ES2316157T3 - Mejoras en o relativas a agentes de contraste. - Google Patents

Abstract

ALGUNOS AGENTES DE CONTRASTE PARA ULTRASONIDOS, QUE COMPRENDEN MICROBURBUJAS DE UN GAS BIOCOMPATIBLE, POR EJEMPLO, UN HALOGENURO DE AZUFRE O UN PERFLUORCARBONO, ESTABILIZADO POR MATERIAL AMFIFILICO OPSONIZABLE, POR EJEMPLO, UN LIPIDO FORMADOR DE MEMBRANA, COMO UN FOSFOLIPIDO, ESPECIALMENTE UN FOSFOLIPIDO CARGADO NEGATIVAMENTE, COMO LA FOSFATIDILSERINA, PUEDEN MOSTRAR UN TIEMPO PROLONGADO DE PERMANENCIA, GENERADORA DE CONTRASTE, EN EL HIGADO DESPUES DE ADMINISTRACION INTRAVENOSA.

Description

Mejoras en o relativas a agentes de contraste.

La invención se refiere a la ecografía por ultrasonidos, más en particular, a procedimientos de ecografía de ultrasonidos del hígado y a agentes de contraste útiles en tales procedimientos a causa de su prolongado tiempo de residencia en el hígado.

Los cánceres tales como hepatomas e invasiones metastásicas del hígado son causa importante de muerte en el mundo industrializado y hay una necesidad continua de procedimientos mejorados para la detección de tumores. Las investigaciones del hígado se pueden realizar, por ejemplo, por radiografía de rayos X después de la administración por inyección de un agente de contraste de rayos X yodado encapsulado en un liposoma. Así, como se describe en el documento WO-A-8809165, tales liposomas se fijan en el hígado y el bazo por interacción con el sistema reticuloendotelial permitiendo el examen de estos órganos por rayos X; en general, el tejido tumoral tiene una vascularidad diferente de la del tejido sano y/o menos sitios de absorción y, por tanto, se puede detectar como una zona de contraste modificado.

Como se indica en el documento WO-A-8809165, el examen por rayos X de hígado típicamente requiere que esté presente el agente de contraste de rayos X yodado a una concentración de 2-2,5 mg de yodo/g de tejido, esto es, en una cantidad total de aprox. 3,5 g en el caso de un ser adulto humano cuyo hígado pesa aprox. 1,5 kg. Se ha sugerido que es típica la incorporación por el hígado de un 40% de liposomas, de manera que se requerirá la inyección de un agente de contraste que contiene aprox. 9 g de yodo para alcanzar este nivel. Esto puede implicar la inyección concomitante de hasta 9 g de lípido, lo que puede conducir a indeseables efectos secundarios.

El examen por ultrasonidos del hígado potencialmente es de gran interés en razón al coste sustancialmente menor de los escáneres ultrasónicos en comparación con los escáneres de rayos X y de tomografía computorizada (TC), a la evitación del uso de radiación ionizante (intensificando potencialmente la seguridad tanto del paciente como del equipo médico) y al coste reducido de los agentes de contraste requeridos. Así, en este último aspecto, se sabe que los agentes de contraste que comprenden dispersiones de microburbujas y/o fluidos volátiles son retrodispersores particularmente eficaces de ultrasonidos debido a la baja densidad y ala capacidad de fácil compresión de las microburbujas; tales dispersiones de microburbujas, si se estabilizan adecuadamente, pueden permitir una visualización ultrasónica muy eficaz de, por ejemplo, el sistema vascular y la microvasculatura del tejido, frecuentemente a dosis ventajosamente bajas. Sin embargo, si bien típicamente tales agentes de contraste se eliminan de la vasculatura mediante asimilación por el sistema reticuloendoterial, por ejemplo en el hígado, el bazo o los nódulos linfáticos, los procedimientos existentes para obtener imágenes de estos órganos son limitados en sus aplicaciones.

El documento US-A-5425366 describe que si bien son incorporados por el hígado varios tipos de agentes de contraste de ultrasonidos en forma de micropartículas, no permiten una obtención eficaz de imágenes usando técnicas convencionales del modo B. Se sugiere que esto es debido a que la señal de ultrasonidos irradiada tiene sólo una pequeña profundidad de penetración en el tejido del hígado como resultado de la reflexión acumulativa por el agente de contraste, lo que conduce a que la imagen se ensombrezca uniformemente. Sin embargo, es igualmente probable que sea resultado de la atenuación de la señal del ultrasonido irradiada por interacción con el material estructural de las micropartículas, por ejemplo conduciendo a la absorción de la señal y conversión en calor.

En el documento US-A-5425366 se ha sugerido que, aunque tales agentes de contraste en micropartículas retenidos en órganos tales como el hígado esencialmente son inmóviles, se pueden visualizar sin embargo por técnicas Doppler color. Se ha propuesto que los niveles superiores de energía de irradiación asociados con investigaciones en Doppler color causan que las micropartículas revienten, por lo que se generan señales sensibles a Doppler descritas como "emisión acústica estimulada acústicamente", aunque parece probable que en la práctica el detector interprete la desaparición de una micropartícula como un movimiento a alta velocidad y genere un desplazamiento apropiado. También se nota que la destrucción progresiva de micropartículas por la señal de ultrasonidos irradiada facilitará la penetración de la señal a mayor profundidad en el tejido a medida que se realiza la investigación.

Una desventaja de esta técnica es la alta atenuación exhibida por agentes de contraste encapsulados en polímeros tales como los descritos en la patente. Esto puede ser resultado de la comparativa rigidez del material encapsulante y que previene la generación de niveles homogéneos de señales a través del hígado. Por tanto, los tiempos de rastreo deben ser necesariamente largos y la información obtenida puede ser difícil de interpretar. Por tanto, la técnica no es adecuada para tomografía ultrasónica. También es desventajosa la pérdida de información y de calidad de imagen que inevitablemente resulta de usar instrumentación Doppler color para detectar cuáles con los resultados efectivamente anómalos de partículas esencialmente inmóviles. Así, la exhibición en color de un instrumento así es para mapear velocidades más que intensidades de color, por lo que la información referente a la intensidad se puede simplemente perder o se puede distorsionar, por ejemplo, usando filtros de alto paso para excluir señales que derivan de tejido que se puede mover lentamente.

Además, a causa de la señalada alta atenuación de agentes de contraste en micropartículas tales como las microcápsulas encapsuladas en polímero descritas en el documento US-A-5425366, la atenuación de la retrodispersión necesariamente es baja. Esto limita inevitablemente la eficacia de la obtención de imágenes con ultrasonidos de otras partes del cuerpo, por ejemplo, la vasculatura, que es posible que se quiera estudiar junto con la obtención de imágenes del hígado.

Por el documento WO-A-9608234 son conocidos agentes de contraste de ultrasonidos de vesículas que contienen gas perfluorobutano estabilizadas por fosfolípidos. Sin embargo, esta publicación silencia cómo las vesículas apuntan al hígado.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 87, nº.15, págs. 5744-8 nota que el hígado incorpora liposomas que contienen fosfatidilserina. No hay mención en este documento de que se pueden usar en el hígado microburbujas estabilizadas por un material opsonizable que contiene fosfatidilserina para obtener imágenes y que las microburbujas mantienen su ecogenia durante horas.

Consecuentemente, hay necesidad de procedimientos de ecografía ultrasónica usando agentes de contraste que permitan una visualización efectiva del hígado por medio de una variedad de técnicas de ecografía. Por ejemplo, las de ecografía convencional del modo B y de armónicos.

La presente invención está basada en el hallazgo de que los agentes de contraste que comprenden microburbujas de gases estabilizadas por materiales fosfolipídicos opsonizables pueden tener un tiempo de residencia que genera contraste prolongado en el hígado y el bazo. Si bien se puede esperar que tal material con microburbujas estabilizado con fosfolípidos sería fagocitado por macrófagos del hígado y el bazo, y si bien en la práctica los materiales fosfolipídicos se pueden seleccionar como se describe en esta memoria más adelante para facilitar su rápida incorporación en el hígado, por ejemplo, por células de Kupffer del sistema reticuloendotelial, es extremadamente sorprendente que pueda continuar su efecto generador de contraste, por ejemplo, durante varias horas, puesto que sería de esperar una rápida destrucción de los agentes de contraste y la pérdida de ecogenia después de tal fagocitosis.

Así, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, en la fabricación de un agente de contraste para uso en la obtención de imágenes ultrasónicas del hígado de un sujeto humano o no humano se usan microburbujas de gas biocompatible estabilizado por material fosfolipídico opsonizable que incluye como mínimo 50% de fosfolípidos cargados negativamente, agente de contraste que es capaz de generar ecogenia en el hígado durante un período de hasta 2-8 horas después de ser administrado a tal sujeto.

El material anfífilo opsonizable, que si se desea puede ser fluorado, puede seleccionarse, por ejemplo, entre lípidos anfífilos opsonizables, proteínas anfífilas opsonizables y polímeros naturales y sintéticos opsonizables.

Los materiales anfífilos opsonizables pueden comprender, por ejemplo, uno o varios lípidos que forman membrana, término que se usa en esta memoria para denotar lípidos anfífilos capaces de formar bicapas en estado de cristal líquido o de gel en medios acuosos; tales lípidos anfífilos forman también monocapas o bicapas individuales en las intercaras gas-agua, por ejemplo, como en películas de Langmuir-Blodget. El término incluye así lípidos que se encuentran en membranas biológicas que se caracterizan por una solubilidad en agua baja, de manera que forman bicapas de cristal líquido o en estado de gel en medio acuoso incluso a concentraciones muy bajas, y por su tendencia en soluciones acuosas a disminuir sustancialmente la tensión superficial, por ejemplo, a casi cero. Tales lípidos formarán monocapas, bicapas o multicapas encapsulantes en torno a las microburbujas en agentes de contraste usados de acuerdo con la invención.

Entre los ejemplos de tales lípidos formadores de membrana están incluidos lipopéptidos, hidratos de carbono derivados lipofílicamente, por ejemplo, que presentan uno o varios grupos acilo graso, ésteres monoglicéridos o diglicéridos de ácido graso, esfingolípidos, glicolípidos, glicerolípidos y, más preferiblemente, fosfolípidos, por ejemplo, ácidos fosfofatídicos, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilinositoles, cardiolipinas y sus correspondientes anólogos liso (por ejemplo, monoacilo, preferiblemente 1-acilados).

El material anfífilo opsonizable de los agentes de contraste usados de acuerdo con la presente invención pueden comprender, por ejemplo, uno o varios lípidos formadores de membrana, opcionalmente junto con los aditivos que modifican propiedades de las membranas tales como estabilidad, capacidad de dispersión, tendencia a la agregación, actividad biológicas, flexibilidad o polaridad. Entre los aditivos representativos están incluidos lípidos no formadores de membrana, por ejemplo, esteroles tales como colesterol.

Es ventajoso, que al menos parte, por ejemplo como mínimo 5%, por ejemplo, como mínimo 20%, preferiblemente como mínimo 50%, de cualquier material lipídico formador de membrana esté constituido por moléculas que individualmente presentan una carga negativa global en condiciones de preparación y/o uso. Parece así que la repulsión electrónica entre membranas de lípidos cargadas favorece la formación de monocapas lipídicas estables y estabilizadoras en torno a las microburbujas de gas; la flexibilidad y capacidad de deformación de tales membranas delgadas intensifica significativamente la ecogenia de los agentes de contraste en comparación con sistemas en los que el gas esta encapsulado por una o varias bicapas lipídicas. Además, tales sistemas de monocapa exhiben una atenuación sustancialmente reducida en comparación con sistemas de bicapas y permiten por ello una mayor penetración de la señal de ultrasonidos irradiada y, consecuentemente, facilitan la obtención de imágenes a mayor profundidad dentro del hígado.

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La presencia de material lipídico formador de membrana cargado negativamente aumenta también la identificación de los agentes de contraste por las células de Kupffer, con lo que se intensifica la incorporación hepática, lo que puede confirmarse por microscopía electrónica de los hígados de, por ejemplo, ratas después de la inyección intravenosa de agentes de contraste que comprenden tal material lipídico.

Entre los ejemplos de lípidos formadores de membrana cargados negativamente están incluidos fosfolípidos cargados negativamente tales como los naturales (por ejemplo, derivados de haba de soja y yema de huevo), semisintéticos (por ejemplo, parcial o totalmente hidrogenados), y fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y cardiolipinas sintéticos; cada uno de los grupos acilo de tales dosfatidilcolinas típicamente contendrá aproximadamente 14-22 átomos de carbono, por ejemplo en grupos palmitoílo y estearoílo.

Se prefiere particularmente el uso de agentes de contraste que comprenden fosfatidilserinas puesto que las células de Kupffer y los macrófagos esplénicos reconocen células rojas de la sangre envejecidas y plaquetas por la presencia de altas concentraciones de fosfatidilserina en su superficie. Consecuentemente reconocerán probablemente y fagocitarán en el hígado y el bazo tales agentes de contraste que contiene fosfatidilserina.

El lípido formador de membrana u otro material opsonizable puede seleccionarse ventajosamente para que sea impermeable al contenido de gas del agente de contraste, al menos durante el transporte del agente de contraste por la corriente sanguínea al hígado. Esto puede lograrse, por ejemplo, empleando gases que tienen valores relativamente bajos de la difusión a través del lípido y membranas similares. Entre los ejemplos de tales gases están incluidos haluros de azufre tales como hexafluoruro de azufre o decafluoruro de azufre, fluorocarburos tales como perfluorocarburos, cetonas fluoradas (por ejemplo, perfluoradas) tales como perfluoroacetona; y éteres fluorados (por ejemplo, perfluorados) tales como dietil perfluorado éter. Son perfluorocarburos representativos que pueden contener, por ejemplo, hasta 7 átomos de carbono, perfluoroalcanos tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluopropanos, perfluorobutanos (por ejemplo, perfluoro-n-butano, opcionalmente mezclado con otros isómeros tales como perfluoro-isobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos y perfluoroheptanos; perfluoroalquenos tales como perfluoro-propeno, perfluorobutenos (por ejemplo, perfluorobut-2-eno) y perfluorobutadieno; perfluoroalquinos tales como perfluorobut-2-ino; perfluorocicloalcanos tales como perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perflurociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano; y mezclas de cualquiera de los anteriores, incluidas mezclas con más gases formadores de membrana tales como aire, nitrógeno, dióxido de carbono, etc., por ejemplo, mezclas que contienen hasta 90% o más de gases permeables en membranas.

El uso de agentes de contraste que comprenden microburbujas de un perfluoroalcano tal como perfluorobutano encapsulado por una o varias fosfatidilserinas es una realización particularmente preferente de este aspecto de la presente invención.

Alternativamente, se puede seleccionar un lípido formador de membrana u otros materiales anfífilos opsonizables que presentan una permeabilidad relativamente baja a gases tales como aire, nitrógeno, dióxido de carbono, oxígeno, etc. Así por ejemplo, materiales lipídicos fluorados formadores de membrana, por ejemplo, aquellos en los que los grupos acilo graso están fluorados, preferiblemente perfluorados, se pueden usar para encapsular una amplia gama de gases biocompatibles (término que incluye sustancias, incluidas mezclas, sustancial o completamente en forma gaseosa o de vapor a la temperatura normal del cuerpo humano, 37ºC) en agentes de contraste útiles de acuerdo con la invención. Entre los ejemplos de tales gases están incluidos aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, óxido nitroso, gases inertes (por ejemplo, helio, argón, xenón o criptón), silanos opcionalmente halogenados (por ejemplo, tetrametilsilano), hidrocarburos de bajo peso molecular opcionalmente halogenados (por ejemplo, que contienen hasta 7 átomos de carbono, por ejemplo, alcanos tales como metano, etano, propanos, butanos o pentanos; cicloalcanos tales como ciclobutano o ciclopentano; alquenos tales como propeno o butenos; alquinos tales como acetileno; éteres; cetonas; ésteres y versiones halogenadas de cualquiera de los anteriores, incluidos perfluorocarburos tales como los mencionados antes), haluros de azufre (por ejemplo, hexafluoruro de azufre o decafluoruro de diazufre) y mezclas de cualquiera de los anteriores.

Se apreciará que las membranas de lípido o similares no es necesario que permanezcan impermeables a las burbujas de gas y/o que estabilicen las burbujas de gas después de que se pare la incorporación del agente de contraste en el hígado y/o se haya incorporado, por ejemplo, mediante su detención en las superficies (por ejemplo, por interacción específica con los receptores), o después de haber sido incorporado por las células de acuerdo con procesos conocidos de internalización. Así, la ecogenia que sigue a tal detención/incorporación puede derivar de microburbujas de gas estabilizadas por el lípido original que forma membrana u otro material opsonizable, microburbujas de las que al menos parte del material anfífilo está reemplazado por fosfolípidos endógenos, microburbujas exentas de gas liberadas del agente de contraste (si no está disuelto o ha desechado de otra forma el hígado) o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Se apreciará además que la estabilización de las microburbujas de gas puede intensificarse si el gas tiene una solubilidad en agua menor que la de los gases normales en sangre tales como oxígeno, dióxido de carbono y nitrógeno.

Las microburbujas de agentes de contraste usados de acuerdo con la invención pueden tener convenientemente un tamaño medio de 1-10 \mum, por ejemplo de 1-7 \mum, permitiendo así su paso libre a través del sistema pulmonar y la eventual incorporación por órganos tales como el hígado y el bazo después de administración intravenosa. Sin embargo, tales microburbujas tienen un tamaño suficiente para presentar una ecogenia sustancial (una propiedad dependiente del tamaño). El uso de microburbujas de este tamaño para intensificar la obtención de imágenes del hígado se puede contrastar con sugerencias de la técnica anterior tales como las del documento WO-A-9109629 de que son deseables tamaños de aproximadamente 30-100 nm con el fin de asegurar el paso a través de las fenestraciones capilares al hígado; las microburbujas en este intervalo de tamaños presentarán una ecogenia significativamente más baja que las microburbujas con un tamaño dentro del intervalo preferido indicado antes.

Si se desea, se puede administrar antes, durante o después de administrar el agente de contraste, una sustancia capaz de estimular la corriente sanguínea en el hígado, por ejemplo, glucagón, y/o una sustancia capaz de incrementar la incorporación hepática por fagocitosis estimulante, por ejemplo un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o fibronectina.

Los agentes de contraste preferidos que contienen fosfolípidos, útiles de acuerdo con la invención, se pueden administrar, por ejemplo, en dosis tales que la cantidad de fosfolípido inyectado esté en el intervalo de 0,1-10 \mug/kg de peso corporal, por ejemplo de 1-5 \mug/kg. Se apreciará que el uso de estos bajos niveles de fosfolípido es una ventaja sustancial en cuanto a minimizar posibles efectos tóxicos secundarios.

A causa de la rápida incorporación en el hígado, por ejemplo, por las células de Kupffer, de agentes de contraste preferidos útiles de acuerdo con la invención, la toma de imágenes de un paciente se puede realizar tan pronto como 5-10 minutos después de administrar el agente de contraste, aunque puede preferirse demorar algo la investigación, por ejemplo, hasta aproximadamente 30 minutos después de la administración, para lograr una incorporación máxima del agente de contraste. El prolongado tiempo de permanencia en el hígado del agente de contraste ecogénico permite realizar una ecografía eficaz de imágenes varias horas (por ejemplo, 2-8 horas) después de la administración.

La ecografía ultrasónica del hígado se puede realizar, por ejemplo, usando frecuencias de ecografía de aproximadamente 0,1-15 MHz, por ejemplo, de 1-10 MHz.

Entre las técnicas de ecografía representativas que se pueden usar de acuerdo con la invención están incluidas la ecografía de modo-B, la ecografía de Doppler con onda continua, técnicas de Doppler con onda pulsada tales como la ecografía Doppler color o de potencia, la ecografía de armónicos y combinaciones de cualquiera de las anteriores. La naturaleza flexible de los agentes de contraste con microburbujas estabilizadas usados de acuerdo con la invención los hace particularmente adecuados para técnicas de ecografía de armónicos basadas en efectos no lineales tales como armónicos superiores (por ejemplo, 2, 3, 4 ... veces la frecuencia de ecografía), subarmónicos (por ejemplo, a ½, ¼, ^{2}/_{3}, ¾ veces la frecuencia de ecografía) y ultraarmónicos (por ejemplo, a ^{3}/_{2}, ^{5}/_{4} ... veces la frecuencia de ecografía), por ejemplo, como se describe en el documento USA-A-5410516; el uso de una ecografía de segundos armónicos puede ser particularmente ventajosa.

Típicamente, la ecografía de armónicos requiere la exposición de agentes de contraste de microburbujas a una irradiación ultrasónica de alta intensidad para una conversión eficaz en energía ultrasónica armónica. A causa de que la distribución espacial de la intensidad de ultrasonidos en grandes regiones de tejido tales como el hígado, tiende a ser muy inhomogénea como resultado de inhomegeneidades a lo largo del haz de ultrasonidos y de la atenuación acústica por el tejido, puede ser necesario emplear intensidades de la irradiación incidente muy altas para obtener intensidades suficientes de la señal de retorno de partes distales del tejido del que se obtienen imágenes; esto puede conducir a una rápida pérdida del efecto de contraste en regiones de tejido adyacentes al transductor y, consecuentemente, a una pérdida del efecto de contraste en un tiempo tan corto como de 1 segundo desde el comienzo de la irradiación. Esto limita inevitablemente la utilidad de tales técnicas para obtener una visión global de una región tisular.

La naturaleza flexible de los agentes de contraste usados de acuerdo con la presente invención, empero, causa que exhiban una alta eficacia en la conversión de energía de armónicos incluso a bajas intensidades de ultrasonidos incidentes, lo que hace que sean eficaces para obtener imágenes de armónicos de regiones profundas del hígado a bajas intensidades de ultrasonidos que no inducen fenómenos de destrucción de microburbujas en regiones del hígado más próximas al transductor. Más en general, la naturaleza flexible de los agentes de contraste permite su uso en una variedad de modalidades de ecografía a bajos niveles de intensidad de los ultrasonidos, que no destruyen el agente de contraste, lo que facilita múltiples barridos de las regiones de interés dentro del hígado, por ejemplo, a los fines de confirmación usando diferentes modalidades de obtención de imágenes.

Si se desea, sin embargo, se pueden usar niveles de intensidad ultrasónica más altos y el contraste se puede detectar por procedimientos que detectan la destrucción de microburbujas. Entre los ejemplos de tales procedimientos están incluidas técnicas sensibles a fases tales como Doppler color (por ejemplo, descrita en el documento US-A-5425366) o Doppler potencia, y técnicas insensibles a fases, por ejemplo, las descritas en el documento US-A-5456257. A diferencia de las microburbujas encapsuladas en polímero típicamente empleadas como agentes de contraste de acuerdo con el documento US-A-545366, los presentes agentes de contraste pueden diseñarse fácilmente para que sean extremadamente sensibles a la energía ulrasónica incidente, por ejemplo, empleando el material anfífilo estabilizador en forma de monocapas. Con ello, la destrucción de microburbujas se puede inducir con niveles sorprendentemente bajos de energía ultrasónica aplicada, lo que permite la obtención de ecografía pseudo-Doppler del hígado o partes de él a niveles de energía ultrasónica incidente muy bajos.

Las técnicas de detección que, por tanto, se pueden emplear incluyen técnicas no Doppler basadas en correlación tales como la obtención de imágenes en color de velocidad y otras técnicas basadas en una baja correlación entre sucesivos pulsos de utrasonidos procesadas en el tiempo de dominio de frecuencia, por ejemplo, usando señales de RF opcionalmente mezcladas con otras señales, señales de RF de amplitud desmodulada o señales de RF procesadas usando otras técnicas. La detección de destrucción real o aparente de microburbujas se puede efectuar también usando técnicas no lineales, por ejemplo, que analizan señales fuera de la anchura de banda de la frecuencia fundamental del pulso ultrasónico emitido, tales como frecuencias de armónicos, subarmónicos o ultaarmónicos o frecuencias de suma o diferencia, por ejemplo, derivadas del pulso emitido y tales armónicos.

Se ha encontrado sorprendentemente que las técnicas de ecografía que normalmente se cree que implican la destrucción de microburbujas se pueden realizar repetidamente usando agentes de contraste de acuerdo con la presente invención. Parecería así que tales técnicas pueden cambiar reversiblemente las propiedades acústicas de los agentes de contraste actualmente usados y no destruir las microburbujas, permitiendo por ello realizar barridos repetidos.

También se ha encontrado sorprendentemente que, incluso después de un prolongado tiempo de residencia en el hígado, los agentes de contraste útiles de acuerdo con la presente invención pueden producir señales Doppler con un espectro significativamente más amplio que los derivados del movimiento de sangre y tejidos. Esto puede permitir la detección independiente de artefactos de movimiento perturbador usando dispositivos de más alta filtración que los normalmente empleados en la obtención de imágenes Doppler. También se pueden usar dispositivos de mayor ganancia, lo que permite la producción de imágenes con una detección homogénea del contraste en el barrido total.

Los agentes de contraste útiles de acuerdo con la invención pueden prepararse por cualquier procedimiento apropiado, ventajosamente por un procedimiento que comprende las etapas de:

(i)

generar una dispersión de microburbujas de gas en un medio acuoso que contiene un material anfífilo opsonizable, tal como un lípido formador de membrana,

(ii)

liofilizar la dispersión de gas estabilizada con anfífilo así obtenida, y

(iii)

reconstituir el mencionado producto secado en un vehículo líquido inyectable.

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La etapa (i) se puede efectuar, por ejemplo, sometiendo el medio acuoso que contiene anfífilo a cualquier técnica apropiada de genera emulsiones, por ejemplo, sonicación, sacudidas, homogeneización a alta presión, agitación a alta velocidad o mezcladura a alta cizalladura, por ejemplo, usando un homogeneizador de rotor-estator, en presencia del gas seleccionado. Si se desea, el medio acuoso puede contener aditivos que sirven como intensificadores de la viscosidad, y/o coadyuvantes de solubilidad para los anfífilos, tales como alcoholes o polioles, por ejemplo, glicerol y/o propilenglicol.

El gas empleado en la etapa de formación de la emulsión no es necesario que sea el del producto final. Así, la mayor parte del contenido de gas puede ser eliminada durante la posterior etapa de liofilización y el gas residual puede eliminarse por evacuación del producto secado, al que se puede aplicar luego una atmósfera o una sobrepresión del gas deseado en el producto final. El gas para formar la emulsión se puede seleccionar, por tanto, simplemente para optimizar los parámetros del proceso para emulsionar sin tener en cuenta consideraciones del producto final. Puede ser particularmente ventajoso en términos de rendimiento de los productos finales con una distribución consistente y estrecha de los tamaños de las microburbujas, formar la emulsión en presencia de un fluoruro de azufre tal como hexafluoruro de azufre o un gas hidrocarburo de bajo peso molecular fluorado tal como un perfluoroalcano o perfluorocicloalcano, preferiblemente que contiene 4 o 5 átomos de carbono.

La formación de la emulsión se efectúa convenientemente a aproximadamente la temperatura ambiente, por ejemplo, a aproximadamente 25 \pm 10ºC. Puede ser necesario calentar inicialmente el medio acuoso para facilitar la hidratación y por tanto la dispersión y dejar luego que se equilibre a temperatura ambiente antes de emulsionar.

Las dispersiones producidas de acuerdo con la etapa (i) pueden someterse ventajosamente a una o varias etapas de lavado antes de la etapa (ii) de liofilización con el fin de separar y eliminar aditivos tales como agentes que intensifican la viscosidad y coadyuvantes de la solubilidad, así como materiales no deseados tales como partículas coloidales que no contienen gas y microburbujas de tamaño demasiado pequeño o demasiado grande. Tal lavado puede efectuarse de manera conocida, separándo las microburbujas usando técnicas tales como flotación o centrifugación. De esta manera se pueden preparar dispersiones de microburbujas fraccionadas por tamaño en las que como mínimo 90% de las microburbujas tienen tamaños dentro de un intervalo de 2 \mum, por ejemplo, que tienen un diámetro medio del volumen en el intervalo de 2-5 \mum.

Puede ser ventajoso realizar la etapa (ii) en presencia de uno o varios agentes crioprotectores y/o lipoprotectores, y/o agentes para impartir masa, agentes que ventajosamente se añaden después de las etapas de lavado, antes de la liofilización. En Acta Pharm. Technol. 34(3), págs. 129-139 (1988) se da una lista sustancial de agentes con acción citoprotectora y/o lioprotectora. Entre los ejemplos de tales agentes están incluidos alcoholes (por ejemplo, alcoholes alifáticos tales como t-butanol), polioles tales como glicerol, aminoácidos tales como glicina, hidratos de carbono (por ejemplo, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa, lactosa y ciclodextrinas, o polisacáridos tales como dextrano) y poliglicoles tales como polietilenglicol, prefiriéndose el uso de azúcares bien tolerados fisiológicamente tales como sacarosa (por ejemplo, en una cantidad tal que haga el producto isotónico o algo hipertónico).

La liofilización de dispersiones de gas se puede efectuar, por ejemplo, congelándolas inicialmente y liofilizando luego la dispersión de gas congelada, por ejemplo de manera generalmente conocida per se. Tales dispersiones de gas congeladas se pueden almacenar congeladas y descongelarlas cuando se desee, por ejemplo simplemente calentándolas y/o añadiendo un vehículo líquido, para regenerar las dispersiones de microburbujas útiles como agentes de contraste de acuerdo con la invención.

Puesto que, normalmente, el producto secado se reconstituirá de acuerdo con la anterior etapa (ii) antes de administrarlo, con la dispersión de gas se pueden llenar ventajosamente viables que se pueden sellar antes de la liofilización, obteniéndose viales cada uno con un contenido de cuantía apropiada, por ejemplo, un vial de unidosis de producto liofilizado seco para reconstitución en una forma inyectable. Al liofilizar la dispersión de gas en viales individuales y no a granel, se evitan la manipulación de la delicada estructura del tipo de panal de cera del producto liofilizado y el riesgo de una degradación al menos parcial de esta estructura. Después de la liofilización y una opcional etapa adicional de evacuación del gas, y de introducir en el espacio de cabecera el gas que se desea que esté presente en el agente de contraste finalmente formulado, los viales se pueden sellar con una selladura apropiada.

En general, la dispersión de gas congelada o el producto secado de la etapa (ii), por ejemplo, después de suplementar o cambiar el contenido de gas por ser necesario o desearlo, se puede reconstituir añadiendo un vehículo líquido inyectable apropiado, tal como agua estéril libre de pirógenos o solución salina para inyección, Cuando el producto seco está contenido en un vial, éste se sella convenientemente con un elemento separador a través del cual se puede inyectar el líquido vehículo usando una jeringa. Puede ser ventajoso mezclar o sacudir suavemente el producto después de la reconstitución, pudiendo requerirse unas sacudidas a mano más que suaves para que resulten productos que se pueden reproducir con un tamaño de las microburbujas consistente.

Otro procedimiento para preparar agentes de contraste útiles de acuerdo con la presente invención comprende poner en contacto con gas material anfífilo opsonizable, mezclar con un líquido vehículo acuoso el material anfífilo pulverizado para formar una suspensión de las microburbujas separadas pulverizadas, dejar que las microburbujas formen una capa, separar esta capa y lavar las microburbujas separadas (por ejemplo, como se describe en el documento US-A-5445813). Otros procedimiento más que se pueden usar implican sacudir una solución acuosa que comprende material anfífilo opsonizable en presencia de gas (por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9428780).

Los Ejemplos siguientes sirven para ilustrar la invención.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que se acompañan,

La Fig. 1A es una micrografía electrónica de una muestra del hígado de una rata de control tratada con solución salina, obtenida como se describe en el Ejemplo 7.

La Fig. 1B es una ampliación de la parte marcada de la Fig. 1A.

La Fig. 1C es una micrografía electronica de una muestra del hígado de una rata tratada con agente de contraste, obtenida como se describe en el Ejemplo 7, y

La Fig. 1D es una ampliación de la parte marcada de la Fig. 1C.

(a). Preparación de agentes de contraste

Ejemplo 1

(a). Preparación de dispersiones de microburbujas de perfluorobutano por sacudidas

Se añaden 25,3 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 12,5 ml de agua que contiene 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). El material de fosfolípido se hidrata por calentamiento a 70ºC durante aproximadamente 30 minutos, enfriando seguidamente a temperatura ambiente. Una porción de 11 ml de la dispersión se divide en porciones de 1 ml entre once viales de 2 mm y el espacio de cabecera de los viales se llena con gas perfluoro-n-butano. Los viales se taponan de forma segura y se sacuden durante 45 segundos usando una mezcladora ESPE CapMix® (mezcladora para materiales dentales). Las dispersiones de microburbujas resultantes se combinan en cuatro viales grandes y se centrifugan a 2000 rpm durante 5 minutos, resultando un material infranadante turbio por debajo de una capa flotante de microburbujas. Se elimina con una jeringa el material infranadante y se reemplaza con un volumen igual de agua a pH neutro. Se repite la etapa de lavado pero ahora el material infranadante es reemplazado por sacarosa al 10% (p/p). Porciones de 2 ml de la dispersión resultante se dividen entre viales de fondo plano de 10 ml diseñados especialmente para liofilización, y los viales se enfrían a -47ºC y se liofilizan durante aproximadamente 48 horas, resultando una sustancia sólida blanca esponjosa. Los viales se pasan a una cámara de vacío y se elimina el aire con una bomba de vacío, que es reemplazado por gas perfluoro-n-butano. Antes del uso se añade agua y los viales se sacuden manualmente con suavidad durante varios segundos, obteniéndose dispersiones de microburbujas adecuadas como agentes de contraste.

b). Preparación de dispersiones de microburbujas de perfluorobutano por mezcladura con rotor-estator

Se añaden 500,4 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 100 ml de agua que contiene 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). La mezcla se sacude y se calienta a 80ºC durante 5 minutos, se deja enfriar a temperatura ambiente, se sacude nuevamente y se deja en reposo durante la noche antes de usarla.

50 ml de la solución resultante se pasan a un matraz de fondo redondo con un cuello cónico. El matraz está equipado con una camisa de vidrio que tiene una entrada de control de la temperatura y una salida conectada a un baño de agua mantenido a 25ºC. Se introduce un eje mezclador de rotor-estator en la solución y, para evitar el escape de gas, se sella el espacio entre la pared del cuello y el eje mezclador con un tapón especial que tiene una conexión de entrada/salida para ajuste del contenido de gas y el control de la presión. La salida de gas se conecta a una bomba de vacío y se desgasea la solución durante un minuto. A través de la entrada de gas se aplica luego una atmósfera de perfluoro-n-butano gas.

La solución se homogeneiza luego a 23000 rpm durante 10 minutos manteniendo el eje del mezclador de rotor-estator de manera que las aberturas queden ligeramente por encima de la superficie del líquido. Se obtiene una dispersión cremosa de color blanco que se pasa a un recipiente que se puede sellar y se purga con perfluoro-n-butano. La dispersión se pasa luego a un embudo separador y se centrífuga a 12000 rpm durante 30 minutos, resultando una capa cremosa de microburbujas en la parte superior y un material infranadante turbio. Se elimina el material infranadante y se reemplaza con agua. Se repite dos veces la centrifugación, pero ahora a 12000 rpm durante 15 minutos. Después de la última centrifugación se reemplaza el material sobrenadante por sacarosa al 10% (p/p). Se dividen porciones de 2 ml de la dispersión resultante entre viales de 10 ml de fondo plano diseñados especialmente para liofilización y los viales se enfrían a -47ºC y se liofilizan durante aproximadamente 48 horas, resultando una sustancia sólida blanca esponjosa. Los viales se pasan ahora a una cámara de vacío y el aire se elimina con bomba de vacío y se reemplaza con gas perfluoro-n-butano. Antes del uso se añade agua y los viales se sacuden manualmente con suavidad durante varios segundos, obteniéndose dispersiones de microburbujas adecuadas como agentes de contraste.

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(c). Preparación de dispersiones de microburbujas de perfluorobutano por sonicación

Se añaden 500,4 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 100 ml de agua que contiene 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). La mezcla se sacude y se calienta a 80ºC durante 5 minutos, se deja enfriar a temperatura ambiente, se sacude nuevamente y se deja en reposo durante la noche antes de usarla.

Esta solución se bombea a través de una celda de paso del sonicador, de 4 ml, y se expone a ultrasonidos a 20 kHz con una amplitud de 90 \mum. El diámetro de la bocina del sonicador es de 1,3 cm, el diámetro interior de la celda es de 2,1 cm y la distancia entre la bocina y el fondo de la celda es de 1 cm. La solución lipídica se mezcla con perfluoro-n-butano en una proporción 1:2 v/v antes de entrar en la celda del sonicador (20 ml/min de solución lipídica y 40 ml/ min de gas perfluoro-n-butano). La temperatura se mantiene a 33ºC. Se obtiene una dispersión blanca y cremosa con la que se llena un recipiente y se purga con perfluoro-n-butano.

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Caracterización

Se miden la distribución de tamaños y la concentración en volumen de las microburbujas usando un aparato Coulter Counter Mark II equipado con una abertura de 50 \mum y un intervalo de medida de 1-30 \mum. Se diluyen muestras de 20 \mul en 200 ml de solución salina saturada con aire a temperatura ambiente y se deja que se equilibren durante 3 minutos antes de las mediciones.

La caracterización de ultrasonidos se realiza en un montaje experimental ligeramente modificado de Jong, N. y Hoff., L. como se describe en Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres, Ultrasonics 31(3), págs. 175-181 (1993). Esta instrumentación mide la eficacia de la atenuación de ultrasonidos en el intervalo de frecuencias de 2 a 8 MHz de una solución diluida del agente de contraste. Durante la medición de la atenuación, se realizó un ensayo de estabilidad de la presión exponiendo la muestra a una sobrepresión 16 kPa durante 90 segundos. Típicamente se diluyen 2-3 \mul de nuestra en 55 ml de Isoton II y la suspensión de la muestra diluida se agita durante 3 minutos antes de analizar. Como parámetro de respuesta principal se usa la atenuación a 3,5 MHz, junto con el valor de la recuperación de la atenuación a 3,5 MHz después de liberar la sobrepresión.

TABLA 1.1 Características in vitro de dispersiones de burbujas producidas de acuerdo con el Ejemplo 1(a)-(c). Número y concentraciones en volumen ponderadas y diámetros medios de volumen. Propiedades acústicas medidas de acuerdo con la descripción anterior

1

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Ejemplo 2 Preparación de varias dispersiones de microburbujas por mezcla con rotor-estator, liofilización e intercambio de gas

El contenido de gas de las 5 muestras preparadas de acuerdo con el Ejemplo 1(b) anterior se reemplazó con aire, perfluorobutano, hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de trifluorometilazufre y tetrametilsilano, respectivamente, de acuerdo con el procedimiento siguiente.

Se ponen en un desecador que tiene una entrada de gas y una salida de gas dos muestras que contienen producto liofilizado del Ejemplo 1(b). El desecador se conecta a un control de vacío/destilador Büchi 168 que permite la puesta en vacío evacuación controlado de las muestras y la entrada de un gas seleccionado. Las muestras se ponen en vacío a aproximadamente 1 kPa durante 5 min, después de lo cual se aumenta la presión a la atmosférica dando entrada al gas seleccionado, taponándose seguidamente de forma apropiada los viales. Se repite el proceso usando otros pares de muestras para cada uno de los gases seleccionados.

A cada uno de los viales se añaden 2 ml de agua destilada y los viales se sacuden suavemente a mano antes de usarlos. Las dispersiones de burbujas resultantes se caracterizan respecto a las mediciones de la distribución como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Tabla 2.1.

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TABLA 2.1 Características in vitro de dispersiones de microburbujas estabilizadas con fosfatidilserina producidas de acuerdo con el Ejemplo 2. Número y concentraciones en volumen ponderadas y diámetro medios de volumen

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Como se deducirá de los resultados anteriores, no hay cambio significativo en la distribución de tamaños después de intercambiar el gas, lo que demuestra que el tamaño de las microburbujas formadas se conserva sustancialmente durante la liofilización y la reconstrucción.

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B. Procedimiento de ecografía del hígado por ultrasonidos

Ejemplo 3

Obtención de imágenes del hígado en conejos

Si inyectaron por vía intravenosa agentes de contraste de acuerdo con el Ejemplo 1, a una dosis de 5 \mug de fosfolípido/kg, en conejos sedados con 0,65 mg/kg de una mezcla de hidrocloruro de xilazina e hidrocloruro de cetamina administrada intramuscularmente. Sobre la piel afeitada encima de la región del hígado se puso un transductor de ultrasonidos. Los estudios transabdominales realizados usando la ecografía en modo B (5-7 MHz), ecografía Doppler color, ecografía de segundos armónicos, ecografía Doppler de potencia, ecografía de armónicos y Doppler color y combinaciones de ecografía Doppler color y de potencia indicaron la presencia de tumores VX2 implantados en el hígado y se correlacionaron con resultados obtenidos por radiografía con rayos X usando como agente de contraste etiodol administrado arterialmente.

Ejemplo 4 Ecografía del hígado en marmota norteamericana

Se usaron los procedimientos del Ejemplo 3 para detectar la presencia de tumores del hígado naturales en marmotas norteamericanas. Los resultados se correlacionaron con el examen histológico de los hígados.

Ejemplo 5 Ecografía del hígado en perros

Se inyectaron por vía intravenosa 66 \mul de una dispersión al 1% de microburbujas preparada como en el Ejemplo 1(a) en un perro mestizo de 20 kg. Se obtuvieron imágenes de segundos armónicos antes y después de 10 minutos de administrar la inyección usando un escáner ATL HDI-3000 equipado para ecografía de segundos armónicos, con una frecuencia de emisión de 2,5 MHz y un transductor de barrido de sector en flecha de fase P5-3. La potencia de salida del escáner se fijó a un nivel bajo con un índice mecánico (MI) de 0,3. El transductor se puso en una zona subcostal próxima a la línea central. La intensificación inducida por contraste de hígado en las imágenes obtenidas después de inyectar era estable y parecía que no se reducía con el tiempo a pesar de un barrido continuo con ultrasonidos. Cuando se comparó con la línea de base de imágenes adquiridas antes de inyectar, se pudo ver una clara intensificación del contraste del hígado entero a una profundidad de más de 10 cm.

Ejemplo 6 Ecografía de un tumor en un hígado humano

Se inyectaron intravenosamente en una mujer paciente 10 \mul de una dispersión de microburbujas preparada como en el Ejemplo 1(a). La ecografía del hígado en modo B fundamental realizada con un escáner ATL HD1-3000 demostró claramente una intensificación vascular de vasos en torno a lesiones metastásicas. 15 minutos después de inyectar, las lesiones que eran isoecoicas con el tejido circundante en el barrido de la línea de base y, por tanto, eran difíciles de ver, presentaban una visibilidad intensificada a medida que el tejido hepático normal circundante se hizo más ecogénico. El efecto era incluso más pronunciado 30 minutos después de inyectar, lo que demuestra los efectos de contraste duraderos y mejorados después de un tiempo de residencia prolongado del agente de contraste en el hígado.

Ejemplo 7 Distribución celular del agente de contraste después de la incorporación in vivo en el hígado de rata

A cada una de tres ratas no anestesiadas se inyectó por vía intravenosa en la vena de la cola una dispersión al 1% de microburbujas preparada como en el Ejemplo 1(a) (50 \mul de microburbujas por kg de peso corporal, que corresponde a varias centenas de veces una dosis típica para ecografía en seres humanos). A ratas de control se inyectó similarmente solución salina. Seguidamente a la inyección se anestesiaron las ratas. Diez minutos después de la inyección, se cortó la pared del estómago y el pecho y se perfundió el hígado con tampón (HEPES 100 mM, pH 7,4) hasta que quedó pálido y luego con el mismo tampón que contenía glutaraldehído (2% v/v) hasta que quedó duro. Luego se abrió el hígado y se cortó en rebanadas finas. Las muestras de tejido se embutieron en una resina epoxídica y se cortaron secciones semidelgadas (aprox. 1 \mum) para examen por microscopía óptica. Se seleccionaron zonas apropiadas sobre la base de la microscopía óptica y se cortaron de ellas secciones ultradelgadas, que se tiñeron con tetróxido de osmio para microscopía electrónica.

Las micrografías electrónicas de control de muestras de ratas tratadas con solución salina (véase la Fig. 1A y la ampliación de ella de la Fig. 1B) revelaron que no había vacuolización en células de Kuppfer, células endoteliales o células parenquimales. Las micrografías electrónicas de muestras de ratas tratadas con agente de contraste (véase Fig. 1C y la ampliación de ella de la Fig. 1D) revelaron que algunas células de Kuppfer tenían internalizadas micropartículas o microburbujas ("p"). Ninguna de estas partículas o microburbujas eran evidentes en células parenquimales o endoteliales. Además, en los bordes de algunas micropartículas o microburbujas se pudo observar material teñido densamente, que se cree que era material fosfolipídico ("PL").

Claims (9)

1. Uso de microburbujas de gas biocompatible estabilizado por material fosfolipídico opsonizable que incluye como mínimo 50% de fosfolípidos cargados negativamente en la fabricación de un agente de contraste para uso en la ecografía de ultrasonidos del hígado de un sujeto humano o animal no humano, en el que el mencionado agente de contraste es capaz de generar ecogenia en el hígado durante un período de 2-8 horas después de la administración al mencionado sujeto.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el mencionado fosfolípido cargado negativamente comprende como mínimo una fosfatidilserina.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mencionado gas biocompatible comprende hexafluoruro de azufre, decafluoruro de diazufre, una cetona fluorada, un éter fluorado o un perfluocarburo.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que el mencionado perfluorocarburo comprende un perfluorobutano.

5. Uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el mencionado material fosfolipídico opsonizable está fluorado y el mencionado gas biocompatible se selecciona entre aire, nitrógeno, dióxido de carbono, oxígeno, hidrógeno, óxido nitroso, un gas inerte, un hidrocarburo de bajo peso molecular opcionalmente halogenado, un haluro de azufre y mezclas de cualquiera de los anteriores.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mencionado agente de contraste se formula para coadministración con una sustancia capaz de estimular el flujo sanguíneo en el hígado y/o una sustancia capaz de aumentar la incorporación hepática por estimulación de la fagocitosis.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mencionado agente de contraste se fabrica para uso en la ecografía basada en efectos no lineales.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que los mencionados efectos no lineales se seleccionan entre armónicos superiores, subarmónicos y ultraarmónicos.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mencionado agente de contraste es también capaz de experimentar la incorporación en el hígado de manera que es capaz de generar ecogenia en el hígado en 5-10 minutos después de la administración al mencionado sujeto.