ES2315040B2 - Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresion de la leucemia mieloide cronica mediante el uso de spi-1/pi.1. - Google Patents
Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresion de la leucemia mieloide cronica mediante el uso de spi-1/pi.1. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para determinar la eficacia del
tratamiento y el grado de progresión de la leucemia mieloide
crónica mediante el uso de SPI-1/PU.1 que
consiste en la determinación de mRNA o de proteína del gen
SPI-1/PU.1, en muestras de células de sangre
o médula ósea de pacientes de LMC y su comparación con muestras de
sujetos sanos o del mismo paciente tras el tratamiento
antileucémico. Niveles de mRNA o proteína de
SPI-1/PU.1 altos o comparables a los de
sujetos sanos son indicadores de respuesta al tratamiento. La
presencia de SPI-1/PU.1 es indicador de
respuesta al tratamiento y recuperación de hematopoyesis normal.
Por el contrario, una expresión reducida es indicador de
persistencia de la leucemia y mal pronóstico.
Description
Procedimiento para determinar la eficacia del
tratamiento y el grado de progresión de la leucemia mieloide crónica
mediante el uso de SPI-1/PU.1.
Sector de la invención: Biomedicina. Marcadores
de pronóstico de la enfermedad y como guía de los profesionales
médicos para seleccionar o evaluar los tratamientos de leucemia
mieloide crónica.
El factor de transcripción
SPI-1/PU.1 es una proteína de la familia ETS,
que juega un papel clave en la hematopoyesis.
SPI-1/PU.1 regula la expresión de genes
importantes para la diferenciación mieloide y linfoide tales como
los receptores de los factores de crecimiento de macrófagos, de
granulocitos, la integrina CD11b y mieloperoxidasa, así como su
propia expresión. También regula la expresión de genes de
inmunoglobulinas (Friedman, 2002).
Diversos estudios indican un papel fundamental
de Spi-1 en el compromiso de las células
pluripotentes hacia distintos linajes hematopoyéticos. Los datos con
ratones deficientes en SPI-1/PU.1 indican
que esta proteína se requiere para el desarrollo tanto de la serie
mieloide (granulocitos y monocitos) como linfoide (Lloberas et
al., 1999). En progenitores eritroides la expresión normal de
Spi-1 es baja y su sobreexpresión desregulada da
lugar a eritroleucemia.
La leucemia mieloide crónica (LMC) es una de las
leucemias más frecuentes. La LMC es una enfermedad bifásica.
Primero cursa con una fase crónica, que suele durar
2-4 años. En esta fase la enfermedad es
relativamente benigna, pero desemboca en todos los casos en una
crisis blástica, que conduce a la muerte normalmente en menos
de un año, a no ser que se someta al paciente a un transplante de
médula ósea en su fase crónica. Esta fase es frecuentemente
precedida de una fase acelerada, con características hematológicas
intermedias entre la crónica y la blástica. Desde el punto de vista
celular la fase crónica se caracteriza por un número elevado de
granulocitos maduros, mientras que en la fase blástica se acumulan
formas blásticas, normalmente de serie mieloide, y con menor
frecuencia, linfoide. Junto con la linfocítica crónica es la
leucemia más frecuente en gente mayor de 50 años, aunque de mucho
peor pronóstico EL marcador molecular de la LMC es la proteína
Bcr-Abl. Es una proteína de fusión con actividad
proteína-tirosina quinasa desregulada, debido a una
traslocación que yuxtapone los cromosomas 19 y 22 y da a lugar al
cromosoma Filadelfia, marcador citogenética de la LMC (Deininger
et al., 2000; Faderi et al., 1999; Goldman and Melo,
2003). El Bcr-Abl está ya presente en la fase
crónica, y los mecanismos que gobiernan la transición de la fase
crónica a la crisis blástica son desconocidos. Hasta ahora no se ha
identificado un cambio molecular común o mayoritario en las crisis
blásticas respecto a la fase crónica.
Históricamente, la LMC se ha tratado con
busulfán e hidroxiurea, desde los años 80, con interferón \alpha,
que suelen inducir remisión hematológica (Silver et al.,
1999). Más recientemente se ha introducido el imatinib, un
inhibidor de la quinasa Bcr-Abl. Los excelentes
resultados obtenidos le están convirtiendo en el fármaco de primera
línea en el tratamiento de la LMC (Kantarjian et al.,
2002).
Sin embargo, aunque estos fármacos, y
especialmente el interferón y el imatinib pueden inducir remisiones
hematológicas, citogenéticas y moleculares en la fase crónica, y el
imatinib incluso en fase acelerada (Talpaz et al., 2002) y
blástica (Druker et al., 2001; Sawyers et al., 2002),
el único tratamiento curativo de la LMC hoy conocido es el
trasplante alogénico de médula ósea en su fase crónica (Goldman and
Melo, 2003). Se ha demostrado también que la eficacia curativa del
trasplante es menor cuanto más tiempo lleva el paciente en fase
crónica, pero es difícil evaluar el tiempo que lleva un paciente en
fase crónica cuando se le hace el diagnóstico por primera vez
(Goldman and Druker, 2001).
Hasta el momento, el único marcador molecular
informativo sobre la evolución de la enfermedad en ausencia de
datos hematológicos y citogenéticas es la determinación de la
presencia del mRNA de Bcr-Abl. Esta determinación se
hace por RT-PCR, usando cebadores que mapean en los
genes BCR y ABL. Aunque la detección de mRNA de
Bcr-Abl es útil en la detección de enfermedad mínima
residual, hasta el momento no hay marcadores moleculares de la
respuesta al tratamiento en LMC.
Los inventores habían demostrado y publicado
anteriormente que la expresión de SPI-1/PU.1
aumentaba al tratar células de una línea celular derivada de LMC
(K562) con con interferón-\alpha, (Gutierrez
et al., 1997). Posteriormente, los inventores han demostrado
que la expresión de SPI-1/PU.1 se
correlaciona con una recuperación hematológica de pacientes de LMC
tratados con interferón-a e imatinib (resultados no
publicados). Medida por RT-PCR, la expresión de
SPI-1/PU.1 es baja al diagnóstico y aumenta
durante al tratamiento con interferón o con imatinib, concomitante
con la normalización hematológica. En la figura 1 se presenta una
muestra representativa de la expresión de
SPI-1/PU.1 en varios pacientes de LMC a lo
largo de su tratamiento con interferón. Se obtuvieron resultados
similares en 13 de 16 casos analizados. En los cuatro casos de la
figura, el tratamiento indujo la recuperación de la hematopoyesis
normal. En estos ensayos se usó el gen de la proteína ribosomal S14
como gen "housekeeping" como control de la cantidad de RNA y
cDNA de las muestras. Este resultado es consistente con lo descrito
previamente por los inventores sobre que la sobreexpresión de
SPI-1/PU.1 en células humanas K562, provoca
parada proliferativa, inducción de la diferenciación monocítica y
bloqueo de la diferenciación eritroide (Gutierrez et al.,
1997).
Cuando se comparan los niveles de
SPI-1/PU.1 (medidos por
RT-PCR cuantitativa) en médula ósea de sujetos
sanos, de pacientes de LMC al diagnóstico, y pacientes en fase
crónica tratados con interferón y con imatinib se encontró que los
niveles de mRNA de SPI-1/PU.1 eran eran
mayores en los pacientes tratados. En la Figura 2 se resumen estas
observaciones en 10 muestras de sujetos sanos, 31 de pacientes de
LMC al diagnóstico, 32 tratados con
interferón-\alpha y 17 tratados con imatinib
(varios de ellos con tratamiento previo con
interferón-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han observado que la expresión
del gen humano SPI-1/PU.1 es alta en células
de médula ósea de sujetos sanos pero es significativamente más baja
en muestras de pacientes de LMC al diagnóstico en fase crónica. Sin
embargo, en pacientes de LMC que están en remisión hematológica, la
expresión de SPI-1/PU.1 se recupera hasta
alcanzar valores normales. Esta regulación positiva de
SPI-1/PU.1 se ha observado tanto en
pacientes de LMC tratados con interferón-\alpha y
con imatinib (los dos tratamientos hoy en uso para esta leucemia).
El procedimiento que se presenta consiste en medir la expresión de
SPI-1/PU.1 en muestras de médula ósea de
pacientes y referirla a una muestra de referencia que exprese dicho
gen. Esta referencia puede ser médula ósea de sujetos sanos o de
una línea celular que exprese dicho gen, como K562 tratadas con
interferón. Una expresión alta o recuperada de
SPI-1/PU.1 es indicador de restablecimiento
de hematopoyesis normal y/o una baja proporción de células
leucémicas en la muestra considerada, y por tanto, una indicación de
éxito del tratamiento.
Figura 1. Expresión de
SPI-1/PU.1 durante la evolución de LMC. Las muestras
1.1., 2.1, 3.1 y 4.1 corresponden al diagnóstico. Las siguientes
son muestras de los pacientes 1, 2, 3 y 4 tomadas con durante el
tratamiento con interferón-\alpha. En todos los
casos los pacientes entraron en remisión hematológica. Se observa
como la expresión de SPI-1/PU.1 aumenta
según se va consiguiendo (mediante el tratamiento) la normalización
hematopoyética. A la derecha se indica entre paréntesis el tamaño de
los amplicones de SPI-1/PU.1 y de S14. A la
izquierda los tamaños de marcadores de tamaño de DNA.
Figura 2. Expresión de
SPI-1/PU.1 (analizada por RT-PCR
cuantitativa y normalizada respecto a la de S14) en muestras de
sujetos sanos (control), y pacientes de LMC al diagnóstico y
tratados in interferón-a e imatinib. En cada caso se
indica el número de muestras analizadas. Las barras de error
indican el Error Estándar de la Media.
Se extraerá RNA de células mononucleares
separadas de médula ósea o de sangre periférica. El RNA se copia a
cDNA usando transcriptasa inversa y cebadores al azar ("random
hexamers") o bien oligonucleótidos específicos de regiones
exónicas del gen SPI-1/PU.1 humano. El cDNA
es amplificado usando como cebadores ("primers") dos
oligonucleótidos que mapean en secuencias exónicas del gen
SPI-1/PU.1 humano. El resultado del PCR se
puede evaluar analizando los productos de la reacción de PCR por
electroforesis en gel de agarosa o bien por PCR cuantitativa o a
tiempo real.
Claims (2)
1. Procedimiento para determinar la eficacia del
tratamiento y determinar el grado de progresión de la leucemia
mieloide crónica mediante el uso de
SPI-1/PU.1, caracterizado por las
siguientes etapas: a) determinación de la presencia de mRNA o
proteína SPI-1/PU.1 en células de médula ósea
o sangre periférica de pacientes de LMC. b) Comparación de los
niveles de mRNA o proteína de SPI-1/PU.1 de
las células del paciente con los de células que expresen
SPI-1/PU.1 (muestra de referencia) o bien
con muestra de mRNA del mismo paciente tras recibir el tratamiento a
evaluar.
2. Procedimiento para evaluar el pronóstico,
determinar la eficacia del tratamiento y determinar el grado de
progresión en la fase crónica de la LMC, según la reivindicación
primera, caracterizado porque la determinación específica de
la presencia de dicho marcador pronóstico
SPI-1/PU.1 se realiza mediante un ensayo de
RT-PCR usando oligonucleótidos cebadores
("primers") específicos del cDNA del gen
SPI-1/PU.1 humano, y usando RNA de células
de sangre periférica o de médula ósea de pacientes de LMC.
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- 2004-11-22 ES ES200402864A patent/ES2315040B2/es not_active Expired - Fee Related
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| ES2315040A1 (es) | 2009-03-16 |
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