ES2314772T3 - Composicion para la prevencion y tratamiento de afecciones catarrales. - Google Patents

Abstract

Utilización de Cistus para elaborar una composición destinada a la profilaxis y/o tratamiento de afecciones catarrales, donde la afección catarral incluye una infección primaria causada por rinovirus.

Description

Composición para la prevención y tratamiento de afecciones catarrales.

La presente invención se refiere a la utilización de Cistus para elaborar una composición o un preparado destinado a la profilaxis y/o el tratamiento de afecciones catarrales (infecciones gripales) que comprenden una infección primaria producida por rinovirus.

Entre las afecciones catarrales típicas están las infecciones de las vías respiratorias tales como resfriados y las inflamaciones de amígdalas y de la faringe así como la tos y la bronquitis. Generalmente aparecen una tras otra; sin embargo, el catarro puede quedar limitado a la nariz, la garganta o los bronquios. Tales afecciones catarrales también se designan como "infecciones gripales". Hay que diferenciarlas de una "verdadera" gripe producida por el virus Influenza, la llamada gripe, que comporta un curso de la enfermedad considerablemente más largo y penoso, y que generalmente va acompañada de fiebre.

También las afecciones catarrales citadas son causadas por virus. Dado que existen, por ejemplo, más de cien tipos diferentes de virus que pueden causar un resfriado, probablemente nunca será posible desarrollar una vacuna contra los resfriados. Por ello, el tratamiento de los catarros y resfriados en general se orienta a paliar los síntomas. Con frecuencia se emplean para ello medios caseros comprobados. Por ejemplo, la inhalación de vapor caliente ayuda en caso de una fuerte obstrucción nasal. Reduce la hinchazón de la mucosa nasal y fomenta la salida de la mucosidad. Este efecto se refuerza, por ejemplo, mediante la adición al agua caliente de unas gotas de aceite de Melaleuca alternifolia o de manzanilla. También es conocido que el enjuague periódico de la nariz con una solución de sal puede reducir la propensión a los resfriados.

Además de las medidas de autoayuda, existen medicamentos que pueden ayudar a estrechar los vasos de la mucosa nasal inflamada, lo que calma la mucosa nasal. Sin embargo, las gotas nasales para deshinchar la mucosa nasal no se deberían utilizar durante más de dos o tres días. Para periodos más largos, podría suceder que, al interrumpir su utilización, la mucosa nasal se hinche aún más y se desarrolle un "resfriado por fármacos" (rinitis medicamentosa).

Contrariamente a los vaporizadores nasales de síntesis química, los fitofármacos presentan pocos efectos secundarios. No dañan la mucosa nasal ni conducen a rinitis medicamentosa, aunque se utilicen durante un tiempo prolongado. Los fitofármacos son tanto más eficaces cuanto antes se utilicen. Ya se pueden emplear como ayuda cuando se manifiestan los primeros síntomas de un catarro. También actúan contra la propagación de la infección.

Por ejemplo, con frecuencia se toman para las afecciones catarrales preparados de equinacea, y en el mercado existen muchos medicamentos diferentes de composición fitoquímica variable. No obstante, el número de estudios controlados sobre la eficacia de estos fitofármacos es limitado, y sus resultados son contradictorios. Sin embargo, un nuevo estudio reciente ha demostrado que la equinacea no posee la eficacia supuesta. Este estudio se realizó con tres preparados de echinacea de perfil fitoquímico diferente, obtenidos de raíces de E. angustifolia mediante extracción con dióxido de carbono, etanol al 60% y etanol al 20%. En este estudio participaron en total 437 voluntarios con infección por rinovirus, que recibieron el medicamento como profilaxis siete días antes de la exposición al virus, o bien como tratamiento en el momento de la exposición al virus. El estudio se realizó con un control por placebo. No se observaron diferencias significativas entre los tres extractos de Echinacea y el placebo en lo que respecta a tasas de infección, severidad de los síntomas, volumen de secreción nasal, índice de leucocitos, concentración de interleuquina-8 en el agua de lavado nasal o titulación cuantitativa de virus (Deutsches \ring{A}rzteblatt 102, Edición 48 de 02.12.2005, Pág. A-3341 / B-2822 / C-2640 y New England Journal of Medicine, 2005, 353, 341-
348).

Otro medicamento a base de plantas es un extracto de las raíces de Pelargonium reniforme o sidoides, que se comercializa con el nombre de Umckaloabo®. Tradicionalmente, el Umckaloabo® se emplea no sólo en caso de afecciones de las vías respiratorias, sino también para las enfermedades gastrointestinales. Actualmente se consideran como componentes determinantes de la actividad una serie de sustancias antibacterianas e inmunomoduladoras tales como la cumarina y los taninos. Se afirma que el extracto posee efectos antibacterianos, antivirales y secretolíticos, y que el medicamento no debe ser utilizado por mujeres embarazadas o lactantes ni por pacientes con enfermedades hepáticas o renales o con tendencia a sangrar, ya que en este ámbito no se ha podido recopilar suficiente experiencia. Además, comparado con otros fitofármacos, el Umckaloabo® es bastante costoso.

Por ello, el objeto de la presente invención es dar a conocer una composición antiviral para la profilaxis y/o el tratamiento de afecciones catarrales (infecciones virales), que comprenden una infección primaria producida por rinovirus, que se puede fabricar económicamente y cuya administración no tiene efectos secundarios o éstos son reducidos.

Este objetivo se consigue mediante la utilización de plantas del género Cistus para elaborar una composición o un preparado destinado a la profilaxis y/o el tratamiento de afecciones catarrales (infecciones gripales) que comprenden una infección primaria producida por rinovirus.

Descripción de las figuras

- la figura 1 muestra los resultados de una prueba de viabilidad con tinción de yoduro de propidio de células A549 tratadas con extracto de Cistus.

- la figura 2 muestra los resultados de una prueba de viabilidad con tinción de yoduro de propidio de células MDCK tratadas con extracto de Cistus.

- la figura 3 muestra los resultados de una prueba de apoptosis de células A549 tratadas con extracto de Cistus.

Descripción detallada de la invención

Se entienden por afecciones catarrales en el sentido de la invención las inflamaciones de las vías respiratorias, es decir, en general, de la nariz, la garganta, la faringe, la tráquea y los bronquios. Los términos "afecciones catarrales" e "infección gripal" se utilizan como sinónimos. Una infección gripal se diferencia de una gripe "verdadera" o Influenza en que ésta sólo es causada por los virus de la Influenza.

En cambio, una infección gripal generalmente es causada por adenovirus, coronavirus y/o rinovirus.

Los adenovirus (Adenoviridae) pertenecen a la familia de los virus de ADN cúbico, sin envoltura, y tienen un diámetro de 60 a 90 nm. Su genoma consta de un ADN bicatenario lineal de una longitud de aproximadamente 36 kilobases. Existen aproximadamente 50 clases inmunológicamente diferentes de adenovirus, entre ellos unos 35 tipos patógenos para los humanos en los subgéneros A-F. La familia Adenoviridae se divide en los géneros Mastadenovirus, que pueden infectar a los mamíferos, y Aviadenovirus, que son endémicos en diversas especies de aves. Los adenovirus se caracterizan por ser extraordinariamente estables frente a agentes químicos y físicos, y toleran valores de pH muy adversos, lo que les permite tener una persistencia comparativamente larga fuera del cuerpo del hospedante.

Los adenovirus causan principalmente enfermedades de las vías respiratorias. Sin embargo, en función de su serotipo también pueden causar una serie de otras enfermedades, por ejemplo, gastroenteritis, conjuntivitis, cistitis, faringitis o diarrea. Los síntomas de una enfermedad de las vías respiratorias varían desde un simple resfriado, a una bronquitis, hasta la neumonía. Los pacientes con un sistema inmunológico debilitado están especialmente expuestos a graves complicaciones de las infecciones por adenovirus, por ejemplo, el ARDS ("Acute Respiratory Distress Syndrome"). Además, se sospecha que existe una correlación entre el tipo de virus Ad-36 y la obesidad en humanos.

Los coronavirus, que pertenecen al género Coronaviridae, en general causan en humanos enfermedades leves de las vías respiratorias superiores, raramente gastroenteritis o síndrome respiratorio agudo severo (SARS), causado por el coronavirus SARS-CoV asociado al SARS.

Los coronavirus pertenecen al grupo de virus con ARN pleomorfo, con envoltura, y con un diámetro de 70 a 160 nm. La longitud de cada cadena ARN (+) es de 20 a 30 kilobases. La familia Coronaviridae se clasifica en tres géneros, los coronavirus, los arterivirus y los torovirus. Entre ellos, sólo los coronavirus incluyen virus patógenos para los humanos. La transmisión de los virus tiene lugar como infección por gotitas (aerógena), como infección por suciedad o manchado (fecal-oral) o por simple contacto (físico) con una persona infectada. Los organismos infectados más jóvenes enferman más gravemente que los de más edad. Los coronavirus causan entre el 15% y el 30% de las afecciones catarrales en humanos, con fiebre leve, resfriado, tos y dolores de garganta.

Se denomina rinitis, catarro nasal, coriza o comúnmente resfriado una irritación aguda o crónica de la mucosa nasal, cuyos síntomas son comezón, ganas de estornudar, secreción y obstrucción por mecanismos infecciosos, alérgicos y no alérgicos. El agente patógeno es generalmente un tipo de picornavirus, el rinovirus. La infección con rinovirus se produce por transmisión directa, por ejemplo, a través de manos contaminadas o como infección por gotitas.

Hasta ahora se conocen más de 115 serotipos de este género. Los rinovirus poseen un ARN (+) monocatenario (ARN mensajero) con una longitud de 7,2 a 8,5 kilobases. Son virus desnudos de estructura icosaédrica y diámetro de 24 a 30 nm. La envoltura de proteína (cápsida) de 10 a 15 nm que rodea el ARN consta de 60 subunidades dispuestas simétricamente, que se denominan protómeros. Cada protómero consta de las cuatro proteínas capsídicas VP1, VP2, VP3 y VP4. Se considera que la multiplicidad de los protómeros es la causa de la diversidad de los antígenos de los rinovirus.

Tal como se ha indicado, las afecciones catarrales generalmente son causadas por adenovirus, coronavirus y/o rinovirus. Según el tipo de virus infeccioso, pueden presentarse afecciones catarrales tales como los resfriados, la tos, la ronquera, los dolores de garganta, por ejemplo, causados por amigdalitis o faringitis, dolores de miembros y de cabeza, escalofríos, fiebre leve y cansancio. Entre las enfermedades catarrales también se cuentan la bronquitis y la bronconeumonía.

Entre las afecciones catarrales la más frecuente es el resfriado en los meses de invierno. Su causa es una infección por rinovirus o, con menor frecuencia, por adenovirus. La composición o preparado descrito se utilizan para la profilaxis y/o el tratamiento de los resfriados.

En las enfermedades catarrales también se pueden presentar infecciones bacterianas que "se superponen" a la infección vírica ya existente. Tales infecciones se denominan infecciones secundarias bacterianas o superinfecciones bacterianas. La utilización, según la invención, de la composición, también se refiere a la profilaxis y/o tratamiento de dichas infecciones secundarias bacterianas.

Según la invención, se utiliza la planta Cistus para elaborar una composición destinada a la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones gripales. Se conocen 20 especies del género Cistus:

C. albidus L.

C. chinamadensis Banares & P. Romero

C. clusii Dunal

C. crispus L.

C. heterophyllus Desf.

C. incanus (también llamada C. creticus)

C. inflatus Pourr. Ex Demoly (también llamada C. hirsutus Lam. o C. psilosepalus Sweet)

C. ladanifer L.

C. laurifolius L.

C. libanotis L.

C. monspeliensis L.

C. munbyi Pomel

C. ochreatus Chr. Sm. ex Buch

C. osbeckiifolius Webb ex Christ.

C. parviflorus Lam.

C. populifolius L.

C. pouzolzii Delile

C. salviifolius L.

C. sintenisii Litard. (también llamada C. albanicus E.F. Warburg ex Heywood)

C. symphytifolius Lam.

Preferentemente, la composición se obtiene de la especie C. incanus. C. incanus comprende dos subespecies, C. incanus ssp. tauricus y C. incanus ssp. undulatus. Con especial preferencia, se utiliza para la composición la subespecie C. incanus ssp. tauricus.

Todavía no se conocen todas las sustancias individuales que componen la planta Cistus. Sin embargo, ya se ha demostrado que las Cistus tienen un contenido elevado de polifenoles. Entre estos polifenoles, los flavonoides están presentes en cantidades muy representativas.

Los flavonoides constan básicamente de dos anillos aromáticos y un anillo heterocíclico oxigenado. Según las diferencias estructurales del anillo heterocíclico oxigenado, los flavonoides se pueden dividir en los seis grupos siguientes: flavonoles, flavanoles, flavanones, flavones, antocianinas e isoflavanoides. Algunos de los componentes detectados en plantas Cistus son flavonoles, tales como la quercetina y la miricetina, y sus glicósidos, flavan-3-oles (catequinas), tales como la (+)-galocatequina y el (+)-galocatequin-3-O-galato, así como dímeros y oligómeros de las catequinas, las proantocianidinas.

Otros componentes son el \alpha-pineno, canfeno y terpenoides, tales como el labda-7,13-dien-15-ol, 8\alpha, 15-labdandiol, ácido labdanólico, ácido laurifólico, ácido acetil laurifólico, 8,13-epoxi-15-dimetoxi-ent-labdano, 3\alpha-hidroxi-ent-13-epimanoilóxido (= ribenol), ácido salmántico, salmantidiol, ácido halímico, ácido dihidrohalímico, ácido 2\beta-hidroxi-dihidrohalímico, ácido cistodioico, cistodiol, ent-cauran-16,17-diol, metiléster del ácido dihidro-abiético, cabraleone y 20,25-epoxi-24-hidroxidamaran-3-on [R. Hegnauer, Chemotaxonomie der Pflanzen, Vol. VIII P. 1989, 246-247].

La composición utilizada, según la invención, se obtiene de las partes aéreas de las plantas. Preferentemente, se utilizan los brotes aéreos de las plantas que vuelven a crecer en el mismo año. Se pueden utilizar todos los componentes de la parte aérea de las plantas, tales como las hojas, los tallos o las flores. Preferentemente, se utilizan los tallos con hojas y flores. Las partes de la planta se pueden secar o prensar directamente después de su recogida, es decir, crudas, en su caso desmenuzadas, a fin de obtener un jugo prensado. En otra forma de realización, las partes de la planta se someten en crudo a una extracción con un disolvente, por ejemplo, a una maceración o percolación. Como alternativa, las partes de la planta se pueden secar y/o posteriormente desmenuzar de forma adecuada antes de la extracción, por ejemplo, mediante rallado o corte.

Para la composición utilizada, según la invención, se emplean partes de la planta secadas y, en su caso, desmenuzadas, el jugo prensado de la planta o un extracto. Según la invención, se usa el término "extracto" para designar a todos los productos obtenidos mediante extracción con un disolvente, por ejemplo, por maceración o percolación.

Preferentemente, la composición es un extracto de la planta Cistus.

En general, la extracción se realiza con un disolvente adecuado. Son disolventes adecuados el agua, los alcoholes como el metanol, etanol o isopropanol, o bien los disolventes clorados tales como el diclorometano, así como acetona, acetilacetona, etilacetato, amoniaco o ácido acético glacial, pero también el dióxido de carbono supercrítico. También se pueden utilizar mezclas de los disolventes mencionados. Preferentemente, se emplea agua o una mezcla de agua con metanol o etanol.

Normalmente, la extracción se realiza a temperaturas de 25ºC llegando, en su caso, hasta la temperatura de ebullición del disolvente utilizado. Preferentemente, la extracción se realiza entre 95ºC y 100ºC.

Para la extracción también se pueden utilizar grasas, por ejemplo, manteca de cerdo, o ceras, por ejemplo, cera de abejas, o aceites, por ejemplo, aceite de oliva y aceite de almendras. Preferentemente, se emplea aceite de almendras.

A fin de conseguir el máximo rendimiento, el material de plantas se puede extraer varias veces. Para ello, se pueden utilizar disolventes diferentes en cada etapa de extracción, o bien después de una extracción con un disolvente se puede realizar una extracción con una grasa, cera o aceite, o viceversa.

Mediante la extracción se obtiene un producto bruto líquido, semilíquido o sólido que se puede utilizar en esa forma para fabricar una composición destinada a la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades catarrales.

Una maceración se realiza generalmente durante cinco a nueve días, preferentemente durante siete días, con una mezcla de agua y etanol a temperatura ambiente, de modo que se rocían las partes de la planta con la mezcla de disolventes y se deja reposar durante el tiempo indicado.

Según la invención, una percolación de las partes de la planta se realiza normalmente tratándolas con agua de 95 a 100ºC durante cuatro a cinco horas haciendo pasar el agua a través de las partes de la planta.

El producto bruto obtenido mediante la extracción con un disolvente, por ejemplo por maceración o percolación, también se puede concentrar y/o secar y/o tratar ulteriormente antes de su utilización. El tratamiento ulterior puede incluir, por ejemplo, etapas de limpieza conocidas por los expertos tales como la centrifugación, filtración o decantado, a fin de eliminar del extracto los materiales en suspensión.

Posteriormente, un extracto obtenido de esta forma se puede procesar para convertirlo en un extracto seco. Para fabricar el extracto seco, se puede extraer del extracto líquido bruto, del extracto concentrado o del extracto limpiado mediante, por ejemplo, deshidratación por aspersión, liofilización o secado al vacío.

La composición se utiliza para la profilaxis y/o tratamiento de afecciones catarrales causadas por rinovirus.

Para su utilización médica, la composición se puede administrar en cualquier forma de aplicación conocida por los expertos, por ejemplo, en forma de comprimidos, comprimidos con recubrimiento, pastillas efervescentes, cápsulas, polvo, granulados, grageas, ungüentos, cremas, soluciones o aerosoles.

En aplicaciones galénicas y otras formas de aplicación, la composición se puede procesar con los medios auxiliares galénicos habituales, tales como ligantes de comprimidos, agentes de relleno, agentes preservantes, agentes de apertura de comprimidos, agentes reguladores de flujo, ablandadores, humectantes, dispersantes, emulsificantes, solventes, retardadores, antioxidantes, reguladores de consistencia, agentes mejoradores de la penetración y/o gases propelentes.

A la composición, según la invención, se pueden añadir otros componentes, tales como vitaminas y minerales.

La composición también se puede añadir, por ejemplo, a piensos animales o a alimentos, tales como las bebidas. En forma de extracto, la composición también se puede preparar con agua en forma de té. No obstante, las partes de la planta, por ejemplo, las hojas de plantas Cistus, se pueden rociar con agua caliente para preparar una infusión. La composición también puede ser un componente de complementos nutricionales, cuya ingesta en invierno puede contribuir a fortalecer las defensas del organismo y, con ello, a prevenir, por ejemplo, una infección de resfriado.

En otra forma de realización, la composición según la invención se puede utilizar como solución, en especial, como solución para hacer gárgaras, para la profilaxis y/o el tratamiento de afecciones catarrales, en especial, de inflamaciones internas de la boca y la laringe.

La composición también se puede utilizar mezclada con partes componentes de otras plantas, de modo que las partes componentes están presentes, preferentemente, en forma de extractos de plantas. Preferentemente, se utilizan los componentes o extractos de plantas que poseen un efecto del mismo tipo o sinérgico.

Según el tipo de aplicación, la concentración de la composición en la forma de presentación es variable. Por regla general, en las formas de presentación sólidas la cantidad de la composición es de 0,5 a 1000 mg por dosis. Preferentemente, la cantidad de la composición está entre 1 y 500 mg por dosis. En las formas de presentación líquidas, la composición puede estar presente con una concentración de 1 \mug/ml a 100 mg/ml, preferentemente de 25 \mug/ml a 50 mg/ml. En las formas de presentación semisólidas, la concentración en la composición es de 1 a 90% en peso, preferentemente de 5 a 75% en peso.

Preferentemente, la composición se administra en forma de comprimidos. En este caso, preferentemente, la composición está presente en forma de extracto. Con especial preferencia, la composición está presente en forma de extracto seco.

También es preferente administrar la composición para su aplicación tópica en forma de emulsiones, ungüentos, geles o cremas. Para ello, la composición se emplea, preferentemente, en forma de extracto, en el que se han obtenido los principios activos mediante extracción de los principios activos de la planta con grasa, cera o aceite. También es preferente transformar dicho extracto en un extracto seco, el cual seguidamente se mezcla con una grasa, cera o aceite, o bien se disuelve en ellos.

También es preferente que la composición se presente en forma de aerosol o vaporizador de recintos. Preferentemente, se utiliza para ello un extracto de Cistus líquido o seco. Además del extracto, el aerosol o vaporizador de recintos puede contener sustancias farmacológicamente inofensivas, portadoras y auxiliares. Se puede utilizar el aerosol o vaporizador de recintos para la desinfección de objetos y recintos con los que los virus catarrales han estado en contacto o pueden llegar a estar en contacto, en especial, los medios de transporte de cualquier clase en los que se transportan personas, animales o alimentos. Por ejemplo, se puede pulverizar un avión con el aerosol o vaporizador de recintos, según la invención, antes del despegue, a fin de impedir la difusión de virus catarrales y de esta forma reducir al mínimo el riesgo de contagio de las personas. También se puede pulverizar el aerosol o el vaporizador de recintos en presencia de personas, por ejemplo, en salas de espera, ya que no tiene ningún efecto tóxico para las personas.

La composición también se puede administrar en forma de agente nasal o solución para inhalaciones. El agente nasal puede ser un vaporizador nasal o un gel nasal. Para su administración se pueden emplear diversos aplicadores y sistemas dispersantes.

La utilización de la planta Cistus, según la invención, no se limita a las personas, y también se puede emplear en animales, en especial mamíferos tales como los animales de compañía o el ganado.

El siguiente ejemplo explica la presente invención.

Se ha realizado una prueba de toxicidad celular, viabilidad celular y actividad antigripal frente a rinovirus de un extracto de Cistus. Para ello, se preparó una solución patrón (1 mg/ml) disolviendo el extracto en PBS (esterilizado) con calentamiento (1 h/100ºC). La dosificación para los estudios in vitro fue de 100 \mug/ml. Como virus aislado se utilizó el rinovirus tipo 14 humano. Como línea de células hospedantes se utilizaron células HeLa (línea de células de carcinoma de cuello uterino humano).

Para la determinación de las propiedades del extracto se utilizaron los siguientes métodos de investigación.

Estudios microscópicos

En los estudios microscópicos se trataron células epiteliales de pulmón A549 y células epiteliales renales caninas MDCK durante periodos de tiempo diferentes (9, 24, 32 y 48 horas) con concentraciones diferentes del extracto (2, 10, 25 y 50 \mug/ml), y posteriormente se estudiaron con microscopía luminosa. Los experimentos se realizaron con control doble.

Ensayos de viabilidad

En los ensayos de viabilidad se trataron células epiteliales de pulmón A549 y células epiteliales renales caninas MDCK durante periodos de tiempo diferentes (24, 48, 56 y 72 horas) con concentraciones diferentes del extracto (2, 10, 25 y 50 \mug/ml), y posteriormente se marcaron con yoduro de propidio a fin de determinar mediante citometría de flujo las proporciones de células muertas y células vivas. Los experimentos se realizaron un total de cuatro veces.

Estudio de la activación apoptótica de caspasas

Para la investigación de la activación apoptótica de caspasas se trataron células A549 durante 48 horas con 25 y 50 \mug/ml del extracto. Posteriormente se realizó la lisis de las células, se separaron por electroforesis las proteínas celulares y se estudió la disociación apoptótica de dichas proteínas por caspasas mediante el método "Western Blot" (Transferencia western) con un anticuerpo anti-PARP (Sustrato de Poli(ADP-Ribosa)Polimerasa, Caspasa). Como estímulo de control positivo se empleó el inductor de apoptosis staurosporina. Los experimentos se realizaron en dos operaciones paralelas.

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Ejemplo Fabricación de un extracto de Cistus incanus ssp. tauricus

Para la extracción se utilizan los brotes aéreos de las plantas que vuelven a crecer en el mismo año (hojas, flores y tallos). El material de plantas se seca al aire libre, en la sombra y a temperatura ambiente, hasta una humedad residual máxima del 10%. Seguidamente, las partes de planta se cortan a un tamaño de \leq8 mm.

Las partes de planta cortadas se someten durante 4 a 5 horas a una percolación a 95 a 100ºC con diez veces su cantidad de agua purificada según la Farmacopea Europea. La solución obtenida se concentra al 18 a 19% de su volumen inicial mediante un evaporador de placas con una temperatura de vapor de 75 a 80ºC. La concentración de sustancia seca es de aproximadamente 45%.

La concentración de sustancia seca se aumenta de 50 a 51% mediante un evaporador agitador, calentando el extracto durante cuatro horas de 110 a 114ºC a presión reducida (0,6 bar). Luego se cuece el extracto durante una hora a 100,3ºC a fin de obtener una concentración de sustancia seca de aproximadamente 53%. Finalmente, se realiza un secado en cintas al vacío a 16 mbar con gradientes de temperatura decrecientes (140ºC, 120ºC, 90ºC, 20ºC). La concentración de sustancia seca es de aproximadamente 92 a 93%. Por último, se muele el extracto. A partir de este extracto se prepara la solución patrón antes descrita.

Estudios de microscopía

En las microfotografías de las series de ensayos con células MDCK y células A549, no se han podido observar cambios significativos del número de células y de morfología celular, si se compara con las muestras de control no tratadas, con ninguna de las concentraciones del extracto utilizadas y de los valores de tiempos estudiados.

Ensayo de viabilidad

Las figuras 1 y 2 muestran un resumen de los resultados del ensayo de viabilidad, donde se compara el número medio de células vivas en cada muestra obtenido en las cuatro determinaciones realizadas. Como resultado, durante todo el periodo de observación de 72 horas no se ha observado ningún efecto negativo del extracto sobre la supervivencia de células MDCK o células A549.

Estudio de la activación apoptótica de caspasas

La figura 3 muestra los resultados del estudio de la activación apoptótica de caspasas, con los resultados del análisis "Western Blot" para determinar la actividad de caspasas. Mientras que el estímulo de control con staurosporina ("Stauro") conduce a una disociación eficiente del sustrato de caspasa poli(ADP-ribosa)polimerasa (Banda PARP hendida), no se detecta una actividad de este tipo en las células no tratadas ("mock") y tampoco en las células tratadas con el extracto (25 \mug/ml, 50 \mug/ml). Una absorción ("blot") de control contra la proteína ERK2 sirvió de control para la carga unificada de proteína. Se desprende como resultado que el tratamiento con el extracto de plantas en las concentraciones utilizadas y durante el tiempo de observación no conduce a la activación de caspasas y a la inducción de apoptosis.

Los estudios relativos a la morfología, viabilidad y activación de caspasas de las células tratadas con extracto de Cistus muestran que una concentración del extracto de hasta 50 \mug/ml no presentan ningún efecto tóxico significativo sobre las células hospedantes utilizadas A549 y MDCK y que no inducen muerte celular ni necrótica ni apoptótica. Además, no se ha observado ninguna reducción significativa del número de células, de modo que el efecto del extracto tampoco limita el crecimiento celular.

Estudios de la actividad antiviral Cultivo de rinovirus

Se inocularon cuatro frascos T175 de células HeLa 80% confluentes con rinovirus humano tipo 14 (HRV) y se incubaron durante una semana a 33ºC. Para ello, se mezclan 50 \mul HRV14 (titulación de virus 10^{8}/ml TCID ("Tissue Culture Infectious Dose")) con 16 ml de medio de infección (D-MEM ("Dulbecco's Modified Eagle Medium"), 2% FCS ("Fetal Calf Serum"), 10-20 mM MgCl2 y se añaden 4 ml a cada T175. Cada T175 se rellena con 10 ml de medio de infección, de modo que cada T175 contiene 14 ml de medio de infección. El virus se recolecta tan pronto se ha disuelto el 70% de las células adherentes.

Purificación de los rinovirus

En primer lugar se centrifuga el virus sobrenadante durante 30 minutos a 3.000 rpm para eliminar el residuo celular. El virus sobrenadante se centrifuga a 35.000 rpm en la ultracentrífuga (rotor tipo SW41 Ti en tubos Beckman de polialómero) a 4ºC durante tres horas sobre un gradiente de sucrosa (1,5 ml de sucrosa al 65% en agua, 300 \mul 10xPBS ("Phosphate-Buffered Saline"), 1.2 ml de agua) y el residuo se incorpora a 100 \mul de medio de infección. La ulterior concentración del virus se realiza con un filtro de exclusión 100 kDa (Centricon YM 100) a 3.300 rpm durante una hora a 4ºC. El retentato contiene el concentrado de virus purificado; el filtrado se desecha.

Estudio de la actividad antiviral ("Tissue Culture Infectious Dose (TCID) assay")

El día anterior se siembran 5 x 104 células HeLa en medio D-MEM por cada placa de 96 pocillos, de modo que al día siguiente aproximadamente el 70% de las células son confluentes. El medio D-MEM se separa por succión al día siguiente y se sustituye con 90 \mul de medio de infección (D-MEM, 2% FCS, 10-20 mM MgCl_{2}). La infección se realiza a la concentración máxima de 100 \mug/ml con 10 \mul de la solución que contiene el virus en la primera fila de los 96 pocillos. Después de mezclar estos 100 \mul mediante pipeteado hacia arriba y hacia abajo, se ponen 10 \mul de cada uno en la segunda fila de los 96 pocillos. Este procedimiento se repite para las filas siguientes (serie de diluciones 1:10). Se realizan dos o tres operaciones paralelas, las cuales se utilizan para la evaluación.

La placa preparada de esta manera se incuba en el incubador durante cinco días a 33ºC. Después de cinco días se lava la placa con PBS como mínimo dos veces, y se colorea durante cinco horas con 100 \mul de violeta de cresilo (al 0,07% en etanol puro) por cada 96 pocillos. Seguidamente, se lava la placa en agua varias veces, se vacía golpeando (unas 10 veces) y se seca. Una coloración azul indica células vivas. Las células muertas se han lavado de los pocillos y dejan un fondo blanco.

Para ensayar el efecto del extracto de Cistus sobre la infectividad del HRV14, se mezcló el medio de infección con 100 \mug/ml de extracto de Cistus, o bien se trataron adicionalmente los virus durante una hora con 100 \mug/ml de extracto de Cistus. Se observó como resultado de todos los ensayos que el extracto de Cistus pudo evitar la infección y, con ello, la destrucción de la capa de células, tanto en el medio de infección como después de la preincubación adicional de los virus. A la concentración utilizada, el extracto de Cistus no tuvo ningún efecto nocivo reconocible sobre las células. De esta manera queda demostrado el efecto inhibidor del extracto de Cistus sobre la infecciosidad de los rinovirus.

Claims (13)

1. Utilización de Cistus para elaborar una composición destinada a la profilaxis y/o tratamiento de afecciones catarrales, donde la afección catarral incluye una infección primaria causada por rinovirus.

2. Utilización, según la reivindicación 1, para el tratamiento de resfriados.

3. Utilización, según la reivindicación 1 ó 2, en la que la planta elegida es del género Cistus Incanus.

4. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en la que se emplean las partes aéreas de la planta.

5. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición está en forma líquida, seca o semisólida.

6. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición está en forma de extracto.

7. Utilización, según una de las reivindicaciones 5 ó 6, en la que el extracto es un extracto acuoso o un extracto alcohólico.

8. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición se administra oralmente o de forma tópica.

9. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición está en forma de agente nasal o mezcla para inhalación.

10. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición está en forma de aerosol o vaporizador de recintos.

11. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6 y 8, en la que la composición está en forma de comprimido, comprimido recubierto, comprimido efervescente, cápsula, polvo, granulado o comprimido recubierto con azúcar.

12. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición está en forma de ungüento, gel o crema.

13. Utilización, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición está en forma de solución para hacer gárgaras o jugo de plantas.