ES2314258T3

ES2314258T3 - Matriz y dosificacion enzimaticas.

Info

Publication number: ES2314258T3
Application number: ES03772547T
Authority: ES
Inventors: Jens-Oliver Sense Proteomic Limited KOOPMANN; Jonathan M. Sense Proteomic Limited BLACKBURN
Original assignee: Sense Proteomic Ltd
Current assignee: Sense Proteomic Ltd
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2003-10-27
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2023-10-27
Also published as: EP1576374B1; AU2003280177A1; WO2004038040A2; WO2004038040A3; US20060275855A1; EP1576374A2; ATE403876T1; DE60322742D1; AU2003280177A8

Abstract

Método de determinación de la actividad de una enzima, o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de la enzima, usando espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio que comprende: (i) proporcionar una sonda que porta una enzima inmovilizada; (ii) introducir opcionalmente el compuesto de prueba; (iii) introducir uno o más reactivos en la enzima inmovilizada durante un tiempo, y en una forma suficiente para que tenga lugar una reacción; (iv) secar opcionalmente la sonda; (v) someter la sonda a espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio; (vi) determinar la actividad de la enzima, o el efecto que el compuesto de prueba tuvo sobre la actividad de la enzima, detectando la presencia y/o ausencia de uno o más productos y/o el uno o más reactivos; caracterizado porque se proporciona una capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la superficie de la sonda, y en el que el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas mediante desorción-ionización por láser, preferiblemente un espectrómetro de masas MALDI.

Description

Matriz y dosificación enzimáticas.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad respecto al documento GB0311946.8, presentado el 23 de mayo de 2003, el documento GB0224872.2, presentado el 25 de octubre de 2002 y el documento PCT/EP02/14859, presentado el 20 de diciembre.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un ensayo enzimático y más particularmente a un ensayo de cinasa para su uso con un espectrómetro de masas mediante desorción/ionización por láser, tal como un espectrómetro de masas MALDI.

Antecedentes de la invención

Las aplicaciones proteómicas para espectrometría de masas han tenido un fuerte crecimiento en los últimos años. Los métodos analíticos usados en proteómica se basan principalmente en electroforesis en gel 2D para la separación de proteínas, y o bien espectrometría de masas o bien degradación de Edman para la identificación de proteínas. Las limitaciones de la electroforesis en gel 2D incluyen una resolución, sensibilidad y reproducibilidad relativamente escasas. Como resultado, los métodos proteómicos que evitan la electroforesis en gel 2D tales como purificación por etiqueta de afinidad codificada por isótopo (ICAT)^{1}, de proteína por afinidad en tándem (TAP)^{2} y el uso de micromatrices^{3} de proteína están ganando popularidad.

Además, estos nuevos métodos han ampliado el alcance de la proteómica desde la recogida y catalogación de datos de expresión diferencial hasta una fase en la que pueden asignarse relaciones entre moléculas y esto se ha denominado proteómica funcional. Recientemente se han usado micromatrices de proteína para analizar 119 cinasas^{4} de levaduras y una fracción principal del proteoma^{5} de levaduras.

Se han analizado micromatrices de proteína mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL), marcadores fluorescentes o radiactivos o mediante sistemas de detección a base de anticuerpos, pero hasta la fecha no mediante espectrometría de masas.

La dependencia actual del uso de ligandos marcados, tales como anticuerpos o sondas marcadas, para analizar micromatrices de proteína limita las aplicaciones para micromatrices de proteína. Por tanto, un sistema de detección libre de marcador sensible sería una gran ventaja y ampliaría el intervalo de aplicación a áreas en las que o bien no están disponibles compuestos marcados, o bien son demasiado caros o en las que el marcaje alteraría fundamentalmente las propiedades del ligando. Un método libre de marcador de este tipo sería particularmente útil en las fases tempranas del descubrimiento del fármaco, en las que se examinan grandes números de compuestos frente a proteínas.

Una sonda de espectrometría de masas de este tipo, con la que se ha fabricado una micromatriz enzimática, permite la interrogación de reacciones enzimáticas y el efecto que tienen compuestos sobre las mismas de una manera libre de marcador mediante desorción e ionización de reactivos y productos. La sonda y los métodos son particularmente útiles en el proceso de descubrimiento de fármacos, por ejemplo en evaluación de series de resultados positivos (hit series evaluation), optimización de compuestos de interés biomédico (lead optimization), toxicogenómica predictiva y perfilado del metabolito.

Sin embargo, las sondas y el método podrían usarse como herramienta de diagnóstico tanto para diagnosticar estados patológicos como monitorizar la evolución de la enfermedad.

Nelson (nov-dic. de 1997) Mass Spectrometry Reviews, vol. 16(6) páginas 353-376 describe el uso de sondas biorreactivas en la caracterización de proteínas.

Zhu et al (nov. de 2000), Nature Genetics, vol. 26, páginas 283-289 describe el análisis de proteína cinasas de levaduras usando chips de proteína.

El documento WO 00/04382 da a conocer matrices de proteína para el examen paralelo, in vitro, de la actividad biomolecular.

Sumario de la invención

Según la invención se proporciona un método de determinación de la actividad de una enzima, o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de la enzima, usando espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio que comprende:

i): proporcionar una sonda que porta una enzima inmovilizada;

ii): introducir opcionalmente el compuesto de prueba;

iii): introducir uno o más reactivos en la enzima inmovilizada durante un tiempo, y en forma suficiente para que tenga lugar una reacción;

iv): secar opcionalmente la sonda;

v): someter la sonda a espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio; y

vi): determinar la actividad de una enzima, o el efecto que el compuesto de prueba tuvo sobre la actividad de la enzima, detectando la presencia y/o ausencia de uno o más productos y/o el uno o más reactivos, caracterizado porque se proporciona una capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la superficie de la sonda, y en el que el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas mediante desorción-ionización por láser.

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Preferiblemente, la espectrometría de masas usa un espectrómetro de masas MALDI. Sin embargo, el experto apreciará que también pueden usarse otros numerosos métodos de espectrometría de masas que permiten el evento de ionización, incluyendo espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser, espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz (MALDI); y espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio (DIOS). Claramente, pueden usarse métodos de espectrometría de masas de transformada de Fourier (FT/MS) tales como espectrometría de masas de resonancia de ión ciclotrón por transformada de Fourier (FT-ICR) para potenciar la precisión de los diversos métodos de ionización.

Aunque el método puede usarse para estudiar cualquier reacción enzimática en la que uno o más reactivos se convierten en uno o más productos y o bien los reactivos y/o bien los productos pueden distinguirse usando, por ejemplo, espectrometría de masas MALDI, es particularmente adecuado como método para investigar cinasas ya que todas las cinasas usan y/o generan un nucleótido trifosfato (NTP) o un nucleótido difosfato (NDP), por ejemplo adenín trifosfato (ATP) o adenín difosfato (ADP) que pueden detectarse de manera fácil y distinguible. El experto entenderá que también pueden usarse otras especies de nucleótidos tales como guanina, uridina y citosina, aunque se prefiere la adenina debido al hecho de que proporciona un ensayo de más sensibilidad ya que la detección puede lograrse a niveles molares pico (10^{-12}). La sensibilidad se mejora usando espectrometría de masas MALDI debido a los efectos potenciadores de la matriz.

En una realización la etapa ii) es esencial, y se determina el efecto que el compuesto de prueba tiene sobre la actividad enzimática mediante la comparación con los resultados obtenidos cuando el compuesto de prueba está ausente. El ensayo puede ejecutarse sobre una única matriz, ejecutando dos o más ensayos en paralelo, o mediante comparación con un patrón. El compuesto de prueba puede añadirse antes, después o lo más preferiblemente con el uno o más reactivos.

El método puede usarse para proporcionar un resultado o bien cualitativo bien cuantitativo.

Preferiblemente, el método determinará la actividad de una o más cinasas o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de una o más cinasas usando espectrometría de masas MALDI. Por tanto, una matriz de cinasa para su uso en el método puede comprender una o más cinasas, por ejemplo, al menos 10, hasta 25, 50, 75, 100, 200, 300 o más de algunas de las más de 500 cinasas del cineoma. Éstas pueden disponerse sobre una micromatriz, estando depositada cada cinasa en un área diana diferenciada.

Para un ensayo de cinasas, el uno o más reactivos pueden comprender un donador de fosfato, un aceptor de fosfato y un catión divalente. El donador de fosfato puede ser un sustrato fosforilado y el aceptor de fosfato puede ser un nucleótido difosfato (NDP). La simplicidad del método reside en el hecho de que estos reactivos son comunes para todas las reacciones de cinasas permitiendo así que se aplique un único conjunto de condiciones a lo largo de una gama de cinasas. Esto significa que el ensayo es robusto y que permite que se use para selección de alto rendimiento.

Por supuesto, es posible usar sustratos genéricos así como diferenciados y se muestran ejemplos de cinasas y sus sustratos en las tablas 1 y 2, adjuntas al presente documento.

En una realización, el donador de fosfato es un nucleótido trifosfato (NTP) y el aceptor de fosfato es un sustrato que va a fosforilarse. Preferiblemente el catión divalente (M^{2+}) es magnesio o manganeso.

En otra realización, el producto es un nucleótido trifosfato o un nucleótido difosfato, cuya presencia se detecta. Por supuesto, dado que una reacción de cinasa típica es reversible, los reactivos pueden ser los productos y viceversa.

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Normalmente, el nucleótido trifosfato o nucleótido difosfato se detectan como [NTP]^{-} o [NDP]^{-} y/o como uno o más picos de aducto de los mismos. El uno o más picos de aducto son normalmente picos de aducto con un catión monovalente (M^{+}) (por ejemplo Na, K, Li.) dependiendo de los reactivos/tampones usados. El uno o más picos de aducto pueden incluir, por ejemplo, [ATP+M]^{-}, [ATP+2M]^{-} y [ATP+3M]^{-} y/o [ADP+M]^{-}, [ADP+2M]^{-} y
[ADP+3M]^{-}.

Un factor importante para poder lograr una buena detección es la selección de un tampón con bajo contenido en sal. Preferiblemente, el tampón con bajo contenido en sal es un "tampón semivolátil" tal como tampón bicarbonato de amonio. Tales tampones no dejan un residuo en evaporación a medida que se convierten en gases, que en el caso del bicarbonato de amonio son amoniaco, dióxido de carbono y agua. Alternativamente, dado que la mezcla de reacción sólo necesita ser un tampón "con bajo contenido en sal" en el punto de evaporación/ionización, sería posible usar un tampón que contiene una concentración superior de una sal semivolátil y luego, tras finalizar la reacción, eliminar el tampón semivolátil a vacío (o bien en la cámara de vacío del espectrómetro de masas o bien en una cámara de vacío externa). Sin embargo, esto es más complejo y menos deseable.

Una característica adicional y significativa de la invención reside en el hecho de que en un ensayo de cinasa los productos/reactivos detectados son pequeños; normalmente inferiores a 1000 daltons y en consecuencia el análisis de espectrometría de masas puede realizarse sin tener que recubrir la sonda con moléculas absorbentes de energía (matriz). Esto simplifica y acelera el procedimiento así como ahorra costes. Sin embargo, la adición de la matriz aumenta la sensibilidad.

Cuando se aplican moléculas absorbentes de energía, éstas deben aplicarse a la sonda en correspondencia con la enzima inmovilizada.

El uno o más reactivos, y si está presente el compuesto de prueba, se introducen preferiblemente en la enzima inmovilizada en forma compartimentalizada, tal como en forma de una gota. Preferiblemente, la gota tiene un volumen inferior a 1 microlitro.

Adicionalmente, se prefiere que el ensayo se realice en un entorno húmedo.

Por supuesto, así como a cinasas, el método de la invención puede aplicarse a otras enzimas. Por tanto, es posible estudiar reacciones enzimáticas de proteínas inmovilizadas sobre matrices de proteína mediante espectrometría de masas donde los reactivos y/o productos son ionizables y en las que la reacción enzimática conduce a un cambio de masa en el reactivo y/o producto. Este puede ser el caso de oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas y ligasas.

Se enumeran subclases típicas de enzimas de estos grupos de enzimas en la tabla 3 a continuación:

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TABLA 3

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3

4

Alternativamente, el método puede usarse para monitorizar reacciones enzimáticas que implican cosustratos (también reactivos en el contexto de esta solicitud) incluyendo NAD, NADP, NADH, NADPH, ATP, GTP, UTP, CTP, UDP-glucosa, UDP-glucosamina UDP-galactosa, piridoxalfosfato, UDP-N-acetil-D-glucosamina, GDP-D-manosa, dTDP-6-desoxi-L-manosa, GDP-6-desoxi-D-talosa, UDP-N-acetilmuramato, S)-3-hidroxiacil-CoA, S-adenosil-L-metionina, acetil-CoA, L-selenoseril-tARN^{sec}, (S)-3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA, 5,10-metilentetrahidrofolato, ascorbato, 2-oxoglutarato, glutatión, piruvato y tetrahidropteridina.

Esto es particularmente útil cuando los sustratos o productos no son ionizables o cuando la reacción no provoca un cambio de masa, tal como se observa para isomerasas (por ejemplo, fenilalanina racemasa que hidroliza ATP).

Más específicamente, la enzima se extrae de uno o más del grupo o de los grupos de aquellas familias de enzimas que son dianas de fármacos comunes, tales como proteína cinasas (incluyendo serina/treonina cinasas y tirosina cinasas), proteasas (incluyendo serina proteasas, cisteína proteasas, aspartil proteasas y metaloproteinasas), carboxilasas, esterasas, fosfodiesterasas, proteína fosfatasas (incluyendo tirosina fosfatasas), receptores acoplados a proteína G, chaperonas dependientes de ATP, ciclooxigenasas, citrocromo P450, sialidasas y deshidrogenasa/reductasas de cadena corta.

Puede proporcionarse una sonda para su uso con un espectrómetro de masas, que comprende un soporte que tiene una superficie diana electroconductora sobre el mismo caracterizado porque la superficie diana comprende una matriz que tiene una pluralidad de enzimas inmovilizadas sobre la misma.

Las enzimas pueden seleccionarse de los grupos de enzimas enumerados anteriormente. Se prefieren particularmente aquellas familias de enzimas que son dianas de fármacos comunes, particularmente aunque no exclusivamente cinasas.

Preferiblemente, la matriz es una micromatriz.

Las enzimas se unen preferiblemente a la sonda como proteínas de fusión, normalmente mediante una etiqueta, tal como, por ejemplo, biotina o una proteína de sh ble.

Se describen aspectos relacionados con la invención por completo en varias solicitudes de patente anteriores de los solicitantes incluyendo el documento WO 01/57198 y por tanto no se tratan con profundidad en el presente documento, pero como otros están todavía sin publicar, tales como el documento GB 0224872.2, se facilitan a continuación detalles relacionados y de apoyo:

Por tanto, las sondas a las que se hace referencia en el presente documento incluyen micromatrices, así como matrices en las que las manchas de proteína serán visibles a simple vista, y están adaptadas de modo que pueden interrogarse por medio de espectrometría de masas mediante desorción/ionización por láser, particularmente, aunque no exclusivamente, desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI).

Los aspectos adicionales incluyen métodos que conducen a la producción de una sonda de este tipo que puede interrogarse por medio de espectrometría de masas mediante desorción/ionización por láser, particularmente desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) y métodos de análisis tales como una micromatriz de proteína o sonda.

Por tanto, el desarrollo de una micromatriz de proteína compatible con EM MALDI, término que incluye micromatrices enzimáticas, fue complejo dado que los métodos existentes de formación de micromatrices de proteína no se transfieren fácilmente a una diana de MALDI. Hay varias razones por las que éste era el caso, incluyendo la naturaleza especializada de las superficies de la sonda y el potencial de que las sales presentes en tampones de reacción interfieran con el método de detección.

Los procedimientos conocidos en la técnica para MALDI requieren normalmente la cristalización conjunta del analito acuoso con moléculas ácidas absorbentes de energía, o "matriz", para promover la ionización de los analitos (Karas y Hillenkamp, 1988). El método de cristalización conjunta del analito y la matriz para MALDI, tal como se conoce en la técnica, da como resultado normalmente un proceso de cristalización heterogénea y produce cristales diferenciados, separados espacialmente que contienen cada uno diferentes cantidades de matriz y analito. Como consecuencia, se observa a menudo que cristales individuales contienen insuficiente analito para el análisis mediante MALDI. A su vez, esto da como resultado un requisito de que el analizador tome muestras de múltiples ubicaciones diferenciadas (es decir, 10-100 o más) dentro de un área diana dada con el fin de obtener una buena señal de analito; esto se denomina algunas veces "la búsqueda de la mancha óptima (sweet spot)". Esto ha impedido anteriormente la miniaturización dado que las manchas de proteína necesitan ser grandes. Eran generalmente del orden de al menos
0,5 mm^{2}.

Con el fin de generar micromatrices de proteína compatibles con MALDI EM, se requerían soluciones para las deficiencias mencionadas anteriormente de la técnica anterior que permitiesen tanto la miniaturización de las áreas diana como el análisis funcional de las proteínas dispuestas en matriz.

Tal como se define en el presente documento, una sonda es un soporte que puede actuar como una diana en análisis mediante espectrometría de masas mediante desorción/ionización, por ejemplo desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI). La sonda porta las enzimas, por ejemplo cinasas y se añaden los reactivos (y opcionalmente compuestos de prueba). Tras un tiempo suficiente para que tenga lugar una reacción, y se formen productos, las sondas se secan y se someten a espectrometría de masas. Los reactivos y/o los productos interaccionan con la lente reflectora del montaje iónico-óptico encontrado en espectrómetros de masas de tiempo de vuelo (TOF) mediante desorción/ionización por láser de la técnica, de modo que se convierten en iones gaseosos que permiten el análisis. Por ejemplo, las sondas de la invención se pueden obtener de dianas para análisis mediante MALDI tal como se conoce en la técnica, las cuales son tratadas de modo que un resto de enlace a proteína de alta afinidad, por ejemplo moléculas de estreptavidina, avidina o neutravidina, esté presente sobre la superficie de la sonda que se une a enzimas biotiniladas para su análisis posterior. Por ejemplo, puede usarse vidrio convencional o dianas de MALDI de oro.

Tal como se define en el presente documento, una micromatriz es una matriz en la que el tamaño de las áreas diana diferenciadas, es decir, las áreas individuales examinadas mediante sonda por un láser, está en el orden de micrómetros o inferior. Mientras que en el extremo superior de la escala, aproximadamente 1000 micrómetros de diámetro, pueden ser visibles a simple vista, en el extremo inferior de la escala las áreas diana diferenciadas no se distinguirán claramente a simple vista.

Las matrices se dispondrán normalmente en matrices que comprenden varias filas y columnas. El número de áreas diana diferenciadas dependerá de qué está siendo examinado, aunque generalmente es deseable tener una alta densidad de estas áreas diferenciadas sobre la superficie de la sonda ya que esto facilitará una selección de alto rendimiento. Normalmente, la sonda comprenderá al menos 10, más preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 1000 y tantas como 10.000 o más áreas diana producidas sobre la misma. (Normalmente, una superficie de sonda tendrá un área de aproximadamente 10.000 mm^{2} - una sonda Bruker tiene un área de 10.292 mm^{2} aunque no es un requisito usar la totalidad de la sonda y la micromatriz puede aplicarse en una o más matrices sobre la misma). La densidad real en una matriz dada dependerá del tamaño del área diana diferenciada (que normalmente se imprimirá como una mancha) y el espacio entre manchas adyacentes. Por tanto, las áreas diana diferenciadas estarán presentes normalmente a una densidad superior a 1 área diana diferenciada por mm^{2} dentro de cualquier matriz.

La enzima es el resto sobre el que se produce la reacción.

El término "enzima" tal como se usa en el presente documento se usa para incluir tanto enzimas completas como subunidades o dominios de las mismas.

"Proteína de fusión" tal como se usa en el presente documento se usa para referirse a una enzima, que tiene una etiqueta, por ejemplo una secuencia consenso de biotinilación o una proteína de unión de resistencia a fleomicina/zeocina unida a la misma.

"Moléculas de ligador" son moléculas que funcionan como sugiere su nombre. Son moléculas que comprenden grupos funcionales que permiten que se formen puentes entre moléculas diferentes.

Otro desarrollo significativo que permite la "miniaturización" de una matriz enzimática formada sobre una diana de MALDI deriva de la aplicación de la tecnología COVET del solicitante descrita en el documento WO 01/57198. En resumen, usando esta tecnología pueden crearse a partir de enzimas expresadas en bibliotecas de ADNc, que portan una "etiqueta de secuencia" que puede usarse para capturar las enzimas con una alta afinidad y en orientación específica sobre la superficie de la micromatriz. En primer lugar, esto permite que las enzimas, por ejemplo una biblioteca de cinasa, se inmovilice de manera estable de modo que se evita la lixiviación de las enzimas de la superficie y en segundo lugar la inmovilización orientada de la proteína de fusión sobre la superficie garantiza una actividad biológica
máxima.

Aún otro aspecto significativo, cuando se compara con micromatrices de proteína actuales, es la provisión de una sonda de este tipo con una superficie electroconductora. Esta superficie que incluye superficies semiconductoras es esencial cuando la sonda va a someterse a análisis mediante MALDI EM. Mientras que el soporte podría estar compuesto completamente por un material electroconductor (término que se usa en el presente documento para incluir materiales semiconductores), se prefiere recubrir un soporte rígido, por ejemplo un vidrio, con un material electroconductor tal como, por ejemplo, oro, aunque podría usarse cualquier metal, por ejemplo plata, platino, iridio, wolframio, cobre, cobalto, níquel y hierro o mezclas de los mismos, o un semiconductor, por ejemplo óxido de silicio, grafito u óxido de germanio.

Cuando la micromatriz enzimática o sonda se produce, por ejemplo, sobre un portaobjetos de vidrio de microscopio de tamaño convencional, puede montarse en un adaptador, que lo porta en un espectrómetro de masas. Se describe un adaptador de este tipo en la solicitud de patente británica en tramitación junto con la presente del solicitante número 0216387.1.

Una característica significativa adicional de la presente invención es la forma en la que el solicitante ha superado los problemas provocados por la enlace no específico de proteína. El solicitante ha superado este problema particular proporcionando una capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la superficie de la sonda. Más particularmente, la superficie de la micromatriz se modifica mediante la inclusión de una capa de moléculas que repelen a las proteínas. Estas moléculas repelentes de proteínas que incluyen, por ejemplo, polietilenglicol, pueden unirse a la superficie de la sonda mediante un ligador, tal como, por ejemplo, un poliaminoácido y que se unen fácilmente a, por ejemplo, una superficie de vidrio u oro y cuyos grupos laterales amino o carboxilo pueden usarse para unir las moléculas repelentes de proteínas de modo que se extienden desde la superficie de la sonda. El experto apreciará que podrían usarse otras moléculas funcionalizadas. Preferiblemente, los restos de unión a enzima se incorporan en una posición en la que se extienden desde la superficie. Los restos de unión a enzima preferidos incluyen, por ejemplo, biotina, biotina-neutroavidina y bleomicina, y estos y otros restos pueden incorporarse en la capa o bien mediante estos grupos funcionales en las moléculas de ligador y/o bien mediante grupos funcionales en las moléculas repelentes de proteínas. Normalmente, se incorporan restos de captura por afinidad en pequeñas proporciones (normalmente inferiores al 20%) en relación con las moléculas repelentes de proteínas.

De esta forma, el solicitante ha podido introducir los restos de captura de enzimas no sólo en una disposición espacial definida, homogénea sino también de una manera que permite el enlace de alta afinidad de una manera específica. La superficie resultante se combina selectivamente para la captura de macromoléculas biológicas sobre la sonda con unión reducida no específica del tipo observado comúnmente sobre superficies de metal o vidrio no derivatizadas y da como resultado adicionalmente una orientación y distribución homogéneas de las macromoléculas biológicas capturadas.

Las moléculas componentes responsables de la repulsión de proteínas no específicas incluyen moléculas que son generalmente de naturaleza hidrófila. Incluyen polímeros, tales como, por ejemplo, polietilenglicol, dextrano, poliuretano y poliacrilamida y monocapas autoensambladas (SAM). Preferiblemente, los polímeros comprenden uno o más grupos secundarios funcionales mediante los cuales pueden unirse los restos de captura de proteínas. En el caso de polietilenglicol, el grupo funcional es un grupo hidroxilo. Las moléculas responsables de la repulsión de proteínas no específicas pueden unirse directamente a la superficie como, por ejemplo, en el caso de SAM o pueden unirse mediante un ligador. Se prefieren particularmente como ligadores poliaminoácidos tales como, por ejemplo, poli-L-lisina, poli-ácido L-aspártico, poli-ácido L-glutámico o mezclas de los mismos.

Estos tienen cadenas laterales de amino o carboxilo mediante las cuales pueden unirse las moléculas responsables de la repulsión de proteínas no específicas y que pueden usarse adicionalmente para unir los restos de captura de proteínas. Alternativamente, o además, los restos de captura de proteínas pueden unirse mediante las moléculas componentes responsables de la repulsión de proteínas no específicas.

La figura 1 ilustra la unión de tales moléculas y compara la orientación definida que puede lograrse mediante este acoplamiento ordenado en comparación con la lograda usando técnicas de unión a anticuerpos actuales que dan como resultado un acoplamiento aleatorio.

En una realización preferida, la sonda tiene como sus restos de captura de enzimas o bien un aglutinante de biotina, por ejemplo neutravidina, avidina o estreptavidina o un aglutinante de proteína resistente a blemicina, por ejemplo bleomicina. Las enzimas se unen a la sonda para crear una micromatriz de proteína imprimiendo una pluralidad de lisados de células bacterianas, de levaduras, sf9 o de mamíferos que contienen proteínas de fusión en las que se expresa una etiqueta de alta afinidad, por ejemplo proteína resistente a biotina o zeocina (ZRP) sobre la superficie de captura. Las proteínas se derivan de la expresión de una biblioteca de ADNc y cada clon individual se marca en el extremo C-terminal y/o en el extremo N-terminal con una secuencia consenso, que permitirá el reconocimiento de alta afinidad de la enzima incluso en presencia por lo demás de las moléculas repelentes de proteína. Sólo la enzima recombinante marcada puede reconocer la superficie de captura y otras proteínas del lisado pueden eliminarse por lavado ya que no se unen a la superficie repelente de proteínas y no tienen una alta afinidad por los restos de unión a proteína presentes en la capa.

Puede proporcionarse un método de producción de una micromatriz enzimática para su uso con un espectrómetro de masas que comprende proporcionar una sonda y depositar la enzima en correspondencia con los restos de captura de proteínas en el área diana diferenciada.

Aún un aspecto adicional proporciona un método de análisis de una sonda en la que se depositan moléculas absorbentes de energía de una manera que desnaturaliza y por tanto separa una enzima de un resto de captura de proteínas dejando la enzima desnaturalizada separada sobre la superficie.

Las moléculas absorbentes de energía forman una capa homogénea de cristales en una ubicación diferenciada en correspondencia con los restos de captura de proteína y la enzima capturada.

La capa homogénea de cristales es sustancialmente continua de modo que los cristales individuales no son visibles a un aumento de 100 veces y no hay huecos visibles. También tiene una profundidad sustancialmente uniforme, de modo que no hay variación aparente en el tamaño del cristal a un aumento de 100 veces.

Las moléculas absorbentes de energía se depositan sobre la superficie en un disolvente no acuoso y el disolvente no acuoso se elimina por evaporación. Preferiblemente, el disolvente no acuoso es un disolvente orgánico, tal como, por ejemplo, acetona o butanona.

Preferiblemente, el disolvente no acuoso incluye un modificador que controla la tasa de evaporación de modo que se produce la cristalización de las moléculas absorbentes de energía sobre la sonda. Los modificadores adecuados incluyen glicerol, polietilenglicol y tioglicerol.

Preferiblemente, las moléculas absorbentes de energía se depositan en una mezcla de desde el 80-99,9%, preferiblemente el 99% de disolvente orgánico, por ejemplo acetona hasta el 20-0,1%, preferiblemente el 1% de modificador, por ejemplo glicerol (vol/vol). Las moléculas absorbentes de energía típicas incluyen cristales de ácido \alpha-ciano-4-hidroxi-cinámico, ácido sinapínico, ácido gentísico, nifidina, ácido succínico, 1,8,9-antracenitriol, ácido 3-indolacrílico, ácido 2-(hidroxifenilazo)benzoico, 4-nitroanilina y combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, las moléculas absorbentes de energía se depositan en correspondencia con la proteína y cada mancha de proteína se recubre con una mancha de tamaño similar de las moléculas absorbentes de energía.

Con el fin de lograr una alta densidad de muestras individuales sobre la micromatriz, las moléculas absorbentes de energía necesitan disponerse en microcristales sobre la superficie. La matriz forma una capa homogénea de cristales planos sin huecos significativos entre ellos y pueden depositarse en cantidades muy pequeñas sobre la micromatriz.

Al contrario que la técnica anterior en la que la matriz y el analito se cristalizan conjuntamente en un disolvente acuoso, el solicitante usa dos etapas distintas en las que se deposita en primar lugar la proteína en un disolvente acuoso y luego las moléculas absorbentes de energía se depositan de modo que cristalizan en el disolvente no acuoso sobre la sonda. Esto tiene la ventaja de que la proteína se deposita en su forma biológica. Sin embargo, el uso de un disolvente no acuoso para suministrar las moléculas absorbentes de energía permite la formación de una capa homogénea de microcristales.

Esto tiene dos beneficios. En primer lugar, la formación de una capa homogénea significa que no es necesario buscar una mancha óptima ya que la capa homogénea garantiza la proteína en presencia de moléculas absorbentes de energía y en segundo lugar da como resultado una medición más precisa debido a la naturaleza uniforme de la capa.

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Breve descripción de los dibujos

Los diversos aspectos de la invención se describirán ahora, a modo de ejemplo sólo, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos en los que:

la figura 1 muestra la unión orientada de las enzimas a una sonda

la figura 2 muestra la detección de ADP y ATP usando espectrometría de masas, y

la figura 3 también muestra la síntesis de ATP mediada por creatina fosfato sobre una superficie.

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Descripción detallada

Ejemplo 1

En referencia a la figura 2, se sintetizó ATP enzimáticamente a partir de la reacción de ADP, creatina fosfato y creatina cinasa (también conocida como creatina fosfocinasa) en bicarbonato de amonio 25 mM a pH 7,4. Se detectó [ADP]^{-} a 427,6 dalton y [ADP+Na]^{-} a 449,6 dalton. Se detectaron los productos de la reacción de creatina fosfato cinasa a 507,6, 529,6, 551,6 y 573,8, lo que se ajusta bien con el peso molecular esperado de [ATP]^{-} y tres aductos de sodio de ATP [ATP+Na]^{-}, [ATP+2Na]^{-} y [ATP+3Na]^{-}.

Las reacciones control en las que se omitió o bien uno de los sustratos de ADP o la creatina fosfato o bien la enzima creatina fosfato cinasa no mostraron picos de ATP.

Ejemplo 2

En referencia a la figura 3, el ejemplo demuestra la biotinilación, captura y desalación de creatina cinasa de músculo de conejo en una sonda recubierta con PEG-PLL-biotina neutravidina para su análisis mediante espectrometría de masas MALDI y la actividad enzimática de la cinasa inmovilizada usando espectrometría de masas MALDI.

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Material

Creatina cinasa de ATP del músculo de conejo: ADP de creatina N-fosfotransferasa, creatina fosfato, Tris HCl
1 mM pH 7,5, MgCl_{2} 1 mM, portaobjetos de vidrio recubierto con oro, PEG-PLL-biotina, neutravidina.

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Disoluciones

Tampón de lavado: Tris-HCl 1 mM pH 7,5 con Triton X-100 al 0,1%; tampón de desalación: Tris-HCl 1 mM pH 7,5.

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Síntesis del polímero de captura por afinidad

Se sintetizó el polímero de poli-L-lisina y PEG-biotina (PEG-PLL-biotina) según el protocolo de Ruiz Taylor^{6}. En resumen, se hicieron reaccionar 100 mg de poli-L-lisina (tamaño promedio 17-30 kDa; Sigma, Dorset, UK) con 109 mg de mPEG-SPA y 1,1 mg de biotina-PEG-CO-NHS (Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama) en 1 ml de tampón carbonato de sodio 100 mM pH 9 durante un periodo de 30 minutos. Se terminó la reacción mediante diálisis en Tris-HCl 1 mM pH 7,5 durante la noche. El producto de esta reacción se denominó PEG-PLL-biotina (el 1% de derivados de PEG contiene un grupo principal de biotina).

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Biotinilación de creatina cinasa

Se disolvió creatina cinasa (100 mg) en 1 ml de Tris HCl 1 mM pH 7,5 y se hicieron reaccionar 1 mg de biotina-PEO-amina de EZ link y 1 mg de etilendiaminacarbodiimida durante 20 minutos a temperatura ambiente.

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Preparación de la superficie de captura por afinidad

Se limpiaron cuidadosamente sondas de micromatrices de proteína antes de su uso con etapas de lavado secuenciales en acetona, acetonitrilo, agua bidestilada y se secaron bajo nitrógeno. Entonces se pipeteó polímero de captura por afinidad recién preparado PEG-PLL-biotina sobre la superficie de la sonda y entonces se distribuyó uniformemente sobre la superficie cubriéndola con película Nesco (Azwell Inc., Osaka, Japón). Tras 30 min., se lavó la sonda en Tris-HCl 1 mM pH 7,5, se secó bajo nitrógeno y entonces se recubrió con 0,5 mg/ml de neutravidina durante una hora a TA en una cámara húmeda. Entonces se aclaró la sonda con tampón de lavado, se lavó dos veces con tampón de desalación y se secó bajo nitrógeno. La superficie está ahora lista para usarse como un dispositivo de captura por afinidad sumamente específico para macromoléculas biotiniladas.

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Captura y detección de proteínas biotiniladas sobre la superficie de la sonda

Se recubrió una superficie de PLL-PEG-biotina neutravidina sobre una diana de MALDI con 50 ng de creatina cinasa biotinilada (Roche, Mannheim, Alemania). Se capturó la proteína biotinilada durante un periodo de 2 horas sobre la diana de MALDI en una cámara húmeda para evitar el secado, se lavó dos veces con tampón de lavado seguido por dos lavados con tampón de desalación, se secó la superficie bajo nitrógeno y se recubrió con 300 nl de una disolución saturada de ácido ciano-4-hidroxicinámico en acetona.

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Monitorización de la actividad cinasa de la creatina cinasa inmovilizada sobre la matriz de proteína

Se lava la matriz con la creatina cinasa inmovilizada con 100 ml de Tris-HCl 1 mM pH 7,5 y entonces se recubre con una mezcla de creatina fosfato 1 mM, ADP 1 mM, MgCl_{2} 1 mM y tampón bicarbonato de amonio 25 mM en un volumen inferior a 1 microlitro. La enzima y los sustratos se incuban en una cámara húmeda a 37ºC durante un periodo de 30 minutos. Se ejecutaron en paralelo reacciones que omitieron o bien ADP, creatina fosfato o bien la cinasa como controles específicos.

Resultados

La figura 3 muestra la detección de ADP y ATP. Se sintetizó ATP enzimáticamente a partir de la reacción de ADP, creatina fosfato y creatina cinasa en bicarbonato de amonio 25 mM a pH 7,4. Se detectó [ADP]^{-} a 427,6 dalton y [ADP+Na]^{-} a 449,6 dalton. Se detectaron los productos de la reacción de creatina cinasa a 507,6, 529,6, 551,6 y 573,8, lo que se ajusta bien al peso molecular esperado de [ATP]^{-} y tres aductos de sodio de ATP [ATP+Na]^{-}, [ATP+2Na]^{-} y [ATP+3Na]^{-}.

Las reacciones control en las que se omitieron o bien uno de los sustratos de ADP o creatina fosfato o bien la enzima creatina cinasa no mostraron picos de ATP.

1 Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F. Gelb, M. H. y Aebersold, R.. Nat Biotechnol. 1999; 17, 994-999.

2 Gavin AC, Bosche M, Krause R, Grandi P, Marzioch M, Bauer A, Schultz J, Rick JM, Michon AM, Cruciat CM, Remor M, Hofert C, Schelder M, Brajenovic M, Ruffner H, Merino. A, Klein K, Hudak M, Dickson D, Rudi T, Gnau V, Bauch A, Bastuck S, Huhse B, Leutwein C, Heurtier MA, Copley RR, Edelmann A, Querfurth E, Rybin V, Drewes G, Raida M, Bouwmeester T, Bork P, Seraphin B, Kuster B, Neubauer G, Superti-Furga G.. Nature 2002; 415 (6868), 141-147.

3 MacBeath, G., y Schreiber, S. F. Science 2000; 289, 1760-1763.

4 Zhu H, Klemic JF, Chang S, Bertone P, Casamayor A, Klemic KG, Smith D, Gerstein M, Reed MA, Snyder M. Nat Genet. 2000; 26(3): 283-9.

5 Zhu H, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M. Science 2001; 293, 2101-2105.

6 Natsume, T., Nakayama, H., Isobe, T. Trends Biotechnolo 2001; 10, 28-33.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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TABLA 2

Esta es una lista de sustratos disponible de Upstate.

http://www.upstate.com/features/kinaseprofiler.q./KinaseProfiler+%23153%3B#kinase1

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Claims

1. Método de determinación de la actividad de una enzima, o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de la enzima, usando espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio que comprende:

(i): proporcionar una sonda que porta una enzima inmovilizada;

(ii): introducir opcionalmente el compuesto de prueba;

(iii): introducir uno o más reactivos en la enzima inmovilizada durante un tiempo, y en una forma suficiente para que tenga lugar una reacción;

(iv): secar opcionalmente la sonda;

(v): someter la sonda a espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser asistida por matriz o espectrometría de masas mediante desorción-ionización sobre silicio;

(vi): determinar la actividad de la enzima, o el efecto que el compuesto de prueba tuvo sobre la actividad de la enzima, detectando la presencia y/o ausencia de uno o más productos y/o el uno o más reactivos;

caracterizado porque se proporciona una capa resistente frente al enlace no específico de proteína sobre la superficie de la sonda,

y en el que el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas mediante desorción-ionización por láser, preferiblemente un espectrómetro de masas MALDI.

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2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha capa resistente frente al enlace no específico de proteína comprende moléculas repelentes de proteínas tales como moléculas de polietilenglicol, moléculas repelentes de proteínas que están inmovilizadas sobre la superficie de la sonda.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la enzima es una cinasa tal como una serina cinasa, tirosina cinasa o treonina cinasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una ligasa, una carboxilasa, una esterasa, una fosfodiesterasa, una proteína fosfatasa tal como una tirosina fosfatasa, un receptor acoplado a proteína G, una chaperona dependiente de ATP, una ciclooxigenasa, un citocromo P450, una sialidasa, una deshidrogenasa de cadena corta, una reductasa de cadena corta o una isomerasa.

4. Método según cualquier reivindicación anterior para determinar la actividad de una o más cinasas o el efecto que un compuesto de prueba tiene sobre la actividad de una o más cinasas usando espectrometría de masas MALDI.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el uno o más reactivos comprenden un donador de fosfato, un aceptor de fosfato y un catión divalente.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el donador de fosfato es un sustrato fosforilado y el aceptor de fosfato es un nucleótido difosfato (NDP).

7. Método según la reivindicación 5, en el que el donador de fosfato es un nucleótido trifosfato (NTP) y el aceptor de fosfato es un sustrato que va a fosforilarse.

8. Método según la reivindicación 5, en el que el catión divalente es magnesio o manganeso.

9. Método según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el nucleótido difosfato o trifosfato es un adenín di o trifosfato.

10. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el producto es un nucleótido trifosfato o un nucleótido difosfato y se detecta su presencia.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el nucleótido trifosfato o nucleótido difosfato se detectan como [NDP]^{-} o [NTP]^{-} o como uno o más picos de aducto de los mismos.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el uno o más picos de aducto son picos de aducto con un catión monovalente (M^{+}).

13. Método según la reivindicación 12, en el que el uno o más picos de aducto incluyen: [ATP+M]^{-}, [ATP+2M]^{-} y [ATP+3M]^{-} y/o [ADP+M]^{-}, [ADP+2M]^{-} y [ADP+3M]^{-}.

14. Método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además, entre la etapa (iv) y la etapa (v), recubrir la sonda con moléculas absorbentes de energía.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dichas moléculas absorbentes de energía se depositan sobre la superficie de la sonda en un disolvente no acuoso, seguido por evaporación del disolvente.

16. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha sonda lleva más de una enzima.

17. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que en la etapa (iii) dicho uno o más reactivos se proporcionan en un tampón con bajo contenido en sal.

18. Método según la reivindicación 17, en el que dicho tampón con bajo contenido en sal es un tampón semivolátil tal como tampón bicarbonato de amonio.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que en la etapa (iii) dicho uno o más reactivos se proporcionan en un tampón semivolátil, y que comprende además la etapa, tras finalizar la reacción, de eliminar el tampón semivolátil.

20. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las enzimas se unen a la sonda como proteínas de fusión, normalmente mediante una etiqueta.

21. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho compuesto de prueba se añade antes, después o con el uno o más reactivos para determinar su efecto sobre la actividad enzimática.

22. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el uno o más reactivos y el compuesto de prueba opcional se introducen en la enzima inmovilizada como una gota, tal como una gota que tiene un volumen inferior a 1 microlitro.