ES2314676T3 - Preparacion prebiotica. - Google Patents

Abstract

Producto alimentario o bebida que modula la flora intestinal humana, que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida, en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 50.

Description

Preparación prebiótica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a preparaciones de arabinoxilano para utilizar como aditivos nutritivos prebióticos y a método para mejorar la salud del tracto gastrointestinal de seres humanos mediante el complemento de sus dietas con dichos aditivos. En una forma de realización preferida, las preparaciones de arabinoxilano se obtienen a partir de fuentes naturales, tal como vegetales y más preferentemente cereales.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a los efectos positivos sobre la salud gastrointestinal, y más particularmente sobre la flora intestinal, de alimentos con determinados polisacáridos que no contienen almidón (NSP). Los NSP comprenden una variedad de compuestos que presentan distintas propiedades fisicoquímicas. Los arabinoxilanos, denominados también pentosanos, constituyen un grupo importante de NSP de cereales y consisten en una cadena principal de unidades de D-xilopiranosil enlazadas \beta-1,4 a las que se enlazan unidades de O-2 y/o O-3 \alpha-L-arabino-furanosil. En un arabinoxilano normal, sin sustituir, monosustituido y disustituido se encuentran residuos de xilosa (véase la figura 1). Los arabinoxilanos puede ser tanto extraíbles con agua como no extraíbles con agua. Estos últimos se pueden solubilizar parcialmente en condiciones alcalinas o utilizando enzimas y enlazar unas grandes cantidades de agua. Los arabinoxilanos extraíbles con agua presentan extraordinario potencial de formación de viscosidad. En general, sus masas moleculares son muy elevadas (hasta 800.000 daltonios) en función de la fuente y del método de extracción. A pesar del hecho de que son únicamente constituyentes menores, resultan importantes para la funcionalidad de los cereales en procesos biotecnológicos tales como la producción de almidón de trigo, pasta y cerveza, la panificación y otras aplicaciones alimentarias.

Se ha demostrado que algunos tipos de oligosacáridos que se obtienen a partir del arabinoxilano o del xilano (un polímero sin sustituir de unidades de D-xilopiranosil enlazadas \beta-1,4) presentan unas propiedades prebióticas. Los prebióticos son unos compuestos, habitualmente oligosacáridos no glucosídicos, que no se pueden digerir mediante los enzimas del tracto gastrointestinal superior pero que se fermentan selectivamente mediante algunos tipos de bacterias intestinales del intestino grueso (Gibson & Roberfroid, 1995; Roberfroid, 1988; Van Loo, 2004). La presencia de prebióticos en la dieta provoca un cambio en la composición de la población bacteriana intestinal, habitualmente caracterizada por un incremento relativo en las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium. Dicho cambio en la flora intestinal se asocia a una mejora de la salud general, una disminución de las infecciones intestinales, un aumento de los niveles de ácidos grasos de cadena corta intestinales, una mejor absorción de los minerales y una inhibición del inicio del cáncer de colon (Van Loo, 2004).

Se ha demostrado que las preparaciones de xilooligosacáridos (XOS, oligosacáridos que consisten en unidades de D-xilopiranosil enlazadas \beta-1,4) con predominancia de oligosacáridos con un grado de polimerización (DP) de 2 a 3 (xilobiosa y xilotriosa), provocan un incremento significativo en el nivel de bifidobacterias en las heces y en el ciego de ratas (EP 0265970B1; Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004), y en el colon de seres humanos (Okazaki et al., 1990). Dichas preparaciones de XOS ricas en xilobiosa inhiben asimismo los síntomas iniciales de la carcinogenia de colon provocada por productos químicos en ratas (Hsu et al., 2004) y mejoran la absorción del calcio (Toyoda et al., 1993). Se ha demostrado asimismo que una preparación que consiste predominantemente en arabinoxil-oligosacáridos (AXOS) con un DP de 3 a 5 (arabinosilxilobiosa, arabinosilxilotriosa, arabinosilxilotetraosa y diarabinosilxilotetraosa) incrementa los niveles de bifidobacterias en los intestinos de ratas y ratones (Yamada et al.,
1993).

Un inconveniente importante del que adolecen las preparaciones comerciales de XOS actuales, que limitan seriamente su potencial comercial, es su precio muy elevado en comparación con otros oligosacáridos, lo que indica que los procesos de fabricación actuales no son rentables. Se ha descrito un método para la fabricación de preparaciones prebióticas con predominancia de unos XOS con un DP de 2 a 3 que implican la extracción química del xilano a partir de productos basados en vegetales (madera dura, mazorcas, vainas de semilla de algodón, salvado de trigo, orujo de cerveza) utilizando disoluciones de NaC1O y disoluciones de KOH muy concentrado, y a continuación la hidrólisis enzimática del xilano extraído mediante enzimas de endoxilanasa (EP 0265970B1). Se ha utilizado un método similar para realizar una preparación prebiótica de AXOS (preparación de AXOS con un DP de 3 a 5) que implica la extracción química de arabinoxilano utilizando una disolución alcalina concentrada y a continuación la eliminación de las sales, la hidrólisis enzimática con endoxilanasa y cromatografía en una columna de carbono (Yamada et al., 1993). El principal inconveniente del que adolecen dichos métodos es que la extracción química del xilano o del arabinoxilano no son ecológicos y requieren una eliminación costosa de los productos químicos mediante una diálisis exhaustiva o por ultrafiltración antes de poder realizar la hidrólisis enzimática. Otro método para producir XOS o AXOS implica la autohidrólisis hidrotérmica de madera dura o de orujo de cerveza. En dicho método se calienta una suspensión de materia vegetal en un reactor especial a 150 - 190ºC durante 20 a 60 minutos (EP 0265970B1; Kabel et al., 2002; Carvalheiro et al., 2004). El inconveniente de dicho método es que, debido a la elevada temperatura de reacción, se producen productos secundarios que no resultan aconsejables para propósitos alimentarios, tales como el furfural, el hidroximetilfurfural y el ácido levulínico (Carvalheiro et al., 2004).

Las preparaciones prebióticas de XOS y AXOS descritas actualmente presentan un grado de polimerización medio que es de 2 (EP 026597081) o de 4 (Yamada et al., 1993). En el caso de aplicaciones particulares del sector alimentario, dichas preparaciones adolecen de algunos inconvenientes. En primer lugar, las preparaciones ricas en xilosa, que tiene un sabor dulce aproximadamente de un 60% de la sacarosa (Suntory, xiloologisacárido, guía informativa del producto, 2001). Se puede pretender un sabor dulce en algunas aplicaciones, pero en otras aplicaciones se pretende un sabor más neutro. Los xilooligosacáridos con un grado medio bajo de polimerización presentan asimismo un sabor dulce aproximadamente del 40% de la sacarosa (Suntory, xiloologisacárido, guía informativa del producto, 2001). En segundo lugar, las preparaciones con un grado medio bajo de polimerización presentan un nivel energético que no es aconsejable en ingredientes para alimentos hipocalóricos. En el cálculo del valor energético de los xilooligosacáridos, el valor de la energía metabolizable de la xilosa se considera de 4 calorías por g, 2 calorías por g en el caso de la xilobiosa y la xilotriosa, y de 0 calorías por gramo en el caso de los xilo-arabino-oligosacáridos con un DP > 4 (Suntory, xiloologisacárido, guía informativa del producto, 2001).

La patente US nº 2002/037331 describe arabinoxilanos obtenidos a partir de salvado que se somete a extrusión, hidrólisis enzimática, y el almidón se hidroliza. A continuación se realiza una etapa de ultrafiltración con un valor límite de 5.000 para purificar los oligosacáridos obtenidos de este modo.

El documento US-A-5.362.502 describe la producción de pentosanos a partir de materiales harinosos que pueden presentar un grado de polimerización aproximadamente de 50 ó 17. El documento WO 02/067698 describe métodos para el fraccionamiento por vía húmeda de salvado de cereales en dos fracciones ricas en proteínas, una que contiene aceites de germen y otros componentes relacionados, una fracción de fibra, que retiene asimismo la mayor parte de las proteínas de aleurona, y una fracción de melaza.

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Sumario de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. Se refiere a un aditivo nutritivo para utilizar en la preparación de un producto alimentario o bebida que module beneficiosamente la flora intestinal humana, comprendiendo dicho aditivo arabinoxilanos que presentan un grado medio de polimerización (DP) comprendido entre 5 y 50. Además, se proporcionan diversos productos de alimentos y de bebidas que comprenden el aditivo así como métodos para preparar dicho aditivo.

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Descripción detallada Lista de figuras

Figura 1: Elementos estructurales de arabinoxilanos. A: residuo de \beta-D-xilopiranosil sin sustituir. B: residuo de \beta-D-xilopiranosil sustituido en O-2 con una parte \alpha-L-arabinofuranosil. C: residuo de \beta-D-xilopiranosil sustituido en O-3 con una parte \alpha-L-arabinofuranosil. D: residuo de \beta-D-xilopiranosil sustituido en O-2 y en O-3 con unas partes \alpha-L-arabinofuranosil. La estructura C muestra el enlace del ácido ferúlico al O-5 de un residuo \alpha-L-arabinofuranosil.

Figura 2: Perfiles de masa molecular por HPSEC de distintas preparaciones de AXOS. La columna era una Shodex SB-806 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K. K., Tokio, Japón). Los volúmenes de elución estándares de pululano con una masa molecular de 78,8 x 10^{4}, 40,4 X 10^{4}, 21,2 X 10^{4}, 11,2 X 10^{4}, 4,73 X 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4}, 0,59 X 10^{4} Da y de glucosa (180 Da) se indican mediante un símbolo "x" de izquierda a derecha.

Figura 3: Porcentaje de degradación de monosacáridos constituyentes de los AXOS-15-0,27 (A), xilooligo-95P (B) y fructooligosacáridos (C) para distintos períodos de incubación a 100ºC a un pH de 2, 3, 7 y 11.

Figura 4: Porcentaje de hidrólisis de AXOS-15-0,27 (A), xilooligo-95P (B) y fructooligosacáridos (C) para distintos períodos de incubación a 100ºC a un pH de 2, 3 y 7.

Figura 5: Porcentaje de hidrólisis de los enlaces de xilosa (A) y los enlaces de arabinosa (B) en los AXOS-15-0,27 para distintos períodos de incubación a 100ºC a un pH de 2, 3 y 7.

Figura 6: Dulzura de los AXOS-15-0,27, xilooligo-95P (B) y sacarosa. Las curvas muestran el porcentaje acumulativo de los individuos (n = 20) que reconocen el sabor dulce trazadas con respecto a la concentración del compuesto en g/l.

Figura 7: Perfiles de masa molecular por HPSEC de fracciones de oligosacáridos obtenidas tras la ultrafiltración de los AXOS producidos mediante tratamiento con endoxilanasa con WU-AX secundario. Las membranas utilizadas presentaron un MMCO de 5 kDa (panel A), 10 kDa (panel B) y 30 kDa (panel C). La columna era una Shodex SB-802.5 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K. K., Tokio, Japón). Los marcadores de masa molecular fueron pululanos estándar P-82 de Shodex con una masa molecular de 11,2 x 10^{4}, 4,73 x 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59 x 10^{4} Da, xilooligosacáridos estándar con una masa molecular de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da, y su volumen de elución respectivo se indica mediante un símbolo "x" de izquierda a derecha.

Figura 8: Perfiles de masa molecular por HPSEC de fracciones de oligosacáridos obtenidas tras la ultrafiltración por pases consecutivos a través de membranas con MMCO de 10 kDa y 30 kDa de AXOS producidos mediante tratamiento con endoxilanasa con WU-AX secundario. Las fracciones analizadas son el concentrado tras pasar a través de una MMCO de 30 kDa del concentrado de una membrana de 10 kDa (RET_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa}), el filtrado tras pasar a través de una MMCO de 30 kDa del concentrado de una membrana de 10 kDa (PER_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa}), o el filtrado tras pasar a través de una membrana de 10 kDa (PER_{10 \ kDa}). La columna era una Shodex SB-802.5 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K. K., Tokio, Japón). Los marcadores de masa molecular fueron pululanos estándar P-82 de Shodex con una masa molecular de 11,2 x 10^{4}, 4,73 x 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59 x 10^{4} Da, xilooligosacáridos estándar con una masa molecular de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da, y su volumen de elución respectivo se indica mediante un símbolo "x" de izquierda a
derecha.

Figura 9: Efectos de la adición al pienso para pollos de los AXOS-7-0,34, AXOS-122-0,66 o xilooligo-95P en la flora del ciego de pollos. La composición de la flora cecal se determinó al cabo de 1 y 2 semanas, respectivamente, tras el inicio del experimento mediante recuento de placas para enterobacterias y bifidobacterias. Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas. En un momento determinado los valores marcados con una letra distinta son significativamente distintos entre sí según el test de Tukey a una p < 0,05.

Figura 10: Efectos de la adición al pienso para pollos de los AXOS-15-0,27 al 0,1% o al 0,25%, fructooligosacáridos (FOS) al 0,25% o al 1% o endoxilanasa en el número de bifidobacterias en el ciego de pollos tras 14 días. Las bacterias que pertenecían al género Bifidobacterium se determinaron mediante PCR cuantitativa. Los valores marcados con una letra distinta son significativamente distintos entre sí según el test de diferencias menos significativas (p < 0,05; n = 3). Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas.

Figura 11: Efectos de la adición al pienso para ratas de los AXOS-8-0,27, AXOS-15-0,27, AXOS-16-0,78 o AXOS-122-0,6 al 0,25% en el nivel de acetato (panel superior), propionato (panel intermedio) y butirato (panel inferior) en las heces de las ratas tras 13 días de alimentación. Los valores marcados con una letra distinta son significativamente distintos entre sí según el test de diferencias menos significativas (p < 0,05; n = 4). Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas.

Figura 12: Efectos de la adición a las dietas para ratas de los AXOS-15-0,27 o xilooligo-95P al 4% en el nivel de acetato en el colon proximal (A), de acetato en el colon distal (B), de propionato en el colon distal (C) y de butirato en el colon distal (D) en ratas tras 14 días de alimentación. Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas.

Figura 13: Efectos de la adición a las dietas para ratas de los AXOS-15-0,27 o xilooligo-95P al 4% en el nivel de bifidobacterias en el ciego tras 14 días de alimentación. Las bacterias que pertenecen al género Bifidobacterium se determinaron mediante PCR cuantitativa. Los valores marcados con una letra distinta son significativamente distintos entre sí según el test de diferencias menos significativas (p < 0,05; n = 4). Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas.

Figura 14: Efectos de la ingestión de 4,88 g/día de los AXOS-15-0,27 o de 4,81 g/día de WPC durante 14 días en el número de bifidobacterias en las heces de seres humanos sanos voluntarios. Las bacterias que pertenecen al género Bifidobacterium se determinaron mediante PCR cuantitativa. Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas. Las barras con una estrella presentan una diferencia significativa del nivel basal según la prueba de Wilcoxon para datos emparejados (p < 0,05; n = 5).

Figura 15: Efectos de la ingestión de dosis unitarias de los AXOS-15-0,27 (0,24, 0,73, 2,21 ó 4,88 g) en la excreción urinaria (A) y fecal (B) de nitrógeno, y en el período de tránsito bucocecal (C). La excreción de nitrógeno se expresa como el porcentaje del nitrógeno marcado con ^{15}N administrado recuperado en las muestras tanto de orina como de heces recogidas durante 0 a 48 h y 0 a 72 h tras la ingestión del alimento del ensayo, respectivamente. El período de tránsito bucocecal se expresa como el porcentaje del PEG marcado con ^{3}H administrado en las muestras de heces recogidas durante 0 a 72 h. Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas. Las barras con una estrella o dos estrellas presentan una diferencia significativa del nivel basal del tratamiento de control según la prueba de Wilcoxon para datos emparejados (p < 0,05; n = 9) y p < 0,01 (n = 9), respectivamente.

Figura 16: Efectos de la ingestión de dosis unitarias de los AXOS-15-0,27 (0,24, 0,73, 2,21 ó 4,88 g) en la excreción urinaria de p-cresol (A) y de fenol (B). La excreción del p-cresol y del fenol se expresan como el contenido total de p-cresol y fenol (mg) recuperados de las muestras de orina recogidas durante 0 a 24 horas tras la ingestión de la alimentación del ensayo. Las barras representan las medias de las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones típicas. Las barras con una estrella o dos estrellas presentan una diferencia significativa del nivel basal del tratamiento de control según la prueba de Wilcoxon para datos emparejados (p < 0,05; n = 9) y p < 0,01 (n = 9), respectivamente.

Descripción

Se ha descrito anteriormente el efecto prebiótico de complementar los alimentos o productos alimentarios con preparaciones particulares de arabinoxilano. Más particularmente las técnicas anteriores proporcionan ejemplos de los efectos bifidogénicos por una parte en los xiloarabinooligosacáridos que presentan un grado de polimerización (DP) medio inferior a 4 y por otro lado en las preparaciones de arabinoxilano que comprenden arabinoxilanos naturales de cadena larga.

Las preparaciones disponibles de xiloarabinooligosacáridos se producen bajo unas condiciones de despolimerización rigurosas y sin control que tienen como resultado la presencia de unos niveles relativamente elevadas de xilosa y de xilooligosacáridos de cadena corta, que presentan un sabor dulce. La dulzura de dichas preparaciones limita su utilización a unos productos alimentarios específicos. Además, las moléculas de xiloarabinooligosacáridos con un DP inferior a 4 presentan un cierto contenido energético metabólico que no se pretende en alimentos hipocalóricos.

Las características fisicoquímicas de los arabinoxilanos naturales, tales como una viscosidad elevada y una capacidad de retención del agua elevada, hacen que no resulten apropiados para utilizar en una amplia gama de productos alimentarios. La despolimerización parcial de los arabinoxilanos naturales aumenta sus características fisicoquímicas y se han descrito preparaciones que comprenden moléculas de arabinoxilano que presentan un DP medio aproximadamente de 58. Sin embargo, la acción prebiótica en seres humanos de dichos arabinoxilanos parcialmente despolimerizados se ha demostrado únicamente con dosis relativamente elevadas (> 6 g por día; Grasten et al. 2003).

La presente invención se basa en el descubrimiento de que las preparaciones de arabinoxilano que comprenden arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 son agentes prebióticos potentes cuando se administran a seres humanos y en los animales analizados como modelos para seres humanos. Además, dichas preparaciones no presentan ninguno de los inconvenientes fisicoquímicos u organolépticos de las preparaciones que comprenden tanto arabinoxilanos naturales como xiloarabinooligosacáridos de cadena corta. Se descubrió asimismo que en seres humanos, ratas y pollos las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención presentaban un efecto bifidogénico superior que las preparaciones que comprenden arabinoxilanos parcialmente despolimerizados que presentan un DP medio de 58 o superior. Además, se observó que las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención ejercen principalmente su acción prebiótica en la parte distal del colon, mientras que los xiloarabinooligosacáridos de cadena corta resultan más activos en la parte proximal del colon. Dicho descubrimiento resulta particularmente importante ya que parece ser que existe una relación entre la composición de la flora del colon distal y del desarrollo de enfermedades del colon y más particularmente el cáncer de colon.

Aparte del efecto prebiótico de por sí, se observaron asimismo otros efectos beneficiosos de la utilización de preparaciones de arabinoxilano de la presente invención tales como la reducción de la excreción de nitrógeno en la orina y el incremento concomitante de la excreción de N en las heces, así como una reducción de la excreción de cresol y fenol en la orina.

Por lo tanto, constituye un primer objetivo de la presente invención proporcionar la utilización de una preparación de arabinoxilano que comprende moléculas de arabinoxilano con un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 50 como aditivo alimentario en la producción de un alimento o una bebida que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida, o como base de un complemento nutritivo. En una forma de realización preferida la preparación de arabinoxilano comprende por lo menos un 15% de dichas moléculas de arabinoxilano. En una forma de realización más preferida la preparación de arabinoxilano comprende por lo menos un 30% de dichas moléculas de arabinoxilano, por ejemplo más del 60%. En una forma de realización aún más preferida los arabinoxilanos comprendidos en las preparaciones según la presente invención presentan un DP medio comprendido entre 7 y 40, incluso más preferentemente un DP comprendido entre 7 y 20. En una forma de realización particular la presente invención proporciona la utilización de una preparación de arabinoxilano que comprende moléculas de arabinoxilano con un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 7, o un grado de polimerización (DP) medio de 6 con su proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa) de 0,40, o un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa) es de 0,5, como aditivo alimentario en la producción de un alimento o una bebida que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida. Preferentemente, el 90% de los arabinoxilanos comprendidos en las preparaciones según la presente invención presentan un DP comprendido entre 2 y 650, tal como se determina utilizando cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento (HPSEC), más preferentemente entre 2 y 130.

En una forma de realización preferida, las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención se pueden obtener a partir de fuentes naturales, tales como la materia vegetal y más preferentemente a partir de cereales. Se pueden seleccionar fracciones de dichos arabinoxilanos naturales o se pueden obtener mediante la despolimerización o la fragmentación de dichos arabinoxilanos naturales o puede tratarse de análogos estructurales producidos mediante procesos químicos, enzimáticos y/o físicos. En una forma de realización preferida, las preparaciones de arabinoxilano se obtienen a partir de una toma lateral de un proceso de separación de gluten y almidón, tal como el WPC (Pfeifer & Lagen). En otra forma de realización preferida, las preparaciones de arabinoxilano se obtienen a partir de salvado de cereales.

Los efectos prebióticos de las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención cuando se administran con la alimentación se observaron con unas dosis de 0,25 g por ración. Por lo tanto, un segundo objetivo de la presente invención proporciona un producto alimentario o bebida que modula la flora intestinal humana, que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos con un DP medio comprendido entre 5 y 50 por ración de dicho producto alimentario o bebida. En una forma de realización particular, la presente invención proporciona un producto alimentario o bebida que modula la flora intestinal y que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida, presentando dichos arabinoxilanos un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50. En una forma de realización incluso más preferida el producto alimentario o bebida comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 60 por ración. Tal como se ha indicado anteriormente, las preparaciones de arabinoxilano según la presente invención resultan particularmente apropiadas como aditivo beneficioso para los alimentos
hipocalóricos.

En una forma de realización particular el producto alimenticio es un producto láctico tal como yogur o queso fresco. Preferentemente dicho producto láctico comprende entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio entre 5 y 50 por 100 g por ración de 125 g. Opcionalmente dicho producto láctico comprende bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus, que puede fermentar arabinoxilanos. En otra forma de realización particular las bebidas de la presente invención son los denominados refrescos funcionales sin alcohol. Preferentemente dichos refrescos funcionales comprenden entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio entre 5 y 50 por 100 ml. Alternativamente, dichos refrescos funcionales comprenden la cantidad pretendida de dichos arabinoxilanos en 250 ml. En una forma de realización funcional los refrescos comprenden bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus, que puede fermentar arabinoxilanos.

En general, los productos alimentarios que presentan cereales o materias obtenidas a partir de los cereales como ingrediente contienen arabinoxilanos. Sin embargo, los arabinoxilanos comprendidos en dichos productos alimentarios son tanto arabinoxilanos naturales de cadena larga con un DP superior a 6.000 como arabinoxilanos parcialmente despolimerizados que presentan un DP de por lo menos 200 a 300. Por lo tanto, el enriquecimiento de dichos productos alimentarios con los arabinoxilanos según la presente invención aumenta asimismo su valor nutritivo. Preferentemente, dicho enriquecimiento se alcanza añadiendo una cantidad determinada de la preparación de arabinoxilano de la presente invención como ingrediente durante la preparación de productos alimentarios que contienen cereales. Resulta evidente que con dicho enriquecimiento se obtiene un producto alimenticio que comprende arabinoxilanos que presentan un DP de 200 o superior, próximo a un grupo de entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos que presenta un DP inferior a 200 por ración de dicho producto alimenticio, presentando dicho grupo de arabinoxilanos un DP medio comprendido entre 5 y 50. En una forma de realización particular, la presente invención proporciona un producto alimentario que contiene cereales y que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos que presenta un DP inferior a 200 por ración de dicho producto y presentando dicho grupo de arabinoxilanos un grado de polimerización (DP) medio comprendido de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50. Los expertos en la materia comprenderán que el enriquecimiento de los productos alimentarios que contienen cereales con dicho grupo de arabinoxilanos que presenta un DP inferior a 200 se pueden obtener por lo menos en parte utilizando enzimas xilanolíticos bajo las condiciones apropiadas durante la preparación de dichos productos alimentarios. En una forma de realización particular dicho producto alimentario es un producto de panadería tal como el pan. Preferentemente dicho pan se enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 por 100 g. En otra forma de realización el producto alimentario es un producto de repostería, tal como un pastel. Preferentemente dicho producto de repostería se enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 por 100 g. En otra forma de realización adicional el producto alimentario es un producto de pasta. Preferentemente dicho producto de pasta se enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 por 80 g. En otra forma de realización adicional el producto alimentario es un cereal para desayunos. Preferentemente dicho cereal para desayunos se enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 por 30 g. En otra forma de realización adicional el producto alimentario es un bizcocho. Preferentemente dicho bizcocho se enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 por 125 g.

Otros productos alimentarios que se pueden complementar beneficiosamente con las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención son por ejemplo, pero sin limitarse a los mismos, productos de carne picada, chocolates, galletas, barras y postres tales como los pudines.

En un tercer objetivo la presente invención proporciona un aditivo nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario o bebida según la presente invención, comprendiendo dicho aditivo por lo menos un 15% de arabinoxilanos que presentan un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 7 y 20. En una forma de realización particular la presente invención proporciona un aditivo nutritivo a utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario o bebida según la presente invención, comprendiendo dicho aditivo por lo menos un 15% de arabinoxilanos que presentan un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 7, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización (DP) medio de 6 con su proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa) de 0,40, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización (DP) medio de 8 con su proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa) de 0,50. En una forma de realización preferida el producto de complemento alimentario es una cápsula, comprimido, polvo o similar. En una forma de realización más preferida el producto de complemento alimentario se formula de tal modo que permite una administración diaria comprendida entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50, por ejemplo entre 1 y
3 g.

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En un cuarto objetivo la presente invención proporciona unos métodos para preparar un aditivo nutritivo a utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario según la presente invención. En una primera forma de realización el método comprende las etapas de:

i.

aislar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua a partir de un material rico en arabinoxilanos tal como el salvado, la harina de trigo o trigo secundario obtenido mediante la eliminación del almidón y la desproteinización de dicho material rico en arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente,

ii.

despolimerizar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.

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En una segunda forma de realización el método comprende las etapas de:

i.

obtener una preparación que contiene arabinoxilanos que se pueden extraer con agua parcialmente despolimerizados, tal como una preparación obtenida en una toma lateral de un proceso de separación de gluten y almidón

ii.

si resulta necesario eliminar el almidón y las proteínas de dicha preparación que contiene arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente,

iii.

despolimerizar la fracción de arabinoxilano contenida en dicha preparación utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.

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En una forma de realización particular la preparación se somete a ultrafiltración tras el tratamiento con los enzimas xilanolíticos a fin de reducir la cantidad de monosacáridos y oligosacáridos que presentan un DP de 4 o inferior de la preparación.

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En un objetivo final la presente invención proporciona un método para analizar la concentración y el DP medio de un grupo de arabinoxilanos con un DP inferior a 200 en un producto alimentario que contiene cereales. Dicho método comprende las etapas de:

i.

triturar una muestra del producto alimentario que contiene cereales, preferentemente tras haber secado o liofilizado dicha muestra;

ii.

extraer la muestra triturada en agua destilada;

iii.

tratar el extracto con enzimas amilolíticos en las condiciones apropiadas a fin de transformar todo el almidón en glucosa, por ejemplo utilizando un tratamiento con amilasa y a continuación un tratamiento con amiloglucosidasa;

iv.

eliminar la glucosa de la muestra obtenida en (iii), por ejemplo metabolizando la glucosa utilizando levaduras;

v.

determinar el perfil de masa molecular de los arabinoxilanos comprendidos en la muestra obtenida en (iv), preferentemente utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC);

vi.

calcular la cantidad relativa y el DP medio de la fracción de arabinoxilanos inferior a un DP de 200, por ejemplo mediante el análisis de la superficie que se encuentra por debajo de la curva de HPLC.

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La presente invención se ilustra con más detallo mediante las formas de realización ilustrativas descritas a continuación.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de XOS/AXOS con un DP medio > 4 Materiales y métodos

Xilooligo-95P. La preparación comercial de xilooligosacáridos Xilooligo-95P, que consiste predominantemente en xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa, se obtuvo en Suntory LTD. (Tokio, Japón).

Preparación de arabinoxilanos que no se pueden extraer con agua a partir de salvado de trigo. Para la preparación de arabinoxilanos que no se pueden extraer con agua (WU-AX), se utilizó salvado de trigo comercial (Meneba Meel BV, Rotterdam, Holanda) como material inicial. El material distinto al arabinoxilano se retiró parcialmente del salvado mediante tratamiento enzimático según el método descrito en Maes et al. (2004). Una suspensión de salvado de trigo en agua (1:7 p/v) se trató en primer lugar con una \alpha-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 150 \mul/g de salvado de trigo) durante 90 minutos a 90ºC para hidrolizar el almidón. Tras enfriar a 50ºC, se ajustó el pH de la suspensión a 6,0 utilizando HCl concentrado y se incubó la suspensión con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 1 \mul/g de salvado de trigo) durante 24 h a 50ºC para hidrolizar las proteínas residuales. A continuación, se sometió a ebullición la suspensión y se filtró, descartándose el filtrado. El residuo, al que se hace referencia como "WU-AX de salvado", se lavó con agua y se secó al aire.

Preparación de arabinoxilanos que no se pueden extraer con agua a partir de harina de trigo o de almidón secundario de trigo. La harina de trigo se puede fraccionar en 4 fracciones distintas utilizando métodos estándar (McRitchie, 1985): almidón A (almidón primario), almidón B (almidón secundario o residual), gluten y fracción hidrosoluble. Los WU-AX se concentran en la fracción del almidón secundario. La materia distinta al arabinoxilano se retiró parcialmente de la fracción secundaria mediante tratamiento enzimático. Una suspensión de almidón secundario en agua (1:6 p/v) se trató en primer lugar con una \alpha-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 30 \mul/g de almidón secundario) durante 60 minutos a 90ºC y amiloglucosidasa (Megazyme, Bray, Irlanda, 20 \mug/g de almidón secundario) durante 16 h a 60ºC para hidrolizar el almidón. Tras hervir durante 30 minutos y centrifugar se incubó el residuo con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 20 \mul/g de almidón secundario) durante 20 h a 50ºC para hidrolizar las proteínas residuales. A continuación, se sometió a ebullición de nuevo la suspensión (30 minutos), se filtró y se retiró el filtrado. El residuo, al que se hace referencia como "harina de WU-AX", se lavó con agua, etanol (95% v/v) y se secó con aire. En vez de extraer los WU-AX a partir del almidón del trigo, los WU-AX se pueden extraer también directamente aislados a partir del almidón secundario del trigo. En este caso se utilizó como materia inicial Meritena 233 (Tate & Lyle, Aalst, Bélgica), un producto secundario del proceso industrial de separación del almidón y el gluten comercialmente disponible. A continuación se trató una suspensión de Meritena 233 en agua (1:5 p/v) con una a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 30 \mul/g de Meritena 233) durante 60 minutos a 90ºC y aminoglucosidasa (Megazyme, Bray, Irlanda, 20 \mug/g de Meritena 233) durante 16 h a 60ºC para hidrolizar el almidón. Tras hervir durante 30 minutos y centrifugar, el residuo se incubó con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 20 \mul/g de Meritena 233) durante 20 h a 50ºC para hidrolizar las proteínas residuales. A continuación, se sometió a ebullición de nuevo la suspensión (30 minutos), se filtró y se retiró el filtrado. El residuo, al que se hace referencia como "WU-AX secundario", se lavó con agua y etanol (95% v/v), y se secó al aire.

Concentrado de pentosano de trigo (WPC). El concentrado de pentosano de trigo (WPC, Pfeifer & Lagen, Dormagen, Alemania) se obtiene a partir de la harina de trigo y su composición química la describieron en detalle Courtin & Delcour (1998). El WPC es rico en arabinoxilanos que se pueden extraer con agua (aproximadamente un 43%) y materia proteica (aproximadamente un 30%). La parte restante consiste principalmente en péptidos de arabinogalactano (aproximadamente un 14%) y en un menor nivel, glucosa polimérica (un 6%).

Preparación de AXOS con un DP medio de 122 y una proporción A/X de 0,66 (AXOS-122-0,66). El material inicial para la preparación de los AXOS-122-0,66 fue el producto comercial Wheat Pentosan Concentrate (WPC, Pfeifer & Lagen, Dormagen, Alemania). El WPC se solubilizó en agua desionizada (1:10 p/v) y se añadió sílice como suspensión acuosa (20% p/v) hasta una proporción sílice/proteína de 7:1. Se ajustó el pH de la mezcla a 4,8 utilizando HCl 0,1 M a fin de alcanzar una absorción máxima de las proteínas con respecto al sílice. Tras 30 minutos de agitación, la suspensión se filtró con un Buchner. Se retiró el residuo que comprendía sílice/proteínas, al mismo tiempo que se sometió el filtrado a precipitación con etanol. Se añadió etanol (95% v/v) mientras se agitaba continuamente hasta una concentración final del 65% (v/v) y tras agitar durante unos 30 minutos adicionales, depositarse (24 h, 24ºC) y filtrarse, el residuo obtenido se secó con disolvente (etanol, acetona y éter dietílico) y se secó con aire. El material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.

Preparación de AXOS con un DP medio de 16 y una proporción A/X de 0,78 (AXOS-16-0, 78). Se prepararon los AXOS-16-0,78 partiendo del producto comercial Wheat Pentosan Concentrate (WPC, Pfeifer & Lagen, Dormagen, Alemania). El WPC se trató con sílice para eliminar las proteínas tal como se ha descrito para la preparación de los AXOS-122-0,66. El filtrado recuperado se continuó incubando a 30ºC durante 24 horas con un XAA, una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 29 unidades por g de Wheat Pentosan Concentrate. Tras la inactivación del enzima mediante ebullición (30 minutos), la disolución obtenida se enfrió y se sometió a una precipitación con etanol. El etanol (95% v/v) se añadió mientras se sometía a agitación continua hasta una concentración final del 80% (v/v) y tras agitar durante unos 30 minutos adicionales, sedimentación (24 h, 4ºC) y filtración, se disolvió el residuo obtenido en agua desionizada y se sometió de nuevo a precipitación con etanol. Se añadió etanol (95% v/v) bajo agitación continua hasta una concentración final del 65% (v/v) y tras agitar durante 30 minutos adicionales, sedimentar (24 h, 4ºC) y filtrar, se retiró el material precipitado. El sobrenadante restante se sometió a evaporación rotatoria, pera eliminar el etanol, se disolvió en agua desionizada y se liofilizó. El material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.

Preparación de AXOS con un DP medio de 7 y una proporción A/X de 0,34 (AXOS-7-0,34). El material inicial para la preparación de los AXOS-7-0,34 fue el WU-AX de salvado que se aisló tal como se ha descrito anteriormente. A continuación se incubó el WU-AX de salvado a 30ºC durante 24 h con una endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 80 unidades por g de WU-AX de salvado aislado en seco. Tras la filtración y la inactivación del enzima mediante ebullición (30 minutos), se liofilizó el filtrado y el material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.

Preparación de AXOS con un DP medio de 15 y una proporción A/X de 0,27 (AXOS-15-0,27). Se utilizó salvado de trigo comercial (Dossche Mills & Bakery, Deinze, Bélgica) como material inicial para la preparación de los AXOS-15-0,27. En primer lugar se trató una suspensión de salvado de trigo en agua (1:7 p/v) con una a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 1 \mul/g de salvado de trigo) durante 90 minutos a 90ºC para hidrolizar el almidón. Tras enfriar a 50ºC, se ajustó el pH de la suspensión a 6,0 utilizando HCl concentrado y se incubó la suspensión con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 40 \mul/g de salvado de trigo) durante 4 h a 50ºC para hidrolizar las proteínas residuales. A continuación, se sometió a ebullición la suspensión durante 20 minutos, se filtró, y se descartó el filtrado. Se lavó el filtrado con agua y se volvió a suspender en agua desionizada (1:14 p/v). Se incubó la suspensión sometiéndola a agitación continua durante 10 h a 50ºC con endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 1,4 unidades por g de salvado de trigo al que se había retirado el almidón y las proteínas, y durante otras 10 h a 50ºC tras la adición de una segunda dosis de endoxilanasa XBS a 1,1 unidades por g de salvado de trigo al que se había retirado el almidón y las proteínas. Tras la inactivación del enzima mediante ebullición (30 minutos), se concentró la disolución hasta un 20% de materia seca en un evaporador en capa delgada y finalmente se secó y se deshidrató por aspersión.

Preparación de AXOS con un DP medio de 8 y una proporción A/X de 0,27 (AXOS-8-0,27). Se prepararon los AXOS-8-0,27 incubando una disolución (1:10 p/v) de AXOS-15-0,27 a 30ºC durante 1 h con XAA, una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 125 unidades por g de AXOS-15-0,27. Tras la inactivación del enzima mediante ebullición (30 minutos), se liofilizó el filtrado y el material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.

Preparación de AXOS con un DP medio de 39 y una proporción A/X de 0,22 (AROS-39-0,22). Se prepararon los AXOS-39-0,22 a partir de WU-AX secundarios que se aislaron a partir de almidón B Meritena 233 tal como se ha descrito anteriormente. Los WU-AX, que presentaban una proporción A/X media de 0,63, se suspendieron a 3 g/l en una disolución amortiguadora de acetato sódico 25 mM (pH 4,7) y se incubaron sometiéndose a agitación continua durante 2 h a 30ºC con endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 3,3 unidades por g de WU-AX secundario. Tras centrifugar (10.000 g, 15 minutos, 18ºC) se sometió a ebullición el sobrenadante durante 30 minutos, para inactivar el enzima, al mismo tiempo que se lavó el residuo con la disolución amortiguadora de acetato sódico mencionada anteriormente (1/4 del volumen inicial). Se inactivó el agua del lavado (30 minutos, 100ºC) y se combinó con el sobrenadante. Tras la filtración, la disolución obtenida se liofilizó para producir AXOS con un DP_{GC} medio de 262 y una proporción A/X de 0,50. La materia solubilizada con enzimas se disolvió de nuevo en agua desionizada (1:20 p/v) y el pH de la disolución se desplazó hasta 2,8 mediante la adición de HCl (1 M). Se incubó la disolución durante 24 h a 90ºC para retirar una fracción grande de los sustituyentes de la arabinosa con enlaces \alpha-1,2 y \alpha-1,3, que son más propensos a la hidrólisis ácida que las subunidades de xilosa con enlaces \beta-1,4 de los AXOS. Tras enfriar a temperatura ambiente, se neutralizó la disolución mediante la adición de NaOH 1 M y se centrifugó (10.000 g, 20 minutos, 18ºC). Se añadió etanol (95% v/v) al sobrenadante obtenido sometiéndose a agitación continua hasta una concentración final de etanol del 80% (v/v). Se agitó la mezcla durante 30 minutos adicionales y se mantuvo durante la noche a 4ºC. Los compuestos de AXOS precipitados se recuperaron mediante centrifugación (10.000 g, 20 minutos, 4ºC), se disolvieron en agua desionizada, se liofilizaron y el material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.

Preparación de AXOS con un DP medio de 13 y una proporción A/X de 0,21 (AXOS-13-0,21). Se prepararon los AXOS-13-0,21 incubando una disolución de AXOS-39-0,22 (3 g/l) a 30ºC durante 2 h con XAA, una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 27,7 unidades por g de AXOS-39-0,22. Tras la inactivación del enzima mediante ebullición (30 minutos), se liofilizó la solución y el material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.

Caracterización de las preparaciones aisladas

Se utilizaron distintas técnicas para caracterizar las preparaciones de oligosacáridos.

El contenido glucídico total y de grupos reductores terminales se determinó mediante análisis cromatográfico gas - líquido tal como describen Courtin et al. (2000). El contenido en arabinoxilano (AX) de las muestras se expresó como 0,88 x (% arabinosa + % xilosa). El grado de polimerización medio de los AXOS determinado mediante cromatografía gas - líquido (DP_{GC} medio) se calculó como la suma del contenido total en xilosa y arabinosa dividido por el contenido en grupos reductores terminales de xilosa. El contenido proteico (N x 5,7) de las muestras se determinó mediante el método de combustión de Dumas una adaptación del método oficial de la AOAC (1995).

La caracterización de los oligosacáridos constituyentes de las preparaciones se realizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica por impulsos (HPAEC-PAD) utilizando un sistema cromatográfico DX-500 (Sunnyvale, CA, EE.UU.) equipado con un detector electromecánico ED-40, una bomba de gradiente GP-50 y un dispositivo automático de obtención de muestras AS-3500. Se solubilizaron las muestras (10 mg) en agua desionizada purificada (2 ml, resistencia específica 18 m\Omega-cm), se filtraron y se inyectaron (25 \mul) en una precolumna Carbopac PA-100 (4 x 25 mm) unida a una columna de intercambio de aniones Carbopac PA-100 (4 x 250 mm). Se realizó la elución (1.0 ml/min) con un gradiente lineal de 0 a 250 mM de acetato sódico en NaOH 100 mM durante 30 minutos, y a continuación un gradiente lineal de 250 a 400 mM de acetato sódico en NaOH 100 mM durante 15 minutos. Tras el gradiente, la columna se eluyó durante 5 minutos con NaOH 100 mM. Se realizó el seguimiento de la elución utilizando el detector ED-40 detector en modo de detección amperométrica de impulsos con los siguientes ajustes para los potenciales y los períodos de tiempo: E_{1}, + 0,05 V (t_{1} = 400 ms); E_{2}, + 0,75 V (t_{2} = 200 ms); E_{3}, - 0,15 V (t_{3} = 400 ms). Se utilizaron arabinosa (A), xilosa (X_{1}), xilobiosa (X_{2}) y XOS con un DP comprendido entre 3 y 6 (X_{3} y X_{6}) como referencias.

Se realizó la cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento (HPSEC) en un sistema de HPLC (Kontron Instruments, 325 sistemas de bombeo, Kontron, Milán, Italia) equipado con sistema de inyección automático. Se disolvieron todas las preparaciones en cloruro sódico al 0.3% (1,5 ml), se filtraron y se inyectaron (20 \mul) en una precolumna Shodex SB-800P (Showa, Denko K. K., Tokyo, Japón, 50 x 6 mm) unida a una columna de HPSEC Shodex SB-806 HQ (300 x 8 mm, intervalo de separación: 1 x 10^{2} - 20 x 10^{6} Da). Se realizó la elución con cloruro sódico al 0,3% (0,5 ml/min; 30ºC) y se realizó el seguimiento con un detector del índice de refracción (VDS Optilab, Berlín, Alemania). Los marcadores de masa molecular fueron pululanos estándar Shodex P-82 (2.0 mg/ml) con unas masas moleculares de 78,8 x 10^{4}, 40,4 X 10^{4}, 21,2 X 10^{4}, 11, 2 X 10^{4}, 4, 73 X 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59 x 10^{4} Da, y glucosa con una masa molecular de 180 Da. El grado de polimerización media (avDP) de los oligosacáridos determinada mediante cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento (avDP_{HPSEC}) se calculó como MM_{HPSE}/132.

Determinación de la actividad de los enzimas xilanolíticos. Se realizó la determinación colorimétrica de la actividad de los enzimas xilanolíticos utilizando xilazima (Megazyme, Bray, Irlanda) y un sustrato insoluble siguiendo las instrucciones del fabricante para el ensayo. Se definió una unidad como la cantidad de enzima necesario para producir un cambio en la extinción a 590 nm de 1,0 en las condiciones del ensayo.

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Resultados y discusión

Se prepararon distintos tipos de AXOS a partir de salvado de trigo o almidón secundario de trigo tal como se ha descrito en Materiales y métodos. Las propiedades de las distintas preparaciones por lo que se refiere al contenido en arabinoxilano, grado medio de sustitución (proporción de arabinosa con respecto a la xilosa) y grado medio de polimerización se representan en la Tabla 1, en la que se comparan con las del Xilooligo-95P, una preparación comercial de XOS con propiedades prebióticas conocidas (Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004). Según la nomenclatura utilizada en la Tabla 1 y asimismo de ahora en adelante, las preparaciones de AXOS se refieren a AXOS-x-y, en las que x es el grado medio de polimerización determinado mediante cromatografía en gas - líquido e y es la proporción de arabinosa con respecto a la xilosa. Las distintas preparaciones presentaban unos grados medios de polimerización comprendidos entre 7 y 122 (en comparación con el 2 del Xilooligo-95P), y los grados de sustitución se encontraban comprendidos entre 0,21 y 0,78 (en comparación con el 0,09 del Xilooligo-95P). Las preparaciones obtenidas a partir de salvado de trigo (AXOS-7-0,34, AXOS-15-0,27, AXOS-8-0,27) presentaban un grado de sustitución inferior que las preparaciones obtenidas a partir de harina de trigo (AXOS-122-0,66,
AXOS-16-0,78).

Se ha demostrado asimismo que el grado de sustitución de los compuestos de AXOS se puede reducir mediante tratamiento con ácido. De hecho, el AXOS-39-0,22 se prepara a partir de WU-AX secundario mediante distintas etapas que comprenden el tratamiento con ácido (véase Materiales y métodos) y ello reduce el grado medio de sustitución de 0,63 del WU-AX secundario hasta 0,22 en el AXOS-39-0,22.

La figura 2 representa la distribución de masas moleculares de las distintas preparaciones de AXOS determinadas por HPSEC. Todas las preparaciones de AXOS resultaron polidispersas y consistían en entidades moleculares con un pico situado próximo al avDP determinado por cromatografía en gas - líquido. El intervalo de grados de polimerización en el que se encuentran el 90% de los oligosacáridos, determinado a partir de los perfiles de elución por HPSEC, se proporciona en la Tabla 1 para las distintas preparaciones de AXOS.

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Ejemplo 2

Fisicoquímica y propiedades sensitivas de las preparaciones de XOS/AXOS Materiales y métodos

Preparaciones de oligosacáridos. Se obtuvieron xilooligo-95P, AXOS-15-0,27, AXOS-39-0,22, y AXOS-13-0.21 tal como se ha descrito en Materiales y métodos del ejemplo 1. La preparación de fructooligosacáridos (FOS) fue el producto comercial Raftilose (Orafti, Tienen, Bélgica). Los AXOS-15-0,27 utilizados para el análisis sensitivo se disolvieron en primer lugar en agua (1:25 p/v) y se trataron con carbono activado para eliminar los posibles sabores extraños resultantes del proceso de producción. La suspensión de AXOS-15-0,27 y carbono activado (0,75 g/g de AXOS-15-0,27) se agitó durante 1 h a 18ºC, y tras decantar, se retiró el carbono activado por centrifugación (10.000 g, 30 min, 18ºC).

Determinaciones de estabilidad. Las determinaciones de estabilidad se realizaron en la parte extraíble con agua de las preparaciones de oligosacáridos, que se obtuvo mediante la suspensión de las preparaciones en agua desionizada (1:10 p/v) y a continuación agitación (2 h, 18ºC), centrifugación (10.000 g, 20 min, 18ºC) y filtración. Tras liofilizar el filtrado, se disolvieron las muestras extraíbles con agua en una disolución amortiguadora universal con unos valores de pH de 2, 3, 7 y 11 para obtener unas disoluciones que presentaban unas concentraciones de oligosacáridos del 0.15% (p/v). La disolución amortiguadora universal se preparó a partir de una disolución inicial de 6,0 g de ácido cítrico, 3,9 g de dihidrogenofosfato potásico, 1,8 g de ácido bórico y 5.8 g de ácido dietilbarbitúrico en agua (1,0 l) (Britton & Welford, 1937). Los alícuotas (20 ml) de dicha disolución inicial se ajustaron con HCl 2,0 M o con NaOH 2,0 M para obtener el pH pretendido.

Cada una de las disoluciones de oligosacáridos se mantuvo en agua en ebullición durante unos períodos de tiempo distintos (0, 5, 10, 15, 20, 30 y 60 minutos). A continuación, se enfrió la disolución y se determinó el contenido glucídico total en monosacáridos y en grupos reductores terminales mediante cromatografía en gas - líquido tal como se ha descrito en Materiales y métodos del ejemplo 1. El porcentaje de degradación de los FOS se calculó con la fórmula (1), mientras que el porcentaje de degradación de los xilooligo-95P y AXOS-15-0,27 se calculó con la fórmula (2). El porcentaje de hidrólisis de los FOS y los xilooligo-95P y AXOS-15-0,27 se calculó con las fórmulas (3) y (4) respectivamente.

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El porcentaje de enlaces hidrolizados de xilosa y arabinosa en los AXOS-15-0,27 se calcularon mediante las fórmulas (5) y (6) respectivamente.

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Análisis sensitivos. Se realizaron los análisis sensitivos en una habitación silenciosa en sesiones que implicaban como máximo 10 voluntarios cada vez. Se pidió a los individuos que se abstuvieran de comer y beber durante como mínimo 1 h antes de empezar la sesión. Se pidió que los individuos participantes en el análisis se familiarizasen en primer lugar con los procedimientos y posteriormente se les pidió que saboreasen muestras codificadas con distintas concentraciones de xilooligo-95P y AXOS-15-0,27, sacarosa (estímulo dulce de referencia), cloruro sódico (estímulo salado de referencia) y ácido ascórbico (estímulo amargo de referencia) preparados en agua desionizada purificada (resistencia específica 18 m\Omega-cm). La disolución con la concentración más elevada de cada compuesto se numeró con la cifra 8 y la menos concentrada con la cifra 1 (Tabla 2). Se pidió a los participantes que saborearan consecutivamente una gama completa de concentraciones de un compuesto ordenada en concentraciones crecientes, pero el orden en que cada uno de los compuestos distintos se presentaba a cada individuo era aleatorio. Antes de probar la serie de concentraciones de un compuesto, se enjuagaban la boca dos veces con agua desionizada purificada (resistencia específica 18 m\Omega-cm) y a continuación se introducían 5 ml de cada disolución de ensayo en la boca del participante mediante una jeringuilla desechable, se paladeaban durante aproximadamente 5 segundos y a continuación se tragaban. Se pidió a los participantes que indicaran la concentración inferior a la que el sabor del compuesto se podía reconocer como dulce, salado o amargo (umbral de reconocimiento individual). El umbral de reconocimiento del sabor medio, determinado como la concentración a la que la mitad de los participantes reconocieron la calidad de sabor correcta de un compuesto particular, se calculó con los datos de los umbrales de reconocimiento individuales obtenidos a partir de 20 personas en total.

Determinaciones de la viscosidad. Se realizaron determinaciones de la viscosidad en la parte extraíble con agua de las preparaciones de oligosacáridos, que se obtuvo mediante la suspensión de las preparaciones en agua (1:10 p/v) y a continuación agitación (2 h, 18ºC), centrifugación (10.000 g, 20 minutos, 18ºC) y filtración. Tras liofilizar el filtrado, se determinó la viscosidad de un 5.0% (p/v) de la disolución con un viscosímetro de tipo Ostwald (Capillary Viscosimeter, Schott Gerate, Tipo 50904) a 30ºC según Vinkx et al. (1991). Las determinaciones de la viscosidad de la disolución se realizaron por triplicado y se expresaron en relación (\eta_{rel}) con la del agua desionizada dividiendo los períodos de flujo de cada una de las disoluciones de oligosacáridos por los períodos de flujo del agua desionizada en las mismas condiciones experimentales. Tras el cálculo de la viscosidad específica (\eta_{sp} = \eta_{rel} - 1), se determinó la viscosidad intrínseca aparente ([\eta_{app}], dl/g) utilizando la ecuación de Morris (Morris, 1984) tal como se indica en la fórmula (7) en la que c (expresada como mg/ml) representa la concentración de oligosacáridos, suponiendo que únicamente los oligosacáridos contribuyen a las propiedades viscosas de las disoluciones. Tras cada análisis, se lavó el viscosímetro dos veces con agua desionizada, dos veces con etanol al 95%, una vez con acetona y una vez con éter dietílico y posteriormente se secó con aire comprimido.

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Resultados y discusión

Se comparó la estabilidad del pH de los AXOS-15-0,27 con la de los compuestos prebióticos conocidos, fructooligosacáridos (FOS, producto comercial Raftilose) y xilooligosacáridos (XOS, producto comercial Xilooligo-95P). Se mantuvieron los distintos oligosacáridos a distintos valores de pH (pH 2, 3, 7 y 11) a 100ºC durante distintos períodos de tiempo. Se determinó la degradación en porcentaje mediante la medida del descenso en el contenido de los monosacáridos constituyentes, y se determinó la hidrólisis en porcentaje mediante la medida del aumento de la cantidad de monosacáridos constituyentes reductores. Tal como se representa en la figura 3, ninguno de los oligosacáridos experimentó una degradación sustancial a un pH bajo o neutro (pH de 2, 3 ó 7). Por otro lado, se observó degradación a un pH alcalino (pH de 11) en los 3 oligosacáridos analizados. Dicho efecto resultó más evidente en el caso del Xilooligo-95P, del que un 73% se había degradado tras 60 minutos. Los oligosacáridos más estables en condiciones alcalinas resultaron los AXOS-15-0,27 (Figura 3). La degradación observada a un pH alcalino se conoce como descamación alcalina, una reacción que se produce a temperaturas elevadas (60 a 100ºC) y evoluciona desde el extremo reductor del oligosacárido (Whistler & BeMiller, 1958; Santori et al., 2003).

De los tres oligosacáridos analizados, los FOS resultaron claramente los más sensibles a la hidrólisis a un pH bajo (figura 4). A un pH de 2 y un 3,58% y un 53% de FOS se hidrolizaron tras 60 minutos. El Xilooligo-95P y los AXOS-15-0,27 presentaron un nivel de hidrólisis equivalente a un pH de 2. Sin embargo, los AXOS-15-0,27 resultaron más estables a un pH de 3 que el Xilooligo-95P, con únicamente un 2% de hidrólisis de los AXOS-15-0,27 en comparación con el 6% del Xilooligo-95P (figura 4). Las investigaciones posteriores de la hidrólisis de los AXOS-15-0,27 a un pH bajo demostraron que los enlaces de la arabinosa resultan más susceptibles ante la hidrólisis ácida que los enlaces de la xilosa. De hecho, la incubación de los AXOS-15-0,27 a un pH de 2, 100ºC durante 60 minutos provocaron la hidrólisis del 54% de todos los enlaces de la arabinosa, mientras que únicamente el 4% de los enlaces de la xilosa se hidrolizaron en dichas condiciones (figura 5).

Se ha descrito que los xilooligosacáridos con un DP bajo tal como el Xilooligo-95P presentan un sabor dulce, con una dulzura aproximadamente del 40% de la de la sacarosa (Suntory, xilooligosacárido, guía informativa del producto, 2001). Hasta el momento no se conocen las propiedades del sabor de los arabinoxilooligosacáridos con un grado superior de polimerización. Con un grupo de análisis del sabor que consistía en 20 personas se ha determinado el umbral de reconocimiento del sabor de los AXOS-15-0,27 y el Xilooligo-95P. Las muestras del ensayo comprendían asimismo, sacarosa, cloruro sódico y ácido ascórbico como representantes de los sabores dulce, salado y amargo, respectivamente. Se pidió a los participantes que indicaran la concentración a la que reconocían un sabor como dulce, salado o amargo para la serie de concentraciones de cada compuesto del ensayo. Únicamente el 15% del grupo de análisis percibió un sabor dulce para los AXOS-15-0,27 con la concentración superior analizada (71,5 g/1), y ninguno de los participantes indicó un sabor salado o amargo. El umbral medio de reconocimiento del sabor para la dulzura de la sacarosa y el Xilooligo-95P fue de 7 y 24 g/l, respectivamente, mientras que el de los AXOS-15-0,27 es superior a 71,5 g/l. Los AXOS-15-0,27 resultan por lo tanto más de 10 veces menos dulces que la sacarosa y más de 3 veces menos dulces que el Xilooligo-95P, que por sí mismo es menos dulce que la sacarosa.

Se determinó la viscosidad para los AXOS-15-27, AXOS-39-0,22 y AXOS-13-0,21, y se comparó con la de los fructooligosacáridos (FOS, producto comercial Raftilose) y los xilooligosacáridos (XOS, producto comercial Xilooligo-95P). Tal como se representa en la Tabla 3, las distintas preparaciones de AXOS presentan una viscosidad intrínseca aparente superior que es de 3 a 10 veces superior con respecto a los FOS y el Xilooligo-95P.

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Ejemplo 3

Fraccionamiento de preparaciones de AXOS por ultrafiltración Materiales y métodos

Preparación de AXOS. Se preparó WU-AX secundario tal como se ha descrito en Materiales y métodos del ejemplo 1. El WU-AX secundario se suspendió en una disolución amortiguadora de acetato de sodio (25 mM, pH 4.7) a 3 g/l y se incubó con XAA, una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca), a 18,4 U por g de WU-AX secundario durante 4 h a 30ºC. Tras la inactivación de los enzimas mediante ebullición durante 30 minutos y la posterior filtración de la suspensión, se recuperaron los AXOS en el filtrado.

Separación de los AXOS por ultrafiltración. Se fraccionaron los AXOS en un dispositivo de ultrafiltración "HP4750 con célula de agitación" terminal (Sterlitech Corporation, Kent, EE. UU.). Las membranas de ultrafiltración utilizadas presentaban un límite de masa molecular (MMCO) de 5 kDa (P005F, Celgard, Wiesbaden, Alemania), 10 kDa (PES-10, Synder Filtration, Vacaville, CA, EE. UU.), o 30 kDa (PES-030H, Celgard). La polarización de la concentración en la superficie de la membrana se minimizó con un mecanismo de barra agitadora magnética recubierta con teflón que se dispuso en una posición central en la célula y presentaba una velocidad de agitación de 700 rpm. La fuente de presión era una botella de nitrógeno gaseoso comprimido. La presión se controló mediante un presóstato y se realizaron todos los experimentos de filtración a una presión constante de 4 bar a temperatura ambiente. La célula de ultrafiltración terminal se llenó con 300 ml de la disolución a fraccionar y se detuvo la filtración cuando se hubo recogido un volumen total aproximadamente de 200 ml de filtrado.

Caracterización de las preparaciones aisladas. Véase Materiales y métodos del ejemplo 1. Se realizó la cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento (HPSEC) tal como se ha descrito en Materiales y métodos del ejemplo 1, exceptuando que se utilizó una columna de HPSEC Shodex SB-802.5 HQ (Showa, Denko K. K., Tokyo, Japón, 300 x 8 mm, intervalo de separación: 1 x 10^{2} -1 x 10^{4} Da). Los marcadores de masa molecular fueron pululanos estándar Shodex P-82 (2.0 mg/ml) con unas masas moleculares de 11,2 x 10^{4}, 4,73 X 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59 x 10^{3} Da, xilooligosacáridos estándar con una masa molecular de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da.

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Resultados y discusión

La presencia de oligosacáridos con una baja masa molecular dulces y metabolizables en las preparaciones de AXOS puede resultar inconveniente para aplicaciones particulares como componente alimentario, mientras que para otras aplicaciones se puede pretender utilizar preparaciones de AXOS de sabor dulce que comprendan principalmente oligosacáridos con una baja masa molecular. Por este motivo resulta útil desarrollar un método que permite fraccionar preparaciones de AXOS de tal modo que los AXOS/XOS con un DP de 2 a 3 se separan de los AXOS con un DP superior. El fraccionamiento de los arabinoxilanos se ha realizado anteriormente mediante la precipitación con disoluciones alcohólicas con concentraciones distintas (Courtin & Delcour, 1998). Sin embargo, la aplicación de la precipitación con alcoholes a escala industrial resulta técnica y económicamente poco atractiva. Por lo tanto, se investigó la viabilidad del fraccionamiento enzimático adicional de los AXOS producidos por ultrafiltración.

A título de ejemplo, AXOS preparados mediante incubación de WU-AX secundario con XAA (18.4 U/g) durante 4 h a 30ºC se sometieron a ultrafiltración utilizando membranas con un límite de masa molecular (MMCO) de 5 kDa, 10 kDa, o 30 kDa.

Cuando se utiliza la membrana de 5 kDa, el perfil de HPSEC de la fracción del filtrado (PER_{5 \ kDa}) (Figura 7a) presenta principalmente oligosacáridos que corresponden al tamaño de la xilobiosa (DP2) y la xilotriosa (DP3). La fracción retenida (RET_{5 \ kDa}), que contiene un 86% de arabinoxilanos solubles de la disolución inicial de AXOS (Tabla 4), presenta básicamente la misma masa molecular que la preparación de AXOS antes de la ultrafiltración, exceptuando que la cantidad de oligosacáridos con DP2 y DP3 se reduce aproximadamente a la mitad (Figura 7a). La eliminación incompleta de los oligosacáridos con un DP bajo de la fracción RET_{5 \ kDa} tiene como resultado su retención como consecuencia de los flujos disminuidos del filtrado provocados por la presencia de componentes con una masa molecular elevada.

Mediante la ultrafiltración realizada utilizando una membrana de 10 kDa, el 34% del contenido de arabinoxilanos se recuperó en la fracción del filtrado, mientras que el 65% se retuvo en la fracción del filtrado (Tabla 4). La fracción del filtrado (PER_{10 \ kDa}) contenía principalmente oligosacáridos con DP2 a DP6.

La fracción retenida (RET_{10 \ kDa}) presentaba un nivel bajo de oligosacáridos de tamaño pequeño con un DP de 2 a 4, y consistía principalmente en monosacáridos con una masa molecular comprendida entre 700 y >110.000 Da (DP5 a DP>850) (Figura 7b). En comparación con la fracción PER_{10 \ kDa}, el filtrado obtenido con la membrana de 30 kDa (PER_{30 \ kDa}) presentaba un contenido superior en oligosacáridos del intervalo de 1000 a 10.000 Da. Correspondientemente, la fracción retenida de la membrana de 30 kDa (RET_{30 \ kDa}) presentaba un contenido inferior de oligosacáridos del intervalo de 1000 a 10.000 Da en comparación con RET_{10kDa}, pero sorprendentemente el contenido de oligosacáridos de DP2 y DP3 resultó superior en RET_{30 \ kDa} que en RET_{10 \ kDa}.

Observando la Tabla 4 resulta evidente que la ultrafiltración influye en la proporción A/X de las fracciones AXOS obtenidas. Las fracciones del filtrado (PER_{5 \ kDa}, PER_{10 \ kDa} y PER_{30 \ kDa}) se enriquecieron con oligosacáridos con una proporción A/X relativamente baja, mientras que las fracciones retenidas (RET_{5 \ kDa}, RET_{10 \ kDa} y RET_{30 \ kDa}) contenían componentes con una proporción A/X superior.

Para analizar la posibilidad de un fraccionamiento adicional de los AXOS por ultrafiltración, se sometió la fracción RET_{10kDa} a un segundo proceso de ultrafiltración en el que se utilizó una membrana con un MMCO de 30 kDa. Los perfiles de HPSEC de la fracción del filtrado (PER_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa}) y de la fracción retenida (RET_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa}) obtenidos tras la ultrafiltración de la RET_{10 \ kDa} a través de una membrana con un MMCO de 30 kDa se presentan, junto con la fracción PER_{10 \ kDa}, en la figura 8.

La fracción RET_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa} contiene principalmente componentes con una masa molecular elevada (> 20.000 Da) que aparecen en el volumen vacío de la columna Shodex SB-802.5 HQ. La fracción PER_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa}, que representa aproximadamente el 25% de los arabinoxilanos de la disolución inicial de AXOS (Tabla 5), consiste principalmente en oligosacáridos de tamaño medio con una masa molecular comprendida entre 700 y 10.000 Da (DP 5 a 75) (figura 8).

Dichos resultados indican que la ultrafiltración, utilizando preferentemente una membrana con un MMCO de 10 kDa se puede utilizar como método para realizar preparaciones de AXOS con tanto un contenido elevado en oligosacáridos con un DP2 - 6, tomando el filtrado de la ultrafiltración, como con un contenido elevado de oligosacáridos con un DP > 4 y un bajo contenido de DP2 - 4, tomando el retenido de la ultrafiltración. La ultrafiltración consecutiva, utilizando preferentemente el retenido de una membrana de 10 kDa y pasando el mismo por una membrana de 30 kDa, se puede utilizar para obtener una fracción de AXOS enriquecida en AXOS comprendidos entre un DP de 5 a 75.

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Ejemplo 4

Efecto de las preparaciones de AXOS en los intestinos de pollos Materiales y métodos

Preparaciones de oligosacáridos. Véase Materiales y métodos del ejemplo 1.

Análisis microbiológicos mediante recuento de placas. El contenido cecal de los pollos se pesó, se diluyó 1:10 en una disolución salina fisiológica de peptona estéril (PPSS; bactopeptona al 0.1 %, NaCl al 0.85%), se homogeneizó en un dispositivo de digestión y se diluyó adicionalmente en PPSS según un esquema de dilución décuplo. A continuación se cultivaron en placa las diluciones apropiadas utilizando la técnica de vertido en placa en agar con glucosa, bilis y rojo violeta (VRBG; Oxoid CM0485B, Basingstoke, Reino Unido) para el recuento de enterobacterias, y en agar anaeróbico Wilkins-Chalgren (Oxoid CM619) modificado mediante la adición de ácido acético glacial (1 ml/l) y mupirocina (100 mg/1) para las bifidobacterias. Las últimas modificaciones mejoran la selectividad del agar de Wilkins-Chalgren agar para las bifidobacterias, y el agar de Wilkins-Chalgren modificado resultó particularmente apropiado para la determinación en una etapa del recuento de bifidobacterias en el ciego de pollos (Rada et al., 1999; Rada & Petr, 2000). Se realizó el recuento de las colonias tras 1 día de incubación aeróbica a 37ºC para las enterobacterias, y tras 4 días de incubación anaeróbica (en frascos anaeróbicos con el sistema anaerógeno Oxoid AN0025A) a 37ºC para las bifidobacterias. Los recuentos se expresaron en g por contenido cecal. Se tomaron diversas precauciones para minimizar la exposición de las bifidobacterias al oxígeno durante la preparación de las muestras: (i) el contenido cecal se retiró del ciego únicamente antes de iniciar la preparación de la muestra; (ii) los diluyentes y los agares se sometieron al autoclave o a ebullición justo antes de utilizarlos para retirar el oxígeno disuelto; (iii) las placas para los recuentos de bifidobacterias se dispusieron en una atmósfera anaeróbica 2 h a partir del inicio de la preparación de la muestra.

Análisis microbiológicos mediante PCR cuantitativa. La extracción del ADN se realizó tal como describen Van de Wiele et al. (2004) en muestras cecales diluidas 1:5 en PPSS. Se realizó la amplificación en 25 \mul de mezclas de reacciones utilizando disoluciones amortiguadoras enriquecidas con los reactivos SYBR® Green PCR Core tal como describen los proveedores (PE Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d Ijssel, Holanda) en placas de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical con tapones ópticos (PE Applied Biosystems). Se utilizaron los cebadores directos e inversos, BIF164f y BIF163r respectivamente (Satokari et al., 2001) a una concentración de 1 \muM para la detección de copias de los genes de ARN ribosómico 16S de las bacterias del género Bifidobacterium. El programa de temperaturas de la PCR fue el siguiente: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, a continuación 40 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 1 minuto y 60ºC durante 1 minuto. El molde de ADN se amplificó en mezclas de reacción por triplicado y se realizó el seguimiento con un dispositivo ABI Prism SDS7000 (PE Applied Biosystems). Las curvas normales se construyeron basándose en la amplificación por PCR en tiempo real en reacciones cuádruples en cuatro diluciones distintas de ADN obtenido a partir de un cultivo de Bifidobacterium breve (cepa LMG11042). Los datos de la PCR en tiempo real para las muestras experimentales se trazaron en comparación con la curva normal y se corrigieron con respecto a la eficiencia de la extracción del ADN utilizando un factor que consistía en la concentración del ADN de la muestra experimental con la mayor concentración de ADN dividido por la concentración de ADN de cada muestra experimental individual.

Análisis estadísticos. El efecto de las distintas dietas en la masa corporal, la ingesta alimentaria o la composición microbiana de los intestinos de los animales se analizó mediante análisis de la varianza unifactorial a un nivel de confianza del 95% utilizando el software Analyse-it, versión 1.71. En el caso de que se observase un efecto estadísticamente significativo para el factor dieta, se analizaron las diferencias entre dietas tanto mediante el test de diferencias menos significativas (LSD) o mediante el test de Tukey a un nivel de confianza del 95%.

Resultados y discusión

El efecto de la adición de preparaciones obtenidas a partir de distintos (arabino)xilanos se analizó con respecto a la composición de los intestinos gruesos de los pollos.

Para un primer experimento, se adquirieron pollos de 64 días de edad (gallos Ross) de un criadero comercial (Avibel, Teilt, Bélgica) y se distribuyeron en 4 corrales (16 pollos por corral). En cada corral existía un abrevadero y un depósito para los alimentos de 1 m. La temperatura del establo era de 35ºC cuando llegaron las aves y se disminuyó posteriormente 1ºC cada 2 días. Los animales se mantuvieron con un fotoperíodo de 23 horas de luz y 1 hora de oscuridad.

Las comidas (1 comida por corral) y el agua potable se administraron a discreción. La duración del experimento fue de 14 días.

Se analizaron los siguientes alimentos experimentales:

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Pienso de control

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Pienso de control + preparación de AXOS-7-0,34 al 0,25% (0,17% de AX puro)

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Pienso de control + preparación de AXOS-122-0,66 al 0,25% (0,18% de AX puro)

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Pienso de control + Xilooligo-95P al 0,25% (0,22% de AX puro)

Las concentraciones indicadas entre corchetes se corrigieron con respecto a su pureza calculada por su contenido en AX. El pienso de control consistía en un pienso inicial comercial (Krix 0, Hendrix UTD, Boxmeer, Holanda) que contenía una mezcla enzimática de xilanasa y glucanasa (Roxazyme) como aditivo.

Se pesaron todos los animales a la edad de siete días y se seleccionaron al azar 8 animales por grupo y se sacrificaron por decapitación. A continuación se disecaron los animales para extraer los ciegos. Se vaciaron los ciegos y los contenidos se reunieron en dos grupos por tratamiento (cuatro ciegos cada uno). Se repitió dicho protocolo cuando los animales restantes alcanzaron la edad de catorce días, exceptuando que los ciegos se reunieron en tres grupos por tratamiento (de tres, tres y dos animales cada uno).

En el caso de los animales del grupo de los AXOS-7-0,34 no se observaron diferencias significativas en el peso corporal con respecto al grupo de control. Los animales del grupo de los AXOS-122-0,66 y el Xilooligo-95P presentaron un peso corporal significativamente inferior al grupo de control tras siete días, pero en los animales analizados tras 14 días la diferencia con el control no era significativa. En el caso del grupo de los AXOS-122-0,66 el peso corporal relativamente inferior tras 7 días se podría deber a un peso corporal significativamente inferior de los pollos de este grupo en la eclosión.

El análisis de la flora microbiana cecal de los pollos indicó unos niveles elevados de enterobacterias (aproximadamente 10^{8} - 10^{9} / g del contenido cecal), tanto tras 7 días como tras 14 días de alimentación, y no se observaron diferencias significativas con respecto a ninguno de los tratamientos. Los niveles de bifidobacterias tras 7 días eran bajos en todos los grupos de tratamiento (aproximadamente 10^{2} - 10^{3} / g del contenido cecal) (figura 9), exceptuando los animales del grupo del Xilooligo-95P en los que el nivel de bifidobacterias era muy superior (aproximadamente 10^{8} / g del contenido cecal). Tras 14 días el número de bifidobacterias en el ciego permanecía bajo en el grupo de control. En cambio, se observó un claro incremento en el número de bifidobacterias (en un factor aproximadamente de 10^{5}) del contenido cecal del grupo de los AXOS-7-0,34. En el grupo del Xilooligo-95P, el nivel de bifidobacterias era ligeramente inferior con respecto al nivel tras 7 días, pero tras 14 días era significativamente superior que para el grupo de control. En el grupo de los AXOS-122-0,66 se produjo un incremento moderado del número de bifidobacterias del contenido cecal tras 14 días, aunque dicho incremento no era significativo con respecto al grupo de control.

Para un segundo experimento con pollos, se adquirieron pollos de 54 días de edad (gallos Ross) de un criadero comercial (Avibel, Teilt, Bélgica) y se distribuyeron en 6 corrales (9 pollos por corral). Las condiciones de los corrales fueron las descritas en el primer experimento (véase anteriormente).

La duración del experimento fue de 14 días:

Se analizaron los siguientes alimentos experimentales:

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Pienso de control

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Pienso de control + preparación de AXOS-15-0,27 al 0,141% (0,1% de AX puro)

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Pienso de control + preparación de AXOS-15-0,27 al 0,352% (0,25% de AX puro)

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Pienso de control + preparación de FOS al 0,263% (0,25% de FOS puros)

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Pienso de control + preparación de FOS al 1,053% (1% de FOS puros)

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Pienso de control + preparación de xilanasa al 0,01%

Las concentraciones indicadas entre corchetes se corrigieron con respecto su pureza calculada por su contenido en AX o FOS. La preparación de FOS fue el producto comercial Raftilose (Orafti, Tienen, Bélgica). La preparación de xilanasa fue el producto comercial Belfeed (Beldem, Groot-Bijgaarden, Bélgica). La composición del pienso de control se proporciona en la Tabla 6. A la edad de 14 días todos los animales se pesaron y se sacrificaron por decapitación. A continuación se disecaron los animales para extraer los ciegos y los contenidos de los ciegos se reunieron para 3 animales que pertenecían al mismo grupo de tratamiento. El número de bifidobacterias en las muestras cecales reunidas se determinó mediante PCR cuantitativa.

Tras dos semanas de alimentación con las dietas respectivas, no se pudieron observar diferencias significativas en el peso corporal entre los distintos tratamientos. Con respecto al número de bifidobacterias en el ciego de los pollos tras 2 semanas, únicamente los pollos alimentados con la dieta que contenía AXOS-15-0,27 al 0,25% presentaron diferencias significativas con respecto al tratamiento de control (figura 10).

El número de bifidobacterias en los pollos alimentados con AXOS-15-0,27 al 0,25% resultó 22 veces superior al de los pollos alimentados con la dieta de control. Se ha de indicar que los fructooligosacáridos (FOS), un compuesto prebiótico bien documentado que se incluyó con propósitos comparativos, no provocó un incremento del número de bifidobacterias en los ciegos de los pollos, incluso con una dosis 4 veces superior a la que los AXOS-15-0,27 resultan efectivos. Ello indica que los AXOS-15-0,27 constituyen un compuesto bifidogénico sorprendentemente potente.

Las bifidobacterias se han asociado positivamente a la salud en animales y en seres humanos y son componentes de muchos compuestos probióticos. Ha existido un interés creciente en enriquecer selectivamente dichas poblaciones bacterianas en el tracto gastrointestinal, además de proporcionar alimentos directamente con preparaciones microbianas, para fomentar o mantener un estado de salud positivo en animales y en seres humanos, comprendiendo un efecto inhibidor en el cáncer colorrectal (Van Loo et al, 2004). Los resultados de los ensayos de alimentación con pollos indican que todos los alimentos que contienen arabinoxilanos estimularon la presencia de bifidobacterias en los ciegos de los pollos. La preparación de AXOS con un grado de polimerización elevado, AXOS-122-0,66, provocó únicamente un incremento moderado no significativo en la población de bifidobacterias del ciego de los pollos. Por otro lado, las preparaciones con un grado de polimerización entre bajo e intermedio, Xilooligo-95P, AXOS-7-0,34 y AXOS-15-0,27 provocaron un incremento potente y significativo en las bifidobacterias sin provocar una disminución del peso corporal de los animales. La respuesta al Xilooligo-95P se pudo observar ya tras 7 días, mientras que los AXOS-7-0,34 y AXOS-15-0,27 provocaron únicamente una respuesta bifidogénica tras 14 días. Ello indica que el Xilooligo-95P se fermenta más rápidamente por las bifidobacterias que las preparaciones de AXOS-7-0,34 y AXOS-15-0,27 que presentan un grado medio de polimerización superior y un grado medio de sustitución superior.

La fermentación lenta mediante bacterias beneficiosas seleccionadas constituye una propiedad pretendida de un compuesto prebiótico para su aplicación en seres humanos y otros animales con unos intestinos largos. La fermentación lenta por parte de las bacterias intestinales incrementa la fracción del compuesto prebiótico que no se consume completamente tras pasar por las partes proximales del colon y por lo tanto se puede utilizar como sustrato para la fermentación por parte de las bacterias apropiadas en las partes distales del colon. En los seres humanos la incidencia del cáncer en las partes distal y rectal del colon, tomadas en conjunto, son superiores a las de las partes proximales del colon (http://www.state.nj.us/health/cancer/cr/subsites.htm), y resulta por lo tanto importante que los compuestos prebióticos puedan estimular la flora intestinal beneficiosa del colon distal y del recto.

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Ejemplo 5

Efecto de las preparaciones de AXOS en los intestinos de ratas Materiales y métodos

Preparaciones de oligosacáridos. Véase Materiales y métodos del ejemplo 1.

Análisis microbiológicos mediante PCR cuantitativa. Véase Materiales y métodos del ejemplo 4. Análisis de los ácidos grasos de cadena corta. Se obtuvieron muestras intestinales con 5 volúmenes de agua/ácido fosfórico/ácido fórmico (91/1,8/0,2, v/v/v) y se clarificaron por centrifugación (22.000 g, 10 minutos). Los ácidos grasos de cadena corta (SFCA) se analizaron mediante cromatografía en gas - líquido (Shimadzu, GC 14A) en una columna empaquetada con Chromosorb W (tamaño de malla 60/30; Supelco, Bellefonte, EE. UU.) y se detectaron mediante ionización de llama. Se calcularon las concentraciones de SCFA basándose en estándares con concentraciones conocidas de ácidos distintos. El ácido caprónico se utilizó como estándar interno.

Análisis estadísticos. El efecto de las distintas dietas en la masa corporal, la ingesta alimentaria, los SCFA o la composición microbiana de los intestinos de los animales se analizó mediante análisis de la varianza unifactorial a un nivel de confianza del 95% utilizando el software Analyse-it, versión 1.71. En el caso de que se observase un efecto estadísticamente significativo para el factor dieta, se analizaron las diferencias entre dietas tanto mediante el test de diferencias menos significativas (LSD) a un nivel de confianza del 95%.

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Resultados y discusión

Para un primer experimento, se adquirieron 40 ratas de 6 semanas de edad (Wistar) en Elevage Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia) y se alojaron en jaulas con el fondo da alambre de acero (2 ratas por jaula) en un recinto con el ambiente controlado (22ºC) con un ciclo de luz - oscuridad de 14 - 10 h. Se permitió el acceso libre de las ratas al agua y a los gránulos (10 mm) de una "dieta humanizada básica" durante 7 días. La composición de la "dieta humanizada básica" se proporciona en la Tabla 7. Tras 7 días de adaptación a la dieta humanizada básica, las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de los 5 grupos distintos de tratamiento (8 ratas/grupo) y en cada uno de los grupos se permitió el acceso libre a los gránulos (10 mm) de una de las siguientes dietas durante 13 días:

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Dieta humanizada básica

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Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-122-0,66 al 0,70% (0,5% de AX puro)

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Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-16- 0,78 al 0,69% (0,5% de AX puro)

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Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-15-0,27 al 0,73% (0,5% de AX puro)

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Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-8-0,27 al 0,72% (0,5% de AX puro)

Las concentraciones indicadas entre corchetes se corrigieron con respecto a su pureza calculada por su contenido en AX. En el caso de las dietas que contenían AXOS, el almidón de la dieta humanizada básica se sustituyó con la cantidad apropiada de AXOS.

Se pesaron los animales y se determinó la ingesta alimentaria 3 veces por semana. Tras 13 días de tratamiento se pesaron todos los animales y se les practicó la eutanasia con una sobredosis de Nembutal. A continuación se disecaron los animales para recoger las heces. Se recogieron las heces como gránulos desde el colon distal hasta el ano. Se reunieron las heces por cada 2 animales que pertenecían al mismo grupo de tratamiento y se analizaron con respecto al contenido en SCFA.

La ingesta alimentaria durante el período de tratamiento se encontraba comprendida entre 18,9 y 27,7 g/día con una media de 22,7 g/día. Los pesos corporales iniciales de las ratas en el inicio del tratamiento fueron en promedio de 262,0 g y los pesos corporales finales tras 13 días de tratamiento fueron en promedio 375,3 g. No se observaron diferencias significativas en el peso corporal o la ingesta alimentaria entre los distintos tratamientos.

Debido a que unos niveles aumentados de SCFS constituyen la característica distintiva de los cambios en la flora microbiana intestinal provocados por la ingesta de compuestos prebióticos (Van Loo, 2004), se ha determinado el contenido en SCFA de las heces para los distintos grupos de tratamiento. Tal como se ilustra en la figura 11, el nivel de propionato de las heces de las ratas alimentadas con AXOS-8-0,27, AXOS-15-0,27 y AXOS-16-0,78 resultó significativamente superior al del grupo de control o al del grupo de los AXOS-122-0,66. Se observó asimismo una tendencia a unos niveles aumentados de acetato y de butirato en las heces en los grupos de los AXOS-8-0,27, AXOS-15-0,27 y AXOS-16-0,78.

Los SCFA tales como el acetato, el propionato y el butirato se producen como capas electrónicas del metabolismo respiratorio de las bacterias en el ambiente anaeróbico del intestino. Se conoce que los compuestos prebióticos incrementan los niveles de SCFA en el intestino grueso. Se pretenden unos niveles elevados de SCFA debido a que reducen el pH del contenido intestinal y de este modo limitan el crecimiento de bacterias putrefactivas potencialmente patógenas. La disminución del pH intestinal implica asimismo un incremento de la solubilidad y de la biodisponibilidad de los minerales calcio y magnesio (Teitelbaum & Walker, 2002). Los ácidos grasos de cadena corta, especialmente el butirato, estimulan además las células epiteliales del colon, incrementando de este modo la capacidad de absorción del epitelio (Topping & Clifton, 2001).

El hecho de que no se observaron diferencias significativas entre las ratas tratadas con AXOS-15-0,27 o AXOS-16-0,78, dos preparaciones con aproximadamente el mismo grado medio de polimerización pero con una distinta proporción A/X, indica que el grado de sustitución no ejerce un impacto importante en la capacidad de los AXOS para estimular la fermentación bacteriana en el colon. Por otro lado, cuando se comparan los efectos de los AXOS-16-0,78 y los AXOS-122-0,66, dos preparaciones con aproximadamente el mismo grado de sustitución pero con un grado de polimerización distinto, resulta claro que las preparaciones de AXOS con un grado elevado de polimerización tales como las de AXOS-122-0,66 constituyen compuestos prebióticos menos potentes que las preparaciones con un grado medio inferior de polimerización. Por lo tanto, las preparaciones de AXOS con un grado medio de polimerización inferior a 120 constituyen los compuestos prebióticos preferidos. En el caso que se prefiera una fermentación lenta, a fin de incrementar la disponibilidad de los AXOS en el colon distal y el recto, se prefieren las preparaciones de AXOS con un grado medio de polimerización superior a 4.

Para un segundo experimento, se adquirieron 24 ratas machos de 6 semanas de edad (Wistar) en Elevage Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia) y se alojaron en jaulas con el fondo da alambre de acero (2 ratas por jaula) en un recinto con el ambiente controlado (22ºC) con un ciclo de luz - oscuridad de 14 - 10 h. Se permitió el acceso libre de las ratas al agua y a los gránulos (10 mm) de una "dieta humanizada básica" durante 6 días. La composición de la "dieta humanizada básica" se proporciona en la Tabla 7. Tras 6 días con la dieta humanizada básica, las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de los 3 grupos distintos de tratamiento (8 ratas/grupo) y en cada uno de los grupos se permitió el acceso libre a los gránulos (10 mm) de una de las siguientes dietas:

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Dieta humanizada básica

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Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-15-0,27 al 5,87% (4% de AX puro)

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Dieta humanizada básica + preparación de Xilooligo-95P al 5,26% (4% de AX puro)

Las concentraciones indicadas entre corchetes se corrigieron con respecto a su pureza calculada por su contenido en AX. En el caso de las dietas que contenían AXOS-15-0,27 o Xilooligo-95P, el almidón de la dieta humanizada básica se sustituyó con la cantidad apropiada de AXOS.

Se pesaron los animales y se determinó la ingesta alimentaria 3 veces por semana. Tras 14 días de tratamiento se pesaron todos los animales, se les practicó la eutanasia con una sobredosis de Nembutal y a continuación se disecaron los animales para extraer el colon proximal, el ciego y el colon distal. Se reunieron los contenidos del ciego por cada 2 animales que pertenecían al mismo grupo de tratamiento y se analizaron con respecto a la cantidad de bifidobacterias mediante PCR cuantitativa. Los contenidos del colon proximal y el colon distal se reunieron por cada 2 animales que pertenecían al mismo grupo de tratamiento y se analizaron con respecto al contenido de
SCFA.

En el colon proximal, los niveles de SCFA resultaron muy inferiores a los del colon distal y únicamente el acetato superó el umbral de detección de las muestras del colon proximal. Por lo tanto, únicamente se pudieron obtener datos para el acetato en el colon proximal y para el acetato, el propionato y el butirato en el colon distal. Ninguno de los tratamientos tuvo como resultado un efecto significativo en los niveles de los SCFA a un nivel de probabilidad del 95%. Sin embargo, se pudieron observar unas tendencias claras a partir de los datos. Tal como se ilustra en la figura 12, los grupos de los AXOS-15-0,27 y Xilooligo-95P presentaron unos niveles superiores de acetato y de butirato, pero no de propionato, en comparación con el grupo de control. El efecto más notable se observó para el butirato en el colon distal, para el que el incremento relativo con respecto al grupo de control fue del 58% en el grupo de los AXOS-15-0,27 y del 34% en el grupo del Xilooligo-95P. El efecto más intenso de los AXOS-15-0,27 con respecto al Xilooligo-95P se observó para todos los SCFA en el colon distal. Resulta interesante que el Xilooligo-95P provoco el incremento más importante de acetato en el colon proximal, mientras que los AXOS-15-0,27 provocaron el aumento más importante en el colon distal.

La cantidad de bifidobacterias incrementó significativamente en los ciegos de las ratas tras alimentarla, tanto con AXOS-15-0,27 como con Xilooligo-95P en comparación con las ratas a las que se administró la dieta de control. El incremento más elevado en las bifidobacterias cecales se observó en el grupo de los AXOS-15-0,27 (1,08 unidades logarítmicas o 12 veces superior con respecto al grupo de control, figura 13).

Los resultados indican que los AXOS-15-0,27 son un compuesto prebiótico más potente que el Xilooligo-95P. Los datos indican asimismo que los AXOS-15-0,27 se fermentan más lentamente que el Xilooligo-95P ya que el Xilooligo-95P provoca un efecto más importante en los SCFA del colon proximal mientras que los AXOS-15-0,27 provocaron un efecto más importante en el colon distal. Se observó asimismo una fermentación más lenta de los AXOS-15-0,27 en comparación con el Xilooligo-95P en los experimentos con pollos presentados en el ejemplo 5. Se pretenden las propiedades de una fermentación lenta de los AXOS-15-0,27 debido a que tienen como resultado más compuesto prebiótico que alcanza el colon distal, donde pueden ejercer sus efectos beneficiosos y la presunta inhibición de la carcinogenia.

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Ejemplo 6

Efecto de las preparaciones de AXOS en los intestinos de seres humanos Materiales y métodos

Preparaciones de AXOS-15-0,27 y WPC. Véase Materiales y métodos del ejemplo 1.

Análisis microbiológicos mediante PCR cuantitativa. Véase Materiales y métodos del ejemplo 4.

Participantes. Ninguno de los voluntarios que participaron en los experimentos presentaban un historial de enfermedades gastrointestinales o metabólicas o de cirugía previa. Los participantes no presentaban tratamiento con antibióticos o cualquier otro medicamento que influyese en el tránsito intestinal o en la flora intestinal durante por lo menos los 3 meses previos al inicio del estudio. Ninguna de las mujeres se encontraba embarazada durante los experimentos. No se impusieron dietas estándar a los voluntarios. Sin embargo, se les pidió que mantuvieran una pauta alimentaria regular hasta el final del período de estudio y que evitasen ingestas excesivas de productos lácticos fermentados y de componentes alimentarios que contuvieran unas cantidades elevadas de hidratos de carbono fermentables. El Comité de Ética de la Universidad de Leuven autorizó los experimentos y todos los participantes presentaron autorización por escrito.

Sustratos marcados. Se sintetizó lactosa-[^{15}N, ^{15}N]-ureido según el método de Schoorl tal como lo modificó Hofmann (1931) con [^{15}N,^{15}N]urea obtenida en Euriso-top (Saint-Aubin, Francia). El macrogol marcado (polietilénglico) con ^{3}H (^{3}H-PEG) se obtuvo en New England Nuclear Life Science Products (Boston, MA, EE. UU.).

Determinación del N_{tot} y el ^{15}N urinarios y fecales. El contenido total de N y el enriquecimiento en ^{15}N de la orina y las heces se determinaron utilizando un analizador elemental (ANCA-SL; PDZ, Cheshire, Reino unido) acoplado tanto con un detector conductor térmico (TCD; PDZ) como con un espectrómetro de masas por relación de isótopos. Se oxidó un volumen conocido de orina (15 \mul) o una masa conocida de heces (aproximadamente 5 a 7 mg de heces liofilizadas) en presencia de oxígeno a 1.000ºC. Los productos de la combustión se pasaron a continuación por un segundo horno que contenía cobre a 600ºC en el que se absorbió el exceso de oxígeno y se redujeron los óxidos de nitrógeno a nitrógeno elemental. El contenido total de nitrógeno se determinó mediante un detector TCD, mientras que el enriquecimiento en ^{15}N se determinó mediante un detector IRMS, acoplado a una unidad de combustión del analizador elemental. La proporción del isótopo ^{15}N con respecto al ^{14}N del N se determinó con respecto a un estándar de laboratorio calibrado (es decir una disolución de sulfato de amonio estándar). El porcentaje de la dosis administrada de ^{15}N recuperado se calculó del siguiente modo (Evenepoel et al., 1999):

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siendo mg excedente

9

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y

AP_{t}: el enriquecimiento en ^{15}N determinado de una muestra de orina específica, expresado en porcentaje atómico (AP)

AP_{bas}: el enriquecimiento en ^{15}N de una muestra de orina basal (expresado en AP)

N_{tot}: el contenido de nitrógeno total en una muestra de orina específica.

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En el caso de las muestras de orina, el porcentaje de la dosis administrada de ^{15}N se acumuló durante el período de 0 a 48 h tras la alimentación de ensayo, mientras que en el caso de las muestras fecales, el porcentaje de la dosis administrada de ^{15}N se acumuló durante el período de 0 a 72 h tras la alimentación de ensayo. Se realizó una corrección para las diferencias en el período de tránsito bucofecal para las muestras fecales. Ello se realizó dividiendo el porcentaje acumulado de la dosis administrada de ^{15}N recuperado en 72 h por el porcentaje acumulado de la dosis administrada de ^{3}H-PEG recuperado en 72 h. El contenido de ^{3}H-PEG en las heces se determinó mediante recuento del centelleo en líquido (espectrómetro de centelleo en líquido Tricarb, modelo 3375; Packard Instruments, Downers Grove, IL, EE. UU.) tras la oxidación a ^{3}H-H_{2}O (oxidante de muestras Packard, modelo 307).

Determinación de los compuestos fenólicos urinarios. El contenido total en p-cresol y fenol se determinaron mediante la tecnología de cromatografía en gas - líquido - espectrometría de masas (GC - MS). El pH de 950 ml de orina se ajustó a un pH de 1 con H_{2}SO_{4} concentrado. Se calentó dicha disolución durante 30 minutos a 90ºC para desproteinizar e hidrolizar los fenoles conjugados. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se añadieron 50 ml de 2,6-dimetilfenol (20 mg/100 ml) como estándar interno. Los fenoles se extrajeron con 1 ml de acetato de etil. Se secó la capa de acetato de etilo con Na_{2}SO_{4} y se analizaron 0,5 ml de dicha disolución mediante GC-MS (Trace GC-MS, Thermo Finnigan, San José, CA, EE. UU.). LA columna analítica era una AT5-MS (Alltech Associates, Deerfield, IL, EE. UU.) de 1 \mul de 30 m x 0.32 mm de diámetro interno. Se utilizó gas helio de grado GC como vehículo con un caudal constante de 1,3 ml/min. La temperatura del horno se programó desde 75ºC (isotérmica durante 5 minutos), y se incrementó en 10ºC/min hasta 160ºC y en 20ºC/min hasta 280ºC. Se realizó la espectrometría de masas en el modo de rastreo completo de impacto de electrones desde m/z 59 hasta m/z 590 a dos rastreos/s. Los resultados para el p-cresol y el fenol se expresaron como el contenido total (mg) recuperado en extracciones a 0 - 24 h.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con el software SPSS, versión 12.0. La valoración estadística de los datos se realizó aplicando la prueba de Wilcoxon para datos independientes a un nivel de confianza del 95%.

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Resultados y discusión

Se realizó un primer experimento en seres humanos con 10 voluntarios sanos (5 hombres y 5 mujeres, con una edad comprendida entre 23 y 37 años). Cada uno de los 10 voluntarios se asignó aleatoriamente a uno de dos grupos de 5 personas. Al primer grupo se le administró durante dos semanas cada día 7 g (4,88 g) de AXOS-15-0,27 suspendido en agua, mientras que al segundo grupo se le administró diariamente 11,6 g (4,82 g) de WPC suspendido en agua. Los valores de peso indicados entre corchetes se corrigieron con respecto a los AXOS basándose en el contenido en AX y el contenido en humedad de la preparación.

Para cada uno de los voluntarios se recogieron muestras fecales durante el día antes del inicio del experimento, y durante el día 15º. Cada vez se recogió la primera evacuación fecal del día, se pesó y se almacenó a -20ºC hasta realizar el análisis microbiano mediante PCR cuantitativa.

Tal como ilustra la figura 14, los pacientes que recibieron 4.88 g/día de AXOS-15-0,27 durante 14 días presentaron un nivel de bifidobacterias fecales que resultó 1,55 unidades logarítmicas (= 35 veces) superior con respecto al nivel basal (p = 0,043). En cambio, el nivel de bifidobacterias se redujo significativamente tras 2 semanas en los participantes a los que se administró 4,82 g/día de WPC, aunque la diferencia con respecto al nivel basal no era significativa (p = 0,715).

Dichos datos indicaron que los compuestos de AXOS con un grado medio de polimerización intermedio tal como los AXOS-15-0,27 (DP medio = 15, Tabla 1) ejercen un efecto prebiótico más intenso que los compuestos con un grado medio de polimerización elevado tal como el WPC (DP medio = 58, Tabla 1). Se pudo rápidamente alcanzar la misma conclusión a partir de los ensayos sobre los efectos bifidogénicos en pollos (véase ejemplo 4) y en el incremento de los SCFA en ratas (véase el ejemplo 5).

En un segundo experimento se valoró el efecto de distintas dosis unitarias de AXOS-15-0,27 sobre el metabolismo del NH_{3}, el p-cresol y el fenol en el colon humano. El NH_{3}, el p-cresol y el fenol son metabolitos tóxicos y potencialmente cancerígenos que producen las bacterias del colon al fermentar las proteínas. El metabolismo del NH_{3} se valoró utilizando lactosa-[^{15}N,^{15}N]-ureido como biomarcador. Con la administración oral, la lactosa - ureido alcanza el colon sin modificar, debido a que el enlace molecular entre la parte glucídica y la urea en la lactosa - ureido resiste la degradación enzimática en el tracto gastrointestinal humano. Cuando la lactosa-[^{15}N,^{15}N]-ureido alcanza el colon se degrada a urea marcada con [^{15}N,^{15}N] por parte de bacterias seleccionadas. La urea marcada experimenta una hidrólisis rápida con la producción de ^{15}NH_{3} (Wutzke et al. 1997). El NH_{3} marcado se mezcla con el amoníaco presente en el colon y, como consecuencia de ello, las variaciones observadas en la determinación del marcador ^{15}N reflejan el destino del NH_{3} del colon.

Además de realizar el seguimiento del metabolismo del NH_{3} del colon, se determinó la presencia de fenol y p-cresol en la orina como característica distintiva de la fermentación bacteriana de las proteínas en el colon. Basándose en los datos publicados (Evenepoel et al. 1999), se supone que en las condiciones fisiológicas aproximadamente entre el 3 y el 6% de las proteínas ingeridas permaneces sin digerir. Cuando las proteínas sin digerir alcanzan el colon, la flora del colon las fermenta. La fermentación bacteriana del aminoácido tirosina tiene como resultado la producción de fenol y p-cresol. Dichos compuestos se absorben en gran medida desde el colon, se elimina su toxicidad en las mucosas y en el hígado (mediante la conjugación con los grupos glucorónido y sulfato) y se excreta finalmente en la orina. Debido a que el fenol y el p-cresol se originan exclusivamente a partir del metabolismo bacteriano y no a partir del metabolismo humano, la diuresis del fenol y el p-cresol refleja la producción bacteriana de dichos compuestos en el colon (Smith & Macfarlane, 1996). Como consecuencia de ello, cualquier influencia de los compuestos prebióticos en la fermentación de las proteínas del colon se debería reflejar en la concentración urinaria de fenol y p-cresol.

El segundo experimento en humanos se realizó con 9 voluntarios sanos (3 hombres y 6 mujeres, con una edad comprendida entre 19 y 26 años). Cada uno de los voluntarios se le administró 5 comidas de ensayo distintas que comprendían dosis distintas de AXOS-15-0,27 con un intervalo de 1 semana entre cada comida del ensayo. Las distintas dosis de AXOS-15-0,27 por día fueron 0, 0,35 g (0,24 g), 1,05 g (0,73 g), 3,17 g (2,21 g) y 7 g (4,88 g), con los valores de los pesos que se encuentran entre corchetes encontrándose corregidos para los AXOS basándose en el contenido en AX y el contenido en humedad de la preparación. El orden con el que los voluntarios recibieron las comidas del ensayo fue aleatorio. La comida del ensayo consistía en una tortita (15,8 g de proteínas, 11,6 g de grasas y 21,1 g de hidratos de carbono; 255 kcal) que contenía 75 mg del sustrato marcado con el isótopo estable lactosa-[^{15}N,^{15}N] -ureido, 185 kBq de macrogol marcado con tritio (^{3}H-PEG), y AXOS-15-0,27 en una dosis apropiada. Se utilizó el ^{3}H-PEG como biomarcador para el período de tránsito bucofecal (Geboes et al., 2005).

Se recogió la orina en recipientes a los que se añadió 1 gramo de neomicina para evitar el crecimiento bacteriano. Se recogió una muestra de orina basal antes de consumir la comida del ensayo. Tras la ingesta de cada comida del ensayo, se recogió la orina de 48 horas en 3 fracciones distintas 0 - 6 h, 6 - 24 h y 24 - 48 h. Tras determinar el volumen de la orina, se tomaron las muestras y se almacenaron a -20ºC hasta el análisis. Las heces se recogieron en 72 h tras la comida del ensayo. Las heces se congelaron inmediatamente tras la evacuación, se pesaron y a continuación se almacenaron a -20ºC. Todas las heces recogidas el mismo día se combinaron y se homogeneizaron antes de un análisis posterior. Se retiraron las muestras con un peso conocido y se liofilizaron. La materia seca se pesó de nuevo y se tomaron alícuotas para el análisis del nitrógeno y de la radiactividad.

Tal como ilustra la figura 15 A, se observó una velocidad de excreción en la orina regularmente baja del nitrógeno marcado con ^{15}N tras la ingesta del ensayo que contenía AXOS-15-0,27 en comparación con la comida de control que carecía de AXOS-15-0,27. Un 44,5% de la dosis de ^{15}N administrada se recuperó en las muestras de orina tras el consumo de la comida de control. Dicha fracción disminuyó hasta un 40,4% (-9% con respecto control), un 43,7% (-2% con respecto al control), un 33,1% (-26% con respecto al control) y un 33,6% (-25% con respecto al control) tras la ingestión de 0,24, 0,73, 2,21 y 4,88 g de AXOS-15-0,27, respectivamente. El descenso en la excreción en la orina del ^{15}N resultó significativo a una p < 0,05 para las dosis de AXOS-15-0,27 de 2,21 y 4,88 g.

Por el contrario, el complemento con AXOS-15-0,27 en las comidas del ensayo provocaron un incremento uniforme en la excreción del ^{15}N por las heces (figura 15 B). En el grupo de la comida de control del ensayo, un 15.1% de la dosis de ^{15}N administrada se recuperó en las heces. Esta fracción aumentó hasta un 16,4% (+8% con respecto al control), un 18,8% (+24% con respecto al control), un 25,3% (+67% con respecto al control) y un 26.1% (+72% con respecto al control) tras la ingestión de 0,24, 0,73, 2,21 y 4,88 g, respectivamente. El incremento en la excreción fecal de ^{15}N resultó significativo a una p < 0,05 para las dosis de AXOS-15-0,27 de 2,21 y 4,88 g. Los AXOS-15-0,27 no ejercieron efecto alguno en el período de tránsito gastrointestinal, determinado mediante el biomarcador ^{3}H-PEG, a cualquiera de las dosis analizadas (figura 15 C).

Se observó una velocidad de excreción en la orina regularmente baja del p-cresol y del fenol tras la ingesta de las comidas del ensayo que contenían AXOS-15-0,27 en comparación con la comida de control que carecía de AXOS-15-0,27 (figura 16). La fracción de p-cresol excretada por la orina disminuyó en un -9%, un - 21%, un -35% y un -41% con respecto al control, tras la ingestión de 0,24, 0,73, 2,21 y 4,88 g de AXOS-15-0,27, respectivamente (figura 16A). La fracción de fenol excretada por la orina disminuyó en un - 45%, un -39%, un -33% y un -45% con respecto al control, tras la ingestión de 0, 24, 0, 73, 2,21 y 4,88 g de AXOS-15-0,27, respectivamente (figura 16B). El descenso en la excreción de fenol en la orina resultó significativo a una p < 0,05 para todas las dosis de AXOS-15-0,27 analizadas, comprendidas entre 0,24 g y 4,88 g. Se ha demostrado de este modo que los AXOS-15-0,27 constituyen un compuesto prebiótico en los seres humanos que resulta activo a unas dosis sorprendentemente bajas, hasta 0,24 g por ración.

La reducción de la excreción en la orina del nitrógeno y el incremento concomitante de la excreción del N fecal se había observado previamente en humanos a los que se había administrado compuestos prebióticos conocidos tales como la inulina y la lactulosa (De Preter et al., 2004; Geboes et al., 2005). Se pretende excreción estimulada de amoníaco por las heces ya que se ha demostrado que el amoníaco reduce la duración de las células epiteliales del colon, aumentando su renovación, y haciendo que resulten más susceptibles a la carcinogenia química (Visek 1978). El amoníaco en la luz del colon procede principalmente de la fermentación bacteriana de las proteínas no digeridas (Smith & Macfarlane, 1996; Fooks et al., 1999). Los hidratos de carbono prebiótico que se pueden fermentar lentamente, tales como los AXOS con unos grados de polimerización intermedios, estimulan las bacterias sacarolíticas y las vías metabólicas sacarolíticas de las bacterias presentes en el colon. Dichos compuestos, por lo tanto, contienen la fermentación proteolítica en el colon y estimulan la reutilización del amoníaco como fuente de nitrógeno por parte de las bacterias que dependen de los hidratos de carbono como fuente principal de carbono y de energía. En el mismo sentido, se pretende la reducción de la excreción urinaria de los metabolitos de la fermentación proteica cresol y fenol ya que dichos compuestos fenólicos se ven implicados en el cáncer de intestino (Bone et al., 1976). Se ha observado previamente una excreción urinaria reducida de compuestos fenólicos para el compuesto prebiótico lactulosa (De Preter et al. 2004). Se supone que la excreción disminuida del cresol y el fenol se provocan mediante una utilización incrementada del aminoácido tirosina o de productos metabólicos de la putrefacción proteica mediante una actividad bacteriana sacarolítica incrementada en el colon, estimulada por los compuestos prebióticos.

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Tablas TABLA 1 Propiedades de distintas preparaciones de (arabino)xilanos

AX: contenido en arabinoxilanos expresado como % de materia seca; A/X: proporción de arabinosa con respecto a la xilosa; avDP_{GC}: grado de polimerización medio determinado mediante cromatografía en gas - líquido; avDP_{HPSEC}: grado de polimerización medio determinado mediante cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento. Intervalo DP 90%: intervalo de grados de polimerización en el que se encuentra el 90% de los oligosacáridos.

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TABLA 2 Concentraciones de los diferentes compuestos utilizados para las pruebas de análisis sensitivo.

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TABLA 3 Viscosidad intrínseca aparente (dl/g) de una disolución al 5% (p/v) de distintos oligosacáridos

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TABLA 4 Ultrafiltración de la preparación de AXOS pasando a través de una membrana simple con un MMCO de 5 kDa, 10 kDa o 30 kDa. Se expresa la recuperación como % del contenido en arabinoxilano del material inicial. Los análisis comprenden la proporción de la arabinosa con respecto a la xilosa (A/X) y el grado medio de polimerización determinado mediante cromatografía en gas - líquido (avDP_{GC})

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TABLA 5 Ultrafiltración de la preparación de AXOS pasando sucesivamente a través de membranas 10 kDa y 30 kDa. Se expresa la recuperación como % del contenido en arabinoxilano del material inicial. Los análisis comprenden la proporción de la arabinosa con respecto a la xilosa (A/X) y el grado medio de polimerización determinado mediante cromatografía en gas - líquido (avDP_{GC})

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TABLA 6 Alimentos y análisis de la composición de la dieta alimentaria para pollos utilizada en el segundo experimento con pollos

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TABLA 7 Análisis de la composición de la "dieta humanizada básica" utilizada en los experimentos con ratas

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Referencias citadas en la descripción La lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Incluso aunque se ha dedicado un enorme tiempo para compilar las referencias, no puede excluirse algún error u omisión, y la OEP renuncia a cualquier responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

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Claims (26)

1. Producto alimentario o bebida que modula la flora intestinal humana, que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida, en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 50.

2. Producto alimentario o bebida según la reivindicación 1, en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50.

3. Producto alimentario o bebida según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida.

4. Producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el producto alimentario es un producto cárnico o un producto láctico.

5. Bebida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la bebida es una bebida no alcohólica o un refresco funcional.

6. Producto alimentario o bebida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho producto alimentario comprende bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus.

7. Producto alimentario según la reivindicación 1, en el que dicho producto alimentario es un producto alimentario que contiene cereales que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos que tienen un DP inferior a 200 por ración de dicho producto y en el que dicho grupo de arabinoxilanos tiene un DP medio comprendido entre 5 y 50.

8. Producto alimentario según la reivindicación 2, en el que dicho producto alimentario es un producto alimentario que contiene cereales que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos que tienen un grado de polimerización (DP) inferior a 200 por ración de dicho producto y en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50.

9. Producto alimentario que contiene cereales según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende entre 1 y 3 g de dichos arabinoxilanos.

10. Producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el producto alimentario es un producto de panadería o de repostería.

11. Producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el producto alimentario es un cereal para desayunos, un bizcocho o un producto de pasta.

12. Producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el producto alimentario es un producto para postre preparado industrialmente.

13. Producto alimentario o bebida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho producto alimentario o bebida es un producto hipocalórico.

14. Método para la preparación de un aditivo nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las etapas de:

i.

aislar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua a partir de un material rico en arabinoxilanos tal como el salvado, la harina de semillas o semillas secundarias obtenido mediante la eliminación del almidón y la desproteinización de dicho material rico en arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente, en el que las semillas son de trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y arroz, y

ii.

despolimerizar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.

15. Método para la preparación de un aditivo nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las etapas de:

i.

obtener una preparación que contiene arabinoxilanos que se pueden extraer con agua parcialmente despolimerizados, tal como una preparación obtenida en una toma lateral de un proceso de separación de gluten y almidón

ii.

si resulta necesario eliminar el almidón y las proteínas de dicha preparación que contiene arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente;

iii.

despolimerizar los arabinoxilanos contenidos en dicha preparación utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.

16. Método según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que la preparación se somete a ultrafiltración, tras el tratamiento con los enzimas xilanolíticos, a fin de retirar los compuestos de bajo peso molecular que tienen un DP de 4 o inferior.

17. Aditivo nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario o bebida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho aditivo comprende por lo menos un 15% de arabinoxilanos, que tienen un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 7 y 20.

18. Aditivo nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario o bebida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho aditivo comprende por lo menos un 15% de arabinoxilanos, en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50.

19. Utilización de una preparación de arabinoxilanos que comprende moléculas de arabinoxilanos con un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 50 como aditivo alimentario en la producción de un alimento o una bebida que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida.

20. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según la reivindicación 19, en la que las moléculas de arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó 7, o un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50, como aditivo alimentario en la producción de un alimento o bebida, que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida.

21. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según la reivindicación 19 o la reivindicación 20 en la preparación de un alimento o bebida que comprende entre 1 y 3 g de dichos arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida.

22. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el alimento es un producto cárnico o un producto láctico.

23. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que la bebida es una bebida no alcohólica.

24. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el producto alimentario es un producto de panadería o de repostería.

25. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el producto alimentario es un producto de pasta, un bizcocho o un cereal para desayunos.

26. Utilización de una preparación de arabinoxilanos según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en la que el producto alimentario o bebida comprende bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus.