ES2316186T3 - Anticuepos erbb2 de internalizacion. - Google Patents

Anticuepos erbb2 de internalizacion. Download PDF

Info

Publication number
ES2316186T3
ES2316186T3 ES99919786T ES99919786T ES2316186T3 ES 2316186 T3 ES2316186 T3 ES 2316186T3 ES 99919786 T ES99919786 T ES 99919786T ES 99919786 T ES99919786 T ES 99919786T ES 2316186 T3 ES2316186 T3 ES 2316186T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
antibodies
cell
seq
molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES99919786T
Other languages
English (en)
Inventor
James D. Marks
Marie Alix Poul
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California Berkeley, University of California San Diego UCSD filed Critical University of California Berkeley
Application granted granted Critical
Publication of ES2316186T3 publication Critical patent/ES2316186T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/812—Liposome comprising an antibody, antibody fragment, antigen, or other specific or nonspecific immunoeffector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo del receptor c-erbB2 al que se une C1 (SEC ID Nº 2), donde el anticuerpo se internaliza en una célula después de la unión al receptor.

Description

Anticuerpos erbB2 de internalización.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a los campos de inmunodiagnóstico e inmunoterapéutica. Más particularmente, esta invención se refiere al descubrimiento de nuevos anticuerpos humanos que se unen específicamente a c-erbB-2 y a moléculas quiméricas que contienen estos anticuerpos.
Antecedentes de la invención
Generalmente se desea identificar anticuerpos que se unen específicamente a clases particulares de células (por ejemplo, células tumorales). Dichos anticuerpos, denominados en ocasiones "anticuerpos guía", pueden usarse para dirigir (suministrar) específicamente diversas moléculas efectoras (por ejemplo, liposomas, citotoxinas, marcas, etc.) a la célula diana.
Los anticuerpos guía han sido de particular interés en el estudio y tratamiento del cáncer. Un objetivo principal de la investigación sobre el cáncer ha sido identificar antígenos tumorales que sean cualitativa o cuantitativamente diferentes de las células normales (Goldenberg (1994) Ca: A Cancer J. for Clinicians. 44: 43-64). La presencia y/o cantidad de dichos antígenos podría detectarse mediante anticuerpos y dicha detección constituye la base de ensayos de diagnóstico y de pronóstico. Además, los anticuerpos podrían usarse para destruir de forma selectiva células tumorales directamente mediante su función efectora (Brown et al., (1989) Blood. 73: 651-661) o uniendo moléculas citotóxicas al anticuerpo (Vitetta et al., (1987) Science 238: 1098-1104; Brinkmann et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 90: 547-551).
A pesar de la demostración de antígenos que se sobreexpresan en células tumorales, los anticuerpos se han usado con éxito limitado para la diagnosis y tratamiento de tumores sólidos (véase la revisión en los documentos Riethmuller et al., (1992) Curr. Opin. Immunol. 4: 647-655 y Riethmuller (1993) Curr. Opinion Immunol. 5: 732-739). Su utilidad se veía obstaculizada por la escasez de anticuerpos específicos de tumores, inmunogenicidad de anticuerpos, baja afinidad de unión y mala penetración en tumores.
La toxicidad no específica es el resultado de la incapacidad del anticuerpo para unirse específicamente y con alta afinidad a células tumorales. Como resultado, se produce la destrucción no específica de células. Además, la molécula de inmunotoxina extraña desencadena una fuerte respuesta inmune en seres humanos. La inmunogenicidad de la porción de toxina de la inmunotoxina se ha superado recientemente usando el análogo humano de ARNasa (Rybak et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci., EEUU, 89: 3165). La porción de anticuerpo de ratón, sin embargo, sigue siendo significativamente inmunogénica (Sawler et al., (1995) J. immunol., 135: 1530).
Podría evitarse la inmunogenicidad y reducirse la toxicidad si estuvieran disponibles anticuerpos humanos específicos de tumores. Sin embargo, la producción de anticuerpos monoclonales humanos usando tecnología de hibridoma convencional ha demostrado ser extremadamente difícil (James et al., (1987) J. Immunol. Meth., 100: 5). Además, la escasez de antígenos específicos de tumores purificados hace necesario inmunizar con células tumorales intactas o antígeno parcialmente purificado. La mayor parte de los anticuerpos producidos reaccionan con antígenos que también son comunes a las células normales y, por lo tanto, son inadecuados para su uso como moléculas guía específicas de tumores.
Sumario de la invención
Esta invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo del receptor c-erbB2 al que se une C1 (SEC ID Nº 2), donde el anticuerpo se internaliza en una célula después de la unión al receptor. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos obtenidos de F5 u obtenidos de C1. Los anticuerpos comprenden preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 2 que tiene sustituciones conservativas. Los anticuerpos particularmente preferidos comparten al menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 y tienen una afinidad de unión por c-erbB2 en células de al menos 10^{5} M. En una realización, los anticuerpos tendrán una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 en no más de 30 restos. El anticuerpo puede comprender al menos una, al menos dos o al menos tres de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la SEC ID Nº 1 y/o la SEC ID Nº 2. Además, o como alternativa, el anticuerpo puede comprender al menos una, al menos dos o al menos tres regiones marco de la SEC ID Nº 1 y/o la SEC ID Nº 2. Un anticuerpo particularmente preferido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
El epítopo reconocido específicamente por F5 o C1 se identifica fácilmente mediante métodos de mapeo de epítopos que utilizan los anticuerpos de F5 o C1 que se proporcionan en este documento.
En otra realización más, esta invención proporciona un medicamento para administrar específicamente una molécula efectora a una célula portadora de un receptor c-erbB2. Esto implica proporcionar una molécula quimérica que comprende la molécula efectora unida a cualquiera de los anticuerpos obtenidos de C1 u obtenidos de F5 descritos en este documento y poner en contacto la célula portadora de un receptor c-erbB2 con la molécula quimérica, con lo que la molécula quimérica se une específicamente a la célula. La molécula quimérica se internaliza en la célula. Las moléculas efectoras preferidas incluyen, aunque sin limitación, citotoxinas, marcas, radionúclidos, fármacos, liposomas, ligandos y anticuerpos. En una realización particularmente preferida, la molécula efectora es una proteína o contiene una proteína y la molécula quimérica es una proteína de fusión. Las células diana particularmente preferidas son células cancerosas (por ejemplo, metastásicas o de tumores sólidos, por ejemplo cáncer de mama).
Esta invención también proporciona las moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento unidas a cualquiera de las moléculas efectoras descritas en este documento. Las moléculas quiméricas se unen a una célula portadora de un receptor c-erbB-2. Las moléculas quiméricas particularmente preferidas son proteínas de fusión.
Esta invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican los diversos anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo del receptor c-erbB2 al que se une C1 (SEC ID Nº 2), donde el anticuerpo se internaliza en una célula después de la unión al receptor, descrito en este documento. De este modo, en una realización, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo del receptor c-erbB2 al que se une C1 (SEC ID Nº 2). Los ácidos nucleicos preferidos codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 2 y la SEC ID Nº 2 que tiene sustituciones conservativas. Los ácidos nucleicos particularmente preferidos hibridan con un ácido nucleico que codifica los anticuerpos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 en condiciones rigurosas. Otros ácidos nucleicos preferidos codifican un anticuerpo que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 y donde dicho anticuerpo tiene una afinidad de unión por el receptor c-erbB2 en células, de al menos 10 \muM. Los ácidos nucleicos particularmente preferidos codifican una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 en no más de 30 restos. Otro ácido nucleico preferido codifica una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2. Otro ácido nucleico preferido comprende una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
Cuando las proteínas quiméricas son proteínas de fusión, esta invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas quiméricas.
En otra realización, esta descripción proporciona células (por ejemplo eucariotas o procariotas) que expresan cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento.
Esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas comprenden preferiblemente un excipiente farmacológico y uno o más de los anticuerpos obtenidos de F5 u obtenidos de C1 descritos en este documento.
También se proporcionan kits como se describen en este documento para el diagnóstico y tratamiento de afecciones patológicas (por ejemplo, cánceres) o para la práctica de cualquiera de los métodos de cribado o transfección descritos en este documento.
Definiciones
Como se usa en este documento, un "anticuerpo" se refiere a una proteína constituida por uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como gran número de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon que, a su vez, define las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Se sabe que una unidad estructural (anticuerpo) de inmunoglobulina típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Las expresiones cadena ligera variable (V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. De este modo, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo bajo los puentes disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'_{2}, un dímero de Fab que, a su vez, es una cadena ligera unida a V_{H}-C_{H}1 mediante un puente disulfuro. EL F(ab)'_{2} puede reducirse en condiciones moderadas para romper el puente disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de este modo el dímero F(ab)'_{2} en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase el documento Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo). Aunque diversos fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un especialista en la técnica entenderá que dichos fragmentos Fab' pueden sintetizarse de novo químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. De este modo, el término anticuerpo, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de anticuerpo producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena sencilla (anticuerpos que existen como una única cadena polipeptídica), más preferiblemente anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv o scfv) en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable están unidas conjuntamente (directamente a través de un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. El anticuerpo Fv de cadena sencilla es un heterodímero V_{H}-V_{L} unido covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias que codifican V_{H} y V_{L} unidas directamente o unidas mediante un enlazador que codifica un péptido. Huston et al., (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. EEUU, 85: 5879-6883. Aunque V_{H} y V_{L} están conectadas entre sí como una sola cadena polipeptídica, los dominios V_{H} y V_{L} se asocian de forma no covalente. Las primeras moléculas de anticuerpo funcionales que se expresaron en la superficie del fago filamentoso fueron Fv de cadena sencilla (scFv), sin embargo, estrategias alternativas de expresión también han tenido éxito. Por ejemplo, pueden presentarse moléculas Fab en un fago si una de las cadenas (pesada o ligera) se fusiona con la proteína de la cápsida g3 y la cadena complementaria se exporta al periplasma como una molécula soluble. Las dos cadenas pueden estar codificadas en el mismo o en diferentes replicones; lo importante es que las dos cadenas de anticuerpo en cada molécula Fab se ensamblen de forma posterior a la traducción y el dímero se incorpore en la partícula del fago mediante enlace de una de las cadenas a g3p (véase por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5733743). Los anticuerpos scFv y varias otras estructuras que convierten las cadenas polipeptídicas ligera y pesada agregadas de forma natural, pero separadas químicamente de la región V de un anticuerpo en una molécula que se pliega en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión al antígeno son conocidos por los especialistas en la técnica (véase por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.091.513, 5.132.405 y 4.956.778). Los anticuerpos particularmente preferidos incluyen todos los que se han presentado en fagos, se cree que los anticuerpos preferidos debe incluir todos los que se han presentado en fagos (por ejemplo, scFv, Fv, Fab y Fv unido por puentes disulfuro (Reiter et al., (1995) Protein Eng. 8: 1323-1331).
Un "sitio de unión al antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de una molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por restos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminal de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones hipervariables" que están interpuestas entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran de forma natural entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen unas con respecto a otras en un espacio tridimensional para formar una "superficie" de unión al antígeno. Esta superficie media en el reconocimiento y unión del antígeno diana. Las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" y están caracterizadas, por ejemplo por Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 4ª ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987).
Un "anticuerpo de internalización" es un anticuerpo que, después de unirse a un receptor u otro ligando en una superficie celular es transportado al interior de la célula (por ejemplo, en una vacuola u otro orgánulo o en el citoplasma de la célula).
Como se usan en este documento, las expresiones "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que es específica la inmunoglobulina. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (K_{d}) de la interacción, en la que una K_{d} más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos implica medir las velocidades de formación y disociación de complejo sitio de unión al antígeno/antígeno, donde dichas velocidades dependen de las concentraciones de los socios del complejo, la afinidad de la interacción y de parámetros geométricos que influyen en la velocidad por igual en ambas direcciones. De este modo, tanto la "constante de velocidad de asociación" (K_{on}) como la "constante de velocidad de disociación" (K_{off}) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. La proporción de K_{off}/K_{on} permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad y de este modo es igual a la constante de disociación K_{d} (véase en general el documento, Davies et al., (1990) Ann. Rev. Biochem., 59: 439-473.
La frase "se une específicamente a una proteína" o "inmunorreactivo específicamente con" cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de una proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por lo tanto, en condiciones de inmunoensayos designadas, los anticuerpos específicos se unen a una proteína particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a una proteína en dichas condiciones pude requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos de F5 o C1 para la proteína c-erbH-2 que se unen a c-erbB-2 y no a otras proteínas presentes en una muestra de tejido. Pueden usarse diversos formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se usan inmunoensayos ELISA en fase sólida de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase el documento Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.
Los términos "polipéptido", "péptido" o "proteína" se usan de forma intercambiable en este documento para designar una serie lineal de restos de aminoácidos conectados unos a otros mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxilo de restos adyacentes. Los restos de aminoácidos están preferiblemente en la forma isomérica natural "L". Sin embargo, pueden sustituirse restos en la forma isomérica "D" por cualquier resto de L-aminoácido, siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. Además, los aminoácidos, además de los 20 aminoácidos "convencionales", incluyen aminoácidos modificados e inusuales, que incluyen, aunque sin limitación los que se presentan en 37 CFR \NAK 1.822(b)(4). Además, debe observarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos o un enlace covalente a un grupo del extremo carboxilo o hidroxilo.
La expresión "polipéptido de unión" se refiere a un polipéptido que se une específicamente a una molécula diana (por ejemplo, un receptor celular) de forma análoga a la unión de un anticuerpo a un antígeno. Los polipéptidos de unión se distinguen de los anticuerpos en que los polipéptidos de unión no se obtienen en última instancia de genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina.
Las expresiones "anticuerpo de F5" o "anticuerpo de C1" típicamente se refieren a anticuerpos que se unen
al(los) epítopo(s) a los que se unen F5 ó C1 respectivamente. Los anticuerpos de F5 o C1 preferidos son anticuerpos de internalización. F5 y C1, cuando se usan para referirse al anticuerpo prototípico, se refieren a anticuerpos que tienen la secuencia de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, respectivamente. El anticuerpo de F5 también se denomina 3TF5 en los ejemplos.
La expresión "sustitución conservativa" se usa en referencia a proteínas o péptidos para reflejar sustituciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad (especificidad o afinidad de unión) de la molécula. Típicamente, las sustituciones conservativas de aminoácidos implican la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1)
Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2)
Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3)
Asparagina (N), Glutamina (Q);
4)
Arginina (R), Lisina (K);
5)
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
6)
Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de cadena doble. A menos que se limite específicamente, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a nucleótidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes de la misma modificadas de forma conservativa (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias así como la secuencia indicada explícitamente.
Específicamente, pueden conseguirse sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos los) codones seleccionados se sustituye por restos de base mezclada y/o desoxiinosina (Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; y Cassol et al., (1992); Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98). La expresión ácido nucleico se usa de forma intercambiable con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.
Las expresiones "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan cuando se presenta en su estado nativo. Sin embargo, el término "aislado" no pretende referirse a los componentes presentes en un gel electroforético u otro medio de separación. Un componente aislado está libre de dichos medios de separación y en una forma lista para su uso en otra aplicación o ya en uso en la nueva aplicación/medio.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" o porcentaje de "homología" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, según lo medido usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.
La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos el 60%, preferiblemente el 80%, lo más preferiblemente el 90-95% o incluso al menos el 95% de identidad de restos de aminoácidos en un intervalo de al menos 30 nucleótidos, preferiblemente en un intervalo de al menos 40 nucleótidos, más preferiblemente en un intervalo de al menos 80 nucleótidos y lo más preferiblemente en un intervalo de al menos 100 nucleótidos, 150 nucleótidos, 200 nucleótidos o más, cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia máxima, según lo medido usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de referencia de prueba se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Después el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia, partiendo de los parámetros de programa designados.
El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse por ejemplo mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (véase en general, el documento Ausbel et al., supra).
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos por parejas para mostrar las relaciones y el porcentaje de identidad de secuencia. También traza un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgings & Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Después, este grupo se alinea con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionado. Dos grupos de secuencias se alinean mediante una simple prolongación del alineamiento por parejas de dos secuencias individuales. El alineamiento final se alcanza mediante una serie de alineamientos progresivos por parejas. El programa funciona designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, puede compararse una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación de porcentaje de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de la longitud del hueco por defecto (0,10) y huecos del extremo pesados.
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en el documento Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coinciden o satisfacen en parte una puntuación umbral con valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra en las proximidades (Alschul et al., supra). Esta palabra inicial en las proximidades actúa como semilla para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que la contienen. Las palabras encontradas se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativo. La prolongación de las palabras encontradas en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo cae una cantidad X por debajo de su valor máximo obtenido, la puntuación acumulativa es de cero o inferior, debido a la acumulación de uno o más alineamientos residuales de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa una longitud de palabra (W) por defecto de 11, los alineamientos (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 de 50 (véase el documento Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89: 10915), expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (véase por ejemplo el documento Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad mínima de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la cual se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad mínima de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad cruzada de forma inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. De este modo, un polipéptido típicamente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación.
Las frases "que hibrida específicamente con" o "hibridación específica" o "hibrida de forma selectiva con", se refieren a la unión, formación de dos cadenas o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferiblemente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total).
La expresión "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones en las que una sonda hibridará preferiblemente con su subsecuencia diana y en menor medida o en absoluto con otras secuencias. "Hibridación rigurosa" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones de Southern y Northern dependen de la secuencia y son diferentes en diferentes parámetros del entorno. Una exhaustiva guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en el documento Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York. Generalmente, se seleccionan condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas que son de aproximadamente 5ºC más bajas que el punto de fusión térmica (T_{m}) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El T_{m} es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda de concordancia perfecta. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales al T_{m} para una sonda particular.
Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o de Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, con la hibridación realizándose durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con SSC 0,2x a 65ºC durante 15 minutos (véase el documento Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª ed) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.,) supra para una descripción de tampón SSC). A menudo, un lavado de alta rigurosidad viene precedido de un lavado de baja rigurosidad para eliminar señal de sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para una cadena doble de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es 1x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de rigurosidad baja para una cadena doble de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es 4-6x SSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una proporción de señal con respecto a ruido de 2x (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético.
Los términos F5 y C1 cuando se refieren a anticuerpos, se refieren a los anticuerpos de las SEC ID Nº 1 y 2, respectivamente. Los anticuerpos preferidos incluyen el anticuerpo de la SEC ID Nº 2 y sustituciones conservativas de estas secuencias siempre que se conserve la especificidad de unión de C1. Los anticuerpos obtenidos de F5 y obtenidos de C1 son anticuerpos obtenidos de secuencias (de aminoácidos o de ácido nucleico) de F5 o C1, respectivamente. Los anticuerpos obtenidos de F5 y de C1 se obtienen preferiblemente mediante uno de varios tipos de derivación que incluyen, aunque sin limitación: 1) derivación mediante intercambio de cadenas; 2) derivación mediante mutagénesis dirigida de CDR; 3) derivación mediante la introducción de múltiples mutaciones en la secuencia mediante PCR propensa al error, cepas mutadoras de E. coli o "Intercambio de ADN (Crameri et al., (1996) Nature Medicine. 2: 100-102)". Los anticuerpos obtenidos de F5 y C1 son reconocidos por su reactividad cruzada con 1) el epítopo de c-erbB-2 reconocido por C1; y/o 2) un anticuerpo anti-C1 anti-ididotípico. Los anticuerpos tienen preferiblemente una afinidad de unión de aproximadamente 2 \mum, más preferiblemente aproximadamente 20 \mum y lo más preferiblemente de menos de aproximadamente 100 nM o mejor y se obtienen preferiblemente mediante cribado (para afinidad por el epítopo al que se une C1) de una biblioteca de presentación en fagos en la que una cadena pesada variable (V_{H}) de F5 o C1 conocida se expresa en combinación con una multiplicidad de cadenas ligeras variables (V_{L}) o a la inversa una cadena ligera variable de F5 o C1 conocida se expresa en combinación con una multiplicidad de cadenas pesadas variables (V_{H}). Los anticuerpos obtenidos de F5 o C1 también incluyen aquellos anticuerpos producidos mediante la introducción de mutaciones en las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada o cadena ligera (CDR1, CDR2 o CDR3) como se describe en este documento. Finalmente, los anticuerpos de F5 y C1 incluyen aquellos anticuerpos producidos mediante cualquier combinación de estos métodos de modificación aplicados a F5 o C1 y sus derivados.
Una molécula quimérica es una molécula en la que dos o más moléculas que existen por separado en su estado nativo se unen conjuntamente para formar una única molécula que tiene la funcionalidad deseada de todas sus moléculas constituyentes. Aunque la molécula quimérica puede prepararse uniendo de forma covalente dos moléculas, cada una sintetizada por separado, un especialista en la técnica entenderá que cuando la molécula quimérica es una proteína de fusión, la quimera puede prepararse de novo como una única molécula "reunida".
Una proteína de fusión es una molécula quimérica en la que las moléculas constituyentes son todas polipéptidos y están unidas (fusionadas) entre sí a través de enlaces peptídicos terminales de modo que la molécula quimérica es un polipéptido de cadena sencilla continuo. Los diversos constituyentes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar acoplados a través de uno o más enlazadores peptídicos.
Un resto o molécula efectora es una molécula o resto que típicamente tiene una actividad característica que se desea administrar a una célula diana (por ejemplo un tumor que sobreexpresa c-erbB-2). Las moléculas efectoras incluyen citotoxinas, marcas, radionúclidos, ligandos, anticuerpos, fármacos, liposomas y proteínas de la envuelta viral que hacen al virus capaz de infectar a una célula que expresa c-erbB-2.
Una célula "diana" puede referirse a una célula o tipo de células al que se unirá específicamente un miembro de una biblioteca de presentación en fagos o una molécula quimérica de esta invención. Las células diana preferidas son células para las que se busca un anticuerpo de internalización o polipéptido de unión. La célula diana se caracteriza típicamente por la expresión o sobreexpresión de una molécula diana que es característica del tipo celular. De este modo, por ejemplo, una célula diana puede ser una célula tal como una célula tumoral, que sobreexpresa un marcador tal como c-erbB-2.
Un "resto guía" se refiere a un resto (por ejemplo, una molécula) que se une específicamente a la molécula diana. Cuando la molécula diana es una molécula en la superficie de una célula y el resto guía es un componente de una molécula quimérica, el resto guía une específicamente la molécula quimérica a la célula portadora de la diana. Cuando el resto guía es un polipéptido, éste puede denominarse "polipéptido guía".
Las expresiones "de internalización" o "internalizado" cuando se usan en referencia a una célula, se refieren al transporte de un resto (por ejemplo, fago) del exterior al interior de una célula. El resto internalizado puede situarse en un compartimento intracelular, por ejemplo una vacuola, un lisosoma, el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi o en el citosol de la propia célula.
Un receptor o marcador de internalización es una molécula presente en la superficie celular externa que, cuando se le une específicamente un anticuerpo o proteína de unión, da como resultado la internalización de ese anticuerpo o proteína de unión en la célula. Los receptores o marcadores de internalización incluyen receptores (por ejemplo, hormona, citoquina o receptores de factores de crecimiento) ligandos y otros marcadores de la superficie celular, la unión a los cuales da como resultado la internalización.
La expresión "ácido nucleico heterólogo" se refiere a un ácido nucleico que no es nativo de la célula en la que se encuentra o cuyo origen último no es la célula o línea celular en la que el "ácido nucleico heterólogo" se encuentra actualmente.
El idiotipo representa el sitio de unión al antígeno altamente variable de un anticuerpo y él mismo es inmunogénico. Durante la generación de una respuesta inmune mediada por anticuerpos, un individuo desarrollará anticuerpos para el antígeno así como anticuerpos anti-idiotipo, cuyo sitio de unión inmunogénico (idiotipo) imita al antígeno. Los anticuerpos anti-idiotípicos también pueden generarse mediante inmunización con un anticuerpo o fragmento del mismo.
Una "biblioteca de presentación en fagos" se refiere a una colección de fagos (por ejemplo, fagos filamentosos) en la que el fago expresa una proteína externa (típicamente heteróloga). La proteína externa es libre de interactuar con (unirse a) otros restos con los que los fagos se ponen en contacto. Cada fago que muestra una proteína externa es un "miembro" de la biblioteca de presentación en fagos.
La expresión "fago filamentoso" se refiere a una partícula viral capaz de presentar un polipéptido heterogéneo en su superficie. Aunque un especialista en la técnica entenderá que pueden emplearse diversas bacteriófagos en la presente invención, en realizaciones preferidas el vector es, o se obtiene de, un bacteriófago filamentoso, tal como por ejemplo, fl, fd, Pfl, M13, etc. El fago filamentoso puede contener un marcador seleccionable tal como tetraciclina (por ejemplo "fd-tet"). Diversos sistemas de presentación en fagos filamentosos son bien conocidos por los especialistas en la técnica (véase por ejemplo los documentos, Zacher et al., (1980) Gene 9: 127-140, Smith et al., (1985) Science 228: 1315-1317 (1985); y Parmley y Smith (1988) Gene 73: 305-318).
Una "señal de empaquetamiento viral" es una secuencia de ácido nucleico necesaria y suficiente para dirigir la incorporación de un ácido nucleico en una cápsida viral.
Una célula de ensamblaje es una célula en la que un ácido nucleico puede empaquetarse en una proteína de la envuelta viral (cápsida). Las células de ensamblaje pueden estar infectadas con una o más partículas virales diferentes (por ejemplo, un fago normal o debilitado y un fago ayudante) que individualmente o en combinación dirigen el empaquetamiento de un ácido nucleico en una cápsida viral.
En este documento se usan las siguientes abreviaturas: AMP, ampicilina; c-erbB-2 ECD, dominio extracelular de c-erbB-2; CDR, región determinante de la complementariedad; ELISA, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas; FACS, clasificador de células activado por fluorescencia; FR región marco; Glu, glucosa; HBS, solución salina tamponada con Hepes, hepes 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4; IMAC, cromatografía de afinidad por metales inmovilizados; K_{on}, constante de velocidad de asociación; K_{off} constante de velocidad de disociación; MPBS, leche desnatada en polvo en PBS; MTPBS, leche desnatada en polvo en TPBS; PBS solución salina tamponada con fosfato, NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, pH 7,0; PCR reacción en cadena de la polimerasa; RU unidades de resonancia; scFv o scFv, fragmento Fv de cadena sencilla; TPBS, 0,05% v/v de Tween 20 en PBS; SPR resonancia de plasmón superficial; V_{\kappa} región variable de cadena ligera de inmunoglobulina kappa; V_{\lambda} región variable de cadena ligera de inmunoglobulina lambda; V_{L}, región variable de cadena ligera de inmunoglobulina; V_{H} región variable de cadena pesada de inmunoglobulina; wt, tipo silvestre.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra el método para la construcción de una gran biblioteca de anticuerpos en fagos de scFv humano. La estrategia para la construcción de bibliotecas implicaba optimizar las etapas individuales de la construcción de bibliotecas para aumentar la eficacia del ensamblaje de genes de scFv y para aumentar la eficacia de la clonación de genes de scFv ensamblados (A). En primer lugar, se usó ARNm de linfocitos para generar repertorios génicos de V_{H} y V_{L} mediante RTPCR que se clonaron en diferentes vectores para crear bibliotecas génicas de V_{H} y V_{L} de 8,0 x 10^{8} y 7,2 x 10^{6} miembros respectivamente. Las bibliotecas génicas de V clonadas proporcionaron una fuente estable e ilimitada de genes de V_{H} y V_{L} para el ensamblaje de scFv. Se incorporó ADN que codificaba el péptido (G_{4}S)_{3} en el extremo 5' de la biblioteca de V_{L}. Esto permitía la generación de genes de scFv mediante corte y empalme por PCR de 2 fragmentos de ADN. Previamente, se ensamblaron repertorios génicos de scFv a partir de 3 fragmentos de ADN diferentes constituidos por V_{H}, V_{L} y ADN enlazador. (B) se amplificaron repertorios génicos de V_{H} y V_{L} a partir de las diferentes bibliotecas y se ensamblaron en un repertorio génico de scFv usando PCR de extensión por solapamiento. Los cebadores usados para volver a amplificar los repertorios génicos de V_{H} y V_{L} hibridaban 200 pb cadena arriba del extremo 5' de los genes de V_{H} y 200 pb cadena debajo de los genes de V_{L}. Estos largos salientes aseguraban una eficaz digestión por enzimas de restricción (C). El repertorio génico de scFv se digirió con NcoI y NotI y se clonó en el plásmido pHEN1 en forma de fusiones con el gen de la proteína de la envuelta gen M13 III () para su presentación en fagos.
La figura 2 ilustra el mapeo de epítopos de scFv de F5, C1 y C6.5. La inhibición de la unión del fago de F5 (panel izquierdo), fago de C1 (panel central) o fago de C6.5 (panel derecho) aumentando las concentraciones de scFv-F5 (\circ), scFv-C1 (\Delta) o scFv-C6.5 (\Box) solubles. Los fagos unidos se detectaban con un Ab biotiniliado anti-M13 y estreptavidina-PE. Los resultados se expresan en % del máximo de intensidad de fluorescencia media (MFI). F5 y C1 solubles inhibían la unión del fago de F5 o C1, pero no del fago de C6.5.
Descripción detallada I. Introducción
Esta invención proporciona nuevos anticuerpos humanos que se unen específicamente al dominio extracelular del producto proteico c-erbB-2 del oncogen HER2/neu. El marcador c-erbB-2 se sobreexpresa en el 30-50% de los carcinomas de mama y otros adenocarcinomas y por lo tanto proporciona un útil marcador de la superficie celular para guiar específicamente a células tumorales tales como carcinomas. En contraste con los anteriores anticuerpos anti-c-erbB-2 conocidos, los anticuerpos de la presente invención (denominados en este documento anticuerpos de F5 o C1) son anticuerpos completamente humanos. Por lo tanto, la administración de estos anticuerpos a un hospedador humano provoca una respuesta inmunogénica pequeña o ninguna respuesta en absoluto.
Además, los anticuerpos de F5 y C1 de esta invención se internalizan rápidamente dentro de la célula. De este modo, son extremadamente útiles para suministrar restos efectores en la célula diana. Además, una vez identificado un anticuerpo o polipéptido de internalización, éste puede usarse para volver a sondear una o más líneas celulares para identificar dianas celulares de internalización anteriormente desconocidas (por ejemplo, receptores).
Se sabe que otros anticuerpos de unión a c-erbB-2 no se internalizan. De este modo, sin vincularse a ninguna teoría particular, se cree que la internalización eficaz de los anticuerpos de F5 y C1 de esta invención es consecuencia del epítopo específico al que se unen estos anticuerpos. Se cree que tanto al anticuerpo de F5 como el de C1 se unen al mismo epítopo y, usando el anticuerpo de C1 identificado en este documento (SEC ID Nº 2) otros anticuerpos que se unen al mismo epítopo pueden identificarse fácilmente. De este modo, en una realización preferida, esta invención proporciona un anticuerpo de internalización que se une específicamente a un epítopo del receptor c-erbB-2 al que se une C1.
Debido al altamente específico guiado hacia células que expresen el receptor c-erbB-2 y la eficaz internalización de las moléculas unidas, los anticuerpos de F5 y C1 de esta invención son muy adecuados para suministrar moléculas efectoras a o dentro de una célula diana (por ejemplo, una célula cancerosa). De este modo, en otra realización preferida, esta invención proporciona adicionalmente moléculas quiméricas que comprenden los anticuerpos de F5 o C1 (es decir anticuerpos que se unen al epítopo al que se une F5 o C1) unidas a una molécula efectora. El anticuerpo de F5 o C1 actúa como molécula guía que sirve para unir específicamente la molécula quimérica a células portadoras del marcador c-erbB2 suministrando de este modo la molécula efectora a la célula diana.
Un efector es una molécula o estructura multimolecular (por ejemplo, un liposoma, una envuelta de un fago (cápsida) o un fago intacto) que se desea suministrar a la célula diana (por ejemplo un tumor que sobreexpresa c-erbB-2). Los efectores preferidos tienen una actividad característica (por ejemplo, suministro de fármacos, citotoxicidad, fluorescencia, radiactividad, etc.). Las moléculas efectoras incluyen, aunque sin limitación, citotoxinas, marcas, radionúclidos, ligandos, anticuerpos, fármacos, ácidos nucleicos, hormonas factores de crecimiento, liposomas y proteínas de la envuelta viral que hacen a un virus capaz de infectar a una célula que expresa c-erbB-2. Una vez suministrada a la diana, la molécula efectora ejerce su actividad característica.
Por ejemplo, en una realización, en la que la molécula efectora es una citotoxina, la molécula quimérica actúa como potente agente destructor de células guiando específicamente a la citotoxina a células tumorales portadoras del marcador c-erbB-2. Las cototoxinas quiméricas que se dirigen específicamente a células tumorales las conocen bien los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento Pastan et al., (1992) Ann. Rev. Biochem., 61: 331-354).
En otra realización, la molécula quimérica puede usarse para detectar la presencia o ausencia de células tumorales in vivo o in vitro o para localizar células tumorales in vivo. Estos métodos implican proporcionar una molécula quimérica que comprende una molécula efectora, que es una marca detectable. Los anticuerpos de F5 o C1 unen específicamente la molécula quimérica a células tumorales que expresan el marcador c-erbB-2 que después quedan marcadas mediante su asociación con la marca detectable. La posterior detección de la marca asociada a la célula indica la presencia y/o masa y/o ubicación de una célula tumoral.
En otra realización más, la molécula efectora puede ser otro resto de unión específico incluyendo, aunque sin limitación, un anticuerpo, un dominio de unión al antígeno, un factor de crecimiento o un ligando. La molécula quimérica actuará entonces como un enlazador bifuncional altamente específico. Este enlazador pude actuar para unir y potenciar la interacción entre células o componentes celulares a los que se une la proteína quimérica. De este modo, por ejemplo, cuando el componente "efector" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-receptor, el componente de anticuerpo de C6 se une específicamente a células cancerosas portadoras de c-erbB-2, mientras que el componente efector se une a receptores (por ejemplo, receptores IL-2, IL-4, FcI, FcII y FcIII) en la superficie de células inmunes. De este modo, la molécula quimérica puede actuar para potenciar y dirigir una respuesta inmune hacia células cancerosas diana.
En aún otra realización más, la molécula efectora puede ser un agente farmacológico (por ejemplo, un fármaco). De este modo, el anticuerpo de C1 o F5 puede conjugarse con un fármaco tal como vinblastina, vindesina, melfalán, N-acetilmelfalán, metotrexato, aminopterina, doxirrubicina, daunorrubicina, genisteína (un inhibidor de tirosina quinasa), una molécula antisentido y otros agentes farmacológicos conocidos por los especialistas en la técnica, guiando específicamente de este modo al agente farmacológico a células tumorales que expresan c-erbB-2.
Como alternativa, los anticuerpos de F5 o C1 pueden estar unidos a un vehículo que contiene la composición terapéutica. Dichos vehículos incluyen, aunque sin limitación, liposomas, micelas, diversas perlas sintéticas y similares.
Un especialista en la técnica entenderá que las moléculas quiméricas de la presente invención incluyen opcionalmente múltiples restos guía (anticuerpos de F5 y/o C1) unidos a un único efector o a la inversa, múltiples moléculas efectoras unidas a un único resto guía. En otra realización más, las moléculas quiméricas incluyen múltiples restos guía y múltiples moléculas efectoras. De este modo, por ejemplo, esta invención proporciona moléculas quiméricas citotóxicas "de doble objetivo" en las que el anticuerpo de F5 o C1 está unido a una molécula citotóxica mientras que otra molécula (por ejemplo, un anticuerpo u otro ligando) está unido al otro extremo de la toxina. Dicha citotoxina de doble objetivo puede comprender, por ejemplo un anticuerpo de F5 o C1 sustituido por el dominio Ia en el extremo amino de un PE y anti-TAC(Fv) insertado en el dominio III. Otros anticuerpos también pueden ser moléculas efectoras adecuadas.
Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos de F5 o C1 preferidos de esta invención son anticuerpos de internalización. A menudo dichos anticuerpos de internalización tienen una actividad biológica incluso sin la presencia de una molécula efectora. Muchos receptores (por ejemplo, receptores del factor de crecimiento) usan la internalización como una manera de modular y regular el efecto de los ligandos. Por ejemplo, la unión al ligando puede dar como resultado la transducción de señales y la internalización del receptor. La disminución del número de receptores causa entonces la regulación negativa del efecto del ligando adicional. Lo mismo ocurre con anticuerpos que se unen a receptores del factor del crecimiento (Hurwitz et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 92: 3353-3357). Por ejemplo, "los factores del crecimiento actúan uniéndose a y activando la actividad catalítica intrínseca de sus receptores de superficie, iniciando de este modo una cascada de señalización que conduce a la respuesta celular. Los complejos factor de crecimiento/receptor no son residentes estáticos de la superficie de la membrana celular sino que experimentan procesos de tráfico endocítico de internalización y clasificación para reciclado o degradación. Por consiguiente, los factores de crecimiento se agotan en el medio extracelular y sus receptores experimentan regulación negativa. Estos procesos de tráfico, debido a su influencia sobre la cinética de complejos de señalización de factor de crecimiento/receptor, son importantes moduladores de respuestas del comportamiento celular" (Reddy et al., (1996) Nature Biotech. 14: 1696-1699).
En el sistema de ErbB2, un mecanismo mediante el cual los anticuerpos de unión a ErbB2 inhiben el crecimiento es provocar la internalización y regulación negativa del receptor (Hurwitz et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 92: 3353-3357). También puede ser posible convertir un anticuerpo de internalización que se une a un receptor del factor de crecimiento en un inhibidor del crecimiento o anticuerpo estimulador. Por ejemplo, las propiedades mitogénicas de EGF se han aumentado rebajando la afinidad de EGF por el receptor de EGF. El EGF de baja afinidad provoca señalización del receptor, pero una menor internalización y regulación negativa que el EGF de tipo silvestre (presumiblemente debido a la baja afinidad) (Reddy et al., (1996) Nature Biotech. 14: 1696-1699). De este modo, el rebajar la afinidad de un anticuerpo de internalización de C1 o F5 podía convertirlo en un factor de crecimiento. Los anticuerpos de internalización de F5 y C1 de esta invención pueden proporcionar compuestos/fármacos que conducen tanto a la inhibición del crecimiento como a la estimulación del crecimiento.
II. Preparación/Síntesis de anticuerpos de F5 y C1
Usando la información de secuencia que se proporciona en este documento, los anticuerpos de F1 y C1 enumerados de forma explícita pueden crearse de forma rutinaria mediante síntesis química de novo o mediante técnicas de expresión de ADN recombinante. Análogamente, anticuerpos de F5 y C1 modificados, identificados de acuerdo con los métodos así como las moléculas quiméricas de esta invención, pueden sintetizarse de novo o expresarse de forma recombinante (particularmente cuando la molécula quimérica es una proteína de fusión).
A) Síntesis química
Loa anticuerpos de F5 y C1 de esta invención pueden sintetizarse químicamente usando métodos bien conocidos de síntesis peptídica. La síntesis en fase sólida en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los restantes aminoácidos en la secuencia es un método preferido para la síntesis química de anticuerpos de C1 y F5. Las técnica para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrified, Solid Phase Peptide Synthesis; pág. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield et al., (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 y Stewart et al., (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III.
Típicamente, los anticuerpos de F5 y C1 se sintetizan químicamente usando un sintetizador de péptidos automatizado tal como un Eppendorf Synostat (Madison, Wis) o un Milligen 9050 (Milford, Mass), aunque también pueden usarse métodos manuales de síntesis peptídica en composición. En una realización, la síntesis se realiza en una resina injertada con polietilenglicol poliestireno (PEG-PS) y usando derivados de N^{\alpha}-Fmoc-aminoácido como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.347.939. Pueden usarse otras resinas y productos químicos de síntesis (por ejemplo, T-boc).
B) Expresión recombinante
En una realización preferida, los anticuerpos de F5 o C1 de la presente invención se preparan usando técnicas convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica en combinación con las secuencias polipeptídicas y de ácido nucleico que se proporcionan en este documento. Las secuencias polipeptídicas pueden usarse para determinar las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican el anticuerpo de F5 o C1 particular descrito de este modo. La secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para reflejar "preferencias" de codón particulares para diversos sistemas de expresión de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos por los especialistas en la técnica. Como alternativa, las secuencias de ácido nucleico que se proporcionan en este documento también pueden usarse para expresar anticuerpos de F5 o C1.
Usando la información de secuencia proporcionada, pueden sintetizarse los ácidos nucleicos de acuerdo con varios métodos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica. La síntesis de oligonucleótidos, se realiza preferiblemente en máquinas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida disponibles en el mercado (Needham-VanDevanter et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168) o se sintetizan de forma manual usando el método de triéster y fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage et al., (Beaucage et al., (1981) Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862).
Una vez que se ha sintetizado un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de F5 o C1, éste puede amplificarse y/o clonarse de acuerdo con métodos convencionales. Las técnicas de clonación molecular para alcanzar estos fines se conocen bien en la técnica. Los especialistas en la técnica conocen una gran variedad de métodos de clonación y amplificación in vitro adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, genes que codifican anticuerpos de F5 o C1. Los ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para guiar a especialistas en la técnica a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en los documentos Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª ed) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook); y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publihing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1994) (Ausubel). En la técnica también se conocen métodos para producir inmunoglobulinas recombinantes. Véase los documentos, Cabilly, Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; y Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. EEUU 86: 10029-10033.
Ejemplos de técnicas suficientes para guiar a especialistas en la técnica a través de métodos de amplificación in vitro, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación con Q\exists-replicasa y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa se encuentran en los documentos Berger, Sambrook y Ausubel, así como en Mullis et al., (1987) Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. EEUU 86 1173; Gautelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 87, 1874; Lomell et al., (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene 4, 560; y Barringer et al., (1990) Gene 89, 117). Métodos mejorados para clonar ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen en el documento Wallace et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.426.039.
Una vez que el ácido nucleico para un anticuerpo de F5 o C1 se ha aislado y clonado, puede expresarse el gen en diversas células manipuladas genéticamente conocidas por los especialistas en la técnica. Los ejemplos de dichas células incluyen bacterias, levaduras, hongos filamentosos, células de insecto (especialmente vectores baculovirales) y células de mamíferos. Se espera que los especialistas en la técnica conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de anticuerpos de F5 o C1.
Como breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican anticuerpos de F5 o C1 se conseguirá típicamente uniendo de forma operativa un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a un promotor (que es constitutivo o inducible) e incorporando el constructo en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para replicación y/o integración en procariotas, eucariotas o ambos. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo de F5 o C1. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión génica que contienen al menos una secuencia de terminación independiente, secuencias que permiten la replicación de la casete en procariotas y eucariotas, es decir vectores lanzadera y marcadores de selección para sistemas procariotas y eucariotas. Véase Sambrook, supra.
Para obtener altos niveles de expresión de un ácido nucleico clonado es común construir plásmidos de expresión que típicamente contienen un potente promotor para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la transcripción y un terminador de la transcripción/traducción. Son ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para este fin en E. coli la región promotora y operadora de la ruta biosintética de triptófano en E. coli de acuerdo con lo descrito por Yanofsky (1984) J. Bacteriol., 158: 1018-1024 y el promotor de la izquierda del fago lambda (P_{L}) de acuerdo con lo descrito por Herskowitz y Hagen (1980) Ann. Rev. Genet., 14: 399-445. La inclusión de marcadores de selección en vectores de ADN transformados en E. coli también es útil. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen genes que especifican resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloramfenicol. Véase Sambrook para detalles respecto a marcadores de selección, por ejemplo para su uso en E. coli.
Están disponibles sistemas de expresión para anticuerpos de F5 o C1 que usan E. coli, Bacillus sp. (Palva et al., (1983) Gene 22: 229-235; Mosbach et al., Nature, 302: 543-545) y Salmonella. Se prefieren los sistemas de E. coli.
Los anticuerpos de F5 o C1 producidos por células procariotas pueden necesitar la exposición a agentes caotrópicos para un plegamiento apropiado. Durante la purificación a partir de, por ejemplo E. coli, la proteína expresada opcionalmente se desnaturaliza y después de renaturaliza. Esto se consigue, por ejemplo, disolviendo los anticuerpos producidos en bacterias en un agente caotrópico tal como guanidina HCl. Después se renaturaliza el anticuerpo, mediante diálisis lenta o filtración en gel. Véase, la Patente de Estados Unidos Nº 4.511.503.
Los métodos para transfectar y expresar genes en células de mamífero se conocen en la técnica. La transducción de células con ácidos nucleicos puede implicar, por ejemplo, incubar vectores virales que contienen ácidos nucleicos de F5 o C1 con células en el intervalo de hospedadores del vector. Véase por ejemplo el documento Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel ed.) (1990) o M. Krieger, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York, NY (1990) y las referencias mencionadas en ese documento.
El cultivo de células usadas en la presente invención, incluyendo líneas celulares y células cultivadas a partir de muestras de tejido o de sangre se conoce bien en la técnica. Freshney (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición Wiley-Liss, Nueva York (1994)) y las referencias mencionadas en ese documento proporcionan una guía general para el cultivo de células.
Las técnicas para usar y manipular anticuerpos se encuentran en Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Grenee, NY; Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold spring Harbor Press, NY; Stites et al., (eds) Basic and Clinical Immunology (4ª ed) Lange Medical Publications, Los Altos, CA y las referencias mencionadas en ese documento; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed) Academic Press, Nueva York, NY: y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497.
En una realización preferida el gen del anticuerpo de F5 o C1 se subclona en un vector de expresión, por ejemplo pUC119Sfi/NotIHismyc (Schier et al., (1995) Immunotechnology 1: 63-71). Esto da como resultado la adición de una etiqueta de hexa-histidina en el extremo C-terminal del scFv. Se prepara un ADN de vector pHEN-1 que contiene el ADN de scFv de F5 o C1 mediante minipreparación de lisis alcalina, digerida con NcoI y NotI y el ADN de scFv se purifica en un gel de agarosa al 1,5%. El ADN de scFv de F5 o C1 se liga en pUC119Sfi1/Not1Hismyc digerido con NcoI y NotI y la mezcla de ligamiento usada para transformar E. coli HB2151 electrocompetente. Para la expresión, se inoculan 200 ml de medio TY 2x que contiene 100 g/l de ampicilina y el 0,1% de glucosa con E. coli HB2151 que aloja el gen F5 o C1 en pUC119Sfit1/Not1Hismyc. El cultivo se incuba a 37ºC hasta un A_{600} nm de 0,8. Se induce la expresión de scFv soluble mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y el cultivo se incuba a 30ºC en un matraz agitador durante una noche.
Después pueden recogerse los anticuerpos de F5 o C1 del periplasma usando el siguiente protocolo: Se recogen células mediante centrifugado a 4000 g durante 15 minutos, se resuspenden en 10 ml de Tris HCl 30 mM enfriado con hielo, pH 8,0, EDTA 1 mM, sacarosa al 20% y se incuba en hielo durante 20 minutos. Después se sedimentan las bacterias mediante centrifugado a 6000 g durante 15 minutos y se elimina la "fracción periplásmica" mediante centrifugado a 30.000 g durante 20 minutos. Después se dializa el sobrenadante durante una noche a 4ºC contra 8 l de tampón de carga IMAC (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) y después se filtra a través de un filtro de 0,2 micrómetros.
En una realización preferida, el scFv de F5 y/o C1 se purifica mediante IMAC. Todas las etapas se realizan preferiblemente a 4ºC. Una columna que contiene 2 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) se lava con 20 ml de tampón de lavado de columna IMAC (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM) y 20 ml de tampón de carga IMAC. La preparación periplásmica se carga después en la columna y la columna se lava secuencialmente con 50 ml de tampón de carga IMAC y 50 ml de tampón de lavado IMAC (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 25 mM). La proteína se eluyó con 25 ml de tampón de elución IMAC (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM) y se recogieron 4 fracciones. El anticuerpo de F5 y C1 puede detectarse mediante absorbancia a 280 nm y la fracción de scFv puede eluirse. Para eliminar el scFv dimérico y agregado, pueden concentrarse muestras hasta un volumen < 1 ml en un Centricon 10 (Amicon) y pueden fraccionarse en una columna Superdex 75 usando un tampón de desplazamiento de HSB (Hepes 10mM, NaCl 150 mM, pH 7,4).
La pureza de la preparación final puede evaluarse analizando una alícuota mediante SDS-PAGE. Las bandas de proteína pueden detectarse mediante tinción de Coomassie. La concentración puede determinarse después mediante espectrofotometría, suponiendo que un A_{280} nm de 1,0 corresponde a una concentración de scFv de 0,7 mg/ml.
III. Modificación de y/o selección de anticuerpos de F5 o C1 modificados
En una realización preferida, la generación de nuevos (diferentes) anticuerpos de F5 o C1 implica generar un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla) y después cribar el anticuerpo para verificar que es un anticuerpo de F5 o C1 (es decir, que se une al epítopo al que se une F5 o C1 y más preferiblemente que se internaliza). Los anticuerpos a cribar pueden generarse aleatoriamente mediante diversos medios, producirse in vivo (por ejemplo, mediante inmunización de un animal con un epítopo de c-erbB2) o producirse ex vivo, por ejemplo en una biblioteca de presentación en fagos o de otro tipo. Los anticuerpos producidos de este modo se criban después para la afinidad de unión a c-erbB2 y/o para la unión específica a un epítopo de F5 o C1 y/o para la internalización en una célula portadora del receptor c-erbB2 o fragmento(s) del mismo.
A) Generación de anticuerpos obtenidos de F5 y C1 para cribado
Como alternativa, los anticuerpos obtenidos de F5 y C1 se obtienen preferiblemente mediante una de varias estrategias que utilizan las secuencias de F5 y C1 que se proporcionan en este documento. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación: 1) obtención mediante intercambio de cadena; 2) derivación mediante mutagénesis dirigida de CDR; 3) derivación introduciendo múltiples mutaciones en la secuencia mediante PCR propensa a errores, cepas mutadoras de E. coli o "intercambio de ADN". Estos anticuerpos obtenidos incluyen "enfoques de biblioteca" en los que se crean bibliotecas de secuencias mutantes partiendo de F5 o C1 y después se seleccionan por su función de unión.
1) Generación de bibliotecas de presentación en fagos
La capacidad de expresar fragmentos de anticuerpo en las superficies de virus que infectan bacterias (bacteriófagos o fagos) hace posible aislar un único fragmento de anticuerpo de unión de una biblioteca de más de 10^{10} clones no de unión. Para expresar fragmentos de anticuerpo en la superficie del fago (presentación en fagos), se inserta un gen del fragmento de anticuerpo en el gen que codifica una proteína de la superficie del fago (pIII) y la proteína de fusión fragmento de anticuerpo-pIII se presenta en la superficie del fago (McCafferty et al., (1990) Nature, 348: 552-554; Hoogenboom et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19: 4133-4137). Puesto que los fragmentos de anticuerpo en la superficie del fago son funcionales, los fagos portadores de fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno pueden separarse de fagos no de unión mediante cromatografía de afinidad por el antígeno (McCafferty et al., (1990) Nature, 348: 552-554). Dependiendo de la afinidad del fragmento de anticuerpo, se obtienen factores de enriquecimiento de 20 veces - 1.000.000 de veces para una única ronda de selección por afinidad. Al infectar bacterias con el fago eluido, sin embargo, pueden obtenerse más fagos y someterse a otra ronda de selección. De esta manera, un enriquecimiento de 1000 veces en una ronda puede convertirse en 1.000.000 de veces en dos rondas de selección (McCafferty et al., (1990) Nature, 348: 552-554). Esto incluso cuando los enriquecimientos son bajos (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597), múltiples rondas de selección por afinidad pueden conducir al aislamiento de fagos raros. Puesto que la selección de la biblioteca de anticuerpos en fagos sobre antígenos da como resultado el enriquecimiento, la mayoría de los clones se unen al antígeno después de cuatro rondas de selección. De este modo, solamente es necesario analizar la unión al antígeno de un número relativamente pequeño de clones (varios cientos). Se observa que en algunas realizaciones preferidas se prefieren sistemas polivalentes de presentación en fago, como se indica en los Ejemplos.
En una realización preferida, un análisis de unión se simplifica incluyendo un codón ámbar entre el gen del fragmento de anticuerpo y el gen III. El codón ámbar hace posible cambiar fácilmente entre fragmentos de anticuerpo presentado y soluble (nativo) simplemente cambiando la cepa bacteriana hospedadora (Hoogenboom et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19: 4133-4137).
Los anticuerpos humanos pueden producirse sin inmunización anterior presentando repertorios génicos de V muy grandes y diversos en fagos (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597). En una realización, se aislaron repertorios de V_{H} y V_{L} naturales presentes en linfocitos de la sangre periférica humana de donantes sin inmunizar mediante PCR. Los repertorios génicos de V se cortaron y empalmaron juntos al azar usando PCR para crear un repertorio génico de scFv que se clonó en un vector fago para crear una biblioteca de 30 millones de anticuerpos en fagos (id.). A partir de esta única biblioteca de anticuerpos en fago "virgen", se han aislado fragmentos de anticuerpo de unión contra más de 17 antígenos diferentes, incluyendo haptenos, polisacáridos y proteínas (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks et al., (1993). Bio/Technology. 10: 779-783; Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628). Se han producido anticuerpos contra proteínas propias, incluyendo tiroglobulina humana, inmunoglobulina, factor de necrosis tumoral y CEA (Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734). También es posible aislar anticuerpos contra antígenos de la superficie celular seleccionando directamente en células intactas. Por ejemplo, se produjeron fragmentos de anticuerpos contra cuatro antígenos de la superficie celular de eritrocitos, seleccionando directamente en eritrocitos (Marks et al., (1993). Bio/Technology. 10: 779-783). Se produjeron anticuerpos contra antígenos del grupo sanguíneo con densidades superficiales de hasta 5.000 sitios/célula. Los fragmentos de anticuerpo eran altamente específicos por el antígeno usando para la selección y eran funcionales en ensayos de aglutinación e inmunofluorescencia. Se produjeron anticuerpos contra los antígenos de baja densidad seleccionando en primer lugar la biblioteca de anticuerpos en fagos en un tipo celular altamente relacionado que carecía del antígeno de interés. Esta selección negativa eliminaba anticuerpos de unión a los antígenos de alta densidad y la posterior selección de la biblioteca mermada en anticuerpos en fagos en células que expresan el antígeno de interés dio como resultado el aislamiento de anticuerpos contra ese antígeno. Con una biblioteca de este tamaño y diversidad, puede aislarse al menos de uno a varios anticuerpos de unión contra un antígeno proteico el 70% de las veces. Los fragmentos de anticuerpo son altamente específicos por el antígeno usado para la selección y tienen afinidades en el intervalo de 1 M a 100 nM (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734). Las bibliotecas de anticuerpos en fagos más grandes dan como resultado el aislamiento de más anticuerpos de alta afinidad de unión para una mayor proporción de antígenos.
La creación de una gran biblioteca de anticuerpos de presentación en fagos adecuada se describe en detalle en los ejemplos proporcionados en este documento.
2) La presentación en fagos puede usarse para aumentar la afinidad de anticuerpos
Para crear anticuerpos de alta afinidad, se crean repertorios génicos de anticuerpos mutantes, partiendo de la secuencia de un anticuerpo de F5 o C1 de unión (por ejemplo, partiendo de los anticuerpos de F5 o C1 de scFv descritos en este documento) y se expresan en la superficie de fagos. Se seleccionan scFv de alta afinidad en antígenos como se ha descrito anteriormente, en los Ejemplos y en Schier et al., (1996) J. Mol. Biol., 263: 551-567.
Se seleccionan scFv de afinidad más alta mediante cromatografía de afinidad en antígenos como se ha descrito anteriormente. Un enfoque para crear repertorios génicos de scFv mutantes ha sido sustituir el gen de V_{H} o V_{L} original con un repertorio génico de V para crear nuevos socios (intercambio de cadena) (Clackson et al., (1991) Nature. 352: 624-628). Usando intercambio de cadena y presentación en fagos, la afinidad de un fragmento de anticuerpo de scFv humano que se unía a hapteno feniloxazolona (phOx) aumentaba de 300 nM a 1 nM (300 veces) (Marks et al., (1992) Bio/Technology. 10: 779-783).
De este modo, por ejemplo, para alterar la afinidad de anticuerpos de F5 o C1, pueden crearse un repertorio génico de scFv mutante que contiene el gen de V_{H} de F5 o C1 y un repertorio génico de V_{L} humano (intercambio de cadena ligera). El repertorio génico de scFv puede clonarse en el vector de presentación en fagos pHEN-1 (Hoogenboom et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19: 4133-4137) y después de la transformación se obtiene una biblioteca de transformantes. Los fagos se preparan y concentran como se describe en los Ejemplos.
Análogamente, para el intercambio de cadena pesada, la CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de V_{H} de F5 o C1 y la cadena ligera se clonan en un vector que contiene un repertorio génico de Vh humano para crear transformantes de biblioteca de anticuerpos en fagos. Para una descripción detallada del intercambio de cadena para aumentar la afinidad del anticuerpo véase Schier et al., (1996) J. Mol. Biol., 255: 28-43, 1996.
Las selecciones de C1 y F5 pueden realizarse incubando el fago con c-erbB-2 biotinilado en solución. La concentración de antígeno se reduce en cada ronda, alcanzando una concentración de menos de la K_{d} deseada en las últimas rondas de selección. Esto da como resultado la selección de fagos en base a la afinidad (Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896).
3) Mutagénesis dirigida para mejorar la afinidad de unión
La mayoría de los antígenos en contacto con las cadenas laterales de aminoácidos se sitúan en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tres en la V_{H} (CDR1, CDR2 y CDR3) y tres en la V_{L} (CDR1, CDR2 y CDR3) (Chotia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917; Chotia et al., (1986) Science, 233: 755-8; Nhan et al., (1991) J. Mol. Biol., 217: 133-151). Estos restos aportan la mayoría de energía de unión responsable de la afinidad del anticuerpo por el antígeno. En otras moléculas, mutar los aminoácidos que entran en contacto con ligandos han demostrado ser medios eficaces para aumentar la afinidad de una molécula de proteína por su socio de unión (Lowman et al., (1993) J. Mol. Biol., 234: 564-578; Wells (1990) Biochemistry, 29: 8509-8516). Puede usarse la mutagénesis dirigida de CDR y el cribado contra c-erbB-2 para generar anticuerpos de C6 que tienen una afinidad de unión y/o internalización de anticuerpos de F5 y C1 mejoradas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
4) Aleatorización de CDR para producir scFv humanos de alta afinidad
En una extensión de mutagénesis dirigida simple, pueden crearse bibliotecas de anticuerpos mutantes en las que se aleatorizan CDR parciales o completas (CDR1 y CDR2 de V_{L} y CDR1, CDR2 y CDR3 de V_{H}). En una realización, cada CDR se aleatoriza en una biblioteca diferente, usando F5 o C1 como plantilla. Las secuencias de CDR de los mutantes con afinidad más alta de cada biblioteca de CDR se combinan para obtener un aumento aditivo de la afinidad. Se ha usado un enfoque similar para aumentar la afinidad de la hormona humana del crecimiento (hGH) por el receptor de la hormona del crecimiento más de 1500 veces de 3,4 x 10^{-10} a 9,0 x 10^{-13} M (Lowman et al., (1993) J. Mol. Biol., 234: 564-578).
La CDR3 de V_{H} ocupa el centro del bolsillo de unión y por lo tanto es probable que las mutaciones en esta región den como resultado un aumento de la afinidad (Clackson et al., (1995) Science, 267: 383-386). En una realización, se aleatorizan cuatro restos de CDR3 de V_{H} al mismo tiempo usando los nucleótidos NNS (véase por ejemplo, Schier et al., (1996) Gene, 169: 147-155; Schier y Marks (1996) Human Antibodies and Hybridomas. 7: 97-105, 1996; y Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-567, 1996).
Para crear la biblioteca, se sintetiza un oligonucleótido que hibrida con el marco 3 de V_{H} de F5 o C1 y codifica la CDR3 de V_{H} y una porción del marco 4. En las cuatro posiciones a aleatorizar, se usa la secuencia NNS, donde
N = cualquiera de los 4 nucleótidos y S = C o T. Los oligonucleótidos se usan para amplificar los genes de V_{H} de F5 o C1 usando PCR, creando un repertorio génico de V_{H} de F5 o C1 mutante. Se usa PCR para cortar y empalmar el repertorio génico de V_{H} con el gen de cadena ligera de C6NIL3-B1 y el repertorio génico de scFv resultante se clona en el vector de presentación en fagos pHEN-1. Se usa ADN de vector ligado para transformar E. coli electrocompetente para producir una biblioteca de anticuerpos en fagos de > 1,0 x 10^{7} clones (Id.).
Para seleccionar scFv mutante de afinidad más alta, cada ronda de selección de las bibliotecas de anticuerpos en fagos se realiza en cantidades decrecientes de c-erbB-2 biotinilado, como se ha descrito anteriormente. Típicamente, 96 clones de la tercera y cuarta rondas de selección se criban para la unión a c-erbB-2 mediante ELISA en placas de 96 pocillos. scFv de veinte a cuarenta clones positivos para ELISA se expresan en cultivos de 10 ml, se recoge el periplasma y se determina la K_{off} de scFv mediante BIAcore. Los clones con la K_{off} más lenta se secuencian y cada scFv único se subclona, por ejemplo, en PUC119 Sf-NotmycHis. El scFv se expresa en cultivos de 1 l y se purifica como se ha descrito anteriormente. Las afinidades de scFv purificados se determinan mediante BIAcore.
5) Creación de homodímeros
Para crear anticuerpos de F5 o C1 (scFv')2, se unen dos scFv de F5 o dos de C1, a través de un enlazador (por ejemplo, un enlazador de carbono, un péptido, etc.) o a través de un puente disulfuro entre, por ejemplo, dos cisteínas. De este modo, por ejemplo, para crear scFv de F5 unido mediante puentes disulfuro, se introduce un resto de cisteína mediante mutagénesis dirigida entre la etiqueta myc y la etiqueta hexahistidina en el extremo carboxilo de F5. La introducción de la secuencia correcta puede verificarse mediante secuenciación de ADN. Si el constructo está en pUC119, el líder pelB dirige el scFv expresado al periplasma y existen sitios de clonación (NcoI y NotI) para introducir scFv mutantes de F5 o C1. El scFv expresado tiene la etiqueta myc en el extremo C, seguida de 2 glicinas, una cisteína y después 6 histidinas para facilitar la purificación mediante IMAC. Después de la formación de puentes disulfuro entre los dos restos de cisteína, los dos scFv están separados entre sí por aproximadamente 26 aminoácidos (dos etiquetas myc de 11 aminoácidos y 4 glicinas).
A partir de este constructo puede expresarse un scFv, purificarse mediante IMAC y analizarse mediante filtración en gel. Para producir dímeros de (scFv')2, la cisteína se reduce mediante incubación con 3-mercaptoetanol 1 mM y la mitad de los scFv se bloquea mediante la adición de DTNB. Los scFv bloqueados y sin bloquear se incuban conjuntamente para formar (scFv')2 y el material resultante puede analizarse mediante filtración en gel. La afinidad de los monómeros scFv' de F5 y C1 y los dímeros (scFv')2 de F5 y C1 se determina mediante BIAcore.
En una realización particularmente preferida, el dímero (scFv')2 se crea uniendo los fragmentos de scFv' a través de un enlazador, más preferiblemente a través de un enlazador peptídico. Esto puede conseguirse mediante una gran variedad de medios bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, un enfoque preferido se describe por Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 90: 6444-6448 (véase también el documento WO 94/13804).
B) Reconocimiento/Selección de anticuerpos de F5 o C1
Como se ha indicado anteriormente, en una realización, esta invención proporciona dos anticuerpos anti-c-erbB-2 que se internalizan eficazmente. Estos anticuerpos, denominados en este documento F5 (SEC ID Nº 1) y C1 (SEC ID Nº 2), se unen específicamente a un epítopo anteriormente no reconocido en el dominio externo de c-erbB-2 y de este modo caracterizan a ese epítopo. Usando la información proporcionada, pueden prepararse de forma rutinaria otros anticuerpos de C1 o F5 que se unen al mismo epítopo.
Independientemente del método usado para generar nuevos anticuerpos de C1 o F5 (por ejemplo, inmunización de animales con c-erbB2, intercambio de dominios en una biblioteca de anticuerpos de cadena sencilla, etc.) para verificar que el anticuerpo producido es un anticuerpo de F5 o C1 preferido, el supuesto anticuerpo de F5 o C1 se criba preferiblemente para 1) afinidad de unión a c-erbB2; y/o 2) unión específica del epítopo de F5 y/o C1; y 3) internalización.
\global\parskip1.000000\baselineskip
1) Medición de la afinidad de unión de anticuerpo/polipéptido
Como se ha explicado anteriormente, la selección para una mayor avidez implica medir la afinidad del anticuerpo (por ejemplo, un F5 o C1 modificado) por el antígeno diana (por ejemplo, c-erbB-2). Los métodos para realizar dichas mediciones se describen con detalle en la solicitud relacionada USSN 08/665.202. En resumen, por ejemplo, la K_{d} de F5, C1 o un anticuerpo obtenido de F5 o de C1, la cinética de unión a c-erbB-2 se determinan en un BIAcore, un biosensor a partir de la resonancia de plasmón superficial. Para esta técnica, el antígeno se acopla a un chip sensor derivatizado capaz de detectar cambios de masa. Cuando el anticuerpo se pasa sobre el chip sensor, el anticuerpo se une al antígeno, dando como resultado un aumento de masa que es cuantificable. La medición de la velocidad de asociación en función de la concentración de anticuerpo puede usarse para calcular la constante de velocidad de asociación (K_{on}). Después de la fase de asociación, se hace pasar tampón sobre el chip y se determina la velocidad de disociación de anticuerpo (K_{off}). La K_{on} se mide típicamente en el intervalo de 1,0 x 10^{2} a 5,0 x 10^{6} y la K_{off} en el intervalo de 1,0 x 10^{-1} a 1,0 x 10^{-6}. La constante de equilibrio K_{d} se calcula a menudo como K_{off}/K_{on} y por lo tanto típicamente se mide en el intervalo de 10^{-5} a 10^{-12}. Las afinidades medidas de esta manera correlacionan bien con afinidades medidas en solución mediante valoración por extinción de la fluorescencia.
Los anticuerpos de F5 y C1 preferidos se unen al epítopo de F5 y C1 de c-erbB-2 en células con una afinidad de unión de al menos 10^{-5} M, más preferiblemente con una afinidad de unión de al menos 1 \muM y lo más preferiblemente con una afinidad de unión de al menos 100 nM, 10 nM o incluso 1 nM.
2) Identificación de anticuerpos que se unen al epítopo al que se une F5 y/o C1
Los anticuerpos de F5 y C1 (por ejemplo, anticuerpos que se unen al mismo epítopo al que se unen C1 y F5) pueden identificarse (seleccionarse) a partir de suero obtenido de un animal inmunizado apropiadamente o de un sistema ex vivo (por ejemplo, una biblioteca de anticuerpos aleatoria) mediante selección de anticuerpos que compitan con C1 o F5 por la unión a un epítopo de c-erbB2. Los anticuerpos obtenidos de F5 y C1 se reconocen por su reactividad cruzada con 1) el epítopo de c-erbB-2 reconocido por F5 y C1; y/o 2) un anticuerpo idiotípico anti F5 o C1. Para la guía e internalización, se prefieren anticuerpos de F5 y C1 de alta afinidad, sin embargo, si se desea convertir un antagonista en un agonista, se espera que puedan preferirse anticuerpos de F5 y C1 de baja afinidad. Además, para muchas aplicaciones la internalización rápida y eficaz es más importante que la afinidad y puede preferirse un anticuerpo de baja afinidad que se internalice rápidamente a un anticuerpo de afinidad más alta que no se internalice tan rápidamente.
a) Reactividad cruzada con anticuerpos anti-idiotípicos
El idiotipo representa el sitio de unión al antígeno altamente variable de un anticuerpo y él mismo es inmunogénico. Durante la generación de una respuesta inmune mediada por anticuerpos, un individuo desarrollará anticuerpos para el antígeno así como anticuerpos anti-idiotipo, cuyo sitio de unión inmunogénico (idiotipo) imita al antígeno.
Después, los anticuerpos obtenidos de F5 o C1 pueden ser reconocidos por su capacidad para unirse específicamente a anticuerpos de F5 y C1 anti-idiotípicos, es decir anticuerpos obtenidos de F5 y C1 y preferiblemente tienen reactividad cruzada con F5 y C1 y con anticuerpos de F5 o C1anti-idiotípicos.
Pueden generarse anticuerpos anti-idiotípicos contra las regiones variables de F5 o C1 usando métodos convencionales bien conocidos por los especialistas en la técnica. En resumen, pueden prepararse anticuerpos anti-idiotipo inyectando anticuerpos de esta invención (por ejemplo, anticuerpos de F5 o C1 o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CDR)) en un animal, generando de este modo antisuero contra diversos determinantes antigénicos en el anticuerpo, incluyendo determinantes en la región idiotípica.
Los métodos para la producción de anticuerpos anti-analito se conocen bien en la técnica. Pueden inyectarse antígenos de gran peso molecular (más de aproximadamente 5000 Daltons) directamente en animales, mientras que compuestos de poco peso molecular (menos de aproximadamente 5000 Daltons) se acoplan preferiblemente a un vehículo inmunogénico de alto peso molecular, normalmente una proteína, para hacerlos inmunogénicos. Los anticuerpos producidos en respuesta a la inmunización pueden utilizarse como suero, fluido ascítico, una fracción de inmunoglobulina (Ig) una fracción de IgG o como material monoespecífico purificado por afinidad.
Pueden prepararse anticuerpos anti-idiotipo policlonales inmunizando a un animal con los anticuerpos de esta invención preparados como se ha descrito anteriormente. En general, es deseable inmunizar a un animal cuya especie y alotipo concuerde con el animal del que se obtuvo el anticuerpo (por ejemplo, biblioteca de presentación en fagos). Esto minimiza la producción de anticuerpos dirigidos contra determinantes no idiotípicos. El antisuero obtenido de este modo se absorbe después normalmente en gran medida contra suero normal de la misma especie de la que se obtuvo la biblioteca de presentación en fagos, eliminando de este modo anticuerpos dirigidos contra determinantes no idiotípicos. La absorción puede conseguirse haciendo pasar antisuero sobre un gel formado reticulando proteínas de suero normales (no inmunes) con gluraraldehído. Los anticuerpos con especificidad anti-idiotípica pasarán directamente a través del gel, mientras que los que tienen especificidad por determinantes no idiotípicos se unirán al gel. La inmovilización de proteínas de suero no inmunes en un soporte polisacarídico insoluble (por ejemplo, sacarosa) también proporciona una matriz para adsorción adecuada.
Pueden producirse anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales usando el método de Kohler et al., (1975) Nature 256: 495. En particular, pueden prepararse anticuerpos anti-idiotipo monoclonales usando tecnología de hibridoma que comprende fusionar (1) células esplénicas de un ratón inmunizado con el antígeno o conjugado hapteno-vehículo de interés (es decir, los anticuerpos de esta invención o subsecuencias de los mismos) con (2) una línea celular de mieloma de ratón que se ha seleccionado por su resistencia a un fármaco (por ejemplo, 8-azaguanina). En general, es deseable usar una línea celular de mieloma que no secrete una inmunoglobulina. En la técnica se conocen varias de dichas líneas celulares. Una línea celular preferida es P3X63Ag8.653. Esta línea celular esta depositada en la American Type Culture Collection como CRL-1580.
La fusión puede realizarse en presencia de polietilenglicol de acuerdo con métodos establecidos (véase por ejemplo los documentos, Monoclonal Antibodies, R Kennett, J. McKearn & K. Bechtol, eds. N.Y., Plenum Press, 1980 y Current Topics in Microbiology & Immunology, Vol. 81, F. Melcbers, M. Potter & N. L. Warner, eds., N.Y. Springer-Verlag, 1978). La mezcla resultante de células fusionadas y sin fusionar se coloca en placas en medio selectivo de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). En estas condiciones, solamente crecerán células híbridas.
Cuando se ha producido el suficiente crecimiento celular (típicamente 10-14 días después de la fusión), el medio de cultivo se recoge y se criba para detectar la presencia de anticuerpo monoclonal idiotípico anti-analito mediante cualquiera de varios métodos que incluyen RIA en fase sólida y ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas. Después, las células de los pocillos de cultivo que contienen anticuerpo de la especificidad deseada se expanden y se vuelven a clonar. Las células de esos cultivos que siguen siendo positivas para el anticuerpo de interés se hacen pasar después normalmente como tumores ascíticos en ratones histocompatibles, susceptibles, sensibilizados con pristano.
El fluido ascítico se recoge mediante una punción de la cavidad peritoneal, se vuelve a ensayar la presencia de anticuerpos y se purifica como se ha descrito anteriormente. Si se usa una línea de mieloma no secretora en la fusión, la purificación por afinidad del anticuerpo monoclonal normalmente no es necesaria puesto que el anticuerpo ya es homogéneo con respecto a sus características de unión al antígeno. Todo esto es necesario para aislarlo de proteínas contaminantes en el ascites, es decir para producir una fracción de inmunoglobulina.
Como alternativa, las líneas celulares híbridas de interés pueden cultivarse en cultivo tisular sin suero y el anticuerpo puede recogerse del medio de cultivo. También es posible hacer pasar a las células por vía intravenosa en ratones y recoger el anticuerpo del suero. Este método generalmente no se prefiere debido a la pequeña cantidad de suero que puede obtenerse mediante extracción de sangre y debido a la necesidad de una exhaustiva purificación de otros componentes del suero. Sin embargo, algunos hibridomas no crecerán como tumores ascíticos y por lo tanto debe usarse uno de estos métodos alternativos para obtener el anticuerpo.
b) Reactividad cruzada con F5 o C1
En lugar del anticuerpo anti-idiotípico, pueden identificarse supuestos anticuerpos obtenidos de F5 y C1 mediante reactividad cruzada con F5 y C1, respectivamente, contra los epítopos de c-erbB-2 de F5 y C1.
Esto puede evaluarse proporcionando células que expresan c-erbB-2 nativo o recombinante o proporcionando el c-erbB-2 aislado unido a un soporte sólido. La competencia entre el supuesto F5 (o C1) y el C1 de la SEC ID Nº 12 en un formato de mapeo de epítopos establece que los anticuerpos compiten por el mismo epítopo. Después se criban los supuestos anticuerpos como se ha descrito anteriormente.
c) Mediciones de reactividad cruzada
Se usan preferiblemente inmunoensayos en el formato de unión competitiva para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, el epítopo o anticuerpo anti-idiotípico de F5 o C1 se inmoviliza en un soporte sólido. Los supuestos anticuerpos obtenidos de F5 u obtenidos de C1 (por ejemplo, generados mediante selección de una biblioteca de presentación en fagos) añadidos al ensayo compiten con el anticuerpo de C1 de la SEC ID Nº 2, por la unión al epítopo o anticuerpo anti-idiotípico inmovilizado. Se compara la capacidad de los supuestos anticuerpos obtenidos de F5 u obtenidos de C1 para competir con la unión del anticuerpo de C1 (SEC ID Nº 2) a la proteína inmovilizada. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada de las proteínas anteriores, usando cálculos convencionales.
Si el supuesto anticuerpo obtenido de F5 u obtenido de C1 compite con C1 y tiene una afinidad de unión comparable a o mayor que C1 con la misma diana, entonces el supuesto anticuerpo obtenido de F5 u obtenido de C1 se considera un anticuerpo (obtenido) de F5 o C1.
3) Medición de la internalización de anticuerpos de C1 y F5
En una realización, esta invención proporciona métodos para identificar anticuerpos de F5 o C1 de internalización. Los métodos implican poner en contacto una célula "diana" con uno o más supuestos anticuerpos de F5 o C1 (por ejemplo, miembros de una biblioteca de presentación en fagos). Después de un periodo de incubación adecuado, las células se lavan para eliminar fagos unidos externamente (miembros de la biblioteca) y después los fagos internalizados se liberan de las células mediante lisis celular. Los fagos internalizados en el lisado celular pueden recuperarse y expandirse usando el lisado que contiene fagos internalizados para infectar a un hospedador bacteriano. El cultivo de bacterias infectadas conduce a la expansión de los fagos que pueden usarse para una posterior ronda de selección. Cada ronda de selección enriquece fagos que se internalizan de forma más eficaz, son más específicos por la célula diana o tienen características de unión mejoradas.
La biblioteca de presentación en fagos se pone en contacto preferiblemente con una línea celular substractiva (es decir, se añade una línea celular sustractiva a las células diana y al medio de cultivo) para eliminar miembros de la biblioteca de presentación en fagos que no son específicos de la(s) célula(s) "diana". La línea celular sustractiva se añade preferiblemente en condiciones en las que los miembros de la biblioteca de presentación en fagos no se internalizan (por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 20ºC, más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 4ºC) de modo que los miembros de unión no específica de la biblioteca no se internalicen (secuestren) antes de que puedan ser sustraídos por la línea celular sustractiva.
Después de la sustracción de los anticuerpos de unión no específica, las células "diana" se lavan para retirar la línea celular sustractiva y para retirar fagos no específicos o unidos débilmente.
Las células diana se cultivan después en condiciones en las que es posible que se produzca la internalización (por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 39ºC, más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37ºC). La duración del periodo de cultivo de internalización determinará la velocidad de internalización de los anticuerpos (miembros de la biblioteca de presentación en fagos) para los que tiene lugar la selección. Con periodos de internalización más cortos, se seleccionan anticuerpos que se internalizan más rápido, mientras que con periodos de internalización más largos, se seleccionan anticuerpos que se internalizan más lentamente. El periodo de internalización es preferiblemente de menos de aproximadamente 120 minutos, más preferiblemente menos de aproximadamente 60 minutos y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 30 minutos o incluso menos de aproximadamente 20 minutos.
Se observa que, durante el periodo de internalización, las células diana se cultivan en condiciones en las que puede producirse internalización. Para varias líneas celulares, esto implica cultivar las células de forma adherente en placas de cultivo.
Una vez que se ha permitido que se produzca la internalización, las células diana se lavan para retirar los no internalizados (por ejemplo, fagos unidos a la superficie).
Después pueden trasladarse las células a medio limpio. En una realización preferida, en las que las células son adherentes, las células se tripsinizan para liberar las células de la matriz extracelular que puede contener anticuerpos en fagos que se unen a la matriz extracelular. La liberación de las células en la solución permite un lavado más exhaustivo y el traslado de las células a un nuevo matraz de cultivo dejará atrás cualquier fago que pueda haberse pegado a la placa de cultivo tisular.
Las células pueden lavarse después con un gran volumen de PBS y lisarse para liberar los fagos internalizados que después pueden expandirse por ejemplo, usarse para infectar E. coli para producir fagos para la siguiente ronda de selección. Se observa que no es necesario visualizar realmente los fagos internalizados. Una simple lisis celular y la expansión de los fagos anteriormente internalizados es suficiente para recuperar miembros de presentación en fagos de internalización. Los métodos para seleccionar miembros de la biblioteca de fagos de internalización también se describen en la solicitud relacionada USSN 60/082.953 y en los Ejemplos que se proporcionan en este documento.
IV. Epítopos de F5 y C1
En otra realización, esta descripción proporciona el(los) epítopo(s) reconocidos y a los que se unen específicamente los anticuerpos de F5 y C1 de esta invención. Este epítopo de internalización se caracteriza por la capacidad de que se le unan específicamente F5 y C1 respectivamente. De este modo, el epítopo de F5 es una región de c-erbB2 que se une específicamente a F5 mientras que el epítopo de C1 es una región de c-erbB2 que se une específicamente a C1 (SEC ID Nº 2). Se cree que tanto F5 como C1 se unen al mismo epítopo de c-erbB2.
Los epítopos de F5 y C1 pueden identificarse mediante mapeo de epítopos usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo el documento Geysen et al., (1987) J. Immunol. Meth. 102, 259-274). Esta técnica implica la síntesis de péptidos c-erbB-2 solapantes. Los péptidos sintetizados se criban después contra F5 y C1 respectivamente y los epítopos de F5 y C1 característicos pueden identificarse mediante especificidad y afinidad de unión.
Los péptidos para el mapeo de epítopos de F5 y C1 pueden prepararse convenientemente usando técnicas de síntesis peptídica "Multipin" (varillas múltiples) (véase, por ejemplo el documento Geysen et al., (1987) Science, 235: 1184-1190). Usando la secuencia conocida de c-erbB-2 (véase por ejemplo, SWISS-PROT: P04626 o Coussens et al., (1985) Science, 230: 1132-1139), las secuencias polipeptídicas de c-erbB-2 solapantes pueden sintetizarse individualmente de manera secuencial en varillas de plástico en una serie de una o más placa(s) de microensayo de 96 pocillos.
El procedimiento para el mapeo de epítopos que usa este sistema peptídico de múltiples varillas se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.739.306. En resumen, las varillas se tratan en primer lugar con un tampón de pre-revestimiento que contiene albúmina de suero bovino al 2% y Tween 20 al 0,1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se insertan las varillas en los pocillos individuales de una placa de microensayo de 96 pocillos que contienen anticuerpo de F5 o C1 en el tampón de pre-revestimiento a 2 mu g/ml. La incubación es durante 1 hora a temperatura ambiente. Las varillas se lavan en PBST (3 aclarados cada 10 minutos) y después se incuban en los pocillos de una placa de microensayo de 96 pocillos que contienen 100 mu de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (Fc) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a una dilución de 1:4.000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las varillas como anteriormente, las varillas se colocaron en pocillos que contenían solución de sustrato de peroxidada de diamonio 2,2'-azino-bis[3-etilbenzotiazolin-b-sulfonato] (ABTS) y H_{2}O_{2} (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, Md) durante 30 minutos a temperatura ambiente para que se produzca la reacción de color. La placa se lee a 405 nm mediante un lector de placas (por ejemplo, lector de placas BioTek ELISA) contra una longitud de onda de absorción de fondo de 492 nm. Los pocillos que mostraban desarrollo de color indicaban reactividad de los péptidos obtenidos de c-erbB-2 en dichos pocillos con F5 o C1.
V. Preparación de Moléculas Quiméricas
En otra realización, esta invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo de F5 o C1 unido a una molécula efectora. Como se ha explicado anteriormente, el componente de molécula efectora de las moléculas quiméricas de esta invención puede ser cualquier molécula cuya actividad se desea suministrar a células que expresan c-erbB-2. Las moléculas efectoras adecuadas incluyen citotoxinas tales como PE, Ricin, Abrin o DT, radionúclidos, ligandos tales como factores de crecimiento, anticuerpos, marcas detectables tales como marcas fluorescentes o radiactivas y composiciones terapéuticas de dichos fármacos conjugados o fusionados directamente, "cápsulas" (por ejemplo, liposomas, cápsulas poliméricas sintéticas, cápsidas de virus, virus vivos) que contienen diversos fármacos u otros agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos).
Una molécula efectora típicamente tiene una actividad característica que se desea administrar a una célula diana (por ejemplo, un tumor que sobreexpresa c-erbB-2). Las moléculas efectoras incluyen citotoxinas, marcas, radionúclidos, ligandos, anticuerpos, fármacos, liposomas, virus o cápsidas virales que contienen ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, moléculas antisentido, ácidos nucleicos peptídicos) y proteínas de la envuelta viral que hacen al virus capaz de infectar a una célula que expresa c-erbB-2. Una vez suministrada a la diana, la molécula efectora ejerce su actividad característica.
Por ejemplo, en una realización, en la que la molécula efectora es una citotoxina, la molécula quimérica actúa como un potente agente destructor de células que guía específicamente a la citotoxina hacia células tumorales portadoras del marcador c-erbB-2. Las citotoxinas quiméricas que se dirigen específicamente a células tumorales son bien conocidas por los especialistas en la técnica (véase por ejemplo el documento, Pastan et al., (1992) Ann. Rev. Biochem., 61: 331-354).
En otra realización, la molécula quimérica puede usarse para detectar la presencia o ausencia de células tumorales in vivo o in vitro y/o para cuantificar células tumorales in vivo o in vitro y/o para localizar células tumorales in vivo. Estos métodos implican proporcionar una molécula quimérica que comprende una molécula efectora, es decir una marca detectable unida al anticuerpo de F5 o C1. Los anticuerpos de F5 o C1 unen específicamente la molécula quimérica a células tumorales que expresan el marcador c-erbB-2 que después se marcan mediante su asociación con la marca detectable. La posterior detección de la marca asociada a la célula indica la presencia y/o ubicación de una célula tumoral.
En otra realización más, la molécula efectora puede ser otro resto de unión específica incluyendo, aunque sin limitación, un anticuerpo, un dominio de unión al antígeno, un factor de crecimiento o un ligando. La molécula quimérica actuará después como enlazador bifuncional altamente específico. Este enlazador puede actuar para unir y potenciar la interacción entre células o componentes celulares a los que se une la molécula quimérica. De este modo, por ejemplo, cuando el componente "efector" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-receptor, el componente de anticuerpo de F5 o C1 se une específicamente a células cancerosas portadoras de c-erbB-2, mientras que el componente efector se une a los receptores (por ejemplo, receptores IL-2, IL-4, FcI, FcII y FcIII) en la superficie de células inmunes. La molécula quimérica puede actuar de este modo para potenciar y dirigir una respuesta inmune hacia células cancerosas diana.
En aún otra realización más, la molécula efectora puede ser un agente farmacológico (por ejemplo, un fármaco) o un vehículo que contiene un agente farmacológico. Esto es particularmente adecuado cuando se desee solamente invocar una respuesta biológica no letal. De este modo, el receptor del anticuerpo de F5 o C1 puede estar conjugado a un fármaco tal como vinblastina, vindesina, melfalán, N-acetilmelfalán, metotrexato, aminopterina, doxirrubicina, genisteína (un inhibidor de tirosina quinasa), una molécula antisentido y otros agentes farmacológicos conocidos por los especialistas en la técnica, guiando de este modo específicamente al agente farmacológico a células tumorales que expresan c-erbB-2.
Como alternativa, el anticuerpo de F5 o C1 puede unirse a un vehículo que contiene la composición terapéutica. Dichos vehículos incluyen, aunque sin limitación, liposomas, micelas, diversas perlas sintéticas o cápsulas poliméricas, cápsidas de virus, virus vivos y similares.
Un especialista en la técnica entenderá que las moléculas quiméricas de la presente invención opcionalmente incluyen múltiples restos guía unidos a un único efector o a la inversa, múltiples moléculas efectoras unidas a un único resto guía. En otra realización más, esta invención las moléculas quiméricas incluyen múltiples restos guía y múltiples moléculas efectoras. De este modo, por ejemplo esta invención proporciona moléculas quiméricas citotóxicas de "doble objetivo" en las que el anticuerpo de F5 o C1 está unido a una molécula citotóxica mientras que otra molécula (por ejemplo, un anticuerpo u otro ligando) está unida al otro extremo de la toxina. Dicha citotoxina de doble objetivo puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo de F5 o C1 sustituido por el dominio Ia en el extremo amino de una PE y anti-TAC(Fv) insertado en el dominio III. Otros anticuerpos también pueden ser moléculas efectoras adecuadas.
A) Citotoxinas
Las citotoxinas particularmente preferidas incluyen exotoxinas de Pseudomonas, toxinas de Diphtheria, ricin y abrin. La exotoxina de Pseudomonas y la toxina de Diphtheria, en particular, se usan frecuentemente en citotoxinas quiméricas.
1) Exotoxina de Pseudomonas (PE)
La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis de proteínas en células eucariotas a través de la inactivación del factor de elongación 2 (EF-2) catalizando su ADP-ribosilación (catalizando la transferencia del resto ribosilo de ADP de NAD oxidado a EF-2).
La toxina contiene tres dominios estructurales que actúan conjuntamente para causar citotoxicidad. El dominio Ia (aminoácidos 1-252) media en la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación en el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ADP ribosilación del factor de elongación 2, que inactiva la proteína y causa la muerte celular. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) sigue sin definir, aunque gran parte de éste, aminoácidos 365-380, puede delecionarse sin pérdida de citotoxicidad. Véase el documento Siegall et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 14256-14261.
Para las máximas propiedades citotóxicas de una molécula de PE preferida, se recomiendan varias modificaciones a la molécula. Se prefiere una secuencia carboxilo terminal apropiada para la molécula recombinante, para translocar la molécula al citosol de las células diana. Las secuencias de aminoácidos que se ha descubierto que son eficaces incluyen, REDLK (como en PE nativa), REDL, RDEL o KDEL, repeticiones de éstas u otras secuencias que funcionan para mantener o reciclar proteínas en el retículo endoplasmático, denominadas en este documento "secuencias de retención endoplasmática". Véase por ejemplo los documentos, Chaudhary et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 87: 308-312 y Seetharam et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 17376-17381.
La molécula guía puede insertarse en sustitución del dominio Ia. Una inserción similar se realizó en lo que se conoce como la molécula TGF-PE40 (también denominada TP40) descrita en Heimbrook et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU, 87: 4697-4701. Véase también el documento Debinski et al., (1994) Bioconj. Chem., 5: 40, para otras variantes de PE).
Las moléculas de PE pueden fusionarse al anticuerpo de F5 o C1 mediante medios recombinantes. Los genes que codifican cadenas proteicas pueden clonarse en ADNc o en forma genómica mediante cualquier procedimiento de clonación conocido por los especialistas en la técnica. Véase por ejemplo el documento Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Los métodos para clonar genes que codifican PE fusionadas a diversos ligandos los conocen bien los especialistas en la técnica. Véase por ejemplo Siegall et al., (1989) FASEB J., 3: 2647-2652; Chaudhary et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 84: 4538-4542.
Los especialistas en la técnica se darán cuenta de que pueden realizarse modificaciones, deleciones, inserciones y similares adicionales a las moléculas quiméricas de la presente invención o a las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas quiméricas de F5 o C1. Especialmente, pueden realizarse deleciones o cambios en PE o en un enlazador que conecta un gen de anticuerpo con PE, para aumentar la citotoxicidad de la proteína de fusión hacia células diana o para reducir la citotoxicidad no específica hacia células sin antígeno para el anticuerpo. Todas estas construcciones pueden hacerse mediante métodos de ingeniería genética bien conocidos por los especialistas en la técnica (véase en general el documento, Sambrook et al., supra) y pueden producirse proteínas que tienen diferentes propiedades de afinidad, especificidad, estabilidad y toxicidad que las hacen particularmente adecuadas para diversas aplicaciones clínicas o biológicas.
2) Toxina de Diphtheria (DT)
Como PE, la toxina de Diphtheria (DT) destruye células mediante ADP ribosilación del factor de elongación 2 (EF-2) inhibiendo de este modo la síntesis de proteínas. La toxina de Diphtheria, sin embargo, se divide en dos cadenas, A y B, unidas mediante un puente disulfuro. Al contrario que PE, la cadena B de DT, que está en el extremo carboxilo, es responsable de la unión al receptor y la cadena A, que está presente en el extremo amino, contiene la actividad enzimática (Uchida et al., (1972) Science, 175: 901-903; Uchida et al., (1973) J. Biol. Chem., 248: 3838-3844).
Las proteínas de fusión de molécula guía-toxina de Diphtheria de esta invención pueden tener el dominio de unión al receptor nativo retirado mediante truncamiento de la cadena B de la toxina de Diphtheria. DT388, una DT en la que la secuencia carboxilo terminal que comienza en el resto 389 está retirada, se ilustra en Chaudhary et al., (1991) Bioch. Biophys. Res. Comm., 180: 545-551.
Al igual que las citotoxinas quiméricas de PE, las moléculas de DT pueden conjugarse químicamente al anticuerpo de F5 o C1, pero también pueden prepararse como proteínas de fusión mediante medios recombinantes. Los genes que codifican cadenas proteicas pueden clonarse en ADNc o en forma genómica mediante cualquier procedimiento conocido por los especialistas en la técnica. Los métodos para clonar genes que codifican DT fusionado a diversos ligandos también los conocen bien los especialistas en la técnica. Véase por ejemplo, el documento Williams et al., (1990) J. Biol. Chem. 285: 11885-11889 que describe la expresión de proteínas de fusión de factor de crecimiento-DT.
La expresión "toxina de Diphtheria" (DT) como se usa en este documento se refiere a DT nativa de longitud completa o a una DT que se ha modificado. Las modificaciones típicamente incluyen la retirada del dominio guía en la cadena B y, más específicamente, implican truncamientos de la región carboxilo de la cadena B.
B) Marcas detectables
La expresión "marca detectable" se refiere a cualquier material que tiene una propiedad física o química detectable. Dichas marcas detectables se han desarrollado bien en el campo de los inmunoensayos y, en general, cualquier marca útil en dichos métodos puede aplicarse a la presente invención. De este modo, una marca es cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo DynabeadsTM), tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato fluorescente, rojo Texas, rodamina y similares), radiomarcas (por ejemplo, ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), proteína azul fluorescente (BFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína roja fluorescente (RFP), luciferasa), enzimas (por ejemplo, LacZ, CAT, peroxidada de rábano rusticano, fosfatasa alcalina y otras, usadas comúnmente como enzimas detectables, como productos de genes marcadores o en un ELISA) y marcas colorimétricas tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Las patentes que muestran el uso de dichas marcas incluyen las Patentes de Estados Unidos Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241.
Se reconocerá que las marcas fluorescentes no deben limitarse a moléculas orgánicas de una única especie, sino que incluyen moléculas inorgánicas, mezclas multimoleculares de moléculas orgánicas y/o inorgánicas, cristales, heteropolímeros y similares. De este modo, por ejemplo, nanocristales núcleo-corteza de CdSe-CdS envueltos en una corteza de sílice pueden derivatizarse fácilmente para acoplarse a una molécula biológica (Bruchez et al., (1998) Science, 281: 2013-2016). Análogamente, quantum dos altamente fluorescentes (seleniuro de cadmio recubierto de sulfuro de zinc) se han acoplado covalentemente a biomoléculas para su uso en detección biológica ultrasensible (Warren y Nie (1998) Science, 281: 2016-2018).
La marca puede acoplarse directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. A menudo se unen marcas no radiactivas mediante medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. El ligando se une después a una molécula anti-ligando (por ejemplo, estreptavidina) que es detectable inherentemente o está unida covalentemente a un sistema de señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente. Pueden usarse varios ligandos y anti-ligandos. Cuando un ligando tiene un anti-ligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina y cortisol, éste puede usarse junto con los anti-ligandos de origen natural marcados. Como alternativa, puede usarse cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo. Las moléculas también pueden conjugarse directamente o a través de un enlazador a compuestos generadores de señales.
Los medios para detectar dichas marcas los conocen bien los especialistas en la técnica. De este modo, por ejemplo, pueden detectarse radiomarcas usando película fotográfica o contadores de centelleo, pueden detectarse marcadores fluorescentes usando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Las marcas enzimáticas se detectan típicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido mediante la acción de la enzima sobre el sustrato y se detectan marcas colorimétricas visualizando simplemente la marca coloreada.
C) Ligandos
Como se ha explicado anteriormente, la molécula efectora también puede ser un ligando o un anticuerpo. Los ligandos y anticuerpos particularmente preferidos son los que se unen a marcadores de superficie de células inmunes. Las moléculas quiméricas que utilizan dichos anticuerpos como moléculas efectoras actúan como enlazadores bifuncionales que establecen una asociación entre las células inmunes portadoras del socio de unión para el ligando o anticuerpo y las células tumorales que expresan el c-erbB-2. Los anticuerpos y factores de crecimiento adecuados los conocen los especialistas en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, factor de necrosis tumoral (TNF), anti-Tac, TGF\forall y similares.
D) Otros restos terapéuticos
Otras moléculas efectoras adecuadas incluyen agentes farmacológicos o sistemas de encapsulado que contienen diversos agentes farmacológicos. De este modo, el anticuerpo de F5 o C1 puede unirse directamente a un fármaco que se debe suministrar directamente al tumor. Dichos fármacos los conocen bien los especialistas en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, doxirrubicina, vinblastina, genisteína, moléculas antisentido, ribozimas y similares.
Como alternativa, la molécula efectora puede comprender un sistema de encapsulado, tal como un liposoma, cápsula polimérica, cápsida viral, virus o micela que contiene una composición terapéutica tal como un fármaco, un ácido nucleico (por ejemplo un ácido nucleico antisentido incluyendo, aunque sin limitación, un ácido nucleico proteico) u otro resto terapéutico que preferiblemente está protegido de la exposición directa al sistema circulatorio. Los medios para preparar liposomas unidos a anticuerpos los conocen bien los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.957.735 y el documento Connor et al., (1985) Pharm. Ther., 28: 341-365.
En una realización particularmente preferida, el liposoma es un liposoma "sigiloso" (estéricamente estabilizado) portador de un polímero hidrófilo externo (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)). El anticuerpo puede acoplarse al liposoma a través del polímero hidrófilo como se describe en la solicitud relacionada USSN 08/665.202.
E) Unión del anticuerpo de F5 o C1 a la molécula efectora
Un especialista en la técnica entenderá que el anticuerpo de F5 o C1 y la molécula efectora pueden unirse conjuntamente en cualquier orden. De este modo, la molécula efectora puede unirse a los extremos amino o carboxilo del anticuerpo de F5 o C1. El anticuerpo de F5 o C1 también puede unirse a una región interna de la molécula efectora o a la inversa, la molécula efectora puede unirse a un punto interno del anticuerpo de F5 o C1 siempre que la unión no interfiera en las respectivas actividades de las moléculas.
El anticuerpo de F5 o C1 y la molécula efectora pueden unirse mediante cualquiera de varios medios bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, la molécula efectora se conjuga, directamente o a través de un enlazador (separador) al anticuerpo de F5 o C1. Sin embargo, cuando la molécula efectora es un polipéptido, es preferible expresar de forma recombinante la molécula quimérica como una proteína de fusión de cadena sencilla.
i) Conjugación de la molécula efectora con el anticuerpo de F5 o C1
En una realización, la molécula guía del anticuerpo de F5 o C1 se conjuga químicamente a la molécula efectora (por ejemplo, una citotoxina, una marca, un ligando o un fármaco o liposoma). Los medios para conjugar moléculas los conocen bien los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, el Capítulo 4 en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y Lennox, eds. John wiley & Sons, Inc. N.Y. (1995) que describe la conjugación de anticuerpos con fármacos anti-cáncer, marcas incluyendo radiomarcas, enzimas y similares).
El procedimiento para unir un agente a un anticuerpo u otra molécula guía polipeptídica variará de acuerdo con la estructura química del agente. Los polipéptidos contienen típicamente diversos grupos funcionales; por ejemplo, ácido carboxílico (COOH) o grupos amino libres (-NH_{2}), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en una molécula efectora para unir el efector a estos.
Como alternativa, la molécula guía y/o molécula efectora puede derivatizarse para exponer o atacar a grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede incluir la unión de cualquiera de varias moléculas enlazadoras tales como las disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.
Un "enlazador", como se usa en este documento, es una molécula que se usa para unir la molécula guía a la molécula efectora. En enlazador es capaz de formar enlaces covalentes con la molécula guía y la molécula efectora. Los enlazadores adecuados los conocen bien los especialistas en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores de carbono heterocíclicos o enlazadores peptídicos. Cuando la molécula guía y la molécula efectora son polipéptidos, los enlazadores pueden unirse a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un puente disulfuro a cisteína). Sin embargo, en una realización preferida, los enlazadores se unirán a los grupos amino y carboxilo del carbono alfa de los aminoácidos terminales.
Un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo o un agente particular y otro grupo reactivo con un anticuerpo, puede usarse para formar el inmunoconjugado deseado. Como alternativa, la derivatización puede implicar tratamiento químico de la molécula guía, por ejemplo, escisión con glicol de un resto de azúcar unido al anticuerpo proteico con peryodato para generar grupos aldehído libres. Los grupos aldehído libres en el anticuerpo pueden hacerse reaccionar con grupos amina o hidrazina libres en un agente para unir el agente a estos. (Véase Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958). También se conocen procedimientos para la generación de grupos sulfhidrilo libres en el polipéptido, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (Véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.659.839).
Se conocen muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para la unión de diversos compuestos incluyendo quelatos metálicos de radionúclidos, toxinas y fármacos a proteínas tales como anticuerpos. Véase por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea Nº 188.256; Patentes de Estados Unidos Nº 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; 4.569.789; y 4.589.071; y el documento Borlinghaus et al., Cancer Res. 47: 4071-4075 (1987). En particular, la producción de diversas inmunotoxinas se conoce bien en la técnica y puede encontrarse por ejemplo en los documentos "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet" Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, págs. 168-190 (1982), Waldmann, Science, 252: 1657 (1991), Patentes de Estados Unidos Nº 4.545.985 y 4.894.443.
En algunas circunstancias, es deseable liberar la molécula efectora de la molécula guía cuando la molécula quimérica ha alcanzado su sitio diana. Por lo tanto, pueden usarse conjugados quiméricos que comprenden enlaces que pueden escindirse en las proximidades del sitio diana, cuando el efector debe liberarse en el sitio diana. La escisión del enlace para liberar el agente del anticuerpo puede promoverse mediante actividad enzimática o condiciones a las que se somete el inmunoconjugado dentro de la célula diana o en las proximidades del sitio diana. Cuando el sitio diana es un tumor, puede usarse un enlazador que puede escindirse en condiciones presentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando se expone a enzimas asociadas al tumor o a pH ácido).
Los especialistas en la técnica conocen varios enlazadores escindibles diferentes. Véase las Patentes de Estados Unidos Nº 4.618.492; 4.542.225 y 4.625.014. Los mecanismos para la liberación de un agente de estos grupos enlazadores incluyen, por ejemplo, irradiación de un enlace fotolábil e hidrólisis catalizada por ácidos. La Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958, por ejemplo, incluye una descripción de inmunoconjugados que comprenden enlazadores que se escinden en el sitio diana in vivo mediante las enzimas proteolíticas del sistema del complemento del paciente. En vista del gran número de métodos que se han presentado para unir diversos compuestos de radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, fármacos, toxinas y otros agentes a anticuerpos, un especialista en la técnica será capaz de determinar un método adecuado para unir un agente dado a un anticuerpo o a otro polipéptido.
ii) Producción de proteínas de fusión
Cuando el anticuerpo de F5 o C1 y/o las moléculas efectoras son relativamente cortos (es decir menos de aproximadamente 50 aminoácidos) pueden sintetizarse usando técnicas químicas de síntesis peptídica convencionales. Cuando ambas moléculas son relativamente cortas, la molécula quimérica puede sintetizarse como un único polipéptido contiguo. Como alternativa, los anticuerpos de F5 o C1 y la molécula efectora pueden sintetizarse por separado y después fusionarse mediante condensación del extremo amino de una molécula con el extremo carboxilo de la otra molécula formando de este modo un enlace peptídico. Como alternativa, Las moléculas guía y efectora pueden condensarse cada una con un extremo de una molécula separadora peptídica formando de este modo una proteína de fusión contigua.
La síntesis en fase sólida en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los restantes aminoácidos en la secuencia es el método preferido para la síntesis química de los polipéptidos de esta invención. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963) y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis 2ª ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984).
En una realización preferida, las proteínas de fusión quiméricas de la presente invención se sintetizan usando metodología de ADN recombinante. Generalmente, esto implica crear una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión, colocar el ADN en una casete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar la proteína en un hospedador, aislar la proteína expresada y, en caso necesario, renaturalizar la proteína.
El ADN que codifica las proteínas de fusión (por ejemplo, Ab de F5 o C1-PE) de esta invención puede prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo por ejemplo clonación y restricción de secuencias apropiadas o síntesis química directa mediante métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; y el método del soporte sólido de la Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066.
La síntesis química produce un oligonucleótido de cadena sencilla. Éste puede convertirse en ADN de cadena doble mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla como plantilla. Un especialista en la técnica reconocería que aunque la síntesis química de ADN está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas mediante el ligamiento de secuencias más cortas.
Como alternativa, pueden clonarse subsecuencias y escindirse las subsecuencias apropiadas usando enzimas de restricción apropiadas. Los fragmentos pueden ligarse después para producir la secuencia de ADN deseada.
En una realización preferida, el ADN que codifica proteínas de fusión de la presente invención puede clonarse usando métodos de amplificación de ADN tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). De este modo, por ejemplo, el gen para el anticuerpo de F5 o C1 puede amplificarse a partir de una plantilla de ácido nucleico (clon) usando un cebador sentido que contiene un primer sitio de restricción y un cebador antisentido que contiene un segundo sitio de restricción. Esto produce un ácido nucleico que codifica la secuencia madura del anticuerpo de F5 o C1 y que tiene sitios de restricción terminales. Una citotoxina (u otro efector polipeptídico) puede cortarse a partir de un plásmido que codifica ese efector usando enzimas de restricción para producir extremos cortados adecuados para hibridar con el anticuerpo de F5 o C1. El ligamiento de las secuencias y la introducción del constructo en un vector producen un vector que codifica la proteína de fusión F5- o C1-molécula efectora. Dichos métodos de clonación por PCR los conocen bien los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento Debinski et al., (1994) Int. J. Cancer, 58: 744-748, para un ejemplo de la preparación de una proteína de fusión a PE).
Aunque las dos moléculas pueden unirse de forma conjunta directamente, un especialista en la técnica entenderá que las moléculas pueden estar separadas mediante un separador peptídico constituido por uno o más aminoácidos. Generalmente el separador no tendrá actividad biológica específica diferente de unir las proteínas o conservar alguna distancia mínima u otra relación espacial entre ellas. Sin embargo, los aminoácidos constituyentes del separador pueden seleccionarse para influir en alguna propiedad de la molécula tal como el plegamiento, carga neta o hidrofobicidad. Un especialista en la técnica entenderá que pueden seleccionarse cebadores de PCR para introducir un enlazador o separador de aminoácidos entre el anticuerpo de F5 o C1 y la molécula efectora, si se desea.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión pueden expresarse en diversas células hospedadoras, incluyendo E. coli, otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares de mieloma. El gen de la proteína recombinante se unirá de forma operativa a secuencias de control de la expresión apropiadas para cada hospedador. Para E. coli esto incluye un promotor tal como los promotores T7, trp o lambda, un sitio de unión al ribosoma y preferiblemente una señal de terminación de la transcripción. Para células eucariotas, las secuencias de control incluirán un promotor y preferiblemente un potenciador obtenido de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc. y una secuencia de poliadenilación y pueden incluir secuencias donadoras y aceptoras de corte y empalme.
Los plásmidos de la invención pueden transferirse a la célula hospedadora seleccionada mediante métodos bien conocidos tales como transformación con cloruro cálcico para E. coli y tratamiento con fosfato cálcico o electroporación para células de mamífero. Las células transformadas con los plásmidos pueden seleccionarse mediante resistencia a antibióticos otorgada por los genes contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp, gpt, neo e hyg.
Una vez expresadas, las proteínas de fusión recombinantes pueden purificarse de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). En una realización preferida, las proteínas de fusión se purifican usando métodos de purificación por afinidad como se describen en los Ejemplos 1 y 2. Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 al 95% de homogeneidad y se prefieren más del 98 al 99% o más homogeneidad para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta una homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden usarse entonces terapéuticamente.
Un especialista en la técnica reconocería que después de la síntesis química, expresión biológica o purificación, la proteína de fusión anticuerpo de F5 o C1-efector puede poseer una conformación sustancialmente diferente a las conformaciones nativas de los polipéptidos constituyentes. En este caso, puede ser necesario desnaturalizar y reducir el polipéptido y después provocar el replegamiento del polipéptido en la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar proteínas e inducir el replegamiento los conocen bien los especialistas en la técnica (Véase los documentos, Debinski et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 14065-14070; Kreitman y Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; y Buchner et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270. Debinski et al., por ejemplo, describen la desnaturalización y reducción de proteínas de cuerpos de inclusión en guanidina-DTE. La proteína se repliega después en un tampón redox que contiene glutatión oxidado y L-arginina.
Un especialista en la técnica reconocería que pueden realizarse modificaciones a las proteínas de fusión anticuerpo de F5 o C1-efector sin disminuir su actividad biológica. Pueden realizarse algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula quía en una proteína de fusión. Dichas modificaciones las conocen bien los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de inicio o aminoácidos adicionales situados en cualquier extremo para crear sitios de restricción o codones de terminación convenientemente situados.
VI. Ensayos de Diagnóstico
Los ensayos de diagnóstico in vivo no forman parte de la presente invención.
Como se ha explicado anteriormente pueden usarse anticuerpos de F5 o C1 para la detección y/o cuantificación in vivo o in vitro de c-erbB-2 y de este modo, en el diagnóstico y/o localización de cánceres caracterizados por la expresión de c-erbB-2.
A) Detección in vivo de c-erB-2
Los anticuerpos de F5 y C1 y/o moléculas quiméricas de la presente invención pueden usarse para la detección y localización in vivo de células (por ejemplo carcinoma positivo para c-erbB-2) portadoras de c-erbB-2. Dicha detección implica administrar a un organismo una molécula quimérica que comprende un anticuerpo de F5 o C1 unido a una marca detectable in vivo. Dichas marcas las conocen bien los especialistas en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, marcas densas a electrones tales como oro o bario que pueden detectarse mediante rayos X y TAC, diversas marcas radiactivas que pueden detectarse usando gammagrafía (centellografía) y diversos materiales magnéticos y paramagnéticos que pueden detectarse usando tomografía de emisión de positrones (PET) y resonancia magnética nuclear (RMN). El anticuerpo de F5 o C1 asocia la marca con la célula portadora de c-erbB-2 que después se detecta y localiza usando el método de detección apropiado.
B) Detección in vitro de c-erB-2
Los anticuerpos de F5 o C1 de esta invención también son útiles para la detección de c-erbB-2 in vitro, por ejemplo en muestras biológicas obtenidas de un organismo. La detección y/o cuantificación de c-erbB-2 en dicha muestra es indicativa de la presencia o ausencia o cantidad de células (por ejemplo, células tumorales) que sobreexpresan c-erbB-2.
El antígeno c-erbB-2 puede cuantificarse en una muestra biológica obtenida de un paciente tal como una célula o una muestra de tejido obtenida de un paciente. Como se usa en este documento, una muestra biológica es una muestra de tejido o fluido biológico que contiene una concentración de antígeno c-erbB-2 que puede correlacionarse con y es indicativa de células que sobreexpresan c-erbB-2. Las muestras biológicas preferidas incluyen sangre, orina y biopsias de tejido.
En una realización particularmente preferida, erB-2 se cuantifica en células de tejido de mama obtenidas de muestras de tejido de mama normal o maligno. Aunque la muestra típicamente se toma de un paciente humano, los ensayos pueden usarse para detectar erB-2 en células de mamíferos en general, tales como perros, gatos, ovejas, vacas y cerdos y más particularmente primates tales como seres humanos, chimpancés, gorilas, macacos y babuinos y roedores tales como ratones, ratas y conejillos de indias.
Se aíslan muestras de tejido o fluidos de un paciente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos por los especialistas en la técnica, más típicamente mediante biopsia o venopunción. La muestra se pretrata opcionalmente según sea necesario mediante dilución en una solución o concentrado de tampón apropiado, si se desea. Puede usarse cualquiera de varias soluciones acuosas tamponadas convencionales, que emplean uno de diversos tampones, tales como fosfato, Tris o similares, a pH fisiológico.
C) Formatos de Ensayo (Detección o Cuantificación de c-erbB-2) 1) Ensayo de Unión Inmunológicos
El péptido c-erB-2 (analito) o un anticuerpo anti-c-erb-2 se detecta preferiblemente en un inmunoensayo que utiliza un anticuerpo de F5 o C1 como agente de captura que se une específicamente a un péptido c-erbB-2.
Como se usa en este documento, un inmunoensayo es un ensayo que utiliza un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo de F5 o C1) para unirse específicamente a un analito (por ejemplo, c-erb-2). El inmunoensayo se caracteriza por el uso de unión específica a un anticuerpo de F5 o C1 en oposición a otras propiedades físicas o químicas para aislar, dirigirse a y cuantificar el analito c-erB-2.
El marcador c-erbB-2 puede detectarse y cuantificarse usando cualquiera de varios ensayos de unión inmunológicos bien reconocidos (Véase por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168) para una revisión de los inmunoensayos generales, véase también los documentos Methods in Cell Biology Volumen 37: Antibodies in Cell Biology, Asai ed. Academic Press, inc. Nueva York (1993); Basic and Clinical Immunology 7ª edición, Sties & Terr, eds. (1991)).
Los inmunoensayos de la presente invención se realizan en cualquiera de varias configuraciones, por ejemplo, las revisadas en los documentos Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Harlow y Lane, supra; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (ed.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Non isotopic immunoassays Plenum Press, NY.
Los inmunoensayos a menudo utilizan un agente de marcado para unir específicamente a y marcar el complejo de unión formado por el agente de captura y el analito (es decir, un complejo anticuerpo de F5 o C1-erB-2). El propio agente de marcado puede ser uno de los restos que comprende el complejo anticuerpo/analito. De este modo, el agente de marcado puede ser un péptido c-erB-2 marcado o un anticuerpo de F5 o C1 marcado. Como alternativa, el agente de marcado es opcionalmente un tercer resto, tal como otro anticuerpo, que se une específicamente al anticuerpo de F5 o C1, al péptido c-erB-2, al complejo anticuerpo anti-c-erB-2/péptido c-erB-2 o a un grupo de captura modificado (por ejemplo, biotina) que está unido covalentemente a c-erB-2 o al anticuerpo de F5 o C1.
En una realización, el agente de marcado es un anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo de F5 o C1. Dichos agentes los conocen bien los especialistas en la técnica y más típicamente comprenden anticuerpos marcados que se unen específicamente a anticuerpos de las especies animales particulares de las que se obtiene el anticuerpo de F5 o C1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-especie). De este modo, por ejemplo, cuando el agente de captura es un anticuerpo de F5 o C1 obtenido de un ser humano, el agente de marcado puede ser una IgG anti-humano de ratón, es decir un anticuerpo específico para la región constante del anticuerpo humano.
Otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tales como proteína A o proteína G de estreptococos también se usan como agente de marcado. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de bacterias de tipo estreptococos. Éstas exhiben una fuerte reactividad no inmunogénica con regiones constantes de inmunoglobulina de diversas especies. Véase, en general, los documentos Kronval et al., (1973) J. Immunol., 111: 1401-1406 y Akerston et al., (1985) J. Immunol., 135: 2589-2542.
En el curso de los ensayos, pueden ser necesarias etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar entre aproximadamente 5 segundos y varias horas, preferiblemente entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el periodo de incubación dependerá del formato de ensayo, analito, volumen de solución, concentraciones y similares. Normalmente, los ensayos se realizan a temperatura ambiente, aunque pueden realizarse en un intervalo de temperaturas, tal como de 5ºC a 45ºC.
a) Formatos de ensayo no competitivo
Los inmunoensayos para detectar c-erb-2 son típicamente competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que se mide directamente la cantidad de analito capturado (en este caso, c-erb-2). En un ensayo de "sándwich" preferido, por ejemplo, el agente de captura (por ejemplo, anticuerpo de F5 o C1) se une directa o indirectamente a un sustrato sólido donde se inmoviliza. Estos anticuerpos de F5 o C1 inmovilizados capturan el c-erb-2 presente en una muestra de ensayo (por ejemplo, una muestra biológica obtenida de tejido tumoral de mama). Al c-erb-2 inmovilizado de este modo se le une después un agente de marcado, tal como un segundo anticuerpo para c-erb-2 portador de una marca. Como alternativa, el segundo anticuerpo puede carecer de marca, pero a su vez, puede unírsele un tercer anticuerpo marcado específico para anticuerpos de las especies de las que se obtiene el segundo anticuerpo. El anticuerpo marcado libre se retira mediante lavado y el restante anticuerpo marcado unido se detecta (por ejemplo, usando un detector gamma cuando la marca es radiactiva). Un especialista en la técnica entenderá que el analito y el agente de captura se invierten opcionalmente en el ensayo anterior, por ejemplo cuando hay que medir la presencia, cantidad o avidez de un anticuerpo de F5 o C1 en una muestra, mediante su unión a un péptido c-erb-2 inmovilizado.
b) Formatos de ensayo competitivos
En ensayos competitivos, la cantidad de analito (por ejemplo, c-erB-2) presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un analito añadido (exógeno) desplazado (o alejado por competencia) de un agente de captura (por ejemplo, anticuerpo de F5 o C1) por el analito presente en la muestra. En un ensayo competitivo, se añade una cantidad conocida de c-erb-2 a una muestra de ensayo con una cantidad no cuantificada de c-erB-2 y la muestra se pone en contacto con un agente de captura, por ejemplo un anticuerpo de F5 o C1 que se une específicamente a c-erb-2. La cantidad de c-erB-2 añadida que se une al anticuerpo de F5 o C1 es inversamente proporcional a la concentración de c-erB-2 presente en la muestra de ensayo.
El anticuerpo de F5 o C1 puede inmovilizarse en un sustrato sólido. La cantidad de erB-2 unido al anticuerpo de F5 o C1 se determina midiendo la cantidad de erB-2 presente en un complejo de erB-2-anticuerpo de C6 o como alternativa midiendo la cantidad de erB-2 que sigue sin complejar. Análogamente, en algunas realizaciones en las que se conoce la cantidad de erB-2 en una muestra y hay que determinar la cantidad o avidez de un anticuerpo de F5 o C1, erB-2 se convierte en el agente de captura (por ejemplo, se fija a un sustrato sólido) y el anticuerpo de F5 o C1 se convierte en el analito.
c) Reducción de la Unión no Específica
Un especialista en la técnica entenderá que a menudo es deseable reducir la unión no específica en inmunoensayos y durante la purificación de analitos. Cuando el ensayo implica c-erB-2, anticuerpo de F5 o C1 u otro agente de captura inmovilizado en un sustrato sólido, es deseable minimizar la cantidad de unión no específica al sustrato. Los medios para reducir dicha unión no específica los conocen bien los especialistas en la técnica. Típicamente, esto implica revestir el sustrato con una composición que contiene proteínas. En particular, se usan ampliamente composiciones de proteínas tales como albúmina de suero bovino (BSA), leche desnatada en polvo y gelatina.
d) Sustratos
Como se ha mencionado anteriormente, dependiendo del ensayo, diversos componentes, incluyendo erB-2, F5 o C1 o anticuerpos para erB-2 o de F5 o C1 se unen opcionalmente a una superficie sólida. En la técnica se conocen muchos métodos para inmovilizar biomoléculas en diversas superficies sólidas. Por ejemplo, la superficie sólida puede ser una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa), una placa de microtitulación (por ejemplo, PVC, polipropileno o poliestireno), un tubo de ensayo (de vidrio o plástico) una varilla tipo "dipstick" (por ejemplo, vidrio, PVC, polipropileno, poliestireno, látex y similares) un tubo de microcentrífuga o una perla de vidrio, sílice, plástico metálica o polimérica. El componente deseado puede unirse covalentemente o no covalentemente a través de una unión no específica.
Puede emplearse una gran diversidad de polímeros orgánicos e inorgánicos, tanto naturales como sintéticos como material para la superficie sólida. Los polímeros ilustrativos incluyen polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etilen tereftalato), rayón, nylon, poli(vinil butirato), difluoruro de polivinilideno (PVDF), siliconas, poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa y similares. Otros materiales que pueden emplearse incluyen papel, vidrios, cerámica, metales, metaloides, materiales semiconductores, cementos o similares. Además, pueden usarse sustancias que forman geles, tales como proteínas (por ejemplo, gelatinas), lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas. Los polímeros que forman varias fases acuosas, tales como dextranos, polialquilenglicoles o tensioactivos, tales como fosfolípidos, sales de alquil amonio de cadena larga (12-24 átomos de carbono), también son adecuados. Cuando la fase acuosa es porosa, pueden emplearse diversos tamaños de poro dependiendo de la naturaleza del sistema.
Al preparar la superficie, puede emplearse una pluralidad de diferentes materiales, por ejemplo como laminados, para obtener diversas propiedades. Por ejemplo, pueden usarse revestimientos de proteínas tales como gelatina, para evitar la unión no específica, simplificar la conjugación covalente, potenciar la detección de señales o similares.
Si se desea la unión covalente entre un compuesto y la superficie, la superficie normalmente será polifuncional o será capaz de polifuncionalizarse. Los grupos funcionales que pueden estar presentes en la superficie y usarse para enlazar pueden incluir ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y similares. La manera de enlazar una gran diversidad de compuestos a diversas superficies se conoce bien y se ilustra ampliamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, los documentos Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York, 1978 y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 3059 (1970).
Además de la formación de enlaces covalentes, pueden usarse diversos métodos para unir de forma no covalente un componente de ensayo. La unión no covalente es típicamente adsorción no específica de un compuesto a la superficie. Típicamente, la superficie se bloquea con un segundo compuesto para evitar la unión no específica de componentes de ensayo marcados. Como alternativa, la superficie se diseña de modo que se una de forma no específica un componente pero no se una significativamente a otro. Por ejemplo, una superficie portadora de una lectina tal como concanavalina A se unirá a un compuesto que contiene carbohidratos pero no a una proteína marcada que carece de glicosilación. Diversas superficies sólidas para su uso en la unión no covalente de componentes de ensayo se revisan en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.447.576 y 4.254.082.
2) Otros Formatos de Ensayo
Los polipéptidos de c-erB-2 o anticuerpos de F5 o C1 también pueden detectarse y cuantificarse mediante cualquiera de varios otros medios bien conocidos por los especialistas en la técnica. Estos incluyen métodos bioquímicos analíticos tales como espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión y similares y diversos métodos inmunológicos tales como reacciones de precipitación en gel o fluido, inmunodifusión (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA) ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes y similares.
El análisis de transferencia de Western y métodos relacionados también pueden usarse para detectar y cuantificar la presencia de péptidos erB-2 y anticuerpos de F5 o C1 en una muestra. La técnica generalmente comprende separar productos de la muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transferir los productos separados a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon o un filtro de nylon derivatizado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente al péptido erB-2 o al anticuerpo anti-erB-2. Los anticuerpos se unen específicamente al agente biológico de interés en el soporte sólido. Estos anticuerpos están marcados directamente o como alternativa son detectados posteriormente usando anticuerpos marcados (por ejemplo, anticuerpos de oveja anti-humanos marcados en los que el anticuerpo para un gen marcador es un anticuerpo humano) que se unen específicamente al anticuerpo que se une al anticuerpo anti-erB-2 o a erB-2, según sea apropiado.
Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos con liposomas (LIA), que usan liposomas diseñados para unirse a moléculas específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. Los productos químicos liberados se detectan después de acuerdo con técnicas convencionales (véase el documento, Monroe et al., (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41).
VII. Composiciones Farmacéuticas
Los anticuerpos de F5 y C1 y moléculas quiméricas de esta invención son útiles para la preparación de composiciones farmacéuticas para administración parenteral, tópica, oral o local, tal como mediante aerosol o por vía transdérmica, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas pueden ser para administración en diversas formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, formas de dosificación unitaria adecuadas para administración oral incluyen polvo, comprimidos, píldoras, cápsulas y grageas. Se reconoce que las proteínas de fusión y composiciones farmacéuticas de esta invención, cuando son para administración oral, deben protegerse frente a la digestión. Esto se consigue típicamente complejando la proteína con una composición para hacerla resistente a hidrólisis ácida y enzimática envasando la proteína en un vehículo apropiadamente resistente tal como un liposoma. En la técnica se conocen bien medios para proteger proteínas frente a la digestión.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para administración parenteral, tal como administración intravenosa o administración en una cavidad corporal u en la luz de un órgano. Las composiciones para administración comúnmente comprenderán una solución de la molécula quimérica disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Pueden usarse diversos vehículos acuosos, por ejemplo solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente sin materia no deseada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración de molécula quimérica en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado y las necesidades del paciente.
Por lo tanto, una composición farmacéutica típica para administración intravenosa sería para administración a aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente y día. Pueden formularse dosificaciones desde 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente por día para uso, particularmente cuando el fármaco es para administración a un sitio aislado y no en el torrente sanguíneo, tal como en una cavidad corporal o en la luz de un órgano. Los métodos para preparar composiciones administrables por vía parenteral los conocerán o serán evidentes para los especialistas en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remintong's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).
Las composiciones que contienen las presentes proteínas de fusión o un cóctel de las mismas (es decir, con otras proteínas) pueden ser para administración en tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son para administración a un paciente que padece una enfermedad, típicamente un carcinoma positivo para c-erbB-2, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente.
Pueden formularse composiciones para administraciones únicas o múltiples de las composiciones para administración dependiendo de la dosificación y frecuencia según sea necesario y tolerado por el paciente. En cualquier caso, la composición debe proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar eficazmente al paciente.
Entre diversos usos de las proteínas de fusión citotóxicas de la presente invención, se incluyen formulaciones para diversos estados de enfermedad causados por células humanas específicas que pueden eliminarse mediante la acción tóxica de la proteína. Una aplicación es la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, tal como mediante el uso de un anticuerpo de F5 o C1 unido a una citotoxina.
Otro enfoque implica el uso de un ligando que se une a un marcador (receptor) de la superficie celular de modo que las células asociadas a la molécula quimérica portadoras del sustrato ligando se asocian con la célula tumoral que sobreexpresa c-erbB-2. La porción del ligando de la molécula se selecciona de acuerdo con el uso pretendido. Las proteínas en las membranas de células T que pueden servir como dianas para el ligando incluyen FcI, FcII y FcIII, CD2 (T11), CD3, CD4 y CD8. Las proteínas que se encuentran de forma predominante en células B que pueden servir como dianas incluyen CD10 (antígeno CALLA), CD19 y CD20. CD45 es una posible diana que se produce en gran medida en células linfoides. Éstas y otras posibles moléculas diana de linfocitos diana para las moléculas quiméricas portadoras de un ligando efector se describen en el documento Leukocyte Typing III, A.J. McMichael, ed., Oxfor University Press (1987). Los especialistas en la técnica se darán cuenta de que pueden seleccionarse ligandos efectores que se unen a receptores expresados en otros tipos de células como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, glicoproteínas de membrana o ligandos o receptores hormonales tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico y similares.
VIII. Kits para Diagnóstico o Tratamiento
En otra realización, esta invención proporciona kits para el tratamiento de tumores o para la detección de células que sobreexpresan c-erbB-2. Los kits comprenderán típicamente una molécula quimérica de la presente invención (por ejemplo, anticuerpo de F5 y/o C1-marca, anticuerpo de F5 y/o C1-citotoxina, anticuerpo de F5 y/o C1-ligando, etc.). Además, los kits pueden incluir opcionalmente material didáctico que contiene instrucciones (por ejemplo, protocolos) que describen medios de uso de la(s) molécula(s) quimérica(s) (por ejemplo, como una citotoxina, para la detección de células tumorales, para aumentar una respuesta inmune, etc.). Aunque el material didáctico típicamente comprende material escrito o impreso, no se limita a estos. Cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicárselas a un usuario final está contemplado por esta invención. Dichos medios incluyen, aunque sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips) medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM) y similares. Dichos medios pueden incluir direcciones de páginas Web que proporcionan dicho material didáctico.
Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la que se ha diseñado el kit. De este modo, por ejemplo, cuando un kit contiene una molécula quimérica en la que la molécula efectora es una marca detectable, el kit puede contener adicionalmente medios para detectar la marca (por ejemplo, sustratos enzimáticos para marcas enzimáticas, juegos de filtros para detectar marcas fluorescentes, marcas secundarias apropiadas tales como anticuerpos de oveja anti-humanos o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros reactivos usados de forma rutinaria para la práctica de un método particular. Dichos kits y contenidos apropiados los conocen bien los especialistas en la técnica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.
Ejemplo 1 Creación de 2 bibliotecas de anticuerpos en fagos Fab humanos no inmunes que contienen 10^{9}-10^{11} miembros
La manipulación de bibliotecas de presentación en fagos de 10^{7} miembros previas mostró dos principales limitaciones: 1) los niveles de expresión de Fab eran demasiado bajos para producir material adecuado para caracterización y 2) la biblioteca era relativamente inestable. Estas limitaciones son el resultado de la creación de la biblioteca en un vector en fagos y el uso del sistema de recombinación cre-lox. Por lo tanto, decidimos que el mejor enfoque para este proyecto era crear una biblioteca de scFv muy grande usando un vector fagémido. El objetivo era producir una biblioteca al menos 100 veces más grande que nuestra anterior biblioteca de scFv de 3,0 x 10^{7} miembros. El enfoque tomado era clonar la biblioteca de V_{H} y V_{L} en replicones diferentes, combinarlos en un repertorio génico de scFv mediante corte y empalme mediante extensión por solapamiento y clonar el repertorio génico de scFv en el vector de presentación en fagos pHEN1. Se sensibilizaron linfocitos de sangre periférica humana y ARN esplénico con la región constante de cadena pesada de IgM y se sintetizaron cebadores de la región constante de cadena ligera kappa y lambda y ADNc de cadena sencilla. Se uso ADNc de cadena sencilla como plantilla para amplificación por PCR de repertorios génicos de VH V\kappa\kappa y V\lambda.
Los repertorios génicos de V_{H} se clonaron en el vector pUC119Sfi-Not como fragmentos Nco1-NotI, para crear una biblioteca de 8,0 x 10^{8} miembros. La biblioteca se diversificó mediante identificación genética por PCR. El ADN enlazador de cadena sencilla se cortó y empalmó en los repertorios génicos de V_{L} usando PCR y el repertorio se clonó como un fragmento XhoI-NotI en el vector pHENIXscFv para crear una biblioteca de 7,2 x 10^{6} miembros. Los repertorios génicos de V_{H} y V_{L} se amplificaron a partir de sus respectivos vectores y se cortaron y empalmaron juntos usando PCR para crear un repertorio génico de scFv. El repertorio génico de scFv se clonó como un fragmento NcoI-NotI en el vector para crear una biblioteca de anticuerpos en fagos de scFv de 7,0 x 10^{9} miembros. La biblioteca era diversa según lo determinado mediante identificación genética con BstN1.
Para verificar la calidad de la biblioteca, se prepararon y seleccionaron fagos en 14 antígenos proteicos diferentes. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Se obtuvieron anticuerpos de scFv contra todos los antígenos usados para la selección, con entre 3 y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
TABLA 1 Resultados de selecciones de bibliotecas de anticuerpos en fagos. Para cada antígeno (columna 1), se indica el número y el porcentaje de clones positivos seleccionados (columna 2) y el número de diferentes anticuerpos aislados (columna 3)
1
15 únicos scFv aislados por antígeno (media 8,7) (Tabla 1). Esto se compara favorablemente con resultados obtenidos de bibliotecas de scFv más pequeñas (de 1 a varios anticuerpos de unión obtenidos contra solamente el 70% de antígenos usados para selección). Se midieron las afinidades de 4 scFv anti-ErbB-2 y 4 scFv anti-Botulinum usando resonancia de plasmón superficial en BIAcore y se descubrió que variaban entre 4,0 x 10^{-9} M y 2,2 x 10^{-10} M para el scFv anti-ErbB-2 y entre 2,6 x 10^{-8} M y 7,15 x 10^{-8} M para el scFv anti-Botulinum (Tabla 2). Los scFv eran altamente específicos para el antígeno usado para la selección (Figura 2). La biblioteca también podía seleccionarse con éxito en mezclas complejas de antígeno.
\newpage
TABLA 2 Afinidades y cinéticas de unión de scFv anti-fragmento C de BoNT A y anti-Erb-B2. Se midieron las constantes de velocidad de asociación (K_{on}) y disociación (K_{off}) para scFv purificados usando resonancia de plasmón superficial y K_{d} se calculó como (K_{off}/K_{on})
2
Por ejemplo, la selección de cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis (el organismo causante de la enfermedad clamidial) produjo siete que reconocían específicamente a clamidia (Tabla 1 y Figura 3). Los scFv podían usarse con éxito en varios ensayos inmunológicos incluyendo ELISA, inmunofluorescencia, transferencia de Western, mapeo de epítopos e inmunoprecipitación. El número de anticuerpos de unión para cada antígeno y las afinidades de los scFv de unión son comparables a los resultados obtenidos de las mejores bibliotecas de anticuerpos en fagos (Tabla 3). Por lo tanto, la biblioteca se estableció como una fuente de paneles de anticuerpos humanos contra cualquier antígeno con afinidades al menos equivalentes a la respuesta secundaria en ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
TABLA 3 Comparación de anticuerpos de unión a proteínas seleccionados de bibliotecas de anticuerpos de presentación en fagos no inmunes. * Para el tipo de biblioteca, N = repertorios génicos de V obtenidos de genes de V que se reordenaron in vivo; SS = genes V semi-sintéticos construidos a partir de segmentos de genes V clonados y oligonucleótidos sintéticos que codifican CDR3 de V_{H}. ND = sin determinar 
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos demuestran la creación de una biblioteca de anticuerpos en fagos de scFv humanos de alta complejidad a partir de la cual puede generarse un panel de scFv humanos de alta afinidad contra cualquier antígeno purificado. Dicha biblioteca es ideal para sondear la superficie de células para identificar nuevos marcadores de la superficie celular.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo 2 Captación de scFv en células mediante endocitosis mediada por receptor y la posterior recuperación
La biblioteca de anticuerpos en fagos de scFv de 7,0 x 10^{9} miembros descrita anteriormente se seleccionó en las líneas celulares tumorales de mama malignas MB231 y ZR-75-1, ambas con y sin selecciones negativas en la línea celular de mama normal HBL100. Se obtuvieron resultados similares como se describe en la sección anterior. Se aislaron scFv que no podían distinguir líneas celulares malignas de no malignas.
Para aumentar la especificidad de las selecciones, se formuló la hipótesis de que los receptores de la superficie celular de unión a fagos podían captarse al interior de las células mediante endocitosis mediada por receptor y después podían recuperarse de las células lisando las células. Esto suponía que: 1) ese fago podía internalizarse mediante endocitosis mediada por receptor y 2) ese fago podía recuperarse en estado infeccioso del interior de las células antes de la degradación lisosomal. La capacidad de seleccionar anticuerpos de fago internalizados podría tener dos beneficios principales: 1) la identificación de anticuerpos que se unen a receptores capaces de internalización y 2) un nivel añadido de especificidad en el proceso de selección. La identificación de anticuerpos que se internalizan sería muy útil para muchos enfoques terapéuticos dirigidos en los que la internalización es esencial (por ejemplo, inmunotoxinas, liposomas dirigidos, vectores de terapia génica dirigidos y otros).
A) Internalización de fago de F5 o C1 mediada por receptor
Para determinar la eficacia, se utilizaron el fago de C6.5 y el fago de diacuerpo de C6.5 (véase, la solicitud relacionada USSN 08/665.202). Previamente se había demostrado que el C6.5 scFv se internaliza, pero a una velocidad baja y que el diacuerpo de C6.5 de algún modo se internaliza mejor (probablemente debido a que causa la dimerización del receptor). El fago de C6.5, fago del diacuerpo de C6.5 o un fago anti-Botulinum irrelevante se incubaron con células SKBR3 (línea celular tumoral de mama que expresa ErbB2) a 37ºC o 4ºC y los fagos no internalizados se retiraron mediante lavado secuencial con PBS y tampón de glicina a pH bajo. Después, las células se permeabilizaron y se añadió anticuerpo anti-M13 biotinilado seguido de estreptavidina y Rojo Texas. Después se examinaron las células usando un microscopio confocal. El fago de C6.5 y el fago de diacuerpo de C6.5 se observaron dentro del citoplasma. Aproximadamente el 1% de las células habían internalizado fago de C6.5 y el 20% de las células habían internalizado fago del diacuerpo de C6.5. No había internalización del fago anti-Botulinum.
Para determinar si el fago infeccioso podía captarse específicamente y recuperarse del interior de las células, se incubaron el fago de C6.5 y el fago de diacuerpo de C6.5 con células SKBR3 a 37ºC. Los fagos no unidos se retiraron lavando con PBS y los fagos unidos a la superficie celular se eluyeron lavando dos veces con glicina a pH bajo. Después se lisaron las células y cada fracción (el primer y segundo lavados con glicina y la fracción citoplasmática) se usó para infectar E. coli TG1. Veinte veces (C6.5) o 30 veces (diacuerpo de C6.5) más fagos se unieron a la superficie celular que el fago anti-Botulinum (lavado 1 con glicina) (Tabla 4). Después del segundo lavado con glicina, el valor cuantitativo de fagos infecciosos de la superficie celular disminuyó, indicando que el lavado era eficaz para retirar fago unido a la superficie (Tabla 4). Después de la lisis celular, el valor cuantitativo aumentaba más de 10 veces (fago de C6.5) o 50 veces (fago de diacuerpo de C6.5) desde el segundo lavado de glicina. Creemos que este valor cuantitativo representa fagos recuperados del interior de la célula. La recuperación del fago del interior de la célula era 100 veces mayor para el fago de C6.5 de unión a ErbB2 que para el fago anti-Botulinum y 200 veces mayor para el fago de diacuerpo de C6.5 (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Valor cuantitativo de fago unido a la superficie celular y fago internalizado. 5,0 x 10^{11} fagos (anti-Botulinum o anti-ErbB2) se incubaron con aproximadamente 1,0 x 10^{5} células SKBR3 que expresaban ErbB2 a 37ºC. Las células se lavaron 10 veces con PBS y los fagos unidos a la superficie se eluyeron con dos lavados con glicina a pH bajo. Después se lavaron las células una vez con PBS y se lisaron las células para liberar el fago internalizado. El valor cuantitativo del fago se determinó después para cada uno de los lavados de glicina y para la fracción de células lisadas, mediante infección con E. coli TG1
4
Tomados conjuntamente, los resultados indican que: 1) los receptores de la superficie celular de unión a fagos pueden ser captados por células y el fago infeccioso puede recuperarse del citoplasma. La cantidad de captación es significativamente mayor que la captación de fago no unido y la diferencia de 100 a 200 veces está dentro del intervalo que permitiría el enriquecimiento de una biblioteca. Lo que se desconoce a partir de los resultados es si los anticuerpos del fago median en la internalización mediada por receptor o si solamente son captados después de la unión mediante renovación de la membrana.
\global\parskip1.000000\baselineskip
B) Selección y caracterización de anticuerpos de internalización a partir de una biblioteca de anticuerpos en fagos
Los resultados descritos anteriormente nos animaron a intentar la selección de la biblioteca de anticuerpos en fagos descrita anteriormente para identificar nuevos anticuerpos en fagos que se internalizaban. Los anticuerpos en fagos se rescataron de la biblioteca y se seleccionaron en células SKBR3. Para la selección, se incubaron fagos con células a 37ºC, se retiraron los fagos no unidos lavando las células con PBS y los fagos unidos a antígenos de la superficie celular se retiraron mediante lavados secuenciales con glicina a pH bajo. Después se lisaron las células para liberar el fago internalizado y se usó el lisado para infectar E. coli TG1 para preparar fagos para la siguiente ronda de selección. Se realizaron tres rondas de selección. Se analizó la unión a células SKBR3 y al dominio extracelular de ErbB2 de cien clones para cada ronda de selección mediante ELISA. Se formuló la hipótesis de que era probable obtener anticuerpos de unión a ErbB2 puesto que se sabe que las células SKBR3 expresan altos niveles y ErbB2 es un receptor que se sabe que se internaliza. Después de cada ronda de selección, el valor cuantitativo de fagos recuperados del citoplasma aumentaba (Tabla 5). Después de la tercera ronda, el 45% de los clones eran positivos para la unión a células SKBR3 y el 17% se unían a ErbB2 (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Resultados de selección de una biblioteca de anticuerpos en fagos para internalización. Para cada ronda de selección, se indica el valor cuantitativo de fago en células lisadas, número de células lisadas y número de fagos por células. Después de la tercera ronda, se analizaron la unión a células SKBR3 mediante ELISA y a ECD de ErbB2 mediante ELISA en clones individuales
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Para estimar el número de anticuerpos unidos únicos, el gen de scFv de clones positivos en ELISA se amplificó por PCR y se identificaron mediante digestión con BstN1. Se identificaron dos patrones de restricción únicos. Los genes de scFv se secuenciaron y se identificaron 2 scFv de unión a ErbB2 únicos. Un análisis similar de clones de SKBR3 positivos en ELISA que no se unían a ErbB2 identificó 11 scFv únicos adicionales.
Para verificar que los anticuerpos en fagos eran específicos para células SKBR3, se prepararon fagos de cada clon único y se analizó la unión a células SKBR3 (alta expresión de ErbB2) así como otras 2 líneas celulares tumorales epiteliales (SK-OV-3, expresión moderada de ErbB2 y MCF7, baja expresión de ErbB2) y una línea celular de mama normal (HS578B). Cada clon único teñía específicamente líneas celulares tumorales pero no la línea celular de mama normal.
Se incubaron células SKBR3 y MCF7 con anticuerpos en fagos C6.5 (control positivo), 3TF5 y 3GH7. Los últimos dos clones se aislaron de la biblioteca, con 3TF5 uniéndose a ErbB2 y el antígeno al que se une 3GH7 desconocido. Los 3 anticuerpos en fagos teñían intensamente células SKBR3 (la línea celular de selección y que presentaba una alta expresión de ErbB2. El fago de C6.5 teñía débilmente células MCF7 (con baja expresión de ErbB2). El clon de 3TF5 anti-ErbB2 de la biblioteca tiñe células MCF7 de forma mucho más intensa que C6.5, al igual que 3GH7.
Se estudiaron células SKBR3, SK-OV-3, MCF7 y HST578 usando scFv purificados nativos de 3TF5 y 3GH7. Para estos estudios, los genes de scFv se subclonaron en un vector que fusiona una etiqueta de hexahistidina al extremo C de scFv. Después se expresaba scFv, se recogía del periplasma bacteriano y se purifica mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. Los dos scFv tiñen intensamente células SKBR3 y no tiñen la línea de células de mama normales HST578. Hay una tinción mínima de la línea celular MCF7 que expresan poco ErbB2 y una tinción intermedia de células SK-OV-3 (que expresaban moderadamente ErbB2). En general, la intensidad de tinción es menor que la observada con el fago. Esto es esperable puesto que el anticuerpo secundario para la tinción de fagos reconoce la proteína principal de la envuelta (2500 copias/fago) dando como resultado una tremenda amplificación de la señal.
Se estudió adicionalmente el anticuerpo en fagos anti-ErbB2 de 3TF5, para determinar si, efectivamente, se había internalizado. Este anticuerpo se seleccionó para un estudio inicial puesto que su internalización podía compararse con C6.5 de unión a ErbB2. Se incubaron 5,0 x 10^{11} fagos de 3TF5 o C6.5 con células SKBR3 a 37ºC o a 4ºC. Después de lavar con PBS, el fago de 3TF5 teñía las células de forma más intensa que el fago de C6.5. Después de lavar con glicina a pH bajo, el microscopio confocal mostró que los fagos de 3TF5 eran internalizados por más de 95% de las células, mientras que C6.5 era internalizado solamente por un bajo porcentaje de células. La incubación de cada anticuerpo a 4ºC no condujo a la internalización.
El scFv de 3TF5 nativo purificado se analizó de forma similar y también era internalizado eficazmente por células SKBR3. Debe observarse que el scFv de 3TF5 nativo existía solamente como monómero sin dimerización o agregación apreciable según lo determinado mediante nitración en gel.
Estos experimentos demuestran que los anticuerpos en fagos pueden ser internalizados por células y recuperarse del citoplasma. Los fagos que se unen e internalizan con el receptor de la superficie celular pueden enriquecerse más de 100 veces que los fagos que no se unen. El nivel de enriquecimiento es mayor que el conseguido seleccionando en la superficie celular. Hemos aplicado este enfoque a la selección de bibliotecas y aislamos anticuerpos en fagos que se unen a y son internalizados por células SKBR-3. Varios de estos anticuerpos se unen a ErbB2, pero se internalizan de forma más eficaz que anticuerpos tales como C6.5 que se generaron seleccionando en antígeno puro. Se han aislado muchos otros anticuerpos que se unen específicamente a SKBR-3 y otras líneas celulares tumorales de mama y se internalizan eficazmente. Estos anticuerpos deben mostrarse útiles para la guía hasta tumores y para identificar nuevos receptores de internalización en células tumorales.
Ejemplo 3 Aumento de la afinidad de fragmentos de anticuerpo con las características de unión deseadas creando bibliotecas de anticuerpos en fagos y seleccionando en la línea celular tumoral de mama adecuada
La presentación en fagos tiene el potencial de producir anticuerpos con afinidades que no pueden producirse usando tecnología de hibridoma convencional. Los fragmentos de anticuerpos humanos de afinidad ultra alta podrían provocar una excelente penetración en tumores, retención en el tumor prolongada y rápida eliminación de la circulación, conduciendo a una alta especificidad. Por lo tanto, realizamos una serie de experimentos para desarrollar metodologías para generar fragmentos de anticuerpos humanos de afinidad ultra alta. Se realizaron experimentos para responder a las siguientes preguntas: 1) ¿Cual es la manera más eficaz de seleccionar y cribar raros anticuerpos en fagos de alta afinidad en medio de un fondo de fagos que se unen con afinidad más baja?; 2 ¿cual es el medio más eficaz para retirar fago unido del antígeno, para asegurar la selección de los anticuerpos en fagos de la más alta afinidad?; 3) ¿cuales son las técnicas más eficaces para fabricar bibliotecas de anticuerpos en fagos mutantes? (mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida; 4) ¿Qué región de la molécula de anticuerpo debe seleccionarse para mutagénesis para aumentar más eficazmente la afinidad del fragmento de anticuerpo?.
Para responder a estas preguntas, estudiamos el scFv humano C6.5, que se une al dominio extracelular (ECD) del antígeno tumoral ErbB-2 con una K_{d} de 1,6 x 10^{-8} M y una K_{off} de 6,3 x 10^{-3} s^{-1} (Schier et al., (1995) Immunotechnology, 1: 63-71). El aislamiento y la caracterización de C6.5 se describen brevemente a continuación y con detalle en la solicitud relacionada USSN 08/665.202).
A pesar de las excelentes proporciones de tejido normal:tumoral in vivo, el suministro cuantitativo de C6.5 no era adecuado para curar tumores en animales que usan radioinmunoterapia (Schier et al., (1995) Immunotechnology, 1: 63-71). Para mejorar el suministro cuantitativo de anticuerpo al tumor, se aumentó la afinidad de C6.5. En primer lugar, se desarrollaron técnicas que permitían la selección de anticuerpos en fagos en base a la afinidad, en lugar del crecimiento diferencial en E. coli o la toxicidad en la cepa hospedadora (Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 255: 28-43; Schier et al., (1996) Gene 169: 147-155; Schier et al., (1996) Human antibodies and hybridomas 7: 97-105). A continuación, determinamos qué puntos en el gen de scFv mutar para conseguir los mayores aumentos de afinidad (Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 255: 28-43; Schier et al., (1996) Gene; Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-567). La mutagénesis aleatoria no produjo un aumento tan grande de la afinidad como la mutagénesis dirigida de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que contienen los aminoácidos que entran en contacto con el antígeno. Los resultados de la diversificación de las CDR indicaban que: 1) el mayor aumento de afinidad se consiguió mutando las CDR situadas en el centro del bolsillo de unión (CDR3 de V_{L} y V_{H}); 2) la mitad de los restos de CDR tienen un papel estructural en el scFv y cuando mutaron volvieron al tipo silvestre; y 3) estos restos estructurales pueden identificarse antes de la construcción de la biblioteca creando modelos de una estructura atómica cristalina homóloga. Estas observaciones condujeron al desarrollo de una estrategia genérica para aumentar la afinidad de los anticuerpos, en la que se introducen aleatoriamente mutaciones de forma secuencial en la CDR3 de V_{H} y V_{L}, con conservación de restos que se ha postulado que tienen un papel estructural mediante modelado por homología (Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-567). Usando este enfoque, aumento la afinidad de C6.5 1200 veces a una K_{d} de 1,3 x 10^{-11} M (id.).
Los estudios de biodistribución revelaron una estrecha correlación entre afinidad y el porcentaje de dosis inyectada de scFv/gramo de tumor (% de DI/g) a las 24 horas (Adams et al., (1998) Cancer Res. 58: 485-490). El mayor grado de retención en el tumor se observó con ^{125}I-C6ML3-9 (1,42% de DI/g, K_{d} = 1,0 x 10^{-9} M). Una retención en el tumor significativamente menor se obtuvo con ^{125}I-C6.5 (0,80% de DI/g, K_{d} = 1,6 x 10^{-8}) y C6G98A (0,19% de DI/g, K_{d} = 3,2 x 10^{-7} M). Las proporciones de órgano normal:tumoral también reflejaban las diferencias de afinidad, por ejemplo proporciones tumor:sangre de 17,2, 13,3, 3,5 y 2,6 y proporciones de tumor con respecto a hígado de 26,2, 19,8, 4,0 y 3,1 para C6ML3-9, C6.5 y C6G98A respectivamente a las 24 horas. Quedan pendientes estudios del scFv de afinidad más alta. Los resultados demuestran nuestra capacidad para aumentar la afinidad de los anticuerpos hasta valores que no pueden obtenerse a partir de tecnología de hibridoma y confirman la importancia de la afinidad en la guía hacia tumores.
Ejemplo 4 Desarrollo preclínico de terapias para cáncer de mama basadas en C6.5
Se han seguido dos enfoques en colaboración para desarrollar terapias para cáncer de mama basadas en C6.5. En una colaboración, se están diseñando moléculas basadas en C6.5 para radioinmunoterapia. Para aumentar el suministro cuantitativo y la retención en el tumor del fragmento de anticuerpo, se crearon "diacuerpos" de scFv diméricos acortando el enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L} de 15 a 5 aminoácidos. Por consiguiente, se produce el emparejamiento entre dominios complementarios de dos cadenas diferentes, creando un dímero estable unido de forma no covalente con dos sitios de unión. In vitro, los diacuerpos producidos a partir de los genes V de C6.5 tienen una afinidad aparente significativamente más alta y una retención durante más tiempo en la superficie de células SK-OV-3 en comparación con scFv de C6.5 (T_{1/2} > 5 h frente a 5 minutos) (Adams et al., (1998) Brit. J. Cancer.). Estudios de biodistribución del diacuerpo de C6.5 mostraron un 6,5% de DI/g de tumor a las 24 horas en comparación con solamente el 1% de DI/g para el scFv de C6.5. Cuando se examinaron las retenciones del diacuerpo durante 72 horas y se determinaron valores acumulativos del área bajo la curva (AUC), las proporciones de AUC de tumor:órgano resultantes eran mayores que las presentadas para otras moléculas de scFv monovalentes o divalentes. El potencial terapéutico de estas moléculas se está examinando en estudios de radioinmunoterapia en ratones desnudos. Puesto que la caracterización in vivo de moléculas basadas en C6.5 no era formalmente uno de los objetivos técnicos, continuamos usando los mutantes de afinidad de C6.5 y diacuerpos basados en C6.5 para estudiar la relación entre afinidad, tamaño y valencia de anticuerpos y la guía a tumores específicos como parte de NIH R01 1 CA65559-01A1.
En una segunda colaboración, se están usando moléculas basadas en C6.5 para guiar liposomas sigilosos que contienen doxorrubicina a cánceres de mama que expresan ErbB2 (Kipotin et al., (1997) Biochemistry. 36: 66-75). Para facilitar el acoplamiento químico del scFv a liposomas, el gen de C6.5 se subclonó en un vector de expresión de E. coli dando como resultado la adición de un resto de cisteína libre en el extremo C del scFv. El scFv de C6.5cys purificado se conjugó con liposomas y la captación in vitro se determinó usando células SKBR3. La captación total era de 3,4 mmoles de fosfolípido/10^{6} células a las 6 horas, con el 70% de la captación internalizado. La captación es comparable a la conseguida usando el 4D5 anti-HER2 Fab' de Genetech. No había captación de liposomas no conjugados. Los resultados indican que C6.5 se une a un epítopo de ErbB2 que da como resultado la internalización a una velocidad comparable con el mejor anticuerpo de internalización producido a partir de hibridomas (4D5). Estudios de terapia in vivo en dichos ratones indicaban que liposomas dirigidos por C6.5 causaban un mayor grado de represión tumoral y una más alta tasa de curación que los liposomas no dirigidos o una combinación de liposomas no dirigidos y anticuerpo sistémico 4D5.
Conclusiones
Los experimentos descritos en este documento establecen que se ha creado una gran (7,0 x 10^{9} miembros) biblioteca de anticuerpos en fagos que pueden proporcionar paneles de anticuerpos humanos para antígenos purificados con afinidades comparables con las afinidades de anticuerpos producidos mediante inmunización de ratón. Los anticuerpos en fagos que se unen a receptores de la superficie celular pueden ser internalizados por las células y recuperarse en un estado infeccioso del interior de la célula. Se desarrollaron metodologías que permiten el enriquecimiento de anticuerpos en fagos de internalización frente a anticuerpos no de internalización de más de 100 veces. Estas metodologías se aplicaron después para seleccionar nuevos anticuerpos de scFv que se unen a receptores de internalización en células SKBR-3. Varios de estos anticuerpos se unen a ErbB2, pero se internalizan más eficazmente que los scFv basados en C6.5. Muchos más anticuerpos se unen a receptores de internalización desconocidos. Todos estos scFv se unen específicamente a células SKBR-3 o a líneas celulares tumorales relacionadas. Los resultados indican que este enfoque de selección es un potente enfoque para generar anticuerpos que pueden distinguir un tipo celular (maligno) de otro (no maligno). Además, hemos demostrado que no solamente es posible seleccionar para la unión, sino seleccionar para la función (internalización). A corto plazo, caracterizaremos adicionalmente los anticuerpos aislados con respecto a especificidad y, en el caso de scFv de unión a ErbB2, afinidad. A largo plazo, usaremos estos reactivos para: 1) estudiar el efecto de afinidad y valencia sobre la velocidad de internalización; y 2) identificar los antígenos a los que se unieron usando inmunoprecipitación. Es probable que los resultados conduzcan a la identificación de nuevos receptores de la superficie celular tumoral de internalización que sean útiles dianas terapéuticas. Si este enfoque demuestra ser útil, planeamos aplicarlo a células tumorales primarias y DCIS. También pretendemos evaluar la guía de liposomas a 3TF5 (scFv de unión a ErbB2 que se internaliza más rápido que C6.5). Es posible que sea más eficaz que C6.5.
Además, los experimentos demuestran estas metodologías para aumentar la afinidad de anticuerpos in vivo a valores que no se alcanzaban anteriormente in vivo. Hemos aplicado estas metodologías para generar nuevos scFv de unión a ErbB2.
Ejemplo 5 Mapeo de epítopos de F5 y C1
Se identificaron dos únicos anticuerpos en fagos que eran internalizados por células SKRB3 (F5 y C1 descritos anteriormente). Ninguno de estos fagos se aislaban cuando se seleccionó la misma biblioteca en ErbB2 recombinante. Para determinar porqué, se midieron la K_{d} de F5 (3,2 x 10^{-7} M) y C1 (K_{d} = 1,0 x 10^{-6} M). Estas K_{d} son significativamente más altas que la K_{d} medida para cuatro de los scFv seleccionados en ErbB2 recombinante (K_{d} = 0,1 a 0,65 nM). Los anticuerpos en fagos de internalización de K_{d} más alta podrían tener que competir con los anticuerpos en fagos no de internalización de K_{d} más baja por la selección en ErbB2 recombinante y probablemente se perdían durante el proceso de selección. Puesto que es probable que los anticuerpos que se internalizan como monómeros sean raros y puesto que habrá muchos más anticuerpos en fagos de afinidad más baja que de afinidad más alta en una biblioteca, no es sorprendente que los anticuerpos de internalización tengan una K_{d} alta. Puesto que es probable que los anticuerpos que se internalizan sean raros, formulamos la hipótesis de que era probable que F5 y C1 reconocieran al mismo epítopo. Esto se confirmó usando un ensayo de competencia (Figura 2). Por lo tanto, como se había supuesto, F5 y C1 reconocen al mismo epítopo y a un epítopo diferente a C6.5. Usando el mismo ensayo, confirmamos que F5 y C1 reconocen a un epítopo diferente que el anticuerpo 4D5 anti-ErbB2 de Genetech (conocido cuando se humaniza como Herceptin).

Claims (24)

1. Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo del receptor c-erbB2 al que se une C1 (SEC ID Nº 2), donde el anticuerpo se internaliza en una célula después de la unión al receptor.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo aislado o es un anticuerpo producido mediante síntesis química o expresión recombinante.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 que tiene sustituciones conservativas.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 y donde dicho anticuerpo tiene una afinidad de unión por erbB2 en células de al menos 10 \muM.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 en no más de 30 restos.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de la SEC ID Nº 1.
7. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende una CDR de la SEC ID Nº 2.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende al menos dos CDR de la SEC ID Nº 1.
9. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende al menos dos CDR de la SEC ID Nº 2.
10. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionadas entre las CDR de la SEC ID Nº 1 y las CDR de la SEC ID Nº 2.
11. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende al menos tres CDR seleccionadas entre las CDR de la SEC ID Nº 1 y las CDR de la SEC ID Nº 2.
12. El anticuerpo de la reivindicación 11, donde dicho anticuerpo tiene tres regiones determinantes de la complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.
13. El anticuerpo de la reivindicación 11, donde dicho anticuerpo tiene tres regiones determinantes de la complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
14. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
15. Una molécula quimérica que se une específicamente a una célula portadora de un c-erbB2, comprendiendo dicha molécula quimérica un efector unido a un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
16. La molécula quimérica de la reivindicación 15, en la que dicho efector se selecciona entre una citotoxina, una marca, un radionúclido, un fármaco, un liposoma, un ligando y un anticuerpo.
17. La molécula quimérica de la reivindicación 15, donde dicha molécula quimérica es una proteína de fusión.
18. La molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha célula es una célula cancerosa.
19. La molécula quimérica de la reivindicación 18, en la que dicha célula cancerosa es una célula de cáncer de mama.
20. La molécula quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, para uso en un método para suministrar específicamente la molécula efectora a una célula portadora de un receptor c-erbB2 poniendo en contacto dicha célula con dicha molécula quimérica, con lo que dicha molécula quimérica se une específicamente a dicha célula.
21. Uso de una molécula quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, para la fabricación de un medicamento para suministrar específicamente la molécula efectora a una célula portadora de un receptor c-erbB2.
22. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
23. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacológico y el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
24. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacológico y la molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19.
ES99919786T 1998-04-24 1999-04-23 Anticuepos erbb2 de internalizacion. Expired - Lifetime ES2316186T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US250056 1988-09-28
US8295398P 1998-04-24 1998-04-24
US82953P 1998-04-24
US09/250,056 US7244826B1 (en) 1998-04-24 1999-02-12 Internalizing ERB2 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2316186T3 true ES2316186T3 (es) 2009-04-01

Family

ID=26768027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES99919786T Expired - Lifetime ES2316186T3 (es) 1998-04-24 1999-04-23 Anticuepos erbb2 de internalizacion.

Country Status (9)

Country Link
US (6) US7244826B1 (es)
EP (1) EP1071460B1 (es)
JP (1) JP2002524024A (es)
AT (1) ATE412432T1 (es)
AU (1) AU769304B2 (es)
CA (1) CA2326377C (es)
DE (1) DE69939820D1 (es)
ES (1) ES2316186T3 (es)
WO (1) WO1999055367A1 (es)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7563874B2 (en) * 1998-08-31 2009-07-21 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
DE60037896D1 (de) * 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
CA2798625C (en) * 2000-04-17 2017-01-24 Dyax Corp. Novel methods of constructing libraries of genetic packages that collectively display the members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins
CN1447696A (zh) 2000-05-19 2003-10-08 杰南技术公司 用于提高对ErbB拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验
PT1360288E (pt) 2000-12-18 2011-03-07 Dyax Corp Bibliotecas orientadas de pacotes genéticos
ITRM20010408A1 (it) * 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.
US20050037061A1 (en) * 2001-07-25 2005-02-17 Saiko Hosokawa Remedies for mammary cancer
AU2003256299A1 (en) 2002-07-01 2004-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to reg iv
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
US6987270B2 (en) 2003-05-07 2006-01-17 General Electric Company Method to account for event losses due to positron range in positron emission tomography and assay of positron-emitting isotopes
DE602004019546D1 (de) 2003-08-26 2009-04-02 Smithkline Beecham Corp Heterofunktionelle copolymere von glycerol und polyethylenglykol, ihre konjugate und zusammensetzungen
MXPA06006009A (es) * 2003-11-28 2006-09-04 Mitra Medical Technology Ab Direccionamiento de antigenos erb.
CA2821167C (en) 2004-05-03 2016-06-28 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Drug delivery liposomes containing anionic polyols or anionic sugars
EP1809246B1 (en) 2004-10-08 2008-07-16 Alza Corporation Method of insertion of a lipid-linked moiety into a pre-formed lipid assembly using microwaves
ES2710439T3 (es) 2005-01-21 2019-04-25 Genentech Inc Dosificación fija de anticuerpos HER
EP2153848A3 (en) * 2005-01-27 2010-07-21 The Regents of the University of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinium neurotoxins
GB0503546D0 (en) * 2005-02-21 2005-03-30 Hellenic Pasteur Inst Antibody
KR101253576B1 (ko) 2005-02-23 2013-04-11 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ 이량체화 억제제를 이용한 암 환자에서의 질환진행까지의 시간 또는 생존의 연장
JP5638804B2 (ja) * 2006-08-04 2014-12-10 アストラゼネカ アクチボラグ ＥｒｂＢ２に対する抗体
US8759087B2 (en) 2006-12-12 2014-06-24 Morpho Sys AG Internalization
EP2899541A1 (en) 2007-03-02 2015-07-29 Genentech, Inc. Predicting response to a HER dimerisation inhbitor based on low HER3 expression
WO2009008916A2 (en) 2007-03-22 2009-01-15 The Regents Of The University Of Californina Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US20090175784A1 (en) 2007-05-11 2009-07-09 Joshua Goldstein Anti-Alpha V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
CA2690334C (en) 2007-06-08 2017-02-14 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to her2 inhibitor treatment
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
EP3124497B1 (en) 2007-09-14 2020-04-15 Adimab, LLC Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US12529164B2 (en) 2007-09-14 2026-01-20 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
WO2009114815A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Dyax Corp Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
WO2009132287A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr1, cdr2, and cdr3 and novel lc cdr1, cdr2, and cdr3 designs
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
CA2732003A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 James D. Marks Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
AU2009308707A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. LIGHT targeting molecules and uses thereof
SG10201402742YA (en) 2009-03-20 2014-08-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
JP5705836B2 (ja) 2009-05-29 2015-04-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ２を発現する胃癌患者のｈｅｒ２シグナル伝達のためのモジュレーター
KR20130000384A (ko) 2010-02-18 2013-01-02 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 뉴레귤린 길항제 및 암의 치료에서의 그의 용도
US8609095B2 (en) 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
JP6039428B2 (ja) * 2010-03-04 2016-12-07 シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ 抗ｈｅｒ２抗体および組成物
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
CA3051311A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
NZ604007A (en) 2010-05-27 2015-03-27 Genmab As Monoclonal antibodies against her2 epitope
KR102024922B1 (ko) 2010-07-16 2019-09-25 아디맵 엘엘씨 항체 라이브러리
US9243057B2 (en) 2010-08-31 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Antibodies for botulinum neurotoxins
US20130245233A1 (en) 2010-11-24 2013-09-19 Ming Lei Multispecific Molecules
WO2012078695A2 (en) 2010-12-06 2012-06-14 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration for preventing cardiotoxicity in treatment with erbb2-targeted immunoliposomes comprising anthracyclin chemotherapeutic agents
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
WO2012112730A2 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivering nucleic acid to a cell
WO2012143523A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
EP4520771A3 (en) 2011-04-20 2025-07-16 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
AU2012245116A1 (en) 2011-04-20 2013-11-07 Genmab A/S Bispecific antibodies against HER2 and CD3
US20140363438A1 (en) 2011-08-17 2014-12-11 Genentech, Inc. Neuregulin antibodies and uses thereof
WO2013043864A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to endothelial targeting
US9327023B2 (en) 2011-10-25 2016-05-03 The Regents Of The University Of Michigan HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells
AU2012346540C1 (en) 2011-11-30 2019-07-04 Genentech, Inc. ErbB3 mutations in cancer
WO2013083810A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of non-responders to her2 inhibitors
RU2014136886A (ru) 2012-03-27 2016-05-20 Дженентек, Инк. Диагностика и виды лечения, связанные с ингибиторами her3
AU2013202947B2 (en) 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
US9717724B2 (en) 2012-06-13 2017-08-01 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies
WO2013192294A1 (en) * 2012-06-20 2013-12-27 Boston 3T Biotechnologies, Inc. Cellular therapies for treating and preventing cancers and other immune system disorders
JP6998646B2 (ja) 2012-11-30 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－ｌ１阻害剤併用療法を必要とする患者の同定
EP2925361A4 (en) 2012-12-03 2016-06-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc COMBINATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF HER2-POSITIVE CARCINOMA
WO2015066543A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting her2 and her3 with bispecific antibodies in cancerous cells
SG11201608192SA (en) 2014-04-11 2016-10-28 Medimmune Llc Bispecific her2 antibodies
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
WO2016022723A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for treating her2-positive cancers that are resistant to her2-targeted therapies
WO2016127097A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for improved cognition
EP3262216A4 (en) * 2015-02-24 2018-12-05 Academia Sinica A phage-displayed single-chain variable fragment library
US11318131B2 (en) 2015-05-18 2022-05-03 Ipsen Biopharm Ltd. Nanoliposomal irinotecan for use in treating small cell lung cancer
PL3337467T3 (pl) 2015-08-20 2021-06-14 Ipsen Biopharm Ltd. Terapia skojarzona z zastosowaniem liposomalnego irynotekanu i inhibitora parp do leczenia nowotworu
PL3337478T5 (pl) 2015-08-21 2026-05-04 Ipsen Biopharm Ltd. Kombinacja leków obejmująca liposomalny irynotekan, oksaliplatynę, 5-fluorouracyl i leukoworynę do leczenia nowotworu trzustki z przerzutami
AU2016340153B2 (en) 2015-10-16 2022-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing camptothecin pharmaceutical compositions
US20180271998A1 (en) 2015-12-04 2018-09-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-stabilized fabs
JP6955507B2 (ja) 2015-12-14 2021-10-27 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｐｄ‐１及びｃｔｌａ‐４との免疫応答性を有する二重特異性並びにその使用方法
WO2017194554A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
EP3535026A1 (en) 2016-11-02 2019-09-11 Ipsen Biopharm Limited Treating gastric cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan, oxaliplatin, 5-fluoruracil (and leucovorin)
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
JP7132232B2 (ja) 2017-02-24 2022-09-06 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｃｄ１３７及び腫瘍抗原に結合できる二重特異性結合分子並びにその使用
JP2021505637A (ja) 2017-12-12 2021-02-18 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 二重特異性ｃｄ１６結合分子、及び疾患の治療におけるその使用
SG11202007572VA (en) 2018-02-15 2020-09-29 Macrogenics Inc Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
US20220118060A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 The Regents Of The University Of California Exercise-induced circulatory factors for amelioration of cognitive, neurological, and regenerative dysfunction during aging
WO2021163272A2 (en) 2020-02-12 2021-08-19 The Regents Of The University Of California Platelet factors and cognitive improvement
JP7745556B2 (ja) 2020-02-21 2025-09-29 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｃｄ１３７結合分子及びその使用
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
US12428457B2 (en) 2021-01-29 2025-09-30 University Of South Florida Cold-shock protein scaffold for engineering non-antibody binding proteins
WO2024092238A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Unity Biotechnology, Inc. Klotho polypeptide or polynucleotide for improving cognition
EP4414386A1 (en) 2023-02-09 2024-08-14 Mariangela Figini Method of chemical synthesis of single-chain antibody fragments and products thereby obtained
NL2038054B1 (en) 2024-06-25 2026-01-15 Academisch Ziekenhuis Leiden A method for preparing liposomes

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5169774A (en) 1984-02-08 1992-12-08 Cetus Oncology Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US4996490A (en) * 1986-11-18 1991-02-26 Atlantic Richfield Company Microwave apparatus and method for measuring fluid mixtures
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
IL99553A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing oligonucleotides linked to expression elements,a kit for the preparation of vectors useful for the expression of a diverse population of random peptides and methods utilizing the same
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
WO1994005781A1 (en) 1992-09-04 1994-03-17 The Scripps Research Institute Phagemids coexpressing a surface receptor and a surface heterologous protein
WO1994011496A1 (en) 1992-11-10 1994-05-26 Ixsys, Inc. Soluble peptides having constrained, secondary conformation in solution and method of making same
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
WO1994026787A1 (en) 1993-05-07 1994-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for generating cell type specific phage antibody libraries
US5658763A (en) 1993-10-25 1997-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Methods and compositions for high protein production from non-native DNA
US6214388B1 (en) * 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5736388A (en) 1994-12-30 1998-04-07 Chada; Sunil Bacteriophage-mediated gene transfer systems capable of transfecting eukaryotic cells
DE69638269D1 (de) 1995-06-14 2010-11-18 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
SE9503151D0 (sv) 1995-09-13 1995-09-13 Bioinvent Internatioal Ab Combined ligand and receptor display
AU2678097A (en) 1996-04-16 1997-11-07 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
WO1998005344A1 (en) 1996-08-05 1998-02-12 Brigham And Women's Hospital, Inc. Bacteriophage-mediated gene therapy
US6054312A (en) 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
AU2001268427B2 (en) * 2000-06-16 2007-03-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Limited Antibodies that immunospecifically bind to blys

Also Published As

Publication number Publication date
US7244826B1 (en) 2007-07-17
AU3742999A (en) 1999-11-16
US8173424B2 (en) 2012-05-08
EP1071460B1 (en) 2008-10-29
DE69939820D1 (de) 2008-12-11
WO1999055367A1 (en) 1999-11-04
ATE412432T1 (de) 2008-11-15
US20080108135A1 (en) 2008-05-08
WO1999055367A9 (en) 2000-03-02
AU769304B2 (en) 2004-01-22
JP2002524024A (ja) 2002-08-06
EP1071460A4 (en) 2004-09-08
US20130337039A1 (en) 2013-12-19
CA2326377C (en) 2016-12-06
US20110218333A1 (en) 2011-09-08
EP1071460A1 (en) 2001-01-31
US20160279262A1 (en) 2016-09-29
CA2326377A1 (en) 1999-11-04
US20150239976A1 (en) 2015-08-27
US7892554B2 (en) 2011-02-22
US9388244B2 (en) 2016-07-12
US8974792B2 (en) 2015-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9388244B2 (en) Internalizing ErbB2 antibodies
US20240026027A1 (en) Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
US7388088B2 (en) High affinity human antibodies to tumor antigens
US7335744B2 (en) Prostate cancer specific internalizing human antibodies
US7081518B1 (en) Anti-mesothelin antibodies having high binding affinity
CN101355966A (zh) 双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法
CN114106179A (zh) 巨胞饮人类抗cd46抗体和靶向癌症疗法
CN112794911A (zh) 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用
ES2528718T3 (es) Diana para linfocitos B
AU2004201055B2 (en) Internalizing ErbB2 antibodies
AU2007234594A1 (en) Internalizing ErbB2 antibodies
MXPA00010440A (es) Anticuerpos erbb2 incorporables
MXPA00010434A (es) Metodos de seleccion de anticuerpos incorporales