ES2313962T3 - Antigenos de cryptoosporidium parvun, anticuerpos dirigidos contra ellos y composiciones terapeuticas y de diagnostico basadas en los mismos. - Google Patents
Antigenos de cryptoosporidium parvun, anticuerpos dirigidos contra ellos y composiciones terapeuticas y de diagnostico basadas en los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2313962T3 ES2313962T3 ES01944811T ES01944811T ES2313962T3 ES 2313962 T3 ES2313962 T3 ES 2313962T3 ES 01944811 T ES01944811 T ES 01944811T ES 01944811 T ES01944811 T ES 01944811T ES 2313962 T3 ES2313962 T3 ES 2313962T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- parvum
- polypeptide
- antibodies
- antibody
- immunogenic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un polipéptido inmunogénico aislado de C. parvum elegido entre el grupo formado por (a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, o un fragmento inmunogénico del mismo que contiene por lo menos 15 aminoácidos y (b) un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
Description
Antígenos de Cryptosporidium parvum,
anticuerpos dirigidos contra ellos y composiciones terapéuticas y de
diagnóstico basadas en los mismos.
La presente invención se refiere en general a
antígenos protozoicos y a genes que los codifican. Más en
particular, la presente invención se refiere a la clonación, la
expresión y la caracterización de polipéptidos del
Cryptosporidium parvum (C. parvum) y anticuerpos
dirigidos contra estos polipéptidos. La invención se refiere también
al uso de polipéptidos antigénicos y de anticuerpos en
composiciones terapéuticas y de diagnóstico.
El Cryptosporidium parvum (C.
parvum) es un protozoo coccidio que infecta una gran variedad de
vertebrados, incluidos los humanos. El C. parvum puede
adquirirse directamente por contacto entre animal y humano,
contacto entre humano y humano o indirectamente por contacto con
fómitos (objetos que contienen el patógeno y actúan como vectores
pasivos), agua y algunas veces el alimento; ver Current y col., N.
Engl. J. Med. 308, 1252-1257, 1983; Centros
de control de enfermedades, "Cryptosporidiosis among children
attending daycare centers - Georgia, Pennsylvania, Michigan,
California, New Mexico" 33, 599-601, 1984;
Wolfson y col., N. Engl. J. Med. 312,
1278-1281, 1995. La adquisición de la infección
tiene lugar por ingestión de oocistos, que se exquistan en la parte
superior del intestino delgado, liberando cuatro esporozoítos
infecciosos. Los esporozoítos penetran en el enterocito de
revestimiento y efectúan la reproducción sexual o asexual,
gametogonia y merogonia, respectivamente. Los productos de ambas
formas de reproducción son capaces de provocar una infección
persistente en el hombre, ver Navin y col., Rev. Infect. Dis.
6, 313-327, 1984.
Las reservas de C. parvum se hallan en
animales salvajes y domésticos, en especial en el ganado bovino
(Tzipori, Microbiol. Rev. 47, 84-96, 1983) y
este patógeno provoca pérdidas económicas importantes en las
explotaciones ganaderas. Las manifestaciones clínicas de la
infección del C. parvum pueden incluir la diarrea acuosa,
dolor convulsivo abdominal epigástrico, absorción deficiente de
nutrientes y pérdida de peso, anorexia y malestar. La enfermedad
normalmente se autolimita en el hospedante inmunocompetente, pero
puede ser letal en un hospedante inmunodeficiente, en especial en
pacientes humanos de una infección avanzada del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), ver Current y col., (1983), lugar
citado; Wolfson y col., N. Engl. J. Med. 312,
1278-1281, 1985; Soave, Infect. Dis. Clin. N. Amer.
2, 485, 1988.
La ausencia de un sistema adecuado de cultivo
"in vitro" ha limitado en gran manera la investigación
del C. parvum. Además, el uso de modelos animales, en
particular con ratones, tiene una validez limitada, porque los
ratones adultos normalmente no son susceptibles de infectarse con el
C. parvum.
Diversos grupos han publicado la clonación y
caracterización de antígenos y genes de C. parvum aplicando
una gran variedad de técnicas, véase, p.ej., Jerkins y col., Infect.
Immun. 61, 2377-2382, 1993; Jenkins y col.,
Mol. Biochem. Parasitol. 71, 149-152, 1995;
Peterson y col., Infect. Immun. 60,
2343-2348, 1992; Ranucci y col., Infect. Immun.
61, 2347-2356, 1993.
Después de la infección natural se ha reconocido
una amplia variedad de proteínas criptosporidianas en sueros
humanos y animales inmunes, ver Ortega-Mora y col.,
Infect. Immun. 60, 3442-3445, 1992; Campbell
y col., J. Clin. Microbiol. 18, 165-169,
1983; Whitmire y col., Infect. Immun. 59,
990-995, 1991; Nina y col., Infect. Immun.
60, 1509-1513, 1992; Peeters y col., Infect.
Immun. 60, 2309-2316, 1992. Los componentes
que constituyen la inmunidad protectora son desconocidos, aunque,
al igual que la mayoría de los protozoos coccidianos intracelulares
obligados, es probable que los brazos tanto celular como humoral de
la respuesta inmune desempeñen papeles importantes en la génesis de
la inmunidad protectora, ver Lillehoj y col., Parasit. Today
10, 10-16, 1994. Se ha descrito también el
uso de proteínas recombinantes de C. parvum en composiciones
de vacuna, véase p.ej. la patente US-5,591,434. Sin
embargo, no existe como consecuencia una terapia de vacunación
eficaz, debido tal vez a que los antígenos empleados en las vacunas
proceden de fuentes no humanas.
Se han efectuado también varios intentos de
identificación de anticuerpos que neutralicen la infección del
C. parvum. En estudio realizados con humanos, se ha observado
que el calostro bovino hiperinmune administrado por vía oral altera
la historia natural del C. parvum disminuyendo la excreción
de oocistos, reduciendo el nivel de diarrea y, en un número menor
de casos, eliminando el parásito de las heces, ver Tzipori y col.,
Br. Med. J. 293, 1276-1277, 1986; Nord y
col., (1989), "Treatment of AIDS associated cryptosporidiosis with
hyperimmune colostrum from cows vaccinated with
Cryptosporidium", Quinta Conferencia Internacional del
SIDA, Montreal, Quebec, mayo de 1989; Ungar y col., Gastroenterology
98, 486-489, 1990. Se han caracterizado
varios antígenos reconocidos por los sueros después de la infección
natural y se ha demostrado que son dianas de los anticuerpos
neutralizadores del sistema murino, ver Arrowood y col., Infect.
Immun. 57, 2283-2288, 1989; Bjomeby y col.,
Infect. Immun. 59, 1172-1176, 1991; Doyle y
col., Infect. Immun. 61, 4079-4084, 1993;
Riggs y col., J. Immunol. 143, 1340-1345,
1989; Peterson y col., Infect. Immun. 60,
2343-2348, 1992. Sin embargo, los estudios animales
del modelo murino de infección indican solamente un rol protector
parcial, cuando estos anticuerpos se administran por vía oral.
Por lo tanto continúa habiendo necesidad de
identificar anticuerpos útiles para composiciones terapéuticas y de
diagnóstico y de identificar antígenos del C. parvum que
reaccionen con sueros humanos y de composiciones terapéuticas y de
diagnóstico y de métodos para utilizar estos antígenos.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de genes que codifican a polipéptidos antigénicos de
C. parvum, la caracterización de estos polipéptidos y de
anticuerpos que reconocen epítopes de estos polipéptidos. Se han
producido por métodos recombinantes las proteínas codificadas por
los genes y estos polipéptidos, fragmentos inmunogénicos y análogos
de los mismos y/o proteínas quiméricas que los incluyen, pueden
utilizarse, solos o en combinación con otros antígenos de C.
parvum, en nuevas vacunas subunitarias para proporcionar
protección contra la infección criptosporidiana en sujetos
mamíferos. Los anticuerpos generados contra estas proteínas y/o
fragmentos de las mismas, solos o en combinación con otros agentes
terapéuticos, pueden emplearse en los nuevos agentes terapéuticos
para sujetos mamíferos. Además, los antígenos y anticuerpos pueden
utilizarse para el diagnóstico.
Por consiguiente, en una forma de ejecución, la
presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido
nucleico, que contiene una secuencia codificadora de un polipéptido
antigénico inmunogénico de C. parvum elegido entre el grupo
formado por (a) un polipéptido antigénico de C. parvum AG1 y
(b) un polipéptido antigénico de C. parvum AG2 o un
fragmento de la molécula de ácido nucleico que contiene por lo menos
15 nucleótidos.
En formas de ejecución adicionales, la invención
se refiere a vectores recombinantes, incluidas las moléculas de
ácido nucleico, a células hospedantes transformadas con estos
vectores y métodos recombinantes de producción de polipéptidos
antigénicos de C. parvum.
En otras formas de ejecución adicionales, la
presente invención se refiere a composiciones de vacuna que
contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido
antigénico inmunogénico de C. parvum elegido entre el grupo
formado por (a) un polipéptido antigénico de C. parvum AG1,
(b) un polipéptido antigénico de C. parvum AG2 y (c) un
fragmento inmunogénico de (a) o (b) que contiene por lo menos 5
aminoácidos, así como a métodos para la fabricación de las
composiciones de vacuna.
En otras formas de ejecución, la invención se
refiere a composiciones terapéuticas que contienen un vehículo
farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo (p.ej. el anticuerpo
monoclonal 1101 ó 222) que reconoce a un polipéptido antigénico
inmunogénico de C. parvum elegido entre el grupo formado por
(a) un polipéptido antigénico de C. parvum AG1, (b) un
polipéptido antigénico de C. parvum AG2 y (c) un fragmento
inmunogénico de (a) o (b) que contiene por lo menos 5 aminoácidos,
así como a métodos de fabricación de las composiciones
terapéuticas.
En otras formas de ejecución adicionales, la
presente invención se refiere a métodos de tratamiento o prevención
de infecciones de C. parvum en un sujeto mamífero. El método
consiste en administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente
eficaz de la vacuna o composiciones terapéuticas recién
nombradas.
En formas de ejecución adicionales, la invención
se refiere a métodos de detección de anticuerpos de C.
parvum en una muestra biológica que consiste en:
(a) aportar una muestra biológica;
(b) hacer reaccionar la muestra biológica con un
polipéptido antigénico de C. parvum elegido entre el grupo
formado por (a) un polipéptido antigénico de C. parvum AG1,
(b) un polipéptido antigénico de C. parvum AG2 y (c) un
fragmento inmunogénico de (a) o (b) que contiene por lo menos 5
aminoácidos, en condiciones tales que permitan a los anticuerpos de
C. parvum, si están presentes en la muestra biológica,
fijarse sobre el polipéptido antigénico de C. parvum para
formar un complejo de antígeno/anticuerpo; y
(c) detectar la presencia o ausencia del
complejo,
detectando para ello la presencia o ausencia de
anticuerpos de C. parvum en la muestra.
En formas de ejecución adicionales, la invención
se refiere a métodos de detección de antígenos de C. parvum
en una muestra biológica que consisten en:
(a) aportar una muestra biológica;
(b) hacer reaccionar la muestra biológica con un
anticuerpo que reconoce a un polipéptido antigénico de C.
parvum elegido entre el grupo formado por (a) un polipéptido
antigénico de C. parvum AG1, (b) un polipéptido antigénico
de C. parvum AG2 y (c) un fragmento inmunogénico de (a) o (b)
que contiene por lo menos 5 aminoácidos, en condiciones tales que
permitan que los antígenos de C. parvum, si están presentes
en la muestra biológica, se fijen sobre el anticuerpo de C.
parvum para formar un complejo de antígeno/anticuerpo; y
(c) detectar la presencia o ausencia del
complejo,
detectando para ello la presencia o ausencia de
antígenos de C. parvum en la muestra.
En otras formas de ejecución adicionales, la
invención se refiere a un kit de ensayo de inmunodiagnóstico para
detectar la infección de C. parvum. El kit de ensayo consta
de un polipéptido antigénico de C. parvum elegido entre el
grupo formado por (a) un polipéptido antigénico de C. parvum
AG1, (b) un polipéptido antigénico de C. parvum AG2 y (c) un
fragmento inmunogénico de (a) o (b) que contiene por lo menos 5
aminoácidos, e instrucciones para la realización del ensayo de
inmunodiagnóstico. La invención se refiere además a kits de ensayo
de inmunodiagnóstico que contienen un anticuerpo que reconoce a un
polipéptido antigénico de C. parvum elegido entre el grupo
formado por (a) un polipéptido antigénico de C. parvum AG1,
(b) un polipéptido antigénico de C. parvum AG2 y (c) un
fragmento inmunogénico de (a) o (b) que contiene por lo menos 5
aminoácidos, e instrucciones para la realización de este ensayo de
inmunodiagnóstico.
Estas y otras formas de ejecución de la presente
invención resultarán palmarias para los expertos en la materia a la
vista de la presente descripción.
En las figuras 1A-1B se
representan la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) y la
correspondiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2) del C.
parvum AG1.
En las figuras 2A-2B se
representa la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:3) y la
correspondiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:4) del C.
parvum AG2.
En las figuras 3A y 3B se representan gráficas
"immunoblots" de anticuerpos humanos purificados por afinidad
y del anticuerpo monoclonal 1101 dirigido contra proteínas
criptosporidianas totales, solubles e insolubles. En la figura 3A
se representa que los anticuerpos humanos reconocen una banda débil
de proteína total de aproximadamente 22 kDa. El anticuerpo
monoclonal 1101 reconoce una banda de 22 kd (figura 3B, pista 1) de
proteína criptosporidiana insoluble y en la figura 3B, pista 2, se
representa que el 1101 reconoce tres bandas (22, 32 y 96 kDa) de la
proteína criptosporidiana soluble.
En las figuras 4A y 4B se representan gráficas
"immunoblots" de anticuerpos humanos purificados por afinidad
y del anticuerpo monoclonal 222 dirigido contra proteínas
criptosporidianas totales, solubles e insolubles. En la figura 4A
se representa que los anticuerpos humanos reconocen tres bandas de
proteína total de aproximadamente 17, 34 y 84 kDa. El anticuerpo
monoclonal 222 no reconoce bandas (figura 4B, pista 1) en la
proteína criptosporidiana insoluble y cinco bandas de
aproximadamente 6, 10, 22, 34 y 84 kDa en la proteína
criptosporidiana soluble (figura 4B, pista 2).
En las figuras 5A-5F se
representa la inmunolocalización en oocistos y esporozoítos de C.
parvum de antígenos reconocidos por los anticuerpos
monoclonales (mAbs) 1101, 222 y JB1. En la figura 5A se representa
que el JB1 (dirigido contra la integrina humana) no marca
específicamente las preparaciones del portaobjetos. En la figura 5B
se representa que el mAb 1101 (dirigido contra el AG1) tiñe
intensamente un modelo difuso de oocistos individuales y de pares
de oocistos. En la figura 5C se representa que el mAb 222 (dirigido
contra el AG2) tiñen los oocistos individuales y aglomerados en un
modelo de tipo circular. En la figura 5D se representa que los
esporozoítos no son visualizable cuando e tiñen con el JB 1. En la
figura 5E se representa que el mAb 1101 tiñe esporozoítos en un
modelo de tinción uniforme y en la figura 5F se representa que el
mAb 222 detecta esporozoítos en un modelo intenso.
En la figura 6 se representa el efecto de
aumentar las concentraciones de los mAbs 1101 y 222 frente a un
control de mAb 2F12 en la invasión de esporozoítos de las células
HT-29.
En la figura 7 se representa el efecto de
combinaciones de mAbs 1101 y 222 en la invasión de esporozoítos de
las células HT-29.
Para la práctica de la presente invención se
emplearán, si no se indica lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular, microbiología, tecnología de DNA recombinante e
inmunología, que pertenecen a los conocimientos técnicos estándar.
Estas técnicas se describen ampliamente en la bibliografía técnica,
véase, p.ej. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, vol. I, II y III, segunda edición (1989); Perbal,
B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow, E., y
col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY (1988); la serie: Methods in Enzymology (S.
Colowick y N. Kaplan, coordinadores, Academic Press, Inc.); y
Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV (D.M.
Weir y C.C. Blackwell, coordinadores., 1986, Blackwell Scientific
Publications).
A lo largo del texto se emplean las siguientes
abreviaturas de aminoácidos:
- alanina: Ala (A)
- arginina: Arg (R)
- asparagina: Asn (N)
- ácido aspártico: Asp (D)
- cisteína: Cys (C)
- glutamina: Gln (Q)
- ácido glutámico: Glu (E)
- glicina: Gly (G)
- histidina: His (H)
- isoleucina: Ile (I)
- leucina: Leu (L)
- lisina: Lys (K)
- metionina: Met (M)
- fenilalanina: Phe (F)
- prolina: Pro (P)
- serina: Ser (S)
- treonina: Thr (T)
- triptófano: Trp (W)
- tirosina: Tyr (Y)
- valina: Val (V)
Para describir la presente invención se
emplearán los términos siguientes, cuyo significado se define a
continuación.
Conviene hacer notar que, tal como se emplean en
esta descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas
singulares "un", "una" y "el" o "la" incluyen a
los referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente
lo contrario. Por ejemplo, la referencia "un polipéptido de C.
parvum" incluye las mezclas de dos o más proteínas de este
tipo y similares. Además, las secuencias de polipéptidos o
nucleótidos derivados no tienen que derivarse físicamente del
organismo o gen de interés, sino que pueden generarse por otros
métodos, incluida por ejemplo la síntesis química, el aislamiento
(p.ej. de C. parvum) o por producción recombinante, basándose
en la información aquí facilitada. Además, el término abarca
también a proteínas que tienen secuencias de aminoácidos
sustancialmente homólogas (que se definen a continuación) a las
secuencias contiguas de aminoácidos codificados por los genes, que
despliegan actividad inmunológica y/o se reconocen en una muestra
biológica obtenida de un sujeto infectado.
Por tanto, los términos "polipéptido" y
"proteína" se emplean indistintamente para indicar secuencias
de longitud completa, así como secuencias inmunogénicas truncadas y
parciales y análogos y formas precursoras activos de los
polipéptidos. De igual manera, los términos "polinucleótido" y
"secuencia de nucleótidos" se emplean indistintamente para
indicar fragmentos de nucleótido del gen, que incluyen por lo menos
unos 8 pares de bases contiguos, con mayor preferencia por lo menos
unos 10-20 pares de bases contiguos (o cualquier
valor intermedio), y con preferencia especial por lo menos de 25 a
50 (o cualquier valor intermedio) o más pares de bases contiguos
del gen. Tales fragmentos son útiles como sondas y en métodos de
diagnóstico, que se describen a continuación con mayor detalle.
Los términos incluyen también a los polipéptidos
en forma neutra o en forma de sales de adición de base o de ácido,
en función del modo de obtención. Tales sales de adición de ácido
pueden contener grupos amino libres y las sales de bases pueden
formarse con grupos carboxilo libres. Las sales de adición de base o
de ácido farmacéuticamente aceptables se describen a continuación
con más detalle. Además, las proteínas pueden modificarse por
combinación con otros materiales biológicos, tales como lípidos
(tanto los que tienen su origen natural en la molécula, como otros
lípidos que no destruyen su actividad inmunológica) y sacáridos, o
por modificación de la cadena lateral, por ejemplo por acetilación
de grupos amino, fosforilación de cadenas laterales hidroxilo,
oxidación de grupos sulfhidrilo, glucosilación de restos aminoácido,
así como otras modificaciones de la secuencia primaria
codificada.
codificada.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
invención abarcan, por tanto, deleciones, adiciones y sustituciones
de la secuencia, en el supuesto de que el producto polipéptido
funciones para producir una respuesta inmunológica, tal como se
define aquí. En este sentido, las sustituciones especialmente
preferidas serán de naturaleza conservadora, es decir, aquellas
sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos.
Por ejemplo, los aminoácidos se dividen por lo general en cuatro
familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina,
arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina,
isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4)
polares sin carga: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina,
treonina, tirosina. Algunas veces, la fenilalanina, triptófano y
tirosina se clasifican como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es
razonablemente previsible que una sustitución aislada de leucina
por isoleucina o valina, o viceversa; de aspartato por glutamato, o
viceversa; de treonina por serina, o viceversa; o una sustitución
conservadora similar de un aminoácido por un aminoácido
estructuralmente afín, no tenga consecuencias importantes en la
actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la
misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero
presentan sustituciones menores de aminoácidos que no afectan
sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína, están
incluidas, por tanto, dentro de la definición del polipéptido de
referencia. Por ejemplo, las moléculas que tienen de 20 a 15
sustituciones por 100 aminoácidos, o menos de 10 sustituciones por
100 aminoácidos, o entre 5 y 3 sustituciones por 100 aminoácidos y
que conservan su actividad biológica (p.ej. la inmunogenicidad)
están incluidas dentro de esta definición.
Una molécula "aislada" de ácido nucleico es
una molécula de ácido nucleico separada y discreta del conjunto del
organismo, con el que la molécula se halla en la naturaleza; o una
molécula de ácido nucleico carente de todas o de una parte de las
secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una
secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero que tiene
secuencias heterólogas (que se definen a continuación) asociadas
con ella.
Se entiende por "composición de vacuna
subunitaria" una composición que contiene por lo menos un
polipéptido inmunogénico, aunque no todos los antígenos, derivados
de u homólogos a un antígeno de un patógeno de interés. Dicha
composición está sustancialmente libre de células o partículas
intactas de patógeno, o de lisado de tales células o partículas.
Por consiguiente, una "composición de vacuna subunitaria" se
fabrica con polipéptidos inmunogénicos del patógeno, por lo menos
parcialmente purificados (con preferencia sustancialmente
purificados) o con análogos recombinantes de los mismos. Una
composición de vacuna subunitaria puede contener el antígeno o los
antígenos subunitarios de interés sustancialmente libres de otros
antígenos o polipéptidos del patógeno.
El término "epítope" indica el sitio de un
antígeno o hapteno, al que responden las células B y/o las células
T específicas. El término se emplea también indistintamente con
"determinante antigénico" o "sitio determinante
antigénico". Los anticuerpos que reconocen al mismo epítope
pueden identificarse en un inmunoensayo simple que desvele la
capacidad de un anticuerpo de bloquear la fijación de otro
anticuerpo sobre un antígeno diana.
Una "respuesta inmunológica" a una
composición o vacuna es el desarrollo en el hospedante de una
respuesta inmune celular y/o mediada por el anticuerpo a la
composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta
inmunológica" incluye, pero no se limita a uno o más de los
efectos siguientes: la producción de anticuerpos, células B,
células helper T, células supresoras T y/o células citotóxicas y/o
células T \alpha\delta, dirigidas específicamente a un antígeno
o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Con
preferencia, el hospedante desplegará una respuesta inmunológica
terapéutica o protectora, de modo que se amplíe su resistencia a la
nueva infección y/o se reduzca la severidad clínica de la
enfermedad. Dicha protección se demostrará con una reducción o
desaparición de los síntomas presentados normalmente por un
hospedante infectado y/o por un tiempo de recuperación más
corto.
Los términos proteína o polipéptido
"inmunogénicos" indican una secuencia de aminoácidos que genera
una respuesta inmunológica recién descrita. Una proteína o
polipéptido "inmunogénicos", tal como se emplea aquí, incluye
la secuencia de longitud completa de los polipéptidos del C.
parvum en cuestión, con o sin secuencias de señal, dominios de
anclaje a membrana, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos
de la misma. Se entiende por "fragmento inmunogénico" un
fragmento que incluye uno o más epítopes y de este modo genera una
respuesta inmunológica, ya descrita antes. Tales fragmentos pueden
identificarse aplicando un gran número de métodos de mapeo de
epítopes, bien conocidos en la técnica, véase p.ej. Epitope Mapping
Protocols, en: Methods in Molecular Biology, vol. 66, (Glenn E.
Morris, coord., 1996), Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por
ejemplo, los epítopes lineales pueden determinarse por síntesis
concurrente de un gran número de péptidos en soportes sólidos, los
péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína y
por reacción de los péptidos con anticuerpos, cuando los péptidos
están todavía fijados sobre los soportes. Estos métodos son
conocidos en la técnica y se han descrito p.ej. en la patente
US-4,708,871; Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 3998-4002, 1984; Geysen y col.,
Molec. Immunol. 23, 709-715, 1986. De manera
similar, los epítopes conformacionales se identifican con facilidad
determinando la conformación espacial de los aminoácidos, p.ej. por
cristalografía de rayos X y por resonancia magnética nuclear
bidimensional, véase p.ej. Epitope Mapping Protocols, lugar citado.
También pueden identificarse las regiones antigénicas de las
mediante gráficas estándar de antigenicidad e hidropatía, por
ejemplo las calculadas con el programa informático Omiga, versión
1.0 desarrollado por el Oxford Molecular Group. Este programa
informático se basa en el método de Hopp/Woods, Hopp y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828, 1981,
para determinar los perfiles de antigenicidad y en la técnica
Kyte-Doolittle, Kyte y col., J. Mol. Biol.
157, 105-132, 1982, para las gráficas
de
hidropatía.
hidropatía.
Para los fines de la presente invención, los
fragmentos inmunogénicos incluirán normalmente por lo menos unos 3
aminoácidos, con preferencia por lo menos unos 5 aminoácidos, con
mayor preferencia por lo menos unos 10-15
aminoácidos y con preferencia especial 25 ó más aminoácidos de la
molécula antigénica original de C. parvum. No hay un límite
superior crítico para la longitud del fragmento, que puede situarse
entre casi la longitud total de la secuencia de la proteína e
incluso una proteína de fusión que tenga dos o más epítopes de AG1
y/o AG2.
Las proteínas o polipéptidos "nativos"
indican proteínas o polipéptidos aislados de la fuente, de la que
proceden las proteínas de origen natural. Los polipéptidos
"recombinantes" indican polipéptidos producidas por técnicas
de DNA recombinante; es decir, producidas a partir de células
transformadas mediante un constructo exógeno de DNA que codifica al
polipéptido deseado. Polipéptidos "sintéticos" son los
obtenidos por síntesis química.
Un "vector" es un replicón, por ejemplo un
plásmido, un fago o un cósmido, al que puede unirse otro segmento
de DNA de modo que se pueda realizar la replicación del segmento
unido.
Una "secuencia codificadora" de DNA o una
"secuencia de nucleótidos que codifica" a una proteína concreta
es una secuencia de DNA, que se transcribe y traduce al polipéptido
"in vitro" o "in vivo", cuando se coloca
bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los límites de
la secuencia codificadora vienen determinados por el codón de
inicio del extremo 5' (amino) y un codón de paro de la traducción en
el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir,
aunque no se limita a ello: secuencias procariotas, el cDNA del
mRNA eucariota, secuencias de DNA genómico de DNA eucariota (p.ej.
de mamífero) e incluso secuencias de DNA sintético. Una secuencia
de terminación de transcripción estará situada normalmente en la
posición 3' de la secuencia codificadora.
Los "elementos de control" del DNA indican
colectivamente los promotores, sitios de fijación de ribosoma,
señales de poliadenilación, secuencias de terminación de
transcripción, dominios reguladores en posición ascendente
(up-stream), ampliadores y similares, que colaboran
colectivamente en la transcripción y traducción de una secuencia
codificadora a una célula hospedante. No todas estas secuencias de
control necesitan siempre estar presentes en un vector
recombinante, en el supuesto de que el gen deseado sea capaz de
transcribirse y traducirse.
"Unido operativamente" significa una
disposición de elementos, en la que los componentes así descritos
están configurados de manera que puedan realizar su función
habitual. Por ejemplo, los elementos de control unidos
operativamente a una secuencia codificadora son capaces de efectuar
la expresión de la secuencia codificadora. Los elementos de control
no tienen que ser contiguos a la secuencia codificadora, en el
supuesto de que funcionen para dirigir la expresión de la misma.
Por tanto, por ejemplo, las secuencias intervinientes transcritas
todavía sin traducir pueden estar presentes entre un promotor y la
secuencia codificadora y el promotor puede seguir considerándose
"unido operativamente" a la secuencia codificadora.
Un elemento de control, por ejemplo un promotor,
"dirige la transcripción" de una secuencia codificadora en una
célula cuando la RNA-polimerasa se fija al promotor
y transcribe la secuencia codificadora al mRNA, que entonces se
traduce al polipéptido codificado por la secuencia codificadora.
Una "célula hospedante" es una célula que
puede transformarse o es capaz de transformación por acción de una
molécula de ácido nucleico exógeno.
Una célula se ha "transformado" por acción
del DNA exógeno cuando tal DNA exógeno se ha introducido dentro de
la membrana celular. El DNA exógeno puede integrarse o no (enlace
covalente) en el DNA cromosómico, formando el genoma de la célula.
En los procariotas y las levaduras, por ejemplo, el DNA exógeno
puede mantenerse en un elemento episómico, por ejemplo un plásmido.
En lo que respecta a las células eucariotas, una célula transformada
de modo estable es aquella, en la que el DNA exogéno se ha
integrado en el cromosoma, de modo que se hereda en las células
hijas por replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra
con la capacidad de la célula eucariota de establecer líneas
celulares o clones comprendidos en una población de células hijas
que contienen el DNA exógeno.
"Homología" indica la identidad porcentual
entre dos polinucleótidos o dos restos polipéptidos. Todas
secuencias de nucleótidos o dos secuencias de polipéptidos, son
"sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias
presentan una identidad de secuencia por lo menos del
80-85%, con preferencia por lo menos del 90% y con
preferencia especial por lo menos del 95%-98% a lo largo de una
longitud definida de las moléculas. Tal como se emplea aquí,
sustancialmente homólogo indica además secuencias que poseen una
identidad completa en el DNA especificado o en la secuencia de
polipéptido.
Se conocen en la técnica los métodos para
determinar la "identidad de secuencias" o la "homología de
secuencias" de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Por ejemplo,
dichos métodos consisten en la determinación de la secuencia de
nucleótidos del mRNA de un gen y/o en la determinación de la
secuencia de aminoácidos codificados por ella y en la comparación
de estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o de
aminoácidos. En general, "identidad" indica la correspondencia
exacta entre nucleótido y nucleótido o entre aminoácido y aminoácido
de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos,
respectivamente. Dos o más secuencias (polinucleótido o
aminoácidos) pueden compararse determinando su "identidad
porcentual". La identidad porcentual de dos secuencias, ya sean
secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos, es el
número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas
dividido por las secuencias más cortas y multiplicado por 100. Un
alineamiento aproximado de secuencias de ácido nucleico se puede
obtener con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman,
Advances in Applied Mathematics 2, 482-489,
1981. Este algoritmo puede aplicarse a secuencias de aminoácidos
empleando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of
Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff, coord., 5 supl. 3,
353-358, National Biomedical Research Foundation,
Washington, D.C., EE.UU., y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids
Res. 14(6), 6745-6763, 1986.
Un complemento ilustrativo de este algoritmo
para determinar la identidad porcentual de una secuencia es el
aportado por el Genetics Computer Group (Madison, WI) en la
aplicación de utilidad llamada "BestFit". Los parámetros por
defecto de este método se describen en el manual del programa
llamado Wisconsin Sequence Analysis Package Program, versión 8
(1995) (suministrado por el Genetics Computer Group, Madison, WI).
Otro método para establecer la identidad porcentual consiste en el
uso del paquete de programas informáticos MPSRCH, es propiedad de
la Unidad de Edimburgo, y ha sido desarrollado por John F. Collins y
Shane S. Sturrok y se distribuye a través de IntelliGenetics, Inc.
(Mountain View, CA). Con este conjunto de paquetes puede emplearse
el algoritmo de Smith-Waterman cuando se emplean
los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo,
penalización de laguna abierta: 12, penalización de extensión de
laguna: uno; y una laguna: seis). A partir de los datos generados,
el valor "coincidencia" (match) refleja la "identidad de
secuencias". En la técnica se conocen también otros programas
idóneos para calcular la identidad o similitud porcentual entre
secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es el BLAST,
empleado con parámetros por defecto. Por ejemplo el BLASTN y el
BLASTP pueden emplearse para determinar la identidad porcentual
tomando los siguientes parámetros por defecto: código genético =
estándar; filtro = ninguno; cepa = las dos; corte = 60; esperado =
10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; clasificación
por = puntuación alta (HIGH SCORE); bases de datos = no redundantes,
GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss
protein + Spupdate + PIR. Los detalles acerca de estos programas
podrán encontrarse en la siguiente dirección de internet:
http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Otro
ejemplo de determinación de la identidad porcentual consiste en
emplear el algoritmo de búsqueda de Smith-Waterman
(Time Logic, Incline Village, NV), con los parámetros ilustrativos
siguientes: matriz ponderada = nuc4x4hb; penalización de abertura
de laguna = 20, penalización de extensión de laguna = 5.
Como alternativa, para los nucleótidos, la
homología puede determinarse por hibridación de polinucleótidos en
condiciones tales que formen dúplex estables entre regiones
homólogas y posterior digestión con nucleasa(s)
específi-
ca(s) de hebras simples y determinación de los fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA, que son sustancialmente homólogas, pueden identificarse con un ensayo de hibridación de Southern, por ejemplo en condiciones restrictivas, del modo definido para este sistema particular. Por ejemplo, las condiciones restrictivas de hibridación pueden incluir 50% formamida, 5x solución de Denhardt, 5x SSC, 0,1% SDS y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y las condiciones de lavado pueden incluir 2x SSC, 0,1% SDS a 37ºC y después 1x SSC, 0,1% SDS a 68ºC. Los expertos en la materia podrán definir las condiciones apropiadas para la hibridación, véase p.ej. Sambrook y col., lugar citado; DNA Cloning, lugar citado; Nucleic Acid Hybridization, lugar citado. Para los aminoácidos, la homología puede determinarse por alineamiento de dos o más secuencias de aminoácidos (ya descrito antes) y determinación del número de sustituciones y/o deleciones. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas cuando se han realizado de 20 a 15 sustituciones o deleciones de aminoácidos por 100 aminoácidos, con mayor preferencia entorno a 10 sustituciones o deleciones de aminoácidos y con mayor preferencia todavía entre 5 y 3 sustituciones o deleciones de aminoácidos. Tal como se emplea aquí, sustancialmente homólogo indica también secuencias que presentan una identidad completa con el DNA o secuencia de polipéptido especificados.
ca(s) de hebras simples y determinación de los fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA, que son sustancialmente homólogas, pueden identificarse con un ensayo de hibridación de Southern, por ejemplo en condiciones restrictivas, del modo definido para este sistema particular. Por ejemplo, las condiciones restrictivas de hibridación pueden incluir 50% formamida, 5x solución de Denhardt, 5x SSC, 0,1% SDS y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y las condiciones de lavado pueden incluir 2x SSC, 0,1% SDS a 37ºC y después 1x SSC, 0,1% SDS a 68ºC. Los expertos en la materia podrán definir las condiciones apropiadas para la hibridación, véase p.ej. Sambrook y col., lugar citado; DNA Cloning, lugar citado; Nucleic Acid Hybridization, lugar citado. Para los aminoácidos, la homología puede determinarse por alineamiento de dos o más secuencias de aminoácidos (ya descrito antes) y determinación del número de sustituciones y/o deleciones. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas cuando se han realizado de 20 a 15 sustituciones o deleciones de aminoácidos por 100 aminoácidos, con mayor preferencia entorno a 10 sustituciones o deleciones de aminoácidos y con mayor preferencia todavía entre 5 y 3 sustituciones o deleciones de aminoácidos. Tal como se emplea aquí, sustancialmente homólogo indica también secuencias que presentan una identidad completa con el DNA o secuencia de polipéptido especificados.
Con el término "variante degenerada" se
indica un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia del
ácido nucleico, que codifica a un polipéptido que tiene la misma
secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el
polinucleótido del que se deriva la variante degenerada.
El término "funcionalmente equivalente"
indica que la secuencia de aminoácidos de un polipéptido antigénico
de C. parvum es tal que generará una respuesta inmunológica
sustancialmente equivalente o mejorada, del como se ha definido
antes, si se compara con la respuesta generada por un polipéptido
antigénico que tenga identidad con los polipéptidos AG1 y AG2, o
porciones inmunogénicas de los mismos. El término incluye además a
los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que generarán una
respuesta neutralizadora sustancialmente equivalente o ampliada u
otras respuestas terapéuticas, si se compara con la de los
anticuerpos monoclonales 1101 y 222. "1101" indica un
anticuerpo monoclonal concreto, ideado contra el polipéptido
antigénico de C. parvum denominado AG1. La generación y
caracterización del 1101 se describe en los ejemplos. De manera
similar, "222" indica un anticuerpo monoclonal concreto,
ideado contra el polipéptido antigénico de C. parvum
denominado AG2. La generación y caracterización del 222 se describe
en los ejemplos.
Una región "heteróloga" de un constructo de
DNA es un segmento identificable de DNA dentro o unido a otra
molécula de DNA, que no está en asociación con la otra molécula en
la naturaleza. Por tanto, si la región heteróloga codifica a un gen
bacteriano, el gen estará flanqueado normalmente por un DNA que no
blanquea al gen bacteriano en el genoma de la bacteria original.
Otro ejemplo de secuencia de codificación heteróloga es un
constructo, en el que la secuencia codificadora propiamente dicha no
se encuentra en la naturaleza (p.ej. secuencias sintéticas que
tienen codones diferentes de los del gen nativo). La variación
alélica o los acontecimientos mutacionales de origen natural no dan
lugar a una región heteróloga de DNA, tal como se emplea aquí.
Los términos "tratamiento" y
"terapéutico" se emplean aquí para indicar (i) la prevención de
una infección o reinfección (profilaxis), incluidas, por ejemplo,
las vacunas o (ii) la reducción o eliminación de los síntomas de la
enfermedad de interés (terapia).
Tal como se emplea aquí, una "muestra
biológica" indica una muestra de tejido o de líquido aislada de
un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, por ejemplo la
sangre, el plasma, el suero, la materia fecal, la orina, la médula
ósea, el líquido espinal, el líquido linfático, las muestras de
piel, las secreciones externas de la piel, los tractos
respiratorio, intestinal y genitourinario, las lágrimas, la saliva,
la leche, los glóbulos sanguíneos, los órganos, las biopsias y
también las muestras de constituyentes de cultivos celulares
"in vitro", incluyendo, pero sin limitarse a ello, los
medios de acondicionamiento resultantes del crecimientos de células
y de tejidos en el medio de cultivo, p.ej. las células recombinantes
y los componentes celulares.
Tal como se emplean aquí, los términos
"marcador" y "marcador detectable" indican una molécula
capaz de detectarse, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los
isótopos radiactivos, los compuestos fluorescentes,
quimioluminiscentes, las enzimas, los sustratos enzimáticos, los
co-factores enzimáticos, los inhibidores
enzimáticos, los cromóforos, los colorantes, los iones metálicos,
los soles metálicos, los ligandos (p.ej. biotina o haptenos) y
similares. El término "compuesto fluorescente" indica una
sustancia o porción de la misma que es capaz de emitir fluorescencia
en un intervalo detectable. Los ejemplos concretos de marcadores
que pueden utilizarse en la invención incluyen a la fluoresceína,
la rodamina, el dansilo, la umbeliferona, el rojo Texas, el luminol,
el NADPH y la
\alpha-\beta-galactosidasa.
Los términos "individuo" y "sujeto" se
emplean indistintamente para indicar cualquier miembro del subfilo
cordados, incluyendo, pero sin limitación, a los humanos y otros
primates, incluidos los primates no humanos, tales como chimpancés
y otras especies monos y simios; los animales domésticos, por
ejemplo vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; los mamíferos
domésticos tales como perros y gatos; los animales de laboratorio,
incluidos los roedores del tipo ratones, ratas y cobayas; las aves,
incluidas las domésticas, salvajes y de cacería, por ejemplo las
gallinas, las perdices y otras aves gallináceas, patos, ocas y
similares. Los términos no indican una edad concreta. Por tanto, se
incluyen tanto los adultos como los individuos recién nacidos. Los
métodos aquí descritos se destinan al uso en cualquiera de las
especies mencionadas de vertebrados.
Para la presente invención es fundamental el
descubrimiento de genes que codifican a dos polipéptidos antigénicos
de C. parvum (llamados "AG1" y "AG2",
respectivamente) y de anticuerpos dirigidos contra estos
polipéptidos, que se ha demostrado que poseen efectos
neutralizadores de la infección de C. parvum en sujetos
mamíferos. Se han aislado, secuenciado y caracterizado en
particular los genes del polipéptido antigénico de C. parvum
1 ("ag1") y del polipéptido antigénico de C. parvum 2
("ag2") y de ellos se han deducido las secuencias de proteína
del AG1 y AG2. Se han generado anticuerpos monoclonales contra las
proteínas producidas por métodos recombinantes y se ha demostrado
que tienen actividad neutralizadora contra los esporozoítos
infecciosos de C. parvum.
Las secuencias de cDNA y las previstas de los
aminoácidos de AG1 y AG2 se representan en las figuras
1A-1B y 2A-2B, respectivamente. Se
subrayan las señales de poliadenilación de consenso, perfecta e
imperfecta, y se marcan con negrita los sitios de
N-glucosilación. La secuencia de DNA del AG1 se
representa también en la SEQ ID NO:1, mientras que en la SEQ ID
NO:3 se representa la secuencia completa del DNA del AG2. Las
secuencias previstas de aminoácidos del AG1 y del AG2 se
representan en las SEQ ID NO:1 y 2 y en las SEQ ID NO:3 y 4,
respectivamente.
Tal como se describe en los ejemplos, el ag1 de
longitud completa, representado en las posiciones de nucleótido
8-394, inclusive, de la figura 1A, codifica una
proteína AG1 de longitud completa de aproximadamente 129
aminoácidos, representada en los aminoácidos 1-129,
inclusive, de la figura 1A (SEQ ID NO:2). La región 3' sin traducir
tiene una longitud de 945 nucleótidos, de la posición 395 a la 1338
de la figura 1A (SEQ ID NO:1). Las señales de poliadenilación
imperfecta se producen en las posiciones 1241-1245 y
1307-1311. A la secuencia se le ha asignado el
número de registro del GenBank Accession Number AF178459. La
proteína codificada por el marco de lectura abierto (ORF) previsto
tiene un peso molecular previsto de unos 15 kDa. El punto
isoeléctrico previsto es pH 9,6 y el 44% de los restos aminoácido
previstos con hidrófobos. Se han identificado dos sitios de
glucosilación unida a N en los restos aminoácido
36-38 y 71-73.
El ag2 de longitud completa, representado en las
posiciones de nucleótido 9-587, inclusive, de la
figura 1B, codifica a una proteína AG2 de longitud completa, de
aproximadamente 193 aminoácidos, representada en los aminoácidos
1-193, inclusive, de la figura 1B (SEQ ID NO:4). La
región 3' sin traducir tiene una longitud de 712 nucleótidos, va de
la posición 588 a la 1298 de la figura 1B (SEQ ID NO:2). Las señales
de poliadenilación imperfecta se producen en las posiciones
945-949 y 1141-1145. A esta
secuencia se le ha asignado el número de registro GenBank Accession
Number AF178460. La proteína codificada por el marco de lectura
abierto (ORF) previsto tiene un peso molecular previsto de aprox.
21,8 kDa. El punto isoeléctrico previsto es de pH 6,3 y un 36% de
los restos aminoácido previstos son hidrófobos. Se han identificado
dos sitios de glucosilación unidos a N en los restos aminoácidos
36-38 y 51-53.
Los polinucleótidos, péptidos antigénicos,
fragmentos inmunogénicos de los mismos o proteínas quiméricas de
C. parvum, incluidos uno o más epítopes de AG1 y AG2, pueden
integrarse, solos o en combinación, en composiciones de vacuna
subunitaria o en otras composiciones terapéuticas para tratar o
prevenir infecciones causadas por el C. parvum. De modo
similar, los anticuerpos generados contra el AG1 o el AG2, por
ejemplo los anticuerpos monoclonales 1101 y 222 y los anticuerpos
de reacción cruzada con ellos, pueden integrarse, solos o en
combinación, en composiciones para prevenir, tratar o neutralizar
infecciones causadas por el C. parvum.
Además del uso en composiciones terapéuticas,
las proteínas y fragmentos de las mismas, los anticuerpos contra
ellas y los polinucleótidos que las codifican pueden utilizarse como
reactivos de diagnóstico para detectar la presencia de la infección
en un sujeto mamífero. De igual manera, los polinucleótidos que
codifican a las proteínas pueden clonarse y utilizarse para diseñar
sondas para detectar y aislar genes homólogos en otros protozoos.
Por ejemplo, los fragmentos que contienen por lo menos
15-20 nucleótidos, con mayor preferencia por lo
menos 20-50 nucleótidos y con preferencia especial
unos 60-100 nucleótidos o más se emplearán en estas
formas de ejecución. Los polipéptidos antigénicos de C.
parvum pueden utilizarse también para purificar anticuerpos
destinados a diagnóstico y fines terapéuticos.
Los polipéptidos antigénicos de C. parvum
pueden utilizarse en composiciones de vacuna, solos o en combinación
antígenos bacterianos, fúngicos, víricos o de otros protozoos.
Estos antígenos pueden aportarse por separado o incluso como
proteínas de fusión que contienen uno o más epítopes de los
polipéptidos antigénicos fusionados juntos y/o con uno o más de los
antígenos recién nombrados. Pueden utilizarse, por ejemplo, otras
proteínas inmunogénicas del C. parvum en las composiciones
terapéuticas en cuestión.
Los anticuerpos dirigidos contra estos
polipéptidos pueden utilizarse como agentes terapéuticos.
Se ha demostrado que los anticuerpos 1101 y 222
tienen en cada caso un efecto neutralizador de la infección de
C. parvum.
Los polipéptidos antigénicos antes descritos y
los fragmentos activos, análogos y proteínas quiméricas derivadas
de los mismos, pueden producirse por un gran número de métodos. En
concreto, los polipéptidos pueden aislarse directamente de
protozoos (oocistos, esporozoítos o adultos) que expresen los
mismos, aplicando técnicas estándar de purificación, véase, p.ej.
Tilley y col., Infect. Immun. 59, 1002-1007,
1991. Después pueden purificarse las proteínas deseadas, p.ej. por
cromatografía de columna, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes u otros
métodos convencionales ya conocidos de la técnica.
Como alternativa, las proteínas pueden
producirse por métodos recombinantes del modo aquí descrito. Tal
como se ha mencionado antes, los productos recombinantes toman la
forma de secuencias parciales de proteína, secuencias de longitud
completa, formas precursoras que incluyen secuencias de señal,
formas maduras sin señales o incluso proteínas de fusión (p.ej. con
un guía apropiado para el hospedante recombinante, o con otra
secuencia subunitaria de antígeno del C. parvum o de otro
patógeno). Las secuencias que codifican a la ag1 y ag2 de la
presente invención pueden aislarse en base a la capacidad de los
productos proteicos de fijarse sobre los anticuerpos presentes en
una muestra infectada, aplicando ensayos de detección que se
describen a continuación. De este modo pueden construirse
bibliotecas de genes y los clones resultantes pueden utilizarse para
transformar una célula hospedante apropiada. Se recogen las
colonias y se exploran en busca de clones que tengan la capacidad
de fijarse sobre anticuerpos del C. parvum. Las colonias
pueden explorarse empleando sueros policlonales o anticuerpos
monoclonales dirigidos contra las proteínas del C.
parvum.
Como alternativa, una vez se han determinado las
secuencias de aminoácidos, se pueden preparar las sondas de
oligonucleótido que contienen los codones para una porción de
determinadas secuencias de aminoácidos y emplearse para explorar
las bibliotecas genómicas y de cDNA en busca de genes que codifiquen
a las proteínas de interés. Las estrategias básicas para obtener
sondas de oligonucleótido y bibliotecas de DNA así como para
explorarlas mediante la hibridación de ácido nucleico son bien
conocidas de los expertos en la materia, véase, p.ej., DNA Cloning:
vol. I, lugar citado; Nucleic Acid Hybridization, lugar citado;
Oligonucleotide Synthesis, lugar citado; Sambrook y col., lugar
citado.
Una vez se ha identificado un clon de la
biblioteca explorada por hibridación positiva, entonces puede
confirmarse por análisis con enzimas de restricción y secuenciación
de DNA que el inserto de la biblioteca concreta contiene una
secuencia de codifica a un polipéptido antigénico de C.
parvum o a un homólogo del mismo. Después pueden aislarse las
secuencias aplicando técnicas estándar y, si se desea, pueden
emplearse reacciones de PCR o enzimas de restricción para eliminar
porciones de la secuencia de longitud completa.
De modo similar pueden aislarse genes
directamente de protozoos aplicando técnicas conocidas, por ejemplo
la extracción con fenol y después puede manipularse la secuencia
para producir las alteraciones deseadas, véase, p.ej., Sambrook y
col., lugar citado, para la descripción de las técnicas que permiten
obtener y aislar el DNA.
Como alternativa, en lugar de clonarse pueden
obtenerse sintéticamente las secuencias de DNA que codifican a las
proteínas de interés. Las secuencias de DNA pueden diseñarse con los
codones apropiados para una secuencia concreta de aminoácidos. En
general se elegirán codones preferidos para el hospedante deseado,
si la secuencia tiene que emplearse para la expresión. Se ensambla
la secuencia completa de oligonucleótidos solapados, obtenida por
métodos estándar y se ensambla para obtener la secuencia
codificadora completa, véase, p.ej., Edge, Nature 292, 756,
1981; Nambair y col., Science 223, 1299, 1984; Jay y col., J.
Biol. Chem. 259, 6311, 1984.
Una vez se han obtenido y aislado las secuencias
codificadoras de las proteínas deseadas, se podrán clonar en
cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la materia
conocen numerosos vectores de clonación y la elección del vector
apropiado para la clonación es un tema de opción. Los ejemplos de
vectores de DNA recombinantes para la clonación y las células
hospedantes que pueden transformarse con ellos incluye al
bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli),
pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias
gram-negativas), pGV1106 (bacterias
gram-negativas), pLAFR1 (bacterias
gram-negativas), pME290 (bacterias
gram-negativas diferentes de la E. coli),
pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9
(Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6
(Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19
(Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de
mamíferos), véase, Sambrook y col., lugar citado; DNA Cloning, lugar
citado; B. Perbal, lugar citado.
Los genes pueden colocarse bajo el control de un
promotor, sitio de fijación de ribosoma (para la expresión
bacteriana) y, opcionalmente, un operador (aquí llamados
colectivamente elementos de "control"), de modo que la
secuencia de DNA que codifica a la proteína deseada se transcriba en
el RNA de la células hospedante transformada con un vector que
contiene este constructo de expresión.
La secuencia codificadora puede contener o no un
péptido de señal o una secuencia guía. Si se incluye una secuencia
de señal, esta podrá ser una secuencia homóloga nativa o una
secuencia heteróloga. Por ejemplo, la secuencia de señal para el
polipéptido antigénico concreto de C. parvum, puede
utilizarse para la secreción del mismo, al igual de muchas otras
secuencias de señal, bien conocidas en la técnica. Las secuencias
guía pueden eliminarse del hospedante por procesado
post-traduccional, véase, p.ej., las patentes
US-4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.
\newpage
Otras secuencias reguladoras pueden ser también
deseables, que permitan la regulación de la expresión de las
secuencias proteicas relativas al crecimiento de la célula
hospedante. Los expertos en la materia ya conocen las secuencias
reguladoras y sus ejemplos incluyen aquellas que provocan la
expresión de un gen que deberá activarse o desactivarse en
respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de
un compuesto regulador. En el vector pueden estar presentes además
otros tipos de elementos reguladores, por ejemplo secuencias de
ampliador.
Las secuencias de control y otras secuencias
reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificadora antes de la
inserción en el vector, por ejemplo en los vectores de clonación
mencionados antes. Como alternativa, la secuencia codificadora
puede clonarse directamente en un vector de expresión, que ya
contenga las secuencias de control y un sitio de restricción
apropiado.
En algunos casos puede ser necesario modificar
la secuencia codificadora de modo que pueda unirse a las secuencias
de control con una orientación apropiada, es decir, para mantener el
marco de lectura correcto. Puede ser también deseable producir
mutantes o análogos de los polipéptidos antigénicos. Los mutantes y
los análogos pueden obtenerse por deleción de una porción de la
secuencia codificadora de la proteína, por inserción de una
secuencia y/o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la
secuencia. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos,
por ejemplo la mutagénesis dirigida a un sitio, se han descrito,
p.ej., en Sambrook y col., lugar citado; DNA Cloning; lugar citado;
Nucleic Acid Hybridization, lugar citado.
Después se emplea el vector de expresión para
transformar una célula hospedante apropiada. Se conoce en la
técnica un gran número de líneas celulares de mamíferos y están
disponibles incluso líneas celulares inmortalizadas de la American
Type Culture Collection (ATCC), por ejemplo, pero sin limitarse a
ellas: las células de ovario de hámster chino (CHO), las células
HeLa, las células de riñón de hámster bebé (BHK), las células de
riñón de simio (COS), las células de carcinoma hepatocelular humano
(p.ej. Hep G2), las células de riñón bovino de
Madin-Darby ("MDBK"), y otras. De modo similar,
en los presentes constructos de expresión pueden utilizarse
hospedantes bacterianos, por ejemplo E. coli, Bacillus
subtilis y Streptococcus spp. Los hospedantes levadura
útiles para la presente invención incluyen, entre otros, el
Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans,
Candida maltosa, Hansenula polymorpha,
Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis,
Pichia guillerimondii, Pichia pastoris,
Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. Las
células de insectos para usar como vectores de expresión de
baculovirus incluyen, entre otras, al Aedes aegypti,
Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila
melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia
ni.
En función del sistema de expresión y del
hospedante elegido, las proteínas de la presente invención se
producen por cultivo de células hospedantes transformadas con un
vector de expresión, ya descrito, en condiciones, en las que se
exprese la proteína de interés. Después puede aislarse la proteína
de las células hospedantes y purificarse. Si el sistema de
expresión secreta la proteína al medio de crecimiento, entonces la
proteína puede purificarse directamente del medio. Si la proteína
no se secreta, entonces se aislará de los lisados celulares. La
selección de las condiciones apropiadas para el crecimientos y los
métodos de recuperación ya es conocida de los expertos en la
materia.
Las proteínas de la presente invención pueden
producirse también por síntesis química, por ejemplo la síntesis de
péptidos en fase sólida, empleando secuencias conocidas de
aminoácidos o secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia
de DNA de los genes de interés. Los expertos ya conocen estas
técnicas, véase, p.ej., J.M. Stewart y J.D. Young, Solid Phase
Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)
y G. Barany y R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis,
Biology, coordinadores: E. Gross y J. Meienhofer, vol. 2, Academic
Press, Nueva York, (1980), pp. 3-254, para las
técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky,
Principles of Peptide Synthesis, editorial Springer, Berlín (1984) y
E. Gross y J. Meienhofer, coord., The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology, lugar citado, vol. 1, para la síntesis clásica
en solución. La síntesis química de péptidos puede ser preferible
si un pequeño fragmento del antígeno en cuestión es capaz de
generar una respuesta inmunológica en el sujeto de interés.
Los polipéptidos antigénicos de la presente
invención, o sus fragmentos, pueden utilizarse para producir
anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Para la práctica
de la presente invención, además de las moléculas de anticuerpo
completo, pueden utilizarse también fragmentos de anticuerpo que
conserven la especificidad inmunológica del anticuerpo entero
(p.ej. los fragmentos Fab y F(ab')2 de la IgG (Pierce)). Los
anticuerpos pueden purificarse mediante métodos estándar para
obtener preparaciones de anticuerpo que estén sustancialmente libres
de proteínas del suero, que puedan afectar la reactividad (p.ej.
mediante purificación de afinidad (Harlow y col.)). Si se desean
anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado
(p.ej. ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un antígeno de la
presente invención, o su fragmento, o un antígeno mutado. Se recoge
el suero del animal inmunizado y se trata con arreglo a
procedimientos ya conocidos, véase, p.ej., Jurgens y col., J. Chrom.
348, 363-370, 1985. Si se emplea suero que
contiene anticuerpos policlonales, entonces los anticuerpos
policlonales pueden purificarse por cromatografía de
inmunoafinidad, aplicando procedimientos conocidos.
Los expertos pueden obtener también fácilmente
anticuerpos monoclonales contra los polipéptidos antigénicos y
contra los fragmentos de los mismos. Ya es conocida la metodología
general para obtener anticuerpos monoclonales por la tecnología del
hibridoma. Por fusión celular pueden crearse líneas celulares
inmortales productoras de anticuerpos y también por otras técnicas,
como son la transformación directa de linfocitos B con DNA
oncogénico o la transfección con virus de
Epstein-Barr, véase, p.ej., M. Schreier y col.,
Hybridoma Techniques (1980); Hammerling y col., Monoclonal
Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett y
col., Monoclonal Antibodies (1980); véanse también las patentes
US-4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887;
4,452,570; 4,466,917; 4,472,500, 4,491,632; y 4,493,890. Pueden
explorarse los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra
los polipéptidos antigénicos, o fragmentos de los mismos, en busca
de varias propiedades; es decir, según isotipos, epítopes,
afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son útiles para la
purificación, empleando técnicas de inmunoafinidad, de los
antígenos individuales, contra los que van dirigidos. Los
anticuerpos tanto policlonales como monoclonales pueden utilizarse
también para la inmunización pasiva o pueden combinarse con
preparaciones de vacuna subunitaria para mejorar la respuesta
inmune. Los anticuerpos que poseen efecto neutralizador del C.
parvum, por ejemplo los anticuerpos monoclonales 1101 y 222 que
se describen a continuación, y otros anticuerpos funcionalmente
equivalentes a ellos, son también útiles para las composiciones
terapéuticas. Los anticuerpos monoclonales y policlonales son
también útiles para fines de diagnóstico.
Los polinucleótidos, polipéptidos antigénicos de
C. parvum y los anticuerpos dirigidos contra ellos de la
presente invención pueden formularse en composiciones para el uso en
diagnóstico, solos o en combinación con otros polinucleótidos,
antígenos y/o anticuerpos, y/o para el uso en inmunización o
tratamiento de sujetos, tal como se describe a continuación. Los
métodos para fabricar tales formulaciones se describen p.ej., en:
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, Pennsylvania, 18ª edición, 1990. Por ejemplo, las
composiciones terapéuticas (p.ej. vacunas) de la presente invención
se fabrican en forma de inyectables, ya se como soluciones
líquidas, ya sea como suspensiones. Pueden prepararse también las
formas sólidas idóneas para la solución o suspensión en vehículos
líquidos inmediatamente antes de la inyección. La preparación puede
también emulsionarse o el ingrediente activo encapsularse en
vehículos de tipo liposoma. El ingrediente activo (p.ej.
inmunogénico) se mezcla por lo general con un vehículo
farmacéuticamente compatible, por ejemplo, agua, solución salina,
dextrosa, glicerina, etanol o similares, y combinaciones de los
mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades
menores de sustancias adyuvantes, por ejemplo agentes humectantes o
emulsionantes y agentes tampones de pH.
Pueden añadirse también a la formulación
adyuvantes que mejoren la eficacia de la vacuna o de otras
composiciones terapéuticas. Los adyuvantes pueden incluir, por
ejemplo dipéptidos de muramilo, avidina, hidróxido de aluminio,
bromuro de dimetildioctadecil-amonio (DDA), aceites,
emulsiones de aceite en agua, saponinas, citoquinas y otras
sustancias ya conocidas en la técnica.
Los polipéptidos antigénicos pueden estar unidos
a un vehículo con el fin de aumentar su inmunogenicidad. Los
vehículos idóneos incluyen macromoléculas grandes, metabolizadas
lentamente, por ejemplo proteínas, incluidas las albúminas del
suero, la hemocianina de lapa de ojo de cerradura, las moléculas de
inmunoglobulina, la tiroglobulina, la ovalbúmina y otras proteínas
bien conocidas por los expertos; los polisacáridos, por ejemplo la
sefarosa, la agarosa, la celulosa, las bolas de celulosa y
similares; los aminoácidos poliméricos, por ejemplo el ácido
poliglutámico, la polilisina y similares; los copolímeros de
aminoácidos; y las partículas inactivas de virus. Los anticuerpos y
polinucleótidos pueden unirse también a tales vehículos
inmediatamente antes de la administración.
Los polinucleótidos, polipéptidos antigénicos o
los anticuerpos dirigidos contra ellos pueden utilizarse en su
forma nativa o bien su contenido de grupos funcionales puede
modificarse, por ejemplo por succinilación de los restos lisina o
por la reacción de la cis-tiolactona. Puede
incorporarse también un grupo sulfhidrilo al vehículo (o al
antígeno) por ejemplo, por reacción de los grupos funcionales amino
con 2-iminotiolano o con el éster
3-(4-ditiopiridil)-propionato de la
N-hidroxisuccinimida. Los vehículos idóneos pueden
modificarse además para que incorporen brazos espaciadores (por
ejemplo hexametilenodiamina u otras moléculas bifuncionales de
tamaño similar) de unión a péptidos.
Otros vehículos idóneos incluyen a las células,
por ejemplo linfocitos, ya que la presentación en esta forma imita
el modo natural de presentación en el sujeto, que da origen al
estado inmunizado. Como alternativa, las moléculas de la presente
invención pueden unirse a los eritrocitos, con preferencia a los
eritrocitos propios del sujeto. Los expertos ya conocen los métodos
para unir péptidos a proteínas o células.
Además, los polipéptidos antigénicos (o
complejos de los mismos) pueden formularse en composiciones de
vacuna ya sea en forma neutra, ya sea en forma de sal. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido
(formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos),
que se forman con ácidos inorgánicos, por ejemplo, los ácidos
clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos, por ejemplo los
ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales
formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también
por reacción con bases inorgánicas, por ejemplo, los hidróxidos
sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico y con bases orgánicas,
por ejemplo la isopropilamina, trimetilamina,
2-etilamino-etanol, histidina,
procaína y similares.
Estas formulaciones contendrán típicamente una
"cantidad terapéuticamente eficaz" del ingrediente activo, es
decir, una cantidad de generar una respuesta inmune o capaz de
generar una respuesta neutralizadora, en un sujeto al que se
administra la composición. En el tratamiento y prevención de la
infección de C. parvum, por ejemplo, una "cantidad
terapéuticamente eficaz" será con preferencia una cantidad que
aumenta la resistencia del mamífero en cuestión a una nueva
infección y/o reduce la severidad clínica de la enfermedad. Tal
protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas,
que normalmente manifiesta un hospedante infectado y/o por un
tiempo más corto de recuperación.
Los expertos pueden determinar fácilmente la
cantidad exacta realizando pruebas estándar y guiándose por las
enseñanzas de esta descripción. La concentración de polipéptido
antigénico, de anticuerpo o de polinucleótido variará por ejemplo
en el intervalo comprendido entre el 1% y el 95% (p/p) de la
composición o incluso mayor o menos, si se considera indicado. Por
ejemplo, las formulaciones de vacuna contendrán de 1 \mug a 1 mg
por dosis de vacuna, aunque puede utilizarse una cantidad mayor o
menor, si fuera necesario. La vacunación repetida (p.ej. de
refuerzo) puede administrarse si se considera necesaria, por ejemplo
después de evaluar las células T reactivas.
Para inmunizar un sujeto se administra la vacuna
por lo general por vía parenteral, normalmente por inyección
intramuscular. Pueden emplearse también los modos de administración
intradérmica y transdérmica. Sin embargo, son también aceptables
otros modos de administración, por ejemplo la inyección subcutánea,
intraperitoneal e intravenosa. La cantidad a administrar dependerá
del animal a tratar, la capacidad del sistema inmune del animal de
sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Los
expertos podrán determinar fácilmente las dosis eficaces mediante
ensayos de rutina, trazando las curvas de
dosis-respuesta. El sujeto se inmuniza por
administración de la vacuna por lo menos en una dosis y, con
preferencia, en dos dosis. Además se podrán administrar al animal
cuantas dosis sean necesarias para mantener el estado de inmunidad a
la infección. De manera similar, para otras composiciones
terapéuticas se pueden administrar los polipéptidos y/o anticuerpos
por inyección (intramuscular, intradérmica, intraperitoneal,
intravenosa, etc.).
Las formulaciones terapéuticas adicionales,
indicadas para otros modos de administración, incluyen los
supositorios y, en algunos casos, las formulaciones de aerosol,
transdérmicas, intranasales, orales y las de liberación sostenida.
En el caso de los supositorios, la composición del vehículo
contendrá los aglutinantes y vehículos tradicionales, por ejemplo
los polialquilenglicoles o los triglicéridos. Tales supositorios
pueden formarse con mezclas que contengan el ingrediente activo en
una cantidad comprendida entre el 0,5 y el 10% (p/p), con
preferencia entre el 1 y el 2%. Los vehículos orales incluyen
excipientes empleados normalmente, por ejemplo las calidades
farmacéuticas de la manita, lactosa, almidón, estearato magnésico,
sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico y similares. Estas
composiciones orales de la vacuna pueden tomarse en forma de
soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas,
formulaciones de liberación sostenida o polvos y pueden contener
del 10 al 95% de ingrediente activo, con preferencia del 25 al
70%.
Las formulaciones intranasales incluirán
normalmente vehículos que no causen irritación a la mucosa nasal ni
interfieran de modo significativo en la función ciliar. En la
presente invención pueden emplearse diluyentes del tipo agua,
solución salina u otras sustancias conocidas. Las formulaciones
nasales pueden contener además conservantes, por ejemplo, aunque
sin limitarse a ellos: clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede
estar presente un tensioactivo para mejorar la absorción de las
proteínas en cuestión en la mucosa nasal.
Las formulaciones de liberación controlada o
sostenida se fabrican incorporando el polinucleótido y/o la proteína
(p.ej. un polipéptido antigénico o un anticuerpo) a vehículos tales
como liposomas, polímeros impermeables no resorbibles, por ejemplo
los copolímeros de etileno/acetato de vinilo y los copolímeros
Hytrel®, los polímeros hinchables, por ejemplo los hidrogeles, o
los polímeros resorbibles, tales como el colágeno, y ciertos
poliácidos y poliésteres, como los empleados para hacer
resorbibles las suturas. Los polipéptidos antigénicos pueden
entregarse también mediante mini-bombas implantadas,
bien conocidas en la técnica.
Los polinucleótidos, polipéptidos antigénicos
y/o anticuerpos de la presente invención pueden administrarse
también mediante un virus portador que los exprese. Los virus
portadores que pueden utilizarse en la presente invención incluyen,
pero no se limitan a las vacunas y otros poxvirus, adenovirus y
herpesvirus. A título ilustrativo, los virus recombinantes de
vacuna, que expresan las nuevas proteínas, pueden construirse del
modo siguiente. En primer lugar se inserta el DNA que codifica la
proteína particular en un vector apropiado, de modo que sea
adyacente al promotor de la vacuna y flanqueando las secuencias de
DNA de la vacuna, por ejemplo la secuencia que codifica a la
timidina-quinasa (TK). Después se emplea este vector
para transfectar células, que están simultáneamente infectadas con
la vacuna. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor
de la vacuna más el gen que codifica a la proteína presente en el
genoma vírico. La TK recombinante resultante puede seleccionarse
cultivando las células en presencia de la
5-bromodesoxiuridina y las placas víricas
resistentes a la misma.
Por lo tanto, una vía de administración implica
la inmunización del ácido nucleico. De este modo pueden
administrarse directamente a un sujeto las secuencias de
nucleótidos (y los elementos reguladores acompañantes) que codifican
a los polipéptidos en cuestión y/o anticuerpos o fragmentos de los
mismos para que se realice una traducción "in vivo" de
los mismos. Como alternativa, la transferencia genética puede
realizarse transfectando las células o los tejidos del sujeto vivo
y reintroduciendo el material transformado al mismo hospedante. Los
ácidos nucleicos (p.ej. DNA y RNA) pueden introducirse directamente
en el organismo hospedante, p.ej. mediante inyección (véanse las
patentes US-5,580,859 y 5,589,466; la publicación
internacional WO/90/11092; y Wolff y col., Science 247,
1465-1468, 1990). También puede efectuarse por
métodos conocidos la transferencia genética mediada por liposomas,
véase p.ej. la patente US-5,703,055; Hazinski y
col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4,
206-209, 1991; Brigham y col., Am. J. Med. Sci.
298, 278-281, 1989; Canonico y col., Clin.
Res. 39, 219A, 1991; y Nabel y col., Science 249,
1285-1288, 1990. Los agentes terapéuticos, por
ejemplo los anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie
expresados en tipos específicos de células, pueden conjugarse con
enlace covalente con la superficie liposómica de modo que el ácido
nucleico puede liberarse a los tejidos y células específicos,
susceptibles de infección. Tal como se ha indicado antes, las
formulaciones de ácidos nucleicos pueden administrarse por
cualquier modo apropiado, por ejemplo, intramuscular, intradérmico o
transdérmico.
Tal como se ha explicado antes, los
polinucleótidos y/o polipéptidos antigénicos de la presente
invención pueden utilizarse también en el diagnóstico para detectar
la presencia de anticuerpos reactivos de C. parvum en una
muestra biológica con el fin de determinar la existencia de una
infección de C. parvum. Por ejemplo, la presencia de
anticuerpos reactivos con polipéptidos antigénicos puede detectarse
aplicando técnica electroforéticas y de inmunodiagnóstico estándar,
por ejemplo los ensayos de competición, de reacción directa o los de
tipo sandwich. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a:
Western blots; ensayos de aglutinación; inmunoensayos marcados y
mediados con enzimas, por ejemplo los ensayos ELISA; los ensayos de
tipo biotina/avidina; los radioinmunoensayos; la
inmunoelectroforesis; la inmunoprecipitación; etc. Las reacciones
incluyen por lo general marcadores de revelado, por ejemplo
marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos,
enzimáticos o moléculas colorantes, así como otros métodos para
detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el
anticuerpo o anticuerpos que reaccionan con él.
Los ensayos recién mencionados implican por lo
general la separación del anticuerpo no fijado en una fase líquida
del soporte de fase sólida, al que se han fijado los complejos de
antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que
pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen sustratos
del tipo nitrocelulosa (p.ej. en forma de membrana o de hoyo de
microvaloración); poli(cloruro de vinilo) (p.ej. láminas u
hoyos de microvaloración); látex de poliestireno (p.ej. bolas o
placas de microvaloración); poli(fluoruro de vinilideno);
papel diazotizado; membranas de poliamida (Nylon); bolas activadas,
bolas con respuesta magnética y similares.
De forma típica, el soporte sólido se hace
reaccionar en primer lugar con un componente de la fase sólida
(p.ej. uno o más polipéptidos antigénicos) en condiciones apropiadas
para la unión, de modo que el componente quede suficientemente
inmovilizado sobre el soporte. Algunas veces, la inmovilización del
antígeno sobre el soporte puede reforzarse uniendo en primer lugar
el antígeno a una proteína que tenga mejores propiedades de unión.
Las proteínas idóneas para tal unión incluyen, pero no se limitan a:
macromoléculas, por ejemplo las albúminas de suero, que incluyen la
albúmina de suero bovino (BSA), la hemocianina de lapa de ojo de
cerradura, las moléculas de inmunoglobulina, la tiroglobulina, la
ovalbúmina y otras proteínas que los expertos conocen bien. Otras
moléculas que pueden utilizarse para fijar los antígenos sobre el
soporte incluyen a los polisacáridos, los ácidos polilácticos, los
ácidos poliglicólicos, los aminoácidos poliméricos, los copolímeros
de aminoácidos y similares. Tales moléculas y métodos de fijación
de estas moléculas a los antígenos ya son conocidos de los expertos
en la materia, véase, p.ej., Brinkley, M.A., Bioconjugate Chem.
3, 2-13, 1992); Hashida y col., J. Appl.
Biochem. 6, 56-63, 1984; y Anjaneyulu y
Staros, International J. of Peptide and Protein Res. 30,
117-124, 1987.
Después de la reacción del soporte sólido con el
componente de fase sólida, cualquier componente de fase sólida no
inmovilizado se eliminará del soporte por lavado y entonces se
pondrá en contacto el componente unido al soporte con una muestra
biológica, de la que se sospecha que contiene restos de ligandos
(p.ej. anticuerpos dirigidos contra los antígenos inmovilizados) en
condiciones idóneas para la unión. Después del lavado para eliminar
los ligandos no fijados, se añade el resto ligante secundario en
condiciones idóneas para la unión, dicho ligante secundario es
capaz de asociarse selectivamente con el ligante fijado. La
presencia del ligante secundario puede detectarse seguidamente
aplicando métodos ya conocidos en la técnica.
Más en particular puede utilizarse el método
ELISA, en el que los hoyos de una placa de microvaloración están
recubiertos con un polipéptido antigénico. Se introduce en los hoyos
recubiertos una muestra biológica que contiene o se sospecha que
puede contener moléculas de inmunoglobulina anti(péptido
antigénico). Después de un período de incubación suficiente para
que el anticuerpo pueda unirse al antígeno inmovilizado, la o las
placa(s) se lavan para eliminar los restos no fijados y se
añade una molécula ligante secundaria marcada de modo detectable.
Se deja que la molécula ligante secundaria reaccione con los
anticuerpos capturados de la muestra, se lava la placa y se detecta
la presencia de la molécula ligante secundaria aplicando métodos
bien conocidos de la técnica.
De este modo, en una forma especial de
ejecución, se pueden detectar fácilmente la presencia de ligandos
dirigidos contra el antígeno de C. parvum en una muestra
biológica empleando un ligando secundario que contenga un
anticuerpo dirigido contra los ligandos del anticuerpo. Se conoce en
la técnica un gran número de moléculas de inmunoglobulina (Ig)
anti-mamífero, que pueden conjugarse fácilmente con
un marcador detectable de tipo enzima, por ejemplo la peroxidasa de
rábano rusticano, la fosfatasa alcalina o la ureasa, aplicando
métodos ya conocidos de los expertos en la materia. Entonces se
emplea un sustrato enzimático apropiado para generar una señal
detectable. En otras formas de ejecución afines pueden practicarse
los métodos ELISA de tipo competitivo, aplicando métodos que los
expertos ya conocen.
Los ensayos pueden realizarse también en
solución, de tal manera que los polipéptidos antigénicos y
anticuerpos específicos de estas proteínas formen complejos en
condiciones de precipitación. En una forma especial de ejecución,
los polipéptidos antigénicos pueden unirse a una partícula de la
fase sólida (p.ej. una esferilla de agarosa o similar) aplicando
métodos de unión ya conocidos en la técnica, por ejemplo la unión
química o la indirecta. La partícula recubierta con el antígeno se
pone seguidamente en contacto en condiciones idóneas para la unión
con una muestra biológica de la que se sospecha que contiene
anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos antigénicos. La unión
cruzada con los anticuerpos fijados provoca la formación de
agregados de complejos de
partícula-antígeno-anticuerpo, que
pueden precipitarse y separarse de la muestra realizando lavado y/o
centrifugación. La mezcla reaccionante puede analizarse para
determinar la presencia o ausencia de complejos de
anticuerpo-antígeno aplicando cualquiera de los
muchos métodos estándar, por ejemplo los métodos de
inmunodiagnóstico mencionados anteriormente.
En otra forma de ejecución se proporciona una
matriz de inmunoafinidad, en la que se inmoviliza sobre un sustrato
una población policlonal de anticuerpos de una muestra biológica de
la que se sospecha que contiene moléculas anti-C. parvum.
Respecto a ello, la purificación inicial por afinidad de la muestra
puede llevarse a cabo empleando antígenos inmovilizados. La
preparación resultante de la muestra contendrá entonces únicamente
restos anti-C. parvum, evitando las potenciales propiedades
de fijación inespecífica al soporte de afinidad. En la técnica se
conoce un gran número de métodos para inmovilizar inmunoglobulinas
(ya sea intactas, ya sea fragmentos específicos de las mismas) en
buen rendimiento y con buena retención de la actividad de fijación
del antígeno. No estando limitadas a ningún método particular, la
proteína A o la proteína G inmovilizadas pueden utilizarse para
inmovilizar las inmunoglobulinas.
Por consiguiente, una vez las moléculas de
inmunoglobulina han quedado inmovilizadas para proporcionar una
matriz de inmunoafinidad, se ponen en contacto los polipéptidos
antigénicos marcados con los anticuerpos fijados en condiciones
idóneas para la unión. Después de haber eliminado por lavado
cualquier antígeno fijado de modo no específico del soporte de
inmunoafinidad, podrá determinarse la presencia de antígeno fijado
ensayando para detectar el marcado aplicando métodos ya conocidos
de la técnica.
Además, los anticuerpos dirigidos contra los
polipéptidos antigénicos, antes que los polipéptidos antigénicos
propiamente dichos, pueden emplearse en los ensayos recién descritos
con el fin de detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra
las proteínas en una muestra dada. Estos ensayos se realizan
esencialmente del modo antes descrito y los expertos los conocen
perfectamente.
Los ensayos en los que intervienen
específicamente los polinucleótidos de la presente invención
incluyen también, pero sin limitarse a ellos: ensayos para alterar
los niveles de mRNA y/o la presencia de polinucleótidos que se
hibridan selectivamente con las secuencias aquí descritas. En el
ensayo para la alteración de los niveles de mRNA se extrae en
primer lugar el ácido nucleico contenido en las muestras (p.ej.
células o tejidos obtenidos del sujeto) con arreglo a métodos
estándar, por ejemplo empleando enzimas líticas o soluciones
químicas según los procedimientos descritos en Sambrook y col.,
lugar citado, o se extraen con resinas de fijación de ácidos
nucleicos con arreglo a las instrucciones del fabricante. Después se
detecta el mRNA extraído por hibridación (p.ej. mediante un
análisis Northern blot) y/o por amplificación (p.ej. PCR). Como
sondas de hibridación pueden utilizarse ácidos nucleicos que tengan
por lo menos 10 nucleótidos, con preferencia entre 20 y 25
nucleótidos, incluso con mayor preferencia entre 50 y 100
nucleótidos, y posean una complementariedad u homología de
secuencias con los polinucleótidos aquí descritos. Es obvio que las
sondas no es necesario que sean idénticas, pero de modo típico
serán idénticas por lo menos en un 80% en lo que respecta a la
región homóloga de tamaño comparable, con mayor preferencia serán
idénticas en un 85% e incluso con mayor preferencia serán idénticas
en un 90-95%. En ciertas formas de ejecución será
ventajoso el uso de ácido nucleicos en combinación con medios
apropiados, por ejemplo un marcador detectable, para detectar la
hibridación. En la técnica se conoce una gran variedad de
indicadores apropiados, incluidos los ligandos fluorescentes,
radiactivos, enzimáticos y de otros tipos (p.ej. avidina/biotina).
Además, los ácidos nucleicos pueden estar unidos a un soporte sólido
(p.ej. vidrio o pastilla) para utilizarse en ensayos de exploración
de alto rendimiento aplicando los métodos descritos, por ejemplo,
en las patentes US-5,405,783, 5,578,832 y 5,445,934.
Los resultados de los ensayos de alto rendimiento pueden analizarse
empleando programas informáticos suministrados por los
fabricantes.
Los reactivos de ensayo mencionados antes,
incluidos los polipéptidos antigénicos o los anticuerpos dirigidos
contra ellos, pueden presentarse en forma de kits, con las oportunas
instrucciones y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar
los inmunoensayos del modo antes descrito. En función del
inmunoensayo concreto que se quiera realizar, el kit puede contener
además marcadores idóneos y otros reactivos y materiales envasados
(p.ej. tampones de lavado y similares). Empleando estos kits se
pueden realizar los inmunoensayos estándar, por ejemplo los
descritos antes.
Ejemplo
1
Se infectan terneros recién nacidos con material
aislado humano de C. parvum obtenido de los Laboratorios
Provinciales Cadham (Winnipeg, MB, Canadá), se recogen las heces y
se almacenan a 4ºC con igual volumen de dicromato potásico del
2,5%. Se aíslan los oocistos de las heces por centrifugación de
flotación con sucrosa y posterior ultracentrifugación en gradientes
progresivos de cloruro de cesio del modo descrito previamente por
Taghi-Kilani y col., J. Immunol. 145,
1571-1576, 1990. Después se almacenan a 4ºC los
oocistos purificados hasta el futuro uso.
Se extrae el RNA de los oocistos empleando el
procedimiento de aislamiento con isotiocianato de guanidio descrito
previamente por Rajkovic y col., PNAS USA 86,
8217-8221, 1989 y se aísla el RNA poliadenililado
(poli-A+) por selección con
oligo-dT. Con cinco ml de oocistos altamente
purificados se obtienen aproximadamente 4,8 mg de RNA total y unos
20 \mug de RNA poliadenililado (poli-A+ RNA)(mRNA)
aislando realizando la selección con oligo-dT
(0,4%).
Después se convierten cinco \mug de RNA
poli-A+ en los cDNA con arreglo a las instrucciones
del fabricante (Stratagene, La Jolla, Ca). Para construir la
biblioteca se emplea el vector de clonación Lambda ZAP IIXROD®
(Stratagene), un derivado de Lambda gtll que contiene el gen lacz
(11-galactosidasa) y el promotor lac. Se ligan los
cDNA a los brazos lambda, se empaquetan "in vitro" y se
extienden en placas sobre una cepa SURE® de E. coli. Se
determina la eficacia de la ligación por selección de color
azul/blanco de las placas en presencia de
5-bromo-4-cloro-3-indoil-11D-galactosidasa
(X-gal) y
2-isopropil-b-D-tiogalactopiranósido
(IPTG). Con este procedimiento se obtienen 2x10^{6} fagos
primarios, el 95% de los cuales se demuestra que son recombinantes
con la selección de color azul/blanco en presencia de
IPTG/X-gal.
Se obtiene suero humano inmune de un paciente
que ha sufrido una infección parasitológicamente documentada. Se
eliminan los anticuerpos dirigidos contra las proteínas de E.
coli por preabsorción con un lisado de E. coli
X-BLUE®-solución salina tamponada (20 mM TRIS, pH =
7,5). Se diluye el suero 1:200 con 0,1% de BSA en Tris 500 mM NaCl)
y se incuba a 4ºC durante una noche, con agitación, en la presencia
de 5 mg/ml de la proteína de la cepa hospedante de E. coli.
Se centrifugan los escombros celulares, formándose un culote y se
separa el líquido sobrenadante. Se realizan las gráficas Immunoblots
de C. parvum y E. coli para tener la seguridad de que
se han eliminado los anticuerpos de E. coli y de que siguen
estando presentes los anticuerpos de C. parvum (tal como se
describe a continuación). Los sueros inmunes así preparados se
emplean en la siguiente exploración de la biblioteca de cDNA.
Después de la electroforesis a través de un
SDS-PAGE del 10% se transfieren las proteínas
criptosporidianas de C. parvum, E. coli o
recombinantes (Transblot SD Semi-dry Electrophoretic
Transfer Cell/Bio-Rad, Mississauga, Ontario) a
membranas del tipo Immobilon-P transfer (Millipore,
Bedford, Ma) con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se
emplea leche desnatada al cinco por ciento (5%) en solución salina
tamponada con TRIS (TBS) para bloquear los immunoblots a 37ºC
durante 2 horas y después se incuba con sueros inmunes diluidos
1:200 o anticuerpos monoclonales diluidos 1:2000 en albúmina de
suero bovino del 0,1% (BSA)/TBS a 37ºC durante 2 horas. Se lavan
las membranas 3 veces durante 5 minutos cada vez en
Tween-20 al 0,05% en TBS (TBST). Se detectan los
anticuerpos IgG empleando IgG de cabra anti-humana o
IgG de cabra anti-ratón, conjugada con peroxidasa
de rábano rusticano (Jackson Immunoresearch Laboratories, West
Grove, PA) diluida 1:3000 con BSA al 0,1% en TBS a 37ºC durante 2
horas. Después de otro lavado se revelan las manchas (blots) con
diaminobencidina 1,4 mM, cloruro de cobalto 8,8 mM y peróxido de
hidrógeno 0,85 mM.
Se efectúan los ensayos Immunoblots de proteínas
de C. parvum y E. coli con suero inmune preabsorbido.
Las bandas predominantes están situadas en 23, 33, 45 y >66
kilodaltones, de modo similar al espectro de antígenos publicado
por otros investigadores.
Los anticuerpos contra las proteínas de E.
coli están presentes en los sueros no absorbidos, pero se
eliminan eficazmente por el procedimiento de absorción, quedan
intactos los anticuerpos criptosporidianos específicos.
Se explora la biblioteca de expresión del cDNA
del modo siguiente: se incuban a 37ºC durante cuatro horas en agar
Luria-Brunelli (LB) aproximadamente 2000 plaquitas
primarias por placa y se recubren las placas con filtros de
nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA) preimpregnados con IPTG 10 mM
y se incuban a 37ºC durante cuatro horas más. Se quitan los
filtros, se colocan filtros duplicados y se mantienen en incubación
durante cuatro horas más. Se bloquean los filtros con leche
desnatada al 5% en TBST y se revelan del modo descrito antes para
el immunoblotting. Los clones positivos se purifican en placa.
Después de la amplificación de la biblioteca se
exploran aproximadamente 650.000 placas primarias y se identifican
ocho clones positivos. Estos se purifican en placa y se rescatan por
escisión "in vivo" en el fagémido de secuenciación
pbluescript SK+.
Se prepara el pBluescript SK+ recombinante que
contiene el cDNA del C. parvum por un método de escisión
"in vivo" suministrado por el fabricante (Stratagene, La
Jolla, CA). Se prepara el DNA plásmido por métodos ya establecidos.
El cDNA insertado se secuencia por el método didesoxi
(Sequenase^{TM}, U.S. Biochemical, Cleveland, Ohio).
Se secuencian por completo los insertos de cDNA
de los clones positivos. Los ocho clones positivos codifican a dos
antígenos distintos, el AG1 y el AG2. La secuencia de cDNA compuesta
de los insertos y los marcos de lectura abierta previstos de los
dos antígenos se presentan en la figura 1.
El marco de lectura abierto incompleto del AG1
deducido de un cDNA simple y dos clones de cDNA solapados se
extiende desde el nucleótido 8 al 394. La región 3' sin traducir
tiene una longitud de 945 nucleótidos y se extiende desde la
posición 395 a la 1338. Las señales de poliadenililación de consenso
están situadas en los nucleótidos 1233-1238 y
1273-1278. Las señales de poliadenililación
imperfecta están identificadas también en los nucleótidos
1241-1245 y 1307-1311. El marco de
lectura abierto previsto codifica a un péptido de 129 aminoácidos
de un peso molecular previsto de 15 Kd. El punto isoeléctrico
previsto se sitúa en pH 9,6, siendo hidrófobos el 44% de los
aminoácidos. Se identifican dos sitios de glucosilación unidos a N
en los restos 36-38 y 71-73.
El marco de lectura abierto compuesto incompleto
del AG2 deducido de cinco clones cDNA solapados se extiende desde
el nucleótido 9 al 587. La región 3' sin traducir tiene una longitud
de 712 nucleótidos y se extiende desde el nucleótido 588 al 1298.
Se identifica un gran número de señales de poliadenililación de
consenso imperfectas, por ejemplo en los nucleótidos
945-949 y 1141-1145. El marco de
lectura abierto previsto codifica a un péptido de 193 aminoácidos
de longitud con un peso molecular previsto de 21,8 Kd. El punto
isoeléctrico previsto se sitúa en pH 6,23 y el 36% de los
aminoácidos son hidrófobos. Se identifican dos sitios de
glucosilación unidos a N en los restos 36-38 y
51-53.
Se realiza una búsqueda en la base de datos del
GenBank empleando el programa informático BLAST (véase, p.ej.
Altschul y col., 25, 3389-3402, 1997),
empleando por ejemplo las siguientes penalizaciones de laguna:
existencia: 11 ó 5, extensión: 1 ó 2. Pueden utilizarse también los
parámetros por defecto. Con las búsquedas no se identifican
proteínas que presenten identidad de secuencia con AG1 o AG2.
Ejemplo
2
Para generar la proteína recombinante se emplean
dos sistemas de vectores de expresión procariotas diferentes, el
pGEX-2TTM (Pharmacia Biotech, Montreal, Canadá) y el
pET-11ATM (Novagen, Madison, Wisconsin). Los
insertos de cDNA de los dos antígenos (AG1 y AG2) se subclonan en
forma de fragmento de extremo relleno SmaI/XhoI en el sito SmaI del
vector pGEX-2T y se transforman en la cepa
DH5-\alpha de E. coli. Se inducen las
proteínas de fusión en presencia de IPTG 0,5 mM y se recolectan las
células bacterianas para el análisis posterior con arreglo a
métodos estándar, por ejemplo el descrito por Smith y col., Gene
67, 31-40, 1988.
Con el fin de subclonar el inserto de cDNA del
AG1 en el pET-11A, se sintetizan por amplificación
directa de DNA los cebadores oligonucleótidos correspondientes al
extremo 5' (AG1 5'-PCR,
5'-GTCATATGGCACGAGAAT
TACCATCTGAT-3') (SEQ ID NO:5) y complementarios del extremo 3' (AG1 3'-PCR, 5'-GACATATGTTAATTTCT
CATTTGTACTTG-3') (SEQ ID NO:6) del cDNA, que contienen los sitios NdeI de ingeniería. La amplificación se lleva a cabo en presencia de la Taq-polimerasa (Perkin Elmer Cetus, Rexdale, Ontario) en una mezcla reaccionante PCR patrón de 100 ml que contiene 1,0 \mug de molde, 100 mM de cada cebador y 0,2 mM de los dNTP a lo largo de 30 ciclos a 94ºC (1 min), 50ºC (1 min) y 72ºC (1 min) con arreglo a las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer Cetus, Rexdale, Ontario). Se digiere el cDNA amplificado con Nde1. Se subclona el inserto aislado en el sitio NdeI del pET-11A y se transforma en la DH5-\alpha de E. coli. Se electroporan los plásmidos que contienen los insertos en la cepa de expresión BL21/IDE3/plyS (Novagen, Madison, WI) de la E. coli, se inducen las proteínas de fusión en presencia de IPTG 0,5 mM y se recolectan las células bacterias para el análisis de proteínas empleando métodos estándar, por ejemplo los descritos en Studier y col., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990.
TACCATCTGAT-3') (SEQ ID NO:5) y complementarios del extremo 3' (AG1 3'-PCR, 5'-GACATATGTTAATTTCT
CATTTGTACTTG-3') (SEQ ID NO:6) del cDNA, que contienen los sitios NdeI de ingeniería. La amplificación se lleva a cabo en presencia de la Taq-polimerasa (Perkin Elmer Cetus, Rexdale, Ontario) en una mezcla reaccionante PCR patrón de 100 ml que contiene 1,0 \mug de molde, 100 mM de cada cebador y 0,2 mM de los dNTP a lo largo de 30 ciclos a 94ºC (1 min), 50ºC (1 min) y 72ºC (1 min) con arreglo a las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer Cetus, Rexdale, Ontario). Se digiere el cDNA amplificado con Nde1. Se subclona el inserto aislado en el sitio NdeI del pET-11A y se transforma en la DH5-\alpha de E. coli. Se electroporan los plásmidos que contienen los insertos en la cepa de expresión BL21/IDE3/plyS (Novagen, Madison, WI) de la E. coli, se inducen las proteínas de fusión en presencia de IPTG 0,5 mM y se recolectan las células bacterias para el análisis de proteínas empleando métodos estándar, por ejemplo los descritos en Studier y col., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990.
Se evalúa la expresión de la proteína
recombinante de C. parvum con los vectores PGEX y pET
mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida y tinción
Coomaissie seguida por un immunoblotting en membranas de
transferencia Immobilon-P aplicando métodos
estándar, por ejemplo los descritos en Sambrook y col., lugar
citado. Se bloquean las manchas Immunoblots que contienen proteínas
inducidas y no inducidas con leche desnatada al 5% en TBST a 4ºC
durante una noche. Se detecta la proteína recombinante empleando
suero humano inmune preabsorbido, del modo descrito antes.
El tamaño previsto de la proteína de fusión AG1
con glutationa-S-transferasa
empleando el vector pGEX-2T es de 43 Kd. El
análisis SDS-PAGE de proteínas inducidas frente a
las no inducidas produce una banda insoluble prevista de
aproximadamente 43 Kd y una banda insoluble adicional de menor
intensidad de aproximadamente 66 Kd. Las dos bandas se reconocen en
el immunoblot por los sueros inmunes humanos y los anticuerpos
monoclonales generados contra la banda de 43 Kd purificados por
electroforesis a través de gel y por electroelución. Cuando el AG1
se expresa en el vector pET-11A se forma una banda
insoluble del tamaño previsto de aprox. 20 Kd, que se reconoce por
los sueros inmunes humanos y por el anticuerpo monoclonal.
El tamaño previsto de las proteínas de fusión
AG2 con la glutationa-S-transferasa
empleando el vector pGEX-2T es de aproximadamente
46 Kd. En el análisis SDS-PAGE de la proteína
inducida frente a la no inducida no consigue producir una banda de
proteína de fusión recombinante en el peso molecular esperado, sino
que produce una banda insoluble fácilmente visualizada de 98 Kd. El
análisis por immunoblot con suero inmune humano y con anticuerpo
monoclonal generado contra la banda purificada de 98 Kd revela la
presencia de una banda débil de aproximadamente 44 Kd y una banda
intensa de 98 Kd. Estas bandas no aparecen en las pistas de control
no inducidas. La secuenciación del vector de expresión confirma el
tamaño del marco de lectura abierto previsto.
Se purifican proteínas criptosporidianas
recombinantes, expresadas en forma de proteínas de fusión GST, por
electroforesis preparativa a través de gel y por electroelución y se
emplean para inmunizar ratones BalbC. Se inmunizan los ratones por
vía intraperitoneal tres veces a intervalos de cuatro semanas con 50
mg de antígeno recombinante purificado en adyuvante RIBI^{TM}
(RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT). Se administra por
inyección intravenosa un refuerzo final de 50 mg de antígeno
recombinante purificado en solución salina tamponada con fosfato.
Tres días después se sacrifican los animales y se recogen sus bazos.
Se fusionan los esplenocitos con NS-1 empleando PEG
(Gibco) y se cultivan en placas de 96 hoyos del modo descrito por
Studier y col., lugar citado. Se seleccionan los hibridomas
positivos mediante inmunoensayo enzimático (EIA), en el que los
hoyos se han recubierto con antígeno recombinante purificado
expresado en el vector pET 11A (AG1), o se someten a exploración
doble con proteína de fusión GST recombinante purificada y GST (AG2)
para identificar los hibridomas criptosporidianos específicos con
arreglo a métodos estándar, p.ej., Wilkins y col., J. Biol. Chem.
271, 3046-3051,
1996.
1996.
Se resuelven por electroforesis los antígenos
criptosporidianos recombinantes purificados, se transfieren a
membranas Immobilon-P y se analizan por
immunoblotting con sueros inmunes humanos diluidos 1:200 en PBS. Se
eluyen en medio ácido los anticuerpos del modo descrito previamente
(véase, p.ej. Peterson y col., Infect. Immun. 60,
2343-2348, 1990), se concentran por centrifugación
en un aparato Centricon-10 (Amicon Inc., Beverly,
MA) hasta un volumen final de 0,5 ml en PBS con arreglo a las
instrucciones del fabricante, y se emplean para el análisis
immunoblotting de las proteínas criptosporidianas del modo descrito
antes.
Se aísla un total de 12 anticuerpos monoclonales
individuales, que reaccionan específicamente en un ensayo EIA con
la proteína de fusión recombinante purificada PETII de AG1. Se
identifican cuatro anticuerpos monoclonales que reaccionan
específicamente con la porción de fusión criptosporidiana de la
proteína de fusión GST del AG2. Se seleccionan dos anticuerpos
monoclonales, el 1101 dirigido contra el Agl y el 222 dirigido
contra el AG2, para el estudio posterior en base a su reactividad
en el Immonoblot con proteínas nativas y en el EIA contra proteínas
recombinantes.
En las figuras 3A y 3B se presentan los análisis
immunoblotting de anticuerpos humanos purificados por afinidad y el
anticuerpo monoclonal 1101 (AG1) dirigido contra las proteínas
criptosporidianas solubles e insolubles, respectivamente. Los
anticuerpos humanos eluidos de la proteína de fusión GST del AG1
reconocen una débil banda en la proteína criptosporidiana total en
aproximadamente 22 Kd (figura 3A), mientras que el anticuerpo
monoclonal 1101 generado contra la proteína de fusión GST del AG1
reconocen una débil banda en 22 Kd de proteína criptosporidiana
insoluble (figura 3B, pista 1) y tres bandas de aproximadamente 22,
32, y 96 Kd de proteína criptosporidiana soluble (figura 3B, pista
2).
Los análisis immunoblotting de anticuerpos
humanos purificados por afinidad y del anticuerpo monoclonal 222
(AG2) dirigidos contra las proteínas criptosporidianas soluble y
insoluble se presentan en las figuras 4A y 4B, respectivamente. Los
anticuerpos humanos eluidos de la proteína de fusión GST del AG2
reconocen tres bandas de la proteína criptosporidiana total, en
aproximadamente 17, 34, y 84 Kd (figura 4A), mientras que el
anticuerpo monoclonal 222 generado contra la proteína de fusión GST
del AG2 no reconoce bandas de proteína criptosporidiana insoluble
(figura 4B, pista 1) y cinco bandas en aproximadamente 6, 10, 22, 34
y 84 Kd de la proteína criptosporidiana soluble (figura 4B, pista
2). La banda intensa de 55 Kd de la figura 4B, pistas 1 y 2, es
artificial.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se lavan tres veces en PBS los oocistos
purificados previamente, se suspenden de nuevo con una densidad de
5 x 10^{7} oocistos/ml y se emplean directamente o se escinden
para generar esporozoítos del modo descrito en el siguiente ejemplo
5A. Se cuantifican los esporozoítos hemocitometría antes del uso. Se
reparten aproximadamente 0,5 x 10^{6} oocistos o esporozoítos en
partes alícuotas en portaobjetos y se dejan secar en el aire a 37ºC.
Se fijan los portaobjetos durante 10 min en metanol del 100%, se
secan y se lavan tres veces con PBS.
Se bloquean los portaobjetos 3x con PBS y se
incuban con anticuerpo monoclonal primario a razón de 5 mg/ml en
PBS/1% BSA/0,1% azida sódica, a 40ºC durante 1 h. Después de lavar
3x con PBS se añade una dilución 1:100 del anticuerpo secundario
(1,4 mg/ml - rodamina, antisuero de cabra anti-ratón
(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) en el mismo
tampón y se incuba en la oscuridad a 40ºC durante 1 h. Se lavan los
portaobjetos 3x con PBS y se detecta la fluorescencia en el
microscopio (Olympus BH5, modelo BH2 PM-10ADS) y se
documenta con fotografías (Kodak Provia 1600).
Los resultados de la inmunolocalización de
anticuerpos monoclonales 1101 (AG1) y 222 (AG2) contra oocistos y
esporozoítos se presentan en las figuras 5A, B, C y 5D, E y F,
respectivamente. El anticuerpo monoclonal JB1 dirigido contra la
integrina humana no marca específicamente restos en el portaobjetos
(figura 5A). El anticuerpo monoclonal 1101 dirigido contra el AG1
tiñe intensamente en un modelo difuso los oocistos individuales y
los pares de oocistos (figura 5B). El anticuerpo monoclonal 222
dirigido contra el AG2 tiñe los oocistos individuales y los
aglomerados en un modelo de tipo circular (figura 5C). Los
esporozoítos no son visualizables con el anticuerpo monoclonal JB1
(figura 5D). El anticuerpo monoclonal 1101 detecta esporozoítos
generando un modelo de tinción uniforme (figura 5E), mientras que
el anticuerpo monoclonal 222 detecta esporozoítos generando un
modelo intenso
(figura 5F).
(figura 5F).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se suspenden los oocistos a razón de 5,0 x
10^{7} por ml en solución salina equilibrada de Hank y se incuban
a 37ºC durante 1,5 horas para que liberen esporozoítos. Se purifican
los esporozoítos en una columna de DEAE-celulosa
equilibrada a 4ºC durante una noche con tampón de columna (80 mM
Na_{2}HPO_{2}, 58 mM NaCl, 55 mM glucosa). Se lavan los
esporozoítos escindidos dos veces con el tampón de columna, se
centrifugan para formar un culote a 3500 x g y se suspenden de
nuevo en 20 ml de tampón de columna. Se introducen los esporozoítos
del culote en un cm de matriz suspendida en una columna de tipo
Econo (BioRad). Se emplean 50 ml de tampón de columna para eluir
los esporozoítos, que se centrifugan para formar un culote y se
lavan dos veces son solución salina equilibrada de Hank. Se
cuantifican los esporozoítos por hemocitometría y se ajusta la
concentración, obteniéndose una concentración final de 0,5 x
10^{6} por ml.
Se obtienen las células HT-29 de
la American Tissue Culture Collection. Se cultivan las células
originalmente en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) más
glutamina (Gibco-BRL) suplementado con suero fetal
bovino del 10% (Intergen) en una atmósfera con un 5% de CO_{2}.
Antes de utilizarse en el ensayo de invasión "in vitro"
se trasvasan las células del DMEM a un medio Leibovitz's
L-15 (Gibco-BRL), suero fetal bovino
del 10% y 5 \mug/mi de penicilina/estreptomicina
(Gibco-BRL)) en una atmósfera con un 5% de CO_{2}
y se someten a pasaje 30 veces para permitir la diferenciación en
el medio sin glucosa, del modo descrito previamente por ejemplo por
Flanigan y col., Infect. Immun. 59, 234-239,
1991.
En estos ensayos se emplean tres anticuerpos
monoclonales. El anticuerpo monoclonal 1101 es una IgG dirigida
contra el antígeno criptosporidiano 1 (AG1) y el anticuerpo
monoclonal 222 es una IgG dirigida contra el antígeno
criptosporidial 2 (AG2). Tal como se ha descrito antes, ambos
anticuerpos monoclonales detectan a la proteína nativa en un ensayo
immunoblot, reaccionan con la proteína recombinante en el ensayo EIA
y localizan los oocistos y esporozoítos en los estudios de
inmunofluorescencia. El anticuerpo monoclonal 2F12 es un anticuerpo
IgG de control negativo, dirigido contra la superficie de
lipooligosacárido de la bacteria Hemophilus ducreyi
(facilitada por el Dr. Ian McClean). Para este ensayo se cultivan
las células en tiras de cubierta hasta aproximadamente una
confluencia del 80% y se exponen a 5 x 10^{5} esporozoítos además
de dosis de valoración de anticuerpos monoclonales del modo
siguiente: los anticuerpos monoclonales 1101, 222 y 2F12 en
concentraciones de 0, 1, 4, 8, 10, 20, 40, 80 \mug/ml de medio de
cultivo. Para determinar si los efectos de neutralización son
aditivos o sinergéticos se añaden los anticuerpos en combinación en
una concentración final de 4 \mug/ml de cada anticuerpo
monoclonal del modo siguiente: 1101, 222, 2F12; 1101+222; 2F12+222;
2F12+1101.
Se cultivan las células expuestas durante
48-72 horas, se fijan en metanol del 100% y para la
evaluación se tiñen con hematoxilina y eosina del modo descrito
previamente por ejemplo por Cotran y col., "Pathological Basis of
Disease" (1998), W.B. Saunders Co. Se efectúa cada ensayo por
triplicado y el número de células infectadas por 25 casillas de
cada portaobjetos se determina por observación en microscopio de
luz. Se determina si las diferencias son significativas aplicando
el test T del programa estadístico del Paquete Estadístico de
Ciencias Sociales (SPSS), que puede obtenerse por ejemplo a través
de internet.
El efecto de concentraciones crecientes de
anticuerpos monoclonales 1101 y 222 si se compara con el anticuerpo
monoclonal 2F12 de control en la invasión de esporozoítos de células
HT-29 se recoge en la tabla 1 y se representa
gráficamente en la figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La reducción de infectividad del AG1 por acción
del anticuerpo monoclonal 1101 se hace significativa en 2
\mug/ml, a pesar de que no se consigue significancia estadística
en 10 ni en 80 \mug/ml. En todo el intervalo de concentraciones
ensayadas, el anticuerpo monoclonal 1101 produce una reducción del
53% de la infectividad, que es muy significativa (p < 0,001). El
anticuerpo monoclonal 222 dirigido contra el AG2 tiene una actividad
neutralizadora más acusada y sostenida, si se compara con el
anticuerpo monoclonal 1101. La neutralización se observa lo largo
del intervalo de 1 a 80 \mug/ml. La reducción media de la
infectividad, resultante de la presencia del anticuerpo monoclonal
222, es del 80%, lo cual es altamente significativo (p >
0,0001).
Para determinar si los efectos neutralizadores
de los anticuerpos monoclonales son aditivos, sinergéticos o
competitivos, se ensayan manteniendo la concentración de cada
anticuerpo monoclonal añadido en 4 \mug/ml, un nivel en el que
las diferencias son muy significativas. Los resultados de estos
estudios se representan gráficamente en la figura 7.
La adición de los anticuerpos monoclonales 1101
y 222 a los cultivos no tiene efecto aditivo ni sinergético en la
reducción de la infectividad, si se comparan por separado o en
combinación con el anticuerpo no específico 2F12. Aunque las
reducción de infectividad son significativas si se comparan con el
control negativo (p<0,001) y con el anticuerpo no específico
2F12 (p<0,002), no hay una interacción discernible entre las
combinaciones de anticuerpos en cuanto a infectividad. En ningún
caso, la neutralización alcanza el 100%. Esto sugiere que el
mecanismo de infectividad se satura por esta vía y tal vez existen
vías secundarias que pueden utilizarse para realizar la invasión.
También es posible que los anticuerpos no bloqueen por completo la
invasión a pesar de que cabría prever que el bloqueo de dos
antígenos diferentes pudiera tener un efecto aditivo, a menos que
los dos anticuerpos compitan por un sitio similar en el proceso de
invasión.
Por consiguiente, se han descrito la clonación,
expresión y caracterización de polipéptidos antigénicos de C.
parvum y anticuerpos que reconocen los epítopes de estos
polipéptidos así como los métodos para la utilización de los
mismos. Aunque se han descrito con detalle las formas de ejecución
preferidas de la presente invención, se da por supuesto que pueden
introducirse variaciones obvias sin apartarse del espíritu ni del
alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones
adjuntas.
Se ha efectuado el depósito de hibridomas útiles
para la puesta en práctica de la invención en la American Type
Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
(los depósitos se han recibido en la ATCC con fecha 16 de mayo de
2000, con las designaciones de depósito de patente ATCC
PTA-1879 y PTA-1880).
<110> UNIVERSIDAD DE MANITOBA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antígenos de Cryptosporidium
parvum, anticuerpos dirigidos contra los mismos y composiciones
terapéuticas y de diagnóstico que los contienen
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 08891854WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/CA01/00856
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-06-15
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/212,083
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1380
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cryptosporidium parvum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(397)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cryptosporidium parvum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cryptosporidium parvum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(590)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cryptosporidium parvum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcatatggc acgagaatta ccatctgat
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatatgtt aatttctcat ttgtacttg
\hfill29
Claims (23)
1. Un polipéptido inmunogénico aislado de C.
parvum elegido entre el grupo formado por (a) un polipéptido
que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, o un fragmento
inmunogénico del mismo que contiene por lo menos 15 aminoácidos y
(b) un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad de
secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
2. El polipéptido aislado de la reivindicación
1, dicho polipéptido contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO:2, o un polipéptido que tiene por lo menos un 90% de identidad de
secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
3. El polipéptido aislado de la reivindicación
2, dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO:2.
4. Una molécula de ácido nucleico que tiene una
secuencia codificadora de un polipéptido inmunogénico de C.
parvum según la reivindicación 3.
5. Un vector recombinante que contiene:
(a) una molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 4; y
(b) elementos de control que están unidos
operativamente con dicha molécula de ácido nucleico, dicha secuencia
codificadora puede transcribirse y traducirse a una célula
hospedante, y por lo menos uno de dichos elementos de control es
heterólogo con respecto a dicha secuencia codificadora.
6. Una célula hospedante transformada con el
vector recombinante de la reivindicación 5.
7. Un método para producir un polipéptido
recombinante de C. parvum que consiste en:
(a) proporciona una población de células
hospedantes según la reivindicación 6; y
(b) cultivar dicha población de células en
condiciones, en las que se exprese el polipéptido codificado por la
secuencia codificadora presente en dicho vector recombinante.
8. Una composición que contiene un vehículo
farmacéuticamente aceptable y un polipéptido inmunogénico de C.
parvum según la reivindicación 3.
9. La composición de la reivindicación 8, que
contiene además un polipéptido antigénico 2 de C. parvum
(AG2).
10. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 y 9, que contiene además un adyuvante.
11. Una composición que contiene un vehículo
farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo, o fragmento del mismo,
que reconoce al polipéptido inmunogénico de C. parvum según
la reivindicación 3.
12. La composición de la reivindicación 11, que
contiene el anticuerpo monoclonal 1101 producido por el hibridoma
de ATCC Accession No. PTA-1879.
13. La composición de la reivindicación 11, que
contiene los anticuerpos monoclonales 1101 y 222, producidos por
los hibridomas de ATTC Accession Nos. PTA-1879 y
PTA-1880, respectivamente.
14. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 8-10 para el uso como vacuna.
15. Uso de una composición según una cualquiera
de las reivindicaciones 8-13 para la fabricación de
un medicamento destinado al tratamiento o prevención de la
infección de C. parvum en un sujeto mamífero.
16. Un método para producir una composición que
consiste en:
(a) proporcionar un polipéptido antigénico de
C. parvum según una cualquiera de las reivindicaciones
1-3; y
(b) combinar dicho polipéptido con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
17. Un método para producir una composición que
consiste en:
(a) proporcionar un anticuerpo que reconoce a un
polipéptido inmunogénico de C. parvum según la reivindicación
3; y
(b) combinar dicho anticuerpo con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1101 producido por el
hibridoma de ATCC Accession No. PTA-1879.
19. Un método para detectar anticuerpos de C.
parvum en una muestra biológica que consiste en:
(a) aportar una muestra biológica;
(b) hacer reaccionar dicha muestra biológica con
un polipéptido inmunogénico de C. parvum según la
reivindicación 3, en condiciones que permitan a los anticuerpos de
C. parvum, si están presentes en la muestra biológica,
fijarse sobre dicho polipéptido de C. parvum para formar un
complejo de antígeno/anticuerpo; y
(c) detectar la presencia o ausencia de dicho
complejo,
detectando para ello la presencia o ausencia de
anticuerpos de C. parvum en dicha muestra.
20. Un método para detectar antígenos de C.
parvum en una muestra biológica que consiste en:
(a) aportar una muestra biológica;
(b) hacer reaccionar dicha muestra biológica con
un anticuerpo que reconozca a un polipéptido inmunogénico de C.
parvum según la reivindicación 3, en condiciones que permitan a
los antígenos de C. parvum, si están presentes en la muestra
biológica, fijarse sobre dichos anticuerpos de C. parvum para
formar un complejo de antígeno/anticuerpo; y
(c) detectar la presencia o ausencia de dicho
complejo,
detectando para ello la presencia o ausencia de
antígenos de C. parvum en dicha muestra.
21. El método de la reivindicación 20, en el que
el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1101 producido por el
hibridoma de ATCC Accession No. PTA-1879.
22. Un kit de ensayo inmunodiagnóstico para
detectar la infección de C. parvum, dicho kit de ensayo
contiene un polipéptido inmunogénico de C. parvum según la
reivindicación 3 e instrucciones para realizar dicho ensayo de
inmunodiagnóstico.
23. Un kit de ensayo inmunodiagnóstico para
detectar la infección de C. parvum, dicho kit de ensayo
contiene un anticuerpo que reconoce a un polipéptido inmunogénico
de C. parvum según la reivindicación 3 e instrucciones para
realizar dicho ensayo de inmunodiagnóstico.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21208300P | 2000-06-15 | 2000-06-15 | |
| US212083P | 2000-06-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2313962T3 true ES2313962T3 (es) | 2009-03-16 |
Family
ID=22789489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01944811T Expired - Lifetime ES2313962T3 (es) | 2000-06-15 | 2001-06-15 | Antigenos de cryptoosporidium parvun, anticuerpos dirigidos contra ellos y composiciones terapeuticas y de diagnostico basadas en los mismos. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6808900B2 (es) |
| EP (2) | EP1294889B1 (es) |
| AT (2) | ATE453714T1 (es) |
| AU (1) | AU6720601A (es) |
| CA (1) | CA2411949C (es) |
| DE (2) | DE60140972D1 (es) |
| ES (1) | ES2313962T3 (es) |
| WO (1) | WO2001096370A2 (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
| US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| DK3766518T3 (da) | 2005-12-29 | 2026-04-13 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Immunogen pcv2-sammensætning til mindskelse af kliniske symptomer hos grise |
| EP3868400A1 (en) | 2005-12-29 | 2021-08-25 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| US20100136060A1 (en) * | 2006-11-22 | 2010-06-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of reducing porcine circovirus-associated disease outbreaks |
| EP2859900A1 (en) * | 2006-12-11 | 2015-04-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
| PT2094872T (pt) * | 2006-12-15 | 2017-04-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc | Tratamento de porcos seropositivos para o anticorpo anti-pcv2 com antigénio de pcv2 |
| EP1941903A1 (en) | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| US7829274B2 (en) | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
| CN101932336B (zh) * | 2007-12-31 | 2014-07-09 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒 |
| KR20100113582A (ko) | 2008-01-23 | 2010-10-21 | 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 | Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법 |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| CN103503841B (zh) * | 2013-09-29 | 2016-01-20 | 捷胜海洋装备股份有限公司 | 一种浮球牵引机的牵引结构 |
| MX373884B (es) | 2013-10-02 | 2020-03-26 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Variante de la proteína pcv2 orf2 y partículas similares al virus compuestas por ésta. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993024649A1 (en) | 1992-05-29 | 1993-12-09 | The Regents Of The University Of California | Cryptosporidium polypeptides, nucleic acid, vectors and methods of use |
| EP0663010B1 (en) * | 1992-10-02 | 2000-08-09 | Research Corporation Technologies, Inc. | Methods for increasing secretion of overexpressed proteins |
| US5591434A (en) | 1993-05-26 | 1997-01-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | DNA sequence encoding surface protein of cryptosporidium parvum |
| AU740141B2 (en) * | 1996-08-23 | 2001-11-01 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona, The | Neutralization-sensitive epitopes of cryptosporidium parvum |
-
2001
- 2001-06-14 US US09/881,556 patent/US6808900B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-15 EP EP01944811A patent/EP1294889B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-15 AT AT06011952T patent/ATE453714T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-06-15 DE DE60140972T patent/DE60140972D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-15 AT AT01944811T patent/ATE407209T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-06-15 AU AU6720601A patent/AU6720601A/xx not_active Withdrawn
- 2001-06-15 ES ES01944811T patent/ES2313962T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-15 EP EP06011952A patent/EP1762620B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-15 CA CA2411949A patent/CA2411949C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-15 WO PCT/CA2001/000856 patent/WO2001096370A2/en not_active Ceased
- 2001-06-15 DE DE60135655T patent/DE60135655D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-23 US US10/948,490 patent/US7288621B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-09-13 US US11/900,817 patent/US7850972B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-29 US US12/915,711 patent/US8241871B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE407209T1 (de) | 2008-09-15 |
| US8241871B2 (en) | 2012-08-14 |
| EP1762620A3 (en) | 2007-04-04 |
| US6808900B2 (en) | 2004-10-26 |
| ATE453714T1 (de) | 2010-01-15 |
| US20080299143A1 (en) | 2008-12-04 |
| CA2411949C (en) | 2012-05-22 |
| EP1762620A2 (en) | 2007-03-14 |
| CA2411949A1 (en) | 2001-12-20 |
| US7288621B2 (en) | 2007-10-30 |
| US20050064553A1 (en) | 2005-03-24 |
| US20120045464A1 (en) | 2012-02-23 |
| EP1762620B1 (en) | 2009-12-30 |
| DE60140972D1 (de) | 2010-02-11 |
| DE60135655D1 (de) | 2008-10-16 |
| WO2001096370A9 (en) | 2002-09-19 |
| US7850972B2 (en) | 2010-12-14 |
| WO2001096370A3 (en) | 2003-01-03 |
| WO2001096370A2 (en) | 2001-12-20 |
| US20020034516A1 (en) | 2002-03-21 |
| EP1294889A2 (en) | 2003-03-26 |
| AU6720601A (en) | 2001-12-24 |
| EP1294889B1 (en) | 2008-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8241871B2 (en) | Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof | |
| ES2389719T3 (es) | Proteínas que comprenden regiones conservadas del antígeno de superficie de Neisseria meningitidis NhhA | |
| US8697856B2 (en) | Plasmodium vivax hybrid circumsporozoite protein and vaccine | |
| BRPI0309570B1 (pt) | fatores camp quiméricos para vacinação contra infecção por streptococcus | |
| ES2316450T3 (es) | Proteina gapc quimerica de streptococcus y su uso en vacunacion y diagnostico. | |
| ES2273861T3 (es) | Inmunizacion de ganado vacuno lechero con proteina gapc frente a infecciones por streptococcus. | |
| AU2009227821A1 (en) | GBS Toxin Receptor | |
| BR112021000312A2 (pt) | Vacina, peptídeos, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor de vacina, método de tratamento ou prevenção da infecção por map ou da condição ou sintoma associado à infecção por map e kit | |
| ES2255488T3 (es) | Clonacion y expresion de proteinas de union a transferrina de haemophilus somnus. | |
| AU2001267206B2 (en) | Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof | |
| ES2283419T3 (es) | Immunizacion de ganado lechero con proteina mig. | |
| AU2001267206A1 (en) | Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof | |
| AU2005239640B2 (en) | GBS Toxin Receptor | |
| AU2011202677A1 (en) | GBS Toxin Receptor |