ES2315890T3 - Procedimiento para el aislamiento de paclitaxel. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la purificación de paclitaxel, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: a) aplicar una mezcla de partida que comprende paclitaxel en un contenedor que comprende un compuesto a base de poliamida; b) aplicar en dicho contenedor una solución de elución que comprende una o más dialquilcetonas mezcladas con un solvente menos polar en el contenedor; c) eluir la mezcla de partida; y d) recoger una o más fracciones de la solución de elución que contiene el paclitaxel.
Description
Procedimiento para el aislamiento de
paclitaxel.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación mediante cromatografía de
paclitaxel a partir de mezclas que contienen paclitaxel.
El paclitaxel, anteriormente conocido como
"taxol", es un importante agente quimioterapéutico útil para el
tratamiento de tumores de ovario, mama y pulmón en seres humanos.
Ha mostrado resultados prometedores en varios casos de cánceres en
humanos y se ha descrito sobre sus utilizaciones clínicas en varios
artículos de revistas, como en Rowinsky, E.K., Ann. Rev. Med. 48:353
1997; Van Hoff., D. D., Semin. Oncol. 24:3 (1997); DeFuria, M. D.,
Phytomedicine 4:273 (1997); y Eisenhauer, E. A., Vermorken, J. B.,
Drugs 55:5 (1998).
El paclitaxel es un compuesto natural y lo aisló
por primera vez Wani, et al., a partir de la corteza del tejo
del Pacífico (Taxus brevifolia). J. Am. Chem. Soc. 93:2325
(1971). Desde entonces, los investigadores han reconocido que el
paclitaxel existe en todas las demás especies del Taxus
genus, incluyendo el tejo europeo (Taxus baccata), el
tejo del Himalaya (Taxus Wallichiana), el tejo chino
(Taxus celebita), el tejo japonés (Taxus cuspidata),
tejo canadiense (Taxus canadensis), tejo mejicano (Taxus
globosa), tejo de Florida (Taxus floridana), y el tejo
ornamental (Taxus media) y en todos sus híbridos y
cultivos.
La fórmula estructural del paclitaxel se ha
determinado y se reproduce a continuación.
El aislamiento del paclitaxel a partir de todos
los tipos de fuentes vegetales potenciales es complejo y difícil,
en parte debido a su muy baja concentración en la biomasa y en parte
debido a la presencia de otros compuestos distintos, principalmente
los taxanos, que presentan unas propiedades similares a las del
paclitaxel. Debido a su alta demanda y a su baja disponibilidad, se
han buscado con interés fuentes potenciales adicionales para la
producción industrial de paclitaxel (Cragg, G. M., et al., J.
Nat. Prod. 56:1657 (1993)). Algunas de estas fuentes incluyen la
renovación de partes de todo tipo de plantas del género Taxus
(hojas, hierbas, y plantas completas cultivadas hidropónicamente),
la fermentación de cultivos tisulares del Taxus, la
fermentación de hongos parásitos en el Taxus, etc.
Normalmente, el paclitaxel se aísla mediante
primero, la extracción de una biomasa con unos solventes adecuados
para obtener extractos que se refinan mediante procedimientos de
extracción líquido-líquido. Después de los
procedimientos de extracción, el aislamiento del paclitaxel
normalmente continúa con una etapa de cromatografía de fase
inversa. Se pueden encontrar muchos ejemplos sobre esta técnica en
la bibliografía, incluyendo: Dauh-Rurng Wu, et
al., J. Chrom. A, 702:233 (1995); Koppaka V. Rao, et al.,
Pharm. Res. 12:1003 (1995); y Xuefeng Yang, et al., J.
Chrom. A, 813:201 (1998). La cromatografía de fase inversa para la
purificación final también se describe en diversas patentes, como:
la patente US nº 5.279.949; la patente US nº 5.380.916; y la
patente US nº 5.969.165. También se desarrolló un procedimiento
continuo basado en un proceso de cromatografía de fase inversa
sobre un lecho móvil simulado. Dauh-Rurng Wu, et
al., J. Chrom. A, 855:71 (1999). Sin embargo, una desventaja de
la utilización de la cromatografía de fase inversa es la necesidad
de utilizar unos solventes que contengan agua, que pueden causar
contrariamente la isomerización del paclitaxel en un
7-epi-paclitaxel no deseado.
La utilización de la cromatografía de fase
normal también es conocida para el aislamiento del paclitaxel. Sin
embargo, este procedimiento utiliza unas fases estacionarias caras,
como las fases alquilo fenilo y pentaflúor fenilo.
Dauh-Rurng Wu, et al., J. Chrom. A, 702:233
(1995). Los métodos más recientes para el aislamiento del
paclitaxel se basan en unos complicados procesos de elución por
gradiente, o en varias etapas de cromatografías que utilizan
distintas composiciones de fase móvil, o en una combinación tanto de
cromatografía de fase inversa como de fase normal. Ver, por
ejemplo, Young Kwang Park, et al., J. Liq. Chrom. & Rel.
Technol. 22 (18): 2755 (1999); Jun Xue, et al., J. Liq.
Chrom. & Rel. Technol. 23 (16): 2499 (2000); la patente US nº
5.478.736. Otro enfoque es la utilización de una cromatografía de
fase normal que utiliza alumbre como adsorbente. Desafortunadamente,
los solventes orgánicos clorados se utilizan a menudo como fase
móvil con alumbre. Además, tanto la epimerización como la
descomposición química del paclitaxel tienen lugar en este sistema,
dependiendo del tiempo de elución. Zhiqiang Z., Zhiguo S., J. Liq.
Chrom. & Rel. Technol. 23 (17): 2683 (2000).
Recientemente, se ha dado a conocer en la
patente US nº 6.333.419 el aislamiento de paclitaxel mediante una
cromatografía de fase normal que utiliza una fase estacionaria de
sílice y una fase móvil de éster de ácido carboxílico. El
procedimiento descrito en la presente memoria se diseñó para la
separación del paclitaxel a partir de la cefalomanina.
Existe, sin embargo, una continua necesidad de
un aislamiento a gran escala del paclitaxel a partir de una variedad
de componentes no deseados con operaciones de purificación simples y
eficaces.
Una ventaja de la presente invención es un
método simple, barato y eficaz para el aislamiento a gran escala y
para la producción de paclitaxel de alta pureza.
Estas y otras ventajas se han alcanzado, por lo
menos en parte, mediante un procedimiento para el aislamiento del
paclitaxel a partir de mezclas de paclitaxel que utiliza una
cromatografía de fase normal basada en un compuesto a base de
poliamida. El procedimiento incluye la aplicación de una mezcla de
partida que comprende paclitaxel en un contenedor que comprende un
compuesto a base de poliamida y después la aplicación de una
solución que comprende una o más diaquilcetonas junto con un
solvente menos polar en el contenedor. La solución se añade para
producirlo y los componentes de la mezcla para eluir del contenedor.
Después, se recogen una o más fracciones de la solución de elución
que contienen el paclitaxel.
El procedimiento se puede utilizar
ventajosamente para la purificación a gran escala del paclitaxel. El
material de partida del paclitaxel puede ser de una fuente que
contiene paclitaxel y algún componente no deseado. Por ejemplo, la
mezcla de partida puede ser un extracto crudo o purificado obtenido
a partir de fuentes vegetales, o mediante la extracción de cultivos
celulares o cepas de bacterias. La mezcla de partida puede ser una
mezcla de paclitaxel, cefalomanina y otros taxanos, pero no se
limitan a esto.
Las formas de realización de la presente
invención incluyen la aplicación de aproximadamente una parte en
peso de la mezcla de partida a un contenedor, por ejemplo, una
columna, rellenada con más de aproximadamente 20 partes en peso de
un compuesto a base de poliamida, por ejemplo, policaprolactama,
poliundecanolactama, polilaurillactama o poli(hexametileno
adipamida co-caprolactama); la aplicación de una
solución que comprende acetona como una o más dialquilcetonas y
bien tolueno o hexano como el solvente menos polar; y el aumento de
la concentración de diaquilcetona en relación con el solvente menos
polar cuando se aplica la solución al contenedor. Después se puede
aislar el paclitaxel puro o el paclitaxel concentrado a partir de
las fracciones adecuadas que contienen las concentraciones más
elevadas de paclitaxel mediante evaporación y cristalización.
Las ventajas adicionales de la presente
invención se pondrán más claramente de manifiesto para los expertos
en la materia a partir de la siguiente descripción detallada, en la
que sólo se muestra y se describe la forma de realización
preferida, simplemente a título ilustrativo de la mejor forma
contemplada de llevar a cabo la invención. Como se pondrá de
manifiesto, la invención es capaz de otras formas de realización
distintas, y sus varios detalles se pueden modificar con respecto a
varios aspectos evidentes, sin alejarse, por ello, de la invención.
La presente invención se puede realizar sin algunos o todos estos
detalles específicos. En otros casos, los procedimientos operativos
bien conocidos no se han descrito en detalle, para no dificultar
innecesariamente la presente invención. En consecuencia, las figuras
y la descripción deben contemplarse como ilustrativas en su
naturaleza, y no de forma restrictiva.
Se hace referencia a las figuras adjuntas, en
las que:
La Figura 1 ilustra la composición del material
de partida utilizado en el Ejemplo 1, determinado mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 2 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 1, determinadas mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 3 ilustra la composición del material
de partida utilizado en el Ejemplo 2, determinado mediante el
análisis por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo
de elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades
de absorbancia.
La Figura 4 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 2, que se eluyeron a
aproximadamente 40ºC determinadas mediante análisis por HPLC, en la
que el eje de abscisas representa el tiempo de elución en minutos, y
el eje de ordenadas representa las unidades de absorbancia.
La Figura 5 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 2, que se eluyeron a
aproximadamente 70ºC determinadas mediante análisis por HPLC, en la
que el eje de abscisas representa el tiempo de elución en minutos, y
el eje de ordenadas representa las unidades de absorbancia.
La Figura 6 ilustra la composición del material
de partida utilizado en el Ejemplo 3, determinado mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 7 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 3, determinadas mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 8 ilustra la composición del producto
cristalino del Ejemplo 3, determinada mediante análisis por HPLC, en
la que el eje de abscisas representa el tiempo de elución en
minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 9 ilustra la composición del material
de partida utilizado en el Ejemplo 4, determinado mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 10 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 4, determinadas mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 11 ilustra la composición del material
de partida utilizado en el Ejemplo 5, determinado mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 12 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 5, determinadas mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 13 ilustra la composición del material
de partida utilizado en el Ejemplo 6, determinado mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La Figura 14 ilustra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 6, determinadas mediante análisis
por HPLC, en la que el eje de abscisas representa el tiempo de
elución en minutos, y el eje de ordenadas representa las unidades de
absorbancia.
La presente invención se desarrolló durante la
investigación de los procedimientos para el aislamiento a gran
escala del paclitaxel. Después de la experimentación e
investigación, se descubrió que el paclitaxel se puede purificar
eficazmente mediante cromatografía cuando la fase estacionaria
comprende un absorbente basado en poliamida y cuando la fase móvil
comprende una mezcla de una o más diaquilcetonas junto a otro
cosolvente menos polar. La presente invención permite
ventajosamente la separación del paclitaxel a partir de mezclas que
contienen impurezas de taxanos, que de otra forma son difíciles de
extraer pero que están asociadas normalmente con las mezclas de
paclitaxel.
Como se utiliza en la presente memoria, las
formas en singular "un(a)" y "el/la"
específicamente engloban también las formas plurales de los términos
a los que se refieren, a no ser que el contexto claramente dicte lo
contrario.
El término "aproximadamente" se utiliza en
la presente memoria para significar, en la zona de, más o menos, o
alrededor de. Cuando el término "aproximadamente" se utiliza
junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo
los límites por encima y por debajo de los valores numéricos
expuestos. En general, el término "aproximadamente" se utiliza
en la presente memoria para modificar un valor numérico por encima y
por debajo del valor establecido mediante una varianza del 20%.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
tanto en una frase de transición como en el cuerpo de la
reivindicación, los términos "comprende(n)" y "que
comprende(n)" se han de interpretar con un significado
abierto-cerrado. Esto es, los términos se han de
interpretar como sinónimos de las frases "presenta por lo
menos" o "incluye por lo menos". Cuando se utiliza en el
contexto de un procedimiento, el término "que
comprende(n)" significa que el procedimiento incluye por
lo menos las etapas citadas, pero que puede incluir unas etapas
adicionales. Cuando se utiliza en el contexto de un compuesto o una
composición, el término "que comprende(n)" significa que
el compuesto o la composición incluye por lo menos las
características o componentes citados, pero que también puede
incluir unas características o componentes adicionales.
Como se utiliza en la presente memoria, la
enumeración de un intervalo numérico para una variable pretende
expresar que la invención se puede realizar con la variable igual a
cualquiera de los valores dentro del intervalo. Así, para una
variable que es inherentemente discreta, la variable puede ser igual
a cualquier valor entero del intervalo numérico, incluyendo los
puntos finales del intervalo. Similarmente, para una variable que es
inherentemente continua, la variable puede ser igual a cualquier
valor real del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales
del intervalo. A modo de ejemplo, una variable que se describe
presentando unos valores entre 0 y 2, puede ser 0, 1 ó 2 para
variables que son inherentemente discretas, y puede ser 0,0, 0,1,
0,01, 0,0001, o cualquier otro valor real para variables que son
inherentemente continuas.
Como se utiliza en la presente memoria, a no ser
que específicamente se indique lo contrario, la palabra "o" se
utiliza en el sentido de "inclusión" de "y/o" y no en el
sentido de "exclusión" de "uno u otro".
A continuación, se hace referencia en detalle a
las formas específicas de realización de la invención. Aunque la
invención se describirá junto con estas formas de realización
específicas, se debe entender que no se pretende limitar la
invención a dichas formas específicas de realización. En la
siguiente descripción, se exponen numerosos detalles específicos
para proporcionar una comprensión rigurosa de la presente invención.
La presente invención se puede realizar sin algunos o sin ninguno de
estos detalles específicos. En otras ocasiones, los procedimientos
operativos bien conocidos no se han descrito en detalle para no
oscurecer innecesariamente la presente invención.
Se puede utilizar cualquiera de los materiales
y/o los procedimientos adecuados conocidos por los expertos en la
técnica para realizar la presente invención. Sin embargo, se
describen los materiales y los métodos preferidos. A no ser que se
indique lo contrario, los materiales, reactivos y similares a los
que se hace referencia en la siguiente descripción y ejemplos se
pueden obtener comercialmente.
La mezcla de partida de paclitaxel se puede
formar a partir de cualquier fuente que contenga paclitaxel y algún
componente no deseado. En la realización de la presente invención,
se puede utilizar cualquier mezcla de partida de paclitaxel. Por
ejemplo, la mezcla de partida puede ser una mezcla de paclitaxel,
cefalomanina y otros taxanos, pero sin limitarse a estos. La mezcla
de partida también puede ser un extracto crudo o parcialmente
purificado de paclitaxel, que se puede obtener a partir de fuentes
habituales como mediante la extracción de la corteza fresca o seca,
de raíces y/o ramas de toda la planta de una planta que contiene
paclitaxel, por ejemplo, una plana Taxus. También se
contempla otra fuente de paclitaxel para su utilización en la
realización de la presente invención, incluyendo un extracto crudo o
purificado obtenido a partir de cultivos celulares de una planta
Taxus cultivada, un caldo de fermentación preparado mediante
el cultivo de un hongo productor de taxano; una fermentación de un
caldo preparado mediante el cultivo de cepas de bacterias
específicas modificadas genéticamente para la producción de
paclitaxel.
Las mezclas de paclitaxel utilizadas en la
invención pueden tener orígenes distintos y pueden contener una
amplia gama de concentraciones de paclitaxel. Las mezclas bien
definidas que presentan un contenido elevado de paclitaxel y otros
taxanos (cefalomanina, dihidrocefalomanina, taxol C,
7-epi-paclitaxel, etc.), se describen
normalmente como paclitaxel cristalino crudo o paclitaxel cristalino
concentrado, se puede purificar ventajosamente esencialmente
mediante un procedimiento de cromatografía de fase única que utiliza
un adsorbente a base de poliamida. El material de partida puede ser
cualquier concentrado de paclitaxel preparado mediante
procedimientos conocidos a partir de biomasas que contienen
paclitaxel. Cuando se utiliza un material de partida complejo, el
procedimiento de purificación se puede complicar debido a la
presencia de impurezas no taxanos. El inicio con una mezcla de
paclitaxel compleja puede dar como resultado el aislamiento del
paclitaxel con una pureza que es inferior a la deseada. Por
consiguiente, la presente invención contempla más de una etapa de
purificación para purificar el paclitaxel así como una etapa de
cromatografía o una etapa de cristalización repetida.
En un aspecto de la presente invención, el
paclitaxel se separa de los componentes no deseados mediante
cromatografía de fase normal. En la cromatografía de fase normal,
se aplica a una columna o un contenedor que soporta un adsorbente
una mezcla que se va a purificar. A continuación, se aplica un
solvente o una mezcla de solventes, es decir, una fase móvil, a la
columna para conseguir que los constituyentes de la mezcla pasen a
través y se eluyan de la columna. La fase móvil se puede colocar
por gravedad o aplicar mediante la utilización de unas bombas
mecánicas y/o válvulas para mantener un control más exacto del
procedimiento, como se sabe en la técnica de la cromatografía. Bajo
condiciones adecuadas, los constituyentes de la mezcla se parten y
se eluyen a partir del final de la columna a distintos intervalos de
tiempo.
Al llevar a cabo las formas de realización de la
presente invención, se aplica una mezcla de paclitaxel a un
contenedor, por ejemplo, una columna, que comprende un compuesto a
base de poliamida para iniciar la purificación de la mezcla. Aunque
se cree que el compuesto a base de poliamida utilizado en la
presente invención facilita la separación de varios constituyentes
debido a los principios de adsorción, no se limitan a ellos o
necesariamente deben actuar en concordancia con los mismos. Los
principios por los que se separa el paclitaxel a partir de una
mezcla según la presente invención no están limitados por ninguna
teoría.
Se cree que la utilización de un adsorbente
basado en poliamida como fase estacionaria en una cromatografía de
fase normal no es habitual. Sin embargo, se cree que las poliamidas
presentan una buena estabilidad química y física en una amplia gama
de solventes orgánicos, que facilitan su utilización en la
separación de los componentes de la mezcla. Según las formas de
realización de la presente invención, el procedimiento de
cromatografía se basa en una poliamida como fase estacionaria.
Aunque existen muchas variaciones potenciales en la composición
química de una estructura de poliamida, la unidad estructural
central -la unión amida (-CO-NH-)- está presente en
todos los casos. Se cree que el orden y el número de unidades de
metileno entre dos uniones amidas son responsables de la eficacia de
la separación de un polímero de poliamida particular.
En base a los experimentos, se determinó que las
polilactamas, y especialmente la policaprolactama, presentan las
mejores propiedades de separación bajo las condiciones utilizadas.
Estos materiales muestran un elevado grado de estabilidad después
de repetidas operaciones de cromatografía sin un cambio apreciable
en su eficacia de separación. La estabilidad y la eficacia de
separación no cambiaron incluso cuando se utilizó la etapa de
elución del gradiente, por ejemplo, cuando se aumenta la
concentración de diaquilcetona en relación con el solvente menos
polar durante la adición y elución de la solución y a partir de la
columna. Las propiedades de una fase estacionaria de poliamida
contrastan con las fases estacionarias orgánicas, como sílice. Por
ejemplo, el cambio de una fase móvil polar a una fase móvil no
polar se puede realizar muy rápidamente sin la necesidad de una
gran cantidad de una fase móvil no polar para la eliminación del
solvente polar a partir de los centros activos y sin secar la fase
estacionaria. La utilización de una poliamida en la cromatografía de
fase normal conduce a una capacidad de hinchazón más baja y
constante en comparación con su utilización en cromatografía de fase
inversa, con una fase móvil que contiene
agua.
agua.
Las poliamidas se fabrican a escala industrial
en una amplia gama de tamaños. El tamaño de partícula más adecuado
para la separación a escala industrial es de aproximadamente 0,05 a
0,16 mm, lo que permite un rendimiento elevado de la fase móvil a
un goteo de baja presión. La buena separación del paclitaxel se
consiguió incluso cuando sólo se utilizaron aproximadamente 20
partes en peso de poliamida por aproximadamente una parte del
material de partida. No obstante, la cantidad de la fase
estacionaria depende de la composición del material de partida y de
la pureza deseada del producto final de paclitaxel. Las poliamidas
adecuadas que se pueden utilizar en la realización de la presente
invención incluyen policaprolactama, poliundecanolactama,
polilaurillactama, poli(hexametileno adipamida
co-caprolactama), etc.
Otra ventaja de la separación de materiales que
contienen paclitaxel en fases estacionarias de poliamida es la
separación selectiva mejorada observada con el aumento de la
temperatura. Se ha determinado que la utilización de temperaturas
elevadas durante el procedimiento conduce a una mejora en la
separación entre taxanos particulares. Se ha descubierto que
mediante el mantenimiento de la fase estacionaria o móvil a una
temperatura superior a la temperatura ambiente, por ejemplo, a
aproximadamente 40-70ºC, se mejora la separación del
paclitaxel de su cefalomanina análoga, que presenta un
comportamiento de separación muy similar. Además, las temperaturas
elevadas disminuyen la viscosidad de la fase móvil y,
consecuentemente, deberían disminuir los costes de producción. La
utilización de cromatografía a temperaturas elevadas no es aplicable
fácilmente a otros procedimientos de separación, especialmente en
los que se utiliza la cromatografía de fase inversa debido a la
epimerización del paclitaxel en los solventes que contienen agua.
Por el contrario, la epimerización de paclitaxel en una solución que
sustancialmente excluye agua o un alcohol es insignificante y por
consiguiente no limita el procedimiento a temperaturas más
bajas.
La selección de los solventes adecuados para la
fase móvil influye en la eficacia de la separación. Se encontró que
la mejor separación de paclitaxel a partir de las impurezas
presentes en un material que contiene paclitaxel en crudo se
consiguió con un procedimiento de elución del gradiente. En una
forma de realización de la presente invención, se aplica una mezcla
de paclitaxel a un compuesto de poliamida seguido por una primera
fase móvil, que contiene una concentración baja de diaquilcetona en
el solvente menos polar, por ejemplo, en el que la solución
comprende la diaquilcetona a una proporción de solvente menos polar
de aproximadamente 5% (V/V) a aproximadamente 15% (V/V). Después de
que se haya aplicado una cantidad suficiente de la primera fase
móvil al compuesto de poliamida en condiciones isocráticas, es
decir, sin cambio de la composición del solvente, se puede aplicar
una segunda fase móvil bajo una condición de gradiente, es decir, en
la que la concentración de diaquilcetona aumenta de una
concentración baja a una concentración alta.
Se cree que en condiciones isocráticas, todas
las sustancias lipofílicas se eluyen a partir de la columna con la
primera fase móvil y que cuando la concentración de diaquilcetona en
la fase móvil aumenta, se cree que todas las sustancias restantes
se eluyen. Este tipo de perfil de elución puede separar eficazmente
no sólo las sustancias que son taxanos sino que también proporciona
una buena separación para todas las sustancias que poseen el
esqueleto del taxano. Al realizar ciertas formas de realización de
la presente invención, se ha observado que el paclitaxel se eluye
como la última sustancia de todos los taxanos comunes. Bajo estas
circunstancias, se cree que tiene lugar el efecto de desplazamiento
del paclitaxel y se ha observado que la zona de elución del
paclitaxel es brusca sin solaparse con ninguna sustancia de elución
previa. Consecuentemente, la elución del paclitaxel como el último
taxano puede excluir efectos "acompañados", que han sido un
problema en el pasado.
En base a experimentos de laboratorio, se
demostró que se puede separar eficazmente el paclitaxel a partir de
otras sustancias mediante cromatografía utilizando una base
estacionaria a base en poliamida y utilizando mezclas de
diquialcetonas y un cosolvente menos polar como fase móvil. Las
diaquilcetonas adecuadas que se pueden utilizar en la realización
de la presente invención incluyen acetona, metil isobutil cetona,
2-butanona, metiletilcetona, etc. La acetona y la
metilisobutilcetona son los solventes más preferidos de entre el
grupo de diaquilcetonas. No son tóxicas y son baratas. Sin embargo,
tienden a ser demasiado polares para utilizarse solas como un
componente separado de la fase móvil. Por consiguiente la polaridad
de la fase móvil disminuye mediante la adición de uno o más
cosolventes menos polares como el hidrocarburo alifático, un
hidrocarburo aromático, o un éter dialquilo.
En una forma de realización de la presente
invención, los puntos de ebullición de los solventes utilizados
como fase móvil deberían ser inferiores a aproximadamente 130ºC.
Esto se debe a que el producto preferiblemente se recupera a partir
de la fracciones cromatográficas mediante evaporación. Si los puntos
de ebullición de los solventes son demasiado bajos, sin embargo, la
evaporación de los solventes eleva las preocupaciones
medioambientales. Por lo tanto, los solventes menos polares
preferidos utilizados en la realización de las formas de realización
de la presente invención incluyen (C_{5}-C_{8})
hidrocarburos alifáticos, como hexano o heptano;
(C_{6}-C_{8}) hidrocarburos aromáticos, como
tolueno; (C_{1}-C_{4}) éteres dialquilos, como
éter dibutilo; éter disobutilo o éter metil
pert-butil; o una mezcla de estos.
Se pueden crear muchas combinaciones de
soluciones a partir de solventes adecuados. Para mejorar la eficacia
del procedimiento, los solventes individuales se pueden recuperar
después del procedimiento de separación, por ejemplo, mediante
destilación. Es preferible utilizar una combinación de solventes que
presentan una amplia diferencia suficiente entre sus puntos de
ebullición para facilitar su separación mediante destilación. En
base a su punto de ebullición, el tolueno es el solvente preferido
de entre el grupo de los solventes menos polares.
Otra consideración en relación a la elección de
los solventes para su utilización como fase móvil depende del
material que se va a separar. Normalmente, las mezclas complejas con
un bajo contenido de paclitaxel también contienen algunas impurezas
muy polares para extraerse. Estas impurezas, en última instancia, se
han de lavar de la columna. Parece que estas mezclas de paclitaxel
se separan más fácilmente mediante la combinación de acetona y
tolueno como fase móvil.
Las fracciones elucionadas que contienen una
alta concentración de paclitaxel se pueden entonces aislar más
mediante evaporación al vacío. La extensión del secado dictará si el
producto da como resultado un residuo viscoso o una masa sólida,
tanto uno como otro se pueden cristalizar a partir de solventes
adecuados para obtener paclitaxel en forma cristalina. La
utilización de un sistema de solventes completamente orgánico junto
a una evaporación rápida de estos solventes reduce ventajosamente o
elimina completamente la isomerización no deseada del paclitaxel a
7-epi-paclitaxel. Esta es otra ventaja sobre
los procedimientos de aislamiento conocidos basados en cromatografía
de fase inversa.
Los siguientes ejemplos se destinan a ilustrar
más ciertas formas de realización preferidas de la invención y no
son limitantes en su naturaleza. Los expertos en la técnica
reconocerán, o serán capaces de establecer, utilizando tan solo una
experimentación rutinaria, varios equivalentes a las sustancias
específicas y a los procedimientos descritos en la presente
memoria.
Se disuelven aproximadamente 0,71 g de una
mezcla cruda que contiene aproximadamente 8,38% de paclitaxel y
aproximadamente 2,23% de cefalomanina (como se muestra en la Figura
1) en aproximadamente 10 ml de una mezcla que contiene acetona y
tolueno en una proporción de 10:90 (V/V). La solución se carga en
una columna rellenada con aproximadamente 45 g de adsorbente a base
de poliamida (Polyamide Roth, tamaño de la partícula de
aproximadamente 50-160 \mum). Después, la columna
se eluye con aproximadamente 600 ml de una solución de acetona y
tolueno 10:90 (V/V). Después se añaden aproximadamente 1200 ml de
una solución de acetona y tolueno a la columna mientras se aumenta
linealmente el gradiente de la acetona desde una proporción de
partida de 10:90 (V/V) hasta una proporción final de 100:0 (V/V). El
flujo de la fase móvil se mantuvo a aproximadamente 50 ml/min
durante todo el proceso de elución. Se tomaron las fracciones de la
solución de elución aproximadamente cada 50 ml desde el tiempo de
inyección hasta el tiempo final de la elución del gradiente y se
analizaron mediante HPLC. Las fracciones de la solución de elución
que contienen paclitaxel se evaporan hasta su secado consiguiendo
aproximadamente 0,14 g de producto que contiene aproximadamente
37,54% de paclitaxel hasta aproximadamente 6,80% de cefalomanina (en
la Figura 2 se muestra el análisis mediante HPLC).
Se disuelven aproximadamente 0,75 g de una
mezcla cruda que contiene aproximadamente 1,99% de paclitaxel y
aproximadamente 0,89% de cefalomanina (como se muestra en la Figura
3) en 15 ml de una mezcla de acetona y tolueno 10:90 (V/V). La
solución se carga en una columna rellenada con aproximadamente 45 g
de poliamida (Polyamide Roth, tamaño de la partícula de
aproximadamente 50-160 \mum). Después, la columna
se eluye con aproximadamente 600 ml de una solución de acetona y
tolueno 10:90 (V/V) mientras se mantiene la temperatura a
aproximadamente 40ºC. Después se añaden aproximadamente 1200 ml de
una solución de acetona y tolueno a la columna mientras se aumenta
linealmente el gradiente de la acetona desde una proporción de
partida de 10:90 (V/V) hasta una proporción final de 100:0 (V/V). Se
tomaron fracciones de la solución de elución cada 50 ml. Las
fracciones se analizaron mediante HPLC. Se realizó el mismo
experimento con un material de partida idéntico y en las mismas
condiciones excepto que la columna se mantuvo a aproximadamente
50ºC, 60ºC o 70ºC. Se evaluaron las fracciones correspondientes que
contienen paclitaxel de las cuatro separaciones para encontrar el
contenido tanto de paclitaxel como de cefalomanina. Se encontró que
el aumento de temperatura conduce a una mejora en la separación
entre estas dos sustancias desde una proporción de aproximadamente
3:89:1 a 40ºC (el análisis mediante HPLC se muestra en la Figura 4)
hasta una proporción de aproximadamente 5:31:1 a 70ºC (en la Figura
5 se muestra el análisis mediante HPLC).
Se disuelven aproximadamente 198,0 g de una
mezcla de paclitaxel crudo que contiene aproximadamente 7,3% de
paclitaxel y aproximadamente 2,3% de cefalomanina (la proporción
inicial de paclitaxel/cefalomanina es de aproximadamente 3:17:1
según un análisis mediante HPLC, como muestra la Figura 6) en 4 l de
acetona y tolueno (10:90 V/V). La solución se carga en una columna
rellenada con aproximadamente 6.830 g de poliamida (Polyamide Roth,
tamaño de partícula 50-160 \mum). A continuación,
se eluye la columna con 100 l de acetona y tolueno (10:90 (V/V). Se
eluye nuevamente con 200 l de una mezcla de acetona y tolueno
mientras se aumenta linealmente el gradiente de la acetona desde una
proporción de partida de 10:90 (V/V) hasta una proporción final de
100:0 (V/V). Se tomaron fracciones de la solución de elución cada
20 l y se se analizaron mediante HPLC. Las fracciones de la solución
de elución que contienen paclitaxel puro se evaporaron hasta su
secado consiguiendo aproximadamente 22,42 g de producto que contiene
aproximadamente 60,5% de paclitaxel y aproximadamente 1,3% de
cefalomanina (el análisis mediante HPLC se muestra en la Figura 7).
La pureza del paclitaxel después de la cristalización a partir de
una mezcla de acetona y hexano (50:50 V/V) es aproximadamente un
98,9% (en la Figura 8 se muestra el análisis mediante HPLC).
Se disuelven aproximadamente 68,3 g de una
mezcla de paclitaxel cristalino crudo que contiene aproximadamente
55,0% de paclitaxel y aproximadamente 19,0% de cefalomanina (la
proporción inicial de paclitaxel/cefalomanina es de aproximadamente
2,89:1 según un análisis mediante HPLC, como muestra la Figura 6) en
2 l de acetona y tolueno (10:90 V/V). La solución se carga después
en una columna rellenada con aproximadamente 6.830 g de poliamida
(Polyamide Roth, tamaño de partícula 50-160 \mum).
Después, se eluye la columna a 50ºC con 100 l de acetona y tolueno
(10:90 (V/V) y se eluye nuevamente con 200 l de una mezcla de
acetona y tolueno mientras se aumenta linealmente el gradiente de la
acetona desde una proporción de partida de 10:90 (V/V) hasta una
proporción final de 100:0 (V/V). Se tomaron fracciones de la
solución de elución cada 20 l y se analizaron mediante HPLC. Las
fracciones de la solución de elución que contienen paclitaxel puro
se evaporaron hasta secado consiguiendo aproximadamente 28,61 g de
producto que contiene aproximadamente 83,1% de paclitaxel y
aproximadamente 1,0% de cefalomanina (el análisis mediante HPLC se
muestra en la Figura 10).
Se disuelven aproximadamente 0,33 g de una
mezcla de paclitaxel crudo que contiene aproximadamente 15,28% de
paclitaxel y aproximadamente 3,35% de cefalomanina (como muestra la
Figura 11) en 8 ml de acetona y hexano 31:69 (V/V). La solución se
carga después en una columna rellenada con aproximadamente 45 g de
poliamida (Polyamide Roth, tamaño de partícula
50-160 \mum). Después, se eluye la columna con 600
ml de acetona y hexano 20:80 (V/V). La columna se eluye nuevamente
con 1200 ml de una mezcla de acetona y hexano mientras se aumenta
linealmente el gradiente de la acetona desde una proporción de
partida de 20:80 (V/V) hasta una proporción final de 100:0 (V/V). Se
tomaron fracciones de la solución de elución cada 50 ml y se
analizaron mediante HPLC. Las fracciones que contienen paclitaxel
puro se evaporaron hasta secado consiguiendo aproximadamente 0,07 g
de producto que contiene aproximadamente 29,7% de paclitaxel y
aproximadamente 3,5% de cefalomanina (el análisis mediante HPLC se
muestra en la Figura 12).
Se disuelven aproximadamente 0,35 g de
paclitaxel concentrado que contiene aproximadamente 65,78% de
paclitaxel y aproximadamente 2,08% de Taxol C (como muestra la
Figura 13) en 20 ml de acetona y tolueno 15:85 (V/V). La solución se
carga después en una columna rellenada con aproximadamente 35 g de
poliamida (Polyamide Roth, tamaño de partícula 315 \mum). A
continuación, se eluye la columna con 750 ml de acetona y tolueno
15:85 (V/V). La columna se eluye nuevamente con 750 ml de una mezcla
de acetona y hexano mientras se aumenta linealmente el gradiente de
la acetona desde una proporción de partida de 15:85 (V/V) hasta una
proporción final de 50:50 (V/V). Se tomaron fracciones de la
solución de elución cada 50 ml y se analizaron mediante HPLC. Las
fracciones que contienen paclitaxel puro se evaporaron hasta secado
consiguiendo aproximadamente 0,25 g de producto que contiene
aproximadamente 68,63% de paclitaxel y aproximadamente 0,63% de
taxol C (el análisis mediante HPLC se muestra en la Figura 14).
En esta exposición se han descrito sólo las
formas de realización preferidas de la invención y algunos ejemplos
de su versatilidad. Se entiende que la invención puede utilizar
otras combinaciones y entornos y es capaz de sufrir cambios o
modificaciones dentro del alcance del concepto inventivo como se
expresa en la presente memoria. Por tanto, por ejemplo, los expertos
en la materia reconocerán o serán capaces de establecer, utilizando
uno o más experimentos de rutina, varios equivalentes a las
sustancias específicas y los procesos descritos en la presente
memoria. Dichos equivalentes se considera que están comprendidos
dentro del alcance de la presente invención, y están cubiertos por
las reivindicaciones siguientes.
Claims (17)
1. Procedimiento para la purificación de
paclitaxel, comprendiendo el procedimiento las etapas
siguientes:
- a)
- aplicar una mezcla de partida que comprende paclitaxel en un contenedor que comprende un compuesto a base de poliamida;
- b)
- aplicar en dicho contenedor una solución de elución que comprende una o más dialquilcetonas mezcladas con un solvente menos polar en el contenedor;
- c)
- eluir la mezcla de partida; y
- d)
- recoger una o más fracciones de la solución de elución que contiene el paclitaxel.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla de partida es un extracto crudo o purificado
obtenido por extracción de entre el grupo constituido por la planta
Taxus entera, su corteza fresca o seca, su raíz, sus hojas o
ramas.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla de partida es un extracto crudo o purificado
obtenido por extracción de cultivos celulares obtenidos a partir de
una planta Taxus.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla de partida es un extracto crudo o purificado
obtenido por extracción de un caldo de fermentación preparado por
cultivo de un hongo productor de taxanos.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla de partida es un extracto crudo o purificado
obtenido por extracción de un caldo de fermentación preparado por
cultivo de unas cepas bacterianas específicas modificadas
genéticamente para la producción de paclitaxel.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el material de partida es una mezcla de paclitaxel,
cefalomaninas y otros taxanos.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que una o más diaquilcetonas se seleccionan de entre el grupo
constituido por acetona, 2-butanona o
metilsiobutilcetona.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el solvente menos polar se selecciona de entre el grupo
constituido por un hidrocarburo alifático
(C_{5}-C_{8}), un hidrocarburo aromático
(C_{5}-C_{8}), un dialquiléter
(C_{1}-C_{4}) o sus mezclas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el hidrocarburo alifático (C_{5}-C_{8})
es hexano o heptano.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el hidrocarburo aromático (C_{6}-C_{8})
es tolueno.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el dialquiléter (C_{1}-C_{4}) se
selecciona de entre el grupo constituido por dibutiléter, diisobutil
éter y terc-butil metil éter.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que una parte en peso de la mezcla de partida se aplica a una
columna rellenada con más de aproximadamente 20 partes en peso del
compuesto a base de poliamida.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la poliamida se selecciona de entre el grupo constituido por
policaprolactama, poliundecanolactama y polilaurillactama.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la poliamida es poli(hexametileno adipamida
co-caprolactama).
15. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la solución comprende una o más dialquilcetonas en una
proporción respecto al solvente menos polar de aproximadamente 5%
(V/V) a aproximadamente 100% (V/V).
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la solución comprende acetona como una o más dialquilcetonas
y bien tolueno o hexano como el solvente menos polar.
17. Procedimiento según la reivindicación 1 ó
16, que comprende asimismo el aumento de la concentración de la
dialquilcetona en relación con el solvente menos polar cuando se
aplica la solución al contenedor.
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