ES2315227T3

ES2315227T3 - Genes que codifican los receptores de odorizantes de insecto y usos de los mismos.

Info

Publication number: ES2315227T3
Application number: ES00915898T
Authority: ES
Inventors: Leslie B. Vosshall; Hubert O. Amrein; Richard Axel
Original assignee: Columbia University
Current assignee: Columbia University
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: AU778993B2; EP1208111A4; CA2364966A1; EP1208111A2; EP1208111B1; DK1208111T3; PT1208111E; AU3709300A; WO2000050566A3; US20030186359A1; WO2000050566A2; ATE409704T1; US7241881B2; JP2003525022A; US20080009065A1; EP2058327A2; US20030143679A1; DE60040395D1; EP2058327A3

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor de odorizantes de insecto, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es idéntica a la expuesta para DORA45 en la SEC ID Nº: 107.

Description

Genes que codifican los receptores de odorizantes de insecto y usos de los mismos.

Esta solicitud reivindica prioridad y es una solicitud de continuación en parte del documento de Estados Unidos de Nº de Serie 09/257.706, presentado el 25 de febrero de 1999.

La invención descrita en este documento se realizó con financiación gubernamental bajo NIH:NIMH, 5P50, MH50733-05 y el NINDS, NS29832-07 del Departamento de Salud y Servicios Humanos. Por consiguiente, el gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

A lo largo de toda esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones mediante numeración arábiga entre paréntesis. Las cintas completas para estas publicaciones se presentan inmediatamente antes de las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

Todos los animales poseen una "nariz", un órgano sensorial olfativo que permite el reconocimiento y la discriminación de la información quimiosensorial presente en el entorno. Se cree que los seres humanos, por ejemplo, reconocen más de 10.000 olores diferentes con un poder discriminatorio exquisito de tal modo que diferencias sutiles en la estructura química pueden conducir con frecuencia a diferencias profundas en la calidad de olor percibida. ¿Qué mecanismos han evolucionado para permitir el reconocimiento y la discriminación de información olfativa compleja y cómo se traduce en última instancia la percepción olfativa en respuestas conductuales apropiadas?. El reconocimiento de los olores se consigue mediante receptores de odorizantes que residen en cilios olfativos, una especialización de las dendritas de las neuronas sensoriales olfativas. Los genes de receptores de odorizantes codifican nuevos receptores serpentina que atraviesan la membrana siete veces. En varias especies de vertebrados y en el invertebrado
Caenorhabditis elegans, hasta 1.000 genes codifican receptores de odorizantes, sugiriendo que 1-5% del potencial codificante del genoma en estos organismos está dedicado al reconocimiento de estímulos sensoriales olfativos (Buck y Axel, 1991; Levy et al., 1991; Parmentier et al., 1992; Ben-Arie et al., 1994; Troemel et al., 1995; Sengupta et al., 1996; Robertson, 1998). Por lo tanto, a diferencia de la visión de color en la que tres fotorreceptores pueden absorber luz por todo el espectro visible, estos datos sugieren que un pequeño número de receptores de odorizantes son insuficientes para reconocer el espectro completo de estructuras moleculares diferentes percibidas por el sistema olfativo. En su lugar, el sistema sensorial olfativo emplea un número extremadamente grande de receptores, siendo cada uno capaz de reconocer un pequeño número de ligandos olorosos.

La discriminación de la información olfativa requiere que el cerebro diferencie cuáles de los numerosos receptores se han activado por un odorizante. En mamíferos, neuronas sensoriales olfativas individuales expresan sólo uno de miles de genes de receptores de tal modo que las neuronas son funcionalmente diferentes (Ngai et al., 1993; Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993; Chess et al., 1994; Dulac y Axel, no publicado). Los axones de las neuronas olfativas que expresan un receptor específico convergen en dos glomérulos espacialmente invariantes entre los 1800 glomérulos dentro del bulbo olfatorio (Ressler et al., 1994; Vassar et al., 1994; Mombaerts et al., 1996; Wang et al., 1998). Por lo tanto, el bulbo proporciona un mapa espacial que identifica cuáles de los numerosos receptores se han activado dentro del epitelio sensorial. La calidad de un estímulo olfativo estaría codificada por lo tanto por combinaciones específicas de glomérulos activados por un odorizante dado.

La lógica de la discriminación olfativa es muy diferente en el nematodo C. elegans. A pesar del gran tamaño de la familia de genes de receptores de odorizantes, los odorizantes volátiles se reconocen únicamente por tres pares de células quimiosensoriales, de las que cada una expresa probablemente un gran número de genes de receptores (Bargmann y Horvitz, 1991; Colbert y Bargmann, 1995; Troemel et al., 1995). La activación de uno cualquiera de los múltiples receptores en una célula conducirá a la quimioatracción, mientras que la activación de receptores en una segunda célula dará como resultado una quimiorrepulsión (Troemel et al., 1997). El circuito neural específico activado por una neurona sensorial dada es, por lo tanto, el determinante de la respuesta conductual. Por lo tanto, este sistema sensorial olfativo de invertebrados conserva la capacidad de reconocer una amplia serie de odorizantes pero tiene sólo un limitado poder discriminatorio.

Los vertebrados generan una representación interna del mundo olfativo externo que debe traducir las características del estímulo en información neural. A pesar de elucidarse un mapa espacial preciso, ha sido difícil en vertebrados discernir cómo se descodifica esta información para relacionar el reconocimiento de olores con respuestas conductuales específicas. El análisis genético del comportamiento dirigido por el olfato en invertebrados puede proporcionar en última instancia un sistema para comprender el vínculo mecánico entre el reconocimiento de olores y el comportamiento. Los insectos proporcionan un sistema modelo atractivo para el estudio de los acontecimientos periféricos y centrales en el olfato porque presentan comportamientos dirigidos por el olfato sofisticados bajo el control de un sistema sensorial olfativo que es significativamente más sencillo anatómicamente que el de los vertebrados (Siddiqi, 1987; Carlson, 1996). El aprendizaje asociativo basado en el olfato, por ejemplo, es fuerte en insectos y da como resultado modificaciones discernibles en la representación neural de olores en el cerebro (Faber et al., 1998). Por lo tanto, puede ser posible asociar modificaciones en conexiones olfativas definidas con paradigmas in vivo para el aprendizaje y la memoria.

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El reconocimiento olfativo en la mosca de la fruta Drosophila se consigue mediante pelos sensoriales distribuidos sobre la superficie del tercer segmento antenal y el palpo maxilar. Las neuronas olfativas dentro de pelos sensoriales envían proyecciones a uno de 43 glomérulos dentro del lóbulo antenal del cerebro (Stocker, 1994; Laissue, et al., 1999). Los glomérulos están inervados por dendritas de las neuronas de proyección, el equivalente en insectos de las células mitrales en el bulbo olfatorio de los vertebrados, cuyos cuerpos celulares rodean a los glomérulos. Estas neuronas del lóbulo antenal, a su vez, se proyectan hacia el cuerpo pedunculado y el cuerno lateral del protocerebro (revisado en Stocker, 1994). La localización de la 2-desoxiglucosa en el mapa genómico de la mosca de la fruta (Rodrigues, 1988) y la formación de imágenes con calcio en la abeja (Joerges et al., 1997; Faber et al., 1998) demuestran que diferentes odorizantes provocan patrones definidos de actividad glomerular, lo cual sugiere que en insectos, así como en vertebrados, se representa un mapa topográfico de la calidad del olor en el lóbulo antenal. Sin embargo, en ausencia de los genes que codifican las moléculas receptoras, no ha sido posible definir una base física para este
mapa espacial.

En este estudio se identifica una gran familia de genes que probablemente codifican los receptores de odorizantes de Drosophila melanogaster. La clonación diferencial, junto con el análisis de secuencias genómicas de Drosophila, ha conducido a la identificación de una familia de supuestos receptores de 7 dominios transmembrana codificados probablemente por 100 a 200 genes dentro del genoma de Drosophila de acuerdo con la descripción de Clyne et al., 1999, Neuron 22, 327-338. Cada receptor se expresa en un pequeño subconjunto de células sensoriales (0,5-1,5%) que está espacialmente definido dentro de la antena y el palpo maxilar. Además, diferentes neuronas expresan complementos diferentes de genes de receptores de tal modo que las neuronas individuales son funcionalmente
diferentes.

La identificación de una gran familia de supuestos receptores de odorizantes en insectos indica que, como en otras especies, la diversidad y especificidad del reconocimiento del olor se proporcionan por una gran familia de genes de receptores. La identificación de la familia de supuestos genes de receptores de odorizantes puede proporcionar una nueva perspectiva de la lógica de la percepción olfativa en Drosophila.

Los insectos proporcionan un sistema atractivo para el estudio de la percepción sensorial olfativa. Se ha identificado una nueva familia de proteínas de 7 dominios transmembrana codificadas por 100 a 200 genes, que probablemente representan la familia de receptores de odorizantes de Drosophila. Los miembros de esta familia de genes se expresan en subpoblaciones definidas topográficamente de neuronas sensoriales olfativas en la antena o el palpo maxilar. Las neuronas sensoriales expresan diferentes complementos de genes de receptores de tal modo que neuronas individuales son funcionalmente diferentes. El aislamiento de genes de receptores de odorizantes candidatos junto con un análisis genético de comportamientos dirigidos por el olor en insectos puede proporcionar, en última instancia, un sistema para comprender el vínculo mecánico entre el reconocimiento del olor y el comportamiento.

Compendio de la invención

Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de odorizantes de insectos. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende: (a) una de las secuencias de ácido nucleico que se exponen en la Figura 8, (b) una secuencia que es degenerada con respecto a una secuencia de (a) como resultado del código genético; o (c) una secuencia que codifica una de las secuencias de aminoácidos que se exponen en la Figura 8.

Esta invención describe una molécula de ácido nucleico de al menos 12 nucleótidos capaz de hibridar específicamente con la secuencia de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Esta invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente. En otra realización, el vector es un plásmido.

Esta invención también proporciona un sistema de vector-hospedador para la producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un receptor de odorizantes de insecto que comprende el vector descrito anteriormente y una célula hospedadora adecuada.

Esta invención proporciona un método de producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un receptor de odorizantes de insecto, que comprende cultivar el sistema de vector-hospedador descrito anteriormente en condiciones que permitan la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido producido de este modo.

Esta invención también proporciona un receptor de odorizantes de insecto purificado. Esta invención describe además un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente.

Esta invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un receptor de odorizantes de insecto. Esta invención también describe un anticuerpo capaz de inhibir de forma competitiva la unión del anticuerpo capaz de unirse específicamente a un receptor de odorizantes de insecto.

Esta invención proporciona un método para identificar un inserto de ADNc que codifica receptores de odorizantes de insecto que comprende: (a) generar una genoteca de ADNc que contiene clones que llevan insertos de ADNc de neuronas sensoriales antenales o del palpo maxilar de un insecto; (b) hibridar ácidos nucleicos de los clones de las genotecas de ADNc generadas en la etapa (a) con una sonda que tiene una secuencia exclusivamente presente en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es idéntica a la expuesta para DORA45 en la SEC ID Nº: 107; y (c) aislar los ácidos nucleicos hibridados resultantes de tal modo que se identifique el inserto de ADNc que codifica el receptor de odorizantes de insecto.

Esta invención también describe insertos de ADNc identificados mediante el método anterior.

Esta invención describe además un método para identificar insertos de ADN que codifican receptores de odorizantes de insectos, que comprende: (a) generar genotecas de ADN que contienen clones que llevan insertos a partir de una muestra que contiene al menos una neurona antenal o del palpo maxilar; (b) poner en contacto los clones de las genotecas de ADNc generadas en la etapa (a) con una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con la secuencia que codifica un receptor de odorizantes de insecto en condiciones apropiadas que permitan la hibridación de las moléculas de ácido nucleico de los clones y la molécula de ácido nucleico; (c) seleccionar clones que hibriden con la molécula de ácido nucleico; y (d) aislar los clones que lleven los insertos hibridados, identificado de este modo los insertos que codifican los receptores de odorizantes.

Esta invención también describe un método para identificar insertos de ADN que codifican receptores de odorizantes de insectos, que comprende: (a) generar genotecas de ADN que contienen clones con insertos de una muestra que contiene al menos una neurona sensorial de la antena o del palpo maxilar; (b) poner en contacto los clones de las genotecas de ADN generadas en la etapa (a) con cebadores de una reacción en cadena de la polimerasa apropiados capaces de unirse específicamente a moléculas de ácido nucleico que codifican receptores de odorizantes en condiciones apropiadas que permitan la amplificación de los insertos hibridados mediante reacción en cadena de la polimerasa; (c) seleccionar los insertos amplificados; y (d) aislar los insertos amplificados, identificando de este modo los insertos que codifican los receptores de odorizantes.

Esta invención también proporciona un método para obtener un ácido nucleico que codifica un receptor de odorizantes a partir de un insecto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que contiene ácido nucleico procedente de un insecto con cebadores de una reacción en cadena de la polimerasa que hibridan específicamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es idéntica a la expuesta para DORA45 en la SEC ID Nº: 107 en condiciones apropiadas que permitan la hibridación de los cebadores con el ácido nucleico para producir un producto de hibridación; (b) amplificar el producto de hibridación resultante usando una reacción en cadena de la polimerasa; y (c) aislar las moléculas amplificadas, obteniéndose de este modo el ácido nucleico que codifica el receptor de odorizantes a partir del insecto.

Esta invención también proporciona un método para transformar células, que comprende transfectar una célula hospedadora con un vector adecuado descrito anteriormente. Esta invención también proporciona células transformadas producidas por el método anterior.

Esta invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de unirse específicamente a un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto una célula transformada o una fracción de membrana de las células transformadas descritas anteriormente con el compuesto en condiciones que permitan la unión del compuesto con el receptor de odorizantes, detectándose la presencia de cualquiera de dichos compuestos unidos específicamente al receptor y, de este modo, identificándose el compuesto como un compuesto que se une específicamente al receptor de odorizantes de insecto.

Esta invención proporciona un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto un receptor de odorizantes de insecto purificado con el compuesto en condiciones que permitan la unión del compuesto con dicho receptor purificado, detectándose la presencia de cualquiera de dichos compuestos unidos específicamente al receptor y, de este modo, identificándose el compuesto como un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto.

Esta invención también describe un método para identificar un compuesto capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto las células transfectadas o fracciones de membrana de las células transfectadas descritas anteriormente con el compuesto en condiciones que permitan la activación de una respuesta de receptor de odorizantes funcional, indicando la activación del receptor que compuesto es capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes.

Esta invención también describe un método para identificar un compuesto capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes que comprende poner en contacto un receptor de odorizantes de insecto purificado con el compuesto en condiciones que permitan la activación de una respuesta de un receptor de odorizantes funcional, indicando la activación del receptor que el compuesto es capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes. En una realización, el receptor purificado esta incorporado en una bicapa lipídica.

Esta invención también describe un método para identificar un compuesto capaz de inhibir la actividad de un receptor de odorizantes, que comprende poner en contacto las células transfectadas o fracciones de membrana de las células transfectadas descritas anteriormente con una cantidad apropiada del compuesto en condiciones que permitan la inhibición de una respuesta de receptor de odorizantes funcional, indicando la inhibición de la respuesta del receptor que el compuesto es capaz de inhibir la actividad de un receptor de odorizantes.

Esta invención describe un método para identificar un compuesto capaz de inhibir la actividad de un receptor de odorizantes, que comprende poner en contacto una cantidad apropiada del receptor de odorizantes de insecto purificado con una cantidad apropiada del compuesto en condiciones que permitan la inhibición de una respuesta de receptor de odorizantes funcional, indicando la inhibición de la respuesta del receptor que el compuesto es capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes. En una realización, el receptor purificado está incorporado en una bicapa lipídica.

Esta invención también describe el compuesto identificado por los métodos descritos anteriormente.

Esta invención describe un método de control de poblaciones de plagas que comprende identificar ligandos odorizantes mediante el método descrito anteriormente que son ligandos odorizantes de alarma y pulverizar el área deseada con los ligandos odorizantes identificados.

Por último, esta invención describe un método de control de una población de plaga que comprende identificar ligandos odorizantes mediante el método descrito anteriormente que interfieren con la interacción entre los ligandos odorizantes y los receptores de odorizantes que se asocian con la fertilidad.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Identificación de genes específicos de la antena y el palpo maxilar poco comunes

Se sometieron fagos específicos de la antena/palpo maxilar candidatos a una escisión in vivo, digestión de los ADN plasmídicos de pBLUESCRIPT resultantes con BamHI/Asp718 y electroforesis en geles de agarosa al 1,5%. Se hibridaron transferencias de southern con sondas de ADNc marcadas con ^{32}P generadas a partir de ARNm de la antena/palpo maxilar (Panel A), ARNm de cabeza menos antena/palpo maxilar (Panel B) o ARNm de cuerpo de hembra virgen (Panel C). El gel teñido con bromuro de etidio se muestra en el Panel D. De los trece clones que se presentan en esta figura, cuatro parecen ser específicos de la antena/palpo maxilar (calles 5, 7, 9 y 11). Sin embargo, sólo dos se expresan de forma selectiva en subconjuntos de células en órganos quimiosensoriales de la mosca adulta. DOR104, un supuesto receptor de odorizantes del palpo maxilar está en la Calle 9. El clon de la Calle 11 (RN106) es homólogo a la lipoproteína y las triglicérido lipasas y se expresa en un dominio restringido en la antena (no se muestran los datos).

Figura 2

Expresión de DOR104 en un subconjunto de neuronas del palpo maxilar

(A) Una sección frontal de un palpo maxilar adulto se hibridó con una sonda de ARN antisentido marcada con digoxigenina y se visualizó con anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Se pueden ver siete células que expresan DOR104 en esta sección de 15 \mum, que representa aproximadamente un tercio del diámetro del palpo maxilar. Se puntuaron secciones seriadas de múltiples palpos maxilares en relación con la expresión de DOR104 y, en promedio, son positivas para este receptor 20 células por palpo maxilar.

(B) Se tiñeron moscas transgénicas que llevan un transgén indicador de DOR104-lacZ con X-GAL en una preparación montada completa. Los palpos maxilares se diseccionaron de la cabeza y se observaron en una preparación con cubreobjetos aplanada bajo óptica de Normaski, que permite la visualización de las 20 células que expresan DOR104-lacZ.

(C) En esta sección horizontal de un palpo maxilar son visibles dendritas y axones de neuronas que expresan DOR104-lacZ. La expresión de lacZ se visualizó con un anticuerpo primario anti-\beta-galactosidasa policlonal y un anticuerpo secundario conjugado con CY3. Las secciones se observaron bajo epifluorescencia y se fotografiaron sobre película negra y blanca.

Figura 3

Secuencias de aminoácidos predichas de genes de receptores de odorizantes de Drosophila

Se alinean secuencias de aminoácidos deducidas de 12 genes DOR usando ClustalW (MacVector, Oxford Molecular). Las posiciones predichas de las regiones transmembrana (I-VII) se indican mediante barras por encima del alineamiento. Las identidades de los aminoácidos se marcan con un sombreado oscuro y las similitudes se indican con un sombreado claro. Las secuencias proteicas de DOR87, 53, 67, 104 y 64 se obtuvieron a partir de clones de ADNc. Todas las demás se obtuvieron a partir de predicciones de GENSCAN de organizaciones intrón-exón en ADN genómico, como se indica mediante la letra "g" después del nombre del gen. Se obtuvo un clon de ADNc parcial para DOR62 y se descubrió que tenía una identidad del 100% con la proteína de GENSCAN en la región de los aminoácidos 245-381. Se predijo una extensión de 40 aminoácidos para DOR19 mediante el análisis del GENSCAN. Ésta se reemplazó por un asterisco en el alineamiento, y el aislamiento de clones de ADNc para este receptor resolverá si está extensión está físicamente presente en la proteína.

Figura 4

Expresión de genes de receptores en regiones espacialmente restringidas de la antena

Cada una de las sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina contra 8 genes DOR hibrida con un pequeño número de células distribuidas en regiones diferentes de la antena. El número total de células por antena que expresan un receptor dado se obtuvo por recuento de las células positivas en secciones seriadas de múltiples antenas. Existen aproximadamente 20 células positivas por antena para DOR67 (A), 53 (B) y 24 (no se muestran los datos); 15 células positivas para DOR62 (C) y 87 (D); y 10 células positivas para DOR64 (E). El número real de células que se tiñen en estas secciones es un subconjunto de este número total. Con la excepción de DOR53 y DOR67, que presentan una fuerte hibridación cruzada, los genes de receptores probablemente identifican diferentes neuronas olfativas, de tal modo que el número de células que se tiñen con una sonda mixta (F) es igual a la suma de las que se tiñen con las sondas individuales (A-E). La mezcla de DOR53, 67, 62, 87 y 64 marca un total de aproximadamente 60 células por antena. Un total de 34 células se tiñen con la sonda mixta en esta sección de 15 \mum. La expresión de los genes ligados DOR71, DOR72 y DOR73 se muestra en los paneles (G), (H) e (I), respectivamente. DOR71 se expresa en aproximadamente 10 células en el palpo maxilar. Se observan cinco células positivas en la sección horizontal en el panel (G). También se examinó la expresión de los otros miembros de este grupo de ligamiento y se descubrió DOR72 en
aproximadamente 15 células (de las que 3 se marcan en esta sección) (H) y DOR73 en de 1 a 2 células por antena (I).

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Figura 5

Los receptores de odorizantes están restringidos a diferentes poblaciones de neuronas olfativas

(A-C) Las moscas del genotipo C155 elav-GAL4; UAS-lacZ expresan lacZ citoplasmático en todas las células neuronales. Los paneles (A-C) muestran imágenes confocales de una sección del palpo maxilar horizontal de una mosca incubada con una sonda de ARN antisentido contra DOR104 (rojo) y un anticuerpo anti-\beta-galactosidasa (verde). DOR104 reconoce cinco células en esta sección del palpo maxilar (A), expresando todas ellas también elav-lacZ (B), como se demuestra por las células amarillas en la imagen combinada en el panel (C).

(D, E) DOR64 y DOR87 se expresan en neuronas no solapantes en la punta de la antena. Se hibridaron sondas de ARN antisentido para DOR64 (digoxigenina-ARN; rojo) y DOR87 (FITC-ARN; verde) en las mismas secciones antenales y se observaron mediante microscopía confocal. El Panel (D) es una superposición digital de imágenes confocales tomadas a intervalos de 0,5 \mum a través de una sección de 10 \mum de la antena. Las células en diferentes planes focales expresan ambos receptores, pero no se encuentran células con doble marcaje.

(F, G) Una hibridación in situ de ARN de dos colores con receptores de odorizantes y proteínas de unión a odorizantes demuestra que estas proteínas se expresan en diferentes poblaciones de células. DOR53 (FITC-ARN; verde) marca unas pocas células interna a la cutícula en el borde medio proximal, mientras que PBPRP2 (digoxigenina-ARN; rojo) marca un gran número de células yuxtapuestas a la cutícula por toda la antena (F). La proteína de unión a odorizante más restringida OS-F (digoxigenina-ARN, rojo) también tiñe a células diferentes de las que expresan DOR67 (FITC-ARN; verde) (G).

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Figura 6

La expresión de receptores está conservada entre individuos

Se hibridaron secciones frontales de antenas de seis individuos diferentes con sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina contra DOR53 (A-C) o DOR87 (D-F). DOR53 marca aproximadamente 20 células en el borde medio proximal de la antena, de las que aproximadamente 5 se muestran marcadas en estas secciones. DOR87 se expresa en aproximadamente el mismo de número de células en la punta distal. Tanto la posición como el número de células que se tiñen se conservan entre diferentes individuos y no presentan dimorfismo sexual.

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Figura 7

Los receptores de odorizantes de Drosophila son muy divergentes

Se digirió ADN genómico de Oregon R aislado de moscas completas con BamHI (B), EcoRI (E) o HindIII (H), se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% y se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Las manchas de transferencia se hibridaron con sondas marcadas con ^{32}P obtenidas a partir de ADNc de DOR53 (A), ADNc de DOR67 (B) o fragmentos de ADN generados por RT-PCR a partir de ARNm antenal para DOR24 (C), DOR62 (D) y DOR72 (E). Se observa una fuerte hibridación cruzada de DOR53 y DOR67 tanto a rigurosidad elevada como reducida (A, B), mientras que DOR24, 62 y 72 revelan sólo una única banda de hibridación en cada calle tanto a rigurosidad reducida (C-E) como a rigurosidad elevada (no se muestran los datos).

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Figura 8

DOR62, 104, 87, 53, 67, 64, 71g, 72g, 73g, 46, 19g y 24g

Se describe tanto la secuencia de ácido nucleico de cada DOR como su secuencia de aminoácidos codificada.

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Figura 9

Análisis de las proyecciones axonales de neuronas receptoras olfativas que expresan un receptor de odorizantes de Drosophila dado

Resultado: todas las neuronas que expresan un receptor dado envían sus axones a un único glomérulo o una estructura sináptica separada en el centro de procesamiento olfativo del cerebro de la mosca. Este resultado es idéntico al obtenido con receptores de odorizantes del ratón: cada glomérulo se destina a recibir la entrada axonal de neuronas que expresan un receptor de odorizantes dado. Por lo tanto, este resultado refuerza el argumento de que estos genes funcionan de hecho como receptores de odorizantes en Drosophila.

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Figura 10

Alineamientos de ClustalW de dos subfamilias de los receptores de odorizantes de Drosophila las familias DOR53 (A-1 y A-2) y DOR64 (B)

Esta figura destaca las similitudes de secuencia entre genes DOR que son distintivos de diagnóstico de las proteínas. Los restos que son idénticos en diferentes genes DOR se destacan en negro, mientras que los restos que son similares se destacan en gris.

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Descripción detallada de la invención

Para facilitar la comprensión de la sección de Procedimientos Experimentales que sigue, se describen ciertos métodos y/o términos que aparecen frecuentemente en Sambrook, et al., (1989).

A lo largo de toda esta solicitud se usan las siguientes abreviaturas convencionales en toda la memoria descriptiva para indicar nucleótidos específicos:

C = citosina: A = adenosina

T = timidina: G = guanosina

Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de odorizantes de insecto. El ácido nucleico incluye, pero no se limita a ADN, ADNc, ADN genómico, ADN sintético o ARN. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica un receptor de odorizantes de Drosophila.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico aislada comprende: (a) una de las secuencias de ácido nucleico que se exponen en la Figura 8, (b) una secuencia que es degenerada con respecto a una secuencia de (a) como resultado del código genético; o (c) una secuencia que codifica uno de las secuencias de aminoácidos que se expone en la Figura 8.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican un receptor de insecto incluyen moléculas que codifican análogos polipeptídicos, fragmentos o derivados de polipéptidos antigénicos que difieren de las formas de origen natural en términos de la identidad o localización de uno o más restos aminoacídicos (análogos de deleción que contienen menos de todos los restos especificados para la proteína, análogos de sustitución en los que uno o más restos especificados se reemplazan por otros restos y análogos de adición en los que uno o más restos aminoacídicos se añaden a una parte terminal o media de los polipéptidos) y que comparten algunas o todas las propiedades de las formas naturales.

Estas moléculas incluyen, pero sin limitación: la incorporación de codones "preferidos" para la expresión por hospedadores no mamíferos seleccionados; el suministro de sitios para escisión por enzimas endonucleasas de restricción; y el suministro de secuencias iniciales, terminales o intermedias adicionales que faciliten la construcción de vectores expresados fácilmente. Por consiguiente, estos cambios pueden dar como resultado un receptor de odorizantes de insecto modificado. Esta invención tiene la intención de incluir moléculas de ácido nucleico que codifican receptores de odorizantes de insectos modificados. Además, para facilitar la expresión del receptor en diferentes células hospedadoras, puede ser necesario modificar la molécula de tal modo que los receptores expresados puedan alcanzar la superficie de las células hospedadoras. El receptor de odorizantes de insecto modificado debe tener actividades biológicas similares a las del receptor de odorizantes de insecto no modificado. Las moléculas también pueden modificarse para aumentar la actividad biológica del receptor expresado.

Esta invención describe una molécula de ácido nucleico de al menos 12 nucleótidos capaz de hibridar específicamente con la secuencia de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. En una realización, la molécula de ácido nucleico hibrida con una secuencia única dentro de la secuencia de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Esta molécula de ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, ADN genómico, ADN sintético o ARN.

Esta invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente. En otra realización, el vector es un plásmido.

En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente está unida operativamente a un elemento regulador.

Los elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen secuencias promotoras para unirse a una ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para la unión al ribosoma. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano incluye un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la transcripción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG. De forma similar, un vector de expresión eucariota incluye un promotor heterólogo u homólogo para la ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación cadena abajo, el codón de inicio AUG y un codón de terminación para la separación del ribosoma. Dichos vectores pueden obtenerse en el mercado o ensamblarse a partir de las secuencias descritas por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los métodos descritos anteriormente para la construcción de vectores en general.

Esta invención también proporciona un sistema de vector-hospedador para la producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un receptor de odorizantes de insecto que comprende el vector descrito anteriormente y un hospedador adecuado.

Esta invención también proporciona un sistema de vector-hospedador en el que el hospedador adecuado es una célula bacteriana, célula de levadura, célula de insecto o célula animal. La célula hospedadora del sistema de expresión anterior puede seleccionarse del grupo que consiste en células en las que la proteína de interés se expresa normalmente o células extrañas tales como células bacterianas (tales como E. coli), células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de nematodo, células vegetales o animales en las que proteína de interés no se expresa normalmente. Las células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, células Vero, células HeLa, células Cos, células Cos, células CV1 y diversas células primarias de mamífero.

Esta invención proporciona un método de producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un receptor de odorizantes de insecto que comprende cultivar el sistema de vector-hospedador descrito anteriormente en condiciones que permitan la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido producido de este modo.

Esta invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un receptor de odorizantes de insecto. Esta invención también describe un anticuerpo capaz de inhibir de forma competitiva la unión del anticuerpo capaz de unirse específicamente a un receptor de odorizantes de insecto. En una realización, el anticuerpo es monoclonal. En otra realización, el anticuerpo es policlonal.

El anticuerpo monoclonal dirigido contra un receptor de odorizantes de insecto puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido contra un epítopo de un receptor de odorizantes de insecto presente en la superficie de una célula. Las secuencias de aminoácidos pueden analizarse por métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica para determinar si producen regiones hidrófobas o hidrófilas en las proteínas con las que se construyen. En el caso de proteínas de membrana celular, se sabe bien que las regiones hidrófobas forman la parte de la proteína que se inserta en la bicapa lipídica que forma la membrana celular, mientras que las regiones hidrófilas se localizan en la superficie celular en un entorno acuoso.

Los anticuerpos dirigidos contra un receptor de odorizantes de insecto pueden ser procedentes del suero o monoclonales y se preparan usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se preparan anticuerpos monoclonales usando la tecnología de hibridomas por fusión de células B productoras de anticuerpo de animales inmunizados con células de mieloma y selección de la línea celular de hibridoma resultante que produce el anticuerpo deseado. Pueden usarse células tales como células NIH3T3 o células 293 que expresan el receptor como inmunógenos para generar dicho anticuerpo. Como alternativa, pueden prepararse péptidos sintéticos usando máquinas disponibles en el mercado.

Como otra alternativa adicional, puede clonarse y expresarse el ADN, tal como un ADNc o un fragmento del mismo, que codifica el receptor o una parte del receptor. El polipéptido expresado se recupera y se usa como un inmunógeno.

Los anticuerpos resultantes son útiles para detectar la presencia de receptores de odorizantes de insecto o para inhibir la función del receptor en animales vivos, en seres humanos o en tejidos o fluidos biológicos aislados a partir de animales o seres humanos.

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Estos anticuerpos pueden ser útiles para identificar o aislar otros receptores de odorizantes de insecto. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos contra el receptor de odorizantes de Drosophila para explorar una biblioteca de expresión de cucaracha para un receptor de odorizantes de cucaracha. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales monoespecíficos contra un receptor de odorizantes de insectos seleccionado. Diferentes bibliotecas de expresión de insectos están fácilmente disponibles y pueden generarse usando tecnologías bien conocidas en la técnica.

Un medio para aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de odorizantes de insecto es sondar una biblioteca con una sonda natural o diseñada artificialmente usando métodos bien conocidos en la técnica. Las sondas pueden ser de ADN o ARN. La biblioteca puede ser de ADNc o ADN genómico.

Esta invención proporciona un método para identificar un inserto de ADNc que codifica receptores de odorizantes de insecto, que comprende: (a) generar una genoteca de ADNc que contiene clones que llevan insertos de ADNc a partir de neuronas sensoriales de la antena o del palpo maxilar de un insecto; (b) hibridar ácidos nucleicos de los clones de las genotecas de ADNc generadas en la etapa (a) con una sonda que tiene una secuencia exclusivamente presente en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es idéntica a la expuesta para DORA45 en la SEC ID Nº: 107; y (c) aislar los ácidos nucleicos hibridados resultantes para identificar de este modo el inserto de ADNc que codifica el receptor de odorizantes de insecto.

En una realización del método anterior, después de la etapa (c), comprende además: (a) amplificar los insertos de los clones seleccionados mediante reacción en cadena de la polimerasa; (b) hibridar los insertos amplificados con sondas a partir de las neuronas de la antena o del palpo maxilar; y (c) aislar los clones que lleven los insertos hibridados identificando de este modo los insertos que codifican los receptores de odorizantes. En una realización, las sondas son sondas de ADNc.

Los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa apropiados pueden seleccionarse a partir de las regiones conservadas de las secuencias de receptores de odorizantes de insectos conocidas. Como alternativa, los cebadores pueden seleccionarse a partir de las regiones que son los sitios activos para la unión de ligandos.

Esta invención también describe insertos de ADNc identificados por el método anterior.

Esta invención describe además un método para identificar insertos de ADN que codifican receptores de odorizantes de insectos, que comprende: (a) generar genotecas de ADN que contienen clones que llevan insertos a partir de una muestra que contiene al menos una neurona antenal o del palpo maxilar; (b) poner en contacto clones de las genotecas de ADNc generadas en la etapa (a) con una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con la secuencia que codifica un receptor de odorizantes de insecto en condiciones apropiadas que permitan la hibridación de las moléculas de ácido nucleico de los clones y la molécula de ácido nucleico; (c) seleccionar clones que hibriden con la molécula de ácido nucleico; y (d) aislar los clones que llevan los insertos hibridados, identificándose de este modo los insertos que codifican los receptores de odorizantes.

Esta invención también describe un método para identificar insertos de ADN que codifican receptores de odorizantes de insecto, que comprende: (a) generar genotecas de ADN que contienen clones con insertos a partir de una muestra que contiene al menos una neurona sensorial de la antena o del palpo maxilar; (b) poner en contacto los clones de las genotecas de ADN generadas en la etapa (a) con cebadores de reacción en cadena de la polimerasa apropiados capaces de unirse específicamente a moléculas de ácido nucleico que codifican receptores de odorizantes en condiciones apropiadas que permiten la amplificación de los insertos hibridados mediante reacción en cadena de la polimerasa; (c) seleccionar los insertos amplificados; y (d) aislar los insertos amplificados, identificándose de este modo los insertos que codifican los receptores de odorizantes.

Esta invención también proporciona un método para obtener un ácido nucleico que codifica un receptor de odorizantes a partir del insecto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que contiene un ácido nucleico de origen de insecto con cebadores de reacción en cadena de la polimerasa que hibridan específicamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es idéntica a la expuesta para DORA45 en la SEC ID Nº: 107 en condiciones apropiadas que permitan la hibridación de los cebadores con el ácido nucleico para producir un producto de hibridación; (b) amplificar el producto de hibridación resultante usando una reacción en cadena de la polimerasa; y (c) aislar las moléculas amplificadas, obteniéndose de este modo el ácido nucleico que codifica el receptor de odorizantes del insecto.

Esta invención también proporciona un método para transformar células que comprende transfectar una célula hospedadora con un vector adecuado descrito anteriormente.

Esta invención también proporciona células transformadas producidas por el método anterior. En una realización, las células hospedadoras son células que habitualmente no expresan receptores de odorizantes. En otra realización, las células hospedadoras están expresando receptores de odorizantes.

Esta invención proporciona un método de identificación de un compuesto capaz de unirse específicamente a un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto una célula transformada o una fracción de membrana de la célula transformada descrita anteriormente con el compuesto en condiciones que permiten la unión del compuesto con el receptor de odorizantes, detectar la presencia de cualquiera de dichos compuestos unidos específicamente al receptor e identificar de este modo el compuesto como un compuesto que se une específicamente al receptor de odorizantes de insecto.

Esta invención proporciona un método de identificación de un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto un receptor de odorizantes de insecto purificado con el compuesto en condiciones que permiten la unión del compuesto con dicho receptor purificado, detectar la presencia de cualquiera de dichos compuestos unidos específicamente al receptor e identificar de este modo el compuesto como un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto. En una realización, el receptor purificado está incorporado en una bicapa lipídica. El receptor purificado puede estar incorporado en los liposomas con una orientación adecuada para llevar a cabo funciones normales. La tecnología de liposomas se conoce bien en la técnica.

Esta invención también describe un método de identificación de un compuesto capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner contacto las células transfectadas o fracciones de membrana de las células transfectadas descritas anteriormente con el compuesto en condiciones que permiten la activación de una respuesta de receptor de odorizantes funcional, indicando la activación del receptor que el compuesto es capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes.

Esta invención también describe un método de identificación de un compuesto capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes, que comprende poner en contacto un receptor de odorizantes de insecto purificado con el compuesto en condiciones que permitan la activación de una respuesta de receptor de odorizantes funcional, indicando la activación del receptor que el compuesto es capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes. En una realización, el receptor purificado está incorporado en una bicapa lipídica.

Esta invención también describe un método de identificación de un compuesto capaz de inhibir la actividad de un receptor de odorizantes, que comprende poner en contacto las células transfectadas o fracciones de membrana de las células transfectadas descritas anteriormente con una cantidad apropiada del compuesto en condiciones que permitan la inhibición de una respuesta de receptor de odorizantes funcional, indicando la inhibición de la respuesta del receptor que el compuesto es capaz inhibir la actividad de un receptor de odorizantes.

Esta invención describe un método de identificación de un compuesto capaz de inhibir la actividad de un receptor de odorizantes, que comprende poner en contacto una cantidad apropiada del receptor de odorizantes de insecto purificado con una cantidad apropiada del compuesto en condiciones que permiten la inhibición de una respuesta de un receptor de odorizantes funcional, indicando la inhibición de la respuesta del receptor que el compuesto es capaz de activar la actividad de un receptor de odorizantes. En una realización, el receptor purificado está incorporado en una bicapa lipídica.

En una realización separada del método anterior, el compuesto no se conoce previamente. Esta invención también proporciona el compuesto identificado por los métodos descritos anteriormente.

Por último, esta invención describe un método de control de una población de plagas, que comprende identificar ligandos odorizantes mediante el método descrito anteriormente que interfieren con la interacción entre los ligandos odorizantes y los receptores de odorizantes que están asociados con la fertilidad.

Esta invención se entenderá mejor a partir de los procedimientos experimentales que se proporcionan a continuación. Sin embargo, un especialista en la técnica apreciará fácilmente que los métodos específicos y resultados analizados son simplemente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que vienen a continuación.

Procedimientos experimentales Animales de experimentación

Se criaron moscas Oregon R (Drosophila melanogaster) sobre medio convencional de harina de maíz-agar-melazas a 25ºC. Se inyectaron construcciones transgénicas en embriones yw. Se obtuvieron moscas C155 elav-GAL4 de Corey Goodman (Lin y Goodman, 1994) y Gary Struhl suministró la reserva de UAS-lacZ (citoplasmático).

Preparación y exploración diferencial de una genoteca de ADNc de antena/palpo maxilar de Drosophila

Se obtuvieron antenas y palpos maxilares de Drosophila por decapitación manual y congelación de 500 moscas adultas y agitación de las antenas y palpos maxilares a través de un tamiz metálico fino. Se preparó ARNm usando un kit de purificación de ARN poliA+ (Stratagene). Se preparó una genoteca de ADNc de antena/palpo maxilar a partir de 0,5 \mug de ARNm usando el kit LambdaZA-PIIXR de Stratagene.

En resumen, se cultivaron en placas fagos a baja densidad (500-1000 pfu/placa de 150 mm) y se entrecruzaron por luz UV después de elevar los cultivos por triplicado a Hybond-N+ (Amersham). Se generaron sondas complejas por marcaje con cebado aleatorio (PrimeltII, Stratagene) de ARNm transcrito por transcripción inversa (kit de RT-PCR, Stratagene) a partir de ARNm corporal de hembras adultas vírgenes y los cultivos por duplicado se hibridaron a rigurosidad elevada durante 36 horas (65ºC en tampón fosfato sódico 0,5 M [pH 7,3] que contenía albúmina de suero bovino al 1%, SDS al 4% y ADN de esperma de arenque a 0,5 mg/ml). Se exploró previamente el tercer cultivo con una mezcla de todas las OBP/PBP clonadas anteriormente (McKenna et al., 1994; Pikielny et al., 1994; Kim et al., 1998) para eliminar una fuente de clones específicos olfativos abundantes pero no deseada. Se aislaron aproximadamente 5.000 OBP/PBP individuales y clones de fagos negativos de cuerpos de hembras vírgenes, se amplificaron sus insertos mediante PCR con cebadores T3 y T7 y aproximadamente 3 \mug de ADN se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,5%. Los geles se transfirieron por duplicado a Hybond-N+ (Amersham), los filtros se entrecruzaron por UV y las transferencias de Southern resultantes se sometieron a análisis de Northern inverso usando sondas complejas generadas a partir de ARNm de cuerpo de hembra virgen. Se identificaron aproximadamente 500 clones que no hibridaban con sondas de cuerpo de hembra virgen y se consolidaron en transferencias de Southern secundarias por triplicado. Estas manchas de transferencia se sondaron con sondas complejas obtenidas de ARNm de la antena/palpo maxilar, de la cabeza menos la antena/palpo maxilar y de cuerpo de hembra virgen. Un total de 210 clones negativos con sondas de cabeza menos antena/palpo maxilar y cuerpos de hembra virgen y fuertemente positivos, débilmente positivos o negativos con sondas de la antena/palpo maxilar se analizaron adicionalmente por secuenciación e hibridación in situ.

Análisis de secuencias del proyecto genoma de Drosophila para proteínas transmembrana

Todas las secuencias genómicas de Drosophila se descargaron de manera discontinua en abril de 1998 del Proyecto Genoma de Drosophila de Berkeley (Berkeley Drosophila Genoma Project, sin publicar). Las secuencias P1 genómicas se analizaron primero con el programa GENSCAN (Burge y Karlin, 1997; http://CCR-081.mit.edu/GENSCAN.html), que predice estructuras de intrones-exones y genera secuencias codificante hipotéticas (CDS) y fases de lectura abiertas. Las proteínas predichas por GENSCAN más cortas de 50 aminoácidos se descartaron. Las fases de lectura abiertas restantes se usaron para buscar supuestas regiones transmembrana mayores de 15 aminoácidos con dos programas que se obtuvieron de los autores y se usaron localmente de modo autónomo (véase Persson y Argos, 1994; Cserzo et al., 1997). El programa Dense Surface Alignment (DAS) está disponible en http://www.biokemi.su.se/-server/DAS/ o de M. Cserzo (miklos@pugh.bip.bham.ac.uk). TMAP está disponible en ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/unix/ o por contacto con el autor, Bengt Persson (bpn@mmb.ki.se). Se escribieron guiones para aplicar los programas DAS y TMAP de forma repetida a conjuntos de secuencias a escala de genoma. Se eliminaron los genes que mostraban una similitud de secuencias significativa con la base de datos de proteínas no redundante del NCBI usando análisis BLAST
(Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997). Todos los guiones necesarios para estos cálculos se escribieron en ANSI C convencional y se procesaron en un SUN Enterprise 3000.

De las 229 nuevas proteínas de Drosophila con tres o más regiones transmembrana predichas, 35 no mostraban una similitud de secuencia clara con ninguna proteína conocida y se seleccionaron para un análisis adicional mediante hibridación in situ. Se generaron sondas para hibridación in situ mediante RT-PCR usando ARNm de la antena/palpo maxilar como molde.

Posiciones de mapa de genes DOR

La posición cromosómica de DOR104 se determinó mediante hibridación in situ de una sonda marcada con biotina con material obtenido por la técnica de aplastamiento de cromosoma politeno de glándula salival como se describe (Amrein et al., 1988).

Las posiciones cromosómicas de todos los demás genes DOR se basaron en las asignaciones de cromosomas de los clones P1 con los que mapean, como se determinó por el Proyecto Genoma de Drosophila de Berkeley (comunicación personal; http://www.fruitfly.org; véase también Hartl et al., 1994; Kimmerly et al., 1996). DOR62 se localiza un cósmido secuenciado por el Proyecto Genoma de Drosophila Europeo (sin publicar; http://edgp.ebi.ac.uk/; Siden-Klamos et al., 1990).

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El aislamiento de clones de ADNc de DOR y transferencia de Southern

Se exploraron 3x10^{6} clones de la genoteca de la antena/palpo maxilar descrita anteriormente con sondas de PCR para los genes DOR87, DOR53, DOR67, DOR64 y DOR62. Estaban presentes ADNc a una frecuencia que variaba de 1:200.000 (DOR67) a 1:1.000.000 (DOR62) en la genoteca y sus secuencias eran destacadamente similares a las CDS hipotéticas predichas por el programa GENSCAN. La frecuencia de estos genes es similar a la de DOR104, que está presente en 1:125.000 en la genoteca de la antena/ palpo maxilar. Toda la secuenciación se realizó con kits de secuenciación de ciclo ABI y las reacciones se procesaron en un sistema de secuenciación ABI 310 ó 377.

Cinco \mug de ADN genómico de Oregon R aislado a partir de moscas completas se digirieron con BamHI, EcoRI o HindIII, se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Nitropure (Micron Separations Inc.). Las manchas de transferencia se hornearon y se hibridaron con sondas marcadas con ^{32}P obtenidas a partir de sondas de ADNc de DOR53 y DOR67, o fragmentos de PCR de DOR24, DOR62 y DOR72. La hibridación se realizó a 42ºC durante 36 horas en SSCP 5 X, Denhardts 10X, ADN de esperma de arenque 500 \mug/ml y formamida al 50% (rigurosidad elevada) o al 25% (rigurosidad reducida) (Sambrook et al., 1989). Las manchas de transferencia se lavaron durante 1 hora en SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC (rigurosidad elevada) o SSC 1X, SDS al 0,5% a 42ºC (rigurosidad reducida).

Hibridación in situ

Se llevó a cabo una hibridación in situ de ARN esencialmente como se describe (Schaeren-Wiemers y Gerfin-Moser, 1993). Este protocolo se modificó para incluir detergentes en la mayoría de las etapas para aumentar la sensibilidad y reducir el efecto de fondo. El tampón de hibridación contenía formamida al 50%, SSC 5X, Denhardts 5X, ARNt de levadura a 250 \mug/ml, ADN de esperma de arenque a 500 \mug/ml, heparina a 50 \mug/ml, EDTA 2,5 mM, Tween-20 al 0,1% y CHAPS al 0,25%. Todas las etapas de anticuerpo se realizaron en presencia de Tritón X-100 al 0,1% y la reacción se desarrolló en tampón que contenía Tween-20 al 0,1%. Los portaobjetos se montaron en Glycergel (DAKO) y se observaron con óptica de Normarski.

Se llevó a cabo una hibridación in situ fluorescente como anteriormente con sondas de ARN marcadas con digoxigenina o FITC. La sonda de digoxigenina se visualizó con anti-digoxigenina de oveja (Boehringer) seguido de anticuerpo de burro anti-CY3 de oveja (Jackson). Se visualizaron las sondas con anticuerpo de ratón anti-FITC (Boehringer) y anticuerpo de cabra anti-ratón Alexa 488 (Molecular Probes) después de la preincubación con suero de cabra normal. Las secciones se montaron en reactivo de Vectashield (Vector Labs) y se observaron en un Microscopio Confocal Biorad 1024.

Para el marcaje doble con un marcador neural, los animales del genotipo C155 elav-Gal4; UAS-lacZ se seccionaron y se hibridaron primero con una sonda de ARN de DOR104 antisentido marcada con digoxigenina y se desarrollaron como se ha descrito anteriormente. La expresión específica de neurona de lacZ dirigida por el potenciador trap de elav-Gal4 se visualizó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-\beta-galactosidasa (Organon-Technika/Cappel), visualizado mediante un anticuerpo secundario conjugado de cabra anti-conejo Alexa 488 (Molecular Probes) después de la preincubación con suero de cabra normal.

La proporción de neuronas en el tercer segmento antenal se calculó por comparación del número de núcleos que se teñían con el anticuerpo monoclonal 44C11 ELAV (suministrado por cortesía de Lily Jan) y los que se teñían con TOTO-3 (Molecular Probes), un tinte de contraste de ácido nucleico, en varias secciones confocales de múltiples antenas. En promedio, 36% de los núcleos en la antena eran positivos a ELAV.

Construcción de transgén DOR104-lacZ y tinción histoquímica

Se aíslo un clon genómico que contenía la región codificante de DOR104 y varias kb de secuencia cadena arriba a partir de una biblioteca genómica preparada a partir de moscas isogénicas para el tercer cromosoma (por cortesía de Kevin Moses y Gerry Rubin). Se aislaron aproximadamente 3 kb de ADN inmediatamente cadena arriba del supuesto sitio de inicio de la traducción de DOR104 por PCR y se subclonaron en el vector pCasperUAG\betaGal (Thummel et al., 1988). Se llevó a cabo la tinción de actividad \beta-galactosidasa con preparaciones montadas de cabeza completa esencialmente como se describe en Wang et al. (1998). Se incubaron secciones congeladas de palpos maxilares de DOR104-lacZ con un anticuerpo policlonal de conejo anti-\beta-galactosidasa y como se ha descrito anteriormente.

Resultados experimentales Clonación de receptores de odorizantes candidatos

En experimentos iniciales, se aisló un ADNc que codificaba un supuesto receptor de odorizantes mediante una estrategia de clonación diferencial diseñada para detectar copias de ADNc de ARNm presente en frecuencias extremadamente bajas en una población de ARNm. En la antena y el palpo maxilar, aproximadamente 30% de las células son neuronas olfativas. Si cada neurona expresase sólo uno de 100 genes diferentes de receptor de odorizantes posibles a un nivel de 0,1% del ARNm en una neurona sensorial, entonces un ARNm de un receptor dado se encontraría a una frecuencia de uno en 300.000 en el ARNm de la antena. Si se expresasen 100 genes de receptores diferentes, entonces la familia completa de genes de receptores estaría representada a una frecuencia de uno en 3.000 ARNm. Por lo tanto, se introdujeron modificaciones experimentales en una clonación diferencial convencional para permitir la identificación de ARNm extremadamente poco frecuente cuya expresión se limita a la antena o al palpo maxilar.

En resumen, se exploraron previamente 5000 entradas de una genoteca de ADNc de la antena/palpo maxilar (véase la sección de Procedimientos Experimentales) y después se sometieron a hibridación de transferencia de Southern con sondas de ADNc de la antena/palpo maxilar, de la cabeza menos la antena/palpo maxilar o de ARNm de cuerpo de hembra virgen (véase la Figura 1). Esta hibridación de transferencia de Southern (o Northern inverso) para ADNc candidatos permite la detección de secuencias presentes a una frecuencia de uno en 100.000 en la sonda, una sensibilidad aproximadamente 100 veces mayor que la de la exploración de placas (véase la sección de Procedimientos Experimentales). Este procedimiento condujo a la identificación de múltiples ADNc específicos de la antena/palpo maxilar que se analizaron mediante secuenciación de ADN e hibridación in situ. Un ADNc, DOR104 (por Drosophila Odorant Receptor) (Figura 1, Calle 9), codifica una supuesta proteína de siete dominios transmembrana con una similitud de secuencia no evidente con receptores serpentina conocidos (Figura 3). La hibridación in situ reveló que este ADNc hibrida con aproximadamente 15% de las 120 neuronas sensoriales dentro del palpo maxilar pero no hibrida con neuronas del cerebro ni de la antena. Se muestran siete células que expresan DOR104 en la sección del palpo maxilar frontal en la Figura 2A.

Estas observaciones sugerían que DOR104 puede ser un miembro de una gran familia de genes de receptores de odorizantes dentro del genoma de Drosophila. Sin embargo, los presentes inventores fueron incapaces de identificar genes adicionales homólogos a DOR104 mediante hibridación de rigurosidad reducida con genoteca de ADN genómico y ADNc o tras el análisis de genes ligados en un paseo genómico. Por lo tanto, se analizó la base de datos del genoma de Drosophila para familias de proteínas de múltiples dominios transmembrana que comparten una similitud de secuencia con DOR104. Se descargaron secuencias que representaban aproximadamente 10% del genoma de Drosophila (Proyecto Genoma de Drosophila de Berkeley) y se sometieron a análisis GENSCAN (Burge y Karlin, 1997) para predecir la estructura de intrones-exones de todas las secuencias dentro de la base de datos. Se buscaron fases de lectura abiertas de más de 50 aminoácidos para proteínas con 3 o más regiones transmembrana predichas usando los algoritmos de superficie de alineamiento densa (DAS) y TMAP (Persson y Argos, 1994; Cserzo et al., 1997; véase también la sección de Procedimientos Experimentales). De los 229 genes candidatos identificados de esta forma, once codificaban proteínas que definen una nueva familia divergente de supuestas proteínas de siete dominios transmembrana con similitud de secuencia con la secuencia de DOR104. Esta familia de receptores de odorizantes candidatos no comparte ningún motivo de secuencia conservado con familias previamente identificadas de receptores de siete dominios transmembrana. Los clones de ADNc que contenían las regiones codificantes para cinco de los 11 genes identificados por análisis GENSCAN se habían aislado a partir de una genoteca de ADNc de la antena/palpo maxilar y sus secuencias se proporcionan en la Figura 3. Las 6 secuencias proteicas restantes proceden de las predicciones del GENSCAN para la organización de intrones-exones. Su organización se adapta bien a la estructura real determinada a partir de las secuencias de ADNc de otros miembros de la familia de genes (Figura 3).

Los receptores consisten en un dominio N-terminal extracelular corto (habitualmente menor de 50 aminoácidos) y siete supuestos dominios transmembrana. El análisis de los supuestos dominios transmembrana (Kyte y Doolittle, 1982; Persson y Argos, 1994; Cserzo et al., 1997) revela múltiples segmentos hidrófobos, pero no es posible a partir de estos análisis determinar inequívocamente ni el número ni la colocación de los dominios transmembrana. En la actualidad, la presente asignación de dominios transmembrana es por lo tanto provisional.

Los miembros individuales de la familia son divergentes y la mayoría presentan una identidad de aminoácidos del 17-26%. Dos agrupamientos ligados de genes de receptores constituyen pequeñas subfamilias de genes con una conservación de secuencia significativamente mayor. Dos genes ligados, DOR53 y DOR67, presentan una identidad de aminoácidos de 76%, mientras que los tres genes ligados, DOR71, 72 y 73, revelan una identidad de 30-55% (Figura 3; véase a continuación). A pesar de la divergencia, cada uno de los genes comparte motivos comunes cortos en posiciones fijas dentro de la supuesta estructura de siete dominios transmembrana que definen estas secuencias como miembros altamente divergentes de una nueva familia de supuestas moléculas receptoras.

Expresión de la familia de genes DOR en neuronas olfativas

Si esta familia de genes codifica supuestos receptores de odorizantes en la mosca, sería de esperar que otros miembros de la familia además de DOR104 se expresaran también en neuronas sensoriales olfativas. Por lo tanto, se realizó una hibridación in situ para examinar el patrón de expresión de receptor de cada uno de los 11 miembros adicionales de la familia de genes en organismos adultos y en desarrollo. En Drosophila, las neuronas sensoriales olfativas están restringidas al palpo maxilar y al tercer segmento de la antena. El tercer segmento de la antena está cubierto con aproximadamente 500 cerdas sensoriales o sensilas finas (Stocker, 1994), conteniendo cada una de una a cuatro neuronas (Venkatesh y Singh, 1984). El palpo maxilar está cubierto con aproximadamente 60 sensilas, estando cada una inervada por dos o tres neuronas (Singh y Nayak, 1985). Por lo tanto, el tercer segmento de la antena y el palpo maxilar contienen aproximadamente 1500 y 120 neuronas sensoriales, respectivamente.

Se realizaron experimentos de hibridación in situ de ARN con sondas antisentido de ARN marcadas con digoxigenina con cada uno de los 11 nuevos miembros de la familia de genes en condiciones de rigurosidad elevada. Una pareja ligada de genes homólogos, DOR53 y DOR67, presenta hibridación cruzada mientras que los 10 genes restantes no presentan hibridación cruzada en estas condiciones (véase a continuación). Cada uno de los 11 genes hibrida con una pequeña subpoblación (0,5-1,5%) de las 1500 neuronas sensoriales olfativas en el tercer segmento antenal (Figura 4). Un gen, DOR71, expresa en aproximadamente 10% de las neuronas sensoriales en el palpo maxilar pero no en la antena (Figura 4G). No se ha detectado expresión de DOR46 o DOR19 en la antena o el palpo maxilar. La expresión de esta familia de genes sólo se observa en células dentro de la antena y del palpo maxilar. No se observo hibridación en neuronas del cerebro, ni tampoco se observó hibridación en ninguna sección en otra parte de la mosca adulta o en ningún tejido de ninguna fase durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, se descubre hibridación en un pequeño número de células en las antenas en desarrollo en la fase de pupa avanzada (no se muestran los datos). No se ha determinado todavía si esta familia de receptores se expresa en el aparato olfativo larvario. Sólo aproximadamente un tercio de las células en el tercer segmento antenal y en el palpo maxilar son neuronas (no se muestran los datos) que están intercaladas con células de soporte sensilares no neuronales y glía. Se han realizado dos experimentos para demostrar que la familia de genes de receptores de siete dominios transmembrana se expresa en neuronas sensoriales en lugar de en células de soporte o glía dentro de la antena y del palpo maxilar. En primer lugar, se desarrollaron programas de detección de anticuerpos fluorescentes de dos colores para colocalizar la expresión de receptores en células que expresan la proteína de unión a ARN específica de neuronas ELAV (Robinow y White, 1988). Una línea de potenciador trap que lleva una inserción de GAL4 en el locus elav expresa altos niveles de lacZ en neuronas cuando se cruza con una línea de respuesta UAS-lacZ transgénica (Lin y Goodman, 1994). La detección por anticuerpo fluorescente de lacZ identifica las neuronas sensoriales en una sección horizontal del palpo maxilar (Figura 5B). La hibridación con la sonda del receptor DOR104 revela expresión en 5 de las 12 células positivas para lacZ en una sección horizontal del palpo maxilar (Figura 5A). Todas las células que expresan DOR104 también son positivas para lacZ (Figura 5C), indicando que este receptor se expresa sólo en neuronas.

En un segundo experimento se demostró que los genes de receptores no se expresan en células no neuronales. Las células de soporte de la antena expresan diferentes miembros de una familia de proteínas de unión a odorizantes (McKenna et al., 1994; Pikielny et al., 1994; Kim et al., 1998). Estos genes codifican abundantes proteínas de bajo peso molecular que se piensa que transportan odorizantes a través de la linfa sensilar (revisado en Pelosi, 1994). Ciertos experimentos in situ de dos colores con una sonda para la proteína de unión a odorizante _{PBPRP}2 (Pikielny et al., 1994), revelan hibridación con un gran número de células ampliamente distribuidas por toda la antena (Figura 5F). En la misma sección, sin embargo, la sonda DOR53 hibrida con una subpoblación no solapante de neuronas restringidas al dominio medio-proximal de la antena. En un experimento similar, la hibridación in situ con la proteína de unión a odorizante, OS-F (McKenna et al., 1994), identifica una subpoblación espacialmente restringida de células de soporte en la antena, mientras que la sonda DOR67 identifica una población diferente de neuronas en un dominio medio-proximal (Figura 5G). Por lo tanto, los supuestos genes de receptores de odorizantes se expresan en una subpoblación de neuronas sensoriales diferente de las células de soporte que expresan las proteínas de unión a odorizante. En su conjunto, estos datos demuestran que 10 de los 12 miembros de la familia que se han identificado se expresan en pequeñas subpoblaciones de neuronas sensoriales olfativas en la antena y el palpo maxilar.

Patrones definidos espacialmente de expresión de receptores

Los experimentos de hibridación in situ revelan que cada receptor se expresa en una subpoblación de neuronas restringida espacialmente en la antena o el palpo maxilar (Figura 4). El número total de células que expresan cada receptor por antena se obtuvo por recuento de las células positivas en secciones seriadas de antenas de múltiples moscas. Estos números se presentan en las leyendas de la Figura 4. DOR67 y 53, por ejemplo, hibridan con aproximadamente 20 neuronas en el borde medio proximal de la antena (Figura 4A y B), mientras que DOR62 y 87 hibridan con subpoblaciones de 20 células en el borde distal de la antena (Figura 4C-D). Aproximadamente 10 células en el dominio distal expresan DOR64 (Figura 4E). Cada uno de los tres genes ligados DOR71, 72 y 73 se expresa en diferentes neuronas. DOR72 se expresa en aproximadamente 15 células antenales (Figura 4H), mientras que DOR73 se expresa en 1 a 2 células en el borde distal de la antena (Figura 41). Por el contrario, DOR71 se expresa en aproximadamente 10 neuronas del palpo maxilar pero no se detecta en la antena (Figura 4G). Los tres tipos sensilares se representan en un mapa topográfico general por todo el tercer segmento antenal. La región proximal-media, por ejemplo, contiene principalmente sensilas basicónicas. Los receptores expresados en esta región (DOR53 y 67) están por lo tanto probablemente limitados a las sensilas basicónicas grandes. Las regiones más distales contienen una mezcla de los tres tipos de sensilas
y, por lo tanto, no es posible a partir de estos datos asignar receptores específicos a tipos sensilares específicos.

El patrón espacial de neuronas que expresan un receptor dado está conservado entre individuos. La hibridación in situ con dos sondas de receptores con tres moscas individuales revela que tanto la frecuencia como la distribución espacial de las neuronas que hibridan están conservadas en individuos diferentes (Figura 6). En la actualidad no se puede determinar la precisión de este mapa topográfico y sólo se puede argumentar que receptores dados se expresan en dominios localizados.

En experimentos preliminares se ha demostrado que el patrón espacial de expresión de un receptor, DOR104, puede recapitularse en moscas transgénicas con un fragmento promotor que flanquea el gen de DOR104. La fusión del supuesto promotor de DOR104 (que consiste en 3 kb de ADN 5' inmediatamente adyacente a la región codificante) con el gen indicador lacZ ha permitido visualizar una subpoblación de neuronas que expresan DOR104 dentro del palpo maxilar. Preparaciones montadas completas de las cabezas de moscas transgénicas revelan una pequeña subpoblación de neuronas sensoriales dentro del palpo maxilar cuyos cuerpos celulares presentan un color azul después de la tinción con X-gal (Figura 2B). El número de células positivas, aproximadamente 20 por palpo maxilar, se corresponde bien con el observado para expresión de ARN de DOR104. La tinción inmunofluorescente de secciones con anticuerpos dirigidos contra \beta-galactosidasa revela más claramente las dendritas y axones de estas neuronas bipolares en el palpo maxilar (Figura 2C). Los niveles de expresión de lacZ en estas líneas transgénicas son reducidos y la amplificación adicional será necesaria para permitir rastrear los axones hasta los glomérulos en el lóbulo antenal. No obstante, los datos sugieren que la información que gobierna el patrón espacial de la expresión de DOR104 en una subpoblación restringida de neuronas del palpo maxilar reside dentro de 3 kb de ADN 5' con respecto al gen de DOR104.

Neuronas individuales expresan complementos diferentes de receptores

El entendimiento de la lógica de la discriminación olfativa en Drosophila requerirá una determinación de la diversidad y especificidad de la expresión de receptores en neuronas individuales. En el epitelio olfativo de vertebrados, es probable que una neurona dada exprese sólo un receptor de la familia de 1.000 genes (Ngai et al., 1993; Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993; Chess et al., 1994; Dulac y Axel, sin publicar). En el nematodo C. elegans, sin embargo, se piensa que neuronas quimiosensoriales individuales expresan múltiples genes de receptores (Troemel et al., 1995). Las observaciones de los presentes inventores con los supuestos receptores de odorizantes de Drosophila indican que una sonda de un receptor dado hibrida con 0,5-1,5% de las neuronas antenales, lo que sugiere que cada célula expresa sólo un subconjunto de genes de receptores. Si se demuestra que cada una de las sondas de receptores diferentes hibrida con subpoblaciones diferentes no solapantes de neuronas, esto proporcionaría pruebas de que las neuronas difieren con respecto a los receptores que expresan.

Se realizó por lo tanto una hibridación in situ con una mezcla de cinco sondas de receptores (Figura 4F) o individualmente con cada una de las cinco sondas (Figura 4A-E). Se observó que el número de neuronas olfativas identificadas con la sonda mixta (aproximadamente 60 por antena) se aproxima a la suma de las neuronas positivas detectadas con las cinco sondas individuales. Estos resultados demuestran que receptores individuales se expresan en diferentes poblaciones no solapantes de neuronas olfativas.

Se ha realizado un experimento adicional usando hibridación in situ de ARN de dos colores para preguntarse si dos genes de receptores, DOR64 y DOR87, expresados en células intercaladas en la antena distal se expresan en diferentes neuronas. Se marcaron sondas de ARN antisentido para los dos genes con digoxigenina-UTP o FITC-UTP y se usaron en combinaciones de dos en dos en hibridación in situ con secciones por toda la antena de Drosophila. Aunque estos dos genes se expresan en dominios lateral-distal solapantes, la hibridación in situ de dos colores revela que las neuronas que expresan DOR64 no expresan DOR87, más bien cada gen se expresa en diferentes poblaciones celulares (Figura 5D y E). En su conjunto, estos datos sugieren que las neuronas sensoriales olfativas dentro de la antena son funcionalmente diferentes y expresan complementos diferentes de receptores de odorizantes. En última instancia, los experimentos concuerdan con un modelo en el que neuronas individuales expresan sólo un gen de receptor único.

El procedimiento de clonación diferencial identificó un gen adicional, A45, que comparte una identidad débil (24%) con la familia de genes DOR a lo largo de una región corta (93 aminoácidos). Este gen, sin embargo, no parece ser un miembro clásico de la familia DOR: es mucho más divergente y significativamente más grande que los otros miembros de la familia (486 aminoácidos). Este gen se expresa en todas las neuronas sensoriales olfativas (no se muestran los datos). Si A45 codifica un receptor de odorizantes divergente, entonces estaría presente en todas las neuronas sensoriales junto con diferentes complementos de los miembros más clásicos de la familia de genes DOR.

El tamaño y organización de la familia de genes de receptores de odorizantes

¿Cómo de grande es la familia de genes de receptores de odorizantes en Drosophila?. A diferencia de los receptores de odorizantes en vertebrados, que comparten una identidad de secuencia de 40-98% a nivel de los aminoácidos, los receptores de mosca son extremadamente divergentes. El grado de similitud de secuencia entre subfamilias de receptores varía de 20-30%. El receptor del palpo maxilar DOR104 es el miembro relacionado más distantemente de la familia con una identidad de aproximadamente 17% con los otros genes de receptores. La inspección de las secuencias de los receptores sugiere que es poco probable que las hibridaciones de transferencia de Southern, incluso las realizadas a rigurosidad reducida, revelen múltiples miembros adicionales de una familia de genes. De acuerdo con esto, la hibridación en transferencia de Southern con sondas de receptores DOR24, 62 y 72, realizadas a rigurosidad elevada o reducida, revela sólo una banda de hibridación única después de la escisión del ADN genómico con tres endonucleasas de restricción diferentes (Figura 7C-E). Los dos agrupamientos ligados de receptores contienen genes con un mayor grado de conservación de secuencia y definen pequeñas subfamilias de genes de receptores. Un grupo de tres receptores, DOR71, 72 y 73, se localiza en la posición del mapa 33B1-2. Los receptores de la antena DOR72 y 73 tienen una identidad de 55% y ambos presentan una identidad de aproximadamente 30% con el tercer gen en el locus, DOR71, que se expresa en el palpo maxilar. DOR67 y DOR53, miembros de una segunda subfamilia, residen con una distancia dentro de 1 kb entre sí en la posición de mapa 22A2-3 y presentan una identidad de secuencia de 76%. No es sorprendente que estos dos genes ligados presenten hibridación cruzada a rigurosidad reducida. Las transferencias de Southern sondadas con DOR67 o DOR53 revelan dos bandas de hibridación que se corresponden con los dos genes dentro de la subfamilia pero no detectan miembros adicionales de la subfamilia en el cromosoma (Figura 7A y B).

Los miembros de la familia de genes de receptores descritos en este documento están presentes en todos menos en el cuarto cromosoma pequeño. No se observa predisposición hacia regiones teloméricas o centroméricas. Las posiciones del mapa, según se determinan a partir de los clones P1 y cosmídico (Proyecto Genoma de Drosophila de Berkeley; Proyecto Genoma de Drosophila Europeo) se proporcionan en los Procedimientos Experimentales. Un número comparativamente grande de genes receptores se localizan en el cromosoma 2 porque el Proyecto Genoma de Drosophila de Berkeley ha concentrado sus esfuerzos en este cromosoma. A diferencia de la distribución de receptores de odorizantes en nematodos y mamíferos (Ben-Arie et al., 1994; Troemel et al., 1995; Robertson, 1998), sólo se han identificado pequeñas series ligadas y la mayoría de los miembros de la familia se aíslan en múltiples loci dispersos en el genoma de Drosophila.

El alto grado de divergencia entre miembros de la familia de genes de receptores de odorizantes de Drosophila recuerda más a la familia de quimiorreceptores en C. elegans que los receptores de odorizantes más conservados de vertebrados. Las estimaciones del tamaño de la familia de genes de receptores de Drosophila, por lo tanto, no pueden obtenerse ni por hibridación de transferencia de Southern ni por análisis de PCR de ADN genómico. En su lugar, las estimaciones de la familia de genes proceden de la estadística de pequeños números. Se detectaron 12 miembros de la familia de genes de receptores de odorizantes de una base de datos del genoma de Drosophila que incluye aproximadamente 10% del genoma. Reconociéndose una posible predisposición en la estimación de los presentes inventores, parece razonable en la actualidad estimar que la familia de receptores de odorizantes incluye probablemente de 100 a 200 genes. Esto está de acuerdo con estimaciones independientes a partir de los experimentos de hibridación in situ que demuestran que una sonda de receptor dada hibrida con 0,5-1,5% de las neuronas. Si se asume que una neurona dada expresa sólo un gen de receptor único, estas observaciones sugieren que la familia de genes incluiría de 100 a 200 miembros.

Discusión experimental El tamaño y la divergencia de la familia de genes

Se ha identificado una nueva familia de proteínas de siete dominios transmembrana que probablemente codifican los receptores de odorizantes de Drosophila. El número de genes de receptores diferentes expresados en las neuronas de la antena y el palpo maxilar reflejará la diversidad y especificidad del reconocimiento del olor en la mosca de la fruta. ¿Cómo de grande es la familia de genes de receptores de odorizantes de Drosophila?. Se han identificado 11 miembros de esta familia de genes divergente en la base de datos de ADN de Drosophila. A pesar de la posibilidad de predisposición, parece razonable asumir que como sólo se ha depositado 10% de la secuencia genómica, probablemente esta familia de genes contiene de 100 a 200 genes. Sin embargo, errores significativos en las estimaciones podrían ser el resultado de una predisposición en la naturaleza de las secuencias representadas en 10% del genoma de Drosophila analizado hasta la fecha. Los experimentos de hibridación in situ que demuestran que cada uno de los genes de receptores marca de 0,5 a 1,5% de las neuronas sensoriales olfativas están de acuerdo con la estimación de 100 a 200 genes de receptores.

Se han identificado varias familias de genes de receptores de odorizantes divergentes, codificando cada una proteínas de siete dominios transmembrana, en especies de vertebrados e invertebrados. En mamíferos, los olores volátiles se detectan por una familia de hasta 1.000 receptores expresados cada uno en el epitelio olfativo principal (Buck y Axel, 1991; Levy et al., 1991; Parmentier et al., 1992; Ben-Arie et al., 1994). Esta familia de genes comparte características con los receptores serpentina de neurotransmisores y está conservada en todos los vertebrados examinados. Los vertebrados terrestres tienen un segundo sistema olfativo anatómicamente y funcionalmente diferente, el órgano vomeronasal, dedicado a la detección de feromonas. Las neuronas sensoriales vomeronasales expresan dos familias diferentes de receptores y se cree que cada una contiene de 100 a 200 genes: una nueva familia de receptores serpentina (Dulac y Axel, 1995) y una segunda familia relacionada con los receptores de neurotransmisores metabotrópicos (Herrada y Dulac, 1997; Matsunami y Buck, 1997; Ryba y Tirindelli, 1997).

En el invertebrado C. elegans, los receptores quimiosensoriales se organizan en cuatro familias de genes que comparten una similitud de secuencia de 20-40% dentro de una familia y esencialmente no tienen similitudes de secuencia entre familias (Troemel et al., 1995; Sengupta et al., 1996; Robertson, 1998). Las cuatro familias de genes en C. elegans en conjunto contienen aproximadamente 1.000 genes implicados en la detección de olores. Los receptores de nematodos no presentan conservación de secuencia con las tres familias diferentes de genes de receptores de odorizantes de vertebrados. Los estudios revelan que la Drosophila ha desarrollado una familia de genes divergente adicional de receptores serpentina compuesta por 100 a 200 genes. La observación de que se logra una función similar, la detección quimiosensorial, mediante al menos ocho familias de genes altamente divergentes que comparten poca o ninguna similitud de secuencia es muy inusual.

¿Por qué la necesidad evolutiva de receptores de odorizantes se satisface con frecuencia por el reclutamiento de nuevas familias de genes en lugar de aprovechar las familias de receptores de odorizantes preexistentes en genomas ancestrales?. El carácter de los odorizantes naturales junto con sus propiedades físicas (por ejemplo, acuosa o volátil) representa un agente de selección importante que dirige la evolución de familias de genes de receptores. El uso de conjuntos de odorizantes "antropomórficos" comunes en los análisis experimentales de especificidad olfativa ha conducido a que prevalezca el punto de vista de que existe un solapamiento significativo en el repertorio de olores percibidos entre diferentes especies. Los estudios de especificidad de odorizantes en diferentes especies con frecuencia emplean olores a concentraciones elevadas artificialmente y pueden presentar una imagen imprecisa del repertorio natural de odorizantes. Simplemente no se conoce la naturaleza de los olores que inicialmente condujeron a la selección ancestral de genes de receptores durante la evolución de las especies de nematodos, insectos o vertebrados. Claramente, propiedades enormemente diferentes en olores salientes pudieron imponer el reclutamiento de nuevas familias de genes para efectuar una función antigua, el olfato. El carácter del olor no es el único agente de selección evolutivo. Los receptores de odorizantes deben interaccionar con otros componentes en la ruta de transducción de señales [Proteínas G (para una revisión, véase Buck, 1996; Bargmann y Kaplan, 1998) y quizás incluso RAMP (McLatchie et al., 1998) y rho (Mitchell et al., 1998)] que pueden dirigir la selección de una familia de receptores serpentina con respecto a otra. Además, los receptores de mamíferos no sólo reconocen odorizantes en el entorno, sino que probablemente reconocen indicaciones de guía que dirigen la formación de un mapa sensorial en el cerebro (Wang et al., 1998). Por lo tanto, las múltiples propiedades que requieren los receptores de odorizantes pueden cambiar enormemente a lo largo del tiempo evolutivo y esto puede subyacer a los orígenes independientes de las múltiples familias de genes de receptores quimiosensoriales.

Establecimiento de un mapa topográfico en la antena y en el cerebro

Se observó que los genes de receptores individuales en la mosca se expresan en dominios topográficamente conservados dentro de la antena. Esta distribución espacial altamente ordenada de expresión de receptores difiere de la observada en el epitelio olfativo del mamífero. En mamíferos, un receptor dado puede expresarse en una de cuatro zonas amplias pero circunscritas en el epitelio olfativo principal (Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993). Una zona dada puede expresar hasta 250 receptores diferentes y neuronas que expresan un receptor dado dentro de una zona parecen estar dispersas aleatoriamente (Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993). El patrón altamente ordenado de expresión observado en la antena de Drosophila podría tener implicaciones importantes para la generación de patrones de las proyecciones hacia el lóbulo antenal. En los sistemas visual, somatosensorial y auditivo, la lámina de receptores periféricos está muy ordenada y se mantienen relaciones vecinas en la periferia en las proyecciones hacia el cerebro. Estas observaciones sugieren que la posición relativa de la neurona sensorial en la periferia determinará el patrón de proyecciones hacia el cerebro.

Los datos sobre la conservación espacial de la expresión de receptores en la antena sugiere que la superposición sobre la generación de patrones espaciales generales de sensilas olfativas (Venkatesh y Singh, 1984; Ray y Rodrigues, 1995; Reddy et al., 1997) debe ser una información posicional más precisa que gobierne la elección de la expresión de receptores. Esta información espacial podría imponer el patrón topográfico fijo de expresión de receptores en la lámina periférica de receptores y al mismo tiempo gobernar las proyecciones sensoriales ordenadas hacia el cerebro. Esta relación entre la identidad posicional y el patrón de proyecciones neuronales se ha sugerido tanto para las neuronas sensoriales periféricas (Merritt y Whitington, 1995; Grillenzoni et al., 1998) como para las neuronas en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila (Doe y Skeath, 1996).

Implicaciones para el procesamiento sensorial

En mamíferos, las neuronas olfativas expresan sólo uno de miles de genes de receptores de odorizantes. Las neuronas que expresan un receptor dado se proyectan con precisión hacia dos de los 1800 glomérulos en el bulbo olfatorio de ratón. Los odorizantes inducirán, por lo tanto, patrones definidos espacialmente de actividad glomerular de tal modo que la calidad de un estímulo olfativo esté codificada por la activación de una combinación específica de glomérulos (Stewart et al., 1979; Lancet et al., 1982; Kauer et al., 1987; Imamura et al., 1992; Mori et al., 1992; Katoh et al., 1993; Friedrich y Korsching, 1997). Además, la capacidad de un odorizante para activar una combinación de glomérulos permite la discriminación de una serie diversa de olores que supera con mucho el número de receptores y sus glomérulos asociados. En el nematodo, una familia igualmente grande de genes de receptores se expresa en 16 pares de células quimiosensoriales, respondiendo sólo tres de ellas a odorizantes volátiles (Bargmann y Horvitz, 1991; Bargmann et al., 1993). Esto implica inmediatamente que una neurona quimiosensorial dada expresará múltiples receptores y que la diversidad de olores reconocidos por el nematodo puede aproximarse a la de los mamíferos, pero el poder discriminatorio se reduce necesariamente de manera drástica.

¿Qué aporta la naturaleza de la familia de genes que se ha identificado en Drosophila acerca de la lógica del procesamiento olfativo en este organismo?. Se estima que los receptores de odorizantes de Drosophila comprenden una familia de 100 a 200 genes. Además, el patrón de expresión de estos genes en el tercer segmento antenal sugiere que las neuronas sensoriales individuales expresan una dotación de receptores diferente y, en última instancia, los datos de los presentes inventores concuerdan con la sugerencia de que las neuronas individuales expresan uno o un pequeño número de receptores. Como en el caso de los mamíferos, el problema de la discriminación de olores se reduce por lo tanto a un problema de distinción por parte del de qué receptores se han activado por un odorizante dado. Si el número de tipos diferentes de neuronas supera el número de glomérulos (43) (Stocker, 1994; Laissue et al., 1999) inmediatamente se deduce que un glomérulo dado debe recibir la entrada de más de una clase de neurona sensorial. Esto implica que un solo glomérulo integrará múltiples estímulos olfativos. Una consecuencia posible de este modelo sería una pérdida de poder discriminatorio mientras se mantiene la capacidad de reconocer una amplia serie de olores. Como alternativa, podría producirse un procesamiento significativo de entradas sensoriales en el lóbulo antenal de la mosca para proporcionar una discriminación proporcionada con el gran número de receptores.

Este modelo de codificación olfativa contrasta enormemente con el sistema olfativo principal de vertebrados en los que las neuronas sensoriales expresan sólo un único receptor y convergen sólo en un único par de glomérulos espacialmente fijos en el bulbo olfatorio. Además, cada neurona de proyección en el bulbo de mamífero extiende sus dendritas hacia sólo un único glomérulo. Por lo tanto, la integración y decodificación de patrones espaciales de actividad glomerular, en vertebrados, debe producirse principalmente en la corteza olfativa. En la mosca de la fruta, la observación de que el número de receptores puede superar el número de glomérulos sugiere que los glomérulos individuales recibirán entradas de más de un tipo de neurona sensorial. Se proporciona un segundo nivel de integración en el lóbulo antenal por subconjuntos de neuronas de proyección que elaboran amplios árboles dendríticos que forman sinapsis con múltiples glomérulos. Por lo tanto, el sistema olfativo de Drosophila revela niveles de procesamiento e integración de entrada sensorial en el lóbulo antenal que probablemente están limitados a centros corticales superiores en el sistema olfativo principal de vertebrados.

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Secuencias de proteína y de ácido nucleico de 55 genes de receptores de odorizantes de Drosophila

Lo siguiente incluye los genes identificados por primera vez en 1998-1999. Las secuencias proteicas usaron códigos de aminoácidos de una sola letra.

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Números de acceso del GENBANK

Los números de acceso para las secuencias descritas en este artículo son AF127921-AF127926.

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<110> Vosshall, Leslie B. The Trustees of Columbia University in the City of

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<120> GENES QUE CODIFICAN RECEPTORES DE ODORIZANTES DE INSECTO Y USOS DE LOS MISMOS

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<130> 0575/58715

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<140> 09/257,706

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<141> 1999-02-25

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<160> 24

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 553

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR62

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<400> 1

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48

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<210> 2

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR62

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<400> 2

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49

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<210> 3

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<211> 1493

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR104

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<400> 3

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50

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<210> 4

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<211> 467

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR104

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<400> 4

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51

52

53

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<210> 5

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<211> 1556

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR87

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<400> 5

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54

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<210> 6

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<211> 376

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR87

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<400> 6

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55

56

57

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<210> 7

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<211> 1305

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR53

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<400> 7

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58

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<210> 8

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR53

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<400> 8

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59

60

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<210> 9

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<211> 1321

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR67

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<400> 9

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61

610

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<210> 10

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR67

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<400> 10

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62

63

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<210> 11

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<211> 1308

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR64

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<400> 11

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64

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<210> 12

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<211> 379

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR64

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<400> 12

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65

66

67

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<210> 13

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<211> 1252

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR71g

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<400> 13

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68

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<210> 14

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<211> 384

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR71g

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<400> 14

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69

70

71

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<210> 15

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<211> 1321

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR72g

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<400> 15

72

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<210> 16

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<211> 379

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR72g

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<400> 16

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73

74

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<210> 17

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<211> 1212

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR73g

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<400> 17

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75

750

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<210> 18

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<211> 378

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR73g

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<400> 18

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76

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<210> 19

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<211> 1198

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR46

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<400> 19

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78

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<210> 20

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<211> 379

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR46

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<400> 20

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79

80

81

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<210> 21

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<211> 1293

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR19g

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<400> 21

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82

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<210> 22

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<211> 430

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<212> PRT

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<213> Traducción DOR19g

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<400> 22

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83

84

85

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<210> 23

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<211> 2075

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<212> DNA

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<213> Drosophila melanogaster DOR24g

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<400> 23

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86

860

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<210> 24

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<211> 383

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster DOR24g

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<400> 24

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87

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Claims

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor de odorizantes de insecto, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es idéntica a la expuesta para DORA45 en la SEC ID Nº: 107.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el receptor de odorizantes de insecto comprende siete dominios transmembrana.

3. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el ácido nucleico es ADN o ARN.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 3, donde el ADN es ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

5. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el ácido nucleico codifica un receptor de odorizantes de Drosophila.

6. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El vector de la reivindicación 6, donde el ácido nucleico aislado está unido operativamente a un elemento regulador.

8. Un plásmido que comprende el vector de la reivindicación 6.

9. Un sistema de vector-hospedador para la producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un receptor de odorizantes de insecto, que comprende el vector de la reivindicación 6 y una célula hospedadora
adecuada.

10. El sistema de vector-hospedador de la reivindicación 9, donde el hospedador adecuado es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula animal.

11. Un método de producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un receptor de odorizantes de insecto, que comprende cultivar el sistema de vector-hospedador de la reivindicación 9 en condiciones que permitan la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido producido de este modo.

12. Un receptor de odorizantes de insecto purificado codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

13. Un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto codificado por el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

15. Un método para identificar un inserto de ADNc que codifica un receptor de odorizantes de insecto, que comprende:

(a) generar una genoteca de ADNc que comprende clones que llevan insertos de ADNc a partir de neuronas sensoriales de la antena o del palpo maxilar de un insecto;

(b) hibridar ácidos nucleicos de los clones de las genotecas de ADNc generadas en la etapa (a) con una sonda que tiene una secuencia exclusivamente presente en un ácido nucleico de la reivindicación 1; y

(c) aislar los ácidos nucleicos hibridados resultantes para identificar de este modo el inserto de ADNc que codifica el receptor de odorizantes de insecto.

16. Un método para obtener un ácido nucleico que codifica un receptor de odorizantes a partir de un insecto, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que contiene ácido nucleico de origen de insecto con cebadores de reacción en cadena de la polimerasa que hibriden específicamente con un ácido nucleico de la reivindicación 1 en condiciones apropiadas que permiten la hibridación de los cebadores con el ácido nucleico para producir un producto de hibridación;

(b) amplificar el producto de hibridación resultante usando la reacción en cadena de la polimerasa; y

(c) aislar las moléculas amplificadas, obteniendo así el ácido nucleico que codifica el receptor de odorizantes del insecto.

17. Un método de transformación de una célula que comprende transfectar una célula hospedadora con el vector de la reivindicación 6.

18. Una célula transformada producida por el método de la reivindicación 17 donde antes de transfectarse con el vector, la célula hospedadora no expresa un receptor de odorizantes de insecto.

19. Un método de identificación de un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto la célula transformada de la reivindicación 18, o una fracción de membrana de dicha célula, con el compuesto en condiciones que permitan la unión del compuesto al receptor de odorizantes, detectar la presencia de dicho compuesto unido específicamente al receptor y de este modo identificar el compuesto como un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto.

20. Un método de identificación de un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto, que comprende poner en contacto el receptor de odorizantes purificado de la reivindicación 12 con el compuesto en condiciones que permitan la unión del compuesto al receptor de odorizantes purificado, detectar la presencia de dicho compuesto unido específicamente al receptor y de este modo identificar el compuesto como un compuesto que se une específicamente a un receptor de odorizantes de insecto.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el receptor de odorizantes de insecto purificado está incorporado en una bicapa lipídica.