ES2314263T3 - Proceso para la preparacion fermentativa de l-treonina,l-lisina,l-valina,l-homoserina usando cepas de la famimlia enterobacteriaceae que contiene una secuencia de orf y yjgf atenuada. - Google Patents

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Abstract

Proceso para la preparación de L-aminoácidos, escogidos del grupo de L-treonina, L-lisina, L-valina y L-homoserina, donde los siguientes pasos son llevados a cabo: a) fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales la expresión del ORF yjgF es eliminada por uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste de * deleción * inserción; y * transición o transversión b) concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos.

Description

Proceso para la preparación fermentativa de L-treonina, L-lisina, L-valina, L-homoserina usando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contiene una secuencia de ORF y yjgF atenuada.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina, L-valina, L-homoserina o L-treonina usando cepas de la familia Enterobacteriaceae en las cuales la expresión del Marco Abierto de Lectura (ORF) con la designación yjgF es eliminada.
Arte previo
Los L-aminoácidos, en particular la L-treonina, son usados en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de productos alimentarios y muy en particular en la nutrición animal.
Es conocida la preparación de L-aminoácidos por fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular de Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, el trabajo está siendo constantemente dirigido a mejorar los procesos de preparación. Las mejoras en estos procesos pueden relacionarse con las medidas de fermentación, tales como por ejemplo la agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los nutrientes del medio, tales como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la preparación del producto, por ejemplo por cromatografía de intercambio iónico o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.
Los métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes son usados para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a antimetabolitos como por ejemplo el análogo de treonina el ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico (AHV), o son auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácidos como por ejemplo L-treonina, son obtenidas de esta manera.
Los métodos de la técnica del ADN recombinante también han sido empleados durante algunos años para mejorar las cepas de la familia Enterobacteriaceae que producen L-aminoácidos, por amplificación de los genes individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigando el efecto en la producción. La información resumida sobre la biología molecular y celular de Escherichia coli y Salmonella se encuentra en Neidhardt (ed): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press, Washington, D.C., EE.UU.
Objetivo de la invención
El objetivo de la invención es proveer nuevas medidas para mejorar la preparación fermentativa de L-aminoácidos, escogidos del grupo de L-treonina, L-lisina, L-valina y L-homoserina.
Resumen de la invención
La invención provee un proceso para la preparación fermentativa de dichos L-aminoácidos, usando microorganismos de la familia Enterobacteriaceae los cuales, en particular, ya producen dichos L-aminoácidos y en los cuales al menos la expresión del ORF yjgF o los alelos del mismo es o son eliminados por uno o más métodos, seleccionados del grupo que consiste de deleción, inserción y transición o transversión.
Descripción detallada de la invención
Cuando los L-aminoácidos o aminoácidos sean mencionados en lo que sigue, esto quiere decir uno o más aminoácidos, incluyendo sus sales, escogidos del grupo que consiste de L-treonina, L-valina, L-lisina y L-homoserina. La L-treonina es particularmente preferida.
El término "atenuación" en este caso describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular o la concentración de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo las cuales son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo mediante el uso de un promotor débil o un gen o alelo u ORF, los cuales codifican para la enzima o proteína correspondiente con una baja actividad o inactiva la enzima o proteína o gen u ORF correspondiente y opcionalmente combinando estas medidas.
El Marco Abierto de Lectura (ORF) describe una sección de una secuencia nucleotídica que codifica o puede codificar para una proteína o polipéptido o ácido ribonucleico a los cuales no se les puede asignar ninguna función de acuerdo al estado de la técnica. Después de asignar una función a la secuencia nucleotídica de la sección en cuestión, esta es en general referida como un gen. Los alelos por lo general son entendidos como variantes significativas de un gen dado. Éstos son distinguidos por diferencias en la secuencia nucleotídica.
La proteína codificada por una secuencia nucleotídica como por ejemplo un ORF, un gen o un alelo, o el ácido ribonucleico codificado es en general denominado producto génico.
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Mediante medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente de acuerdo a la invención o también de las proteínas del estado de la técnica es en general reducida de 0 a 75%, 0 a 50% 0 a 25%, 0 a 10% ó 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida. El microorganismo de partida es entendido que significa el microorganismo en el cual las medidas inventivas son llevadas a cabo.
El proceso está caracterizado porque son llevados a cabo los siguientes pasos:
a)
fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en el cual la expresión del ORF yjgF es eliminada,
b)
concentración de dicho L-aminoácido en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, y opcionalmente
c)
aislamiento del L-aminoácido deseado, los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones del mismo (> 0 a 100%) permanecen opcionalmente en el producto.
Los microorganismos, en particular los microorganismos recombinantes, los cuales provee la presente invención pueden producir dichos L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Los mismos son representativos de la familia Enterobacteriaceae escogidos de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Son preferidos los géneros Escherichia y Serratia. Del género Escherichia en particular la especie Escherichia coli y del género Serratia en particular la especie Serratia marcescens son mencionadas.
Las cepas apropiadas, que producen L-treonina en particular, del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, son, por ejemplo
-
Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)
-
Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(11):1877-1882 (1997)
-
Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4278, 765)
-
Escherichia coli VNIIgenetika MI (US-A-4.321.325)
-
Escherichia coli VNIIgenetika 472223 (US-A-5,631,157)
-
Escherichia coli BKIIm B-3996 (US-A-5.175.107)
-
Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
-
Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)
Las cepas apropiadas productoras de L-treonina del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, son, por ejemplo
-
Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38 (6): 1045-2051 (1979))
-
Serratia marcescens TLr156 (Gene 57 (2-3): 151-158. (1987))
-
Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992))
Las cepas de la familia Enterobacteriaceae que producen L-treonina tienen preferiblemente, entre otras, una o más características genéticas o fenotípicas escogidas del grupo que consiste de: resistencia al ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a \alpha-metilserina, resistencia al ácido diaminosuccínico, resistencia al ácido \alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia al ácido ciclopentano-carboxílico, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina, como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina, como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, requerimiento de L-metionina, opcionalmente un requerimiento parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofía con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a rafinato treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia al L-ácido glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina dehidrogenasa deficiente, opcionalmente habilidad para la utilización de sacarosa, potenciación del operón treonina, potenciación de la homoserina dehidrogenasa I-aspartato quinasa I, preferentemente de la forma resistente de retroalimentación, potenciación de aspartato semialdehido dehidrogenasa, potenciación del fosfoenol piruvato decarboxilasa, opcionalmente de la forma resistente de retroalimentación, potenciación del fosfoenol piruvato sintasa, potenciación de transhidrogenasa, potenciación del producto génico RhtB, potenciación del producto génico RhtC, potenciación del producto génico Yfik, potenciación de piruvato carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.
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Se ha encontrado que los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae producen L-lisina, L-valina, L-homoserina o L-treonina de una forma mejorada después de la eliminación de la expresión del ORF yjgF.
La invención también provee microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-treonina, donde al menos:
a)
el operón thrABC en el cual los genes que codifican para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa están sobre-expresados, y
b)
el ORF yjgF es eliminado,
\vskip1.000000\baselineskip
los microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-lisina, donde al menos:
a)
el gen pckA que codifica para el fosfoenol piruvato carboxiquinasa es eliminado, y
b)
el ORF yjgF es o son eliminados,
\vskip1.000000\baselineskip
los microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-valina, donde al menos:
a)
el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa es eliminado,
b)
el ORF yjgF es o son eliminados, y
\vskip1.000000\baselineskip
los microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-homoserina, donde al menos:
a)
el gen thrA es sobre-expresado,
b)
el gen thrB es eliminado,
c)
el ORF yjgF es eliminado.
Dichos microorganismos se originan preferentemente de las especies de E. coli.
Las secuencias nucleotídicas de los genes o marcos abiertos de lectura (ORF) de Escherichia coli pertenecen al estado de la técnica y también pueden ser encontrados en la secuencia del genoma de Escherichia coli publicada por Blattner y otros (Science 277: 1453-1462 (1977)).
El ORF yjgF de Escherichia coli K12 es descrito, entre otros, por los siguientes datos:
Descripción:
marco abierto de lectura
Función:
función desconocida
Descripción:
el marco abierto de lectura yjgF codifica para una proteína de 15.1 kDa, el punto isoeléctrico es 5.8; localizado cromosómicamente, por ejemplo en E. coli K12 MG1655 se encuentra en la región intergénica de los genes mgtA, la cual codifica para una ATPasa de transporte de Mg2+ de P-Typ1, y el gen pyrI, el cual codifica para la subunidad reguladora de la aspartato carbamoiltranferasa
Referencia:
Wasinger VC. y Huphery-Smith I.; FEMS Microbiology Letters 169 (2): 375-382 (1998)
\quad
Volz K.; Protein science 8(11): 2428-2437 (1999)
\quad
Parsons y otros; Biochemistry 42(1):80-89 (2003)
Número de acceso:
AE000495
El ORF yjgF de Salmonella typhimurium está descrito, entre otros, en la siguiente referencia: Enos-Berlage y otros; Journal of Bacteriology 180 (24): 6519-6528 (1998)
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser encontradas en los bancos de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.), el banco de datos de secuencias de nucleótidos de los Laboratorios Europeos de Biología Molecular (EMBL, Heidelberg, Alemania o Cambridge, UK) o el banco de datos de ADN de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Para mayor claridad, la secuencia conocida para el ORF yjgF de Escherichia coli es mostrada con SEQ ID No. 1 y la secuencia, la cual es también conocida, para el ORF yjgF de Salmonella typhimurium es mostrada con SEQ ID No. 11. Las proteínas codificadas por estos marcos de lectura son mostradas con SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 12.
Los marcos abiertos de lectura descritos en las referencias de los textos mencionados pueden ser usados de acuerdo a la invención. Los alelos de estos marcos abiertos de lectura o genes, en particular de Enterobacteriaceae, los cuales resultan de la degeneración del código genético o debido a mutaciones tales como las que se describen debajo pueden además ser usadas. El uso de genes endógenos o marcos abiertos de lectura es preferido.
Los "genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" se entiende que significan los genes o marcos abiertos de lectura alelos o secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie.
Los alelos apropiados del ORF yjgF incluyen aquellos que contienen mutaciones de función neutral o "mutaciones con sentido". Estas incluyen, entre otras, aquellas que conducen al menos a un (1) intercambio conservativo del aminoácido codificado por ellos. El número máximo de intercambios conservativos de aminoácidos puede relacionarse a 2, 3, 5, 10, 20 pero no en el caso de más de 30 aminoácidos. Por los intercambios conservativos de aminoácidos mencionados, la capacidad funcional es disminuida o incrementada de 0% a no más de 24%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% ó 1%.
En el caso de los aminoácidos aromáticos, los intercambios conservativos se refieren a cuando la fenilalanina, el triptófano y la tirosina son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos hidrofóbicos, los intercambios conservativos se refieren a cuando la leucina, la isoleucina y la valina son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos polares, los intercambios conservativos se refieren a cuando la glutamina y la asparagina son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos básicos, los intercambios conservativos se refieren a cuando la arginina, la lisina y la histidina son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos acídicos, los intercambios conservativos se refieren a cuando el ácido aspártico y el ácido glutámico son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, los intercambios conservativos se refieren a cuando la serina y la treonina son intercambiados entre sí. Todos los demás intercambios de aminoácidos son llamados intercambios de aminoácidos no-conservativos.
Del mismo modo, aquellas secuencias de nucleótidos que codifican para variantes de las proteínas mencionadas las cuales adicionalmente contienen un alargamiento o acortamiento de al menos un (1) aminoácido en el extremo N o C terminal también pueden ser usadas. Este alargamiento o acortamiento no es de más de 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o radicales aminoacídicos.
Los alelos apropiados incluyen también aquellos que codifican para proteínas en las cuales al menos un (1) aminoácido es insertado (inserción) o removido (deleción). El número máximo de tales cambios, llamados indels, pueden relacionarse a 2, 3, 5, 10, 20 pero en ningún caso más de 30 aminoácidos.
Los alelos apropiados además incluyen aquellos que se pueden conseguir por hibridización, en particular bajo condiciones de astringencia, usando la SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 11 o partes de las mismas, en particular las regiones codificantes o las secuencias complementarias a ellas.
Las instrucciones para la identificación de las secuencias de ADN por medio de hibridización pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hibridization" de Boehringer Mannhein GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl y otros (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-269 (1991)). La hibridización tiene lugar bajo condiciones de astringencia, es decir únicamente los híbridos formados en los cuales la sonda y la secuencia blanco, por ejemplo los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos 70% idénticos. Se conoce que la astringencia de la hibridización, incluyendo los pasos de lavado, es influida o determinada por variaciones en la composición del tampón, la temperatura y la concentración de
sales.
La reacción de hibridización es en general llevada a cabo bajo astringencia relativamente baja comparada con los pasos de lavado (Hybaid Hibridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Un tampón correspondiente al tampón 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50ºC-68ºC, por ejemplo, puede ser empleado para la reacción de hibridización. Las sondas pueden también hibridizar aquí con nucleótidos que son menos de un 70% idénticos a la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y son eliminados por lavado bajo condiciones astringentes. Esto puede lograrse, por ejemplo, bajando la concentración de sales a 2x SSC y opcional y subsecuentemente a 0.5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hibridisation, Boehringer Mannhein, Mannhein, Alemania, 1995) siendo establecida una temperatura de aproximadamente 50ºC-68ºC. Es opcionalmente posible bajar la concentración de sales a una concentración correspondiente a 0.2x SSC ó 0.1x SSC. Los fragmentos de polinucleótidos que son, por ejemplo, al menos 70% ó al menos 80% ó al menos 90% a 95% ó al menos 96% a 99% idénticos a la secuencia de la sonda empleada pueden ser aislados por incremento de la temperatura en el paso de hibridización de 50ºC a 68ºC en pasos de aproximadamente 1-2ºC. Más instrucciones de la hibridización se obtienen en el mercado en la forma de los llamados kits (por ejemplo DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Manhheim, Alemania, Catálogo No.1603558).
Para lograr una atenuación, por ejemplo, la expresión de los genes o marcos abiertos de lectura o las propiedades catalíticas de las enzimas proteicas pueden ser reducidas o eliminadas. Las dos medidas pueden ser combinadas opcionalmente.
La reducción en la expresión de los genes puede tener lugar cultivando apropiadamente, por modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica o también por la técnica de ARN-antisentido. Las estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión al ribosoma, el codón de inicio y los terminadores. El experto puede encontrar información a este respecto, entre otros, por ejemplo, en Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), en Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnaker ("Gene und Klone", VCH Verlgasgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).
Las mutaciones que conducen a cambio o reducción en las propiedades catalíticas de las enzimas proteicas son conocidas del estado de la técnica. Ejemplos que pueden ser mencionados son los trabajos de Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1977)), Yano y otros (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 1991)). Las descripciones resumidas pueden ser encontradas en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como por ejemplo el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Las mutaciones posibles son transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos un (1) par de bases o nucleótidos. En dependencia del efecto del intercambio de aminoácidos causado por la mutación en la actividad enzimática, las "mutaciones de sentido erróneo" o "mutaciones sin sentido" son referidas a esto. La mutación de sentido erróneo conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro, siendo esto, en particular, un intercambio no conservativo de aminoácidos. La capacidad funcional o actividad de la proteína es afectada por este medio y reducida a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ó 0 a 5%. Las mutaciones sin sentido conducen a un codón de parada en la región codificante del gen y por tanto a una interrupción prematura de la traducción. Las inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a "mutaciones de corrimiento de marco", las que conducen a la incorporación de aminoácidos incorrectos o la interrupción prematura de la traducción. Si se forma un codón de parada en la región codificante como consecuencia de la mutación, esto también conduce a una terminación prematura de la traducción. Las deleciones de al menos uno (1) ó más codones típicamente conducen también a una pérdida completa de actividad de la enzima.
Las instrucciones sobre la generación de tales mutaciones están en el estado de la técnica y pueden ser encontradas en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), aquel de Winnaker ("Gene und Klone", VHC Verlgasgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) ó en Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Las mutaciones apropiadas en el gen, tales como las mutaciones de deleción mencionadas a modo de ejemplo (ver SEQ ID No. 10), pueden ser incorporadas dentro de cepas apropiadas por reemplazo de genes o alelos.
Un método común es el método descrito por Hamilton y otros (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), de reemplazo de genes con la ayuda de pMAK705 de una replicación condicionada derivada de pSC101. Otros métodos descritos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, el de Martinez-Morales y otros (Journal of Bacteriology 182: 842-847 (2000)), puede asimismo ser usado.
También es posible transferir las mutaciones en genes particulares o mutaciones que afecten la expresión de los genes particulares o marcos abiertos de lectura dentro de varias cepas por conjugación o transducción.
Explicaciones más detalladas de los términos en genética y biología molecular se encuentran en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, por ejemplo, el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed., Springer verlag, New York (EE.UU.), 2000) ó el libro de texto de Berc, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company, New York (EE.UU.), 2002) o el manual de Sambrook y otros (Molecular Cloning, A laboratory Manual, (serie de 3 volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).
De acuerdo a la descripción, esto además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-treonina, con cepas de la familia Enterobacteriaceae para potenciar una o más enzimas de la vía conocida de biosíntesis de treonina o enzimas de metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de fosfato dinucleótido adenina nicotinamida reducida o enzimas de la glicólisis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del azufre, además de la atenuación del ORF yjgF.
El término "potenciación" en este caso describe el incremento en la actividad intracelular o la concentración de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo las cuales son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo por incremento del número de copias del gen o genes o marcos abiertos de lectura, usando un promotor potente o un gen o marco abierto de lectura que codifica para una enzima correspondiente o proteína con una alta actividad, y opcionalmente combinando estas medidas.
Por medidas de potenciación, en particular la sobre-expresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente es en general incrementada por lo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ó 500%, hasta un máximo de 1000% ó 2000%, basado en la proteína de tipo salvaje o la actividad o la concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Para la producción de L-treonina debe ser ventajoso, además de la atenuación del ORF yjgF, al mismo tiempo para uno o más de los genes escogidos del grupo que consiste de
\bullet
el operón thrABC que codifica para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa (US-A-4,278,765),
\bullet
el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica para la piruvato decarboxilasa (WO 99/18228),
\bullet
el gen pps que codifica para la fosfoenol piruvato sintasa (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)),
\bullet
el gen ppc que codifica para la fosfoenol piruvato carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
\bullet
los genes pntA y pntB los cuales codifican para la transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
\bullet
el gen rhtB que confiere resistencia a la homoserina (EP-A-0 994 190),
\bullet
el gen mqo que codifica para la malato:quinona oxidoreductasa (WO 02/06459),
\bullet
el gen rhtC que confiere resistencia a la treonina (EP-A-1 013 765),
\bullet
el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica para la proteína de exportación de treonina (WO 01/92545),
\bullet
el gen gdhA que codifica para la glutamato dehidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); gene 23: 199-209 (1983)),
\bullet
el gen hns que codifica para la proteína HLP-II de unión al ADN (WO 03/004671),
\bullet
el gen pgm que codifica para la fosfoglucomutasa (WO 03/004598),
\bullet
el gen fba que codifica para la fructosa bifosfato aldolasa (WO 03/004664),
\bullet
el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica para la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa del sistema fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
\bullet
el gen ptsI del operón ptsHIccr que codifica para la enzima I del sistema fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
\bullet
el gen ccr del operón ptsHIccr que codifica para el componente IIA glucosa-específico del sistema fosfotransferasa PTS(WO 03/004674),
\bullet
el gen ptsG que codifica para el componente IIBC glucosa-específico (WO 03/004670),
\bullet
el gen lrp que codifica para el regulador del regulón leucina (WO 03/004665)
\bullet
el gen csrA que codifica para el regulador global Csr (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993)),
\bullet
el gen fadR que codifica para el regulador del regulón fad (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)),
\bullet
el gen iclR que codifica para el regulador del metabolismo intermedio central (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)),
\bullet
el gen mopB que codifica para la chaperona de 10kd (WO 03/004669)y es también conocida por el nombre groES,
\bullet
el gen ahpC del operón ahpC que codifica para la subunidad menor de la alquil hidroperóxido reductasa (WO 03/004663),
\bullet
el gen ahpF del operón ahpF que codifica para la subunidad mayor de la alquil hidroxiperóxido reductasa (WO 03/004663),
\bullet
el gen cysK que codifica para la cisteína sintasa A (WO 03/006666),
\bullet
el gen cysB que codifica para el regulador del regulón cys (WO 03/006666),
\bullet
el gen cysJ del operón cysJIH que codifica para la flavoproteína de NADPH sulfito reductasa (WO 03/6666),
\bullet
el gen cysI del operón cysJIH que codifica para la hemoproteína de NADPH sulfito reductasa (WO 03/6666),
\bullet
el gen cysH del operón cysJIH que codifica para la adenilil sulfato reductasa (WO 03/006666),
\bullet
el gen phoB del operón phoBR que codifica para el regulador positivo PhoB del regulón pho (WO 03/008606),
\bullet
el gen phoR del operón phoBR que codifica para la proteína sensora del regulón pho (WO 03/008606),
\bullet
el gen phoE que codifica para la proteína E de la membrana celular externa (WO 03/008606),
\bullet
el gen pykF que codifica para la piruvato quinasa I estimulada por fructosa (WO 03/008609),
\bullet
el gen pfkB que codifica para la 6-fosfofructoqueinasa II (WO 03/008610),
\bullet
el gen malE que codifica para la proteína de unión periplásmica de transporte de maltosa (WO 03/008605),
\bullet
el gen sodA que codifica para la superóxido dismutasa (WO 03/008613),
\bullet
el gen rseA del operón rseABC que codifica para una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (WO 03/008612),
\bullet
el gen rseC del operón rseABC que codifica para un regulador global del factor sigmaE (WO 03/008612),
\bullet
el gen sucA del operón sucABCD que codifica para la subunidad decarboxilasa de la 2-cetoglutarato dehidrogenasa (WO 03/008614),
\bullet
el gen sucB del operón sucABCD que codifica para la subunidad E-2 dihidrolipoiltranssuccinasa de la cetoglutarato dehidrogenasa (WO 03/008614),
\bullet
el gen sucC del operón sucABCD que codifica para la subunidad \beta de la succinil-CoA sintetasa (WO 03/008615),
\bullet
el gen sucD del operón sucABCD que codifica para la subunidad \alpha de la succinil-CoA sintetasa (WO 03/008615),
\bullet
el gen adk que codifica para la adenilato quinasa (Nucleic Acids Research 13(19): 7139-7151 (1985)),
\bullet
el gen hdeA que codifica para una proteína periplásmica con función tipo chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23): 7747-7748 (1993)),
\bullet
el gen hdeB que codifica para una proteína periplásmica con una función tipo chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23): 7747-7748 (1993)),
\bullet
el gen icd que codifica para la isocitrato dehidrogenasa (Journal of Biological Chemistry 262(22): 10422-10425 (1987)),
\bullet
el gen mglB que codifica para la proteína de transporte HLP-II de unión a galactosa (Molecular and General Genetics 229(3): 453-459 (1991)),
\bullet
el gen lpd que codifica para la dihidrolipoamida dehidrogenasa (European Journal of Biochemistry 135(3): 519-527 (1983)),
\bullet
el gen aceE que codifica para el componente E1 del complejo piruvato dehidrogenasa (European Journal of Biochemistry 133(1): 155-162 (1983)),
\bullet
el gen aceF que codifica para el componente E2 del complejo piruvato dehidrogenasa (European Journal of Biochemistry 133(3): 481-489 (1983)),
\bullet
el gen pepB que codifica para la aminopeptidasa B (Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392-397 (1996)),
\bullet
el gen aldH que codifica para la aldehído dehidrogenasa (E.C. 1.2.1.3) (Gene 99(1): 15-23 (1991)),
\bullet
el gen bfr que codifica para la homoproteína de almacenamiento de hierro (bacterioferritina) (Journal of Bacteriology 171(7): 3940-3947 (1989)),
\bullet
el gen udp que codifica para la uridina fosforilasa (Nucleic Acids Research 17(16): 6741 (1989)),
\bullet
el gen rseB que codifica para el regulador de la actividad del factor sigmaE (Microbiology 24(2): 355-371 (1997)),
ser potenciados, en particular sobre-expresados.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de genes endógenos o marcos abiertos de lectura es en general preferido.
\vskip1.000000\baselineskip
Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular treonina, además de la atenuación del ORF yjgF, para uno o más de los genes escogidos del grupo que consiste de
\bullet
el gen tdh que codifica para la treonina dehidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
\bullet
el gen mdh que codifica para la malato dehidrogenasa (E.C: 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
\bullet
el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) yjfA (Número de acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), (WO 02/29080),
el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) ytfP (Número de acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), (WO 02/29080),
\bullet
el gen pckA que codifica para la enzima fosfoenol piruvato carboxiquinasa (WO 02/29080),
\bullet
el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa (WO 02/36797),
\bullet
el gen aceA que codifica para la enzima isocitrato liasa (WO 02/081772),
\bullet
el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema fosfotransferasa (WO 02/081721) y es también denominado gen mlc,
\bullet
el gen fruR que codifica para el represor fructosa (WO 02/081698) y es también denominado gen cra,
\bullet
el gen rpoS que codifica para el factor sigma^{38} (WO 01/05939) y es también denominado gen katF,
\bullet
el gen aspA que codifica para la aspartato amonio liasa (WO 03/008607) y
\bullet
el gen aceB que codifica para la malato sintasa A (WO 03/008603)
ser atenuados, en particular eliminados o que la expresión de los mismos sea reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la eliminación de la expresión del ORF yjgF puede además ser ventajoso para la producción de L-lisina, L-valina, L-homoserina o L-treonina, eliminar reacciones colaterales no deseadas (Nakayaa: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en "Overproduction of Microbial Products", Krumphanzl, Sykita, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo a la invención pueden ser cultivados en el proceso batch (cultivo batch), el proceso batch alimentado (proceso alimentado) el proceso batch alimentado repetido (proceso de alimentación repetida). Un resumen de métodos de cultivo conocidos es descrito en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag; Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a ser usado debe reunir los requerimientos de las cepas particulares de un modo apropiado. Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos están contenidos en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., EE UU, 1981).
Los azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de maní y grasas de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético, pueden ser usados como fuente de carbono. Estas sustancias pueden ser usadas individualmente o como una mezcla.
Los compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz macerado, harina de frijol de soya y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden ser usados como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno pueden ser usadas individualmente o como una mezcla.
El ácido fosfórico, dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno fosfato dipotasio o las sales correspondientes conteniendo sodio pueden ser usadas como la fuente de fósforo. El medio de cultivo debe además comprender sales de metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, las cuales son necesarias para el crecimiento. Finalmente, sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden ser empleadas además de las sustancias antes mencionadas. Los precursores apropiados pueden además ser añadidos al medio de cultivo. Las sustancias de partida mencionadas pueden ser añadidas al cultivo en la forma de un batch simple, o pueden suplementarse durante el cultivo de una manera apropiada.
La fermentación es en general llevada a cabo a un pH de 5.5 a 9.0, en particular de 6.0 a 8.0. Los compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amonio o amonio acuoso, o compuestos ácidos, tales como el ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden ser empleados de una forma apropiada para el control del pH del cultivo. Antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres poliglicoles de ácidos grasos, pueden ser empleados para el control de la formación de espuma. Las sustancias apropiadas que tienen una acción selectiva, como por ejemplo antibióticos, pueden ser añadidas al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las condiciones aeróbicas, el oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire, son introducidos en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 25ºC a 45ºC, y preferiblemente de 30ºC a 40ºC. El cultivo es continuado hasta que se haya formado la mayor cantidad de los L-aminoácidos o la L-treonina. Este objetivo es alcanzado usualmente dentro de 10 a 160 horas.
El análisis de los L-aminoácidos puede ser llevado a cabo por cromatografía de intercambio aniónico con la consiguiente obtención de ninhidrina, como describen Spackman y otros (Analytical Chemistry, 30: 1190-1206 (1958)) o éste puede ser llevado a cabo por HPLC de fase reversa, como describen Lindroth y otros (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo a la invención es usado para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, tales como L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, en particular L-treonina.
Un cultivo puro de la cepa de Escherichia coli K-12 DH5\alpha/pMAK705 fue depositado como DSM 13720 el 8 de septiembre del 2000 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ- Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
La presente invención es explicada en más detalle a continuación con la ayuda de ejemplos de realización.
Los medios mínimo (M9) y completo (LB) para Escherichia coli usados son descritos por J.H Miller (A short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento del ADN plasmídico de Escherichia coli y de todas las técnicas de restricción, ligazón, tratamiento de fosfatasa alcalina y de Klenow son llevados a cabo por el método de Sambrook y otros (Molecular Cloning- A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A menos que se describa de otra forma, la transformación de Escherichia coli es llevada a cabo por el método de Chung y otros (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación para la preparación de las cepas y los transformantes es 37ºC. Temperaturas de 30ºC y 44ºC son usadas en el método de reemplazo génico de Hamilton y otros.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Construcción de la mutación de deleción del ORF yjgF
Las partes de las regiones génicas que se ubican corriente arriba y corriente abajo del ORF yjgF y partes de la región 5' y 3' del ORF yjgF a partir de Escherichia coli K12 son amplificadas usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y oligonucléotidos sintéticos. El inicio de las secuencias de nucleótidos del ORF yjgF y las secuencias que se ubican corriente arriba y corriente abajo en E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1, Número de acceso AE000495), los siguientes cebadores son sintetizados (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
1
El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655 empleado para el PCR es aislado de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes con "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania).
Un fragmento de ADN de aproximadamente 622 pb de talla de la región 5' del ORF yjgF, llamado yjgF5' y mostrado en la SEQ ID No. 7 y un fragmento de ADN de aproximadamente 612 pb de talla de la región 3' del ORF yjgF, llamado yjgF3' y mostrado en la SEQ ID No. 8, pueden ser amplificados con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis y otros 1990) PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con Taq-DNA polimerasa (Gibco-BRL, Eggenstein, Alemania).
Cada uno de los productos de PCR son ligados con el vector pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holanda) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y transformados en la cepa de E. coli TOP10F'. La selección de las células portadoras de plásmidos tiene lugar en agar LB, al cual se añaden 50 \mug/ml de ampicilina. Después del aislamiento del ADN del plásmido, el vector pCR2.1yjgF5' es cortado con las enzimas de restricción Ecl136II y XbaI y, después de la separación en gel de agarosa al 0.8%, el fragmento yjgF5' es aislado con la ayuda del kit de extracción en gel QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). Después del aislamiento del ADN del plásmido el vector pCR2.1yjgF3' es cortado con las enzimas EcoRV y XbaI y ligado con el fragmento yjgF5' aislado. La cepa de E. coli DH5\alpha es transformada con el lote de ligazón y las células portadoras del plásmido son seleccionadas en agar LB, al cual se añaden 50 \mug/ml de ampicilina. Después del aislamiento del ADN del plásmido aquellos plásmidos en los cuales la secuencia de ADN mutagénico mostrado en SEQ ID No. 9 es clonada son detectadas por corte de control con las enzimas HindIII/XbaI y StuI/HincII. Uno de los plásmidos es llamado pCR2.1TOPO\DeltayjgF.
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Ejemplo 2
Construcción del vector pMAK\DeltayjgF de reemplazo
El ORF yjgF eliminado descrito en el ejemplo 1 es aislado del vector pCR2.1TOPO\DeltayjgF después de la restricción con las enzimas HindIII y XbaI y separación en gel de agarosa al 0.8%, y ligado con el plásmido pMAK705 (Hamilton y otros (1989) Journal of Bacteriology 171, 4617-4622), el cual ha sido digerido con las enzimas HindIII y XbaI. El lote de ligazón es transformado en DH5\alpha y las células portadoras de plásmidos son seleccionadas en agar LB, al cual se añaden 20 \mug/ml de cloranfenicol. EL clonaje exitoso es demostrado después del aislamiento del ADN del plásmido y corte con las enzimas HindIII/XbaI y PstI. EL vector de reemplazo formado, pMAK705\DeltayjgF (= pMAK705deltayjgF), es mostrado en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Mutagénesis posición-específica del ORF yjgF en la cepa de E. coli MG442
La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina es descrita en la especificación de la patente US-A-4.278.765 y depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
Para el reemplazo del ORF yjgF cromosómico con la construcción de deleción codificada por el plásmido, MG442 es transformada con el plásmido pMAK705\DeltayjgF. El reemplazo del gen es llevado a cabo por el método de selección descrito por Hamilton y otros (1989) Journal of Bacteriology 171, 4617-4622) y es verificado por métodos de PCR estándares (Innis y otros (1990) PCR protocols. A guide to Methods and Applications, Academic Press) con los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
2
Después de que el reemplazo ha tenido lugar, MG442 contiene la forma del alelo \DeltayjgF mostrado en SEQ ID No. 10. La cepa obtenida es llamada MG442\DeltayjgF.
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Ejemplo 4
Preparación de L-treonina con la cepa MG442\DeltayjgF
MG442\DeltayjgF es multiplicada en medio mínimo con la siguiente composición: 3.5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1.5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, O.1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}0, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar.
La formación de L-treonina es verificada en cultivos batch de 10 ml contenidos en frascos cónicos de 100 ml. Para esto, 10 ml del medio de precultivo de la siguiente composición: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}
SO_{4}, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0.5 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa son inoculados y el lote es incubado durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). 250 \mul de este precultivo son transinoculados dentro de 10 ml del medio de producción (25 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4,} 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 0.03 g/l de FeSO_{4}*7H_{2}O, 0.018 g/l MnSO_{4}*1H_{2}0, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa) y el lote es incubado durante 48 horas a 37ºC. Después de la incubación la densidad óptica (DO) de la suspensión del cultivo es determinada con un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una medición de 660 nm de longitud de onda.
La concentración de L-treonina formada es entonces determinada en el sobrenadante filtrado estéril del cultivo con un analizador de aminoácidos de Eppendorf-Biotronik (Hamburg, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y reacción en post-columna con detección de ninhidrina.
El resultado del experimento es mostrado en la Tabla 1.
TABLA 1
3
Breve descripción de la figura
\bullet Figura 1: pMAK705\DeltayjgF (= pMAK705deltayjgF)
Los datos de la longitud se entienden como datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones usadas tienen el siguiente significado:
\bullet cat:
gen de resistencia a cloranfenicol
\bullet rep-ts:
región de replicación del plásmido pSC101 sensible a temperatura
\bullet yjgF5':
parte de la región 5' del ORF yjgF y la región ubicada corriente arriba
\bullet yjgF3':
parte de la región 3' del ORF yjgF y la región ubicada corriente abajo
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción tienen el siguiente significado
\bullet EcoRV:
endonucleasa de restricción de Escherichia coli RY13
\bullet Ecl136II:
endonucleasa de restricción de Escherichia coli
\bullet HindII:
endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae R_{c}
\bullet HindIII:
endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae R_{D}
\bullet PstI:
endonucleasa de restricción de Providencia stuartii
\bullet StuI:
endonucleasa de restricción de Streptomyces tubercidicus
\bullet XbaI:
endonucleasa de restricción de Xanthomonas badrii
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación fermentativa de L- aminoácidos usando cepas de la familia Enterobacteriaceae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020491 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1548)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (527) .. (952)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF yjgF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yjgF-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yjgF-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yjgF-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yjgF-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> prim_transcript
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (622)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto de PCR yjgF5'
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> prim_transcript
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (612)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto de PCR yjgF3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1411)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN técnico/residuos de la secuencia del sitio múltiple de clonaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58) .. (671)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la región corriente arriba y parte de la región 5' del ORF yjgF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (672) .. (737)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN técnico/residuos de la secuencia del sitio múltiple de clonaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (738) .. (1359)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la región 3' del ORF yjgF y parte de la región corriente abajo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1359) .. (1411)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN técnico/residuos de la secuencia del sitio múltiple de clonaje
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (177)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio del ORF yjgF delta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 5' del ORF yjgF delta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (100) .. (162)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN técnico/residuos de la secuencia del sitio múltiple de clonaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (163) .. (174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 3' del ORF yjgF delta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (175) .. (177)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de parada del ORF yjgF delta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (387)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF yjgF
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
16

Claims (76)

1. Proceso para la preparación de L-aminoácidos, escogidos del grupo de L-treonina, L-lisina, L-valina y L-homoserina, donde los siguientes pasos son llevados a cabo:
a)
fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales la expresión del ORF yjgF es eliminada por uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste de
\bullet
\vtcortauna deleción
\bullet
\vtcortauna inserción; y
\bullet
\vtcortauna transición o transversión
b)
concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1, donde el L-aminoácido deseado es aislado, los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones (>0 a 100%) del mismo opcionalmente permaneciendo en el producto.
3. Proceso para la preparación de los L-aminoácidos, escogidos del grupo de L-treonina, L-lisina, L-valina y L-homoserina por fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, donde el ORF yjgF es eliminado en éstos.
4. Proceso para la preparación de L-aminoácidos de acuerdo a las reivindicaciones 1 - 3, donde, para la producción de L-treonina, los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son fermentados, en el cual adicionalmente al mismo tiempo la actividad o concentración de una o más de las proteínas codificadas por los genes escogidos del grupo que consiste de:
4.1
el operón thrABC que codifica para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa,
4.2
el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,
4.3
el gen pps que codifica para la fosfoenol piruvato sintasa,
4.4
el gen ppc el cual codifica para la fosfoenol piruvato carboxilasa,
4.5
los genes pntA y pntB los cuales codifican para la transhidrogenasa,
4.6
el gen rhtB de Escherichia coli que codifica para un proteína que confiere resistencia a homoserina,
4.7
el gen mqo el cual codifica para la malato:quinona oxidoreductasa,
4.8
el gen rhtC de Escherichia coli que codifica para una proteína que confiere resistencia a treonina,
4.9
el gen thrE que codifica para la proteína de exportación de treonina,
4.10
el gen gdhA que codifica para la glutamato dehidrogenasa,
4.11
el gen pgm que codifica para la fosfoglucomutasa
4.12
el gen fba que codifica para la bifosfato aldolasa,
4.13
el gen ptsH que codifica para la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa,
4.14
el gen ptsI que codifica para la enzima I del sistema fosfotransferasa,
4.15
el gen crr que codifica para el componente IIA glucosa-específico,
4.16
el gen ptsG que codifica para el componente IIBC glucosa-específico,
4.17
el gen lrp que codifica para el regulador del regulón leucina,
\newpage
4.18
el gen csrA que codifica para el regulador global Csr,
4.19
el gen fadr que codifica para el regulador del regulón fad,
4.20
el gen iclR que codifica para el regulador del metabolismo intermedio central,
4.21
el gen mopB que codifica para la chaperona de 10Kd,
4.22
el gen ahpC que codifica para la subunidad menor de la alquil-hidroperóxido reductasa,
4.23
el gen ahpF que codifica para la subunidad mayor de la alquil-hidroperóxido reductasa,
4.24
el gen cysK que codifica para la cisteína sintasa A,
4.25
el gen cysB que codifica para el regulador del regulón cys,
4.26
el gen cysJ que codifica para la flavoproteína de la NADPH sulfito reductasa,
4.27
el gen cysI que codifica para la hemoproteína de la NADPH sulfito reductasa,
4.28
el gen cysH que codifica para la adenilil sulfato reductasa,
4.29
el gen phoB que codifica para el regulador positivo PhoB del regulón pho,
4.30
el gen phoR que codifica para la proteína sensor del regulón pho,
4.31
el gen phoE que codifica para la proteína E de la membrana celular externa,
4.32
el gen pykF que codifica para piruvato quinasa I estimulada por fructosa,
4.33
el gen pfkB que codifica para la 6-fosfofructoquinasa II,
4.34
el gen malE que codifica para la proteína de unión periplásmica del transporte de maltosa,
4.35
el gen sodA que codifica para la superóxido dismutasa,
4.36
el gen rseA que codifica para una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE,
4.37
el gen rseC que codifica para un regulador global del factor sigmaE,
4.38
el gen sucA que codifica para la subunidad decarboxilasa de la 2-cetoglutarato dehidrogenasa,
4.39
el gen sucB que codifica para la subunidad E2 dihidrolipoiltransscuccinasa de la cetoglutarato dehidrogenasa,
4.40
el gen sucC que codifica para la subunidad [beta] de la succinil-CoA sintetasa,
4.41
el gen sucD que codifica para la subunidad [alfa] de la succinil-CoA sintetasa,
4.42
el gen adk que codifica para la adenilato quinasa,
4.43
el gen hdeA que codifica para una proteína periplásmica con una función tipo chaperonina,
4.44
el gen hdeB que codifica para una proteína periplásmica con una función tipo chaperonina,
4.45
el gene icd que codifica para la isocitrato dehidrogenasa,
4.46
el gen mglB que codifica para la proteína periplásmica de transporte de unión a galactosa,
4.47
el gen lpd que codifica para la dihidrolipoamida dehidrogenasa,
4.48
el gen aceE que codifica para el componente E1 del complejo piruvato dehidrogenasa,
4.49
el gen aceF que codifica para el componente E2 del complejo piruvato dehidrogenasa,
4.50
el gen pepB que codifica para la aminopeptidasa B,
4.51
el gen aldH que codifica para la aldehído dehidrogenasa,
4.52
el gen bfr que codifica para la homoproteína de almacenamiento de hierro,
4.53
el gen udp que codifica para la uridina fosforilasa, y
4.54
el gen rseB que codifica para el regulador de la actividad del factor sigmaE
es incrementada por lo menos en 10%, en relación con la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida, por sobre-expresión de uno o más de dichos genes.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Proceso para la preparación de L-aminoácidos de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3, donde, para la producción de L-treonina, los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son fermentados, en los cuales adicionalmente al mismo tiempo la actividad o concentración de una o más de las proteínas codificadas por los genes escogidos del grupo que consiste de:
5.1
el gen tdh que codifica para la treonina dehidrogenasa,
5.2
el gen mdh que codifica para la malato dehidrogenasa,
5.3
el producto del gen del marco de abierto de lectura (ORF) yjfA de E. coli, cuando dicho microorganismo es Escherichia coli,
5.4
el producto génico del marco de abierto de lectura (ORF) ytfP de E. coli, cuando dicho microorganismo es Escherichia coli,
5.5
el gen pckA que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa,
5.6
el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa,
5.7
el gen aceA que codifica para la isocitrato liasa,
5.8
el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema fosfotransferasa,
5.9
el gen fruR que codifica para el represor fructosa,
5.10
el gen rpoS que codifica para el factor sigma ^{38},
5.11
el gen aspA que codifica para la aspartato amonio liasa (aspartasa) y
5.12
el gen aceB que codifica para la malato sintasa A
es reducida de 0 a 75% comparada a la actividad o la concentración de la proteína en el microorganismo de partida por atenuación de uno o más de dichos genes.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-treonina, donde al menos:
a)
el operón thrABC cuyos los genes codifican para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa es sobre-expresado, y
b)
el ORF yjgF es eliminado.
7. Microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-lisina, donde al menos:
a)
el gen pckA que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa es eliminado, y
b)
el ORF yjgF es o son eliminados.
8. Microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-valina, donde al menos:
a)
el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa es eliminado, y
b)
el ORF yjgF es o son eliminados.
\newpage
9. Microorganismos recombinantes del género Escherichia, productores de L-homoserina donde al menos:
a)
el gen thrA es sobre-expresado,
b)
el gen thrB es eliminado, y
c)
el ORF yjgF es eliminado.
10. Microorganismos de acuerdo a las reivindicaciones 6 a 9, donde los microorganismos se originan de las especies de E. coli.
ES03782410T 2003-01-30 2003-12-16 Proceso para la preparacion fermentativa de l-treonina,l-lisina,l-valina,l-homoserina usando cepas de la famimlia enterobacteriaceae que contiene una secuencia de orf y yjgf atenuada. Expired - Lifetime ES2314263T3 (es)

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