ES2314097T3 - Nanoparticulas para la administracion de adn a un organo diana. - Google Patents
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Abstract
Uso de nanopartículas cargadas con ADN para la transfección de ADN en células in vitro, en el que las células son preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente células eucariotas en cultivo y/o en el que el ADN se selecciona del grupo que consiste en ADNs plásmidos y oligonucleótidos antisentido, preferiblemente del grupo que consiste en ADNs plásmidos que comprenden la información de genes supresores de tumores y oligonucleótidos antisentido contra oncogenes, y/o en el que el ADN se transfecta bajo el control de un promotor inducible, en el que las nanopartículas se prepararon mediante polimerización a partir de un monómero seleccionado entre alquilcianoacrilatos.
Description
Nanopartículas para la administración de ADN a
un órgano diana.
La presente invención se refiere al uso de
nanopartículas para la transfección de ADN en células eucariotas.
La presente invención también se refiere a la administración de ADN
a un órgano diana en el cuerpo humano o animal. En particular, la
presente invención se refiere al uso de nanopartículas para la
administración de ADN relacionado con el tratamiento del cáncer a
un órgano diana afectado por un tumor en el cuerpo humano o animal
como, por ejemplo, el cerebro en el caso de tumores cerebrales. La
presente invención también se refiere al uso de nanopartículas para
la fabricación de un medicamento contra tumores en un órgano diana
en el cuerpo humano o animal. La presente invención también se
refiere a un procedimiento de tratamiento centrado en la diana del
cuerpo humano o animal mediante la administración de ADN adecuado
para prevenir y/o tratar terapéuticamente cánceres.
Las nanopartículas tal como se utilizan en la
presente invención son partículas fabricadas de un polímero
sintético o natural y que tienen un diámetro en el intervalo de 1 a
1000 nm. Se podía observar en la técnica anterior que las
nanopartículas son adecuadas para unir (por ejemplo, adsorber,
absorber, comprender) sustancias naturales o sintéticas, tales como
fármacos, medicamentos, agentes de diagnóstico, oligonucleótidos
antisentido, proteínas, plásmidos, etc.) y transportar dichas
sustancias a órganos diana en el cuerpo humano o animal, como el
cerebro, hígado, riñones, etc. (WO 95/22963 y WO 98/56361).
Particularmente, se podía demostrar que las nanopartículas se
pueden utilizar para transportar medicamentos para el tratamiento de
cánceres a un órgano diana, incluyendo el cerebro. En otras
palabras: los medicamentos que en ningún caso pueden pasar a través
de la barrera hematoencefálica (bbb) son capaces de hacerlo mediante
su unión a nanopartículas adecuadas (WO 00/74658).
En particular, se observó que las nanopartículas
fabricadas mediante la polimerización de un monómero seleccionado
del grupo que consiste en metilmetacrilatos, alquilcianoacrilatos,
hidroxietilmetacrilatos, ácido metacrílico, dimetacrilato de
etilenglicol, acrilamida, N,N'-bismetilen
acrilamida, metacrilato de 2-dimetilaminoetilo,
N,N-L-lisindiiltereftalato, ácido
poliláctico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico,
polianhidratos, poliortoésteres, gelatina, albúmina, macromoléculas
o carbohidratos desolvatados, poliestireno,
poli(vinilpiridina), poliacroleína y poliglutaraldehído en
presencia de un estabilizante que permiten el paso de la barrera
hematoencefálica, estando dichas partículas opcionalmente
recubiertas por una sustancia, tal como Polisorbato® 80 (Monooleato
de Polioxietileno (20) sorbitano = Tween® 80) o similar, se pueden
utilizar para transportar fármacos para el tratamiento del cáncer,
tales como doxorrubicina, a un órgano diana específico, tal como
cerebro (mediante le paso a través de la barrera hematoencefálica),
mientras que otros órganos no están afectados por dicho
fármaco.
La transfección de genes o ADN, respectivamente,
en células in vivo con micropartículas se describe en la
Patente de Estados Unidos No. 6.248.720. Las micropartículas que
consisten en polímeros bioadhesivos, que se definen como polímeros
que tiene la capacidad de unirse al epitelio mucoso bajo condiciones
fisiológicas normales, se administran oralmente o por inhalación y
contienen genes bajo el control de un promotor. A continuación, el
gen liberado se puede utilizar para métodos terapéuticos de genes a
realizarse en la célula. Esta estrategia, sin embargo, no se podía
transformar en un método útil en la práctica para la transfección de
genes en todo tipo de células, particularmente debido al hecho de
que el gen o ADN, respectivamente, transportado por la
micropartícula no podía pasar a través de las barreras fisiológicas,
tales como la barrera hematoencefálica. Según esto, la patente de
Estados Unidos anterior da a conocer solamente una terapia génica
inespecífica para el tratamiento de células epiteliales, células
linfáticas asociadas a los intestinos, células de bazo o células de
hígado.
En una base mundial, los tumores del cerebro
pertenecen a los tumores más extendido observados en gente joven.
En los Estados Unidos, aparecen 180.000 nuevos casos de diferentes
tumores cerebrales, en particular tumores del grupo heterogéneo de
gliomas malignos, que cubre astrocitomas anaplásicos, glioblastomas
y, especialmente, el glioblastoma multiforme altamente maligno. El
hecho de que las preparaciones para suprimir farmacológicamente la
formación de reincidentes aún no esté disponible, da lugar a una
mortalidad elevada de gente joven afectada por dichos tumores. Por
lo tanto, es muy deseado hallar métodos de tratamiento
satisfactorios de dichos tumores con el fin de obtener una mejora
en la tasa de tratamiento satisfactorio.
Los gliomas malignos y los glioblastomas en
humanos, se tratan, en la mayoría de casos, mediante la extracción
quirúrgica del tejido tumoral, seguido de quimioterapia y/o
radiación. En muchos de los casos, el tratamiento por quimioterapia
no es satisfactorio, ya que existen dos barreras que superar para
agentes citostáticos en la etapa de tratamiento antes de tener su
efecto completo, es decir, la barrera hematoencefálica y una
quimiorresistencia intrínseca que aparece frecuentemente de la
barrera hematoencefálica y del tumor. Por lo tanto, es esencial en
la evolución del tratamiento farmacológico de tumores cerebrales del
tipo anterior desarrollar estrategias para el transporte de dichos
agentes quimioterapéuticos a través de la barrera hematoencefálica
in vivo. Entre los métodos conocidos se encuentran métodos de
apertura de barrera (tratamiento invasivo) para abrir la barrera
hematoencefálica, métodos de modificación del agente farmacológico,
mediante el cual la modificación permite que el agente atraviese la
barrera hematoencefálica y métodos de utilización de péptidos
quiméricos para dirigir moléculas pequeñas farmacológicamente
eficaces a sitios específicos en el cerebro.
En las publicaciones WO referidas anteriormente,
entre otras, se realizaron propuestas de sistemas de liberación de
fármacos que permiten el reconocimiento de fármacos, incluyendo
fármacos anticancerígenos, a órganos específicos en el cuerpo
humano o animal y, en particular, al cerebro, mediante lo cual los
fármacos que se sabe que no pasan la barrera hematoencefálica
podían ser transportados al cerebro con el fin de tratar los
cánceres de cerebro. Particularmente, después de recubrir
nanopartículas cargadas con un fármaco analgésico (por ejemplo, el
hexapéptido encefalina, dalargina) o con un fármaco anticáncer (por
ejemplo, doxorrubicina) con Polisorbato® 80 y administrar dichas
composiciones farmacológicas que contienen nanopartículas en un
vehículo adecuado al cuerpo humano o animal, se podía determinar un
aumento de la concentración de dichos fármacos en el cerebro, en
comparación con el caso de una administración de dichos fármacos
solos, pero sin el sistema de liberación de fármacos.
La mayoría de estrategias para liberar genes a
células utilizan virus o vectores virales en los que se insertan
genes o plásmidos. A continuación, las células o tejido del cuerpo
se exponen al virus o vector viral que contiene el gen o plásmido.
A continuación, el virus infecta o entra en la célula y libera el
gen o plásmido en el interior de la célula. De manera ideal, a
continuación el gen se transcribe en la célula y los productos de
transcripción resultantes son biológicamente activos. Sin embargo,
la estrategia que utiliza virus o vectores virales tiene numerosos
problemas, siendo uno de ellos que los vectores virales pueden
producir efectos secundarios tóxicos. Además, provocan una
respuesta inmune que es indeseable. Además, un gen que se expresa
de manera continua se puede "desconectar" mediante la respuesta
celular y, de este modo, se vuelve inactivo en un proceso de
tolerancia. Finalmente, los vectores virales, debido a su
distribución inespecífica en el cuerpo, no permiten un
reconocimiento de los genes/ADN en sitios específicos del cuerpo,
particularmente sin reconocimiento en áreas protegidas por barreras
naturales, tales como la barrera hematoencefálica.
Sabel B.A.:
"Forschungsthemen-und ziele", Otto von Guericke
Universität, Forschungsbericht 2001, página 229, sugiere realizar
más trabajo de investigación con nanopartículas con el fin de tratar
tumores. En particular, se sugiere unir, entre otras cosas, ADN
antisentido a nanopartículas con el fin de atravesar la barrera
hematoencefálica. No existe información contenida con respecto a la
naturaleza de las nanopartículas que deberían utilizarse para este
objetivo. De este modo, esta referencia no menciona los monómeros
utilizados para la polimerización de las nanopartículas y, además,
no menciona los alquilcianoacrilatos para producir estas
nanopartículas.
US 6.248.720 describe la transfección de genes o
ADN en células in vivo con micropartículas. Se describen
varios materiales para producir las micropartículas, y se indica que
las micropartículas bioadhesivas preferidas comprenden
polianhídridos. Los alquilcianoacrilatos no se mencionan en la
misma.
WO 00/74658 describe que las nanopartículas
fabricadas de un material polimérico se pueden utilizar para
dirigir una sustancia fisiológicamente activa a un sitio específico
en el cuerpo de un mamífero. Sin embargo, no habla sobre material
genético como sustancia efectiva para ser transportada por
nanopartículas.
Un objetivo de la presente invención era aplicar
la estrategia de transportar fármacos para el tratamiento del
cáncer y ADN a través de la barrera hematoencefálica a sustancias
adicionales eficaces en el tratamiento de cánceres, particularmente
de gliomas y glioblastomas. Un objetivo adicional de la presente
invención era utilizar nanopartículas para dirigir nuevos agentes y
fármacos eficaces en el tratamiento del cáncer a áreas específicas
del cuerpo humano o animal y, particularmente, para pasar dichos
fármacos y agentes a través de la barrera hematoencefálica. Un
objetivo adicional de la presente invención era proponer un medio
para una transfección de moléculas de ADN en células in
vitro más eficaz y más económica. Un objetivo adicional de la
presente invención era incluir en el gen a expresar un promotor
inducible que controla la expresión del gen en la célula en la que
se transfectan.
Ahora se ha descubierto sorprendentemente que no
sólo los fármacos anteriores (y muchos otros) se pueden transportar
a través de la barrera hematoencefálica mediante nanopartículas
recubiertas de manera adecuada, sino también macromoléculas, tales
como genes que suprimen la actividad del cáncer, se pueden unir a (o
incorporar a) nanopartículas adecuadas y, a continuación, se pueden
transportar fácilmente a través de la barrera hematoencefálica para
la supresión eficaz de la actividad cancerígena por un promotor
específico transportado de manera simultánea. También se observó
sorprendentemente que las nanopartículas son un medio muy eficaz y
barato para transfectar moléculas de ADN en células eucariotas
in vitro en una vía de liberación no viral. También era
sorprendente que se pueda controlar la acción de la expresión
génica, de manera que se puedan reducir los efectos tóxicos
inducidos por la expresión génica y se pueda disminuir la
probabilidad de que las células se vuelvan resistentes al producto
génico.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
al uso de nanopartículas cargadas con genes para la transfección de
ADN en células in vitro e in vivo, preferiblemente en
células eucariotas, más preferiblemente en el cerebro, y aún más
preferiblemente en el cerebro de pacientes que padecen de cáncer de
cerebro, según la reivindicación 1.
Además del uso en el cerebro de las
nanopartículas cargadas con genes, también se puede realizar en
otros órganos del mamífero afectados por tumores. Para dar sólo unos
pocos ejemplos, dichos otros órganos pueden ser el hígado, los
riñones, el intestino, el estómago, los pulmones y los
testículos.
La presente invención también describe un
proceso de administración de ADN a un órgano diana en el cuerpo
humano o animal, cuyo proceso comprende
- -
- preparar nanopartículas en una ruta de síntesis conocida per se;
- -
- cargar dichas nanopartículas con ADN;
- -
- administrar dichas nanopartículas cargadas de ADN al cuerpo humano o animal en una cantidad suficiente para obtener una concentración de ADN eficaz en el órgano diana.
La presente invención también va dirigida a un
medicamento según la reivindicación 2.
La presente invención también se refiere al uso
de nanopartículas obtenidas mediante un proceso descrito en detalle
a continuación para la administración de ADN a un órgano diana en un
cuerpo humano o animal.
La presente invención también se refiere al uso
de nanopartículas obtenidas mediante un proceso descrito en detalle
a continuación para la fabricación de un medicamento contra tumores
en un órgano diana del cuerpo humano o animal.
La presente invención finalmente también
describe un procedimiento de tratamiento centrado en una diana del
cuerpo humano o animal para evitar y/o tratar terapéuticamente el
cáncer, cuyo método comprende administrar al cuerpo una cantidad
eficaz de uno o más de un ADN eficaz contra el cáncer, siendo dicho
ADN administrado en una forma combinada con nanopartículas.
El término "nanopartículas", tal como se
utiliza en la presente invención, indica una estructura portadora
que es biocompatible y suficientemente resistente a la destrucción
química y/o física por el medio de uso, de manera que una cantidad
suficiente de nanopartículas permanece sustancialmente intactas
después de la entrada en el cuerpo humano o animal tras la
administración intraperitoneal u oral o intravenosa para ser capaces
de alcanzar el órgano diana deseado, por ejemplo, el cerebro, el
hígado, los riñones, etc. Normalmente, las nanopartículas son
partículas coloidales sólidas. Los fármacos u otros materiales
relevantes (por ejemplo, aquellos utilizados con fines de
diagnóstico en medicina nuclear o en terapia por radiación y/o
aquellos utilizados para fines de prevención y/o terapéuticos) se
pueden disolver en las nanopartículas atrapadas, encapsuladas y/o
adsorbidas o adheridas.
Las nanopartículas son partículas sintéticas
fabricadas de material polimérico natural o sintético. Las
partículas tienen un diámetro por debajo de 1000 nm, preferiblemente
entre aproximadamente 1 y 1000 nm.
En el proceso y el uso de la presente invención,
las nanopartículas comprenden un material polimérico que se
selecciona del grupo que consiste en polialquilcianoacrilatos,
preferiblemente polibutilcianoacrilatos. Entre los materiales
monoméricos particularmente adecuados para fabricar nanopartículas
biodegradables mediante la polimerización de emulsión en una fase
continua acuosa se incluyen alquilcianoacrilatos (preferiblemente
butilcianoacrilatos). Otras nanopartículas se fabrican mediante
técnicas diferentes a partir de alquilcianoacrilatos. Se ha
publicado un resumen de materiales y métodos de fabricación (véase,
J. Kreuter (1991) Nanoparticles-preparation and
applications. En: M. Donbrow (Ed.) Microcapsules and nanoparticles
in medicine and pharmacy. CRC Press, Boca Raton, Florida, páginas
125 a 141). Los materiales poliméricos que se forman a partir de
precursores monoméricos y/u oligoméricos en la etapa de
polimerización/generación de nanopartículas, son conocidos per
se de la técnica anterior, como lo son también los pesos
moleculares y la distribución de pesos moleculares del material
polimérico que una persona experta en la materia de la fabricación
de nanopartículas puede seleccionar de manera adecuada de acuerdo
con el conocimiento habitual. En este aspecto, se hace referencia a
Kreuter et al., loc. cit., y las referencias citadas en la
presente invención.
El término "ADN", tal como se utiliza en la
presente memoria y las reivindicaciones, se refiere básicamente a
cualquier ADN concebible en el presente campo de la técnica. En
realizaciones preferidas, el término "ADN" pretende comprender
dos tipos de ADN, es decir, ADN plásmido, más preferiblemente ADN
plásmido que comprende la información de genes supresores de
tumores, incluso más preferiblemente ADN plásmido que comprende la
información de los genes supresores de tumores p53 y pRB, por un
lado, y oligonucleótidos antisentido, más preferiblemente
oligonucleótidos antisentido contra oncogenes, incluso más
preferiblemente oligonucleótidos antisentido contra oncogenes, tal
como Bc12, por el otro lado. Se puede utilizar un tipo de ADN (y,
consecuentemente, un tipo de nanopartículas cargadas con ADN) en la
presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar dos o más
tipos de ADN, que dan lugar a una pluralidad de tipos de
nanopartículas cargadas con diferentes tipos de ADN y utilizables
según la presente invención.
Sorprendentemente, el ADN y particularmente el
ADN de los dos tipos anteriores se podían incorporar o adsorber a
nanopartículas y los dos complejos ADN-nanopartícula
resultantes se podían inocular en el organismo, particularmente en
el organismo que padece cáncer (específicamente, pero sin
limitación, el cáncer de cerebro). A continuación, se podía
observar la supresión de la proliferación tumoral, e incluso se
podía inducir una necrosis tumoral y apoptosis.
En una realización preferida, pero no esencial,
de la invención, el ADN plásmido que comprende un promotor, más
preferiblemente el ADN plásmido que comprende un promotor inducible,
se puede incorporar en las nanopartículas. Como la etapa novedosa
se incluye, en el ADN cargado o en la nanopartícula y a expresar en
la célula, un promotor inducible, se puede conseguir un control
externo de la expresión del gen relevante, y el gen se puede
conectar y desconectar según se desee. Como ventaja inesperada
sobre la técnica anterior, se puede controlar la acción de la
expresión de gen/ADN. Dicho control puede reducir los efectos
secundarios tóxicos de una expresión continua de genes y/o puede
reducir la probabilidad de que las células se vuelvan resistentes a
los productos génicos, produciendo una selección negativa.
En una realización preferida de la presente
invención, se utilizó la región reguladora en dirección 5' del
virus del papiloma humano (HPV-URR) como promotor
inducible. La expresión de supresor de tumores se induce después de
la administración de Dexametasona u otros inductores o compuestos.
De este modo, se podía conseguir la apoptosis de las células
tumorales, así como la regresión de tumor. Otros promotores de
ejemplo utilizables según la presente invención con el promotor del
virus citomegalia (CMV) o el promotor del virus de simio 40 (SV
40).
Además, se podían conseguir efectos intensos que
incluyen una regresión tumoral mediante una administración de
combinación de uno o más de un tipo de nanopartículas que contienen
ADN y nanopartículas que contienen una o más de una sustancia
citostáticamente eficaces. En una realización preferida, el ADN
supresor de tumores, incluso más preferido detrás de un promotor
inducible, se puede inyectar antes de la inoculación de un complejo
de nanopartículas que contiene un compuesto citostáticamente eficaz.
En una realización incluso más preferida de la administración de
combinación, el compuesto citostáticamente eficaz es
Doxorrubicina.
En el proceso de transfección de ADN en células,
y también en el proceso de administración de un ADN a un órgano
diana en el cuerpo humano o animal, la primera etapa comprende la
preparación de nanopartículas en una ruta de síntesis conocida
per se. Se puede utilizar básicamente cada ruta de síntesis
adecuada para la preparación de nanopartículas adecuadas para la
administración de ADN. En una realización preferida del proceso, la
síntesis se inicia a partir de uno de los materiales monoméricos,
siendo la base química para los polímeros mencionados
anteriormente. El material monomérico, u opcionalmente más de uno de
los materiales monoméricos mencionados anteriormente, se
polimerizan, preferiblemente en una etapa de polimerización entre
fases, en un no-disolvente adecuado para las
nanopartículas generadas. Como es habitual y descrito en detalle en
la técnica anterior a los que se hace referencia anteriormente, la
polimerización se realiza en presencia de un estabilizante adecuado
a temperaturas y en concentraciones conocidas para un experto en la
materia, por ejemplo, a partir de las referencias anteriores.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, el proceso de preparación de las nanopartículas puede
comprender la etapa de inclusión de un estabilizantes en las
nanopartículas. Por tanto, en tal caso, el estabilizante debe ser
un componente esencial de la composición para la preparación de
nanopartículas. Un estabilizante puede ser preferiblemente un
compuesto que tiene propiedades tensioactivas.
En realizaciones preferidas, sólo se utiliza un
estabilizante. En este caso, el transporte del ADN a una diana
específica en el interior o sobre el cuerpo humano o animal se puede
conseguir de una manera ideal. Por ejemplo, se puede transportar un
ADN y permitir que atraviese la barrera hematoencefálica (bbb) de
una manera eficaz, de manera que la cantidad de sustancia eficaz en
el punto de efecto aumenta de manera considerable, y la dosis
administrada al humano o animal se puede correspondiente reducir.
Sin embargo, también es posible utilizar más de uno, por ejemplo,
dos o más estabilizantes.
Básicamente, cada estabilizante que permite
conseguir el objeto de la presente invención es adecuado para ser
incorporado en el sistema de reconocimiento de fármacos de la
invención.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, dicho estabilizante para las nanopartículas que se
utiliza para la transfección del ADN en células o para la
administración de ADN de una manera dirigida se selecciona del
grupo que consiste en estabilizantes que permiten evitar la
aglomeración de nanopartículas. Más específicamente, el
estabilizante se puede seleccionar entre compuestos que fortalecen
el enlace ente el ADN y las nanopartículas.
En procesos específicamente ventajosos de
preparación de nanopartículas, dicho estabilizante comprende una
sustancia seleccionada del grupo que consiste en polisorbatos,
preferiblemente polisorbato 80, polisorbato 85, polisorbato 81;
dextranos y derivados de los mismos, preferiblemente, dextrano
12.000, dextrano 70.000, dietilaminoetil-(DEAE)dextrano,
ésteres de ácidos carboxílicos de alcoholes multifuncionales,
poloxámeros, poloxaminas, éteres alcoxilados, ésteres alcoxilados,
mono-, di- y triglicéridos alcoxilados, fenoles alcoxilados y
difenoles, sustancias de la series Genapol® y Bauki®, sales
metálicas de ácidos carboxílicos, sales metálicas de sulfatos de
alcohol y sales metálicas de sulfosuccinatos y mezclas de dos o más
de dichas sustancias. Por ejemplo, dicho estabilizante comprende
una sustancia seleccionada del grupo que consiste en polisorbato
80, polisorbato 85, polisorbato 81, dextrano 12.000, dextrano
70.000, DEAE-dextrano, ésteres de ácidos
carboxílicos y preferiblemente, ésteres de ácidos grasos de glicerol
y sorbitol, incluso más preferiblemente monoestearato de glicerol,
monoestearato sorbitano y monooleato sorbitano, poloxámero 188
(Pluronic® F68), éteres etoxilados, ésteres etoxilados,
triglicéridos etoxilados, fenoles y difenoles etoxilados, sales
metálicas de ácidos grasos y sales metálicas de sulfatos de alcohol
graso, preferiblemente sales sódicas de ácidos grasos y de sulfatos
de alcohol graso, incluso más preferiblemente estearato sódico y
lauril sulfato sódico y mezclas de dos o más de dichas
sustancias.
En el proceso de la invención, ha resultado que
las nanopartículas producen resultados especialmente buenos, si el
estabilizante de las nanopartículas utilizado en el proceso de
preparación comprende una sustancia seleccionada entre
DEAE-dextrano y mezclas del mismo con otros
estabilizantes, tal como se ha mencionado anteriormente. Cuando se
utilizan dichas partículas, se podía realizar muy bien la etapa de
dirigir la sustancia o sustancias fisiológicamente eficaces en un
sitio específico en el interior o sobre el cuerpo humano o animal.
En particular, en la etapa de dirigir el ADN a la barrera
hematoencefálica y penetrar dicha sustancia o sustancias la bbb sin
aglomeración de las partículas, se observó una cantidad eficaz
relativamente elevada del ADN en el cerebro disponible para la
acción en el tumor. De este modo, la eficacia del paso de dicha
sustancia a través de la bbb se podía aumentar, mientras la
cantidad de nanopartículas se podía reducir de manera particular si
las nanopartículas contenían DEAE dextrano como estabilizante,
opcionalmente mezclado con otros estabilizantes.
En una realización preferida de la presente
invención, el proceso de preparación de las nanopartículas puede
comprender la etapa de aplicar un recubrimiento a las nanopartículas
con el fin de permitir que el ADN se pueda transportar fácilmente
al órgano diana y/o pase a través de la barrera hematoencefálica.
Básicamente, también se pueden utilizar en la presente invención
todos los recubrimientos descritos en la técnica anterior que
permiten que las nanopartículas y/o sus componentes farmacológicos
pasen la barrera hematoencefálica. Se puede utilizar una sustancia
como recubrimiento, o un conjunto de sustancias (dos, tres, etc.
sustancias) se pueden utilizar como material de recubrimiento. En
una realización preferida, el recubrimiento puede comprender o
consistir en Polisorbato 80 (disponible comercialmente como Tween®
80 de ICI). El polisorbato 80 se puede utilizar solo o combinado
con otros materiales de recubrimiento adecuados, como, por ejemplo,
con Poloxámeros (disponible comercialmente como Pluronic® de BASF
Wyandotte). Las cantidades de material de recubrimiento utilizado
en la preparación de las nanopartículas se pueden seleccionar
fácilmente por un experto en la materia según las cantidades de
recubrimiento utilizadas en la técnica anterior. En una realización
particularmente preferida, la cantidad de material de
recubrimiento, cuando se preparan nanopartículas según el proceso de
la presente invención, se encuentra en el intervalo de 0,1 a 100
mg/ml de solución de recubrimiento, más preferiblemente en el
intervalo de 1 a 50 mg/ml, incluso más preferiblemente en el
intervalo de 5 a 20 mg/ml, por ejemplo 10 mg/ml.
La tercera etapa del proceso de transfección de
la presente invención comprende la etapa de adición de la
nanopartículas cargadas con ADN al cultivo de células, en las que el
ADN va a transfectarse. En una realización preferida de la presente
invención, esto se realiza en un medio de cultivo habitual y, más
preferiblemente, durante un tiempo suficiente para permitir que el
ADN se transfecte en las células. El tiempo (al igual que otras
condiciones de la reacción) se puede seleccionar libremente por un
experto en este campo de la técnica sin ninguna limitación,
particularmente, se pueden determinar las condiciones de reacción en
uno o dos experimentos de prueba orientativos. En realizaciones más
preferidas, el tiempo para incubar las nanopartículas cargadas con
ADN con las células en el cultivo se encuentra en un intervalo de 1
h a 72 h, incluso más preferiblemente en un intervalo de 6h a 36 h
y los más preferiblemente en un tiempo de 12 h a 30 h, por ejemplo
24 h. La concentración de nanopartículas cargadas con ADN en el
medio de cultivo para la etapa de transfección se encuentra
preferiblemente en el intervalo de 1 \mug a 20 \mug, incluso
más preferiblemente en el intervalo de 1 \mug a 10 \mug, por
ejemplo de 1 \mug a 6 \mug. Las temperaturas son temperaturas de
cultivo habituales para células y se pueden encontrar
preferiblemente en el intervalo de 20 a 40ºC, más preferiblemente en
el intervalo de 30 a 37ºC. En realizaciones específicas de la
presente invención, se puede utilizar sólo un medio de cultivo. Sin
embargo, se encuentra en la experiencia y conocimiento de un experto
en el presente campo que se pueden utilizar diferentes medios de
cultivo en el transcurso del procedimiento de transfección. Por
ejemplo, en el uso de la presente invención, se prefiere que el
complejo de nanopartículas y ADN se añada al medio de cultivo
normal que es, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado (MEM) o Medio
de Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM), y las
nanopartículas cargadas con ADN se incuben con las células en dicho
cultivo durante un cierto tiempo, por ejemplo, 5 h. Cinco horas
después de la adición, se cambia el medio de cultivo,
preferiblemente a medio nuevo, incluso más preferiblemente a medio
nuevo del mismo tipo, y las células se cultivan durante otro
periodo de tiempo, por ejemplo, durante otras 24 h, en condiciones
normales, por ejemplo (sin limitación) a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contenía CO_{2} al 5%. La determinación de una
transfección satisfactoria del ADN en las células se puede llevar a
cabo de las maneras habituales, las vías preferidas de las cuales
son una visualización de la expresión de genes informadores después
de la fijación de las células mediante reacción química o mediante
fluorescencia. Además, se analiza la transcripción de otros genes
mediante, por ejemplo, la técnica de transferencia Northern.
La tercera del proceso de administración de la
presente invención es la administración de las nanopartículas
cargadas con ADN, preparadas y cargadas en las dos etapas previas tal como se ha descrito anteriormente, al
cuerpo humano o animal en una cantidad suficiente para obtener una concentración de ADN eficaz en un órgano
diana.
cargadas con ADN, preparadas y cargadas en las dos etapas previas tal como se ha descrito anteriormente, al
cuerpo humano o animal en una cantidad suficiente para obtener una concentración de ADN eficaz en un órgano
diana.
La administración se puede realizar por cada vía
adecuada. Por ejemplo, las nanopartículas cargadas con ADN se
pueden administrar por vía oral, subcutánea, intravenosa, o
intraperitoneal, y se prefieren particularmente las vías
intravenosa o intraperitoneal. En realizaciones específicas de la
presente invención, también es posible una combinación de más de
una de las vías mencionadas anteriormente. El ADN se transporta al
órgano diana, portado por las nanopartículas, donde el proceso de
la presente invención consigue de manera particular un
reconocimiento del ADN en los órganos específicos, mientras que
otros se dispondrán sin el ADN. Esto permite la reducción de la
dosis de nanopartículas cargadas con ADN y permite simultáneamente
la prevención de efectos secundarios en otros sitios del cuerpo
humano o animal.
En cualquier caso, la concentración de ADN
obtenida en el órgano diana debe ser una concentración eficaz en el
tratamiento del cáncer.
En una realización particularmente preferida, se
podría aprender que, con el fin de obtener la concentración
anterior en el órgano diana, la cantidad de nanopartículas cargadas
con ADN por unidad de dosificación debería estar en el intervalo de
mg a 20 mg, basado en 1 kg de peso corporal de humano o animal a
tratar. Se deberían administrar por día de 1 a 4 unidades de
dosificación, preferiblemente de 1 a 3 unidades de dosificación,
con el fin de obtener el efecto anticancerígeno deseado en el órgano
diana.
Según la presente invención, las nanopartículas
cargadas con ADN seleccionado del grupo que consiste en ADN
plásmido y oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para un
tratamiento eficaz de cánceres, particularmente si el órgano diana
es el cerebro. Otros órganos dianas pueden ser el hígado, los
riñones, el intestino, el estómago, los pulmones y los testículos.
Después de utilizar las nanopartículas cargadas con ADN, la
concentración de ADN eficaz en el órgano diana se podía aumentar
considerablemente en comparación con el caso de la administración
de ADN no cargado en nanopartículas. Particularmente, en los casos
en los que la administración de nanopartículas cargadas con ADN se
combina con la administración de nanopartículas cargadas con un
medicamento anticancerígeno/sustancia citostáticamente eficaz, se
podía conseguir la apoptosis de células tumorales y una regresión
sustancial del
tumor.
tumor.
La presente invención también se refiere al uso
de nanopartículas cargadas con ADN para la administración de ADN a
un órgano diana en el cuerpo humano o animal. Dicho uso puede ser un
uso en el que las nanopartículas están cargadas con ADN (un ADN o
un conjunto de ADNs) solo o un uso en el que las nanopartículas
están cargadas con ADN (un ADN o un conjunto de ADNs) que comprende
un promotor inducible. En el último caso, el ADN o ADNs que
comprende un promotor inducible se puede administrar al cuerpo
mediante nanopartículas. En una realización preferida, el ADN es un
tipo de ADN o es más de un tipo de ADN, por ejemplo, dos tipos de
ADN que están cargados en el mismo tipo de nanopartículas o en
diferentes tipos de nanopartículas para dar lugar a un tipo o dos
tipos diferentes de nanopartículas cargadas con ADN. En
realizaciones preferidas de dicho uso, el ADN es ADN relacionado
con el tratamiento del cáncer y, más preferiblemente, se selecciona
del grupo que consiste en ADNs plásmidos y oligonucleótidos
antisentido, preferiblemente del grupo que consiste en ADNs
plásmidos que comprenden la información de los genes supresores de
tumores y oligonucleótidos antisentido contra oncogenes. En una
realización aún más preferida, el ADN se selecciona del ADN plásmido
que comprende la información de los genes supresores de tumores p53
y pRB y oligonucleótidos antisentido contra oncogenes, tales como
Bcl2 o Tgf\beta.
La presente invención se refiere además al uso
de nanopartículas cargadas con ADN para la fabricación de un
medicamento contra tumores en un órgano diana del cuerpo humano o
animal. Dicho uso puede ser un uso en el que las nanopartículas
están cargadas con ADN (un ADN o un conjunto de ADNs) solo o un uso
en el que las nanopartículas están cargadas con ADN (un ADN o un
conjunto de ADNs) que comprende un promotor inducible para dicho
ADN o ADNs. En el último caso, el ADN o ADNs que comprenden un
promotor inducible se pueden utilizar para la fabricación de un
medicamento. El órgano diana de destino puede ser preferiblemente el
cerebro. En otras realizaciones, los órganos diana pueden ser uno o
más órganos seleccionados del grupo que consiste en el cerebro, el
hígado, los riñones, el intestino, el estómago, los pulmones y los
testículos. En una realización preferida, el ADN es un tipo de ADN
o es más de un tipo de ADN, por ejemplo, dos tipos de ADN que están
cargados en el mismo tipo de nanopartículas o en diferentes tipos
de nanopartículas para dar lugar a un tipo o dos tipos diferentes
de nanopartículas cargadas con ADN. En realizaciones preferidas de
dicho uso, el ADN es ADN relacionado con el tratamiento del cáncer
e, incluso más preferiblemente, se selecciona del grupo que consiste
en ADNs plásmidos y oligonucleótidos antisentido, preferiblemente
del grupo que consiste en ADNs plásmidos que comprenden la
información de los genes supresores de tumores y oligonucleótidos
antisentido contra oncogenes. En una realización aún más preferida,
el ADN se selecciona del ADN plásmido que comprende la información
de los genes supresores de tumores p53 y pRB y oligonucleótidos
antisentido contra oncogenes, tales como Bcl2 o Tgf\beta. Dichos
medicamentos basados en nanopartículas pueden ser inmensamente
ventajosos sobre fármacos y sustancias químicas anticancerígenas
habituales, ya que se pueden administrar fácilmente a un paciente,
o un paciente puede tomar por sí solo los medicamentos sin los
riesgos que previenen, hasta ahora, una automedicación en casos de
cáncer. Además, tal como se ha indicado anteriormente, dichos
medicamentos se pueden combinar con nanopartículas cargadas con
medicamentos anticancerígenos y, particularmente, agentes
citostáticamente eficaces. Mediante dichas combinaciones, se puede
realizar un tratamiento incluso más eficaz de tumores no tratables
en otros casos.
Particularmente, con las nanopartículas cargadas
con ADN utilizadas en el campo de la presente invención, el ADN
relacionado con el tratamiento del cáncer, opcionalmente en
combinación con otros medicamentos y agentes relacionados con el
tratamiento del cáncer, se pueden dirigir a un órgano específico en
el cuerpo humano o animal, específicamente a un órgano afectado por
un tumor. En una realización particularmente preferida, el órgano
afectado por el tumor es el cerebro, y la administración de las
nanopartículas que tienen adsorbidas a las mismas o adsorbidas
sobre las mismas o incluidas en las mismas uno o más de un ADN
permite el paso de dicho ADN a través de la barrera
hematoencefálica. Particularmente, es posible el tratamiento
dirigido de carcinomas malignos, tales como gliomas malignos,
astrositos anaplásicos, glioblastomas y, particularmente, del
glioblastoma multiforme.
Las nanopartículas cargadas con ADN utilizadas
en la presente invención también son utilizables en el tratamiento
terapéutico de genes de enfermedades hereditarias. Ejemplos de
dichas enfermedades hereditarias son síndrome adrenogenital (AGS),
déficit de alfa-1 tripsina, resistencia a la APC
tipo leiden, corea de Huntington, fibrosis quística, mutación del
factor V leiden, síndrome X frágil, síndrome de gaucher,
hemocromatosis, homocistinuria, hipercolesterolemia,
hiperlipidemias tipo III, secuencia de lisencefalitis aislada,
síndrome de cri-du-chat, síndrome
de lesch-nyhan, lisencefalitis, síndrome de
Miller-dieker, morbus osler, morbus fabry,
mucoviszidosis, musculodistrofia, fenilcetonuria, mutación de la
protrombina, retinoblastoma y síndrome de
Walker-warburg.
Resumiendo las ventajas, las nanopartículas
cargadas con ADN utilizadas según la presente invención se pueden
disponer fácilmente en la terapia anticancerígena específica debido
a su propiedad de que son dirigidas específicamente a un órgano
diana en el cuerpo humano o animal sin afectar a otros órganos. Esto
permite la reducción de la administración de agentes
citostáticamente eficaces. En combinación con éstas, se pueden
reducir considerablemente dosis de citostáticos que producen
efectos secundarios y perjudiciales.
\newpage
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la presente invención. Los ejemplos se refieren sólo a
realizaciones preferidas y no deberían interpretarse que limitan la
presente invención.
Ejemplo
1
La carga de ADN mediante adsorción en las
nanopartículas se podía realizar de la siguiente manera: 10 mg de
nanopartículas de PBCA-(DEAE dextrano) liofilizadas se prepararon
mediante polimerización, en una vía habitual para la fabricación de
nanopartículas, de butil cianoacrilato al correspondiente polímero
(polibutil cianoacrilato = PBCA) que tiene un peso molecular
promedio de aproximadamente 1.547 g/mol y que contiene Dextrano
70.000 y dietilaminoetil dextrano (DEAE-dextrano) en
una proporción molar de 1,5 a 1 como estabilizante. Las
nanopartículas que tienen un diámetro promedio de aproximadamente
200 a 300 nm se resuspendieron en 1 ml de una solución de tampón
fosfato que tenía un pH de 4,5 a 5,5 con agitación. Se añadieron a
la suspensión de 20 a 150 \mug/ml de ADN (ADN plásmido que
comprende la información del gen supresor de tumores p53) en tampón
fosfato o, alternativamente, en agua), continuando la agitación
durante 4 a 16 horas. Después de la centrifugación de la mezcla, se
analizó el sobrenadante mediante espectroscopía UV. Se recuperó el
residuo de nanopartículas cargadas con ADN y se resuspendió en 1 ml
de agua filtrada millipore. Se añadieron 10 mg de Tween® 80 a la
suspensión con el fin de proporcionar un recubrimiento a las
nanopartículas. La suspensión se agitó durante 30 minutos, seguida
de la centrifugación para eliminar el componente de recubrimiento no
unido. El residuo resultante se resuspendió de nuevo en 1 ml de
solución salina de NaCl al 0,9%; la suspensión así obtenida estaba
lista para la inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para la transfección de ADN en las células in
vitro, se añadió un complejo de nanopartículas y ADN (ADN
plásmido que comprendía la información del gen supresor de tumores
p53) a células cultivadas en D-MEM (medio de Eagle
modificado por Dulbecco). 5 horas después de la adición del complejo
de nanopartículas y ADN, se cambió el medio (a
D-MEM nuevo) y se incubó adicionalmente a 37ºC
durante 24 horas. Se visualizó la expresión de los genes
informadores (informador = \beta-galactosidasa,
proteína de luz verde, después de un promotor heterólogo) después
de la fijación de las células mediante reacción química o
fluorescencia. La transcripción de otros genes se analizó mediante
Transferencia Northern.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La eficacia de nanopartículas cargadas con genes
informadores (informador = \beta-galactosidasa,
proteína de luz verde, después de un promotor heterólogo) se analizó
adicionalmente en un test modelo con ratas. Las ratas de la cepa CD
Fisher se inocularon intracranealmente con células de las líneas de
células de glioma C6, F98 o RG2, las últimas dando lugar a un
rápido crecimiento de tumores.
Se narcotizaron ratas macho Fisher CD (edad: 15
semanas, 250 g) con Ketanest (80 mg/kg, i.p.) y, a continuación,
Rompun (12,5 mg/kg i.m.). A continuación, se fijó la cabeza en un
aparato estereotáctico y se abrió (3 a 4 mm lateral, lado derecho
próximo al bregma, diámetro del agujero, 1 mm), mediante un taladro
de alta velocidad. Mediante una aguja de 26G conectada a una
micro-jeringa Hamilton, se inocularon 1 x 10^{3}
células tumorales suspendidas en un medio sin suero (3 \mul) en
una profundidad de 4 mm en el cerebro. La sutura se cerró mediante
grapas.
En un test histológico, se determinó la
distribución de las nanopartículas cargadas con ADN mediante la
administración sistemática a los animales de una suspensión de
complejo ADN-nanopartícula cargado con genes
informadores en una cantidad de 5 mg/500 \mul (el volumen
inyectado fue de 500 \mul). Se realizó una perfusión después de
24 horas y después de 5 días. Los cortes troceados del criostato no
teñidos de todos los órganos sirvieron para determinar la
localización de las partículas fluorescentes mediante la observación
de los trozos con un microscopio fluorescente. La localización
exacta se determinó con trozos paralelos teñidos con azul de
metileno. Se encontró la expresión de genes informadores en el
cerebro, el hígado, el bazo, los riñones y los intestinos, de
manera más dominantes en el tejido de tumor cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\bullet WO 9522963 A [0002]
\bullet WO 9856361 A [0002]
\bullet WO 0074658 A [0002] [0011]
\bullet US 6248720 B [0004] [0010]
\bullet US 180000 A [0005]
\bullet
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KREUTER. Microcapsules and nanoparticles in medicine and
pharmacy. CRC Press, 1991, 125-141
[0023]
Claims (11)
1. Uso de nanopartículas cargadas con ADN para
la transfección de ADN en células in vitro, en el que las
células son preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente
células eucariotas en cultivo y/o en el que el ADN se selecciona
del grupo que consiste en ADNs plásmidos y oligonucleótidos
antisentido, preferiblemente del grupo que consiste en ADNs
plásmidos que comprenden la información de genes supresores de
tumores y oligonucleótidos antisentido contra oncogenes, y/o en el
que el ADN se transfecta bajo el control de un promotor inducible,
en el que las nanopartículas se prepararon mediante polimerización a
partir de un monómero seleccionado entre alquilcianoacrilatos.
2. Medicamento para la administración
intraperitoneal o intravenosa que contiene nanopartículas cargadas
con ADN para la administración de ADN a un órgano diana en el cuerpo
humano o animal, en el que las nanopartículas se prepararon
mediante polimerización a partir de un monómero seleccionado entre
alquilcianoacrilatos, y en el que el medicamento comprende
preferiblemente además nanopartículas cargadas con un medicamento
anticancerígeno, preferiblemente con un agente citostáticamente
eficaz.
3. Medicamento según la reivindicación 2, en el
que se utiliza un estabilizante en el transcurso de la
polimerización de dicho monómero o monómeros a las nanopartículas,
preferiblemente en el que se utiliza dietilaminoetil dextrano como
estabilizante.
4. Medicamento según las reivindicaciones 2 ó 3,
en el que se aplica un recubrimiento a las nanopartículas,
preferiblemente un recubrimiento tensioactivo, más preferiblemente
un recubrimiento fabricado de Tween 80, y/o en el que el ADN se
selecciona del grupo que consiste en ADNs plásmidos y
oligonucleótidos antisentido, preferiblemente del grupo que
consiste en ADNs plásmidos que comprenden la información de genes
supresores de tumores y oligonucleótidos antisentido contra
oncogenes.
5. Medicamento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, que proporciona una concentración de ADN en
el órgano diana en una concentración eficaz para el tratamiento del
cáncer o en una concentración eficaz para el tratamiento de
enfermedades hereditarias y/o en el que la cantidad de
nanopartículas cargadas con ADN por unidad de dosificación se
encuentra en el intervalo de 5 a 20 mg/kg de peso corporal y/o en el
que la administración se encuentra en forma de 1 a 4 unidades de
dosificación por día, preferiblemente de 1 a 3 unidades de
dosificación por
día.
día.
6. Uso de nanopartículas cargadas con ADN que
comprenden opcionalmente un promotor inducible para la fabricación
de un medicamento para la administración intraperitoneal o
intravenosa contra tumores en un órgano diana del cuerpo humano o
animal, en el que las nanopartículas se prepararon mediante
polimerización a partir de un monómero seleccionado entre
alquilcianoacrilatos, y en el que el ADN es preferiblemente un ADN
relacionado con el tratamiento del cáncer.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el
ADN se selecciona del grupo que consiste en ADNs plásmidos y
oligonucleótidos antisentido, preferiblemente del grupo que consiste
en ADNs plásmidos que comprenden la información de genes supresores
de tumores y oligonucleótidos antisentido contra oncogenes y/o en el
que el promotor se selecciona del grupo que consiste en la región
reguladora en dirección 5' del virus del papiloma humano
(HPV-URR), el promotor del virus citomegalia (CMV) y
el promotor del virus de simio (SV 40).
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
6 ó 7, en el que el órgano diana es un órgano diana afectado por un
tumor, en el que el órgano u órganos diana son preferiblemente el
cerebro, el hígado, los riñones, el intestino, el estómago, los
pulmones y/o los testículos, preferiblemente en el que el órgano
diana es el cerebro, y/o en el que el tumor se selecciona del grupo
que consiste en gliomas malignos, astrocitomas anaplásicos,
glioblastomas y glioblastoma multiforme.
9. Proceso de preparación de nanopartículas
cargadas con ADN, que comprende:
- -
- preparar nanopartículas en una ruta de síntesis conocida per se; donde las nanopartículas se preparan mediante la polimerización a partir de un monómero seleccionado entre alquilcianoacrilatos; y
- -
- cargar dichas nanopartículas con ADN en una cantidad suficiente para obtener una concentración de ADN eficaz en el órgano diana,
- -
- donde dicho ADN o ADNs comprenden opcionalmente un promotor inducible.
10. Proceso según la reivindicación 9, en el que
las nanopartículas comprenden una sustancia del grupo que consiste
en estabilizantes y recubrimientos, seleccionando el estabilizante
preferiblemente del grupo que consiste en estabilizantes que
permiten evitar la aglomeración de nanopartículas y estabilizantes
que potencian el enlace entre el ADN o ADNs y las nanopartículas,
más preferiblemente estabilizantes seleccionados del grupo que
consiste en polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85, dextrano
12.000, dextrano 70.000, dietileaminoetil (DEAE) dextrano, ésteres
de ácidos grasos de glicerol y sorbitol, poloxámero 188, éteres
etoxilados, ésteres etoxilados, fenoles y difenoles etoxilados,
sales metálicas (preferiblemente sales sódicas) de ácidos grasos y
de sulfatos de alcohol graso, y mezclas de dos o más de dichas
sustancias.
11. Proceso según la reivindicación 10, en el
que las nanopartículas están recubiertas por una sustancia
seleccionada del grupo que consiste en Tween R 80, otros
polisorbatos, poloxámeros y polietilenglicol.
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