ES2313800T3

ES2313800T3 - Aparato y procedimiento de separacion magnetica.

Info

Publication number: ES2313800T3
Application number: ES99960615T
Authority: ES
Inventors: Leon W. M. M. Terstappen
Original assignee: Veridex LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2019-11-30
Also published as: CA2352064C; WO2000032293A1; DK1144073T3; EP1144073B1; EP1144073A4; AU1747500A; ATE404269T1; JP2002531811A; PT1144073E; DE69939332D1; EP1144073A1; CA2352064A1; JP4409096B2

Abstract

Aparato para observar entidades microscópicas que responden magnéticamente suspendidas en un medio fluido, que comprende: un recipiente que tiene una pared transparente; si una cámara formada en su interior para contener el medio fluido; una estructura de captura ferromagnética soportada sobre la superficie interior de la pared transparente; y medios magnéticos para inducir un gradiente magnético interno en la proximidad de la estructura de captura ferromagnética, con lo cual las entidades que responden magnéticamente si inmovilizan a lo largo de la pared adyacente a la estructura de captura; caracterizado por el hecho de que la estructura de captura ferromagnética comprende una pluralidad de elementos ferromagnéticos que tienen una separación no uniforme entre elementos adyacentes.

Description

Aparato y procedimiento de separación magnética.

La presente invención se refiere a aparatos y a procedimientos para realizar análisis cualitativos y cuantitativos de especímenes biológicos microscópicos. En particular, la invención se refiere a estos aparatos y procedimientos para aislar, recoger, inmovilizar, y/o analizar especímenes o sustancias biológicas microscópicas que son susceptibles de unión inmunoespecífica o no específica con partículas de respuesta magnética que tienen un agente de unión para producir especies marcadas magnéticamente en un medio fluido. Tal como se usa aquí, términos tales como "entidad objetivo" se refieren a estos especímenes o sustancias biológicas o de interés de investigación que son susceptibles de este marcado magnético.

La patente US 5.985.153 describe un aparato y un procedimiento en el que se utiliza un gradiente magnético externo para atraer entidades objetivo marcadas magnéticamente en una cámara de recogida en una de sus superficies, y donde se utiliza un gradiente magnético interno para tener una alineación precisa de aquellas entidades en esa superficie. El movimiento de las entidades biológicas marcadas magnéticamente a la superficie de recogida se obtiene aplicando un gradiente magnético vertical para mover las entidades biológicas marcadas magnéticamente a la superficie de recogida. La superficie de recogida está provista de una estructura de recogida ferromagnética, tal como una pluralidad de líneas ferromagnéticas soportados sobre una superficie ópticamente transparente.

Una vez las entidades biológicas marcadas magnéticamente se llevan suficientemente cerca de la superficie mediante gradiente aplicado de manera externa, entran bajo la influencia de un gradiente local intenso producido mediante la estructura de recogida ferromagnética y se inmovilizan en posiciones lateralmente adyacentes a la misma. El gradiente local supera preferiblemente las fuerzas de adhesión que pueden sujetar las entidades biológicas a la superficie transparente después de que colisionen con la superficie. Alternativamente, la capacidad adhesiva de la superficie debe ser lo suficientemente débil para permitir que la fuerza magnética horizontal mueva las entidades biológicas marcadas magnéticamente hacia las estructuras ferromagnéticas. La homogeneidad y la naturaleza hidrofóbica o hidrofílica de la superficie son factores que pueden influenciar en el material elegido para la superficie de recogida o el tratamiento de esta superficie para obtener una superficie resbaladiza.

Según la presente invención, se describen otras realizaciones alternativas y mejoras para la cámara de recogida, la geometría interior de la cámara de recogida, y otras técnicas útiles que se pueden realizar mediante el uso de una estructura de separador de gradiente magnético vertical.

Los aparatos que forman la presente invención se define mediante las reivindicaciones 1 a 9.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A es un diagrama esquemático de un separador magnético;

La figura 1B es un diagrama que muestra el campo magnético previsto en el separador magnético de la figura 1A;

Las figuras 2A-C son microfotografías de especímenes recogidos en un separador magnético;

Las figuras 3A-I son vistas en planta de estructuras de recogida ferromagnéticas alternativas para su uso en un separador magnético;

Las figuras 5A-B son histogramas de señales de fluorescencia obtenidos a partir de un separador magnético (5A) y a partir de un citómetro de flujo (5B) utilizado para cuantificar las especies en muestras de fluido idénticas;

La figura 4 es un diagrama esquemático de un mecanismo óptico de seguimiento y detección para analizar las especies recogidas en un separador magnético 11,

Las figuras 6A-6B son microfotografías de especímenes recogidos en un separador magnético;

Las figuras 7A y 7B son diagramas esquemáticos sucesivos que muestran un procedimiento de recogida mejorada con carga en un separador magnético;

Las figuras 8A y 8B son respectivas vistas en sección transversal y en planta de una estructura de recogida ferromagnética y eléctricamente conductora para un separador magnético;

Las figuras 9A-9C son vistas esquemática sucesivas se muestran un procedimiento de separación de partículas en un separador magnético;

Las figuras 10A y 10B son vistas esquemática sucesivas que muestran un procedimiento de medición de la densidad de las partículas en un fluido que tiene una densidad de partículas desconocida;

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Las figuras 11A y 11B son vistas en sección de un recipiente de separación configurado para múltiples análisis simultáneos de fluidos que contienen múltiples especies objetivo con concentraciones diferentes.

Descripciones detalladas I. Recogida de gradiente vertical y observación de entidades objetivo

En una primera realización (que no forma parte de la invención), se recogen entidades objetivo tales como células contra una superficie de recogida de un recipiente sin una alineación posterior adyacente a una estructura de recogida ferromagnética. La superficie de recogida se orienta perpendicular a un gradiente de campo magnético producido mediante imanes externos. En esta realización, nanopartículas magnéticas y entidades biológicas marcadas magnéticamente se recogen en una distribución substancialmente homogénea sobre una superficie ópticamente transparente, mientras que las entidades no seleccionadas permanecen por debajo en el medio fluido. Este resultado se puede realizar colocando una cámara en una separación entre dos imanes dispuestos como se muestra en la figura 1A, de manera que la superficie de recogida transparente de la cámara es perpendicular de una manera efectiva respecto a un gradiente de campo vertical generado mediante imanes externos 3. Los imanes 3 tienen un espesor de 3 mm, y se estrechan hacia una separación de 3 mm. Los imanes 3 se sujetan en un yunque 1, que se apoya sobre un alojamiento 2. Un soporte a la recipiente 4 sujeta el recipiente 6 en una región entre los imanes donde las líneas de la fuerza magnética se dirigen de una manera substancialmente perpendicular respecto a la superficie de recogida 5 del recipiente 6. La superficie de recogida del recipiente está formada preferiblemente de un elemento de policarbonato con un espesor de 0,1 mm. La superficie de recogida es paralela, y 2 mm por debajo, a la superficie superior de los imanes externos 3. El espacio entre los bordes de superficie interiores superiores de los imanes es de 3 mm.

El ángulo de estrechamiento de los imanes 3 y la anchura de la separación entre los dos imanes determinan la magnitud del gradiente de campo magnético aplicado y la posición preferible de la superficie de recogida del recipiente. El gradiente de campo producido mediante los imanes se puede caracterizar como que tiene una región substancialmente uniforme, en el que las líneas de campo del gradiente son substancialmente paralelas, y regiones de flecos, en las que las líneas de campo del gradiente divergen hacia los imanes. La figura 1B muestra líneas del gradiente de campo magnético matemáticamente aproximadas para una disposición de imán de este tipo. Las líneas de campo magnético (no representadas) son predominantemente paralelas a la superficie de la cámara, mientras que las líneas del gradiente son predominantemente perpendiculares a la misma. Para recoger una capa distribuida de manera uniforme de las entidades objetivo, el recipiente se posiciona para colocar la cámara en la región uniforme, de manera que no hay substancialmente ningún componente del gradiente magnético transversal que podría provocar el transporte lateral de las entidades biológicas marcadas magnéticamente a la superficie la recogida.

Para ilustrar el diseño de recogida del material magnético sobre el área de superficie de recogida, una cámara con unas dimensiones internas de una altura de 2,5 mm (z), una anchura de 3 mm (x) y una longitud de 30 mm (y) se llenó con 225 \mul de una solución que contiene cuentas magnéticas de un diámetro de 150 nm y se colocó entre los imanes tal como se muestra en la figura 1A. Las cuentas magnéticas se movieron a la superficie de recogida y se distribuyeron de manera uniforme. Cuando el recipiente se elevó respecto a los imanes, de manera que una porción significativa de la parte superior del recipiente se colocó en una región de flecos, cantidades significativas de las partículas magnéticas paralelas y acumuladas en áreas laterales respectivas de la superficie la recogida se colocaron más próximas a los imanes.

Para mejorar la uniformidad de la recogida sobre la superficie de recogida, el material de la superficie se puede seleccionar o tratar de otra manera para tener una atracción adhesiva para las especies recogidas. En esta disposición adhesiva, la deriva horizontal de las especies recogidas debido a cualquier desvío en la colocación de la cámara o desviación de los ardientes magnéticos perpendiculares deseados en la región "substancialmente uniforme" se puede eliminar.

Un ejemplo del uso de la presente realización, el dispositivo descrito es una prueba de cáncer sanguíneo. Se pueden detectar células epiteliales derivadas de tumores en la sangre periférica. Aunque presente en cantidades bajas, 1-1000 células por 10 ml de sangre, las células se pueden recuperar y analizar de manera cuantitativa a partir de una muestra de sangre periférica utilizando un ferrofluido específico de células anti-epiteliales. La figura 3 muestra un ejemplo del uso de los imanes y de la cámara sin estructura ferromagnética sobre la superficie de recogida para localizar, diferenciar y enumerar células de tumores derivados epiteliales seleccionadas en la sangre periférica. En este ejemplo, se incubaron 5 ml de sangre con 35 \mug de un ferrofluido específico de células epiteliales (EPCAM-FF, Immunicon Corp. Huntingdon Valley, PA) durante 15 minutos. La muestra se colocó en un separador magnético de cuatro polos (QMS 17, Immunicon Corp.) durante 10 minutos y la sangre se descartó. El recipiente se retiró del separador y las células recogidas presentes en la pared del recipiente de separación se volvieron a suspender en 3 ml de un tampón que contenía un detergente para permeabilizar las células (Immunoperm, Immunicon, Corp.) y se colocó otra vez en el separador durante 10 minutos. El campo que contenía el detergente se descartó y el recipiente se retiró del separador y las células recogidas en la pared se volvieron a suspender en 200 \mul de un tampón que contiene una tinta de ácido nucleico que se excita con ultravioleta DAPI (sondas moleculares) y anticuerpos monoclonales de citoqueratina (que identifican células epiteliales) marcadas con el Cy3 de fluorocromo. Las células se incubaron durante 15 minutos, después de lo cual el recipiente se colocó en el separador. Después de cinco minutos, la fracción no recogida que contiene reagentes en exceso se descartó, el recipiente se retiró del separador y las células recogidas se volvieron a suspender en 200 \mul de un tampón isotónico. Esta solución se colocó en una cámara de recogida y se colocó en el separador magnético mostrado en la figura 1A. Las células marcadas del ferrofluido y las partículas del ferrofluido libres se movieron inmediatamente a la superficie de recogida y se distribuyeron de manera uniforme a lo largo de la superficie, tal como se muestra en la figura 2A. La figura muestra un área representativa sobre la superficie de recogida utilizando luz transmitida y un objetivo 20X. En la figura 2B se muestra el mismo campo, pero ahora se utiliza un cubo de filtro para excitación y emisión de Cy3. Se pueden identificar dos objetos y se indican con 1 y 2. La figura 2C muestra el mismo campo pero que el cupo de filtro está cambiado a uno con un cubo de filtro de emisión y excitación para DAPI. Los objetos en la posición 1 y 2 contienen tintes DAPI, tal como se indica en las posiciones 3 y 5, que confirman su identidad como células epiteliales. Se identifican mediante el tinte DAPI células no epiteliales adicionales y otros elementos celulares; un ejemplo se indica mediante el número 4.

II. Estructuras de recogida ferromagnéticas que producen la alineación central de las células

Para proporcionar una recogida espacialmente diseñada de las entidades objetivo, se puede prever una estructura de recogida ferromagnéticas en la superficie de recogida del recipiente, para producir un gradiente magnético local intenso para inmovilizar las entidades objetivas adyacentes lateralmente a las estructuras. Las diferentes estructuras ferromagnéticas descritas a continuación se han realizado mediante técnicas de litografía estándar utilizando níquel (Ni) o permaleación (aleación Ni-Fe). El espesor de las capas de metal evaporadas varió entre 10 nm y 1700 nm. Las estructuras de 10 nm eran parcialmente transparentes. La fuerza de inmovilización de estas estructuras finas, sin embargo, era considerablemente menor que las del intervalo de espesores 200-700 nm. Aunque la inmovilización y la alineación de entidades biológicas marcadas magnéticamente se produjo de una manera suficientemente fiable, el uso de estas estructuras moderadamente más gruesas fue facilitado mediante una superficie de recogida que no tenía ninguna fuerza adhesiva o una fuerza adhesiva pequeña. Los espesores de las estructuras de recogida entre 200 y
1700 nm fueron efectivos en la captura de las entidades biológicas marcadas magnéticamente y para superar la adhesión de la superficie.

Las figuras 3A a I muestran varios imanes para estructuras de recogida electromagnéticas.

En la figura 3B (que no forma parte de la invención) la estructura de recogida ferromagnética comprende alambres de Ni con una separación comparable al diámetro de las células (nominalmente de 10 micrones). Una disminución en la separación entre los alambres mostrados en la figura 3C (que no forma parte de la invención), producen una posición de las células mucho más uniforme respecto al borde del alambre. Casi todas las células aparecen que están alineadas de una manera centrada. Sin embargo, una porción de cada célula solapa, y es oscurecida por, el alambre de Ni.

Las células recogidas a lo largo de las estructuras de recogida ferromagnéticas se pueden detectar mediante un sistema de seguimiento y detección automático. El sistema de seguimiento y detección, mostrado en la figura 4, utiliza una etapa motorizada controlada por ordenador para mover los imanes y la cámara en las direcciones X e Y bajo un rayo láser que tienen un punto elíptico de 2-15 \mum. La velocidad máxima de la tabla es de 2 cm/segundo en la dirección Y, y de 1 mm/segundo en la dirección X. Dos lentes cilíndricas (1) y (2) y un objetivo de posición ajustable (3) tomado de un reproductor de discos compactos Sony se utilizó para hacer un punto elíptico de 2 x 15 \mum sobre la muestra con un diodo láser de 635 nm (4) como fuente de luz (ver recuadro 5). La luz reflejada desde la muestra se proyectó sobre un fotomultiplicador (6) a través de un espejo dicroico (7), una lente esférica (8), un diafragma (9) y filtros de paso de banda (10). La medición de las diferencias en la dirección de polarización de la luz reflejada desde los alambres y proyectada sobre un fotodiodo de cuadrante (11) a través del espejo (12), el espejo dicroico (7), una placa de cuarto de longitud de onda (13), un separador de rayo polarizado (14), una lente cilíndrica (15) y una lente esférica (16) se utilizaron para determinar la posición del punto láser sobre la muestra y proporcionar de vuelta una señal al objetivo (3) para corregir su posición para cualquier desviación (ver la inserción 17). Un fotodiodo (18) se colocó perpendicular a la muestra y se utilizó para medir la luz dispersa desde los eventos iluminados. El mecanismo de retroalimentación del sistema de seguimiento se optimiza de manera que el rayo láser mantenía la misma posición X y Z respecto a las líneas mientras se exploraba en la dirección Y con velocidades de hasta 1 cm/segundo. Al final de la línea de longitud de 2 cm, se cambió la posición del objetivo a la siguiente línea, que se repitió hasta que se exploraron todas las líneas de la cámara.

Para evaluar el rendimiento del sistema de seguimiento y detección y compararlo con el de un citómetro de flujo, se prepararon cuentas de poliestireno de 6 \mum que se conjugaron a ferrofluido, así como cuatro cantidades diferentes del fluorocromo Cy5. Las cuentas utilizaron con una concentración de 10^{5} ml^{-1} colocadas en una cámara con estructuras de recogida ferromagnéticas del tipo ilustrado en la figura 3C. La cámara se colocó en la región de gradiente uniforme entre los dos imanes y todas las cuentas se alinearon entre las líneas. El sistema de seguimiento y detección se utilizó para medir las señales de fluorescencia obtenidas mientras exploraba a lo largo de los alambres ferromagnéticos. La figura 5A muestra un histograma de las señales de fluorescencia de la mezcla de cuentas. Se pueden apreciar cuatro picos claramente resueltos que representan las cuentas sin Cy5, débilmente, intermedia y marcadas de una manera brillante con Cy5. Una mezcla de las mismas cuentas se realizó y se midió con un citómetro de flujo también equipado con un diodo láser de 635 nm (FAC-Scalibur, BDIS, San José, CA). El histograma de las señales de fluorescencia se muestra en la figura 5B, y muestra que aunque se pueden discernir cuatro poblaciones diferentes, están claramente menos resueltas que en los casos donde las muestras se midieron con el citómetro de inmovilización magnético de la presente invención. Estos resultados demuestran que la alineación de las cuentas obtenidas con el sistema aquí descrito proporciona una sensibilidad y una precisión de la medición de las cuentas fluorescentes que superior a la del citómetro de flujo.

En aplicaciones donde se desea medir simultáneamente entidades biológicas con diferencias significativas en el tamaño y según la presente invención, la estructura de recogida se configura para tener una geometría no uniforme para alinear de una manera centrada las células u otras especies de diferentes tamaños. Un ejemplo de esta estructura se muestra en la figura 3D. Un diseño de estructuras de recogida se hace con un área de la superficie de recogida que tiene alambres con un periodo de 10 \mum y una separación de 7 \mum, y otra área que tiene alambres con un periodo de 25 \mum y una separación de 7 \mum. Esto se utilizó para recoger tanto pequeñas plaquetas como leucocitos más grandes de toda la sangre. Antes de la recogida, la sangre se incubó con ferrofluidos específicos para las plaquetas y los leucocitos, es decir, un ferrofluido marcado con monoclonal CD41 y un fluido marcado con el anticuerpo monoclonal CD45, respectivamente. Los leucocitos y las plaquetas se alinean a lo largo de los alambres en las respectivas áreas de la superficie de recogida, tal como se muestra en la figura 3D. La medición de las plaquetas se puede realizar en el área con pequeños espacios entre los alambres, y la medición de los leucocitos se puede realizar en el área con espacios mayores entre los alambres. La variación de la anchura de separación a lo largo de la longitud de la estructura ferromagnética proporciona una alineación lineal de las células recogidas de diferentes tamaños a lo largo de un eje central común.

Son posibles muchos más diseños de estructuras de recogida dentro del alcance de la invención para capturar y alinear de una manera centrada células de diferentes tamaños en una única muestra. Otro ejemplo se muestra en las figuras 3E, 3F, 3G, 3H y 3I. La figura 3E muestra una separación de alambres similar a la mostrada en la figura 3C, pero los alambres tienen salientes laterales formados a lo largo de sus longitudes. Para la geometría de la figura 3E, había dos posiciones elegidas mediante las células - a la izquierda o a la derecha de los salientes tal como se muestra. Este diseño induce una colocación periódica de las células en los dos ejes del plano de recogida. La adición de una forma de borde de "diente" triangular en lugar de una "barra", tal como se muestra en la figura 3F evita la ligera (derecha-izquierda) asimetría observada en la figura 3E. La adición de una forma de borde de "diente" triangular asimétrico mayor como se muestra en la figura 3G también es efectiva para células de diferentes tamaños. Un estilo triangular más afilado se muestra en las figuras 3H. La figura 3I muestra una fila de rectángulos aislados, con su separación a lo largo de un juego de eje para coincidir con el tamaño de las células. La separación a lo largo del otro eje supera el tamaño de las células, de manera que las células se mueven libremente hacia las posiciones entre los lados separados de una manera más próxima de los rectángulos.

Un ejemplo de la utilización de la estructura ferromagnética diseñada de costumbre sobre la superficie de recogida es la prueba de cáncer sanguíneo. Las células epiteliales derivadas del tumor se pueden detectar en la sangre periférica y se pueden recuperar de una manera cuantitativa a partir de la sangre periférica utilizando ferrofluidos específicos de células anti-epiteliales. La apariencia física de las células epiteliales derivadas del tumor es extremadamente heterogénea variando entre células apoptóticas con un tamaño de 2-5 \mum a grupos de células del tumor con un tamaño de 100 \mum o más. Para acomodar este gran intervalo de tamaños, se pueden utilizar estructuras ferromagnéticas de forma triangular que se muestran esquemáticamente en las figuras 3G o 3H. Un ejemplo de la colocación de células de cáncer derivadas de sangre periférica se muestra en la figura 6. En este ejemplo, se incubaron 5 ml de sangre con ferrofluido específico de células epiteliales (EPCAM-FF, Immunicom Corp.) y se procesaron utilizando el mismo procedimiento que el descrito anteriormente. La suspensión celular final se colocó en el separador magnético. Las células marcadas con ferrofluido y las libres de ferrofluido se movieron inmediatamente a la superficie de recogida. La figura 6A muestra un área sobre la superficie de recogida utilizando luz transmitida y un objetivo 20X. Estructura de recogida ferromagnética se indica con 1, el espacio de recogida ancho abierto con 2, el espacio de recogida este hecho con 3 y un objeto grande con 4. La figura 6B muestra la misma área solamente utilizando ahora excitación UV. El objeto grande incluso es una célula grande tal como se confirma mediante el tintado con el indicador de tinte nuclear 5 y se alinea con precisión. El sistema de seguimiento descrito en la figura 4 se utilizó de una manera exitosa para explorar a lo largo de las estructuras ferromagnéticas mostradas en las figuras 3H y 6A.

III. Estructuras de recogida ferromagnéticas que se pueden dirigir

Además de la utilización de estructuras ferromagnéticas para crear altos gradientes magnéticos locales, también pueden servir como conductores electrónicos para aplicar cargas de campos electrónicos locales. Además, los conductores electrónicos se pueden formar sobre la superficie de recogida para permitir la manipulación electrónica de las entidades objetivo recogidas. La capacidad para mover primero las entidades biológicas a una posición específica seguida mediante un análisis óptico se muestra esquemáticamente en la figura 7A. La posterior aplicación de cargas electrónicas generales o localizadas, mostrada en la figura 7B, añade otra dimensión a la utilidad del sistema descrito. Se conocen aplicaciones útiles de cargas electrónicas locales para aplicaciones que implican células, ARN, proteínas y ADN. Un dibujo esquemático de un diseño de una superficie de recogida de este tipo se muestra en la figura 8. Para optimizar el control sobre la carga electrónica uno puede primero evaporar un diseño/capa específica de aluminio 1 sobre un substrato ópticamente transparente 4, que proporciona un circuito electrónico a las estructuras ferromagnéticas individuales, 5 en la figura 8B. La siguiente capa de Ni u otro material ferromagnético se evapora sobre el substrato, 2 en la figura 8A, para crear las estructuras ferromagnéticas individuales 5 en la figura 8B. Una capa de aislamiento 3 se puede obtener mediante la evaporación de SiO_{2} u otro material aislante. Las entidades biológicas marcadas magnéticamente 7 se localizan entre las estructuras ferromagnéticas. La carga electrónica se puede aplicar a continuación para mejorar la especificidad de la unión inmunoespecífica, el cambio de la orientación de la entidad biológica capturada según su polaridad electrónica, o para modificar las propiedades de la entidad (por ejemplo, para "explotarla") aplicando una carga electrónica a los conductores. Las entidades biológicas se pueden estudiar antes y/o después de la aplicación de cargas electrónicas.

IV. Superficies de cámara porosas para la retirada de partículas en exceso

Cuando se procesan grandes volúmenes iniciales de muestras de fluido y se reducen a volúmenes menores mediante separación magnética, la concentración de las partículas de marcar magnético con tamaño de nanómetro (<200 nm) aumenta de manera proporcional. La superficie de recogida en las cámaras tiene una capacidad limitada para capturar partículas magnéticas en exceso no unidas, y estas partículas pueden interferir con el posicionamiento y la observación de las entidades biológicas marcadas magnéticamente. Una disposición para separar partículas marcadas magnéticamente en exceso no unidas a partir de las entidades biológicas marcadas magnéticamente se muestra en la figura 9. La cámara de recogida comprende un compartimento externo 1 y un compartimento interno 2. La muestra de fluido que contiene partículas magnéticas no unidas 3 y entidades biológicas marcadas y no marcadas magnéticamente 4 se coloca en el compartimento interno 2. Por lo menos una superficie 5 de la cámara interna es porosa, por ejemplo, una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro entre 0,5 y 2 \mum. Nanopartículas magnéticas pueden pasar a través de los poros, pero las células marcadas magnéticamente mayores no pueden. La superficie opuesta en la cámara interna 6 consiste en una superficie transparente con o sin estructuras de recogida ferromagnéticas, tal como se ha descrito anteriormente.

Después de que la cámara interna se llena con la muestra de fluido, la cámara externa se llena con un tampón. El recipiente se coloca a continuación entre los dos imanes, tal como se muestra en la figura 9B. La cámara se coloca de manera que respectivas porciones laterales del recipiente se extienden en la región de gradiente magnético en hileras. Las partículas magnéticas no unidas se transportan mediante el gradiente magnético a través de la membrana (5) y hacia respectivas regiones laterales 8 de la cámara externa (1). Este movimiento es consistente con las líneas de campo de gradiente magnético mostradas en la figura 1B. La acumulación lateral de las partículas se ve ayudado de una manera efectiva mediante el movimiento horizontal de esas nanopartículas que primero corte en la superficie y a continuación se deslizan a lo largo de la superficie de deslizamiento (7').

Las entidades biológicas marcadas magnéticamente, tales como las células, también se mueven según las líneas de gradiente (9) hasta que alcanzan la membrana, mientras que las entidades biológicas no magnéticas se acumulan en el fondo bajo la influencia de la gravedad. Después de la separación de las partículas unidas está completa, la cámara se retira del separador magnético y se invierte (10). La cámara segunda coloca en la región de gradiente uniforme para optimizar la homogeneidad de la distribución de las células en la superficie de recogida, figura 9C. Las células marcadas magnéticamente se mueven hacia la superficie ópticamente transparente (6) (indicadas con 11 en la figura 9B y 14 en la figura 9C), mientras que las entidades biológicas no magnéticas se acumulan en la membrana (5) bajo la influencia de la gravedad. Las nanopartículas magnéticas libres se mueven verticalmente hacia la superficie 6. Las nanopartículas magnéticas libres ya no están presentes en la trayectoria de observación, y las entidades biológicas marcadas magnéticamente se pueden examinar. El sistema descrito anteriormente es especialmente adecuado para aplicaciones en las cuales el número de células objetivo es bajo, para evitar la obturación de la membrana.

V. Variación longitudinal de la altura de la cámara

La altura de la cámara en relación con la concentración de la entidad objetivo determina la densidad de la distribución de las entidades objetivo recogidas en la superficie de recogida de un recipiente, tal como se ha descrito anteriormente. Para aumentar el rango de densidades de recogida de la superficie que son aceptables para precisar la cuenta y el análisis, uno puede variar la altura de la cámara para eliminar la necesidad de diluir o concentrar la muestra, para el análisis de las muestras donde la concentración puede variar muy ampliamente. En la figura 10A, se muestra una sección transversal de una cámara con una superficie de recogida 1, y seis compartimentos que tienen diferentes alturas. Las células objetivo se colocan de manera aleatoria en la cámara. En la figura 10B, se muestra la misma sección transversal, pero ahora las células se han movido a la superficie de recogida bajo la influencia del gradiente magnético. En el área con una mayor profundidad de la cámara, la densidad de las células es demasiado alta para medir de una manera precisa, mientras que en el área con menor profundidad de la cámara están presentes pocas células para proporcionar una cuenta celular precisa. Para ilustrar también este principio, un histograma de la densidad celular a lo largo de la superficie de recogida se muestra en la figura 11C. Véase que el número de células en el área con la mayor densidad esta subestimado. La aproximación aquí descrita aumenta el rango de concentraciones que se pueden medir de una manera precisa, comparadas con las mediciones del número de células utilizadas tradicionalmente en analizadores de hematología y citómetros de flujo.

VI. Diferentes compartimentos en la cámara

Diferentes tipos de entidades objetivo presentes en diferentes densidades pueden estar presentes en la muestra. Para permitir análisis múltiples simultáneos, las cámaras pueden estar hechas con múltiples compartimentos. Un ejemplo de este tipo de cámara se muestra en la figura 11A. La superficie de recogida 1 y dos compartimentos separados 2 y 3 en estas cámaras permiten el uso de una serie diferente de reagentes. En el caso de que las áreas en la cámara no estén separadas mediante una pared, tal como se muestra con 4 en la figura 11B, los reagentes utilizados moverán todos los tipos de células marcadas magnéticamente a la parte superior. Un ejemplo es, por ejemplo, el uso simultáneo de un ferrofluido de leucocitos específico y específico de plaquetas. La densidad de las plaquetas es considerablemente mayor que la de los leucocitos, y así la medición de las plaquetas se debería hacer en la parte poco profunda de la cámara (que puede tener una separación lineal relativamente pequeña sobre la superficie de recogida) y la medición de los leucocitos se podría realizar en la parte más profunda de la cámara (que podría tener una separación de línea relativamente más grande sobre la superficie de recogida), tal como la disposición mostrada en la figura 3D.

Los términos y expresiones que se han utilizado se usan como términos descripción y no de limitación. No hay ninguna intención en el uso de estos términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o de cualquier porción de las mismas. Por lo tanto, se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención tal como se reivindica.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5985153 A [0002]

Claims

1. Aparato para observar entidades microscópicas que responden magnéticamente suspendidas en un medio fluido, que comprende:

un recipiente que tiene una pared transparente; si una cámara formada en su interior para contener el medio fluido;

una estructura de captura ferromagnética soportada sobre la superficie interior de la pared transparente; y medios magnéticos para inducir un gradiente magnético interno en la proximidad de la estructura de captura ferromagnética, con lo cual las entidades que responden magnéticamente si inmovilizan a lo largo de la pared adyacente a la estructura de captura;

caracterizado por el hecho de que la estructura de captura ferromagnética comprende una pluralidad de elementos ferromagnéticos que tienen una separación no uniforme entre elementos adyacentes.

2. Aparato según la reivindicación 1, en el que la estructura de captura ferromagnética comprende una pluralidad de elementos lineales separados mediante separaciones que tienen por lo menos dos anchuras de separación diferentes.

3. Aparato según la reivindicación 1, en el que la estructura de captura ferromagnética comprende una pluralidad de elementos alargados paralelos, y en el que la separación entre los elementos adyacentes varía a lo largo del eje longitudinal de los elementos alargados.

4. Aparato según la reivindicación 1, en el que la estructura de captura ferromagnética comprende una pluralidad de elementos alargados paralelos que tienen salientes laterales formados a lo largo de su longitud.

5. Aparato para salvar entidades microscópicas que responden magnéticamente suspendidas en un medio fluido, que comprende:

un recipiente que tiene una pared transparente y una cámara formada en su interior para contener el medio fluido;

una estructura de captura ferromagnética soportada sobre la superficie interior de la pared transparente; y medios magnéticos para inducir un gradiente magnético interno en la proximidad de la estructura de captura ferromagnética, con lo cual las entidades que responden magnéticamente se inmovilizan a lo largo de la pared adyacente a la estructura de captura;

caracterizado por el hecho de que la estructura de captura ferromagnética comprende una fila de dos dimensiones de depósitos discretos de material ferromagnético.

6. Aparato según la reivindicación 5, en el que en los depósitos son substancialmente en forma de V, formando áreas de recogida substancialmente triangulares entre los mismos.

7. Aparato según la reivindicación 5, en el que los depósitos forman una rejilla rectilínea de islas substancialmente rectangulares de material ferromagnético.

8. Aparato según la reivindicación 7, en el que la separación entre las islas respectivas a lo largo de un eje rectilíneo difiere de la separación a lo largo del otro eje rectilíneo.

9. Aparato según la reivindicación 5, en el que la fila de dos dimensiones de depósitos discretos está configurada para tener una geometría no uniforme para alinear de manera centrada dichas entidades microscópicas.