ES2314378T3 - Uso de arn intronico para medir la expresion genica. - Google Patents

Abstract

Un método para controlar la expresión génica en una muestra biológica, que comprende: (a) proporcionar un polinucleótido complementario a una secuencia de ARN intrónica dentro de un gen diana, donde la expresión de dicha secuencia de ARN intrónica se correlaciona con la expresión de una secuencia de ARNm exónica dentro de dicho gen; (b) hibridar dicho polinucleótido con dicha secuencia de ARN intrónica para formar un complejo de polinucleótido- ARN intrónico; y (c) detectar el complejo de polinucleótido-ARN intrónico.

Description

Uso de ARN intrónico para medir la expresión génica.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Es bien sabido que la expresión génica dentro de las células y tejidos puede indicar el estado fisiológico y/o patológico de la célula, del tejido o del paciente. Durante varios decenios, la expresión génica, según lo medido por el análisis inmunohistoquímico de los marcadores de proteínas, se ha usado para efectuar decisiones de tratamiento. Por ejemplo, los niveles de los receptores de estrógenos y receptores de progesterona medidos de este modo ahora se usan habitualmente para seleccionar pacientes de cáncer de mama para el tratamiento con fármacos anties-
trogénicos.

La bibliografía de investigación más reciente proporciona pruebas de que los niveles tisulares de ciertas especies de ARNm tienen valor de diagnóstico y de pronóstico. Esto es un cambio prometedor ya que las tecnologías para medir los niveles de ARN celular, según demuestran múltiples RT-PCR y plataformas de matrices de ADN, pueden ser muy sensibles, específicas y cuantitativas. La PCR-TR se considera generalmente más sensible que la tecnología de matrices de ADN. Sin embargo, el diseño y selección de sondas/cebadores de RT-PCR puede ser desafiante porque existen criterios múltiples para conseguir un rendimiento óptimo. Este desafío es particularmente grande cuando el ARN de la muestra a estudiar proviene de tejidos fijados, embebidos en cera, porque dicho ARN suele estar muy fragmentado (K. Specht et al., Am. J. Pathol 158: 419-29 [2001]; T. E. Godfrey et al., J. Mol. Diagnostics 2: 84-91 [2000]).

Es una práctica aceptada medir la expresión de cualquier gen determinado ensayando el nivel de cualquiera de sus secuencias de ARNm maduro, procesado por corte y empalme, transcrito (secuencia de exón en lugar de secuencia de intrón). En teoría, un exón se define como cualquier segmento de un gen interrumpido representado en el producto de ARN maduro, y un intrón se define como un segmento de ADN que se transcribe pero se elimina del transcrito empalmando entre sí los exones de cada lado del mismo [B. Lewin. Genes IV, Cell Press, Cambridge Mass.1990]. La razón para la práctica aceptada del uso de secuencias de exones es teóricamente sencilla, porque los ARN maduros [ARNm] codifican proteínas, que definen fenotipos celulares, mientras que se considera que el ARN intrónico tiene comparativamente poca influencia en el fenotipo celular. Además, la opinión predominante es que los intrones se degradan rápidamente y son por tanto más difíciles de detectar que las secuencias de los exones {véanse las introducciones de los siguientes artículos: Thomas et al., J. Virol. 76:532-40 [2002]; Clement et al., J. Biol. Chem. 276:16919-30 [2001]; Sharp et al., Ann. Rev. Biochem. 55:1119-1150 [1986]}.

Adicionalmente, Kapranov et al., Science 296:916-919 [2002] describe matrices de oligonucleótidos que contienen sondas situadas en promedio cada 35 pares de bases a lo largo de los cromosomas humanos 21 y 22. Usando ARN citosólico poliadenilado obtenido a partir de 11 líneas celulares humanas, se presentan mapas que identifican áreas activas de la transcripción del ARN en estos cromosomas y los autores llegan a la conclusión de que se transcribe hasta un orden de magnitud más de la secuencia genómica que lo que sería justificable por los exones previstos y caracterizados previamente.

La presente invención se refiere al uso de ARN intrónico para medir la expresión génica. Se mostrará que las secuencias de ARN intrónico suelen ser fácilmente detectables mediante RT-PCR incluso cuando se usa ARN muy degradado procedente de tejidos fijados. Además, tienden a correlacionarse en su expresión con sus exones respectivos. El último punto es particularmente inesperado porque existen pocas o ninguna prueba de que las proporciones de las constantes de velocidad global para la síntesis y regeneración de las secuencias de intrones y exones transcritas son similares. De hecho, la bibliografía científica proporciona pruebas de la complejidad del pre-ARNm y la regeneración de intrones procesados por corte y empalme. Por ejemplo, puede existir pre-ARNm en múltiples grupos cinéticos (Elliot and Rosbash, Exp. Cell Res. 229:181-8 [1996]), con subpoblaciones que contienen ARN intrónicos que no están eficazmente procesados por corte y empalme y se transportan al citoplasma como especies de ARNm "inmaduro", donde pueden degradarse a diferente velocidad que las secuencias de ARN intrónicas nucleares (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4360-5 [1997]). Además, parece ser que algunos ARN intrónicos procesados por corte y empalme entran en el citoplasma en estructura de lazo (Clement et al., RNA 5:206-20
[1999]).

Sumario de la invención

La presente invención se basa en pruebas experimentales que demuestran que las secuencias de intrones transcritas, que por definición están presentes en el ARN nuclear heterogéneo pero típicamente no se incorporan en el ARNm, tienen utilidad de diagnóstico y de pronóstico. Esto es un descubrimiento importante por varias razones. Típicamente, las secuencias de los intrones son más largas que las secuencias de los exones, 20 veces o más. De esta manera, los intrones, dado que tienen una longitud media mucho mayor, proporcionalmente proporcionan mayores oportunidades para un diseño óptimo de sondas de expresión génica, por ejemplo, en el caso de RT-PCR, la creación de conjuntos de sonda/cebador que poseen un mejor rendimiento técnico. Independientemente, como las secuencias intrónicas evolucionan más rápidamente que las secuencias de los exones, los ARN intrónicos son adecuados para controlar la expresión de distintos miembros estrechamente relacionados de una familia de
genes.

En un aspecto, la invención se refiere a un método para controlar la expresión génica en una muestra biológica, que comprende:

(a) proporcionar un polinucleótido complementario a una secuencia de ARN intrónica dentro de un gen diana, donde la expresión de tal secuencia de ARN intrónica se correlaciona con la expresión de una secuencia de ARNm exónica dentro del gen diana;

(b) hibridar el polinucleótido con la secuencia de ARN intrónica para formar un complejo polinucleótido-ARN intrónico; y

(c) detectar el complejo polinucleótido-ARN intrónico.

En un aspecto particular, la expresión del gen diana se mide mediante la RT-PCR, en cuyo caso en el proceso anterior puede usarse un conjunto de cebador/sonda basado en intrón.

En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para usar secuencias basadas en intrón para diseñar y crear conjuntos de cebador-sonda para la RT-PCR. Dichos cebadores y sondas son particularmente adecuados para detectar y cuantificar niveles de ARN intrónico en muestras de tejidos fijados, embebidos en parafina (FPET), para el análisis de la expresión génica de alta sensibilidad. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de conjuntos de cebador-sonda basados en intrón en ensayos de perfiles de la expresión génica, tales como el análisis de la expresión génica de muestras FPET para diagnosticar y/o predecir el pronóstico de diversos estados patológicos.

En particular, la invención se refiere a un método para preparar una molécula de oligonucleótido monocatenaria para la amplificación de un gen diana y medir el nivel de una especie de ARN intrónico, que comprende:

(a) identificar al menos un secuencia de intrón dentro del gen diana, donde la expresión de la secuencia de intrón se correlaciona con la expresión de una secuencia de exón dentro del gen diana;

(b) preparar una molécula de oligonucleótido monocatenaria que se corresponda con al menos una parte de la secuencia de intrón transcrita; y

(c) usar la molécula de oligonucleótido para medir la expresión génica.

Al igual que antes, la expresión génica puede medirse, por ejemplo, mediante la RT-PCR, en cuyo caso se usa un conjunto de cebador/sonda basado en intrón (que consta de dos cebadores y una sonda) para medir la expresión génica.

Si el oligonucleótido es un cebador directo, típicamente se diseña para comprender las secuencias 5' de una secuencia diana dentro de la secuencia intrónica transcrita. Si el oligonucleótido es un cebador inverso, típicamente se diseña para complementar las secuencias 5' de una secuencia diana aguas abajo del cebador directo dentro de la secuencia intrónica transcrita. Es importante identificar y usar una secuencia diana suficientemente larga para la amplificación por PCR. La secuencia diana debe ser generalmente al menos de aproximadamente 50 bases de nucleótidos de longitud, en particular al menos de 55 bases de nucleótidos de longitud, y en algunas realizaciones al menos de aproximadamente 60 bases de nucleótidos de longitud. Los cebadores y sondas de PCR se diseñan siguiendo principios bien conocidos. De este modo, el cebador de PCR es típicamente de 17-30 bases de nucleótidos de longitud y generalmente contiene aproximadamente del 20% al 80% de bases G + C. Es deseable diseñar los cebadores de PCR con una temperatura de fusión (Tm) entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 70ºC.

Cuando la molécula de oligonucleótido monocatenaria es una sonda de PCR, generalmente se diseña para comprender o complementar una parte interna de una secuencia diana dentro de la secuencia intrónica transcrita. Para la amplificación TaqMan®, la sonda de PCR se marca con un colorante fluorescente indicador y un resto de
inactivación.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para medir la expresión de un gen mediante la amplificación de un gen diana por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que comprende:

(a) identificar al menos una secuencia intrónica diana dentro del gen diana, donde la expresión de la secuencia intrónica se correlaciona con la expresión de una secuencia de exón correspondiente dentro del gen diana; y

(b) amplificar la secuencia intrónica diana transcrita usando un conjunto de cebador/sonda de PCR específico de intrón.

La secuencia de intrón diana es típicamente al menos aproximadamente de 50 bases de longitud, y el conjunto de cebador y sonda de PCR está diseñado para corresponder a secuencias únicas dentro de la secuencia intrónica diana transcrita.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para amplificar fragmentos de ARN en una muestra que representan al menos un gen de interés, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores y sonda de PCR; y

(b) realizar la amplificación por PCR,

donde los cebadores y la sonda de PCR se diseñan basándose en una secuencia intrónica identificada dentro del gen de interés, y donde la expresión de la secuencia intrónica se correlaciona con la expresión de una secuencia de exón dentro del gen de interés.

En una realización particular, los cebadores y la sonda de PCR se diseñan típicamente basándose en una secuencia única dentro del intrón identificado. En otra realización, la muestra comprende ARN fragmentado que representa múltiples genes de interés y entra en contacto con un grupo de cebadores y sondas de PCR diseñados basándose en secuencias únicas dentro de intrones presentes en los genes de interés.

En una realización preferida, la amplificación se realiza en una muestra de tejido fijado embebido en parafina (FPET), que puede proceder, por ejemplo, de una biopsia de tumor obtenida a partir de un paciente humano. El tumor puede ser cualquier tipo de tumor sólido tal como, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón o cáncer colorrectal. El tejido tumoral puede recogerse mediante diversos métodos, incluyendo la biopsia de aguja fina, la biopsia de aguja gruesa o la resección.

En una realización particular, la invención se refiere a métodos que usan conjuntos de cebador-sonda de PCR basados en intrón en el análisis de la expresión génica para predecir la probabilidad de recurrencia en pacientes con cáncer de mama en sus primeros estadíos.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una matriz que comprende una pluralidad de polinucleótidos que hibridan con los genes diana de interés, donde preferentemente al menos el 70% de los polinucleótidos comprenden secuencias intrónicas.

En otro aspecto más, la invención se refiere a secuencias de amplicón basadas en intrón y a su uso en el análisis de la expresión génica.

En una realización particular, la invención se refiere al análisis de la expresión génica de una muestra biológica representativa de cáncer de mama invasivo, basado en la determinación de los niveles de expresión de transcritos de ARN o de los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en:

(a)

Bcl2, cyclinG1, NFKBp65, NME1, EPHX1, TOP2B, DR5, TERC, Src, DIABLO;

(b)

Ki67, XIAP, hENT1, TS, CD9, p27, cyclinG1, pS2, NFKBp65, CYP3A4;

(c)

GSTM1, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, P27, CYP3A4, pS2, NFKBp65, ErbB3;

(d)

PR, NME1, XIAP, upa, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, ALDH1A3, CTSL;

(e)

CA9, NME1, TERC, cyclinG1, EPHX1, DPYD, Src, TOP2B, NFKBp65, VEGFC;

(f)

TFRC, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, ErbB3, NFKBp65;

(g)

Bcl2, PRAME, cyclinG1, FOXM1, NFKBp65, TS, XIAP, Ki67, CYP3A4, p27;

(h)

FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, PRAME, TS, Ki67, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(i)

PRAME, FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, TS, Ki6, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(j)

Ki67, XIAP, PRAME, hENT1, contig51037, TS, CD9, p27, ErbB3, cyclinG1;

(k)

STK15, XIAP, PRAME, PLAUR, p27, CTSL, CD18, PREP, p53, RPS6KB1;

(l)

GSTM1, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, GSTp, EREG, ID1, PLAUR;

(m)

PR, PRAME, NME1, XIAP, PLAUR, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, DR5;

(n)

CA9, FOXM1, cyclinG1, XIAP, TS, Ki67, NFKBp65, CYP3A4, GSTM3, p27;

(o)

TFRC, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, DPYD, TERC, NME1, VEGFC, y

(p)

CEGP1, PRAME, hENT1, XIAP, Contig51037, ErbB3, DPYD, NFKBp65, ID 1, TS,

incluyendo el uso de secuencias basadas en intrones.

En otra realización, la invención se refiere al análisis de la expresión génica de una muestra biológica representativa de cáncer de mama ER-positivo basado en la determinación de los niveles de expresión de transcritos de ARN o de los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en:

(a)

PRAME, p27, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID 1, EstR1, DIABLO;

(b)

Contig51037, EPHX1, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(c)

Bcl2, hENT1, FOXM1, Contig51037, cyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(d)

HIF1A, PRAME, p27, IGFBP2, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(e)

IGF1R, PRAME, EPHX1, Contig51037, cyclinG1, Bcl2, NME1, PTEN, TBP, TIMP2;

(f)

FOXM1, Contig51037, VEGFC, TBP, HIF1A, DPYD, RAD51C, DCR3, cyclinG1, BAG1;

(g)

EPHX1, Contig51037, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(h)

Ki67, VEGFC, VDR, GSTM3, P27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(i)

CDC25B, Contig51037, hENT1, Bcl2, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP;

(j)

VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, P27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(k)

CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

(l)

DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

(m)

p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(n)

CDH1; PRAME, VEGFC; HIF1A; DPYD; TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

(o)

IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF;

(p)

GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

(q)

hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(r)

STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

(s)

NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, hENT1, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

(t)

VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1;

(u)

EIF4E, Contig51037, EPHX1, cyclinG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

(v)

CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa;

(w)

ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

(x)

FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

(y)

GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, EBX05, CA9, CYP, KRT18, y

(z)

Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF,

incluyendo el uso de secuencias basadas en intrones.

En otra realización, el cáncer es cáncer de mama y el gen o los genes analizados se seleccionan del grupo consistente en: FOXM1; PRAME; SKT15, Ki-67; CA9; NME1; SURV; TFRC; YB-1; RPS6KB1; Src; Chkl; CCNB1; Chk2; CDC25B; CYP3A4; EpCAM; VEGFC; hENT1; BRCA2; EGFR; TK1; VDR; Blc12; CEGP1; GSTM1; PR; BBC3; GATA3; DPYD; GSTM3; ID1; EstR1; p27; XIAP; IGF1R; AK055699; P13KC2A; TGFB3; BAGI1; pS2; WISP1; HNF3A y NFKBp65.

En otra una realización más, la invención se refiere al análisis de la expresión génica de una muestra biológica representativa de cáncer de mama invasivo, basado en la determinación de los niveles de expresión de los transcritos de ARN o productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en:

(a)

p53BP2, Bcl2, BAD, EPHX1, PDGFR\beta, DIABLO, XIAP, YB1, CA9 y KRT8;

(b)

GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6 y WISP1;

(c)

PR, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, IGFBP2, TIMP1, CA9, MMP9 y COX2;

(d)

CD68, GRB7, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6 y WISP1;

(e)

Bcl2, p53BP2, BAD, EPHX1, PDGFR\beta, DIABLO, XIAP, YB1, CA9 y KRT8;

(f)

KRT14, KRT5, PRAME, p53BP2, GUS1, AIB1, MCM3, CCNE1, MCM6 e ID1;

(g)

PRAME, p53BP2, EstR1, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3 y VEGFB;

(h)

CTSL2, GRB7, TOP2A, CCNB1, Bcl2, DIABLO, PRAME, EMS1, CA9 y EpCAM;

(i)

EstR1, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3 y VEGFB;

(j)

Chk1, PRAME, p53BP2, GRB7, CA9, CTSL, CCNB1, TOP2A, el tamaño del tumor e IGFBP2;

(k)

IGFBP2, GRB7, PRAME, DIABLO, CTSL, \beta-catenina, PPM1D, Chk1, WISP1 y LOT1;

(l)

HER2, p53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, EPHX1, TOP2A, TRAIL, CA9 y AREG;

(m)

BAG1, p53BP2, PRAME, IL6, CCNB1, PAI1, AREG, el tamaño del tumor, CA9 y Ki67;

(n)

CEGP1, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, AKT2 y FGF18;

(o)

STK15, p53BP2, PRAME, IL6, CCNE1, AKT2, DIABLO, cMet, CCNE2 y COX2;

(p)

KLK10, EstR1, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1 y BBC3;

(q)

AIB1, p53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, CD3, p53, CA9, GRB7 y EPHX1;

(r)

BBC3, GRB7, CD68, PRAME, TOP2A, CCNB1, EPHX1, CTSL, GSTM1 y APC;

(s)

CD9, GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, CCNB1, CD3, DIABLO, ID1 y PPM1D;

(t)

EGFR, KRT14, GRB7, TOP2A, CCNB1, CTSL, Bcl2, TP, KLK10 y CA9;

(u)

HIFl\alpha, PR, DIABLO, PRAME, Chk1, AKT2, GRB7, CCNE1, TOP2A y CCNB1;

(v)

MDM2, p53BP2, DIABLO, Bcl2, AIB1, TIMP1, CD3, p53, CA9 y HER2;

(w)

MYBL2, p53BP2, PRAME, IL6, Bcl2, DIABLO, CCNE1, EPHX1, TIMP1 y CA9;

(x)

p27, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, AKT2 e ID1;

(y)

RAD51, GRB7, CD68, TOP2A, CIAP2, CCNB1, BAG1, IL6, FGFR1 y p53BP2;

(z)

SURV, GRB7, TOP2A, PRAME, CTSL, GSTM1, CCNB1, VDR, CA9 y CCNE2;

(aa)

TOP2B, p53BP2, DIABLO, Bcl2, TIMP1, AIB1, CA9, p53, KRT8 y BAD;

(ab)

ZNF217, GRB7, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, APC4 y \beta-catenina.

En una realización diferente, la invención se refiere al análisis de la expresión génica de una muestra biológica, usando secuencias de polinucleótidos basadas en intrones que hibridan al menos con uno de los genes seleccionados del grupo consistente en: CD68; CTSL; FBXO5; SURV; CCNB1; MCM2; Chk1; MYBL2; HIF1A; cMET; EGFR; TS; STK15; IGFR1; BCl2; HNF3A; TP53BP2; GATA3; BBC3; RAD51C; BAG1; IGFBP2; PR; CD9; RB1; EPHX1; CEGP1; TRAIL; DR5; p27; p53; MTA; RIZ1; ErbB3; TOP2B; EIF4E, CD68; CTSL; FBXO5; SURV; CCNB1; MCM2; Chk1; MYBL2; HIF1A; cMET; EGFR; TS y STK15.

El análisis de la expresión génica puede realizarse en un formato de matriz, y la matriz preferiblemente es una matriz de alta densidad que comprende al menos 100, más preferiblemente al menos 150, y aún más preferiblemente 200 secuencias en una sección de 5-10 \mu. Finalmente, la presente invención se refiere al uso de ARN intrónico en pronósticos de cáncer como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-M muestran secuencias intrónicas enmascaradas para los genes CEGP1, FOXM1, PRAME y STK15. Los amplicones usados para la RT-PCR se muestran en cursiva.

La Figura 2 muestra conjuntos de cebador/sonda para CEGP1, FOXM1, PRAME y STK15. Las secuencias de los cebadores directo e inverso se indican con "F" y "R", respectivamente. Las secuencias de los cebadores se designan con "P".

La Figura 3 muestra los coeficientes de correlación [R] para la co-expresión del ARN del exón de CEGP1 con otras 47 secuencias de ARN. Símbolos: rombo = exón de CEGP1 frente a sí mismo (= 1,0 por definición); cuadrados = intrones de CEGP1; triángulos = secuencias de otros genes.

La Figura 4 muestra los coeficientes de correlación [R] para la co-expresión del ARN del exón de PRAME con otras 47 secuencias de ARN. Símbolos: rombo = exón de PRAME frente a sí mismo (= 1,0 por definición); cuadrados = intrones de PRAME; triángulos = secuencias de otros genes.

La figura 5 muestra los coeficientes de correlación [R] para la co-expresión del ARN del exón de STK15 con otras 47 secuencias de ARN. Símbolos: rombo = exón de STK15 frente a sí mismo (= 1,0 por definición); cuadrados = intrones de STK15; triángulos = secuencias de otros genes.

La Figura 6 muestra un conjunto ejemplar de genes, cuya expresión puede analizarse por los métodos de la presente invención.

Descripción detallada de la realización preferida A. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York; NY 1994), proporcionan al especialista en la técnica una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud. Un especialista en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen como se indica a continuación.

Los términos "corte y empalme" y "corte y empalme de ARN" se usan de manera indistinta y se refieren al procesamiento de ARN que elimina intrones y une exones para producir el ARNm maduro con secuencias codificantes continuas que se transportan al citoplasma de una célula eucariota.

En teoría, el término "exón" se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que está representado en el producto de ARN maduro (B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990). En teoría, el término "intrón" se refiere a cualquier segmento de ADN que se transcribe pero se elimina del interior del transcrito por corte y empalme de los exones que están a cada lado del mismo. Funcionalmente, en la secuencia del ARNm de un gen definido por los números de ID de Sec de Ref. aparecen secuencias de exones. Funcionalmente, las secuencias intrónicas son las secuencias intermedias dentro del ADN genómico de un gen, separadas por secuencias de exones y que tienen secuencias consenso de corte y empalme GT y AG en sus extremos 5' y 3'.

El término "micromatriz" se refiere a una disposición ordenada de elementos hibridables en una matriz, preferiblemente sondas polinucleotídicas sobre un sustrato.

El término "polinucleótido", cuando se utiliza en singular o en plural, generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. De este modo, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen en este documento incluyen, sin limitación, ADN mono- y bi-catenario, ADN que incluye regiones mono- y bi-catenarias, ARN mono- y bi-catenario, y ARN que incluye regiones mono- y bi-catenarias, moléculas hibridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenario o, más típicamente, bicatenario o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido" como se usa en este documento se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente incluyen sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple-hélice a menudo es un oligonucleótido. El término "polinucleótido" específicamente incluye los ADNc. El término incluye ADN (incluyendo ADNc) y ARN que contienen una o más bases modificadas. De este modo, los ADN o los ARN con estructuras modificadas para conseguir estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como se usa este término en el presente documento. Además, se incluyen dentro del término "polinucleótidos" como se define en este documento ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas modificadas química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células sencillas y
complejas.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono- o bi-catenarios, híbridos de ARN:ADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos sonda de ADN monocatenarios a menudo se sintetizan por métodos químicos, por ejemplo, usando sintetizadores de oligonucleótidos automáticos que están disponibles comercialmente. Sin embargo, pueden obtenerse oligonucleótidos por una diversidad de métodos distintos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y por la expresión de ADN en células y organismos.

Las expresiones "genes expresados diferencialmente", "expresión génica diferencial" y sus sinónimos, que se usan indistintamente, se refieren a un gen cuya expresión es de un nivel superior o inferior en un paciente o sujeto de ensayo en relación a otro, por ejemplo, en un sujeto que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, en relación a su expresión en un sujeto normal o de control. Las expresiones también incluyen genes cuya expresión está activada hacia un mayor o menor nivel en diferentes etapas de la misma enfermedad. También se entiende que un gen expresado diferencialmente puede estar activado o inhibido a nivel del ácido nucleico o a nivel de la proteína, o puede ser objeto de corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto de polipéptido diferente. Dichas diferencias pueden demostrarse por un cambio en los niveles de ARNm, expresión en la superficie, secreción u otras divisiones de un polipéptido, por ejemplo. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o una comparación de las proporciones de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos procesados de manera diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diferentes estadíos de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye tanto diferencias cuantitativas como diferencias cualitativas en el patrón de expresión temporal o celular en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células normales o enfermas, o entre células que han experimentado diferentes acontecimientos de enfermedad o estadíos de enfermedad. Para el fin de esta invención, se considera que está presente la "expresión génica diferencial" cuando hay al menos aproximadamente dos veces, preferiblemente al menos aproximadamente cuatro veces, más preferiblemente al menos aproximadamente seis veces, más preferiblemente al menos aproximadamente diez veces de diferencia entre la expresión de un gen determinado en sujetos normales y enfermos, o en los diversos estadíos del desarrollo de la enfermedad en un sujeto
enfermo.

El término "sobre-expresión" con respecto a un transcrito de ARN se usa para referirse al nivel del transcrito determinado por normalización al nivel de los ARNm de referencia, que podría ser todos los transcritos medidos en la muestra o un conjunto de referencia particular de ARNm.

La frase "amplificación génica" se refiere a un proceso mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una célula o línea celular particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina a menudo "amplicón". A menudo, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de la expresión génica, también aumenta en la proporción del número de copias efectuadas del gen particular
expresado.

El término "pronóstico" se usa en este documento para referirse a la predicción de la probabilidad de muerte o progresión atribuible al cáncer, incluyendo la recurrencia, la propagación de metástasis y la resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como cáncer de mama. El término "predicción" se usa en este documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responda de manera favorable o desfavorable a un fármaco o conjunto de fármacos, y también el alcance de esas respuestas, o de que el paciente sobreviva tras la extirpación quirúrgica del tumor primario y/o quimioterapia durante un cierto periodo de tiempo sin recurrencia de cáncer. Los métodos de predicción de la presente invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento escogiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos de predicción de la presente invención son herramientas valiosas para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como una intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco o combinación de fármacos determinada, y/o radioterapia, o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, tras la cirugía y/o terminación de la quimioterapia u otras modalidades de tratamiento.

El término supervivencia a "largo plazo" se usa en este documento para referirse a la supervivencia durante al menos 3 años, más preferiblemente durante al menos 5 años, y mucho más preferiblemente durante al menos 10 años tras la cirugía u otro tratamiento.

El término "aumento de resistencia" a un fármaco u opción de tratamiento particular, cuando se usa de acuerdo con la presente invención, significa la disminución de respuesta a una dosis estándar del fármaco o a un protocolo de tratamiento estándar.

El término "disminución de la sensibilidad" a un fármaco u opción de tratamiento particular, cuando se usa de acuerdo con la presente invención, significa la disminución de respuesta a una dosis estándar del fármaco o a un protocolo de tratamiento estándar, cuando la disminución de la respuesta puede compensarse (al menos parcialmente) por el aumento de la dosis del fármaco o la intensidad del tratamiento.

La "respuesta del paciente" puede evaluarse usando cualquier punto final que indique un beneficio para el paciente, incluyendo, sin limitación, (1) la inhibición, en alguna medida, del crecimiento del tumor incluyendo la ralentización y detención completa del crecimiento; (2) la reducción del número de células tumorales; (3) la reducción del tamaño del tumor; (4) la inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención total) de la infiltración de células tumorales hacia tejidos y/u órganos periféricos adyacentes; (5) la inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención total) de la metástasis; (6) la mejora de la respuesta inmune anti-tumoral, que puede, pero no tiene que, dar como resultado la regresión o el rechazo del tumor; (7) el alivio, en alguna medida, de uno más síntomas asociados con el tumor; (8) el aumento de la duración de la supervivencia después del tratamiento; y/o (9) el descenso de la mortalidad en un momento determinado después del tratamiento.

El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al tratamiento profiláctico o medidas preventivas, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) el estado patológico o trastorno diana. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se desea prevenir el trastorno. En el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales, o hacer que las células tumorales sean más susceptibles al tratamiento por otros agentes terapeúticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia.

El término "tumor", como se usa en este documento, se refiere a todo el crecimiento celular neoplásico y proliferación, tanto maligna como benigna, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que está caracterizado típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer cerebral.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citoquinas u otros productos de secreción en niveles anormales, la supresión o el agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un especialista normal en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico, que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren mayores temperaturas para una hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridar cuando las cadenas complementarias están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que el aumento de las temperaturas relativas tendería a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas más bajas menos. Si se desean detalles y explicaciones adicionales de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones rigurosas" o las "condiciones de alta rigurosidad", como se definen en este documento, típicamente: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura de lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridación, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; ó (3) emplean formamida al 50%, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado altamente riguroso que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50ºC. El especialista en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. cuando sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de la presente invención, la referencia a "al menos uno", "al menos dos", "al menos cinco" etc. de los genes enumerados en cualquier conjunto génico particular significa una cualquiera o todas y cada una de las combinaciones de los genes enumerados.

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B. Descripción Detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas de recombinación), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro de la experiencia en la técnica. Estas técnicas se explican a fondo en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2^{nd} edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc); "Handbook of Experimental Immunology" 4^{th} edition (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc, 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).

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1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El fin de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es hacer copias de un gen para proporcionar mayores cantidades de ácido nucleico para uso posterior. La PCR es un proceso basado en una enzima polimerasa especializada (por ejemplo la ADN polimerasa de Taq), que puede sintetizar una cadena complementaria a una cadena de ADN determinada en una mezcla que contiene los cuatro dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y dos cebadores oligonucleotídicos que flanquean la secuencia diana a amplificar. Los dos cebadores oligonucleotídicos se usan para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer nucleótido, o sonda, está diseñado para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. Aunque el diseño de la sonda puede diferir, en el método de PCR TaqMan® las señales de la sonda se controlan por la proximidad de un colorante fluorescente indicador y un colorante fluorescente de inactivación. Cualquier emisión inducida por láser desde el colorante indicador se inactiva por el colorante de inactivación cuando los dos colorantes se localizan próximos entre sí como están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima polimerasa (por ejemplo la ADN polimerasa de Taq) escinde la sonda de una manera dependiente de la plantilla. Los fragmentos de la sonda resultante se disocian en solución, y la señal procedente del colorante indicador liberado está exenta del efecto de inactivación del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante indicador por cada nueva molécula sintetizada y la detección del colorante indicador no inactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

El material de partida para la PCR puede ser ADN, ADNc, ARNm o cualquier otro polinucleótido que necesite amplificarse. Como la PCR requiere ADN monocatenario como plantilla, si el material de partida es ADN bicatenario necesita desnaturalizarse para producir ADN monocatenario.

Como el ARN no puede servir como plantilla para la PCR, si el material de partida es ARN, la primera etapa es la transcripción inversa de la plantilla de ARN en ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Esta versión de PCR se denomina generalmente PCR transcriptasa inversa (RT-PCR). Las dos transcriptasas más comúnmente usadas son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa se ceba típicamente usando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligo-dT, dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, el ARN extraído de una muestra de tejido (por ejemplo FPET) se puede transcribir de forma inversa usando un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido puede usarse después como una plantilla en la siguiente reacción de PCR.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, típicamente emplea la ADN polimerasa de Taq, que tiene una actividad nucleasa 5'-3' pero carece de una actividad endonucleasa correctora 3'-5'. De este modo, la PCR TaqMan® típicamente utiliza la actividad nucleasa 5' de la polimerasa de Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa 5' equivalente. En este caso, la sonda se diseña para ser no-extensible por la enzima ADN polimerasa de Taq. La RT-PCR TaqMan® puede realizarse usando un equipo comercialmente disponible tal como, por ejemplo, el ABI PRISM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM} (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). En una realización preferida, el procedimiento de la nucleasa 5' se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativo en tiempo real tal como el ABI PRISM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM}. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye un programa informático para ejecutar el instrumento y para el análisis de los datos.

Los datos de ensayo de la nucleasa 5' inicialmente se expresan como Ct, o el ciclo umbral. Como se ha señalado anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese momento en la reacción de amplificación. El momento en el que la señal fluorescente se registra por primera vez como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar errores y el efecto de la variación de una muestra a otra, la RT-PCR se realiza normalmente usando un patrón interno. El patrón interno ideal se expresa en un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Son ARN frecuentemente usados para normalizar los patrones de la expresión génica ARNm para los genes básicos administradores ("housekeeping genes") gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDG) y \beta-actina.

Para detalles adicionales de la PCR cuantitativa en tiempo real véase también Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996). La PCR se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.202, 4.683.195, 4.965.188 y 5.075.216.

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2. Intrones y Corte y Empalme de ARN

La mayoría de los genes en eucariotas superiores contienen más de 100.000 pares de nucleótidos, algunos contienen más de 2 millones de pares de nucleótidos. Esta longitud es significativamente mayor que la de la secuencia de nucleótidos requerida para codificar una proteína de tamaño medio (300-400 aminoácidos), que está en el orden de aproximadamente 1000 nucleótidos. La mayor parte de la longitud extra consta de secuencias no codificantes (intrones) que interrumpen las secuencias codificantes (exones) dentro de la secuencia génica. La mayoría de los genes de eucariotas superiores que codifican ARNm, ARNt y algunos que codifican ARNr se interrumpen por secuencias intrónicas. Los genes para el ARNm típicamente tienen de 0 a 60 intrones; mientras que los genes para el ARNt típicamente incluyen 0 ó 1 intrón.

Cuando se transcribe ARNm a partir de ADN, al principio se transcriben tanto las secuencias de los exones como las secuencias de los intrones en el denominado ARN nuclear heterogéneo (ARNhn) o ARN inmaduro o pre-ARNm. Sin embargo, antes de que el ARN salga del núcleo, las secuencias intrónicas a menudo se eliminan del ARNm transcrito como resultado de un proceso conocido como corte y empalme del ARN. El proceso de eliminación de intrones implica un proceso preciso de formación de bucles controlado por una secuencia específica de nucleótidos contigua a los exones. Casi todos los intrones pueden identificarse por secuencias consenso específicas. Las dos primeras bases de un intrón son siempre GU, mientras que las dos últimas bases son siempre AG, pero los sitios de corte y empalme 5' y 3' típicamente tienen secuencias consenso que se extienden más allá de los pares GU y AG. El corte y empalme del ARNm tiene lugar en una partícula llamada espliceosoma, mientras que el ARNt y el ARNr se cortan y empalman por mecanismos que no implican espliceosomas.

Los intrones son típicamente mucho más largos que los exones (secuencias que están presentes en el ARNm). Un exón eucariota medio es de aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, mientras que un único intrón humano puede ser tan largo como de cerca de 500.000 nucleótidos, aunque típicamente es de aproximadamente 2000-4000 nucleótidos. En general, un gen eucariota contiene muchas más secuencias intrónicas que de exones, como se ilustra en la siguiente tabla (Molecular Biology of the Cell, Bruce Alberts et al., eds., 3ª edición, Garland Publishing Company, New York, N.Y., 1994, p.340):

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TABLA 1

1

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En una realización particular de la presente invención, las secuencias intrónicas en un gen de interés están sometidas a un proceso de selección para identificar la secuencia o secuencias de ARN intrónicas que se coexpresan con secuencias de ARN de exones (es decir, ARNm) del mismo gen. Dichas secuencias intrónicas seleccionadas, cuya expresión se correlaciona con la expresión de secuencias de exones, tienen propiedades especialmente deseables como potenciales marcadores de diagnóstico: (1) a causa de su comportamiento técnico favorable (específicamente, la optimización de la especificidad y sensibilidad de ensayo); y (2) cualquier importancia biomédica asociada al nivel de ARNm del gen también está asociada a los niveles celulares de secuencias intrónicas. Por ejemplo, es probable que altos niveles de una especie de ARNm que codifica un factor de crecimiento potente estén probablemente correlacionados con altos índices de crecimiento de una célula. Las secuencias intrónicas que tienen niveles celulares que correlacionan con niveles del ARNm de este mismo gen tienen la misma probabilidad de correlacionarse con altos índices de crecimiento de una célula. Dichas secuencias intrónicas seleccionadas pueden usarse para explorar muestras de tejido valiosas para buscar correlaciones clínicas y significado de diagnóstico, predicción o
pronóstico.

Un proceso ejemplar para seleccionar secuencias intrónicas que se coexpresan con el ARNm del mismo gen es el siguiente. Brevemente, para cualquier gen de interés, se ensaya un conjunto de tejidos pertinentes de una población de pacientes de interés para medir los niveles de un conjunto de secuencias intrónicas y de ARNm. Después se seleccionan las secuencias intrónicas que se ha descubierto que tienen el mayor coeficiente de correlación de Pearson para la coexpresión con secuencias de ARN de exones (ARNm). El número de pacientes estudiados en este proceso es peferiblemente al menos superior a 50 y más preferiblemente de al menos aproximadamente 100.

En un ejemplo específico, el asunto biomédico de interés trata de pacientes con cáncer de mama y el gen de interés puede ser el marcador de crecimiento tumoral Ki-67. En este caso, se usan tumores de 50 o más pacientes de cáncer de mama para medir los niveles de ARNm de Ki-67 y los niveles de las secuencias de múltiples intrones de Ki-67 y se seleccionan los intrones que tienen el mayor coeficiente de correlación de Pearson para la co-expresión con ARN de exones.

Una ventaja de este proceso es que la selección de la secuencia intrónica preferida puede realizarse con muestras de tejido relativamente fáciles de obtener y abundantes (por ejemplo, muestras que carecen de registros clínicos asociados valiosos). Dado que dicho tejido puede proporcionar grandes cantidades de ARN para explorar, será posible detectar señales de expresión génica incluso a partir de sondas subóptimas. Después pueden usarse ensayos muy sensibles y específicos basados en las secuencias intrónicas seleccionadas para explorar muestras de tejido valiosas, por ejemplo, muestras asociadas a una información clínica importante, tal como la recurrencia de la enfermedad, muerte o la respuesta a fármacos terapéuticos o regímenes de tratamiento definidos.

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3. Perfilado de la expresión génica usando intrones basados en conjuntos cebador/sonda de la PCR

En el momento actual, los cebadores y sondas de la PCR se han diseñado en base a la secuencia de ARNm o ADNc, sin considerar las secuencias intrónicas. De hecho, los intrones se consideran normalmente un material "de embalaje" que se elimina durante el corte y empalme y generalmente se degrada de forma rápida.

La presente invención está basada en el descubrimiento experimental inesperado de que los ARN de los intrones pueden detectarse fácilmente por RT-PCR, incluso usando ARN altamente degradado procedente de muestras de tejido fijado embebido en parafina. En particular, se ha descubierto que en el perfil de la expresión génica para un gen determinado, las señales de RT-PCR de conjuntos sonda/cebador basados en intrón pueden ser grandes, o más grandes, que las señales de RT-PCR basadas en exón. Aunque este descubrimiento se confirma por unos pocos descubrimientos recientes con ciertas especies de ARNm, no está de acuerdo con la opinión predominante de que los intrones se degradan muy rápidamente después del corte y empalme (Thomas et al., J. Virol. 76:532-40 [2002]; Clement et al., J. Biol. Chem. 276:16919.30 [2001]: Sharp et al., Ann. Rev. Biochem. 55:1119-1150 [1986].

También inesperados, los descubrimientos experimentales subyacentes a la presente invención indican que el ARN intrónico puede usarse para perfilar la expresión génica, porque las cantidades en tejido de las secuencias de intrones y exones expresadas tienden a correlacionarse. Este resultado es inesperado porque existen escasas o ninguna prueba de que la proporción de la constante de velocidad global para la síntesis y la renovación de las secuencias de intrones y exones transcritas son similares. De hecho, la bibliografía científica proporciona pruebas de la complejidad de la renovación de pre-ARNm y de intrones procesados (sometidos a cortes y empalme). Por ejemplo, puede existir pre-ARNm en múltiples grupos cinéticos (Elliot and Rosbash, Exp. Cell Res. 229:181-8 [1996]), con subpoblaciones que contienen ARN intrónicos que no están eficazmente empalmados y se transportan al citoplasma como especies de ARNm "inmaduros", donde pueden degradarse a diferente velocidad que las secuencias de ARN intrónicas nucleares (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4360-5 [1997]). Existen pruebas de que ciertos ARN intrónicos procesados por corte y empalme entran en el citoplasma en estructura de lazo (Clement et al., ARN 5:206-20
[1999]).

Finalmente, los datos presentados en este documento indican que las secuencias intrónicas pueden servir como marcadores moleculares de diagnóstico o pronóstico. Examinando cuatro ARNm que previamente habían demostrado ser de carácter pronóstico en cánceres, se demuestra que sus secuencias intrónicas correspondientes son también de pronóstico, y en las mismas direcciones que las secuencias de exones transcritas parentales (es decir, de pronóstico tanto positivo como negativo).

En resumen, el enfoque de la invención se ha demostrado como sigue. El documento WO 0378662 describe un conjunto de genes que predicen la probabilidad de recurrencia de cáncer de mama. En este estudio, se midieron los niveles de las secuencias de exón transcritas en muestras de tejido de cáncer de mama fijado embebido en parafina de 146 pacientes usando conjuntos de cebador/sonda de PCR basados en exón. En el estudio descrito en este documento, se crearon ensayos de RT-PCR para medir los niveles de las secuencias de intrón transcritas dentro de cuatro de los genes marcadores identificados anteriormente, y después se usaron para explorar el ARN de 60 muestras de biopsia fijadas embebidas en parafina (que representaban 60 pacientes diferentes, un subconjunto de los pacientes evaluados en el estudio anterior). Los datos presentados en los ejemplos mostrados a continuación demuestran que para cada gen los intrones y los exones están co-expresados, y que los intrones predicen el riesgo de recurrencia de la enfermedad recurrente según lo predicho por los datos anteriores basados en
exones.

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3. Diseño de Cebadores y Sondas de PCR Basado en Intrones

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se diseñan cebadores y sondas de PCR en base a secuencias intrónicas presentes en el gen a amplificar. Por consiguiente, el primer paso en el diseño del cebador/sonda es la delineación de las secuencias intrónicas dentro de los genes. Esto se puede hacer mediante el programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático ADN BLAT desarrollado por Kent, W.J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), o por el programa informático BLAST incluyendo sus variaciones. Los pasos posteriores siguen métodos bien establecidos de diseño del cebadores y sondas de la PCR.

Para evitar señales no específicas, es importante enmascarar las secuencias repetitivas dentro de los intrones al diseñar los cebadores y las sondas. Esto puede lograse fácilmente usando el programa Repeat Masker disponible on-line a través del Colegio Universitario de Medicina Baylor, que explora secuencias de ADN contra una biblioteca de elementos repetitivos y devuelve una secuencia problema en la cual los elementos repetitivos están enmascarados. Las secuencias intrónicas enmascaradas pueden usarse entonces para diseñar secuencias de cebador y sonda usando cualquiera de los paquetes de diseño de cebador/sonda comerciales o disponibles al público de otra manera, tales como Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-desing (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000); Primer3 en WWW para usuarios generales y para biólogos programadores. En: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386).

Los factores más importantes considerados en el diseño de cebadores de PCR incluyen la longitud del cebador, la temperatura de fusión (Tm), y el contenido de G/C, la especificidad, las secuencias de cebador complementarias y la secuencia 3' terminal. En general, los cebadores de PCR óptimos son generalmente de 17-30 bases de longitud, y contienen aproximadamente el 20-80%, tal como, por ejemplo, son aproximadamente el 50-60% de bases G+C. Las Tm típicamente preferidas están entre 50 y 80ºC, por ejemplo, aproximadamente de 50 a
70ºC.

Para más directrices para los diseños de cebador y sonda de la PCR véase, por ejemplo, Dieffenbach, C.W. et al., "General Concepts for PCR Primer Desingn" en: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis y Gelfand, "Optimazation of PCRs" en: PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; y Plasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe desin. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997).

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4. Aplicaciones

Los métodos de la presente invención y, específicamente, de los cebadores y sondas de PCR basados en intrones de este documento, tienen utilidad en todos los campos donde se requiere la amplificación de un ácido nucleico (incluyendo ARN, ADN y, en general, cualquier oligo- y polinucleótido) que representa un gen o un fragmento de gen. De esta manera, los cebadores y las sondas de PCR diseñados de acuerdo con la presente invención pueden usarse para amplificar genes individuales, o genes múltiples presentes en una muestra biológica con el fin de perfilar la expresión génica por cualquier metodología incluyendo, sin limitación, el perfilado de la expresión génica basado en una PCR cuantitativa (por ejemplo, RT-PCR cuantitativa), y análisis de micromatrices y ensayos basados en
perlas.

Por ejemplo, en una realización específica de la técnica de micromatriz, se aplicaron insertos de clones de ADNc amplificados por PCR a un sustrato en una matriz densa. Preferiblemente se aplican al sustrato al menos 10.000 secuencias de nucleótidos. Los genes de la micromatriz, inmovilizados en el microchip en al menos 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc marcadas con fluorescencia a través de la incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción inversa del ARN extraídos de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip hibridan con especificidad en cada punto del ADN en la matriz. Después del lavado riguroso para eliminar las sondas no unidas específicamente, se explora el chip mediante microscopia láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara fotográfica CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento de la matriz permite valorar la abundancia del ARNm correspondiente. Con fluorescencia de color dual, se hibridan sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN por pareja a la matriz. De este modo se determina de forma simultánea la abundancia relativa de los transcrito procedentes las dos fuentes que corresponden a cada gen específico. La escala miniaturizada de la hibridación proporciona una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para una gran cantidad de genes. Estos métodos han demostrado tener la sensibilidad requerida para detectar transcripciones poco frecuentes, que se expresan en algunas copias por célula, y para detectar de forma reproducible al menos aproximadamente dos veces más diferencias en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). El análisis en micromatriz puede realizarse por equipos comercialmente disponibles, siguiendo los protocolos del fabricante, tales como el uso de la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología micromatriz de
Agilent.

Un aspecto importante de la presente invención es usar la amplificación génica basada en intrones como parte del perfilado de la expresión génica para ajustar a los pacientes los mejores fármacos o combinaciones farmacológicas y para proporcionar información de pronóstico. Por ejemplo, la expresión medida de genes en tejido canceroso (por ejemplo, tejido de biopsia de cáncer de mama) puede usarse para predecir la probabilidad de la supervivencia a largo plazo, sin la enfermedad de pacientes después de la cirugía y/u otra terapia para el cáncer, o predecir la respuesta del paciente a un enfoque terapéutico particular. Para este fin es típicamente necesario corregir (normalizando) tanto las diferencias en la cantidad de ARN ensayado como la variabilidad en la calidad del ARN usado. Por lo tanto, los ensayos de la invención miden e incorporan generalmente la expresión de ciertos genes normalizadores, incluyendo genes de referencia bien conocidos, tales como GAPDH y Cyp1. Como alternativa, la normalización puede basarse en la señal media o mediana (Ct) de todos los genes ensayados o de un subconjunto grande de los mismos (enfoque de normalización global). Sobre la base del gen-por-gen, la cantidad normalizada medida de un ARNm de un tumor de un paciente se compara con la cantidad encontrada en un cáncer, por ejemplo, el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama. El número (N) de tejidos con cáncer, por ejemplo cáncer de mama, en este conjunto de referencia debe ser suficientemente alto para asegurar que diferentes conjuntos de referencia (en su conjunto) se comportan esencialmente de la misma manera. Si se cumple esta condición, la identidad de los tejidos con cáncer de mama individuales presentes en un conjunto particular no tendrá un impacto significativo en las cantidades relativas de los genes ensayados. Generalmente, el conjunto de referencia de tejidos con cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30, preferiblemente al menos aproximadamente 40 muestras diferentes de tejido con cáncer de mama fijado, embebido en parafina (FPE). A menos que se indique otra cosa, los niveles de expresión normalizados para cada ARNm/tumor/ensayado/paciente se expresarán como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. Más específicamente, el conjunto de referencia de un número suficientemente alto (por ejemplo, 40) de tumores ofrece una distribución de niveles normalizados de cada especie de ARNm. El nivel medido en una muestra de tumor particular a analizar caerá en algún percentil dentro de este intervalo, que puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica.

En un estudio de la fase II de la expresión génica en muestras de tejido fijado embebido en parafina de carcinoma de mama invasivo, se descubrió que la sobreexpresión de cualquiera de los siguientes genes en el tejido de cáncer de mama indicaba una probabilidad reducida de supervivencia sin recurrencia del cáncer después de la cirugía: FOXM1; PRAME; SKT15, Ki-67; CA9; NME1; SURV; TFRC; YB-1; RPS6KB1; Src; Chk1; CCNB1; Chk2; CDC25B; CYP3A4; EpCAM; VEGFC; hENT1; BRCA2; EGFR; TK1; VDR.

En el mismo estudio, la sobreexpresión de cualquiera de los siguientes genes en cáncer de mama indica un mejor pronóstico para la supervivencia sin recurrencia del cáncer después de la cirugía: Blc12; CEGP1; GSTM1; PR; BBC3; GATA3; DPYD; GSTM3; ID1; EstR1; p27; XIAP; IGF1R; AK055699; P13KC2A; TGFB3; BAGI1; pS2; WISP1; HNF3A; NFKBp65.

En este mismo estudio de la fase II de la expresión génica en muestras de tejido fijado embebido en parafina de cáncer de mama ER positivo, la sobreexpresión de los siguientes genes fue indicativa de una probabilidad reducida de supervivencia sin recurrencia de cáncer después de la cirugía: PRAME; FOXM1; EPHX1; HIF1A; VEGFC; Ki-67; VDR; NME1. Algunos de estos genes (PRAME; FOXM1; VEGFC; Ki-67; VDR y NME1) también se identificaron como indicadores de un mal pronóstico en el análisis previo, sin limitarse al cáncer de mama ER-positivo. Se descubrió que la sobreexpresión de los genes restantes (EPHX1 y HIF1A) era un indicador negativo de la supervivencia libre de la enfermedad sólo en cáncer de mama ER-positivo. Se descubrió que la sobreexpresión de los siguientes genes en cáncer ER-positivo era indicativa de un pronóstico mejor para la supervivencia sin recurrencia del cáncer después de la cirugía: Bcl-2; DIABLO; IGF1R; GSTM3. De los últimos genes, Bcl-2; IGFR1 y GSTM3 también se han identificado como indicadores de un buen pronóstico en el análisis previo, sin limitarse al cáncer de mama ER-positivo. La sobreexpresión de DIABLO parecía ser un indicador positivo de la supervivencia libre de enfermedad sólo en cáncer de mama ER-positivo. Para detalles adicionales, véase el documento WO0378662.

Los estudios anteriormente descritos se realizaron esencialmente según lo descrito en el ejemplo 2 más abajo, excepto porque la amplificación génica se estudió usando amplicones basados en exones. Para detalles adicionales, véase el documento WO0378662. Según lo atestiguado por los datos que se muestran en el ejemplo 2, los datos obtenidos usando amplicones basados en intrones muestran una excelente correlación con los datos anteriores, y proporcionan típicamente la ventaja añadida del aumento de sensibilidad.

Los resultados del estudio de fase II anterior de carcinoma ductal de mama invasivo se sometieron a análisis multivariante en forma de etapas, usando el Modelo de Riesgo Proporcional de Cox usando la siguiente ecuación:

RR = exp[coef(genA)\ x\ Ct(genA)\ +\ coef(genB)\ x\ Ct(genB)\ +\ coef(genC)\ x\ Ct\ (genC) + ...............].

\newpage

En esta ecuación, los coeficientes para los genes que son indicadores de resultado beneficioso son números positivos y los coeficientes para los genes que son indicadores de un resultado desfavorable son números negativos. Los valores de "Ct" en la ecuación son los \DeltaCt, es decir reflejan la diferencia entre el valor de Ct normalizado promedio para una población y el Ct normalizado medido para el paciente en cuestión. El convenio usado en el análisis ha sido que los \DeltaCt por debajo y por encima del promedio de la población tienen signos positivos y signos negativos, respectivamente (reflejando la mayor o menor abundancia de ARNm). El riesgo relativo (RR) calculado resolviendo esta ecuación indicaba si el paciente tiene una posibilidad aumentada o reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia de cáncer.

En un análisis multivariante, usando un conjunto de interrogantes incluyendo un número reducido de genes, se han identificado los siguientes conjuntos de diez genes que tienen un valor de predicciónparticularmente grande de la supervivencia del paciente sin recurrencia del cáncer después de la extirpación quirúrgica del tumor primario.

1.

Bcl2, cyclinG1, NFKBp65, NME1, EPHX1, TOP2B, DR5, TERC, Src, DIABLO;

2.

Ki67, XIAP, hENT1, TS, CD9, p27, cyclinG1, pS2, NFKBp65, CYP3A4;

3.

GSTM1, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, NFKBp65, ErbB3;

4.

PR, NME1, XIAP, upa, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, ALDH1A3, CTSL;

5.

CA9, NME1, TERC, cyclinG1, EPHX1, DPYD, Src, TOP2B, NFKBp65, VEGFC;

6.

TFRC, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, ErbB3, NFKBp65.

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En un análisis multivariante, usando un conjunto de interrogantes incluyendo todos los genes identificados, se han identificado los siguientes conjuntos de diez genes que tienen un valor de predicción particularmente grande de la supervivencia del paciente sin recurrencia del cáncer después de la extirpación quirúrgica del tumor primario.

1.

Bcl2, PRAME, cyclinG1, FOXM1, NFKBp65, TS, XIAP, Ki67, CYP3A4, p27;

2.

FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, PRAME, TS, Ki67, PDGFRa, p27, NFKBp65;

3.

PRAME, FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, TS, Ki6, PDGFRa, p27, NFKBp65;

4.

Ki67, XIAP, PRAME, hENT1, contig51037, TS, CD9, p27, ErbB3, cyclinG1;

5.

STK15, XIAP, PRAME, PLAUR, p27, CTSL, CD18, PREP, p53, RPS6KB1;

6.

GSTM1, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, GSTp, EREG, ID1, PLAUR;

7.

PR, PRAME, NME1, XIAP, PLAUR, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, DR5;

8.

CA9, FOXM1, cyclinG1, XIAP, TS, Ki67, NFKBp65, CYP3A4, GSTM3, p27;

9.

TFRC, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, DPYD, TERC, NME1, VEGFC;

10.

CEGP1, PRAME, hENT1, XIAP, Contig51037, ErbB3, DPYD, NFKBp65, ID1, TS.

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Usando el mismo enfoque de análisis multivariante para el cáncer de mama ER-positivo, se han identificado los siguientes conjuntos de diez genes que tienen un valor de predicción particularmente grande de la supervivencia del paciente sin recurrencia del cáncer después de la extirpación quirúrgica del tumor primario.

1.

PRAME, p27, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

2.

Contig51037, EPHX1, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

3.

Bcl2, hENT1, FOXM1, Contig51037, cyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

4.

HIF1A, PRAME, p27, IGFBP2, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

5.

IGF1R, PRAME, EPHX1, Contig51037, cyclinG1, Bcl2, NME1, PTEN, TBP, TIMP2;

6.

FOXM1, Contig51037, VEGFC, TBP, HIF1A, DPYD, RAD51C, DCR3, cyclinG1, BAG1;

7.

EPHX1, Contig51037, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

8.

Ki67, VEGFC, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

9.

CDC25B, Contig51037, hENT1, Bcl2, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP;

10.

VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

11.

CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

12.

DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

13.

p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

14.

CDH1, PRAME, VEGFC, HIF1A, DPYD, TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

15.

IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF;

16.

GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

17.

hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

18.

STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

19.

NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, hENT1, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

20.

VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1;

21.

EIF4E, Contig51037, EPHX1, cyclinG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

22.

CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa;

23.

ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

24.

FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

25.

GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, FBXO5, CA9, CYP, KRT18;

26.

Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF.

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En vista de la excelente correlación entre los resultados del perfilado de la expresión génica basada en exones y basada en intrones (véase el ejemplo 2), se espera que los mismos conjuntos génicos tengan valor de pronóstico similar cuando el perfilado de la expresión génica se basa en la cuantificación de las señales de RT-PCR de conjuntos de cebador/sonda basados en intrones.

Serán evidentes detalles adicionales de la invención en los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplo 1

Diseño y uso de conjuntos de cebador/sonda de PCR específicos de intrones

Se extrajo ARN de muestras de biopsia de cáncer de mama fijadas en formalina, embebidas en parafina (FPET) (Clionomics Biosciences Inc., Pittsfield, MA) como sigue. Se cortaron tres secciones de 10 \mum y se colocaron en un tubo de 1,5 ml. Se retiró la parafina por extracción con xileno (1 ml, 3 veces) seguido de lavado con etanol (1 ml, dos veces). Se aisló el ARN de los bloques de tejido seccionados usando el kit de purificación MasterPure^{TM} (Epicentre, Madison, WI). Se cuantificó el ARN por el método de fluorescencia de RiboGreen (Molecular Probes). Después se agruparon veinte muestras de ARN FPET y se usaron como se describe a continuación.

Se sintetizó ADNc de primera cadena usando la Transcriptasa Inversa Omniscript de Qiagen con los cebadores específicos de los genes agrupados (cebadores inversos mostrados en la figura 2), hexámeros aleatorios e inhibidor de la RNasa, usando el ARN FPET agrupado (400 ng). Se realizó también una reacción sin transcriptasa inversa (RT) con 150 ng de ARN FPET agrupado, suficiente ARN para realizar la amplificación Taqman en 5 ng/pocillo.

TABLA 2

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3

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Ensayo de TaqMan

Se realizaron ensayos de TaqMan para la lista de 48 genes en pocillos triplicados con un volumen de reacción de 25 \mul y una entrada de ARN de 5 ng por ensayo. Se realizó una reacción "no RT" para cada gen en un solo pocillo como control para verificar que se estaban midiendo las señales de ARN en lugar de ADN. La cuantificación en tiempo real se realizó en el ABI 7700 usando los siguientes parámetros:

Condiciones del ciclo: 95ºC, 10 minutos para un ciclo, 95ºC, 20 seg. seguido de 60ºC, 45 seg, 40 ciclos.

Volumen de reacción: 25 \mul.

Ajuste de la capa de tinción: FAM, (la referencia pasiva es ROX).

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Resultados

Los conjuntos de cebador-sonda de Taqman específicos de intrón se diseñaron en base a intrones enmascarados de los genes CEGP1, FOXM1, PRAME y STK15. Para delinear secuencias intrónicas dentro de los genes, la secuencia de referencia NCBI para cada ARNm (NM_XXXXXX) se alineó con el genoma humano usando el programa de herramienta de alineación de tipo BLAST (BLAT) disponible en el sitio de recursos de genoma on-line de la Universidad de Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu). Después se buscaron las secuencias intrónicas para secuencias repetitivas usando el programa Repeat Masker disponible on-line a través del Colegio Universitario de Medicina Baylor (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html). Las secuencias repetidas, tales como repeticiones Alu, se identifican por este programa y enmascaran. Es importante excluir estas secuencias antes de diseñar los cebador-sondas porque producen señales fuertes, no específicas. Las secuencias intrónicas enmascaradas (figuras 1A-M) después se usaron para diseñar conjuntos de cebador-sonda usando Primer Express (ABI). Otros programas adecuados para los conjuntos de cebador-sonda incluyen, por ejemplo, el programa de diseño de cebador-sonda más novedoso para ensayos MGB por diseño (ABI). Los amplicones para cada conjunto de cebador-sonda están delineados en negrita en la figura 1. Cada conjunto específico de cebador-sonda se muestra en la figura
2.

Los conjuntos de cebador-sonda específicos de intrón (genes de ensayo) se utilizaron junto con su correspondiente conjunto de cebador-sonda específico de exón (genes de referencia) en experimentos estándar del perfil de expresión génica de Taqman usando grupos de ARN FPET. La expresión normalizada se calculó mediante la fórmula 2^{\Delta Ct} donde \DeltaCt es la diferencia entre los Ct del conjunto de cebador-sonda del gen de ensayo y los conjuntos de cebador-sonda de los genes de referencia [Ct (referencia)- Ct (prueba)].

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Ejemplo 2

Un estudio de Fase II de la expresión génica en tumores de mama premalignos y malignos

Se diseñó y se realizó un estudio de expresión génica con el objeto principal de caracterizar molecularmente la expresión génica en muestras de tejido fijado, embebido en parafina de carcinoma ductal de mama invasivo y para explorar la correlación entre dichos perfiles moleculares y la supervivencia libre de enfermedad.

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Diseño del estudio

Se realizaron ensayos moleculares en tejidos tumorales primarios de mama, embebidos en parafina, fijados con formalina obtenidos de 60 pacientes individuales a los que se les había diagnosticado cáncer de mama. Todos los pacientes se sometieron a cirugía con diagnostico de carcinoma invasivo de mama. Los pacientes se incluyeron en el estudio solamente si la valoración histopatológica, realizada según lo descrito en el apartado Materiales y Métodos, indicaba cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

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Materiales y Métodos

Cada bloque de tumor representativo se caracterizó por histopatológica estándar para el diagnóstico, valoración semi-cuantitativa de la cantidad de tumor, y grado del tumor. Se prepararon un total de 6 secciones (de 10 micrómetros de grosor cada una) y se colocaron en dos tubos de microcentrífuga Costar Brand (tubos de polipropileno de 1,7 mL, transparentes; 3 secciones en cada tubo). Si el tumor constituía menos del 30% del total del área de la muestra, haberse diseccionado de forma tosca por el patólogo, usando microdisección sin precisión, poniendo el tejido tumoral directamente dentro del tubo Costar.

Cuando se obtuvo más de un bloque del tumor como parte del procedimiento quirúrgico, todos los bloques del tumor se sometieron a la misma caracterización, según lo descrito anteriormente, y se usó para el análisis el bloque más representativo de la patología.

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Análisis de la expresión génica

Se extrajo y purificó ARNm de muestras fijadas, embebidas en parafina y se preparó para el análisis de la expresión génica como se ha descrito anteriormente.

Los ensayos moleculares de la expresión génica cuantitativa se realizaron por la RT-PCR, usando el Sequence Detection System^{TM} ABI PRISM 7900^{TM} (Perkin-Elmer Biosistemas Applied, Foster City, CA, USA). ABI PRISM 7900^{TM} consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real a través de cables ópticos de fibra para los 384 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye el programa informático para el funcionamiento del instrumento y para analizar los datos.

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Análisis y resultados

Se analizó el tejido tumoral para la expresión de 48 secuencias de ARN diferentes que representaban los productos de 37 genes diferentes. Se normalizaron los valores del ciclo umbral (Ct) para cada paciente en base a la mediana de todos los genes para ese paciente particular. Los datos del resultado clínico estaban disponibles para todos los pacientes a partir de una revisión de datos registrados y de los gráficos de los pacientes selecciona-
dos.

\newpage

Los resultados se clasificaron como:

0

muerte debida al cáncer de mama o por causa desconocida o el paciente sigue vivo con recurrencia de cáncer de mama;

1

vivo sin recurrencia de cáncer de mama o muerto debido a una causa distinta al cáncer de mama.

El análisis se realizó mediante:

El análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo transcurrido hasta el resultado (0 ó 1 según se ha definido anteriormente) donde se censuraron los pacientes que estaban vivos sin recurrencia del cáncer de mama o que murieron debido a una causa distinta del cáncer de mama. Este enfoque se usó para evaluar el impacto del pronóstico de genes individuales y también conjuntos de genes múltiples.

Para cada gen se definió un Modelo de Riesgo Proporcional de Cox (véase, por ejemplo, Cox, D.R. y Oakes, D. (1984), Analysis of Survival Data, Chapman and Hall, London, new York) con el tiempo transcurrido hasta la recurrencia o hasta la muerte como variable dependiente, y el nivel de expresión del gen como variable independiente. Se identificaron los genes que tienen un valor-p < 0,05 en el modelo de Cox. Para cada gen, el modelo de Cox proporciona el riesgo relativo (RR) de recurrencia o muerte para un cambio unitario en la expresión del gen. Se puede elegir repartir a los pacientes en subgrupos a cualquier valor umbral de la expresión medida (en la escala Ct), donde todos los pacientes con valores de expresión por encima del umbral tienen mayor riesgo, y todos los pacientes con valores de expresión por debajo del umbral tienen menor riesgo, o viceversa, dependiendo de si el gen es un indicador de pronóstico malo (RR>1,01) o bueno (RR<1,01). De esta manera, cualquier valor umbral definirá subgrupos de pacientes con un riesgo aumentado o reducido respectivamente.

La tabla 3, a continuación, muestra la correlación por parejas de la expresión (presentada por coeficientes de correlación) entre los intrones y exones ensayados para los genes CEGP1, FOXM1, PRAME y STK15. Para dos de los cuatro genes, CEGP1 y PRAME, se encontró intrones que producían coeficientes de correlación [para la co-expresión con sus exones respectivos] por encima de 0,90. En el caso de STK15, un intrón se correlacionó con la expresión del exón con un coeficiente de correlación \sim0,80. Para FOXM1, las correlaciones de la expresión intrón:exón eran significativamente más bajas. En este último caso, sin embargo, parece probable que la expresión real pueda estar altamente correlacionada pero no sea detectable por una razón técnica. La expresión del exón FOXM1 en muchos pacientes estaba por debajo del umbral de detección del ensayo, que potencialmente previene la detección de las altas correlaciones que puedan existir. Si esta hipótesis es correcta, los intrones FOXM1 se registrarían aún como marcadores de pronóstico clínico negativo según lo demostrado previamente para FOXM1. Como se demuestra más adelante, este resultado ocurre.

Las figuras 3, 4 y 5 muestran la correlación por parejas de la expresión de los ARN ensayados contra los ARN de los exones CEGP1, PRAME y STK15. Como se muestra, los intrones respectivos de estos genes ofrecieron las correlaciones más altas. Es notable que la lista de 48 genes incluyera genes seleccionados, mediante varias estrategias basadas en bioinformática, genes con una probabilidad particular de correlacionarse en expresión CEGP1, PRAME, STK15 y FOXM1. Estas estrategias no basadas en intrones fueron las más satisfactorias en el caso de STK15, ya que varios genes candidatos tenían coeficientes de correlación de expresión en el intervalo de 0,6-0,7.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Correlaciones entre la expresión de intrones, exones para cuatro genes

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4

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La tabla 4, a continuación, muestra el impacto sobre la supervivencia de los pacientes de la expresión de los exones e intrones de CEGP1, FOXM1, PRAME, y STK15. Todos los exones parentales tenían un impacto significativo en el riesgo relativo [RR], como se ha determinado previamente, excepto en el caso de FOXM1. Como el presente estudio evaluó a 60 pacientes del grupo original de 146 pacientes, el marcador FOXM1 puede haber perdido significado debido al riesgo estadístico de examinar un conjunto de datos reducido. Muy notablemente, para los cuatro genes ensayados, la expresión de los intrones afectaba significativamente al RR, y en la misma dirección que los exones
parentales.

TABLA 4 Resultados del modelo de Cox para 60 pacientes con Cáncer de mama

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5

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Existe una percepción común de que los niveles constantes de las secuencias de exones transcritas exceden enormemente de las secuencias de intrones transcritas (Sharp et al. Ann Rev. Biochem. 55: 1119-50 [1986]). Sin embargo, el examen de la expresión de exones e intrones de CEGP1, FoxM1, PRAME y STK15, usando TaqMan [TM] RT-PCR para ensayar el ARN de tejido de cáncer de mama fijado y embebido en parafina, ha demostrado que las intensidades de la señal de los intrones y de los exones estaban en el mismo intervalo, y en todos los casos en el intervalo de detección útil del ensayo [datos no mostrados]. La detección del ARN intrónico en este estudio es aún más notable porque el tejido usado se fijó en formalina, que degrada el ARN, y por tanto limita sustancialmente la capacidad para detectar el ARN (T.E. Godfrey et al. J. Mol. Diag. 2: 84-91 [2000]). En el caso de CEGP1 tres de los intrones ensayados produjeron señales más bajas y uno una señal más alta que el exón. En el caso de FOXM1, cinco de nueve intrones ensayados produjeron señales más altas que el exón. En el caso de PRAME, las intensidades de la señal del intrón y el exón ensayados eran casi idénticas. Finalmente, para STK15 todos los intrones tenían intensidades de señal que eran de 1/4 a 1/20 las del exón, pero todavía estaban en el intervalo útil del ensayo. De esta manera, estos resultados indican que los niveles de estado estacionario de los intrones expresados son adecuados para el uso de los ARN, de los intrones como marcadores moleculares.

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a lo que se considera que son realizaciones específicas, se entiende que la descripción no está limitada a éstas. Por ejemplo, aunque la descripción incluye diversos genes y conjuntos de genes asociados al cáncer de mama, se contemplan genes y conjuntos de genes similares y métodos que conciernen a otros tipos de cáncer.

<110> GENOMIC HEALTH, INC.

{}\hskip1cm SCOTT, Randal W.

{}\hskip1cm BAKER, Joffre B.

{}\hskip1cm KIEFER, Michael C.

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<120> USO DE ARN INTRÓNICO PARA MEDIR LA EXPRESIÓN GÉNICA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 39740-0007 PCT

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<140> No asignado

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<141> 2004-02-19

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/448.991

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-02-20

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 67

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1566

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (802)...(1027)

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<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1126)...(1518)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-CEP1 int 1.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4985

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (83)...(253)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1975)...(2296)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2445)...(2468)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2499)...(2551)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4295)...(4352)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-CEGP1 int 3.1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2556

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (507)...(743)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1584)...(1678)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2428)...(2474)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-CEGP1 int 4.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 716

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-CEGP 1 int 5.1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2041

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (559)...(869)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (888)...(1052)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1102)...(1380)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1393)...(1692)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1841)...(1907)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOXM1 int 3.2

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1871)...(1936)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOXM1 int 3.1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 993

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52)...(124)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOXM1 int 4.1

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (110)...(185)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOXM1 int 4.2

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (249)...(397)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (442)...(749)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 602

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOXM1 int 5.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4656

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOXM1 int 7.1

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (316)...(615)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (626)...(930)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1044)...(1259)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1452)...(1802)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2085)...(3116)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3138)...(3433)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3442)...(3728)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3814)...(4081)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4289)...(4371)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 614

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-PRAME int 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 432

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-PRAME int 4.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3740

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-STK15 int 1.1

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)...(151)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (321)...(491)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (537)...(615)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (853)...(894)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1259)...(1309)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1337)...(2516)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2521)...(3567)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

18

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1622

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-STK15 int 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (705)...(989)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n= a, t, c, o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1093

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MGB-STK15 int 4.1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgcctgtt ccgatctg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccaaagtt ctctgctgaa aacc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgaagca gcaac

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgttgctgt gtgatgctgt ca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcagccac tcccttgatc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagggcata agcct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccccttgcc tttggagaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaggcctgg aggcatcaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcccaaat cct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttaatggtg tttagcacag atgca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccactgtagc atgcgaagca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaatgcaca ggaaac

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctgcggt gtggagtgt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaggcttc gtctggtgtc t

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagccctc ttggcaactc tcct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatgctgt ctgtgagcct cat

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacccctgcc cactagaaat g

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acccaagatg tcatctcctg tagcgtcaca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatagatggg tttatggctg aaggt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcttggcaa ctctcctgac act

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcagagcc gtc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatctcaaa aggaaacaag ttctg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtggctgg cttctaactc t

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgatcaa atgaaagcat cact

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagccagc cacccaatta

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgtcattt ggtatttgtc aagtgt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacttgcac aaaacccagt gaatta

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggacagaga caagatgtga tgtg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctggcacct agacaaaaca tg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatagggac ccttc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgtcctat tttcctctga agaga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaagctga aggtccaaca t

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctggccaa ttaag

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcattcatgt ggccgtagca t

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggagagg gagccaaaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgtttggg ttttca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggatcag aacccgtatg tga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaaacaga gataaggtga acca

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgcgtcct gtctg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtgacctt gggcttgtg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcaaccca tttccagaga gaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgggtccc tgtt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggtgacct agcagcttgg t

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctctggcc cagcctta

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccctgaccc cagctg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtaatgtct cttcctcttc cgtaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgaactgag taggttgctg aaaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaagggaca aggaag

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattcacatt tataaccca catgga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatccaaagt aaaggcggaa aga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtcttgtc gggaat

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaggaatg aacccacaga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatgagaac cagtggattt agact

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctaaaagc aaaaga

\hfill

Claims (90)

1. Un método para controlar la expresión génica en una muestra biológica, que comprende:

(a) proporcionar un polinucleótido complementario a una secuencia de ARN intrónica dentro de un gen diana, donde la expresión de dicha secuencia de ARN intrónica se correlaciona con la expresión de una secuencia de ARNm exónica dentro de dicho gen;

(b) hibridar dicho polinucleótido con dicha secuencia de ARN intrónica para formar un complejo de polinucleótido-ARN intrónico; y

(c) detectar el complejo de polinucleótido-ARN intrónico.

2. El método de la reivindicación 1 en el que dicha secuencia de ARN intrónica se selecciona identificando secuencias intrónicas que se co-expresan con el ARNm de dicho gen diana, y seleccionando una secuencia de ARN intrónica que tiene el coeficiente de correlación más alto para dicha co-expresión.

3. El método de la reivindicación 1 en el que dicha secuencia de ARN intrónica es de al menos 50 bases de nucleótidos de longitud.

4. El método de la reivindicación 1 en el que dicha secuencia de ARN intrónica es de al menos 55 bases de nucleótidos de longitud.

5. El método de la reivindicación 1 en el que dicha secuencia de ARN intrónica es de al menos 60 bases de nucleótidos de longitud.

6. El método de la reivindicación 1 en el que dicha muestra biológica es una muestra de tejido.

7. El método de la reivindicación 6 en el que dicho tejido es un tejido tumoral.

8. El método de la reivindicación 7 en el que dicho tumor es cáncer.

9. El método de la reivindicación 8 en el que dicho cáncer se selecciona del grupo consistente en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer cerebral.

10. El método de la reivindicación 6 en el que dicha muestra dicha de tejido es una muestra de tejido fijada, embebida en cera.

11. El método de la reivindicación 10 en el que dicha muestra de tejido es una muestra de tejido fijada en formalina, embebida en parafina.

12. El método de la reivindicación 10 en el que dicho ARN exónico está fragmentado.

13. El método de la reivindicación 1 en el que dicha muestra biológica es un fluido biológico.

14. El método de la reivindicación 1 en el que dicha hibridación se realiza en condiciones rigurosas.

15. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente la etapa de cuantificar la expresión de dicho ARN intrónico.

16. El método de la reivindicación 1 en el que dicho polinucleótido es un oligonucleótido monocatenario.

17. El método de la reivindicación 16 en el que dicho oligonucleótido monocatenario es una sonda de PCR.

18. El método de la reivindicación 17 en el que dicha sonda de PCR se diseña en base a una secuencia única dentro de dicha secuencia de ARN intrónico.

19. El método de la reivindicación 16 en el que dicho oligonucleótido monocatenario es un cebador de PCR.

20. El método de la reivindicación 19 en el que dicho cebador de PCR se diseña en base a una secuencia única dentro de dicha secuencia de ARN intrónico.

21. El método de la reivindicación 1 en el que se controla la expresión de más de un gen diana.

22. El método de la reivindicación 21 que comprende controlar simultáneamente al menos 50 genes diana.

23. El método de la reivindicación 21 que comprende controlar simultáneamente al menos 100 genes diana.

24. El método de la reivindicación 21 que comprende controlar simultáneamente al menos 500 genes diana.

25. El método de la reivindicación 21 que comprende controlar simultáneamente al menos 10.000 genes diana.

26. El método de la reivindicación 25 en el que las secuencias de ARN intrónico correspondientes a una pluralidad de dichos genes diana se disponen como una matriz inmovilizada sobre una superficie sólida.

27. El método de la reivindicación 1 en el que dicho gen diana se selecciona de los genes enumerados en la Figura 6.

28. Un método para preparar una molécula de oligonucleótido monocatenaria para la amplificación de un gen diana que comprende:

(a) identificar al menos una secuencia de intrón dentro de dicho gen diana, cuya expresión correlaciona con la expresión de una secuencia de ARNm exónico dentro de dicho gen diana; y

(b) preparar una molécula de oligonucleótido monocatenaria que corresponde al menos a una parte de la secuencia de intrón transcrita.

29. El método de la reivindicación 28 que comprende identificar secuencias de repetición dentro de dicha secuencia de intrón antes de preparar dicha molécula de oligonucleótido monocatenaria.

30. El método de la reivindicación 29 en el que dichas secuencias de repetición se enmascaran antes de preparar dicha molécula de oligonucleótido.

31. El método de la reivindicación 28 en el que dicha molécula de oligonucleótido monocatenaria es un cebador de PCR.

32. El método de la reivindicación 31 en el que dicho cebador de PCR es un cebador directo diseñado para comprender secuencias 5' de una secuencia diana dentro de dicha secuencia de intrón transcrita.

33. El método de la reivindicación 31 en el que dicho cebador de PCR es un cebador inverso diseñado para complementar secuencias 5' de una secuencia diana aguas abajo del cebador directo dentro de dicha secuencia de intrón transcrita.

34. El método de la reivindicación 32 ó 33 en el que dicha secuencia diana es de al menos 50 bases de nucleótidos de longitud.

35. El método de la reivindicación 32 ó 33 en el que dicha secuencia diana es de al menos 55 bases de nucleótidos de longitud.

36. El método de la reivindicación 32 ó 33 en el que dicha secuencia diana es de al menos 60 bases de nucleótidos de longitud.

37. El método de la reivindicación 31 en el que dicho cebador de PCR es de 17-30 bases de nucleótidos de
longitud.

38. El método de la reivindicación 31 en el que dicho cebador de PCR contiene aproximadamente del 20% al 80% de bases G+C.

39. El método de la reivindicación 31 en el que la temperatura de fusión (Tm) de dicho cebador de PCR está entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 70ºC.

40. El método de la reivindicación 28 en el que dicha molécula de oligonucleótido monocatenaria es una sonda de PCR.

41. El método de la reivindicación 40 en el que dicha sonda de PCR está diseñada para comprender o complementar una parte interna de una secuencia diana dentro de la secuencia de intrón transcrita.

42. El método de la reivindicación 41 en el que dicha sonda de PCR se marca con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente de inactivación.

43. El método de la reivindicación 28 en el que dicho gen diana se selecciona de los genes enumerados en la Figura 6.

\newpage

44. Un método para amplificar ARN intrónico en una muestra de tejido fijada embebida en parafina que representa al menos un gen de interés, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto el ADN obtenido por transcripción inversa del ARN intrónico, cuya expresión correlaciona con la expresión de un ARN exónico correspondiente, con al menos un conjunto de cebadores y sonda de PCR que corresponden a dicho ARN intrónico; y

(b) realizar la amplificación por PCR.

45. El método de la reivindicación 44 en el que dichos cebadores y sonda de PCR se diseñan en base a una secuencia única dentro de dicho ARN intrónico.

46. El método de la reivindicación 44 en el que dicha muestra comprende ARN fragmentado que representa múltiples genes de interés.

47. El método de la reivindicación 46 en el que dicha muestra se pone en contacto con un grupo de cebadores y sondas de PCR diseñados en base a secuencias únicas dentro de los intrones, cuya expresión se correlaciona con la expresión de los exones correspondientes, presentes en dichos genes de interés.

48. El método de la reivindicación 47 en el que dicho grupo comprende al menos uno de los conjuntos de cebador/sonda basados en intrón mostrados en la Figura 2.

49. El método de la reivindicación 47 en el que dicho grupo comprende al menos un conjunto de cebador directo o inverso o sonda mostrado en la Figura 2.

50. El método de la reivindicación 46 en el que dicha muestra de tejido es de una biopsia tumoral.

51. El método de reivindicación 50 en el que dicha biopsia tumoral se obtiene de un paciente humano.

52. El método de la reivindicación 51 en el que dicho tumor es cáncer de mama.

53. El método de la reivindicación 51 en el que dicho tumor es cáncer pulmón.

54. El método de la reivindicación 51 en el que dicho tumor es cáncer colorectal.

55. El método de la reivindicación 51 que comprende adicionalmente la etapa de determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de dichos genes de interés o sus productos de expresión.

56. El método de la reivindicación 55 en el que la expresión diferencial de dichas transcripciones de ARN o sus productos se correlaciona con una respuesta del paciente pronosticada al tratamiento o con la supervivencia del paciente.

57. El método de la reivindicación 44 en el que dicho gen de interés se selecciona de los genes enumerados en la Figura 6.

58. El método de la reivindicación 52 en el que el tumor es cáncer de mama invasivo, y el método comprende:

(1) determinar los niveles de expresión de los transcritos del ARN o los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionado de grupo consistente en:

(a)

Bcl2, cyclinG1, NFKBp65, NME1, EPHX1, TOP2B, DR5, TERC, Src, DIABLO;

(b)

Ki67, XIAP, hENT1, TS, CD9, p27, cyclinG1, pS2, NFKBp65, CYP3A4;

(c)

GSTM1, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, NFKBp65, ErbB3;

(d)

PR, NME1, XIAP, upa, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, ALDH1A3, CTSL;

(e)

CA9, NME1, TERC, cyclinG1, EPHX1, DPYD, Src, TOP2B, NFKBp65, VEGFC;

(f)

TFRC, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, ErbB3, NFKBp65;

(g)

Bcl2, PRAME, cyclinG1, FOXM1, NFKBp65, TS, XIAP, Ki67, CYP3A4, p27;

(h)

FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, PRAME, TS, Ki67, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(i)

PRAME, FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, TS, Ki6, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(j)

Ki67, XIAP, PRAME, hENT1, contig51037, TS, CD9, p27, ErbB3, cyclinG1;

(k)

STK15, XIAP, PRAME, PLAUR, p27, CTSL, CD18, PREP, p53, RPS6KB1;

(l)

GSTM1, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, GSTp, EREG, ID1, PLAUR;

(m)

PR, PRAME, NME1, XIAP, PLAUR, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, DR5;

(n)

CA9, FOXM1, cyclinG1, XIAP, TS, Ki67, NFKBp65, CYP3A4, GSTM3, p27;

(o)

TFRC, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, DPYD, TERC, NME1, VEGFC; y

(p)

CEGP1, PRAME, hENT1, XIAP, Contig51037, ErbB3, DPYD, NFKBp65, ID1, TS

en dicha muestra;

(2) someter los datos obtenidos en la etapa (a) a análisis estadístico; y

(3) determinar si la probabilidad de supervivencia a largo plazo de dicho paciente, sin cáncer de mama recurrente ha aumentado o disminuido.

59. El método de reivindicación 58 en el que los niveles de expresión de dichas transcripciones de ARN o de sus productos de expresión se normalizan contra los niveles de expresión de todas las transcripciones del ARN o de sus productos de expresión en dicha muestra de tejido de cáncer de mama, o de un conjunto de referencia de transcripciones del ARN o de sus productos.

60. El método de la reivindicación 52 en el que el tumor es cáncer de mama invasivo receptor estrógeno (ER)-positivo, y el método comprende

(1) determinar los niveles de expresión de las transcripciones del ARN o de los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en:

(a)

PRAME, p27, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(b)

Contig51037, EPHX1, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(c)

Bcl2, hENT1, FOXM1, Contig51037, cyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(d)

HIF1A, PRAME, p27, IGFBP2, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(e)

IGF1R, PRAME, EPHX1, Contig51037, cyclinG1, Bcl2, NME1, PTEN, TBP, TIMP2;

(f)

FOXM1, Contig51037, VEGFC, TBP, HIF1A, DPYD, RAD51C, DCR3, cyclinG1, BAG1;

(g)

EPHX1, Contig51037, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(h)

Ki67, VEGFC, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(i)

CDC25B, Contig51037, hENT1, Bcl2, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP;

(j)

VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(k)

CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

(l)

DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

(m)

p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(n)

CDH1; PRAME, VEGFC; HIF1A; DPYD, TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

(o)

IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF;

(p)

GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

(q)

hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(r)

STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

(s)

NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, hENT1, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

(t)

VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1;

(u)

EIF4E, Contig51037, EPHX1, cyclinG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

(v)

CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa;

(w)

ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

(x)

FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

(y)

GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, EBXO5, CA9, CYP, KRT18; y

(z)

Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF;

(2) someter los datos obtenidos en la etapa (1) al análisis estadístico; y

(3) determinar si la probabilidad de la supervivencia a largo plazo de dicho paciente, sin cáncer de mama recurrente ha aumentado o disminuido.

61. El método de la reivindicación 60 en el que los niveles de expresión de dichas transcripciones del ARN o de sus productos de expresión se normalizan contra los niveles de expresión de todas las transcripciones del ARN o de sus productos de expresión en dicha muestra del tejido de cáncer de mama, o de un conjunto de referencia de transcripciones del ARN o de sus productos.

62. El método de la reivindicación 52 en el que el tumor es cáncer de mama, y el método comprende

(1) determinar los niveles de expresión de las transcripciones del ARN o de los productos de expresión de un gen o conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en: FOXM1; PRAME; SKT15, Ki-67; CA9; NME1; SURV; TFRC; YB-1; RPS6KB1; Src; Chk1; CCNB1; Chk2; CDC25B; CYP3A4; EpCAM; VEGFC; hENT1; BRCA2; EGFR; TK1; VDR; Blc12; CEGP1; GSTM1; PR; BBC3; GATA3; DPYD; GSTM3; ID1; EstR1; p27; XIAP; IGF1R; AK055699; P13KC2A; TGFB3; BAGI1; pS2; WISP1; HNF3A; y NFKBp65, normalizados contra los niveles de expresión de todas las transcripciones del ARN o de sus productos en dicha muestra, o de un conjunto de referencia de transcripciones del ARN o de sus productos de expresión;

(2) someter los datos obtenidos en la etapa (a) al análisis estadístico; y

(3) determinar si la probabilidad de supervivencia a largo plazo de dicho paciente, sin cáncer de mama recurrente ha aumentado o disminuido.

63. El método de la reivindicación 62 en el que los niveles de expresión de dichas transcripciones del ARN o de sus productos de expresión se normalizan contra los niveles de expresión de todas las transcripciones del ARN o de sus productos de expresión en dicha muestra de tejido de cáncer de mama, o de un conjunto de referencia de transcripciones del ARN o de sus productos.

64. El método de la reivindicación 52 en el que el tumor es cáncer de mama invasivo, y el método comprende determinar los niveles de expresión de las transcripciones del ARN o de los productos de expresión de un gen o conjunto de genes del grupo consistente en:

(a)

p53BP2, Bcl2, BAD, EPHX1, PDGFR\beta, DIABLO, XIAP, YB1, CA9, y KRT8;

(b)

GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6, y WISP1;

(c)

PR, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, IGFBP2, TIMP1, CA9, MMP9, y COX2;

(d)

CD68, GRB7, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6, y WISP1;

(e)

Bcl2, p53BP2, BAD, EPHX1, PDGFR\beta, DIABLO, XIAP, YB1, CA9, y KRT8;

(f)

KRT14, KRT5, PRAME, p53BP2, GUS1, AIB1, MCM3, CCNE1, MCM6, e ID1;

(g)

PRAME, p53BP2, EstR1, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3, y VEGFB;

(h)

CTSL2, GRB7, TOP2A, CCNB1, Bcl2, DIABLO, PRAME, EMS1, CA9, y EpCAM;

(i)

EstR1, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3, y VEGFB;

(j)

Chkl, PRAME, p53BP2, GRB7, CA9, CTSL, CCNB1, TOP2A, tamaño del tumor, e IGFBP2;

(k)

IGFBP2, GRB7, PRAME, DIABLO, CTSL, \beta-Catenina, PPM1D, Chkl, WISP1, y LOT1;

(l)

HER2, p53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, EPHX1, TOP2A, TRAIL, CA9, y AREG;

(m)

BAG1, p53BP2, PRAME, IL6, CCNB1, PAI1, AREG, tamaño del tumor, CA9, y Ki67;

(n)

CEGP1, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, y AKT2, y FGF18;

(o)

STK15, p53BP2, PRAME, IL6, CCNE1, AKT2, DIABLO, cMet, CCNE2, y COX2;

(p)

KLK10, EstR1, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, y BBC3;

(q)

AIB1, p53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, CD3, p53, CA9, GRB7, y EPHX1

(r)

BBC3, GRB7, CD68, PRAME, TOP2A, CCNB1, EPHX1, CTSL, GSTM1, y APC;

(s)

CD9, GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, CCNB1, CD3, DIABLO, ID1, y PPM1D;

(t)

EGFR, KRT14, GRB7, TOP2A, CCNB1, CTSL, Bcl2, TP, KLK10, y CA9;

(u)

HIFl\alpha, PR, DIABLO, PRAME, Chkl, AKT2, GRB7, CCNE1, TOP2A, y CCNB1;

(v)

MDM2, p53BP2, DIABLO, Bcl2, AIB1, TIMP1, CD3, p53, CA9, y HER2;

(w)

MYBL2, p53BP2, PRAME, IL6, Bcl2, DIABLO, CCNE1, EPHX1, TIMP1, y CA9;

(x)

p27, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, AKT2, e ID1;

(y)

RAD51, GRB7, CD68, TOP2A, CIAP2, CCNB1, BAG1, IL6, FGFR1, y p53BP2;

(z)

SURV, GRB7, TOP2A, PRAME, CTSL, GSTM1, CCNB1, VDR, CA9; y CCNE2;

(aa)

TOP2B, p53BP2, DIABLO, Bcl2, TIMP1, AIB1, CA9, p53, KRT8, y BAD;

(ab)

ZNF217, GRB7, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, APC4, y \beta-catenina,

en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida del dicho paciente,

(2) someter los datos obtenidos en la etapa (a) a análisis estadístico; y

(3) determinar si la probabilidad de dicha supervivencia a largo plazo ha aumentado o disminuido.

65. El método de la reivindicación 64 en el que los niveles de expresión de dichas transcripciones del ARN o de sus productos de expresión se normalizan contra los niveles de expresión de todas las transcripciones del ARN o sus productos de expresión en dicha muestra de tejido de cáncer de mama, o de un conjunto de referencia de las transcripciones del ARN o de sus productos.

66. Un método de pronóstico de enfermedad a largo plazo - supervivencia libre de un paciente de cáncer usando ARN intrónico para medir la expresión génica usando una serie que comprende una pluralidad de polinucleótidos, que hibridan con genes diana de interés, inmovilizados en una superficie sólida, en la que al menos uno de dichos polinucleótidos comprende una secuencia basada en intrón cuya expresión correlaciona con la expresión de una secuencia de exón correspondiente.

67. El método de la reivindicación 66 en el que todos dichos polinucleótidos comprenden secuencias intrónicas.

68. El método de la reivindicación 66 que comprende al menos uno de los amplicones mostrados en las Figuras 1 A-M, o el complemento del mismo.

69. El método de reivindicación 66 que comprende dos o más de los amplicones mostrados en las Figuras 1 A-M, o el complemento del mismo.

70. El método de la reivindicación 66 que comprende todos los amplicones mostrados en las Figuras 1 A-M, o el complemento del mismo.

\newpage

71. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan al menos un gen de interés del grupo consistente en: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, CA9, Contig51037, RPS6K1 y Her2, en el que al menos el 80% de las secuencias de dicha serie está basada en intrón.

72. El método de la reivindicación 71 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos 5 de dichos genes.

73. El método de la reivindicación 71 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos 10 de dichos genes.

74. El método de la reivindicación 71 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con todos dichos genes.

75. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos un gen de interés seleccionado del grupo consistente en: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, CA9, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, GSTM3, RPS6KB1, Src, Chkl, ID1, EstR1, p27, CCNB1, XIAP, Chk2, CDC25B, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, pS2, hENT1, WISP1, HNF3A, NFKBp65, BRCA2, EGFR, TK1, VDR, Contig51037, pENTl, EPHX1, IF1A, CDH1, HIFl\alpha, IGFBP3, CTSB, Her2 y DIABLO.

76. El método de la reivindicación 75 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos 5 de dichos genes.

77. El método de la reivindicación 75 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos 10 de dichos genes.

78. El método de la reivindicación 75 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con todos dichos genes.

79. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos un conjunto de genes seleccionado del grupo consistente en:

(a)

Bcl2, cyclinG1, NFKBp65, NME1, EPHX1, TOP2B, DR5, TERC, Src, DIABLO;

(b)

Ki67, XIAP, hENT1, TS, CD9, p27, cyclinG1, pS2, NFKBp65, CYP3A4;

(c)

GSTM1, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, NFKBp65, ErbB3;

(d)

PR, NME1, XIAP, upa, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, ALDH1A3, CTSL;

(e)

CA9, NME1, TERC, cyclinG1, EPHX1, DPYD, Src, TOP2B, NFKBp65, VEGFC;

(f)

TFRC, XIAP, Ki67, TS, cyclinG1, p27, CYP3A4, pS2, ErbB3, NFKBp65;

(g)

Bcl2, PRAME, cyclinG1, FOXM1, NFKBp65, TS, XIAP, Ki67, CYP3A4, p27;

(h)

FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, PRAME, TS, Ki67, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(i)

PRAME, FOXM1, cyclinG1, XIAP, Contig51037, TS, Ki6, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(j)

Ki67, XIAP, PRAME, hENT1, contig51037, TS, CD9, p27, ErbB3, cyclinG1;

(k)

STK15, XIAP, PRAME, PLAUR, p27, CTSL, CD18, PREP, p53, RPS6KB1;

(l)

GSTM1, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, GSTp, EREG, ID1, PLAUR;

(m)

PR, PRAME, NME1, XIAP, PLAUR, cyclinG1, Contig51037, TERC, EPHX1, DR5;

(n)

CA9, FOXM1, cyclinG1, XIAP, TS, Ki67, NFKBp65, CYP3A4, GSTM3, p27;

(o)

TFRC, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, DPYD, TERC, NME1, VEGFC; y

(p)

CEGP1, PRAME, hENT1, XIAP, Contig51037, ErbB3, DPYD, NFKBp65, ID1, TS.

\newpage

80. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos un conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en:

(a)

PRAME, p27, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(b)

Contig51037, EPHX1, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(c)

Bcl2, hENT1, FOXM1, Contig51037, cyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(d)

HIF1A, PRAME, p27, IGFBP2, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(e)

IGF1R, PRAME, EPHX1, Contig51037, cyclinG1, Bcl2, NME1, PTEN, TBP, TIMP2;

(f)

FOXM1, Contig51037, VEGFC, TBP, HIF1A, DPYD, RAD51C, DCR3, cyclinG1, BAG1;

(g)

EPHX1, Contig51037, Ki67, TIMP2, cyclinG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(h)

Ki67, VEGFC, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(i)

CDC25B, Contig51037, hENT1, Bcl2, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP;

(j)

VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(k)

CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

(l)

DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

(m)

p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(n)

CDH1; PRAME, VEGFC; HIF1A; DPYD, TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

(o)

IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF;

(p)

GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

(q)

hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CyclinG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(r)

STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

(s)

NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, SENTI, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

(t)

VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1;

(u)

EIF4E, Contig51037, EPHX1, cyclinG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

(v)

CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa;

(w)

ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

(x)

FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

(y)

GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, EBXO5, CA9, CYP, KRT18; y

(z)

Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF.

81. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos un conjunto de genes seleccionados del grupo consistente en:

(a)

p53BP2, Bcl2, BAD, EPHX1, PDGFR\beta, DIABLO, XIAP, YB1, CA9, y KRT8;

(b)

GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6, y WISP1;

(c)

PR, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, IGFBP2, TIMP1, CA9, MMP9, y COX2;

(d)

CD68, GRB7, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6, y WISP1;

(e)

Bcl2, p53BP2, MALO, EPHX1, PDGFR\beta, DIABLO, XIAP, YB1, CA9, y KRT8;

(f)

KRT14, KRT5, PRAME, p53BP2, GUS1, AIB1, MCM3, CCNE1, MCM6, e ID1;

(g)

PRAME, p53BP2, EstR1, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3, y VEGFB;

(h)

CTSL2, GRB7, TOP2A, CCNB1, Bcl2, DIABLO, PRAME, EMS1, CA9, y EpCAM;

(i)

EstR1, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3, y VEGFB;

(j)

Chkl, PRAME, p53BP2, GRB7, CA9, CTSL, CCNB1, TOP2A, tamaño del tumor, e IGFBP2;

(k)

IGFBP2, GRB7, PRAME, DIABLO, CTSL, \beta-catenina, PPM1D, Chkl, WISP1, y LOT1;

(l)

HER2, p53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, EPHX1, TOP2A, TRAIL, CA9, y AREG;

(m)

BAG1, p53BP2, PRAME, IL6, CCNB1, PAI1, AREG, tamaño del tumor, CA9, y Ki67;

(n)

CEGP1, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, y AKT2, y FGF18;

(o)

STK15, p53BP2, PRAME, IL6, CCNE1, AKT2, DIABLO, cMet, CCNE2, y COX2;

(p)

KLK10, EstR1, p53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, y BBC3;

(q)

AIB1, p53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, CD3, p53, CA9, GRB7, y EPHX1;

(r)

BBC3, GRB7, CD68, PRAME, TOP2A, CCNB1, EPHX1, CTSL GSTM1, y APC;

(s)

CD9, GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, CCNB1, CD3, DIABLO, ID1, y PPM1D;

(t)

EGFR, KRT14, GRB7, TOP2A, CCNB1, CTSL, Bcl2, TP, KLK10, y CA9;

(u)

HIF1\alpha, PR, DIABLO, PRAME, Chkl, AKT2, GRB7, CCNE1, TOP2A, y CCNB1;

(v)

MDM2, p53BP2, DIABLO, Bcl2, AIB1, TIMP1, CD3, p53, CA9, y HER2;

(w)

MYBL2, p53BP2, PRAME, IL6, Bcl2, DIABLO, CCNE1, EPHX1, TIMP1, y CA9;

(x)

p27, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, AKT2, e ID1;

(y)

RAD5 1, GRB7, CD68, TOP2A, CIAP2, CCNB1, BAG1, IL6, FGFR1, y p53BP2;

(z)

SURV, GRB7, TOP2A, PRAME, CTSL, GSTM1, CCNB1, VDR, CA9; y CCNE2;

(aa)

TOP2B, p53BP2, DIABLO, Bcl2, TIMP1, AIB1, CA9, p53, KRT8, y BAD; y

(ab)

ZNF217, GRB7, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, APC4, y \beta-catenina.

82. El método de la reivindicación 66 que comprende secuencias de polinucleótidos basadas en intrón que hibridan con al menos uno de los genes seleccionados del grupo consistente en: CD68; CTSL; FBXO5; SURV; CCNB1; MCM2; Chk1; MYBL2; HIF1A; cMET; EGFR; TS; STK15, IGFR1; BC12; HNF3A; TP53BP2; GATA3; BBC3; RAD51C; BAG1; IGFBP2; PR; CD9; RB1; EPHX1; CEGP1; TRAIL; DR5; p27; p53; MTA; RIZ1; ErbB3; TOP2B; EIF4E, CD68; CTSL; FBXO5; SURV; CCNB1; MCM2; Chkl; MYBL2; HIF1A; cMET; EGFR; TS; y STK15.

83. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso secuencias de polinucleótidos basadas en intrón correspondientes a al menos un gen seleccionado de los genes enumerados en la Figura 6.

84. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso secuencias de polinucleótidos basadas en intrón correspondientes a una pluralidad de genes seleccionados de los genes enumerados en la Figura 6.

85. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de ambas secuencias de polinucleótidos basadas en intrón y basadas en exón.

86. El método de la reivindicación 66 que comprende el uso de ambas secuencias de polinucleótidos basadas en intrón y basadas en exón que hibridan el mismo gen diana de interés.

87. El método de la reivindicación 66 en el que dicha serie comprende al menos 100 genes.

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88. El método de la reivindicación 87 en el que dicha serie comprende al menos 100 genes en una sección de 100 \mu.

89. El método de la reivindicación 87 en el que dicha serie comprende al menos 150 genes en una sección de 100 \mu.

90. El uso de al menos un polinucleótido que comprende una secuencia basada en intrón en el que la expresión del intrón correlaciona con la expresión de una secuencia de exón correspondiente, para medir la expresión génica usando ARN intrónico en el pronóstico de cáncer.