en 200 ml de tampón FACS. Las muestras se analizaron con un analizador Becton Dickinson FACscan. Para asegurar que los pocillos de clones positivos eran específicos para \alpha_{d} de rata, se repitió la exploración con células CHO no transfectadas. Se clonaron los pocillos que cumplían los criterios de reaccionar con transfectantes CHO de \alpha_{d} de rata y no las células CHO no transfectadas.

Después de la exploración primaria, se clonaron las células de pocillos positivos inicialmente por dilución doble y posteriormente por dilución limitante en RPMI, FBS al 15%, hipoxantina sódica 100 mM, timidita 16 mM, y 10 unidades/ml de IL-6. En la etapa de dilución limitante, se determinó el porcentaje de pocillos que mostraban crecimiento y se predijo la clonalidad usando un análisis de distribución Poisson. Los pocillos que mostraban crecimiento se analizaron por FACS después de 10-12 días. Después de la clonación final, los pocillos positivos se expandieron en RPMI y FBS al 11%. La clonación produjo un cultivo considerado positivo por estos criterios, a partir del cual se expandieron cuatro subclones diferentes denominados 197A-1, 197A-2, 197A-3, y 197A-4.

Antes de la fusión 199, se reforzó a un segundo hámster en el día 307 con 2,3 x 10^{6} células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata (RAD). Se administraron dos inmunizaciones finales cuatro días antes de la fusión (día 334) y de nuevo tres días antes de la fusión (día 335). El refuerzo en el día 334 constaba de 2 x 10^{6} células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata y se administraron 200 \mul de \alpha_{d} de rata purificado unido a Sepharose® (descrito previamente) por inyección intraperitoneal. El refuerzo del día 335 constaba de 5 x 10^{6} de células CHO transfectadas con \alpha_{d} de rata, también administradas por inyección intraperitoneal. Los protocolos de fusión y exploración para la fusión 199 fueron idénticos a los de la fusión 197, y se identificaron y clonaron tres hibridomas, denominados 199A, 199H, y 199M, con sobrenadante reactivo con \alpha_{d} de rata.

2. Se realizó una segunda inmunización usando los mismos protocolos que condujeron a las fusiones 197 y 199. Después del refuerzo del día 334, no hubo inmunizaciones adicionales hasta los días 394 y 395. Antes de la fusión, se administró a los hámsteres 2 x 10^{6} células CHO transfectadas con RAD junto con 300 \mul de \alpha_{d} de rata purificado-Sepharose® que se administraron por vía interperitoneal. Los protocolos de fusión y exploración para la posterior fusión 205 fueron idénticos a los de las fusiones 199 y 197, excepto que durante la clonación, se usaron reactivos ELISA para hámster armenio, por ejemplo anticuerpos de cabra anti-hámster armenio (Jackson ImmunolResearch Labs), como exploración inicial. Los pocillos positivos identificados por este procedimiento se exploraron posteriormente por FACS como se ha descrito. La fusión 205 produjo tres clones positivos diferentes llamados 205A, 205C, 205E.

3. En otro procedimiento para generar anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d} de rata, se inmunizaron ratones BALB/c de 6 a 12 semanas de edad en el día 1 con \alpha_{d} de rata purificado-Sepharose® administrado por vía subcutánea en adyuvante completo de Freund. Se administró un segundo refuerzo por la misma vía en el día 25 con el mismo inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund. Se realizó un tercer refuerzo idéntico al segundo en el día 42. No se realizaron refuerzos adicionales hasta los refuerzos pre-fusión que constaban de 400 \mul (para la fusión 226) y 250 \mul (para la fusión 236) de \alpha_{d} de rata purificado-Sepharose® inyectados por vía intraperitoneal. Cada volumen contenía aproximadamente 10 a 15 \mug de antígeno determinado por tinción de Coomassie. Los refuerzos pre-fusión para la fusión 226 sucedieron en los días 62 y 63 y la fusión se realizó en el día 66. Para la fusión 236, los refuerzos pre-fusión se realizaron en los días 132 y 133 y la fusión se realizó en el día 136. Ambos protocolos de fusión diferían de los usados para las fusiones de hámster armenio descritos anteriormente en que se usó una proporción 5:1 ratio de esplenocitos a células NS-1 en comparación con la proporción de 2:1 en las fusiones de hámster armenio. El protocolo de fusión fue idéntico por todo los demás al protocolo de hámster armenio.

Los protocolos de exploración y clonación para las fusiones 226 y 236 fueron idénticos a los usados en las fusiones 197, 199, y 205, excepto que se realizó una exploración inicial por ELISA. En el ELISA, se empleó un anticuerpo de cabra anti-molécula completa de ratón para capturar el anticuerpo de ratón del sobrenadante de hibridoma y se usó un conjugado anticuerpo de cabra anti-ratón-peroxidasa de rábano rusticano para detectar el anticuerpo de ratón. Los sobrenadantes positivos se exploraron posteriormente por FACS como se ha descrito para las fusiones 197 a 205.

La fusión 226 produjo nueve clones positivos denominados 226A, 226B, 226C, 226D, 226E, 226F, 226G, 226H, y 226I. La fusión 236 produjo diez clones positivos denominados 236A, 236B, 236C, 236F, 236G, 236H, 236I, 236K, 236L, y 236M. Los anticuerpos monoclonales generados a partir de estos clones se isotiparon por ELISA como se ha descrito en el Ejemplo 15. Se descubrió que todos los anticuerpos eran de isotipo IgG1.

Caracterización de Anticuerpos Monoclonales Contra \alpha_{d} de Rata

Para caracterizar los anticuerpos anti-\alpha_{d} de rata, se prepararon lisados de bazos marcados con biotina como se ha descrito en el Ejemplo 22, sección D, anteriormente. Los lisados de preaclararon antes de su uso en inmunoprecipitaciones. Inicialmente, se añadieron 50 \mug/ml de inmunoglobulina murina normal al lisado y la solución resultante se mezcló con rotación continua durante 30 minutos a 4ºC. Se añadieron 75 \mul de una suspensión de proteína A-Sepharose® revestida con anticuerpo de conejo anti-inmunoglobulina de ratón y se continuó la mezcla con rotación continua durante 30 minutos. Las perlas de proteína A revestidas con anticuerpo de conejo anti-ratón se sedimentaron por centrifugación a 15.000 rpm en una microfuga de sobremesa durante cinco minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante. El material sedimentado se desechó.

Para cada hibridoma clonado, se pusieron aproximadamente 300 \mul de sobrenadante en un tubo de microfuga Eppendorf, al que se añadieron 30 \mul de Triton X-100® al 10%, 30 \mul de una solución madre 100X de pepstatina, leupeptina y aprotinina, 100 \mug de cristales PMSF, y 50 \mul de lisado esplénico de rata biotinilado preaclarado. Las muestras se agitaron con vórtice suavemente y se pusieron en un equipo de rotación continua a 4ºC durante 30 minutos. Se preparó una muestra de control añadiendo 10 mg/ml de un anticuerpo policlonal de conejo específico anti-\alpha_{d} de rata a 50 \mul de lisado esplénico de rata.

Después de incubación de 30 minuto, se añadieron 75 \mul de perlas de proteína A-Sepharose® en una suspensión de PBS a cada muestra y se incubaron con rotación continua a 4ºC durante 30 minutos. Las pelas acopladas a proteína A se sedimentaron por centrifugación a 15.000 rpm en una microfuga de sobremesa durante 5 minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante. Las perlas sedimentadas se lavaron secuencialmente con una serie de lavados detergentes de 1 ml del siguiente modo: tampón nº 1 que contenía Tris 10 mM, NaCl 400 mM, Triton X-100® al 1,0%, pH 8,0; tampón nº 2 que contenía Tris 10 mM, NaCl 400 mM, Triton X-100® al 0,5%, pH 8,0; tampón nº 3 que contenía Tris 10 mM, NaCl 400 mM, Triton X-100® al 1,0%, desoxicolato al 0,1%, pH 8,0; y tampón nº 4 que contenía Tris 10 mM, NaCl 400 mM, LiCl_{2} 0,5 M, pH 8,0. Se realizó un lavado final con tampón de lavado nº 1. Las perlas se agitaron con vórtice suavemente entre cada lavado y se sedimentaron usando una microfuga de sobremesa. Los sobrenadantes se retiraron por una pipeta de transferencia, y después del lavado final, se retiró todo el tampón restante de las perlas por una jeringa Hamilton. Se añadió una alícuota de 50 \mul de tampón de muestra de SDS que contenía Azul Bromofenol y colorantes de Pironina Y y \beta-mercaptoetanol a una concentración final del 10% a cada sedimento. La mezcla se agitó en vórtice vigorosamente durante 1-2 minutos y se incubó a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 15.000 rpm en una microfuga de sobremesa a 4ºC y la proteína liberada se recogió y se transfirió a un nuevo tubo de microfuga. Se hirvieron alícuotas de cada muestra durante cuatro minutos en un baño de agua antes de cargarlas en geles de SDS-PAGE al 7,5%. Después de la separación por PAGE, las proteínas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa durante una hora a 200 mAmp, y los filtros se bloquearon en una solución de BSA al 3,0%/TBS-T durante una noche a 4ºC. Se añadió una solución de BSA al 0,1%-TBS-T que contenía una dilución 1:6.000 de estreptavidina-OPD a cada filtro y se dejó que la incubación continuara durante una hora a temperatura ambiente. Los filtros se lavaron cinco veces durante diez minutos cada vez en TBS-T, y se revelaron usando el kit ECL de Amersham de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

Se descubrió que el clon 199M inmunoprecipitaba una proteína heterodimérica. La subunidad proteína más grande tenía un peso molecular aproximado de 170-175 kD que era coherente con el tamaño de la proteína inmunoprecipitada por el control policlonal de conejo anti-\alpha_{d} de rata. También se precipitó una segunda proteína con un peso molecular aproximado de 95 kD, coherente con el peso de CD18.

Ejemplo 23 Especificidad del anticuerpo Monoclonal 199M

Se usó una columna de afinidad CNBr-Sepharose® con anticuerpo monoclonal 199M conjugado para purificar por afinidad \alpha_{d} de rata de lisados celulares de bazo. En resumen, aproximadamente se lisaron aproximadamente 1,3 x 10^{10} células esplénicas de rata en tampón constituido por NaCl 150 mM, PMSF 10 mM, Tris 10 mM, Triton X-100® al 1%, pH 8,0. Las células en el tampón se incubaron durante 30 minutos en hielo y se centrifugaron a aproximadamente 10.000 x g durante 30 minutos a 4ºC.

El anticuerpo 199M se conjugó con Sepharose® 4B activado con CNBr (Pharmacia) por el siguiente procedimiento. Se suspendió un gramo de la resina activada en HCl 1 mM durante 15 minutos y se lavó tres veces con 15 ml de HCl 1 mM y una vez con 15 ml de tampón de acoplamiento que contenía HCO_{3} 0,1 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0. Se añadió el anticuerpo 199M en tampón de acoplamiento a suspensión de resina a una concentración final de aproximadamente 10-20 mg/ml y la mezcla se incubó durante una noche a 4ºC. El siguiente día la resina conjugada se sedimentó por centrifugación y se retiró el sobrenadante. Los grupos sin reaccionar en la resina se bloquearon por incubación en Tris 0,1 M, pH 8,0 durante una hora a temperatura ambiente. La resina conjugada se lavó con ácido cítrico 0,1 M, pH 3,0, y se almacenó en tampón de lisis en forma de una suspensión 1:2 que contenía azida sódica al 0,1%.

Para la purificación por afinidad, se incubaron células esplénicas con mezcla continua durante una noche con 0,4 ml de la resina de Sepharose® conjugada con 199M. La resina después se sedimentó por centrifugación y se lavó cuatro veces con 15 ml de tampón de lisis. Se hirvieron brevemente alícuotas de aproximadamente 100 \mul de cada gel en tampón de muestra reductor que contenía Tris-HCl 0,1 M, pH 6,8, SDS al 2,0%, glicerol al 20%, azul bromofenol al 0,0002%, \beta-mercaptoetanol al 10% (concentración final del 5%) y se cargaron y las proteínas se revelaron usando un gel de poliacrilamida SDS al 6,0% (SDS-PAGE).

Se descubrió que el material purificado por afinidad contenía dos especies proteicas principales y una minoritaria cuando se separaba en SDS-PAGE. Una banda proteica destacada con un peso molecular de 90 kD era coherente con el tamaño conocido de CD18 y esta banda no se secuenció. Se detectó una segunda banda destacada de 160 kD que era coherente con el peso molecular predicho para \alpha_{d}. Además, también se detectó una banda minoritaria con un peso molecular aparente de 200 kD. Tanto la especie de 160 kD como la de 200 kD se analizaron adicionalmente por secuenciación proteica amino terminal comparando los resultados con la secuencia de aminoácidos predicha por el ADNc de \alpha_{d} de rata, así como las secuencias de aminoácidos conocidas para CD11c y CD11b. Se descubrió que la secuencia de las bandas tanto de 160 como de 200 kD era coherente con la secuencia de aminoácidos predicha por \alpha_{d} de rata clonado, lo que sugiere que puede haber dos formas de \alpha_{d}, quizá como resultado de variantes de ayuste o diferencias de glicosilación.

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Ejemplo 24 Ensayo de Proliferación de Células T Usando Macrófagos que Expresan \alpha_{d} de Rata

Se usaron macrófagos que expresaban \alpha_{d} aislado de bazos de rata como células presentadoras de antígeno (APC) para estimular una línea de células T específica para la proteína básica de la mielina denominada LR-21. En resumen, se inyectó a las ratas por vía intravenosa un volumen de 100 \mul de partículas de hierro (BioMag, Cambridge, MA). El siguiente día se preparó una única suspensión celular a partir de los bazos y se recogieron los macrófagos \alpha_{d}^{+} que habían fagocitado las partículas de hierro usando un imán. La citometría de flujo e inmunoprecipitación indicaron que del 50 al 80% de las células que fagocitan hierro son \alpha_{d}^{+}.

Los resultados indicaron que los macrófagos esplénicos que expresaban \alpha_{d} eran APC muy malas en comparación con otras APC tales como macrófagos tímicos. El anticuerpo monoclonal denominado 205C también se ensayó en el ensayo de proliferación con los macrófagos \alpha_{d} positivos y la línea celular LR-21. Después se realizaron ensayos de proliferación del siguiente modo.

Se suspendieron macrófagos esplénicos positivos para la expresión de \alpha_{d} a una densidad de 6 x 10^{6} células/ml en RPMI que contenía suero de rata normal al 5% y se añadieron 100 \mul de la suspensión de macrófagos a cada pocillo. Se suspendieron células de la línea LR-21 a 1 x 10^{6} células/ml en RPMI con suero de rata normal al 5% y se añadieron 50 \mul de la suspensión a cada pocillo. Se añadió anticuerpo monoclonal 205C a cada pocillo en un volumen de 50 \mul a una concentración final de 50, 10 y 2 \mug/ml. Las placas se incubaron a 37ºC durante 72 horas y se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina durante las 24 horas finales de incubación. Las células se recogieron en mallas de fibra de vidrio y se determinó la incorporación de ^{3}H usando un Contador Direct Beta (Packard Matrix 96).

Los resultados de los experimentos indican que elevadas concentraciones de anticuerpo 205C (10 y 50 \mug/ml) son capaces de reducir la proliferación de células T de un modo dependiente de dosis.

Ejemplo 25 Inmunoprecipitación de \alpha_{d} de Médula Ósea de Rata

Se recogieron células de médula ósea de una rata Lewis lavando abundantemente el hueso fémur con PBS. Las células se lavaron, se biotinilaron, y se inmunoprecipitaron, esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 18, usando 20 \mug de anticuerpos monoclonales purificados para inmunoprecipitar proteína de 100 \mul de lisados celulares preaclarados. La detección de la proteína inmunoprecipitada se realizó del modo que se ha descrito anteriormente.

El anticuerpo monoclonal contra \alpha_{d} de rata 205C inmunoprecipitó dos bandas que migraban a 160 kD y 95 kD. Las bandas de este tamaño eran coherentes con el tamaño para la cadenas \alpha y P en \alpha_{d}/CD18 como se observa en inmunoprecipitación de proteínas de lisados de células esplénicas usando el mismo anticuerpo. Los anticuerpos contra CD11a, CD11b, o CD11c de rata inmunoprecipitaban cadenas alfa distintas de \alpha_{d} y todos los anticuerpos coinmunoprecipitaban una proteína que tenía un peso molecular coherente con el conocido para CD18.

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Ejemplo 26 Expresión de \alpha_{d} en Modelos Animales

Los resultados preliminares indicaron que \alpha_{d} de rata se expresa selectivamente por subpoblaciones de macrófagos, incluyendo macrófagos corticales en el timo, células de Kupffer en el hígado, células perivasculares en el sistema nervioso central, un subconjunto de macrófagos peritoneales, y macrófagos de médula ósea residentes. Además, un subconjunto de macrófagos inducidos por tioglicolato mostró regulación positiva de la expresión de \alpha_{d} después de la estimulación con dexametasona. La expresión de \alpha_{d} de rata restringida a macrófagos observada sugirió el análisis adicional de la expresión en diversos modelos animales.

Expresión de \alpha_{d} de Rata en Modelo de Fenilhidrazina

La administración de fenilhidrazina a animales provoca el daño masivo de glóbulos rojos (rbc) que conduce a una anemia transitoria. Las rbc dañadas se eliminan de la circulación por de la pulpa roja, lo que provoca una esplenomegalia significativa. Se propone que los macrófagos que expresan \alpha_{d} pueden estar implicados en la eliminación de rbc dañadas y otro material foráneo de la circulación.

Para ensayar esta hipótesis, se trataron grupos de ratas con solución salina sola o fenilhidrazina disuelta en solución salina y se les administró por inyección intraperitoneal a una dosificación de 100 mg/kg de peso corporal. En algunos experimentos, las ratas se trataron con un antisuero policlonal generado contra el "dominio I" de \alpha_{d} de rata.

En diversos momentos puntuales después de la administración de fenilhidrazina, se sacrificó a los animales. Se usaron el peso del bazo y el hematocrito como parámetros de eliminación de rbc. Además, se recogieron el riñón, el bazo y el hígado para la evaluación histopatológica, que incluía inmunotinción para CD11a, CD11b, CD11c y \alpha_{d}.

Los hallazgos globales indicaron que cuatro días después del tratamiento con fenilhidrazina (controles salinos y tratamiento con \alpha_{d}) las ratas desarrollaban una esplenomegalia drástica, mientras que los niveles del hematocrito bajaban. El tratamiento con el suero policlonal contra \alpha_{d} no tenía afecto sobre el peso del bazo o la bajada en el hematocrito inducida con fenilhidrazina.

Se seccionó el tejido de ratas tratadas con solución salina y 4 días de fenilhidrazina a un grosor de 4 \mum y se secó al aire en portaobjetos Superfrost Plus (VWR Scientific) a temperatura ambiente durante 15 minutos. Antes de su uso, los portaobjetos se incubaron a 50ºC durante aproximadamente 5 minutos. Las secciones se fijaron en acetona (EM Science) fría (4ºC) durante 2 minutos a temperatura ambiente y se dejaron secar a temperatura ambiente. Las secciones se colocaron en 100 ml de TBS 1X, 1,1 ml de H_{2}O_{2} al 30% (Sigma), 1 ml de NaN_{3} al 10% (Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente para retirar la actividad peroxidasa endógena. Cada sección se bloqueó usando 150 \mul de una solución que contenía suero de rata normal al 30% (Harlan Bioproducts), BSA al 2% (Sigma) en TBS 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual la solución se transfirió suavemente desde las secciones. Cada sección recibió 75 \mul de anticuerpo de hámster anti-\alpha_{d} de rata 205C biotinilado a una concentración de proteína de 13,3 \mug/ml diluido en solución de bloqueo, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las secciones se lavaron tres veces en TBS 1X durante 5 minutos cada vez para retirar cualquier anticuerpo no unido. Se retiró el exceso de TBS aspirando alrededor del tejido después del lavado final. Se diluyó anticuerpo de cabra anti-biotina conjugado con peroxidasa (Vector Laboratories) 1:200 en solución de bloqueo y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron dos veces en TBS 1X durante 5 minutos cada lavado. Se aplicó sustrato AEC (Vector Laboratories) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina de Gill nº 2 (Sigma) y se aclararon en agua, después de lo cual se deshidrataron sucesivamente en EtOH al 70%, 95%, 100%, y Xileno. Las secciones después se montaron con cytoseal (VWR).

En las secciones esplénicas de rata tratadas con solución salina, la mayoría de la expresión de \alpha_{d} se localizaba en la pulpa roja esplénica en células identificadas morfológicamente como macrófagos, granulocitos, y una subpoblación de linfocitos. En los bazos de rata tratados con fenilhidrazina, sin embargo, la pulpa roja esplénica había experimentado cambios morfológicos de modo que el único tipo celular identificado fue una población de macrófagos grandes que habían atrapado glóbulos rojos dañados. Se observó que la mayoría de estos macrófagos grandes expresaban \alpha_{d}. Además en la rata tratada con fenilhidrazina, parece que había un aumento en la cantidad de macrófagos en la pulpa blanca esplénica que expresaba \alpha_{d}.

También se realizó un experimento de marcador doble para determinar la expresión de \alpha_{d} y CD11c en un bazo de rata tratado con fenilhidrazina. Como se ha descrito previamente, la expresión de \alpha_{d} se detectó en macrófagos grandes en la pulpa roja esplénica que parecían haber atrapado glóbulos rojos dañados. La expresión de CD11c también se detectó en macrófagos grandes en la pulpa roja esplénica y parecía que había más células CD11c positivas en la pulpa roja que células \alpha_{d} positivas. La mayoría de los macrófagos que expresaban \alpha_{d} también expresaban CD11c aunque se observó un pequeño subconjunto de macrófagos \alpha_{d} positivos que no expresaban CD11c. También había una población de macrófagos CD11c positivos que no expresaban \alpha_{d}.

Por lo tanto, el análisis de inmunohistología indica que parece haber una regulación positiva de la expresión de CD11c en el bazo de animales tratados con fenilhidrazina en comparación con los controles salinos en el día 4. La expresión de las otras integrinas, CD11a, CD11b y \alpha_{d}, sin embargo, parece no estar afectada por el tratamiento con fenilhidrazina. El tratamiento con anticuerpo policlonal contra el dominio "I" de \alpha_{d} tampoco mostró efecto sobre la captación de rbc por los macrófagos de la pulpa roja, pero la mayoría de los macrófagos que estaban atrapando rbc eran \alpha_{d} positivos. Los macrófagos \alpha_{d} positivos que habían atrapado rbc dañadas no estaban presentes en bazos recogidos 7 días después de la administración de fenilhidrazina.

Después se realizó un experimento de marcador doble sobre los bazos de ratas tratadas con 4 días de fenilhidrazina usando un ensayo de apoptosis e ICC con anticuerpo 205C conjugado con biotina. Se seccionó el tejido de rata normal y ratas tratadas con cuatro días de fenilhidrazina a un grosor de 4 micrómetros y se secó al aire en portaobjetos Superfrost Plus (VWR Scientific) a temperatura ambiente durante 15 minutos y se almacenó a -20ºC. Antes de su uso, los portaobjetos se calentaron a 50ºC. Los portaobjetos calentados se colocaron en tampón que contenía 100 ml de TBS 1X, 1,1 ml de H_{2}O_{2} al 30% (Sigma), 1 ml de NaN_{3} al 10% (Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente para retirar la actividad peroxidasa endógena. Cada sección se bloqueó usando 150 \mul de una solución que contenía suero de rata normal al 20% (Harlan Bioproducts), BSA al 2% (Sigma) en TBS 1x durante 10 minutos a 37ºC, después de lo cual la solución se transfirió suavemente desde las secciones. Cada sección se incubó durante 30 minutos a 37ºC con 75 \mul de anticuerpo de hámster anti-\alpha_{d} de rata 205C biotinilado a una concentración de proteína de 26,6 \mug/ml diluido en solución de bloqueo. Las secciones después se lavaron tres veces durante cinco minutos cada vez en TBS 1X para retirar el anticuerpo no unido. Se retiró el exceso de TBS aspirando alrededor del tejido después del lavado final. Se aplicó conjugado de avidina/biotina conjugado con fosfatase alcalina (Vector Laboratories) preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante a cada sección durante 20 minutos a 37ºC. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron dos veces durante cinco minutos cada vez en TBS 1X. Las secciones se fijaron durante cinco minutos con paraformaldehído al 4% (Sigma) a 4ºC. Las secciones después se aclararon en PBS 1X y se colocaron en tampón CSK (NaCl 100 mM, sacarosa 300 mM, pipes 10 mM pH 6,8, MgCl_{2} 3 mM, Triton-X-100® al 0,5%) durante dos minutos a 4ºC. Las secciones se aclararon en PBS 1X durante dos minutos a temperatura ambiente después de lo cual las secciones se lavaron tres veces durante cinco minutos cada vez con PBS 1X. Se aplicó mezcla de reacción TUNNEL (Boehringer Mannheim) a cada sección durante 60 minutos a 37ºC. Después de la incubación, las secciones se lavaron tres veces en PBS 1X durante 5 minutos cada lavado. La metodología del kit de apoptosis es similar a la hibridación in situ; el reactivo TUNEL (que está conjugado con FITC) hibrida con ADN "mellado". Se aplicó Converter-POD (un anticuerpo conjugado con peroxidasa que reconoce la marca FITC en el reactivo TUNEL) a cada sección durante 30 minutos a 37ºC y las secciones se lavaron tres veces durante cinco minutos cada vez con PBS 1X. Se aplicó AEC (Vector Laboratories) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Las secciones se montaron con Aquamount (VWR).

En el modelo, numerosas células en las regiones de pulpa tanto roja como blanca del bazo estaban experimentando apoptosis, pero no se halló que los macrófagos grandes en la pulpa roja (que expresaban \alpha_{d} y desaparecían en el día 7 del modelo) que habían atrapado RBC estuvieran experimentando apoptosis.

Análisis de Tipo Celular de la Expresión de \alpha_{d} de Rata en Bazo de Rata Normal

Para determinar qué tipos celulares de rata expresan \alpha_{d}, se realizó una tinción de marcaje doble en bazo de rata normal. Se prepararon secciones de bazo de rata normal como se ha descrito anteriormente a través de la etapa de bloqueo de suero de rata. Después de la adición de anticuerpos marcadores celulares primarios, se diluyó anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Laboratories) 1:500, en el mismo diluyente usado para los anticuerpos primarios, y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces en TBS 1X durante cinco minutos cada lavado. Se diluyó anticuerpo de burro anti-cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Laboratories) 1:300, en diluyente de anticuerpo, y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar y bloquear como anteriormente, cada sección recibió 75 \mul de anticuerpo de hámster anti-\alpha_{d} de rata (205C) biotinilado, a una concentración de proteína de 20 \mug/ml, durante 1 hora 45 minutos cada vez y después se lavaron para retirar el anticuerpo no unido. Se retiró el exceso de TBS aspirando alrededor del tejido después del lavado final. Se diluyó anticuerpo de cabra anti-biotina conjugado con peroxidasa (Vector Laboratories) 1:200, en diluyente de anticuerpo, y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces en TBS 1X durante cinco minutos cada lavado. Se aplicó sustrato AEC (Vector Laboratories) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Después se aplicó sustrato Fast Blue (Vector Laboratories) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Los portaobjetos después se montaron con Aquamount (Baxter).

Se realizó inmunocitoquímica de anticuerpo doble usando anticuerpos contra CD5, CD2, CD4, CD8, marcador NK, o HIS45 (un marcador de células T) junto con anticuerpo anti-\alpha_{d} en un intento por determinar el fenotipo de células que expresan \alpha_{d}. No se detectaron células con doble marcaje con CD2/\alpha_{d} o HIS45/\alpha_{d}. En la pulpa roja esplénica de una rata normal \alpha_{d} marcó grupos de células pequeñas que se descubrió que también expresaban CD5. No se determinó si las células CD5 positivas eran células T o células B. También se determinó que una pequeña población de células que expresan \alpha_{d} en la pulpa roja expresaban CD4. Además, también se identificó un subconjunto de células NK y células CD8 positivas que expresaba \alpha_{d}. Por lo tanto, se halló expresión de \alpha_{d} en el bazo en un subconjunto de células T, posiblemente un subconjunto de células B, un subconjunto de células NK, y un subconjunto de macrófagos.

Expresión de \alpha_{d} En Células Tumorales Leucocitos Granulocíticos Grandes (LGL) del Modelo de Rata F344

Se diseñó un modelo de rata para leucemia LGL en ratas F344 usando células tumorales recibidas del National Cancer Institute que se inyectaron por vía intravenosa en 3 ratas macho F344 (1 millón de células cada una). La enfermedad tardó tres meses en manifestarse, momento en el cual se sacrificaron varios animales y se examinaron los tejidos por FACS y análisis histoquímico.

Para el análisis FACS, se retiró una parte del bazo y se preparó una única suspensión celular como se describe en el ejemplo a continuación. En resumen, el tejido esplénico se picó en trozos más pequeños con tijeras y se pasaron a través de un tamiz de malla de alambre en presencia de D-PBS. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 30 ml de D-PBS. Se prepararon gradientes de Histopaque (Sigma) estratificando 5,0 ml de la suspensión celular en 5,0 ml de Histopaque dentro de un tubo de centrífuga de 15 ml. Los gradientes se centrifugaron durante 30 minutos a 1.500 rpm usando una Centrífuga de Sobremesa Beckman y la capa celular se recogió, se lavó una vez en D-PBS, y se contó por un hemacitómetro. Las células se resuspendieron en tampón FACS (RPMI-1640/FBS al 2%, azida sódica al 0,2%) a una densidad de 1 x 10^{6} células/muestra.

Las células se tiñeron con dos colores por incubación con el anticuerpo de hámster anti-\alpha_{d} de rata 205C conjugado con biotina (10 \mug/ml) y uno de una serie de anticuerpos contra marcadores celulares de rata que estaban conjugados con FITC. Estos anticuerpos secundarios incluían anticuerpos anti-macrófagos-FITC, anti-CD3-FITC, y anti-IgM (células B)-FITC (todos de PharMingen), además de un anticuerpo con especificidad por células NK conjugado con FITC (Harlan). Los anticuerpos conjugados con FITC se usaron cada uno a 10 \mul/muestra.

Las muestras se incubaron primero en hielo durante 30 minutos con anticuerpo 205C-biotina, se lavaron tres veces en tampón FACS, y se resuspendieron en 1,0 ml de tampón FACS. Se añadieron los conjugados FITC junto con 5 \mul de estreptavidina-PE (Pharmigen) y las muestras se colocaron en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, las muestras se lavaron tres veces en tampón FACS y se resuspendieron en 200 \mul de tampón FACS. Las muestras se examinaron usando un Becton Dickinson FACscan y se analizaron los datos usando el software Lysis II (Becton Dickinson).

Los resultados demostraron de manera abrumadora la expresión de \alpha_{d} en la superficie de células NK, o LGL. Las células que se tiñeron positivas para marcadores de células B y células T no revelaron expresión de \alpha_{d} y las células que se tiñeron usando el marcador de macrófagos mostraron un grado solamente ligero de expresión de \alpha_{d}. Se cree que, en este punto en la enfermedad, el bazo está compuesto predominantemente de células tumorales NK, coherente con la observación de que una gran población de células esplénicas se teñía para la expresión tanto de marcador NK como \alpha_{d}.

Estas observaciones también eran coherentes con los resultados de un experimento paralelo usando células de sangre periférica también recogidas de los mismos animales y procesadas como anteriormente para FACS. Los resultados usando células de sangre periférica indicaron que células NK en circulación también expresan \alpha_{d}, mientras que células que expresan otros marcadores celulares en la sangre no mostraban expresión de \alpha_{d}. Los resultados usando células de sangre periférica, sin embargo, no fueron tan drásticos como los resultados con células esplénicas supuestamente debido a una diferencia en el porcentaje de diferentes tipos celulares presentes en el bazo y sangre periférica.

En el posterior análisis FACS de células esplénicas de rata de estos animales modelo, se obtuvieron resultados idénticos. Después del análisis adicional usando el procedimiento anterior de preparación celular, las células tumorales LGL también han mostrado tinción para la expresión de CD 18 así como CD11a, CD11b, y CD11c.

Se realizó análisis histoquímico tanto en tejido normal como tejido enfermo NK F344 usando el procedimiento ICC descrito anteriormente. Los datos preliminares indicaron que \alpha_{d} se expresaba en tejido pulmonar y hepático tumoral NK F344, pero no se detectó o se expresó a niveles muy bajos en tejido respectivo normal. El tejido pulmonar enfermo mostró expresión de \alpha_{d} en grupos pequeños y grandes de células, así como células individuales en todo el pulmón. El hígado NK F344 mostró débil marcaje alrededor de los vasos y otras células en todo el tejido. Los anticuerpos contra las otras integrinas \beta_{2} indicaron que estas moléculas se expresan a niveles similares en tejido tanto normal como enfermo aunque no patrones de marcaje variaban.

En análisis paralelos, el timo de rata normal mostró ligera expresión de \alpha_{d} en células dispersadas en la corteza, mientras que el timo F344 NK mostró un nivel aumentado de expresión de \alpha_{d}. Aunque el bazo normal mostró expresión en la pulpa roja, el bazo NK tenía marcaje grupal en todo el tejido.

Después se ensayó el bazo NK a intervalos semanales desde la aparición de la enfermedad que indicó que el nivel de expresión de \alpha_{d} aumentaba hasta la tercera semana y después bajaba en la cuarta semana.

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Ejemplo 27 Ensayo para la Inhibición de Lisis de Células Diana Inducida por Células Tumorales-NK Usando Anticuerpos Monoclonales Anti-\alpha_{d}

Una función específica de las células NK es marcar y eliminar células infectadas con virus o foráneas. Para ensayar la capacidad de las células NK de lisar una célula diana específica, se marcan células diana con ^{51}cromo y según sucede la lisis, se detecta la radiactividad creciente en el medio. Se postuló que \alpha_{d}, que se ha demostrado previamente que se expresa en células NK, puede participar en la eliminación celular dirigida por NK. Para ensayar esta hipótesis, se preincubaron células tumorales con anticuerpos contra \alpha_{d} para evaluar la función de \alpha_{d} en un ensayo funcional.

Preparación de Células Efectoras tumorales-NK \alpha_{d} Positivas

Se inyectó a ratas F344 células tumorales NK, originalmente obtenidas del National Cancer Institute y se pasaron a animales tres a cuatro semanas antes de la retirada del bazo. El bazo se retiró y se picó en pequeños trozos que se pasaron a través de un tamiz de malla de alambre en presencia de D-PBS. La suspensión celular resultante se centrifugó a 1.500 rpm en una centrífuga de sobremesa Beckman durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró y el sedimento celular se resuspendió en 30 ml de D-PBS.

Después se realizó la separación en Histopaque de células mononucleadas de sangre del siguiente modo. Se añadieron cinco ml de Histopaque (Sigma) a seis tubos de centrífuga de 15 ml en cuya parte superior se estratificaron 5,0 ml de la suspensión celular descrita anteriormente. Las células se centrifugaron a 1.500 rpm durante 30 minutos en una centrífuga de sobremesa Beckman a temperatura ambiente. La capa celular se recogió, se combinó y se contó por un hemacitómetro. Se prepararon varias diluciones de las células tumorales aisladas en tampón D-PBS y posteriormente se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpos anti-\alpha_{d} de rata a una concentración de 50 \mug/ml. Los anticuerpos de control incluían un anticuerpo anti-CD18 de rata y un anticuerpo anti-ICAM-1 de rata que también se incubaron con las células a 50 \mug/ml de concentración. Las células tumorales se pre-incubaron con anticuerpos a 37ºC durante aproximadamente 30 minutos antes del ensayo.

Marcaje con Cromo de Células Diana Yak-1

Se cultivaron células Yak-1 (ATCC), una línea celular de linfoma de ratón, en FBS al 10%/RPMI 1640. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron a una densidad de aproximadamente 1 x 10^{7} células en 1,5 a 4,0 ml de "medio de ensayo" RPMI preparado a partir de 500 ml de RPMI 1640, 5 ml de solución antibiótica Pen-Estrep, y 10 ml de FBS. Se añadieron de aproximadamente 200 a 300 \muCi de ^{51}cromo a la suspensión de células Yak-1 que después se incubaron a 37ºC durante 45 a 60 minutos con mezcla suave. Después de la incubación, el volumen se aumentó a 50 ml con medio de ensayo y las células se sedimentaron por centrifugación. El sobrenadante se desechó y las células se suspendieron en 1 a 3 ml de medio de ensayo y se ajustó a una densidad de 5 x 10^{4} células/ml. También se prepararon células Yak-1 no marcadas a una concentración de 1 x 10^{7} células/ml para su uso como controles autólogos.

La actividad de las células marcadas se determinó ensayando 100 \mul de la suspensión celular marcada por triplicado usando un contador gamma.

Ensayo de Liberación de Cromo a Corto Plazo

Se sembraron células efectoras NK de cada dilución por triplicado en un volumen de 100 \mul de medio de ensayo en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se añadieron 100 \mul de células Yak-1 marcadas a cada pocillo. La liberación autóloga, es decir,espontánea o de fondo, se obtuvo incubando 100 \mul de células marcadas con células Yak no marcadas en cada una de las diluciones efectoras. La liberación de ^{51}cromo total se obtuvo añadiendo Triton® al 1,0% a células diana en un conjunto de pocillos. La liberación espontánea se midió por la cantidad de ^{51}cromo encontrada en pocillos con solamente células diana. La incubación de células efectoras/diana se realizó durante cuatro horas a 37ºC después de lo cual las placas se centrifugaron y se recogieron 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo y se midió la radiactividad.

La actividad citolítica se calculó usando la siguiente fórmula:

% actividad citolítica = \frac{\text{cmp muestra – cpm liberación espontánea}}{\text{cmp 100% liberación – cmp liberación espontánea}} x 100

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Los resultados indicaron que ni los anticuerpos de hámster anti-\alpha_{d} de rata (incluyendo 199M y 205C) ni los anticuerpos de ratón anti-\alpha_{d} de rata (226A, 226B, 226C, 226D, 226F, 226G, 226H, y 226I) llevaron a cabo la capacidad de las células tumorales NK de eliminar o lisar las células diana marcadas.

Ejemplo 28 Aislamiento de Clones de ADNc de Ratón

Se intentó el aislamiento de un homólogo \alpha_{d} de ratón.

Se realizó hibridación entre-especies usando dos sondas generadas por PCR: un fragmento de 1,5 kb correspondiente a las bases 522 a 2.047 del clon humano 19A2 (SEC ID Nº 1), y un fragmento de rata de 1,0 kb que corresponde a las bases 1.900 a 2.900 en el clon humano 19A2 (SEC ID Nº 1). Las sonda humana se generó por PCR usando los pares de cebadores denominados ATM-2 y 9-10.1 expuestos en las SEC ID Nº 38 y 39, respectivamente; la sonda de rata se generó usando los pares de cebadores 434L y 434R, expuestos en las SEC ID Nº 34 y 35, respectivamente. Las muestras se incubaron a 94ºC durante 4 minutos y se sometieron a 30 ciclos de la secuencia de etapas de temperatura: 94ºC; 50ºC 2 minutos; 72ºC, 4 minutos.

5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3'	(SEC ID Nº 38)

5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3'	(SEC ID Nº 39)

Los productos de PCR se purificaron usando el kit Qiagen Quick Spin de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante, y se marcaron aproximadamente un ADN de 180 in con 200 \muCi de [^{32}P]-dCTP usando un kit Boehringer Mannheim Random Primer Labeling de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El isótopo no incorporado se retiró usando una Columna Centrisep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las sondas se desnaturalizaron con NaOH 0,2 N y se neutralizaron con Tris-HCl 0,4 M, pH 8,0, antes de su uso.

Se sembró una biblioteca de ADNc cebada con oligo dT tímica de ratón en lambda ZAP® II (Stratagene) a aproximadamente 30.000 placas por placa de 15 cm. Las transferencias de placa en filtros de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH) se incubaron a 50ºC con agitación durante 1 hora en una solución de prehibridación (8 ml/transferencia) que contenía formamida al 30%. Se añadieron sondas humanas y de rata marcadas a la solución de prehibridación y la incubación se continuó durante una noche a 50ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente, una vez en 2X SSC/SDS al 0,1% a 37ºC, y una vez en 2X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC. Los filtros se expusieron a película Kodak X-Omat AR a -80ºC durante 27 horas con un filtro intensificador.

Cuatro placas que daban señales positivas en transferencias duplicadas se volvieron a sembrar en estrías en medio LB con magnesio (LBM)/placas de carbenicilina (100 mg/ml) y se incubaron durante una noche a 37ºC. Las placas de fagos se transfirieron con filtros Hybond® (Amersham), se sondearon como en la exploración inicial, y se expusieron a película Kodak X-Omat AR durante 24 horas a -80ºC con un filtro intensificador.

Se transfirieron doce placas que daban señales positivas en diluyente de fago de bajo Mg^{++} que contenía Tris-HCl 10 mM y MgCl_{2} 1 mM. El tamaño del inserto se determinó por amplificación por PCR usando los cebadores T3 y T7 (SEC ID Nº 13 y 14, respectivamente) y las siguientes condiciones de reacción. Las muestras se incubaron a 94ºC durante 4 minutos y se sometieron a 30 ciclos de la secuencia de etapas de temperatura: 94ºC, durante 15 segundos; 50ºC, durante 30 segundos; y 72ºC durante 1 minuto.

Seis muestras produjeron distintas bandas que variaban en tamaño de 300 bases a 1 kb. Se liberaron fagómidos mediante co-infección con fago auxiliar y se recircularizaron para generar Bluescript® SK^{-} (Stratagene). Las colonias resultantes se cultivaron en LBM/carbenicilina (100 mg/ml) durante una noche. Se aisló el ADN con un kit miniprep Promega Wizard® (Madison, WI) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. El análisis de restricción con EcoRI del ADN purificado confirmó los pesos moleculares que se detectaron usando PCR. Se secuenció el ADN inserto con los cebadores M13 y M13 inverso.1 expuestos en las SEC ID Nº 40 y 41, respectivamente.

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'	(SEC ID Nº 40)

5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'	(SEC ID Nº 41)

La secuenciación se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 4.

De los seis clones, solamente dos, denominados 10.3-1 y 10.5-2, proporcionaron información de secuencia y eran fragmentos de 600 pb idénticos. La secuencia de 600 pb era un 68% idéntica a una región correspondiente de \alpha_{d} humana, un 40% idéntica a CD11a humana, un 58% idéntica a CD11c humana, y un 54% idéntica a CD11b de ratón. Este fragmento de 600 pb después se utilizó para aislar un ADNc más completo que codificaba un homólogo de \alpha_{d} de ratón putativo.

Se sembró una biblioteca de ADNc esplénico de ratón (cebada con oligo dT y aleatoriamente) en lambda Zap® II (Stratagene) a 2,5 x 10^{4} fagos/placa de LBM de 15 cm. Las placas se transfirieron en membranas de transferencia de nylon Hybond® (Amersham), se desnaturalizaron con NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M, se neutralizaron con Tris Base 0,5 M/NaCl 1,5 M/HCl 11,6 M, y se lavaron en 2X SSC. El ADN se entrecruzó con filtros por irradiación
ultravioleta.

Se exploraron aproximadamente 500.000 placas usando las sondas 10.3-1 y 10.5-2 previamente marcadas descritas supra. Las sondas se añadieron a una solución de prehibridación y se incubaron durante una noche a 50ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente, una vez en 2X SSC/SDS al 0,1% a 37ºC, y una vez en 2X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC. Los filtros se expusieron a película Kodak X-Omat AR durante 24 horas a -80ºC con un filtro intensificador. Catorce placas que dieron señales positivas en transferencias duplicadas se sometieron a una exploración secundaria idéntica a la exploración inicial excepto para los lavados de elevada rigurosidad finales adicionales en 2X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC, en 0,5X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC, y a 55ºC en 0,2X SSC/SDS al 0,1%. Los filtros se expusieron a película Kodak X-Omat AR a -80ºC durante 13 horas con un filtro intensificador.

Se transfirieron dieciocho placas positivas en diluyente de fago de bajo Mg^{++} y el tamaño del inserto se determinó por amplificación por PCR como se ha descrito anteriormente. Siete de las muestras dieron bandas sencillas que variaban en tamaño de 600 pb a 4 kb. El análisis de restricción con EcoRI del ADN purificado confirmó los tamaños observados de la PCR y el ADN se secuenció con los cebadores M13 y M13 inverso.1 (SEC ID Nº 40 y 41, respectivamente).

Un clon denominado B3800 contenía un inserto de 4 kb que correspondía a una región de 200 bases cadena abajo del extremo 5' del clon de \alpha_{d} humana 19A2 e incluía 553 bases de una región no traducida 3'. El clon B3800 mostró una identidad del 77% con una región correspondiente de \alpha_{d} humana, una identidad del 44% con una región correspondiente de CD11a humana, una identidad del 59% con una región correspondiente de CD11c humana, y una identidad del 51% con una región correspondiente de CD11b de ratón. El segundo clon A1160 era un inserto de 1,2 kb que se alineaba con el extremo 5' de la región codificante de \alpha_{d} humana aproximadamente 12 nucleótidos cadena debajo de la metionina de inicio. El clon A1160 mostró una identidad del 75% con una región correspondiente de \alpha_{d} humana, una identidad del 46% con una región correspondiente de CD11a humana, una identidad del 62% con una región correspondiente de CD11c humana, y una identidad del 66% con una región correspondiente de CD11b de ratón.

El clon A1160, el fragmento cercano al extremo 5' del clon humano 19A2, es de 1.160 bases de longitud, y comparte una región de solapamiento con el clon B3800 que comienza en la base 205 y que continúa hasta la base 1.134. El clon A1160 tiene una inserción de 110 bases (bases 704-814 del clon A1160) no presente en la región solapante del clon B3800. Esta inserción sucede en un límite exón-intrón probable [Fleming, y col., J. Immunol. 150: 480-490 (1993)] y se retiró antes del posterior ligamiento de los clones A1160 y B3800.

Amplificación Rápida del Extremo de ADNc 5' del Clon de \alpha_{d} de Ratón Putativo

Se usó RACE PCR [Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends", en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, y col. (eds.) pág. 28-38, Academic Press: Nueva Cork (1990)] para obtener secuencias 5' perdidas del clon de \alpha_{d} de ratón putativo, incluyendo la secuencia no traducida 5' y la metionina de inicio. Se usó un kit RACE-Ready esplénico de ratón (Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se diseñaron dos cebadores específicos de gen, antisentido, A1160 RACE1-primario y A1160 RACE2-anidado (SEC ID Nº 42 y 43), para realizar la PCR primaria y anidada.

5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3'	(SEC ID Nº 42)

5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3'	(SEC ID Nº 43)

Los cebadores, SEC ID Nº 42 y 43, corresponden con las regiones que empiezan 302 y 247 bases desde el extremo 5', respectivamente. La PCR se realizó como se ha descrito, supra, usando el cebador de anclaje 5' (SEC ID Nº 44) y el ADNc de bazo de ratón suministrado con el kit.

5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3'

(SEC ID Nº 44)

La electroforesis del producto de PCR reveló una banda de aproximadamente 280 bases de tamaño, que se subclonó usando un kit de clonación TA (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se cultivaron diez colonias resultantes, y se aisló y secuenció el ADN. Se identificaron 60 bases adicionales de la secuencia 5' por este procedimiento, que corresponden a las bases 1 a 60 de la SEC ID Nº 45.

Características del ADNc de Ratón y Secuencia de Aminoácidos Predicha

Se expone una secuencia compuesta del ADNc de ratón que codifica un homólogo putativo de \alpha_{d} humana en la SEC ID Nº 45. Aunque la homología entre los dominios externo de los clones humano y de ratón es elevada, la homología entre los dominios citoplasmáticos es solamente del 30%. La variación observada puede indicar diferencias funcionales C-terminales entre las proteínas humana y de ratón. Como alternativa, la variación en los dominios citoplasmáticos puede estar provocada por la variación de ayuste, o puede indicar la existencia de un(os) gen(es) adicional(es) de integrina \beta_{2}.

A nivel de aminoácidos, el ADNc de ratón predice una proteína (SEC ID Nº 46) con una identidad del 28% con CD11a de ratón, una identidad del 53% con CD11b de ratón, una identidad del 28% con CD11a humana, una identidad del 55% con CD11b humana, una identidad del 59% con CD11c humana, y una identidad del 70% con \alpha_{d} humana. La comparación de las secuencias de aminoácidos de los dominios citoplasmáticos de \alpha_{d} humana y el homólogo de ratón putativo indica regiones de la misma longitud, pero que tienen estructura primaria divergente. La similar longitud de secuencia en estas regiones sugiere variación de especie en lugar de formas variantes de ayuste. Cuando se comparan con el polipéptido de rata predicho, Ejemplo 20, supra, los dominios citoplasmáticos de ratón y rata muestras una identidad mayor del 60%.

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Ejemplo 29 Aislamiento de Clones de ADNc de \alpha_{d} de Ratón Adicionales para la Verificación de Secuencia

Para verificar las secuencias nucleica y de aminoácidos descritas en el Ejemplo 28 para \alpha_{d} de ratón, se aislaron secuencias de ratón adicionales para los propósitos de confirmación.

Se realizó el aislamiento de ADNc de ratón por hibridación con dos sondas de \alpha_{d} homólogas (3' y 5') usando tanto una biblioteca cebada aleatoriamente esplénica de ratón como una biblioteca de ADNc cebada con oligo dT en lambda ZAP® II (Stratagene). La biblioteca se sembró a 5 x 10^{5} fagos por placa de LBM de 15 cm. Las pacas se transfirieron en membranas de nylon Hybond® (Amersham), y las membranas se desnaturalizaron (NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M), se neutralizaron (Tris Base 0,5 M/NaCl 1,5 M/HCl 11,6 M) y se lavaron (solución salina 2X SSC). El ADN se entrecruzó a filtros por irradiación ultravioleta.

Se generaron sondas usando los cebadores descritos a continuación en una reacción de PCR en las siguientes condiciones. Las muestras se mantuvieron a 94ºC durante 4 minutos y después se procesaron a través de 30 ciclos de la secuencia de etapas de temperatura (94ºC durante 15 segundos; 50ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 1 minuto en un termociclador Perkin-Elmer 9600).

La sonda 3' era de aproximadamente 900 bases de longitud y abarcaba una región de los nucleótidos 2.752 a 3.651 (en la SEC ID Nº 1) (5' - 3') y se produjo con los cebadores 11.b-1/2FOR11 y 11.b-1/2REV2 que se muestran en las SEC ID Nº 69 y 74, respectivamente. Esta sonda se usó en una primera serie de transferencias.

La sonda 5' era de aproximadamente 800 bases de longitud y abarcaba una región de los nucleótidos 149 a 946 (en la SEC ID Nº 1) (5' - 3') y se produjo con los cebadores 11.b-1/2FOR1 y 11.a-1/1REV1 que se muestran en las SEC ID Nº 50 y 85, respectivamente). Esta sonda se usó en una segunda serie de transferencias.

En una tercera serie de transferencias, se usaron ambas sondas descritas anteriormente juntas en las mismas placas.

Se exploraron aproximadamente 500.000 placas usando las dos sondas de antes que se marcaron del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo 20. Se añadieron las sondas marcadas a una solución de prehibridación, que contenía formamida al 45%, y se incubaron durante una noche a 50ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente (22ºC). Se realizó un lavado final en 2X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC. La autorradiografía fue durante 19 horas a -80ºC en película Kodak X-Omat AR con un filtro intensificador.

Quince placas que dieron señales positivas en transferencias al menos duplicadas se sometieron a una exploración secundaria realizada como se ha descrito para la exploración inicial excepto que se usaron ambas sondas marcadas 3' y 5' para la hibridación y se incorporó un lavado final adicional usando 2X SSC/SDS al 0,1% a 65ºC. La autorradiografía se realizó como se ha descrito anteriormente durante 2,5 horas.

Trece placas (denominadas MS2P1 a MS2P13) que dieron señales positivas se transfirieron en diluyente de fago de bajo Mg^{++}. El tamaño del inserto se determinó por amplificación por PCR (termociclador Perkin-Elmer 9600) usando los cebadores T3 y T7 que hibridan con el fagómido Bluescript® en ZAP® II (secuencia previamente descrita) en las mismas condiciones mostradas anteriormente. Los tamaños de las bandas variaban de 500 bases a 4 kb. Los fagómidos se aislaron, se prepararon, y se secuenciaron con los cebadores M13 y M13 inverso.1 (SEC ID Nº 40 y 41, respectivamente). Cinco de los trece clones; MS2P-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12, y MS2P-13, se secuenciaron, y juntos, representaban una región de aproximadamente la base 200 en el extremo 5' a aproximadamente 300 bases después del primer codón de parada en el extremo 3'.

Se realizó secuenciación automatizada como se ha descrito en el Ejemplo 4 usando primero los cebadores M13 y M13 inverso.1 (SEC ID Nº 40 y 41, respectivamente) para secuenciar los extremos de cada clon y para determinar su posición relativa a la construcción nº 17 (SEC ID Nº 45). Cada clon después se secuenciación completamente usando los cebadores apropiados (enumerados a continuación) para esa región particular.

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11.b-1/2FOR1	5'-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3'	(SEC ID Nº 50)

11.a-1/1FOR2	5'-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3'	(SEC ID Nº 60)

11.a-1/1FOR3	5'-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3'	(SEC ID Nº 61)

11.b-1/2FOR4	5'-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3'	(SEC ID Nº 62)

11.b-1/2FOR5	5'-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3'	(SEC ID Nº 63)

11.b-1/2FOR6	5'-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3'	(SEC ID Nº 64)

11.b-1/2FOR7	5'-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3'	(SEC ID Nº 65)

11.b-1/2FOR8	5'-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3'	(SEC ID Nº 66)

11.b-1/2FOR9	5'-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3'	(SEC ID Nº 67)

11.b-1/2FOR10	5'-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3'	(SEC ID Nº 68)

11.b-1/2FOR11	5'-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3'	(SEC ID Nº 69)

11.b-1/2FOR12	5'-GTCACAGAGGGAACCTCC-3'	(SEC ID Nº 70)

11.b-1/2FOR13	5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3'	(SEC ID Nº 71)

11.b-1/2FOR14	5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3'	(SEC ID Nº 72)

11.b-1/2FOR1	5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3'	(SEC ID Nº 73)

11.b-1/2REV2	5'-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3'	(SEC ID Nº 74)

11.b-1/2REV3	5'-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3'	(SEC ID Nº 75)

11.b-1/2REV4	5'-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3'	(SEC ID Nº 76)

11.b-1/2REV5	5'-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3'	(SEC ID Nº 77)

11.b-1/2REV6	5'-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3'	(SEC ID Nº 78)

11.b-1/2REV7	5'-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3'	(SEC ID Nº 79)

11.b-1/2REV8	5'-GATCCAACGCCAGATCATACC-3'	(SEC ID Nº 80)

11.b-1/2REV9	5'-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3'	(SEC ID Nº 81)

11.b-1/2REV10	5'-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3'	(SEC ID Nº 82)

11.b-1/2REV1	5'-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3'	(SEC ID Nº 51)

11.b-1/2REV12	5'-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3'	(SEC ID Nº 83)

11.b-1/2REV13	5'-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3'	(SEC ID Nº 84)

11.a-1/1REV1	5'-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3'	(SEC ID Nº 85)

11.a-1/1REV2	5'-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3'	(SEC ID Nº 86)

Las secuencias se editaron, se alinearon, y se compararon con una secuencia de \alpha_{d} de ratón aislada previamente (construcción nº 17, SEC ID Nº 45).

La alineación de las nuevas secuencias reveló una deleción de 18 bases en la construcción nº 17 que empieza en el nucleótido 2.308; la deleción no causaba un desplazamiento en la fase de lectura. El clon MS2P-9, secuenciado como se ha descrito anteriormente, también reveló la misma deleción de 18 bases. Se ha observado que la deleción sucede en el 50% de los clones de ratón que incluyen la región pero no se ha detectado en clones de \alpha_{d} de rata o ser humano. La deleción de dieciocho bases se caracteriza por una secuencia palindrómica de 12 bases AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEC ID Nº 91). Esta repetición invertida en la secuencia de ácido nucleico es auto-complementaria y puede formar un bucle, causando escisión durante la transcripción inversa. La secuencia de \alpha_{d} de ratón que incluye las 18 bases adicionales se expone en la SEC ID Nº 52; la secuencia de aminoácidos deducida se expone en la SEC ID Nº 53.

Ejemplo 30 Hibridaciones In situ en Ratón

Entonces se determinó la distribución tisular para \alpha_{d} de ratón para proporcionar una comparación con la existente en seres humanos, descrita en el Ejemplo 6.

Se generó una sonda de ARNm de 200 pb monocatenaria a partir de un molde de ADN, correspondiente a los nucleótidos 3.460 a 3.707 en la región de cola citoplasmática del ADNc murino, por transcripción de ARN in vitro incorporando ^{35}S-UTP (Amersham).

Se hibridaron embriones de ratón completos (recogidos en los días 11-18 después de la fertilización) y diversos tejidos de ratón, incluyendo bazo, riñón, hígado, intestino, y timo, in situ con la sonda de ARNm monocatenaria radiomarcada.

Los tejidos se seccionaron a un grosor de 6 \mum, se adhirieron a portaobjetos revestidos Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), y se almacenaron a -70ºC. Antes de su uso, los portaobjetos se retiraron de -70ºC y se pusieron a 50ºC durante aproximadamente 5 minutos. Las secciones se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a 4ºC, se deshidrataron con un gradiente creciente de etanol (70-95-100%) durante 1 minuto a 4ºC a cada concentración, y se secaron al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se desnaturalizaron durante 2 minutos a 70ºC en formamida al 70%/2X SSC, se aclararon dos veces en 2X SSC, se deshidrataron con el gradiente de etanol descrito supra y se secaron al aire durante 30 minutos. La hibridación se realizó durante una noche (12-16 horas) a 55ºC en una solución que contenía ribosondas marcadas con ^{35}S a 6 x 10^{5} cpm/sección y agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) para dar una concentración final de formamida al 50%, NaCl 0,3 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, sulfato de dextrano al 10%, solución de Denhardt 1X, ditiotreitol (DTT) 100 mM y EDTA 5 mM. Después de la hibridación, las secciones se lavaron durante 1 hora a temperatura ambiente en 4X SSC/DTT 10 mM, 40 minutos a 60ºC en formamida al 50%/2X SSC/DTT 10 mM, 30 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC, y 30 minutos a temperatura ambiente en 0,1X SSC. Las secciones se deshidrataron, se secaron al aire durante 2 horas, se recubrieron con emulsión fotográfica Kodak NTB2, se secaron al aire durante 2 horas, se revelaron (después de almacenamiento a 4ºC en oscuridad completa) y se contratiñeron con hematoxilina/eosina.

El tejido esplénico mostró una fuerte señal principalmente en la pulpa roja. Este patrón es coherente con el de la distribución de macrófagos tisulares en el bazo, pero no excluye otros tipos celulares.

Ejemplo 31 Generación de Construcciones de Expresión de Ratón

Para construir un plásmido de expresión que incluya secuencias de ADNc de ratón que muestren homología con \alpha_{d} humana, se ligaron insertos de los clones A1160 y B3800. Antes de este ligamiento, sin embargo, se añadió una secuencia líder 5', que incluye una metionina de inicio, al clon A1160. Se diseñó un cebador denominado "5' PCR leader" (SEC ID Nº 47) para que contuviera: (1) bases no específicas idénticas en las posiciones 1-6 que permitan la digestión; (2) un sitio BamHI (subrayado en la SEC ID Nº 47) de las posiciones 7-12 para facilitar la subclonación en un vector de expresión; (3) una secuencia Kozak consenso de las posiciones 13-18, (4) una secuencia señal que incluye un codón para una metionina de inicio (negrita en la SEC ID Nº 47), y (5) 31 bases adicionales de que solapan específicamente la secuencia 5' del clon A1160 para permitir la hibridación de cebador. Se usó un segundo cebador denominado "3' end frag" (SEC ID Nº 48) con el cebador "5' PCR leader" para amplificar el inserto del clon A1160.

5'-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3'	(SEC ID Nº 47)

5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3'	(SEC ID Nº 48)

El producto de PCR resultante no se digirió con BamHI, lo que sugiere que una cantidad insuficiente de bases precedía el sitio de restricción, prohibiendo el reconocimiento por la enzima. La longitud de la secuencia de "cola" que precede el sitio BamHI en el cebador 5' (SEC ID Nº 47) se aumentó y se repitió la PCR sobre el producto amplificado de la primera PCR. Se diseñó un cebador 5', denominado mAD.5'.2 (SEC ID Nº 49), con bases no específicas adicionales en las posiciones 1-4 y 20 bases adicionales que solapaban específicamente las secuencias cebadoras "5' PCR leader" previamente empleadas.

5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3'

(SEC ID Nº 49)

Los cebadores "mAD.5'.2" y "3' end frag" se usaron juntos en PCR con el producto de la primera amplificación como molde. Se subclonó el producto de la PCR secundaria resultante en el plásmido pCRtmII (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante y se introdujeron por transformación en células One shot (Invitrogen) competentes. Se identificó un clon que contenía el producto de PCR por análisis con enzimas de restricción usando BamHI y EcoRI y se secuenció. Después de que se verificara la secuencia, se aisló el inserto por digestión con BamHI y EcoRI y se purificó en gel.

El inserto del clon B3800 se aisló por digestión con EcoRI y NotI, se purificó en gel, y se añadió a una reacción de ligamiento que incluía el fragmento BamHI/EcoRI de A1160 aumentado. Se permitió que procediera el ligamiento durante 14 horas a 14ºC. Se añadió el vector pcDNA.3 (Invitrogen), digerido con BamHI y NotI,a la reacción de ligamiento con ligasa adicional y la reacción se continuó durante otras 12 horas. Se introdujo por transformación una alícuota de la mezcla de reacción en células E. coli competentes, las colonias resultantes se cultivaron, y un clon positivo se identificó por análisis de PCR con los cebadores 11.b-1/2FOR1 y 11.b-1/2REV11 (SEC ID Nº 50 y 51, respectivamente). Estos cebadores unen los fragmentos A1160 y B3800, por lo tanto la detección de un producto de amplificación indica que los dos fragmentos estabas ligados. Se verificó la secuencia del clon positivo con los cebadores expuestos en las SEC ID Nº 50 y 51, que amplifican de la base 100 a 1.405 detrás de la metionina de inicio.

Ejemplo 32 Construcción de un Ratón Knock-out

Para evaluar de forma más precisa la función inmunológica de la proteína codificada por el ADNc de \alpha_{d} de ratón putativo, se diseñó un ratón "knock-out" donde la secuencia de ADN genómico que codifica el homólogo de \alpha_{d} putativo está alterado por recombinación homóloga. El significado de la proteína codificada por el gen alterado se evalúa de este modo por la ausencia de la proteína codificada. La generación de ratones "knock-out" se describe en Deng, y col., Mol. Cell. Biol. 13: 2134-2140 (1993).

El diseño de dichos ratones comienza con la construcción de un plásmido que contiene secuencias que tienen que "eliminarse" por acontecimientos de recombinación homóloga. Se usó fragmento de 750 pares de bases del ADNc de ratón (correspondiente a los nucleótidos 1.985 a 2.733 en la SEC ID Nº 45) para identificar una secuencia genómica de ratón que codifica el homólogo de \alpha_{d} de ratón putativo a partir de una biblioteca genómica \lambdaFIXII. La exploración primaria produjo 14 placas positivas, siete de las cuales se confirmaron por exploración secundaria. Se obtuvieron lisados líquidos de dos de las placas que dan la señal más fuerte y se aisló el ADN \lambda por procedimientos convencionales. El mapeo con enzimas de restricción y el análisis de Southern confirmaron la autenticidad de un clon, denominado 14-1, y se aisló el ADN del inserto por digestión con NotI. Este fragmento se clonó en Bluescript® SKII^{-}.

Para identificar un fragmento de restricción de aproximadamente 9 a 14 kb, una longitud de la que se ha informado que optimiza la probabilidad de acontecimientos de recombinación homóloga, se realizó hibridación de Southern con la sonda de ADNc de 750 pb. Antes de la hibridación, se construyó un mapa de restricción para el clon 14-1. Se identificó un fragmento de 12 kb como un posible candidato y este fragmento se subclonó en pBluescript® SKII^{+} en una posición donde el ADN de ratón está flanqueado por casetes que codifican timidina quinasa. El análisis adicional de este clon con una sonda del dominio I (correspondiente a los nucleótidos 454-1.064 en la SEC ID Nº 45) indicó que el clon no contenía secuencias que codifican el dominio I.

Usando la misma sonda del dominio I, se volvió a explorar la biblioteca genómica \lambdaFIXII. Inicialmente, se detectaron seis clones positivos, uno de los cuales siguió siendo positivo después de la exploración secundaria. El ADN aislado de este clon reaccionó fuertemente en análisis de Southern con una sonda del dominio I. No se detectó reactividad usando la sonda de 750 pb original, sin embargo, que indica que este clon incluía regiones 5' a los nucleótidos 1.985-2.773 de la SEC ID Nº 45.

Como alternativa, la ausencia de hibridación con la sonda de 750 pb puede haber sugerido que el clon era otro miembro de la familia de proteínas integrinas. Para determinar si esta explicación era plausible, se subclonó el inserto de 13 kb en pBluescript® SKII^{+}. El ADN purificado se secuenció usando cebadores correspondientes a las secuencias de ácido nucleico del dominio I de \alpha_{d} 441-461, 591-612, 717-739, y 898-918 inversa en la SEC ID Nº 52. La información de secuencia se obtuvo usando solamente el primer cebador 4441-4461, y solamente se amplificó de forma eficaz el exón más 5' del dominio I. El resto del dominio I no se amplificó. El clon resultante, por lo tanto, comprendía el exón 6 del gen de \alpha_{d} de ratón, y las secuencias intrónicas en los extremos 3' y 5' del exón. El exón 7 no estaba representado en el clon. Después de la secuenciación, se genera una construcción que contiene genes de resistencia a neomicina y timidina quinasa.

El gen de resistencia a neomicina (neo^{r}) se inserta en el plásmido resultante de un modo que interrumpe la secuencia que codifica la proteína del ADN de ratón genómico. El plásmido resultante, por lo tanto, contiene un gen neo^{r} dentro de las secuencias de ADN genómico de ratón, todas las cuales están posiciones dentro de la región codificante de timidina quinasa. De este modo la construcción plasmídica se requiere para favorecer la recombinación homóloga sobre la recombinación aleatoria [Chisaka, y col., Nature 355: 516-520 (1992)].

Se usó una estrategia alternativa para generar construcciones útiles para la producción de ratones \alpha_{d} knock out. Dos series de cebadores oligonucleotídicos se sometieron a Genome Systems, Inc. (St. Louis, MO) para análisis por PCR de elevada rigurosidad de una biblioteca de inserto grande preparada a partir de ADN genómico de células madre embrionarias. Los cebadores correspondían al primero y el último exón del dominio I en \alpha_{d}. Se identificaron tres clones, dos de los cuales, denominados 1117 y 1118, eran reactivos con ambos cebadores y uno, denominado 1119, que sólo podía amplificarse con los cebadores del último exón.

Identificación de un ADN de \alpha_{d} Genómico de Ratón

Se preparó ADN plasmídico a partir de lisados bacterianos de los clones 1117 y 1118 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Genome Systems, Inc.) Los insertos de \alpha_{d} se verificaron por PCR usando los oligonucleótidos madk.f1 (SEC ID Nº 104) y madk.r1 (SEC ID Nº 105) y madk.r2 (SEC ID Nº 106).

madk.f1: SEC ID Nº 104

TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GC

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madk.r1: SEC ID Nº 105

GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGG

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madk.r2: SEC ID Nº 106

TAT AGC ATA GCG AAT GAT CC

Se digirieron alícuotas de ambos plásmidos con las enzimas de restricción BamHI, PstI, SacI, SalI, SmaI, XbaI, y XhoI (Boehringer Mannheim). Cada muestra de digestión se resolvió en gel de agarosa al 0,8% y los polinucleótidos se transfirieron sobre membrana de transferencia de ácido nucleico Hybond®-N^{+} (Amersham) para el análisis. La mancha de transferencia se sondeó con ADN cebado aleatoriamente ^{32}P generado usando un molde de 1,6 kb obtenido por PCR usando los oligos madfor 1 (SEC ID Nº 107) y madrev 1 (SEC ID Nº 108).

madfor 1: SEC ID Nº 107

ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATC

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madrev 1: SEC ID Nº 108

TCG AGA TCC ACC AAA CTG CAC

La hibridación se realizó a 42ºC durante una noche en tampón SSPE con formamida al 50%. La mancha de transferencia marcada se lavó cinco veces en SSPE 2X a temperatura ambiente. Las bandas radiomarcadas se visualizaron por exposición de la mancha de transferencia a película de autorradiografía Kodak X-Omat a -70ºC durante dos horas.

Se identificaron dos fragmentos de interés a partir del clon 1118: un fragmento SacI de 4,1 kb y un fragmento XbaI de 8,3 kb. Se ligaron los contenidos de muestra completos de las digestiones con SacI y XbaI del clon 1118 en el vector pBluescriptR KS^{+} sin purificación adicional, y después del ligamiento, se introdujeron por transformación los contenidos de reacción completos en preparaciones competentes por calcio de la cepa de E. coli TG1/lambda SmR. Las colonias resultantes se aislaron y se cultivaron durante una noche en 200 \mul de medio selectivo que contenía virus auxiliar M13KO7 para replicar el ADN monocatenario. Después se transfirió una alícuota de 10 \mul de sobrenadante de cada pocillo sobre membrana de transferencia Hybond®-N^{+} y se hibridó con la misma sonda y protocolo que se ha descrito anteriormente. Los cultivos se expandieron a partir de nueve clones positivos y se aisló el ADN plasmídico de cada cultivo usando un Wizard® Plus Miniprep DNA Purification System (Promega). Se usaron digestiones con encimas de restricción y PCR para confirmar la presencia y el tamaño de los insertos en los plásmidos aislados.

Tres clones se sometieron a análisis de secuencia usando los cebadores de vector T3 y T7 y los cebadores oligonucleotídicos correspondientes a secuencias de \alpha_{d} murino. La comparación de secuencia de estos tres clones con el ADNc murino usando el software Geneworks indicó que los tres contenían ambos exones 1 y 2 de \alpha_{d} murino. El clon más largo, mencionado como A, era un clon XbaI de 8.280 kb de longitud, y los dos clones más cortos, mencionados como E y H, eran clones SacI idénticos de 4.112 kb de longitud. El clon XbaI de 8.280 kb se seleccionó para desarrollo adicional.

Ejemplo 33 Clonación de \alpha_{d} de Conejo Construcción y Exploración de la Biblioteca de ADNc de Conejo

La identificación de homólogos de \alpha_{d} humana en ratas y ratones condujo a la investigación de la existencia de un homólogo de conejo que sería útil en modelos de conejo de patologías humanas descritas infra.

Se preparó ARN poli A^{+} a partir de un bazo de conejo completo usando un kit Invitrogen FastTrack (San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante y reactivos suministrados con el kit. A partir de 1,65 g de tejido, se aislaron 73 \mug de ARN poli A^{+}. El ARN del bazo de conejo se usó para construir una biblioteca de ADNc ZAP® Express usando un kit de Stratagene (La Jolla, CA). El ADNc resultante se clonó direccionalmente en sitios EcoRI y XhoI en los brazos lambda de un vector fagómido pBK-CMV. Se usó Gigapack® II Gold (Stratagene) para empaquetar los brazos lambda en las partículas fágicas. Se estimó que el título de la biblioteca resultante era de aproximadamente 8 x 10^{5} partículas, con un tamaño de inserto promedio de 1,2 kb.

La biblioteca se amplificó una vez sembrando para el crecimiento de placas confluentes y se recogió el lisado celular. La biblioteca amplificada se sembró a aproximadamente 30.000 unidades formadoras de placa (pfu) por placa de 150 mm con E. coli y la mezcla resultante se incubó durante 12-16 horas a 37ºC para permitir la formación de placas. El ADN fágico se transfirió sobre membranas de nylon Hybond® N^{+} (Amersham, Arlington Heights, Illinois). Las membranas se hibridaron con una mezcla de dos sondas de ADN de PCR de \alpha_{d} de ratón radiomarcadas cebadas aleatoriamente. La primera sonda se generó a partir de un producto de PCR que abarca los nucleótidos 149-946 de la SEC ID Nº 52. La segunda sonda era de un producto de PCR que abarca los nucleótidos 2.752-3.651 de la SEC ID Nº 52. Las sondas se marcaron por cebado aleatorio (Boehringer Mannheim Random Primed DNA Labeling Kit) y la mezcla de reacción se pasó sobre una columna Sephadex® G-50 para retirar los nucleótidos no incorporados. La solución de hibridación estaba compuesta de SSPE 5X, Denhardt 5X, SDS al 1%, Formamida al 40% y las sondas se marcaron a 1 x 10^{6} dpm/ml. La hibridación se realizó a 42ºC durante 16-18 horas. Los filtros se lavaron extensivamente en SSPE 2X/SDS al 0,1% a temperatura ambiente y se expusieron a película de rayos X para visualizar cualquier placa de hibridación.

Se identificaron dos clones con homología de secuencia significativa con \alpha_{d} humana. El clon nº 2 era de aproximadamente 800 pb de longitud y se mapeó en el extremo 5' de \alpha_{d} humana. El clon nº 2 incluye una metionina de inicio y una secuencia líder completa. El clon nº 7 era de aproximadamente 1,5 kb e incluye una metionina de inicio. El extremo 5' del clon nº 7 solapaba con el del clon nº 2, mientras que las secuencias 3' terminaban en un punto detrás de las secuencias del dominio I. El clon nº 7 se secuenció completamente por el procedimiento de paseo con cebador. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida para el clon nº 7 se exponen en las SEC ID Nº 100 y 101, respectivamente.

La secuencia de aminoácidos N terminal predicha para \alpha_{d} de conejo determinada a partir de los clones nº 2 y nº 7 indicaba una proteína con una identidad del 73% con \alpha_{d} humana, una identidad del 65% con \alpha_{d} de ratón, y una identidad del 58% con CD11b de ratón, CD11b humana, y CD11c humana. La secuencia de ácido nucleico para el clon nº 2 se expone en la SEC ID Nº 92; la secuencia de aminoácidos predicha se expone en la SEC ID Nº 93.

Se intentó el aislamiento de un ADNc de \alpha_{d} de conejo de longitud completa usando el clon nº 7 de conejo marcado y volviendo a explorar la biblioteca de ADNc de la que se obtuvo el fragmento. Se identificaron veinticinco clones adicionales con uno, denominado clon 49, que se determinó que era el más largo. El clon 49 se secuenció completamente usando la técnica de deleciones anidadas. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para el clon 49 se exponen en las SEC ID Nº 102 y 103, respectivamente. Como los clones nº 7 y nº 49 no solapaban, se diseñaron oligonucleótidos para usarlos como cebadores en una PCR con ADNc de bazo de conejo de la primera cadena para aislar la secuencia perdida.

La relación de la secuencia de aminoácidos putativa de estos dos clones parciales con la de otras leucointegrinas se describe en la Tabla 1.

TABLA 1 Porcentaje de identidad de miembros de la familia de integrinas \beta_{2} a nivel de aminoácidos

1

El aislamiento de un clon de \alpha_{d} de conejo permite la expresión de la proteína, o en la superficie de transfectantes o como una forma de longitud completa o truncada soluble. Esta proteína después se usa como un inmunógeno para la producción de anticuerpos monoclonales para su uso en modelos de conejo de patologías humanas.

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Ejemplo 34 Aislamiento de \alpha_{d} de Mono Preparación de columnas de afinidad

Para preparar una resina de columna de afinidad para aislar \alpha_{d} de bazo de mono, se dializaron 10 mg de cada uno de los anticuerpos anti-\alpha_{d} humana 212D y 217L durante una noche frente a tampón de acoplamiento que contenía NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. Se preparó aproximadamente 1,0 g de CNBr Sepharose® 4B (Pharmacia, Piscataway NJ) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante y se combinó 1,0 ml de la resina con cada uno de los anticuerpos dializados. La suspensión resultante se mezcló por rotación durante una noche a 4ºC y la resina acoplada se obtuvo por centrifugación durante 5 minutos a 1.000 rpm en una centrífuga de sobremesa Beckman. La fracción de sobrenadante no absorbida se recogió y se ensayó para la presencia de proteína no acoplada por un espectrofotómetro. Los resultados indicaron que todo el anticuerpo disponible se había unido a la matriz de gel. Los grupos activos no acoplados en las resinas se bloquearon con etanolamina 1 M durante 2 horas a temperatura ambiente y las resinas se lavaron en una serie de cambios alternos de pH alto y bajo en tampón de acoplamiento seguido de un lavado final usando tampón acetato que contenía NaC_{2}H_{3}O_{2}\cdot3H_{2}O 0,1 M y NaCl 0,5 M, pH 4,0. Ambas resinas se almacenaron a 4ºC en tampón de acoplamiento.

Preparación de Bazo de Mono

Se obtuvieron bazos de macaco hembra del University of Washington's Regional Primate Center. El tejido esplénico se inyectó con 100 U/ml de colagenasa D (Sigma) y se picó en pequeños trozos. Los trozos de tejido después se resuspendieron en un pequeño volumen de Tampón de Lisis que contenía Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, pH 8,0, con detergente Triton-X100® al 1,0% y se almacenaron a -70ºC. Se añadieron inhibidores de proteasa PLA (una mezcla de Pepstatina A, leupeptina, y aprotinina, cada uno de Sigma) y fluoruro de 4-(2-aminoetil) benceno sulfonilo-HCl (AEBSF) (Nova Biochem La Jolla, CA) para evitar la proteolisis de proteína durante el almacenamiento. El tejido se almacenó hasta un total de seis bazos de macaco que se obtuvieron.

El tejido esplénico de los seis monos se combinó y homogeneizó en una mezcladora Waring, tres ciclos de diez segundos cada uno, en Tampón de Lisis TSA que contenía Tris 25 mM, NaCl 0,15 M, NaN_{3} al 0,02%, Triton® al 1,0%, PLA 1X y AEBSF 0,1 mM. El lisado se recogió y se colocó en una plataforma de balanceo durante una hora a 4ºC, y después se centrifugó durante 15 minutos a 3.000 rpm en una centrífuga de sobremesa Beckman. Se recogió el sobrenadante y se desecharon los desechos celulares sedimentados. Se recogió un volumen total de 550 ml de lisado y se preaclaró incubando el lisado durante 2 horas a 4ºC con CNBr Sepharose® previamente tratada en etanolamina 1 M para bloquear los sitios reactivos. Después de la incubación, la resina se retiró por centrifugación y se recogió el sobrenadante.

Purificación por Afinidad y Secuenciación

El lisado esplénico preparado como se ha descrito anteriormente se dividió en mitades y se combinó individualmente con los geles CNBr Sepharose® preparados con 212D y 217L. Las suspensiones resultantes se mezclaron con rotación durante tres días a 4ºC, después de lo cual se recogió la fracción no absorbida por centrifugación a 1.500 rpm 10 minutos en una centrífuga de sobremesa Beckman y se guardó. Los geles se transfirieron a tubos de centrífuga de 15 ml y se lavaron secuencialmente en varios volúmenes de D-PBS. Se hirvieron brevemente alícuotas de aproximadamente 100 \mul de cada gel en tampón de muestra reductor que contenía Tris-HCl 0,1 M, pH 6,8, SDS al 2,0%, glicerol al 20%, azul bromofenol al 0,0002%, \beta-mercaptoetanol al 10% (concentración del final 5%) y se cargaron y las proteínas se resolvieron usando un gel de poliacrilamida SDS al 6,0% (SDS-PAGE). El gel se tiñó con Coomasie y se detectaron proteínas que tenían pesos moleculares coherentes con \alpha_{d} y CD18 junto con varias proteínas de fondo.

En un intento de mejorar la purificación de la proteína que tenía el peso molecular similar a \alpha_{d}, se lavaron dos alícuotas de 100 \mul de cada gel con proteína unida por diferentes medios. En un procedimiento, los geles se lavaron varias veces en tampón que contenía NaCl 150 mM, Tris 10 mM, Triton-X100® al 1,0%, pH 8,0, y en un segundo procedimiento, los geles se lavaron de forma idéntica, pero la proteína unida se eluyó en un lavado final con glicina 0,05 M, pH 2,4. Como antes, la proteína eluida se hirvió brevemente en tampón de muestra reductor y se resolvió en un gel SDS-PAGE al 6,0%. La tinción con Coomasie detectó solamente proteínas coherentes con \alpha_{d} y CD18 de la resina lavada en tampón glicina de bajo pH, por tanto se eligió este procedimiento de aislamiento. Para aislar la proteína para secuenciación, el resto de la resina CNBr Sepharose® se lavó cuatro veces como se ha descrito anteriormente y se resuspendieron aproximadamente tres cuartas partes de la resina en 2,0 ml de glicina 0,05 M, pH 2,4, y se agitaron con vórtice vigorosamente. La resina se sedimentó por centrifugación durante 3 minutos y se recogió la fracción no absorbida. El gel después se lavó una vez más en tampón glicina y este lavado se combinó con la fracción no absorbida previa. Las fracciones combinadas se dializaron frente a D-PBS durante una noche a 4ºC con dos cambios. Después de la diálisis, las muestras se secaron para reducir los volúmenes a 1,0 ml.

Para la secuenciación, los eluatos se separaron en geles de resolución al 7,0% y las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon (PVDF) (Millipore, Bedford MA) como se ha descrito en el Ejemplo 2. En resumen, los geles se lavaron una vez en agua desionizada y se equilibraron durante 15 a 45 minutos en tampón ciclohexilamino-ácido propanosulfónico 10 mM (CAPS), pH 10,5, con metanol al 10%. Las membranas de PVDF se aclararon tanto en metanol como en agua destilada, después se equilibraron en tampón de transferencia CAPS durante 15 a 30 minutos. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF durante 3 horas a 70 voltios después de lo cual se tiñeron en tinción de Coomasie R250 al 0,1% filtrado durante 10 minutos. Las membranas se lavaron para desteñirlas en metanol al 50%/ácido acético al 10% tres veces, 10 minutos cada lavado, se lavaron una vez más en agua filtrada, y se secaron.

Se detectaron dos bandas de proteína predominantes de aproximadamente 150 kD y 95 kD de las dos resinas acopladas a 212D y 217L que eran coherentes con las proteínas detectadas en los geles de escala analítica procesados previamente. Se detectó una banda un poco distinta en la membrana derivada de la resina acoplada a 217L localizada directamente debajo de la proteína a 150 kD, pero la banda no se detecto después de que la membrana se secara. La nada de 150 kD de cada membrana se escindió de la membrana y se secuenció directamente con un secuenciador de proteínas Applied Biosystems (Foster City, CA) Modelo 473A de acuerdo con el procedimiento sugerido por el fabricante.

Los resultados indicaron que la secuencia amino terminal de la proteína de mono aislada usando resina acoplada a 212D tenía la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 109, y el extremo amino de la proteína aislada usando la resina acoplada a 217L tenía la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 110. La "X" en la SEC ID Nº 110 indica un resto indeterminable.

Proteína Acoplada a 212D: SEC ID Nº 109

NLDVEEPTIFQEDA

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Proteína Acoplada a 217L: SEC ID Nº 110

NLDVEEPTIFXEDA

Se muestra una comparación de las secuencias de mono con las secuencias amino terminal de \alpha_{d} humana y otras cadenas \alpha en la familia de integrinas \beta_{2} en la Tabla 2.

TABLA 2 Comparación de la Secuencia Amino Terminal de \alpha_{d} de Mono Con Subunidades \alpha de \beta_{2} Humanas

2

3

En base a la identidad de secuencia, puede concluirse que tanto 212D como 217L reconocen \alpha_{d} tanto en macacos como en seres humanos.

Ejemplo 35 Caracterización de Antígeno 217L

En base a la secuencia N-terminal de la proteína precipitada del bazo de mono en el ejemplo previo, puede concluirse que los anticuerpos 217L y 212D reconocen la proteína \alpha_{d} tanto en mono como en seres humanos. El análisis inmunocitoquímico (ICC) y los experimentos de inmunoprecipitación, sin embargo, indican que 217L tiene reactividad adicional no compartida por 212D. Experimentos FACS e ICC usando anticuerpos contra todas las cadenas \alpha descartaron la reactividad cruzada de 217L con CD11c, la cadena \alpha de leucointegrina más estrechamente relacionada, y CD11b. Por lo tanto, puede ser que el anticuerpo 217L también reconozca una variante conformacional, de glicosilación, o de ayuste de \alpha_{d} o una nueva cadena \alpha que comparte homología de secuencia con \alpha_{d}.

La distribución única del antígeno reconocido por el anticuerpo 217L en tejido pulmonar sarcoide (véase el Ejemplo 18), con un patrón de tinción no solapante en relación con CD11c, sugiere que el antígeno puede tener significado biológico. Por lo tanto, para entender más completamente el significado del antígeno 217L, se requieren análisis de la proteína y el ADN subyacente que codifica la proteína y se contemplan diversos enfoques.

Se realiza la inmunoprecipitación de un complejo proteico de células dendríticas humanas o sangre periférica usando el anticuerpo 217L, seguido de la secuencia N-terminal de las proteínas precipitadas. El análisis de secuencia revelará si la proteína reconocida en células de sangre periférica comparte identidad amino terminal con \alpha_{d}. La proteína precipitada de las células dendríticas o células de sangre periférica después se trata con enzimas desglicosilantes y se compara con CD11c y \alpha_{d} precipitadas de otras fuentes para proporcionar una comparación del peso molecular de la secuencia de aminoácidos primaria.

Además, se sondea una biblioteca de ADNc generada a partir de ARN de células dendríticas con el ADNc de \alpha_{d} complejo en baja rigurosidad. Los clones reactivos se analizan por secuenciación de ácido nucleico en la longitud completa del clon para determinar si existen secuencias no \alpha_{d} en los clones.

Ejemplo 36 Modelo Animales Para Determinar la Utilidad Terapéutica de \alpha_{d}

Los datos inmunohistológicos en perros y de hibridación in situ en ratas y ratones han determinado que en bazo \alpha_{d} se expresa principalmente por macrófagos presentes en pulpa roja y en ganglios linfáticos, \alpha_{d} se encuentra en cordones medulares y senos. El patrón de expresión es remarcadamente similar al que se ha presentado para dos antígenos murinos definidos por los anticuerpos monoclonales F4/80 y SK39. Aunque la caracterización bioquímica de estos antígenos murinos ha demostrado que son distintos de \alpha_{d}, es muy probable que \alpha_{d} defina el mismo subconjunto de macrófagos que los antígenos F4/80 y SK39 murinos.

En ratones, se han identificado macrófagos SK39-positivos en pulpa roja esplénica donde pueden participar en la eliminación de materiales foráneos de la circulación, y en la médula de ganglios linfáticos [Jutila, y col., J. Leukocyte Biol. 54: 30-39 (1993)]. También se ha informado de macrófagos SK39-positivos en sitios de inflamación tanto aguda como crónica. Además, los monocitos reclutados a cavidades peritoneales inflamadas por tioglicolato también expresan el antígeno SK39. Colectivamente, estos hallazgos sugieren que, si las células SK39^{+} también son \alpha_{d}^{+}, entonces estas células son responsables de la eliminación de materiales foráneos en el bazo y participan en la inflamación donde los macrófagos desempeñan una tarea significativa.

Aunque la función de \alpha_{d} sigue sin estar clara, se ha demostrado que otras integrinas \beta_{2} bien caracterizadas participan en una amplia diversidad de acontecimientos de adhesión que facilitan la migración celular, potencian la fagocitosis, y promueven las interacciones célula-célula, acontecimientos todos que conducen a la regulación positiva de los procesos inflamatorios. Por lo tanto, es muy plausible que la interferencia con la función \alpha_{d} normal también pueda interferir con la inflamación donde los macrófagos desempeñan una tarea significativa. Dicho efecto anti-inflamatorio podría ser el resultado de: i) el bloqueo del reclutamiento de macrófagos a sitios de inflamación, ii) la evitación de la activación de macrófagos en el sitio de inflamación o iii) la interferencia con las funciones efectoras de los macrófagos que dañan el tejido huésped normal a través de respuestas autoinmunes específicas o como resultado del daño de células adyacentes.

Las patologías en que se evidencia que los macrófagos desempeñan una tarea significativa en el proceso de la enfermedad incluyen esclerosis múltiple, artritis, aterosclerosis de injerto, algunas formas de diabetes y enfermedad inflamatoria del intestino. Los modelos animales, analizados a continuación, han demostrado reproducir muchos de los aspectos de estos trastornos humanos. Se ensayan inhibidores de la función \alpha_{d} en estos sistemas de modelo para determinar si existe la posibilidad de tratar las enfermedades humanas correspondientes.

Arteriosclerosis de Injerto

El transplante cardiaco ahora es la forma aceptada de intervención terapéutica para algunos tipos de cardiopatía en fase final. Como el uso de ciclosporina A ha aumentado los índices de supervivencia de un año al 80%, ha surgido el desarrollo progresivo de arteriosclerosis de injerto como causa principal de muerte en transplantes cardiacos que sobreviven después del primer año. Recientes estudios han descubrieron que la incidencia de arteriosclerosis de injerto significativa 3 años después de transplante cardiaco está en el intervalo del 36-44% [Adams, y col., Transplantation 53: 1115-1119 (1992); Adams, y col., Transplantation 56: 794-799 (1993)].

La arteriosclerosis de injerto típicamente consta de lesiones intimales difusas, oclusivas que afectan a la pared del vaso coronario completo, y a menudo están acompañadas por deposición de lípidos. Aunque la patogénesis de la arteriosclerosis de injerto sigue sin ser conocida, supuestamente está ligada a diferencias de histocompatibilidad entre el donante y el receptor, y es de naturaleza inmunológica. Histológicamente, las áreas de engrosamiento intimal están compuestas principalmente de macrófagos, aunque ocasionalmente se observan células T. Por lo tanto, es posible que macrófagos que expresan \alpha_{d} puedan desempeñar una función significativa en la inducción y/o desarrollo de arteriosclerosis de injerto. En dicho caso, se podrían dar anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña (por ejemplo, ICAM-R soluble) de la función \alpha_{d} de forma profiláctica a individuos que recibieron transplantes de corazón y están en riesgo de desarrollar arteriosclerosis de injerto.

Aunque la aterosclerosis en transplantes de corazón presenta la mayor amenaza de la vida, también se observa arteriosclerosis de injerto en transplantes de otros órganos sólidos, incluyendo riñones e hígados. El uso terapéutico de agentes bloqueantes de \alpha_{d} podría prevenir la arteriosclerosis de injerto en otros transplantes de órganos y reducir las complicaciones provocadas por los fallos del injerto.

Un modelo para arteriosclerosis de injerto en ratas implica aloinjertos cardiacos heterotópicos transplantados a través de barreras de histocompatibilidad minoritarias. Cuando se transplantan aloinjertos cardiacos de Lewis en receptores F-344 compatibles MHC de clase I y II, el 80% de los aloinjertos sobreviven al menos 3 semanas, mientras que el 25% de los injertos sobreviven indefinidamente. Durante este rechazo de injerto de bajo grado, se forman lesiones de arteriosclerosis en el corazón donante. Las lesiones arteriales en aloinjertos de 120 días de edad típicamente tienen engrosamiento intimal fibrótico difuso indistinguible en aspecto de lesiones de arteriosclerosis de injerto encontradas en aloinjertos cardiacos humanos.

A las ratas se les transplantan corazones no coincidentes en los antígenos de histocompatibilidad minoritarios, por ejemplo Lewis en F-344. Se da periódicamente anticuerpos monoclonales específicos para \alpha_{d} de rata o inhibidores de molécula pequeña de \alpha_{d} a los receptores del transplante. Se espera que el tratamiento reduzca la incidencia de arteriosclerosis de injerto en corazones donantes no rechazados. El tratamiento de las ratas con anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña contra \alpha_{d} puede no estar limitado a tratamiento profilácticos. También se espera que el bloqueo de la función \alpha_{d} reduzca la inflamación mediada por macrófagos y permita la reversión del daño arterial en el injerto.

Aterosclerosis en Conejos Alimentados con Colesterol

Conejos alimentados con una dieta aterogénica que contiene un suplemento de colesterol durante aproximadamente 12-16 semanas desarrollar lesiones intimales que cubren la mayor parte de la superficie de la luz de la aorta ascendente [Rosenfeld, y col., Arteriosclerosis 7:9-23 (1987); Rosenfeld, y col., Arteriosclerosis 7:24-34 (1987)]. Las lesiones ateroscleróticas observadas en estos conejos se parecen a las observadas en seres humanos. Las lesiones contienen grandes cantidades de células T, la mayoría de las cuales expresan CD45RO, un marcador asociado con células T de memoria. Aproximadamente la mitad de las células T también expresan el antígeno MHC de clase II y algunas expresan el receptor de IL-2 lo que sugiere que muchas de las células están en un estado activado.

Una característica de las lesiones ateroscleróticas encontradas en conejos alimentados con colesterol, pero aparentemente ausente en modelos de roedor, es la acumulación de lesiones ricas en células espumosas. Se cree que los macrófagos de células espumosas son el resultado de la captación de lipoproteína de baja densidad (LDL) oxidada por receptores específicos. Se ha descubierto que las partículas LDL oxidadas son tóxicas para algunos tipos celulares incluyendo células endoteliales y células de músculo liso. La captación de partículas LDL oxidadas, potencialmente tóxicas por los macrófagos sirve como irritante y dirige la activación de los macrófagos, los que contribuye a la inflamación asociada con lesiones ateroscleróticas.

Una vez que se han generado anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} de conejo, se trata a los conejos alimentados con colesterol. Los tratamientos incluyen la administración profiláctica de anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña contra \alpha_{d}, para demostrar que los macrófagos \alpha_{d}^{+} están implicados en el proceso de la enfermedad. Estudios adicionales demostrarían que anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña contra \alpha_{d} son capaces de revertir el daño de los vasos detectado en conejos alimentados con una dieta aterogénica.

Diabetes Insulinodependiente

Ratas BB desarrollar espontáneamente diabetes insulinodependiente a los 70-150 días de edad. Usando inmunohistoquímica, pueden detectarse macrófagos MHC de clase II^{+}, ED 1^{+} infiltrando los islotes en fase temprana de la enfermedad. Muchos de los macrófagos parece que se dedican a la fagocitosis de desechos celulares o células normales. Según progresa la enfermedad, se encuentran grandes cantidades de macrófagos infiltrando los islotes, aunque también parece que cantidades significativas de células T, y células B tardías, se reclutan en el sitio [Hanenberg, y col., Diabetologia 32: 126-134 (1989)].

El desarrollo de diabetes en ratas BB parece depender tanto de la infiltración temprana de macrófagos como del reclutamiento posterior de células T. El tratamiento de ratas BB con partículas de sílice, que son tóxicas para los macrófagos, ha sido eficaz para bloquear la infiltración temprana de macrófagos de los islotes. En ausencia de infiltración temprana de macrófagos, no se consigue que suceda el posterior daño tisular por una población linfocitaria autoagresiva. La administración de anticuerpo monoclonal OX-19 (específico para CD5 de rata) o anticuerpo monoclonal OX-8 (específico para CD8 de rata), que bloquea la fase asociada a células T de la enfermedad, también es eficaz en la supresión del desarrollo de la diabetes.

El papel central de los macrófagos en la patología de este modelo lo hace atractivo para ensayar inhibidores de la función \alpha_{d}. Las ratas genéticamente predispuestas al desarrollo de diabetes insulinodependiente se tratan con anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña contra \alpha_{d} y se evalúan para el desarrollo de la enfermedad. La prevención o retardo de la aparición clínica evidencia que \alpha_{d} desempeña un papel central en el daño por macrófagos a las células de los islotes.

Enfermedad Inflamatoria del Intestino (Colitis Ulcerosa por Enfermedad de Crohn)

Los modelos animales usados en el estudio de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) generalmente se producen por administración intrarrectal de irritantes nocivos (por ejemplo, ácido acético o ácido trinitrobencenosulfónico/etanol). La inflamación colónica inducida por estos agentes es el resultado de lesión química o metabólica y carece de la inflamación crónica y que recae espontáneamente asociada con IBD humana. Sin embargo, un modelo recientemente descrito usando inyecciones subserosas de polímeros de peptidoglicano-polisacárido (PG-PS) purificados de estreptococos del grupo A o grupo D parece ser un modelo fisiológicamente más relevante para IBD humana [Yamada, y col., Gastroenterology 104: 759-771 (1993)].

En este modelo se inyecta PG-PS en la capa subserosa del colon distal. La respuesta inflamatoria resultante es bifásica con un episodio agudo inicial tres días después de la inyección, que está seguido por una fase crónica espontánea de tras a cuatro semanas después. La respuesta de fase tardía es de naturaleza granulomatosa, y provoca engrosamiento del colon, adhesiones, nódulos colónicos y lesiones de la mucosa. Además de la lesión de la mucosa, la colitis por PG-PS frecuentemente conduce a anemia por artritis y hepatitis granulomatosa. Las manifestaciones extraintestinales de la enfermedad hacen al modelo atractivo para estudiar la colitis de Crohn porque una cantidad significativa de pacientes con enfermedad de Crohn activa padecen enfermedad de articulaciones artríticas e inflamación hepatobiliar.

Las lesiones granulomatosas son el resultado de inflamación crónica que condice al reclutamiento y posterior activación de células del linaje de monocitos/macrófagos. La presencia de lesiones granulomatosas en enfermedad de Crohn y el modelo animal anterior hacen de ésta una diana clínica atractiva para anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} u otros inhibidores de la función \alpha_{d}. Se espera que los inhibidores de la función \alpha_{d} bloqueen la formación de lesiones asociadas con IBD o incluso inviertan el daño tisular observado en la enfermedad.

Artritis

Parece que la artritis es una patología multi-factorial que implica una diversidad de tipos celulares inflamatorios incluyendo neutrófilos, linfocitos T y macrófagos fagocíticos. Aunque existe una diversidad de modelos de artritis, las preparaciones de proteoglicanos de la pared celular de estreptococos producen un trastorno muy similar a la enfermedad humana.

En ratas, la pared celular de estreptococos induce la inflamación de las articulaciones periféricas caracterizada por episodios repetidos de progreso de la enfermedad seguido de remisión y finalmente provocando la destrucción de la articulación durante un periodo de varios meses [Cromartie, y col., J. Exp. Med 146: 1585-1602 (1977); Schwab y col., Infection and Immunity 59: 4436-4442 (1991)]. Durante la fase crónica de la enfermedad, se cree que los fagotitos mononucleados o los macrófagos desempeñan una tarea principal en la destrucción del sinovio. Además, los agentes que suprimen el reclutamiento de macrófagos en el sinovio reducen de forma eficaz la inflamación y patología características de la artritis.

El papel central para los macrófagos en la destrucción de sinovio que conduce a artritis prevé que anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} o inhibidores de la función \alpha_{d} pueden tener potencial terapéutico en el tratamiento de esta enfermedad. Como en otros modelos previamente descrito, se espera que los anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña contra \alpha_{d} administrados profilácticamente bloqueen o moderen la inflamación articular y eviten la destrucción del sinovio. Agentes que impiden la función \alpha_{d} también pueden moderar la inflamación en curso evitando el reclutamiento de macrófagos adicionales a la articulación o bloqueando la activación de macrófagos. El resultado neto sería invertir la destrucción en curso de la articulación y facilitar la reparación tisular.

Esclerosis Múltiple

Aunque la patogénesis de la esclerosis múltiple (MS) sigue sin estar clara, está generalmente aceptado que la enfermedad está mediada por células T CD4^{+} que reconocen autoantígenos en el sistema nervioso central e inician una cascada inflamatoria. La respuesta inmune resultante provoca el reclutamiento de células inflamatorias adicionales, incluyendo macrófagos activados que contribuyen a la enfermedad. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal que reproduce algunos aspectos de MS. Recientemente, se ha demostrado que anticuerpos monoclonales reactivos con CD11b/CD18 [Huitinga, y col., Eur. J. Immunol. 23: 709-715 (1993)] presentes en macrófagos inflamatorios bloquean la enfermedad tanto clínica como histológica. Los resultados sugieren que anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña contra \alpha_{d} probablemente son eficaces en el bloqueo de la respuesta inflamatoria en EAE. Dichos agentes también tienen aplicaciones terapéuticas importantes en el tratamiento de MS.

Alveolitos Compleja Inmune

Los macrófagos alveolares localizados en los conductos alveolares, las vías aéreas, tejido conectivo, y espacios pleurales del pulmón representan la primera línea pulmonar de defensa contra agentes ambientales inhalados. En respuesta a estimulación por agentes, incluyendo LPS derivado de bacterias, IFN-\gamma y complejos inmunes, los macrófagos alveolares liberan una diversidad de potentes mediadores inflamatorios, incluyendo radicales de oxígeno altamente reactivos e intermedios de nitrógeno. Aunque los aniones superóxido, el peróxido de hidrógeno y el óxido nítrico (NO) tienen funciones importantes en la erradicación de patógenos y la lisis de dianas tumorales, estos agentes pueden tener efectos perjudiciales sobre tejidos normales.

En un modelo de rata de alveolitis compleja inmune, se ha demostrado que la liberación de NO de macrófagos alveolares media gran parte del daño pulmonar [Mulligan, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 638-6342 (1991)]. El NO\cdottambién se ha implicado como mediador en otras lesiones mediadas por complejos inmunes incluyendo vasculitis dérmica [Mulligan, y col., supra] y podría desempeñar potencialmente una tarea en enfermedades tales como glomerulonefritis.

El daño tisular mediado por NO\cdotno está limitado a la inflamación que implica complejos inmunes. Por ejemplo, células microgliales estimuladas, por agentes tales como PMA, LPS o IFN-\gamma, producen NO\cdota niveles capaces de eliminar oligodendrocitos [Merrill, y col., Immunol. 151:2132 (1993)]. También se ha descubierto que las células de los islotes pancreáticos son sensibles a NO, y la liberación por los macrófagos de este mediador se ha implicado en el daño tisular que conduce a diabetes [Kroncke, y col., BBRC 175: 752-758 (1991)]. Más recientemente, se ha demostrado de concluyente que la liberación de NO\cdotdesempeña una tarea en el choque endotóxico [MacMicking, y col., Cell 81: 641-650 (1995)]. Cuando se administra lipopolisacárido (LPS), ratones de tipo silvestre normales experimentan una disminución progresiva, severa en la presión arterial que provoca la muerte. Ratones deficientes en óxido nítrico inducible, sin embargo, experimentan una disminución mucho menos severa en la presión arterial en response a LPS, y todos sobreviven al tratamiento.

Ensayos in vitro hincan que el bloqueo de \alpha_{d} es eficaz para bloquear algunos aspectos de la activación de macrófagos (o leucocitos que expresan \alpha_{d}, en general), incluyendo la liberación de NO. Se descubrió que los macrófagos alveolares estimulados con IFN-\gamma en presencia de antisuero policlonal anti-\alpha_{d} (generado en conejos contra un polipéptido del dominio I de \alpha_{d} de rata) producían significativamente menos nitrito/nitrato - productos de descomposición de NO\cdotque macrófagos tratados con antisuero de control. Este hallazgo indica que anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d}, particularmente contra el dominio I, pueden ser agentes anti-inflamatorios potentes con usos potenciales en MS, diabetes, inflamación pulmonar y choque endotóxico. Además, en contraste con CD18, que realiza la función de una amplia diversidad de tipos leucocitarios, la distribución limitada de \alpha_{d} puede hacer de ésta una diana más atractiva que CD18 para evitar la activación de macrófagos (o leucocitos que expresan \alpha_{d}, en general).

La alveolitis inducida por complejo inmune de IgG de rata es un modelo experimental ampliamente usado importante para entender la lesión pulmonar aguda. La lesión se provoca instilando anticuerpos anti-albúmina de suero bovino (BSA) en los pulmones mediante canulación traqueal, seguido de una inyección intravenosa de BSA. La formación de complejos inmunes en la microvasculatura del pulmón conduce a la activación del complemento y el reclutamiento de neutrófilos en el pulmón. Supuestamente, la formación de complejos inmunes en el pulmón después de la extravasación de leucocitos desde la sangre y el posterior movimiento de los leucocitos a través del epitelio pulmonar. La posterior liberación de mediadores, incluyendo radicales, TNF-\alpha y óxido nítrico (NO), desde células endoteliales activadas, neutrófilos y macrófagos que participan en el progreso de la enfermedad. Las características patológicas de la enfermedad incluyen permeabilidad vascular aumentada que conduce a edema y la presencia de grandes cantidades de eritrocitos y PMN presentes en los espacios alveolares.

Se ensayó antisuero policlonal específico para el dominio I de \alpha_{d} en un modelo de rata de alveolitis inducida por complejos inmunes. Se administró suero policlonal anti-\alpha_{d} mediante canulación traqueal al mismo tiempo que se introdujo anti-BSA en los pulmones. Posteriormente se provocó la lesión pulmonar por administración intravenosa de BSA junto con una cantidad traza de BSA marcada conI (aproximadamente 800.000 cpm) para cuantificar el edema como resultado de la lesión pulmonar. Se permitió que la lesión pulmonar procediera durante cuatro horas y se evaluó el daño usando un valor de permeabilidad pulmonar, que se define como la tasa de BSA marcada con ^{125}I en el pulmón en comparación con la cantidad de marcador presente en 1,0 ml de sangre. Típicamente los valores de permeabilidad pulmonar para controles positivos varían entre 0,6 y 0,8, mientras que los controles negativos (ratas que no reciben BSA) tienen valores de índice de permeabilidad en el intervalo de 0,1-0,2.

Estudios iniciales indicaron que el tratamiento con antisuero policlonal anti-\alpha_{d} reducía los valores de permeabilidad pulmonar en más del 50%, que representa una moderación drástica de la lesión pulmonar. Históricamente, los tratamientos con anti-CD18 han reducido los valores de permeabilidad en un 60%. Estos hallazgos indican que \alpha_{d} puede ser la integrina \beta_{2} más importante durante la lesión pulmonar aguda, sin embargo, no puede determinarse de forma precisa si el efecto del antisuero impide la extravasación de leucocitos desde la sangre, o el movimiento a través del epitelio pulmonar.

Como prueba adicional de que \alpha_{d} modera la lesión pulmonar, se evaluaron los niveles de TNF-alfa en el fluido de lavado broncoalveolar. Se descubrió que el tratamiento con el antisuero anti-\alpha_{d} reducía los niveles de TNF-alfa aproximadamente cuatro veces. Desde hace tiempo se ha visto TNF-alfa como un mediador importante en inflamación pulmonar aguda, y responsable del reclutamiento de células inflamatorias en sitios de inflamación, activación celular y daño tisular. Supuestamente, el antisuero anti-\alpha_{d} bloquea la activación de macrófagos alveolares residentes durante la formación de alveolitis compleja inmune, y de este modo modera la liberación de TNF-\alpha y NO, y reduce el posterior daño tisular causado por estos agentes y el reclutamiento de neutrófilos.

Modelo de Rata F344 de leucemia LGL

La leucemia LGL en ratas F344 se describió por primera vez en los primeros años de la década de los 80 como una leucemia transplantable con actividad de células NK estable. Esta leucemia se ha sugerido como un posible modelo para linfoma gamma T humano y leucemia linfocítica crónica de células T [Ward y Reynolds, Am. J. Pathol. 111: 1-10 (1982); Stromberg, Am. J. Pathol. 119: 517-519 (1985); Reynolds, y col. J. Immunol. 132: 534-540 (1984)]. Este modelo proporciona abundantes células para estudios de la función celular de LGL y NK. Es de particular interés la presencia de \alpha_{d} sobre la superficie de estas células detectada usando anticuerpo de hámster anti-rata 205C a través de análisis FACS descrito en el Ejemplo 26. En vista de esta observación, se examinaron las tareas de \alpha_{d} in vitro (por ejemplo, usando los ensayos citolíticos previamente descritos) e in vivo.

Las características patológicas de leucemia LGL incluyen esplenomegalia severa, un hígado veteado pálido, agrandamiento de los ganglios linfáticos periféricos y hemorragias petequiales en el pulmón, cerebro, y ganglios linfáticos. Como \alpha_{d} está presente en la pulpa roja de bazo de rata normal (en macrófagos esplénicos), y la evidencia de leucemia LGL es esplenomegalia severa, se propuso la hipótesis de que las células tumorales NK \alpha_{d} positivas también pueden "localizar" o atrapar a un ligado ya conocido y proliferar ahí. Para ensayar esta hipótesis, se radiomarcaron las células tumorales y se inyectaron con y sin tratamiento de anticuerpo contra \alpha_{d} en ratas receptoras. Se retiraron los bazos de estos animales después de tres horas y se determinó la presencia de células tumorales NK. A continuación se proporciona una descripción más completa de los procedimientos usados y los resultados experimentales.

Se transfirieron adoptivamente células tumorales, obtenidas de los bazos de ratas con Leucemia LGL y preparadas como se describe a continuación, a ratas receptoras de 2 a 4 semanas antes de cada experimento. A partir de estudios previos por histología y análisis FACS, se sabe que sucede una rápida proliferación del tumor y la esplenomegalia resultante aproximadamente de tres a cuatro semanas después de la transferencia adoptiva. En el primer experimento, se retiró un bazo de un animal que se había expuesto a células tumorales durante cuatro semanas. Se hizo una única suspensión celular picando el bazo en trozos más pequeños con tijeras y pasando estos trozos a través de un tamiz de malla en presencia de D-PBS. La suspensión celular se recogió en un tubo de 50 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 1.500 rpm en una centrífuga de sobremesa Beckman a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó, y las células se resuspendieron en 30 ml de D-PBS. Se estratificaron aproximadamente 5,0 ml de esta suspensión celular sobre 5,0 ml de Histopaque, y se centrifugaron los gradientes durante 30 minutos a 1.500 rpm. Se recogió la capa celular de estos gradientes, se combinó, y se contó por un hemacitómetro. Se ajustó la cantidad de células de modo que cada rata receptora recibiera 1,0 x 10^{7} células, con una ligera sobre-estimación que representa la pérdida de células durante los lavados y la preparación de las jeringas. Las células se suspendieron en "medio de ensayo" NK (RPMI-1640 más antibióticos, más FBS al 2%) y se marcado con 10 mCi de ^{51}cromo durante una hora a 37ºC. Después de la incubación, se aumentó el volumen de la suspensión celular a 50 ml con medio de ensayo y se sedimentaron las células por centrifugación durante 10 minutos, 1.200 rpm. El sobrenadante se desechó y las células se lavaron dos veces más como se ha descrito. Las células marcadas se suspendieron a una concentración final de 1 x 10^{7} células/ml y se preincubaron en presencia o ausencia de anticuerpos anti-\alpha_{d} de rata así como un anticuerpo IgG1 de control antes de la inyección en ratas receptoras. La concentración final de anticuerpo usada por animal se ajustó a 5,5 mg/kg, o aproximadamente 1 mg/animal. Se usó un mínimo de cuatro animales para cada condición.

Las ratas receptoras se pesaron y se les inyectó por vía subcutánea de 150 a 200 \mul de solución ACE (que contenía 0,25 ml de Ketamina, 0,2 ml de Ace y 0,8 ml de Rompin) para anestesiar. De cada tratamiento con anticuerpo, se inyectaron 1,0 x 10^{7} células por vía intravenosa en los animales. Se examinaron aproximadamente 300 \mul de cada suspensión celular usando un contador gamma para determinar las cpm totales inyectadas/rata. Se dejó que las células NK marcadas circularan en las ratas durante tres horas después de lo cual se sacrificaron los animales y se extrajo 1,0 ml de sangre periférica por punción aórtica. Se retiraron los bazos de cada animal, se pesaron, y se contaron usando un contador gamma. Para determinar el porcentaje de células que vuelven al bazo, se dividieron las cuentas por minuto (cpm)/bazo por las cpm conocidas totales inyectadas en la rata. Para determinar las cpm en sangre periférica, se hizo la suposición de que la sangre representa aproximadamente el 6,0% del peso total de la rata. Las cpm en 1,0 ml de sangre se multiplicaron por el 6,0% del peso total del animal para determinar las cpm totales en la sangre. Esta cantidad después se dividió por la cantidad total de cpm inyectadas en cada animal para obtener el porcentaje de cpm que quedan en la sangre.

En el primer experimento, se usaron los anticuerpos 226B, 226G, 226H, 226I, 20C5B (un anticuerpo CD18 no bloqueante) y un anticuerpo de control. Parecía que los anticuerpos 226B y 226G reducían significativamente la cantidad de células que vuelven al bazo en comparación con el anticuerpo de control y los otros dos anticuerpos 226; aproximadamente del 7 al 8% de las células marcadas volvía al bazo después de incubación con los anticuerpos de control, mientras que aproximadamente el 6% de las células volvía al bazo después de incubación con los anticuerpos 226B y 226G. El porcentaje de cpm totales en sangre, entre el 0,9 y el 1,4%, no mostraba una marcada diferencia entre los grupos de tratamiento con la excepción de 226B, que tenía valores inferiores a todos los demás grupos.

En un segundo experimento, se hicieron varios ajustes al protocolo definido anteriormente. Primero, se hizo un aumento a cuatro animales por condición, y segundo, se retiró el bazo de una rata que contenía un tumor a las 2,5 semanas después de la transferencia adoptiva en lugar de cuatro semanas como anteriormente. Las células NK se prepararon exactamente del mismo modo y se inyectaron en animales receptores después de incubación con anticuerpo 226B o 226G o un anticuerpo de control a las dosis definidas anteriormente. De nuevo, se dejó que las células marcadas circularan durante tres horas después de lo cual se sacrificaron los animales y se recogieron la sangre y los bazos como anteriormente. Además, se retiraron los tejidos de dos de los animales/condición para determinar otras localizaciones de las células tumorales. Estos tejidos incluían hígado, cerebro, timo, pulmón, hueso largo (para médula ósea) y
riñón.

Los resultados indicaron que, en la IgG1 de control, aproximadamente el 32% de las células tumorales estaban en el bazo, mientras que tanto 226B como 226G mostraban cantidades reducidas, el 28% y el 29%, respectivamente, de células marcadas en el bazo. El porcentaje de células en la sangre era similar para cada anticuerpo, aproximadamente del 3 al 4% de las cpm totales se encontraban en la sangre, con el tratamiento con anticuerpo 226G ligeramente menor que los otros dos grupos.

La distribución tisular fue similar entre los grupos de tratamiento mostrando el hígado el 27% de las cpm totales, el cerebro el 0,05%, el timo el 0,10%, el pulmón el 15%, el riñón el 0,80%, y el hueso largo el 1,3%.

En un tercer experimento, se hizo un aumento en la cantidad de animal por condición (n=6 ó 7) en un intento de detectar las diferencias estadísticas entre los tres grupos de tratamiento anteriores. De nuevo, se usó el bazo de un animal al que se había inyectado células tumorales dos semanas antes del experimento y se preparó por el mismo procedimiento descrito anteriormente. Las células se marcaron del mismo modo y se inyectaron en los animales y se dejó que circularan durante tres horas. En este experimento, solamente se recogieron muestras de sangre y los bazos de los animales debido a la gran cantidad de animales usados.

Los resultados eran coherentes con el segundo experimento porque se observó que aproximadamente el 30% de las células marcadas había vuelto al bazo en el grupo de control, mientras que se encontraba en el bazo solamente el 25% en las células tratadas con anticuerpo 226B y el 27% en las células tratadas con anticuerpo 226G. Los valores sanguíneos de nuevo no mostraron diferencias importantes entre grupos, encontrando aproximadamente el 17% de las cpm totales en la sangre en el grupo de control y se encontraron el 15,8% y el 14,75%, respectivamente, para los grupos tratados con 226B y 226G.

Para determinar si tres horas era un momento puntual óptimo para examinar las diferencias entre los grupos de tratamiento, se hizo un pequeño ajuste en un cuarto experimento. De nuevo, las se aislaron y se prepararon del mismo modo para inyección en animales receptores, excepto en que se añadió un anticuerpo anti-CD18 20C5B adicional al panel de anticuerpos de ensayo. Además, solamente se usaron cuatro animales para cada condición. En este experimento, se dejó que las células circularan solamente durante 30 minutos después de la inyección, momento en que se extrajeron muestras de sangre y se retiró el bazo de los animales.

En el momento puntual 30 minutos, las cpm totales en el bazo estaban reducidas de los valores observados en el segundo y tercer experimentos en un 12 a un 13%. No había diferencias aparentes entre todos los grupos de tratamiento en las muestras de bazo, aunque dos de los cuatro animales en el grupo tratado con anticuerpo 226B tenían valores ligeramente inferiores. Los valores sanguíneos de nuevo eran similares entre todos los grupos, encontrando aproximadamente del 6 al 7% de las cpm totales en la sangre. La única diferencia marcada entre los grupos de sangre era una distribución mayor de los puntos de datos de los animales tratados con anticuerpo 226B y 226G. Estos hallazgos sugieren que \alpha_{d} desempeña una tarea en el retorno de las células de leucemia al bazo. Los experimentos indican que el retorno requiere varias horas y que la inhibición máxima con los anticuerpos monoclonales específicos para \alpha_{d} sucede a las 3 horas.

Modelos de Macaco para Esclerosis Múltiple y Aterosclerosis

Se demostró por tinción inmunohistoquímica e inmunoprecipitación que los anticuerpos monoclonales 212D y 217L reaccionan de forma cruzada con esplenocitos de macaco. La especificidad de reconocimiento se confirmó por inmunoprecipitación y secuenciación amino terminal de un homólogo de especie de \alpha_{d} de bazo de macaco (Ejemplo 34). En vista de estas observaciones previas, se usaron los dos anticuerpos para teñir tejidos obtenidos de macacos en estudios de encefalitis autoinmune experimental (EAE) o aterosclerosis. Estas dos enfermedades están marcadas por infiltración en lesiones de macrófagos fagocíticos que captan proteína básica de mielina (MBP) en la EAE o lipoproteína de baja densidad en aterosclerosis. Los macrófagos cargados de MBP o lípido pueden identificarse morfológicamente o por tinción con Oil Red O (ORO) o anticuerpo Ham 56 (Dako, Carpinteria, CA). El protocolo empleado en estos estudios es como se describe en el Ejemplo 18 para caracterizar la expresión de \alpha_{d} en tejidos humanos.

Las secciones de cerebros de macaco con EAE estaban marcadas por infiltración de linfocitos y macrófagos. La expresión de \alpha_{d} se localizaba en un subconjunto de macrófagos en lesiones que se teñían con ORO lo que indica una captación previa de MBP. Las lesiones que eran negativas para la tinción con ORO también eran negativas para la expresión de \alpha_{d}. Este resultado sugiere una correlación directa entre la tinción con ORO y \alpha_{d}. Se observaron resultados similares usando los anticuerpos 217K, 217I, y 217H.

Se obtuvieron lesiones de aterosclerosis de arterias torácicas o abdominales de macacos con dietas elevadas en grasas. Las lesiones suceden en ambas localizaciones en seres humanos, pero las que progresan patológicamente se localizan más a menudo en la aorta abdominal. Las lesiones ensayadas en este estudio se separaron en cinco fases diferentes (I a V) y normal. Las lesiones de fase (IV/V) se obtuvieron de la aorta abdominal y el resto se obtuvo de la aorta torácica.

Las lesiones de fase temprana (I/II) mostraron poca infiltración de macrófagos y niveles bajos o incluso ausentes de expresión de \alpha_{d}. En las lesiones de fase tardía, la infiltración de células espumosas fue mayor y la expresión de \alpha_{d} era detectable.

Los patrones de tinción para otras subunidades de cadena \alpha de leucointegrina se solapaban con, aunque no eran idénticos a, la expresión de \alpha_{d} en ambos tejidos. De forma más notable, se detectó la expresión de subunidades \alpha de leucointegrinas no \alpha_{d} en linfocitos que no se teñían con anticuerpos anti-\alpha_{d}.

Estos resultados sugieren que la expresión de \alpha_{d} puede ser característica de macrófagos fagocíticos en ambos modelos animales. No está claro, sin embargo, si \alpha_{d} está directamente implicada en la fagocitosis o algún proceso corriente abajo tal como la presentación de antígeno.

Ejemplo 37 Expresión de \alpha_{d} en Modelos Preclínicos

Para evaluar la expresión diferencial de \alpha_{d} en diversas patologías, se tiñeron secciones tisulares de modelos animales de enfermedad con suero policlonal anti-\alpha_{d} producido como se ha descrito anteriormente (véase el Ejemplo 22). Se seccionó el tejido de ratas normales y enfermas a un grosor de 6 \mum y se secó al aire en portaobjetos Superfrost Plus (VWR Scientific) a temperatura ambiente durante una noche. Después de secar, las secciones se almacenaron a -70ºC hasta su uso. Antes de su uso, los portaobjetos se retiraron de -70ºC y se pusieron a 50ºC durante aproximadamente 5 minutos. Las secciones se fijaron en acetona fría (4ºC) (Stephens Scientific) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se dejaron secar a temperatura ambiente. Cada sección se bloqueó con 150 \mul de una solución que contenía suero de rata normal al 30% (Harlan Bioproducts), suero de cabra normal al 5% (Vector Laboratories) y suero bovino al 1% (BSA) (Sigma Chemical Company) en TBS 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual la solución se transfirió suavemente desde las secciones. Se diluyeron suero policlonal de conejo, a una concentración de proteína de 34 \mug/ml, y suero preinmune del mismo conejo, a una concentración de proteína de 38,5 \mug/ml, en la solución de bloqueo y se aplicaron por separado 100 \mul a cada sección tisular durante 30 minutos 37ºC. Se transfirió la solución se suero desde las secciones y se retiró el anticuerpo no unido lavando tres veces en TBS 1X durante 5 minutos. Se retiró el exceso de TBS por transferencia después del lavado final. Se preparó anticuerpo de cabra anti-conejo biotinilado a partir de un kit Elite Rabbit IgG Vectastain® ABC (Vector) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante y se aplicaron 100 \mul de la solución resultante a cada sección durante 15 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se lavaron dos veces en TBS 1X durante cinco minutos en cada lavado, después de lo cual se aplicaron 100 \mul de conjugado de estreptavidina-oro (Goldmark Biologicals), diluido 1:100 en suero de rata normal al 5% y BSA al 1%, a cada sección durante una hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron tres veces con TBS durante cinco minutos cada lavado, y se aplicaron 100 \mul de glutaraldehído al 1% (Sigma) en tampón TBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron de nuevo tres veces en TBS durante cinco minutos cada lavado, y cinco veces en agua desionizada estéril durante tres minutos cada lavado. El exceso de líquido se transfirió desde cada portaobjetos y se aplicaron dos gotas de solución potenciadora de plata y de solución iniciadora (Goldmark Biologicals) a cada sección. Se dejó que la reacción procediera durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual las secciones se aclararon minuciosamente en agua desionizada estéril, se secaron al aire durante una noche a temperatura ambiente y se montaron con Cytoseal 60 (VWR). Como controles, se marcaron secciones tisulares con anticuerpos monoclonales que reconocían CD11a, CD11b, CD11c y CD18 en los mismos experimentos por protocolos idénticos.

El marcaje con sueros policlonales contra \alpha_{d} y anticuerpos monoclonales contra CD11a, CD11b, CD11c, y CD18 reveló un patrón de tinción para \alpha_{d} diferente que el observado para las otras subunidades \alpha.

En tejido pulmonar normal, se detectó la expresión de \alpha_{d} en el epitelio respiratorio de los bronquios (pero no en el epitelio de los espacios alveolares) y en células individuales que parece que son macrófagos alveolares dentro los espacios aéreos. La señal observada con el suero policlonal era significativamente mayor que el nivel de señal de fondo con el control de suero pre-inmune. En tejido de granuloma pulmonar, 24 y 96 horas después de la administración de glicano, se detectó una señal diferente con \alpha_{d} que tiñe el epitelio respiratorio en toda el área alveolar y se detectó una señal más fuerte en lo que parece que son macrófagos alveolares en la totalidad de las vías aéreas. En el tejido pulmonar de animales que se había recuperado supuestamente de la enfermedad (sacrificados 16 días después de la administración de glicano), no se observó señal con el anticuerpo contra \alpha_{d}. Se observó muy poco fondo con el suero de pre-inmunización en cada uno de estos tejidos.

Usando tejido pulmonar de rata de un modelo de asma inducida por antígeno, se detectó una señal muy fuerte con anticuerpo contra \alpha_{d} en el epitelio respiratorio tanto de los bronquios como de los espacios alveolares. La señal era significativamente mayor que el nivel de señal de fondo en el control de suero de pre-inmunización.

Modelo Preclínico - L. monocytogenes

Las evidencias sugieren que los macrófagos \alpha_{d} positivos en la pulpa roja del bazo están implicados en la eliminación de rbc dañados y otras partículas de la circulación. Existe la hipótesis de que los macrófagos \alpha_{d} positivos de la pulpa roja del bazo también eliminan agentes bacterianos de la circulación. Los agentes no infecciosos que no requieren la inducción de un respuesta de células T específicas de antígeno se eliminarían directamente por los macrófagos de la pulpa roja. En contraste, los agentes infecciosos oportunistas eliminados por los macrófagos de la pulpa rojo requiere una respuesta inmune de células T contra el productiva para la erradicación de las bacterias. Por lo tanto, se propuso que la expresión de \alpha_{d} en los macrófagos de la pulpa roja pueden servir para regular interacciones macrófago/célula T regulando el movimiento de los macrófagos desde la pulpa roja en las zonas marginales o funcionando como una molécula accesoria implicada en las interacciones macrófago/célula T que conducen a la activación de las células T.

Para investigar la función de \alpha_{d} durante las respuestas inmunes contra agentes infecciosos, se evalúa la expresión de \alpha_{d} en el bazo usando un modelo murino de Listeria monocytogenes. Se examina la examina la expresión de \alpha_{d} en los macrófagos de la pulpa roja que han fagocitado bacterias. También se ensayan los anticuerpos contra \alpha_{d} en el modelo para determinar la función desempeñada por \alpha_{d} en la inducción de una respuesta de células T protectora contra L. monocytogenes.

Ejemplo 38 La Función de \alpha_{d} en Lesión de Médula Espinal

Después de un traumatismo del sistema nervioso central (SNC), la respuesta inmune implica una mezcla de neutrófilos invasores, células asesinas naturales y monocitos fagocíticos/macrófagos [Means, y col., J. Neurophathol. & Exp. Neurol., 42: 707-719 (1983)]. Esta respuesta incluye la liberación de mediadores inflamatorios, la inducción de microglía reactiva, infiltración de plaquetas, daño endotelial con permeabilidad vascular potenciada y desarrollo de edema. Las recientes observaciones sugieren que la inflamación post-traumática en la médula espinal contribuye a déficit crónicos, parcialmente a través de la desmielinización o a través de un daño más directo a las neuronas y axones [Blight, A.R., Central Nervous System Trauma, 2: 299-315 (1985)]. Además, un estudio reciente informó de que la cantidad de macrófagos/microglía estaba significativamente correlacionada con la cantidad de daño tisular en cada nivel de la médula espinal después de una lesión por impacto [Carlson, y col., Exp. Neurol., 151: 71-81 (1998)]. Tanto los neutrófilos como los macrófagos fagocitan los desechos los que a su vez induce un estallido oxidativo que provoca la producción de especies de oxígeno reactivas. Estos agentes antibacterianos, aunque son eficaces, pueden conducir a daños en el tejido sano adyacente. Por tanto, es posible que la infiltración de leucocitos y la producción concomitante de especies de oxígeno reactivas estén implicadas con la propagación de la lesión secundaria más allá del sitio de impacto inicial. La hipótesis se apoya por estudios en que el bloqueo de la infiltración de neutrófilos o macrófagos condujo a disminuciones en el grado de la lesión después de apoplejía o lesión de la médula espinal [Blight, Neurosci, 60: 263-273 (1994)].

Para evaluar la función de \alpha_{d} en lesiones de médula espinal, se utilizó un modelo de rata en combinación con anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d}, algunos de los cuales bloquean la unión a su ligando VCAM-1. En este modelo, se introdujo una transección completa en el cuarto segmento torácico (T) de la médula espinal, que produce sistemáticamente disreflexia autonómica [Krassioukov, y col., Am. J. Physiol. 268: H2077-H2083 (1995)]. Este modelo es ventajoso porque la pequeña lesión quirúrgica produce una zona estrecha bien definida de destrucción de tejido primario que facilita el análisis de los efectos de la lesión medular en el área.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la política establecida en la "Guide to Care and Use of Experimental Animals" preparada por el Canadian Counsel on Animal Care. A cuarenta y dos ratas Wistar macho (Charles River) que pesaban 270-320 gramos se les administró inicialmente atropina (0,5 mg/kg) y diazepam (2,5 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Después de diez minutos, se anestesió a las ratas por inyección intraperitoneal con pentobarbital sódico (35 mg/kg). Se administraron inyecciones suplementarias de anestésico (2 mg/kg) durante la cirugía según fuera necesario. Las ratas se pusieron en una almohadilla calentadora durante la cirugía y la temperatura corporal se mantuvo cercana a 37ºC. Se retiró la protuberancia dorsal de la tercera vértebra torácica (T3) y se realizó una laminectomía para exponer la médula espinal con guía microscópica. La médula se transeccionó completamente en el segmento espinal T4 con la hoja de un escalpelo. Se cerraron los músculos y la piel por encima de la laminectomía y los animales se recuperaron bajo una lámpara de calor. Los cuidados postoperatorios de las ratas parapléjicas se realizaron como se ha descrito anteriormente [Krassioukov y col., Neurosci. 70: 211-226 (1996)]. Después de la recuperación de la cirugía, se proporcionó alimento y agua ad libitum. Los animales sobrevivieron durante dos días después de la cirugía.

Las ratas (de cuatro a cinco por grupo) se dividieron en los siguientes grupos de tratamiento: (1) 1 mg/kg de anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} 226H, 236L, 226B, o un anticuerpo IgG1 kappa de isotipo coincidente irrelevante 1B7 y (2) 5 mg/kg de anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} 226H, 236L, o el control 1B7. Cada ratón recibió un anticuerpo en el régimen de tratamiento.

Los anticuerpos se seleccionaron siguiendo ensayos de unión in vitro usando VCAM-1 humana recombinante fusionada a una región de inmunoglobulina y una línea celular CHO que expresa \alpha_{d} de rata y CD18 humana. Se examinó un panel de anticuerpos para la actividad de anticuerpos individuales de bloquear la unión de \alpha_{d} a VCAM-1. Los resultados de los ensayos de unión indicaron que algunos anticuerpos no bloqueaban la unión ("no bloqueantes"), algunos bloqueaban la unión en el intervalo del 50% ("bloqueantes medios"), mientras que otros bloqueaban la unión en el intervalo del 75% al 85% ("bloqueantes fuertes"). Se eligieron anticuerpos representativos de los grupos no bloqueantes, bloqueantes medios y bloqueantes fuertes para su uso como se describe a continuación.

Todos los anticuerpos monoclonales se administraron por inyección en la vena de la cola el día antes de la cirugía, inmediatamente después de la cirugía, y al siguiente día. Los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2, sin cloruro cálcico o cloruro de magnesio para asegurar un volumen adecuado para facilitar la inyección. En otro grupo de control, se inyectaron 15 mg/kg de metilprednisolona (MP) mediante la vena de la cola a los 30 minutos, 2 horas, y 24 horas después de la transección completa de la médula espinal. Un grupo de control adicional de ratas sufrió transección de la médula espinal como se ha descrito anteriormente, pero no recibió tratamiento adjunto.

Dos días después de la cirugía, se anestesió profundamente a los animales con una inyección intraperitoneal de 3 g/kg de uretano (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) antes de la perfusión transcardiaca. Después de abrir la cavidad torácica, se inyectó heparina en el ventrículo izquierdo. Se les prefundieron a las ratas 250 ml de medio de cultivo tisular oxigenado, pH 7,4, (medio de Eagle modificado por Dulbecco; Gibco BRL) seguido de 500 ml de formaldehído de fijación al 4% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Se retiró la médula espinal torácica caudal a la transección (T4-8) para el examen como se ha descrito previamente [Krenz y Weaver, Neurosci 85: 443-458 (1998)]. Después de un periodo de postfijación durante una noche en el mismo agente de fijación, las partes de la médula espina se criopreservaron con soluciones de sacarosa al 10%, 20%, y 30% en PBS a 4ºC. Las partes de médula espinal después se cortaron en secciones horizontales (50 \mum) en un criostato. Las secciones se tiñeron con violeta de cresilo al 1%, pH 4, usando procedimientos convencionales para visualizar los leucocitos polimorfonucleados, se aclararon en xileno, y se cubrieron con montante DPX (BDH Laboratory Supplies, Poole, U.K.). Se contó la cantidad de macrófagos/microglía que mostraban una morfología fagocítica, redondeada y de neutrófilos que mostraban los núcleos multilobulados característicos después de la tinción con violeta de cresilo en el área de la médula en el sitio de la lesión. La cuantificación de células inmunes se realizó usando microscopía de campo claro y un lente de objetivo 40X equipada con una rejilla (área total de 0,08 mm^{2}). Se examinaron tres áreas de muestra, comenzando en el borde la médula transeccionada y moviéndose de forma causal y desde un borde lateral al otro para las células inmunes. El procedimiento produjo un área cuantificada total promedio de médula espinal de 2,72 mm^{2}. Después se repitió el procedimiento en otra sección de médula espinal. Las áreas de muestra se seleccionaron entre secciones horizontales de la médula con la mayor materia gris (límite entre la lámina V y VII) porque la respuesta inflamatoria era más destacada en la materia gris. La cantidad total de macrófagos y neutrófilos contada en cada área de muestra se dividió por el área de muestra total (mm^{2}) para obtener la cantidad media de macrófagos y neutrófilos por mm^{2} en cada grupo de tratamiento. Los grupos tratados con anticuerpo (1 mg/kg y 5 mg/kg) se compararon con el control de IgG-coincidente irrelevante respectivo a la misma dosis y con un control de transección no tratado con fármaco. En una comparación adicional, se compararon los grupos que disminuían de forma más significativa la cantidad media de células inmunes con animales tratados MP y con animales de control de cirugía. Todos los recuentos celulares se realizaron de forma ciega con respecto a la identificación del grupo de tratamiento.

Los resultados indicaron que eran evidentes en el sitio de la lesión microglía activada y/o macrófagos sanguíneos identificados como células mononucleadas, redondas con gran citoplasma translúcido dos días después de la transección. Se descubrió que los animales de control que no recibieron anticuerpo contra \alpha_{d} o tratamiento con corticosteroides adjunto tenían un promedio de 396 \pm 27 macrófagos/microglía por mm^{2} en el sitio de la lesión de médula. El tratamiento con el anticuerpo IgG1 irrelevante 1B7 a la dosis inferior (1 mg/kg) aumentó la cantidad de macrófagos/microglía a 462 \pm 46 por mm^{2}, pero este valor no era significativamente diferente de los animales de control que no recibieron tratamiento con anticuerpo. De los anticuerpos contra \alpha_{d} ensayados, 226H y 236L a 1 mg/kg cada uno condujeron a reducciones significativas en la cantidad promedio de macrófagos por mm^{2} en comparación con el anticuerpo 1B7 y con el control de transección. Específicamente, la administración de 226H redujo los macrófagos/microglía por mm^{2} a 147 \pm 17 y la administración de 236L redujo los macrófagos/microglía por mm^{2} a 131 \pm 8 en comparación tanto con 1B7 como con animales que no recibieron tratamiento. En contraste, la inyección de anticuerpo contra \alpha_{d} 226B a 1 mg/kg redujo la cantidad de macrófagos/microglía por mm^{2} a 327 \pm 65, que no fue significativamente diferente de los valores de control. El tratamiento MP condujo a una observación de 250 \pm 24 macrófagos/microglía por mm^{2}, que era significativamente menor que en los animales de control pero mayor que lo detectado en animales tratados con los anticuerpos contra \alpha_{d} 226H y 236L. Este resultado fue inesperado ya que la metilprednisolona es el fármaco más ampliamente usado para el tratamiento clínico de lesión aguda de la médula espinal.

Cuando la dosis de anticuerpos contra \alpha_{d} se aumentaba a 5 mg/kg, la cantidad promedio de macrófagos/microglía por mm^{2} con tratamiento con 226H y 236L era significativamente menor que la del control, pero la cantidad no era significativamente diferente de la cantidad en animales tratados con el anticuerpo de control de isotipo IgG1 coincidente irrelevante.

Los resultados con respecto a leucocitos neutrofílicos (NL) indicaron que la mayoría se detectaba individualmente o en agregados en toda la materia gris. Solamente una pequeña parte de los NL visibles se detectaba en la materia blanca a cada lado de la materia gris. Además, se encontraron algunos neutrófilos que se adhería a la superficie luminal de las vénulas y arteriolas en las secciones de tejido espinal. En animales que no recibieron tratamiento, la cantidad promedio de NL por mm^{2} era de 295 \pm 56 y en los tratados con 1 mg/kg de 1B7, la cantidad de NL aumentaba significativamente hasta 503 \pm 93. Ningún tratamiento con anticuerpo contra \alpha_{d} redujo la cantidad de NL en comparación con los animales de control que no recibieron tratamiento. Específicamente, 226H y 226B a 1 mg/kg proporcionaron una cantidad aumentada de NL por mm^{2} hasta 361 \pm 80 y 332 \pm 43, respectivamente. En comparación con animales tratados con 1B7, el tratamiento con 236L a 1 mg/kg y MP disminuyó significativamente la cantidad de NL por mm^{2} hasta 263 \pm 47 y 193 \pm 39, respectivamente. Estas observaciones, sin embargo, no fueron significativamente diferentes del grupo de control que no recibió tratamiento.

A 5 mg/kg, el tratamiento con 1B7 aumentó la cantidad promedio de NL hasta 343 \pm 37, pero el aumento observado no era significativo en comparación con el grupo de animales no tratados. En comparación con el tratamiento con 1B7, el anticuerpo 226H disminuyó la cantidad promedio de NL presentes hasta 236 \pm 38, pero la reducción no era significativa en comparación con animales que no recibieron tratamiento. En contraste, 236L redujo la cantidad de NL hasta 190 \pm 17 por mm^{2} que era significativa en comparación con animales que recibieron tratamiento con 1B7.

Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} a bajas dosis reducen la cantidad de leucocitos en médula espinal lesionada, posiblemente a través de la alteración de una interacción con VCAM-1 que sería coherente con las observaciones presentadas previamente. Otros informes usando anticuerpos contra el contrarreceptor mejor conocido para VCAM-1, VLA-4, mostraron una infiltración disminuida de células VLA-4 positivas en el cerebro y prevención de signos clínicos y patológicos de encefalomielitis alérgica experimental (EAE). Asimismo se mostró que el tratamiento anti-TNF\alpha inhibía la incidencia y gravedad de EAE y un mecanismo de acción era inhibiendo la expresión de VCAM-1 en los vasos de la médula espinal que conduce a una reducción significativa de la entrada de leucocitos en el SNC. Estas observaciones previas sugieren que el bloqueo de la interacción de \alpha_{d} en la superficie de los leucocitos con VCAM-1 en la superficie de las células endoteliales o células gliales puede ser responsable de la respuesta inflamatoria atenuada observada.

Como uno de los anticuerpos, 226H, que bloqueaba la infiltración de macrófagos no bloqueaba la unión entre \alpha_{d} y VCAM-1, estos resultados sugieren que el modo de inhibición por el anticuerpo puede incluir el bloqueo entre compañeros de unión de \alpha_{d} diferentes de VCAM-1. Una posibilidad es la existencia de un equivalente de rata a ICAM-R. Las observaciones previas han indicado que, además de VCAM-1, \alpha_{d} también se une a ICAM-R, aunque con mucha menos afinidad que a VCAM-1. Es interesante observar que parece que ICAM-R está ausente en las células endoteliales y se expresa principalmente en monocitos, linfocitos y neutrófilos en estado de reposo lo que descarta su implicación en la adhesión leucocitos-endotelio en circunstancias normales. Se ha sugerido que ICAM-R tiene una función en las fases iniciales de contacto célula-célula de los leucocitos y que ICAM-R está implicada en la regulación de la interacción intercelular de leucocitos LFA-1/ICAM-1. Se ha demostrado que la función de ICAM-R en la interacción leucocitaria temprana es la inducción de agregación celular. La alteración de los contactos iniciales que dan lugar a la agregación reduce la eficacia de la respuesta inmune. También se ha demostrado que la interacción de otro ligando para ICAM-R, LFA-1 induce un cambio de LFA-1 a su estado activado en el sitio de contacto intercelular. Es posible que la co-expresión de \alpha_{d} y ICAM-R en leucocitos en estado de reposo pudiera funcionar de un modo muy parecido y que la interacción entre las dos proteínas pudiera promover los acontecimientos de activación leucocitaria dependientes de contacto. A la inversa, la alteración de las interacciones, por ejemplo, a través del uso de un anticuerpo contra \alpha_{d}, podría supone la entrada reducida de leucocitos en la médula espinal.

Varias explicaciones podrían justificar el aumento en la infiltración de macrófagos. De forma muy simple, el resultado puede ser un fenómeno del sistema. Como alternativa, la dosis mayor de anticuerpo puede haber provocado el entrecruzamiento de FcyR en los macrófagos maduros, provocando un estallido inicial de producción de quimioquinas que atrajeron leucocitos adicionales al sitio de la lesión. Del mismo modo, la producción de quimioquinas podría explicar las mayores cantidades tanto de neutrófilos como de macrófagos en el sitio de la lesión después del tratamiento con 1B7 que sucedió en la mayoría de los casos. Otra posible explicación para los resultados observados es la variabilidad entre animales ya que los anticuerpos contra \alpha_{d} se ensayaron en cepas de distinta estirpe de ratas Wistar. Por ejemplo, diferentes grupos de ratas podrían tener estados ligeramente diferentes de inmunocompetencia. Para ensayar esta posibilidad, se replicaron los experimentos usando una dosis tanto baja como alta de los anticuerpos monoclonales al mismo tiempo en animales de la misma camada o de camadas relacionadas.

Ejemplo 39 Expresión de \alpha_{d} en Enfermedad de Crohn

El trabajo previo (Ejemplo 18) indicó que se detectan leucointegrinas a niveles mayores en secciones tisulares de pacientes con enfermedad de Crohn. Para evaluar el grado al que se modula la expresión de \alpha_{d} en enfermedad de Crohn, se examinó la expresión en secciones tisulares de colon enfermo y normal del siguiente modo.

Se seccionó el tejido de colon de cinco individuos con enfermedad de Crohn y un colon normal a un grosor de 6 \mum y se secó al aire en portaobjetos Superfrost Plus (VWR Scientific) durante cinco minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se almacenaron a -20ºC hasta que se realizó el ensayo. Antes de su uso, los portaobjetos se incubaron a 50ºC durante aproximadamente dos minutos. Las secciones se fijaron en acetona fría (4ºC) (EM Science) durante dos minutos y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente. Las secciones se pusieron en tampón que contenía 100 ml de TBS 1X, 1,1 ml de H_{2}O_{2} al 30% (Sigma), y 1,0 ml de NaN_{3} al 10% (Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente para retirar la actividad peroxidasa endógena. Cada sección se incubó en 150 \mul de una solución de bloqueo que contenía suero humano normal al 20% (Boston Biomedica), suero de rata normal al 5% (Harlan), y BSA al 2% (Sigma) en TBS 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, la solución se transfirió suavemente desde las secciones. Se preparó anticuerpo monoclonal primario a una concentración de proteína de 10 \mug/ml en solución de bloqueo y se aplicaron 75 \mul a cada sección tisular durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las secciones se lavaron tres veces durante cinco minutos cada vez en TBS 1 X para retirar el anticuerpo no unido. Se retiró el exceso de aspirando alrededor del tejido después del lavado final. Se diluyó anticuerpo de rata anti-ratón biotinilado (Jackson Laboratories) 1:400 en solución de bloqueo y se aplicaron 75 \mul a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces con TBS 1X durante cinco minutos cada lavado. Se preparó complejo de avidina/biotina conjugado con peroxidasa (Vector Laboratories) añadiendo 9 \mul de reactivo A y 9 \mul de reactivo B, ambos reactivos suministrados por el fabricante, a 782 \mul de TBS 1X, y se aplicaron 75 \mul de la mezcla resultante a cada sección durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces en TBS 1X durante cinco minutos cada lavado. Se aplicó sustrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories) y el desarrollo de color se detuvo por inmersión en agua. Se aplicó una gota de ácido ósmico al 1% (VWR) a cada sección durante aproximadamente 15 segundos para potenciar la intensidad de señal y la reacción se detuvo por inmersión en agua. Las secciones se contratiñeron en hematoxilina de Gill nº 2 (Sigma) y se aclararon en agua antes de deshidratarlas y montarlas con Cytoseal (VWR).

En el colon normal, no se detectó marcaje con los anticuerpos 217L, 217K, o 212D. El anticuerpo 240I marcó numerosas células en agregados linfoides así como linfocitos y eosinófilos dispersados en la lámina propia. El anticuerpo 240I también marcó tipos celulares que parece que eran macrófagos o linfocitos activados. La tinción con anticuerpo 169A era similar a la del anticuerpo 240I. El anticuerpo 169B marcó linfocitos y macrófagos dispersados en la lámina propia y la submucosa, además de un subconjunto de células de músculo liso alrededor de las arterias y en la muscularis externa.

Con muestras de colon de Crohn, los patrones de marcaje observados con los anticuerpos individuales solapaban, pero los patrones de expresión no eran idénticos. No se detectó marcaje con los anticuerpos 212D o 217K. El anticuerpo 240I marcaba granulomas con expresión diferencial en las células gigantes multinucleadas en los agregados linfoides y marcaba linfocitos en los agregados linfoides. El anticuerpo 240I marcaba eosinófilos y linfocitos dispersados en la lámina propia. El anticuerpo 217L también marcaba granulomas con diferente expresión en las células gigantes multinucleadas en los agregados linfoides. El anticuerpo 217L marcaba un pequeño subconjunto de linfomas en la lámina propia y la submucosa que también se marcaban con 240I. El patrón de tinción del anticuerpo 169A era muy similar al encontrado para 240I excepto en que 169A marcaba menos linfocitos. La tinción con el anticuerpo 169B era similar al patrón con 169A excepto en que 169B también marcaba un subconjunto de células de músculo liso alrededor de los vasos y en la muscularis externa.

Ejemplo 40 Liberación de TNF\alpha de Células \alpha_{d}^{+} de Bazo de Rata

Para caracterizar una subpoblación esplénica única de células \alpha_{d}^{+} con respecto a la capacidad de producir citoquinas después de la estimulación, se realizaron los siguientes experimentos.

A ratas Lewis se les inyectó por vía subcutánea en la ijada trasera 100 \mul de una emulsión 1:1 de Adyuvante Completo de Freund (CFA) en PBS y los animales se sacrificaron siete días después. Se recogieron los bazos y se preparó una única suspensión celular por procedimientos convencionales. Se retiraron selectivamente células B, células auxiliares T CD4^{+}, y macrófagos usando anticuerpos monoclonales contra CD4 (anticuerpo W3/25, E.A.A.C.C. Nº 84112002), CD11b (anticuerpo OX42, E.A.A.C.C. Nº 87081803) y CD45Ra/b (anticuerpo OX33, Pharmingen) pre-armados sobre un conjugado de perlas magnéticas anti-IgG de ratón. El anticuerpo contra CD4 identifica células T, el anticuerpo contra CD11b identifica macrófagos, monocitos, granulocitos, y células asesinas naturales, y el anticuerpo contra CD45Ra/b reconoce células B, subconjuntos de células T, monocitos, granulocitos, y macrófagos. Después se usó un imán para retirar las células recubiertas de anticuerpo. Las células no adherentes se recogieron y se realizó una selección positiva usando anticuerpos monoclonales de rata anti-\alpha_{d} 205C y 226G biotinilados, seguido de incubación con perlas magnéticas de estreptavidina. Las células recubiertas de anticuerpo se recogieron usando un imán y se suspendieron a 5 x 10^{5} células/ml en medio de cultivo (RPMI 1640 que incluye suero de rata Lewis normal al 2%, penicilina/estreptomicina, piruvato sódico; L-glutamina).

Se añadieron dos ml de suspensión celular a pocillos individuales en una placa de 24 pocillos revestidos con 3 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 de rata (G418, Pharmingen), anticuerpo de control irrelevante, o sin anticuerpo. La placa se incubó a 37ºC en CO_{2} al 7% y se recogieron los sobrenadantes de cada pocillo después de 20 horas, 48 horas, y 72 horas. Se hicieron alícuotas de los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC inmediatamente después de la recogida. Antes del ensayo, los sobrenadantes se diluyeron 1:2 y se pusieron en un ensayo de detección anti-TNF\alpha de rata (Biosource).

Los resultados indicaron que después de la estimulación con el anticuerpo monoclonal anti-CD3, las células \alpha_{d}^{+} liberaban aproximadamente 280 pg/ml de TNF\alpha después de 20 horas en comparación con aproximadamente 40 pg/ml con los grupos tratados con control de anticuerpo y solamente medio.

Ejemplo 41 Modulación de la Liberación de TNF\alpha de Esplenocitos Activados con Anticuerpos Contra \alpha_{d}

Para evaluar la función de los esplenocitos fagocíticos \alpha_{d}^{+} en una respuesta inflamatoria, se realizaron los siguientes experimentos.

Como se ha demostrado previamente que los macrófagos esplénicos \alpha_{d}^{+} fagocitas partículas magnéticas inyectadas en ratas, se recogieron células de este tipo del siguiente modo. A cuatro ratones se les inyectó por vía intravenosa 200 \mul de una suspensión de perlas magnéticas (conjugadas con amina, Perspective Biosystems). Después de 24 horas, se retiraron los bazos y se preparó una única suspensión celular pasando el tejido a través de un tamiz de mala de alambre. Las células se aislaron usando un imán y se lavaron una vez en PBS que contenía magnesio y calcio, se pusieron en cultivo en RPMI/medio FBS al 10%, y se cultivaron en las siguientes seis condiciones: (i) sin tratamiento; (ii) con anticuerpo monoclonal de hámster anti-\alpha_{d} de rata 205C (10 \mug/ml) que reacciona de forma cruzada con \alpha_{d} de ratón; (iii) con anticuerpo monoclonal de hámster anti-\alpha_{d} de rata 205E (10 \mug/ml) que también reacciona de forma cruzada con \alpha_{d} de ratón; (iv) con lipopolisacárido (LPS); (v) con LPS y anticuerpo monoclonal 205C (10 \mug/ml); y (vi) con LPS y anticuerpo monoclonal 205E (10 \mug/ml) que también reacciona de forma cruzada con \alpha_{d} de ratón.

Donde se indicaba, las células se trataron primero con el anticuerpo durante 30 minutos después del cual se recogió una muestra de 200 \mul de medio condicionado que representa el momento puntual inicial (t=0). Después se añadió LPS (10 ng/ml) a los pocillos como se ha indicado anteriormente y se recogieron alícuotas de los medios a 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, y 4 horas y se ensayaron para el TNF\alpha liberado por ELISA usando un kit de TNF\alpha murino (ENDOGEN, nº 005452). Después de recogerlas, las muestras se congelaron inmediatamente hasta el ensayo. Justo antes del ensayo, el medio condicionado se diluyó 1:1 y se ensayó de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

Los resultados indicaron que los esplenocitos que no se habían activado con LPS no mostraban liberación significativa de TNF\alpha en el medio independientemente del tratamiento con anticuerpo previo. Los esplenocitos que se habían tratado con LPS liberaban TNF\alpha en el medio a un nivel detectable, mientras que las células activadas por LPS tratadas con anticuerpo 205C o 205E mostraban niveles significativamente inferiores de liberación de TNF\alpha. Estos resultados eran coherentes en todos los momentos puntuales ensayados y se confirmaban en ensayos repetidos posteriormente. Además, se observaron los mismos resultados en experimentos posteriores con esplenocitos que no se aislaron usando perlas magnéticas. Finalmente, los resultados preliminares indicaron que la liberación de IL-1\beta de los esplenocitos se inhibía de forma similar por los anticuerpos monoclonales anti-\alpha_{d}.

Ejemplo 42 Caracterización de la Expresión de \alpha_{d} en Eosinófilos

Las observaciones previas indicaron que \alpha_{d} se expresa en todos los eosinófilos de sangre periférica (Ejemplo 18). Para examinar adicionalmente la expresión y función de \alpha_{d} en eosinófilos humanos, se realizaron los siguientes análisis.

Expresión de integrina \alpha_{d} en granulocitos humanos

Se examinó la expresión de \alpha_{d} en granulocitos humanos en células preparadas del siguiente modo. Se aislaron eosinófilos normodensos (es decir,aquellos con una densidad relativa normal de más de 1,09) de sangre periférica de voluntarios alérgicos por centrifugación en gradiente de densidad, lisis de eritrocitos hipotónica, y selección negativa inmunomagnética como se ha descrito anteriormente [Hansel, y col., J. Immunol. Meth.145:105 (1991)]. Se purificaron los neutrófilos de sangre periférica de voluntarios normales por centrifugación en gradiente de densidad y lisis de eritrocitos hipotónica sola [Bochner, y col., J. Immunol. 145: 1832 (1990)]. Las purezas respectivas de los tipos celulares siempre excedían el 95%. Se realizó enriquecimiento de la sangre periférica para los basófilos usando una separación en gradiente de densidad de percoll doble que aumentó la cantidad de basófilos al 3-10% del recuento de leucocitos total [Bochner, y col., J. Immunol. Meth. 125:265 (1989)]. La expresión de integrinas en las células recién aisladas de la sangre después de estimulación en cultivo se evaluó usando inmunofluorescencia indirecta de un solo color y citometría de flujo como se ha descrito anteriormente [Bochner, y col., J. Immunol. Meth. 125: 265 (1989); Matsumoto, y col., Blood 86:1437 (1995)]. También se realizó la detección de dos colores de basófilos (usando anti-IgE). Todas las muestras se fijaron en paraformaldehído al 0,1% (Sigma) y se analizaron usando un citómetro de flujo EPICS Profile II (Coulter). Se recogieron aproximadamente 10.000 sucesos y se representaron en una escala de log cuatro que produce valores para la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Los resultados indicaron que los eosinófilos expresan las cuatro integrinas \beta_{2}. El nivel de expresión superficial de la integrina \alpha_{d} era mayor que el de CD11c, pero menor que la expresión de integrina \alpha_{4} (CD49d), CD11a, o CD11b. Los resultados también indicaban que los basófilos tienen niveles ligeramente superiores de expresión de integrina \alpha_{d} en comparación con los neutrófilos.

Regulación de la expresión superficial de integrina \alpha_{d} en eosinófilos humanos

Se realizaron estudios iniciales para determinar si los eosinófilos podrían movilizar rápidamente almacenas intracelulares de \alpha_{d}\beta_{2} como se ha informado para los neutrófilos [Van der Vieren, y col., Immunity 3:683 (1995)]. Se incubaron eosinófilos purificados de sangre periférica (preparados como se ha descrito anteriormente) durante 15 minutos con PMA o el ionóforo de calcio A23187 y se midió la expresión superficial de varias cadenas \alpha de la familia de las integrinas \beta_{2} por inmunofluorescencia indirecta (descrita anteriormente).

Los resultados indicaron que tanto PMA a 50 ng/ml como el ionóforo de calcio a 1 \muM aumentaban significativamente la expresión de \alpha_{d} y CD11b. En unos minutos de la adición de PMA, la expresión aumentaba y alcanzaba niveles significativamente aumentados en diez minutos. Esta observación sugería que los eosinófilos tienen almacenes citoplasmáticos de \alpha_{d}\beta_{2} que, similares a los almacenes de CD11b, pueden movilizarse rápidamente a la superficie celular.

En vista de estos resultados, se ensayaron otros estímulos que activan los eosinófilos para los efectos agudos sobre la expresión de \alpha_{d}\beta_{2}. La incubación de los eosinófilos durante quince minutos con MDC (100 nM), IL-5 (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml), y eotaxina (100 \muM) no lograron alterar la expresión de la integrina \alpha_{d}.

Observaciones previas han indicado que muchas respuestas de eosinófilos pueden potenciarse por exposición prolongada a ciertas citoquinas, tales como IL-5, en un fenómeno conocido como "imprimación" [Walsh, y col., Immunol. 71:258 (1990)]. Por lo tanto se diseñaron experimentos para examinar si la imprimación de cultivos de eosinófilos con IL-5 conduciría a cambios en la expresión superficial de integrina \alpha_{d}. Se incubaron eosinófilos purificados, preparados como se ha descrito anteriormente, durante cuatro días con 10 ng/ml de IL-5 y se ensayó la expresión de diversas integrinas como se ha descrito anteriormente.

Los resultados indicaron que aunque la expresión de integrina \alpha_{d} en la superficie celular aumentaba de cuatro a cinco veces, el nivel de expresión de integrina \alpha_{4} seguía inalterable. La cinética del aumento en la expresión de integrina \alpha_{d} indicaba un aumento estadísticamente significativo en la expresión después de cuatro a siete días de cultivo. En contraste, los niveles de integrina \alpha_{4} no cambiaron significativamente. La cinética de la expresión potenciada de \alpha_{d} con exposición a PMA fue similar a la de CD11b, lo que sugiere que estas dos leucointegrinas pueden existir en compartimientos intracelulares similares o idénticos. La localización de este compartimiento para cada integrina en eosinófilos no es conocida; sin embargo, en neutrófilos, los almacenes preformados de CD11b se han localizado en gránulos específicos [Todd, y col., J. Clin. Invest. 74:1280 (1984); Bainton, y col., J. Exp. Med. 166:1641
(1641)].

Como los eosinófilos de lavado broncoalveolar (BAL) de fase tardía expresan muchas características de los eosinófilos imprimados con citoquinas [Kroegel, y col., Ann. Rev. Respir. Dis. 143:A45 (1991); Sedgewick, y col., J. Immunol. 149:3710 (1992)], también se examinó la expresión de \alpha_{d} en este tipo celular. Se obtuvieron células BAL de pacientes alérgicos que habían experimentado una exposición a alergeno segmentado endobronquial con extracto de ambrosía o D. petrynissinus 18 horas como se ha descrito previamente [Kroegel, y col., J. Clin. Allergy Immunol. 93725 (1994)]. La pureza de los eosinófilos en fluido BAL de fase tardía era del 19 \pm 4%.

Los resultados indicaron que los eosinófilos de BAL de fase tardía también mostraban un aumento estadísticamente significativo en la expresión de integrina \alpha_{d}, con niveles similares a los observados después de tres días de cultivo estimulado con IL-5. Al examinar los niveles de integrina \alpha_{d} en eosinófilos de BAL de fase tardía, es decir, las células que ya han experimentado adhesión celular y migración para alcanzar la luz de las vías aéreas, se observaron niveles de expresión intermedios a los observados en eosinófilos recién aislados y cultivados con IL-5. Estos datos sugieren que al menos una parte de los elevados niveles \alpha_{d} encontrados después del cultivo con IL-5 se debe probablemente a la transcripción y traducción aumentada de integrina \alpha_{d}.

Eosinófilos que Expresan \alpha_{d} se Unen a VCAM-1

Aunque se ha demostrado que la integrina \alpha_{d} se une a ICAM-R y posiblemente media la adhesión leucocito-leucocito [Van der Vieren, y col., Immunity 3:683 (1995)], se diseñaron experimentos para examinar otros posibles ligandos para \alpha_{d} expresada en eosinófilos. En parte debido a diversos estudios previos que sugieren la adhesión de eosinófilos dependiente de integrina \beta_{2}, independiente de CD11b a VCAM-1 [Matsumoto, y col., Blood 86:1437 (1995)], se realizaron estudios iniciales usando VCAM-1 recombinante inmovilizada.

Para eosinófilos tanto recién purificados como cultivados, se realizaron pocillos revestidos con células de adhesión a VCAM-1 marcadas con ^{51}Cr (250 ng/ml) o BSA (1%) durante 30 minutos a 37ºC como se ha descrito anteriormente [Matsumoto, y col., Blood 86:1437 (1995)]. En algunos experimentos, las células se preincubaron durante 30 minutos a 4ºC con concentraciones de saturación de uno o más de los siguientes anticuerpos monoclonales bloqueantes antes de examinar la adhesión: anti-CD18 (7E4), anti-CD11a (MHM24), anti-CD11b (clon 44), anti-CD11c (BU-15), anti-\alpha_{d} (2401), y anti-\alpha_{4} (HP2/1).

Para células CHO transfectadas y parentales, la adhesión se realizó usando placas revestidas idénticas a las empleadas para la adhesión de eosinófilos. El examen de las células CHO transformadas indicó que la expresión de \alpha_{d} era relativamente baja, y como resultado, la interacción entre transfectantes CHO y VCAM-1 no se detectaba tan fuerte como la que hay entre eosinófilos y VCAM-1. Por lo tanto se empleó una modificación de una técnica de lavado suave descrita anteriormente [Shanley, y col., J. Immunol. 160: 1014 (1998)]. Esta técnica permitía que las células no adherentes se soltaran de la placa invertida con centrifugación a 1 x g durante 30 minutos a 20ºC. Las células adherentes restantes después se retiraban usando EDTA 0,1 M (Sigma) y se contaban por citometría de flujo. Además de VCAM-1, también se usaba selectina E (100 ng/ml) para revestir los pocillos en algunos experimentos de adhesión. Además de los anticuerpos monoclonales bloqueantes usados en los estudios de eosinófilos, se pretrató VCAM-1 inmovilizada con una dilución apropiada de anticuerpo monoclonal F(ab')_{2} anti-VCAM-1 antes de la adición de células CHO.

Los resultados indicaron que los eosinófilos recién aislados se adherían a VCAM-1 y el anticuerpo monoclonal que bloquea la integrina \alpha_{4} inhibía de forma eficaz la adhesión. El bloqueo con el anticuerpo anti-CD11b no tuvo efecto. La adhesión también podía inhibirse forma significativa y sistemática por anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} 240O, aunque a un menor grado (aproximadamente 30% de inhibición) que el observado usando el anticuerpo anti-\alpha_{4}.

Fueron incluso más asombrosos los resultados de los experimentos de adhesión de VCAM-1 en que se emplearon eosinófilos cultivados con IL-5, que expresan niveles potenciados de integrina \alpha_{d}. En estas condiciones, los anticuerpos monoclonales contra integrinas CD18, \alpha_{d}, o \alpha_{4} eran igual de eficaces en la reducción de la adhesión hasta niveles de fondo, mientras que una combinación de anticuerpos bloqueantes contra CD11a, CD11b, y CD11c no tuvo efecto. También se observó que los eosinófilos cultivados con IL-5 presentaban adhesión de fondo potenciada y adhesión a VCAM-1 reducida en comparación con la observada con eosinófilos recién asilados. En base a los estudios de bloqueo de anticuerpo monoclonal con eosinófilos recién aislados, la adhesión a VCAM-1 estaba principalmente mediada a través de integrinas \alpha_{4}. Sin embargo, en eosinófilos cultivados con IL-5, la adhesión a VCAM-1 estaba mediada de forma igual por integrinas \alpha_{4} y \alpha_{d}. Juntos, estos datos son los primeros en demostrar la regulación dependiente de activación de la expresión de integrina \alpha_{d}\beta_{2} y la función sobre eosinófilos humanos y documentan una nueva función para \alpha_{d}\beta_{2} como un ligando alternativo para VCAM-1.

En base al resultado de que las integrinas \alpha_{d} en eosinófilos se unen a VCAM-1 y puede regularse positivamente con IL-5, esta leucointegrina puede desempeñar una función en el reclutamiento de eosinófilos imprimados con citoquinas a sitios inflamatorios.

Ejemplo 43 Células CHO que Expresan \alpha_{d} Se Unen a VCAM-1

Para verificar adicionalmente que \alpha_{2}\beta_{2} funciona como un ligando de VCAM-1, se generaron transfectantes CHO que expresan las cadenas de integrina \alpha_{d} y \beta_{2} humanas del siguiente modo.

Se transfectaron células de ovario de hámster chino como se ha descrito en el Ejemplo 11. Las células CHO transfectadas con \alpha_{d}\beta_{2} se cultivaron en DMEM/medio F12 con piruvato 1 mM y L-glutamina 2 mM (Biofluids) suplementado con FBS dializado al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y 600 \mug/ml de G418 (todos de Life Technologies). El medio para cultivo de la línea celular CHO parental era similar excepto en que se usó FBS no dializado (Life Technologies) y se usaron hipoxantina 0,1 mM y timidina 16 nM (Sigma) en lugar de G418. Las células transfectadas expresaban las cadenas de integrina \alpha_{d} y \beta_{2} a niveles moderados y no expresaban integrinas CD11a, CD11b, CD11c, o \alpha_{4}. La línea celular CHO parental no lograba expresar ninguna de estas integrinas. Se realizaron ensayos de adhesión como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 42.

Los resultados indicaron que las células CHO transfectadas con \alpha_{d}\beta_{2} se adherían a pocillos revestidos con VCAM-1. La adhesión se bloqueaba de forma eficaz por un anticuerpo monoclonal F(ab')_{2} contra el primer dominio de VCAM-1 así como por anticuerpos monoclonales contra CD18 o \alpha_{d}. En contraste, las células CHO no transfectadas parentales no lograban adherirse a VCAM-1 y ningún tipo celular presentaba adherencia significativa a los pocillos revestidos con selectina E.

El hallazgo de que el anticuerpo monoclonal contra el sitio de unión de la integrina \alpha_{4} en el primer domino de VCAM-1 bloqueaba completamente la adhesión de VCAM-1 dependiente de interina \alpha_{d}\beta_{2} sugería fuertemente que el sitio de unión de \alpha_{d}\beta_{2} es casi igual o idéntico al de integrinas \alpha_{4}. Como hay poca homología de aminoácidos entre las integrinas \alpha_{d} y \alpha_{4}, este resultado era inesperado. Si las integrinas \alpha_{d}\beta_{2} pueden unirse a otros ligados de integrina \alpha4, tales como fibronectina o la molécula de adhesión celular adresina mucosa 1, se desconoce.

Regiones de VCAM-1 Requeridas para la Unión de \alpha_{d}

Se ha demostrado que los dos primeros dominios de VCAM-1 soportan la unión de las integrinas \alpha_{4} y se han identificado aminoácidos relevantes en esos dominios. Para determinar si \alpha_{d} comparte sitios similares de reconocimiento en las moléculas VCAM-1, se construyó un plásmido que contenía secuencias para los dominios 1 y 2 de VCAM-1 fusionado a Fc de inmunoglobulina humana. Además, se generó una versión modificada de la construcción de expresión de los dos dominios de VCAM-1 por PCR para que incluyera una mutación de sustitución donde la alanina en el resto 40 estuviera remplazada con un resto de aspartato. Las dos construcciones de expresión se introdujeron por transfección transitoria en células COS usando el protocolo de DEAE-Dextrano previamente descrito. La proteína se purificó del sobrenadante de cultivo usando Proteína A Sepharose® como se ha descrito anteriormente.

Se ensayó la capacidad de células CHO que expresan \alpha_{4}\beta_{1} o \alpha_{d}\beta_{2} de unirse a una proteína de fusión de VCAM-1 de cinco dominios/Ig o la proteína de fusión ICAM-1/Ig del siguiente modo. Se inmovilizaron CAM en placas de microtitulación de 96 pocillos a 0,5 \mug/pocillo en tampón bicarbonato (pH 9,5). Las placas se bloquearon con gelatina de pez al 1% y se trataron con tampón, anticuerpo irrelevante o un anticuerpo contra VCAM-1 bloqueante. Las células CHO transformadas con \alpha_{d} o \alpha_{4} se trataron con tampón solamente, anticuerpo irrelevante o un anticuerpo monoclonal específico para la cadena alfa (130K o 217I para \alpha_{d} o \alpha4,1 para \alpha_{4}) o un anticuerpo contra la cadena alfa bloqueante. Las células se lavaron antes de la adición a los pocillos revestidos con CAM a una densidad de 100.000 células por pocillo. Las células se incubaron en presencia del anticuerpo inmovilizado durante veinte minutos antes de la adición de glutaraldehído al 5%. Después de la fijación, las placas se lavaron con agua destilada y las células se tiñeron con violeta cristal al 1%. Después de desteñir con etanol al 66% durante varias horas, se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de placa Dynatech.

Los resultados indicaron que tanto \alpha_{d}\beta_{2} como \alpha_{4}\beta_{1} reconocían las formas de cinco dominios y de dos dominios de VCAM-1 a grados equivalentes que indican que puede que no se requiera dominios adicionales para la unión. Aunque se detectaron diferencias entre la unión \alpha_{d}/VCAM-1 y la unión \alpha_{4}/VCAM-12, es probable que las diferencias fueran el resultado de la expresión diferencial en las células CHO transformadas. La unión de ambas líneas celulares se bloqueó por el anticuerpo contra VCAM-1 (50 a 100%), anticuerpo contra \alpha_{4} (100%) y anticuerpo contra \alpha_{d} (50%). La línea transfectada con \alpha_{4} no reconocía la VCAM-1 mutante y la unión de la línea celular de \alpha_{d} al mutante era el 50% de la detectada con VCAM-1 de tipo silvestre. Ninguna línea celular CHO mostraba unión de ICAM-1/Ig. Combinados, estos resultados sugieren que tanto \alpha_{d} como \alpha_{4} reconocen los dominios 1 y 2 de VCAM-1 y reconocen epítopes solapantes, aunque no idénticos.

Ejemplo 44 Marcaje de \alpha_{d} como Antígeno Tumoral

La expresión espacial y temporalmente restringida de \alpha_{d} sugiere que la molécula puede servir como diana para retirar poblaciones de células patogénicas que expresan \alpha_{d} en la superficie. Varias observaciones previas condujeron a esta posibilidad.

Por ejemplo, en comparación con otras leucointegrinas, la expresión de \alpha_{d} está menos extendida. Parece que la expresión de \alpha_{d} está limitada a un subconjunto especializado y/o altamente diferenciado de leucocitos. A diferencia de otras leucointegrinas, parece que la expresión de \alpha_{d} está sujeta a regulación como se evidencia por la rápida regulación negativa en células primarias o transformadas en cultivo. Los anticuerpos monoclonales contra \alpha_{d} muestran reactividad variable aunque los anticuerpos sean específicos para \alpha_{d}. Por ejemplo, el anticuerpo anti-\alpha_{d} 212D muestra reactividad limitada con células mieloides de tejido normal y altamente diferenciadas en comparación con la reactividad observada con otro anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} 217L. Es interesante observar que los ratones knockout \alpha_{d} sobreviven hasta el nacimiento y más allá, pero esta observación proporciona poca información acerca de la función biológica de \alpha_{d}. Finalmente, se ha detectado expresión de \alpha_{d} en un 70% estimado de leucemias caninas, y se han detectado elevados niveles de expresión de \alpha_{d} en células de leucemia NK recién aisladas de ratas F344 (Ejemplo 26). Aunque las células tumorales serían una población preferida para la eliminación usando \alpha_{d} como diana, también podría eliminarse cualquier tipo celular indeseable que exprese \alpha_{d} de modo descrito a continuación.

Se seleccionan uno o más anticuerpos con preferencia por los que muestra reactividad de bajo nivel con tejido normal. Una posibilidad sería el anticuerpo 212D por razones analizadas anteriormente. También se seleccionan anticuerpos de control apropiados, incluyendo un anticuerpo irrelevante como control negativo. Se obtienen muestras de sangre y tumor de pacientes con leucemia y linfoma y se exploran por inmunocitoquímica y para la expresión en la superficie celular con análisis por FAScan, inmunoprecipitación y análisis de transferencia de Western usando los anticuerpos seleccionados. La detección de tinción positiva después conduciría a procedimientos alternativos para desarrollar el procedimiento de eliminación.

En un enfoque, se clona la región hipervariable del anticuerpo de tinción positiva seleccionado anteriormente y se expresa en el contexto de un isotipo humano de fijación del complemento. Después de la subclonación y el cambio de isotipo, se evalúa de nuevo la especificidad y reactividad como se ha descrito anteriormente incluyendo, por ejemplo, análisis FACS, histología en tejido normal, e inmunoprecipitación. Se desarrolló un vector de casete para el propósito de expresar una región hipervariable elegida en un contexto de IgG1 humana. Además, se diseñó una serie de cebadores y se sintetizaron para facilitar la amplificación de una región hipervariable de un anticuerpo de interés a partir de una línea celular de hibridoma [Gavilondo-Cowley, y col., en HYBRIDOMA, Vol 9 Nº 5, 1990, Mary Anne Leibert Inc., Publishers, Media, PA, pág. 407-417]. El anticuerpo resultante después se ensaya in vitro para determinar si su unión en presencia de complemento provoca muerte celular. Preferiblemente, el ensayo in vitro se realiza usando células tumorales. Los ensayos de control determinarán si el anticuerpo monoclonal muestra la misma actividad en cultivos celulares que no expresan \alpha_{d}.

El anticuerpo monoclonal también se ensaya para determinar si la unión provoca internalización que indica que el anticuerpo puede conjugarse con un fármaco citotóxico.

Se desarrolla un modelo preclínico donde se examina la actividad citolítica in vivo. En un ejemplo, se examina la equivalencia en el modelo de rata F344 (Ejemplo 26). Otro modelo es el sistema SCID/Hu donde se han transplantado células humanas. Por ejemplo, se transplantan células U937 mieloides, células T Jurkat T, o células HTC166 de carcinoma de colon humano en ratones, se recogen los tumores, y se tiñen los tumores para los antígenos de superficie usando anticuerpos anti-\alpha_{d} (por ejemplo, 212D y 217L). La detección de expresión de \alpha_{d} conduce al uso de los anticuerpos in vivo para retirar tumores.

Ejemplo 44 Anticuerpos Monoclonales Human Anti-\alpha_{d}

Se identifican anticuerpos monoclonales humanos explorando repertorios de anticuerpos presentados en fagos filamentosos como se ha descrito anteriormente [Waterhouse, y col., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993); Parsons, y col., Protein Engineering 9: 1043-1049 (1996)]. En resumen, se usan segmentos del gen V funcionales de donantes humanos no inmunizados para construir un repertorio de fragmentos de cadena Fv sencilla (scFv) presentados en la superficie de un fago. Los fragmentos se clonan en un vector fagómido que permite que se produzcan tanto el fago presentado como scFv soluble sin subclonación. Se ha incorporado una marcad de histidina para permitir la rápida purificación de scFv por cromatografía por quelación de níquel. El uso de este formato de biblioteca generalmente permite el aislamiento de fragmentos de anticuerpos monoclonales humanos en menos de dos semanas. El aislamiento se realiza como se ha descrito anteriormente [Marks, y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), Vaughan, y col., Nature Biotechnol. 14: 309-314 (1996)]. Preferiblemente se identifican anticuerpos que reconocen específicamente el dominio I.

Ejemplo 45 Tratamiento con Anticuerpo Anti-\alpha_{d} en Ratones Apolillados

En ratones mutantes apolillados [Koo, y col., J. Immunol. 147: 1194-1200 (1992); Koo. y col., J. Immunol. 151: 6733-6741 (1993)], existe el gen me^{v} recesivo autosómico como una mutación puntual de la proteína celular hematopoyética tirosina fosfatase en ratones C57BL/6. Los homocigotos desarrollan una inflamación mielomonocítica crónica que implica la acumulación de células mielomonocíticas en el pulmón y la piel que provoca neumonitis intersticial, atrofia tímica, y disfunción de células T y células NK. La afección inflamatoria es transferible por las células de la médula ósea de estos ratones lo que indica que la mutación me^{v} se debe a un defecto de las células madre en la vía mielomonocítica. Como \alpha_{d} está presente en células mieloides, se emprendió un procedimiento para evaluar cualquier efecto inhibidor en los cambios inmunopatológicos con tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} en ratones normales después de transplante de médula ósea de ratones mutantes apolillados.

Se obtuvieron ratones C57BL/6J (B6)-me^{v}/me^{v} y sus hermanos normales +/- (B6)-+/- del Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Los ratones se mantuvieron en un entorno sin patógenos con alimento y agua proporcionados ad libitum. Todos los ratones eran de seis a diez semanas de edad.

En el Día 1, todos los ratones recibieron 2 \mug/ml de anticuerpo \alpha-NK1.1, (PK136, Pharmingen) en 0,5 ml de PBS mediante inyección intraperitoneal. En el Día 0, todos los ratones B6 +/- se irradiaron con 750 Rad. Se recogió la médula ósea de (B6) me^{v}/me^{v} como se ha descrito anteriormente. Las células retiradas de la tibia y el fémur se transfirieron a medio de cultivo RPMI suplementado y se incubaron durante dos horas antes de la inyección intravenosa en los ratones irradiados. Los ratones se trataron inmediatamente con anticuerpo anti-\alpha_{d} 205C o anticuerpo irrelevante a 5 mg/kg en 200 \mul de PBS mediante inyección intraperitoneal. El anticuerpo monoclonal de hámster purificado 205C anti-rata que reacciona de forma cruzada con \alpha_{d} de ratón se ha descrito previamente. Como control negativo, un grupo de ratones recibió un volumen igual de solución salina. En los Días 4 a 25, los ratones se trataron con inyección de anticuerpo o solución salina en días alternos para un total de diez tratamientos y los animales se controlaron para los cambios en el peso y signos de enfermedad. En general, se continuaron las observaciones para cada grupo durante un total de dos meses.

El estado moribundo es el criterio de valoración del ensayo. Los animales que llegaron a estar muy enfermos, sin embargo, se sacrificaron. Se evalúa la tasa de supervivencia entre los grupos y se usan análisis histológicos de tejido como indicadores adicionales de la eficacia del tratamiento de anticuerpo contra \alpha_{d}. Se realiza un estudio similar considerando las propiedades terapéuticas de los anticuerpos contra \alpha_{d} para complementar el estudio profiláctico descrito anteriormente.

Para el día 35, ninguno de los ratones tratados con el anticuerpo contra \alpha_{d} había muerto, mientras que dos de los nueve ratones en el grupo tratado con solución salina habían muerto y tres de los siete restantes habían desarrollado afecciones típicas del síndrome. En el grupo tratado con anticuerpo irrelevante, tres de los cojo habían muerto.

Ejemplo 46 Expresión de \alpha_{d} en Leucemias Humanas

Las leucemias pueden dividirse en dos clases, mieloide y linfoide, de acuerdo con el linaje celular y estas dos clases pueden distinguirse adicionalmente como agudas o crónicas. A causa de la restricción aparente de la expresión de \alpha_{d} a células del linaje mieloide, se formuló la hipótesis de que las leucemias mieloides, pero no las linfocíticas, expresan \alpha_{d}. Una segunda línea de investigación, si la primera hipótesis era correcta, fue determinar si la expresión de \alpha_{d} variaba de acuerdo con la patogenicidad, suponiendo de este modo una función relacionada con la enfermedad para \alpha_{d} en estas células.

Se ha detectado expresión de \alpha_{d} en células de sangre periférica usando los anticuerpos 212D y 217L como se ha descrito en el Ejemplo 18. En el examen de las células de leucemia, primero se analizaron células de médula ósea normales por procedimientos citométricos de flujo para la expresión de \alpha_{d} para establecer una medida inicial para este tipo celular. Se usaron los anticuerpos 212D y 217L para teñir muestras de pacientes de acuerdo con protocolos convencionales y ambos anticuerpos mostraron débil reactividad con monocitos en la médula. El anticuerpo 212D solamente fue ligeramente positivo.

El análisis citométrico de flujo de las células leucémicas de sangre periférica o médula ósea de los pacientes indicó la presencia de epítopes 212D y 217L en mieloblastos y monoblastos en tres pacientes con leucemia mielogénica aguda (AML). También se observó expresión en células de un paciente con leucemia linfocítica crónica (CLL). Se evaluaron las células de otro paciente AML en una fecha posterior y se descubrió que eran \alpha_{d} positivas. La expresión de \alpha_{d} en las células era del 50 al 100% mayor que los anticuerpos monoclonales de control, pero significativamente inferior que los niveles de expresión de CD11a, CD11b, y CD11c.

A la luz de estos resultados, también se evaluó la línea celular U937, una leucemia de linaje mieloide equivalente a células AML en fase M-4 (en una escala de diferenciación de M1-M5). Los patrones de expresión de CD11a, CD11b, CD11c, y \alpha_{d} eran similares a los de células de pacientes AML. Es interesante observar que la presencia de la proteína \alpha_{d} en la superficie celular era dependiente de las condiciones de cultivo. Medio rico con elevados niveles séricos (Medio de Dulbecco Modificado por Iscove, FBS al 20%) sostenía la expresión de \alpha_{d}, mientras que medio de cultivo básico (RPMI, FBS al 10%) no.

El hallazgo de que se detectaba expresión de \alpha_{d} en linfoblastos de un paciente CLL indica que \alpha_{d} puede expresarse en células del linaje de los linfocitos y es coherente con otros datos (es decir, la expresión de \alpha_{d} en células CD5^{+} de rata y células CD8^{+} caninas). El nivel de expresión relativamente elevado de otras leucointegrinas en estas células excluye el uso de estas células para examinar la función de \alpha_{d} de un modo reproducible, y sugiere que la redundancia funcional de esta familia compensaría la inhibición de un miembro en estos tipos celulares. De hecho, la expresión de \alpha_{d} por estas células puede ser coincidental con la transcripción aberrante.

Aunque estos experimentos no apoyan completamente las hipótesis iniciales, la presencia de la proteína \alpha_{d} en leucemias de linaje tanto mieloide como y linfoide sugiere que una amplia población de pacientes puede beneficiarse del uso de terapias anti-\alpha_{d} dirigidas a la retirada de tumores en lugar de la inhibición funcional.

Se espera que se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones de la invención como se expone en los ejemplos ilustrativos anteriores a los especialistas en la técnica. Por consiguiente, solamente las limitaciones que aparecen en las reivindicaciones adjuntas deben aplicarse a la invención.

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<110> Gallatin, Michael W.

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Van der Vieren, Monica

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<120> Nueva Subunidad Alfa de Integrina \beta2 Humana

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<130> 27866/35694

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<140>

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<141>

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<150> 08/173.497

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<151> 23-12-1993

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<150> 08/286.889

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<151> 05-08-1994

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<150> 08/362.652

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<151> 21-12-1994

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<150> 08/943.363

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<151> 03-10-1997

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<150> 09/193.048

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<151> 16-11-1998

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<150> 09/350.259

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<151> 08-07-1999

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<160> 114

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 3726

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)..(3485)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

4

5

6

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

9

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttyaayytgg aygtngarga rccnatggtn ttyca

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaacctgg acgtggagga gcccatggtg ttccaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaacctgg acgtngaasa ncccatggtc ttccaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttyaayytng aygtngarga rcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttyaayytgg acgtngaaga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgraanacca tnggytc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggaagacc atnggytc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attaaccctc actaaag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatacgactc actatag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

raanccytcy tgraaactyt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1006

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> perro

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtnttycarg argaygg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccactgtcag gatgcccgtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttacgaat tcgccaccat ggctctacgg gtgcttcttc tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttacgaat tcgccaccat gactcggact gtgcttcttc tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttacgaat tcgccaccat gaccttcggc actgtg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgctgactg cctgcagttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttctgacgc gtaatggcat tgtagacctc gtcttc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtatgcag gatcccatca agagatggac atcgct

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgcatgtc tcgaggctga agccttcttg ggacatc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatagactgc tgggtagtcc ccac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaagattgg gggtaaataa caga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3528

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3453)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

31

32

33

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1151

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccaagctg tcatgggcca g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccagcaga ctgaagagca cgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaacagct atgaccatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacatgttc actgcctcta gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggacagt cagacgactg tcctg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3519

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52)..(3516)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

40

41

42

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

45

46

47

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttacggat ccggcaccat gaccttcggc actgtgatcc tcctgtgtg

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctggacgat ggcatccac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagagttac ggatccggca ccat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagccagct tcggacagac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgtccac agaacagaga g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3803

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3483)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

50

51

52

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

55

56

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(3522)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

59

60

61

62

63

64

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

67

68

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgtcatgg gtctaacctg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggttagacc catgacagg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccttgcag ctggacaatg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaagctgg ctgcatcctc tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcctgcca ctggcgtgtg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccagatgaa ggacttcgtc aa

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgggatca ttcgctatgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caatggatgg accagttctg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagatcggct cctactttgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggagcct cgagacagg

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccactgtcct cgaagctgga g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcgtcctg tgctggctgt gggctc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcctggcat gtgaggctga g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtgatcag taggcaggaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcacagagg gaacctcc

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcctgagt gaggctgaaa tca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagatgctgg atctaccatc tgc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgagctggg agatttttat gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggatcagc actgaaatct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtttgaaga agccaagctt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacagcggag gtgcaggcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcactgctt gcgctggc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtaagata gctctgctgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcccacag ccagcacagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccaacgc cagatcatac c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacggccagg tccaccaggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgtcccct agcactgtca g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgacgaagt ccttcatctg gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaactgcaag ctggagccca g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggatgctg cgaagtgcta c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccttggagc tggacgatgg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaagatctc cagagtgtcc aagacaagag atg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctcgagt gtgagagctg aactgaaacc ttc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctgtgacg tcagagttga gtccaaatat gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgacacta tagaataggg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcaggagc tcctgtgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> conejo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (61)..(852)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

70

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> conejo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

72

720

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggtctgga ggtgccttcc tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgagcagg agcacctggc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2499

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

73

74

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3956

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

76

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3785

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3483)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

81

82

83

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

85

86

87

88

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1318

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> conejo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(1255)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

90

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 413

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> conejo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> conejo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1482)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

95

96

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 494

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> conejo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtccaggac aagagatgga cattgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctatttc atagcaagaa tggg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatagcatag cgaatgatcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggtccgtg gagttgtgat c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgagatcca ccaaactgca c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> mono

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> mono

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> mono

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

Claims

1. Uso de un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} _{ITGAD} para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de déficit crónicos como resultado de inflamación en el sitio de una lesión del sistema nervioso central (SNC) causada por traumatismo.

2. Un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} para el tratamiento de déficit crónicos como resultado de inflamación en el sitio de una lesión del SNC causada por traumatismo.

3. El uso o el anticuerpo de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} bloquea la unión entre \alpha_{d} y un compañero de unión.

4. El uso o el anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el compañero de unión es VCAM-1.

5. El uso o el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{d} se secreta por un hibridoma seleccionado entre el grupo constituido por (226H)/Nº de Acceso ATCC HB 12592/ y (236L)/Nº de Acceso ATCC 12593/.

6. El uso o el anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo monoclonal se une al dominio I de \alpha_{d}.

7. El uso o el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la lesión del SNC es una lesión de la médula espinal.