ES2316192T3 - Proteina patched-2 de vertebrado. - Google Patents

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Abstract

Ácido nucleico aislado que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido patched-2 que comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de (a), y codificante de un polipéptido que presenta la capacidad de unirse a Desert Hedgehog (Dhh) y de afectar a la señalización de Dhh.

Description

Proteína patched-2 de vertebrado.
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a moléculas de señalización, específicamente a moléculas de señalización y mediadoras en la cascada hedgehog (hh) que se encuentran implicadas en la proliferación y diferenciación celulares.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de los organismos multicelulares depende, por lo menos en parte, de mecanismos que especifican, dirigen o mantienen la información posicional para la formación de patrones de células, tejidos u órganos. Se han asociado diversas moléculas de señalización secretadas, tales como elementos de las familias del factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta), de Wnt, de factores de crecimiento fibroblástico y hedgehog, con la actividad de formación de patrones de diferentes células y estructuras en Drosophila, así como en vertebrados (Perrimon, Cell 80:517-520, 1995).
Los genes de polaridad de los segmentos se descubrieron por primera vez en Drosophila, que al mutar causaban una modificación del patrón de las estructuras de los segmentos corporales. Estas modificaciones afectaban al patrón a lo largo del eje anteroposterior. Se identificó el gen hedgehog (Hh) por primera vez mediante un cribado genético en Drosophila melanogaster (Nusslein-Volhard et al., Roux, Arch. Dev. Biol. 193:267-282, 1984), como gen de polaridad de los segmentos que desempeña una amplia diversidad de funciones en el desarrollo (Perrimon, supra). Aunque únicamente se ha identificado un gen Hh de Drosophila, se han aislado tres homólogos Hh de mamífero: Hh Sonic (Shh), Hh Desert (Dhh) y Hh Indian (Ihh) (Echelard et al., Cell 75:1417-30, 1993; Riddle et al., Cell 75:1401-16, 1993). Shh se expresa a nivel elevado en el notocordio y en la placa del suelo de embriones de vertebrado en desarrollo y actúa estableciendo el destino celular en extremidades, somites y tubo neural durante el desarrollo. Los ensayos in vitro de explantes, así como la expresión ectópica de Shh en animales transgénicos demuestran que Shh desempeñan un papel clave en la formación de patrón del tubo neural (Echelard et al., supra, 1993; Ericson et al., Cell 81:745-56, 1995; Marti et al., Nature 375:322-5, 1995; Roelink et al., supra, 1995; Hynes et al., Neuron 19:15-26, 1997). Hh también desempeña un papel en el desarrollo de las extremidades (Krauss et al., Cell 75:1431-44, 1993; Laufer et al., Cell 79:993-1003, 1994), de los somites (Fan y Tessier-Lavigne, Cell 79:1175-86, 1994; Johnson et al., Cell 79:1165-73, 1994), de los pulmones (Bellusci et al., Develop. 124:53-63, 1997), y de la piel (Oro et al., Science 276:817-21, 1997). De manera similar, Ihh y Dhh se encuentran implicados en el desarrollo de hueso, intestino y células germinales (Apelqvist et al., Curr. Biol. 7:801-4, 1997; Bellusci et al., Development 124:53-63, 1997; Bitgood et al., Curr. Biol. 6:298-304, 1996; Roberts et al., Development 121:3163-74, 1995). Específicamente, se ha implicado Ihh en el desarrollo de los condrocitos (Vortkamp, A. et al., Science 273:613-22, 1996), mientras que Dhh desempeña un papel clave en el desarrollo de los testículos (Bitgood et al., supra). Con la excepción del intestino, en el que se expresan tanto Ihh como Shh, los patrones de expresión de los miembros de la familia hedgehog no se solapan (Bitgood et al., supra).
En la superficie celular, la función de Hh aparentemente se encuentra mediada por un complejo receptor multicomponente que implica patched (Ptch) y smoothened (smo), dos proteínas multi-transmembranales identificadas inicialmente como genes de polaridad de los segmentos en Drosophila y caracterizadas después en vertebrados (Nakano et al., Nature 341:508-513, 1989; Goodrich et al., Genes Dev. 10:301-312, 1996; Marigo et al., Develop. 122:1225-1233, 1996; van den Heuvel, M. y Ingham, P.W., Nature 382:547-551, 1996; Alcedo, J. et al., Cell 86:221-232, 1996; Stone, D.M. et al., Nature 384:129-34, 1996. Tras unirse Hh a Ptch, se reduce el efecto inhibidor normal de Ptch sobre Smo, permitiendo que Smo transduzca la señal Hh a través de la membrana plasmática. Todavía no se ha establecido si el complejo receptor Ptch/Smo media en la acción de la totalidad de los 3 hedgehogs de mamífero o si existen componentes específicos. Se ha detectado la expresión de un segundo gen Ptch en tejido ocular adulto tanto de ratón como de tritón japonés (Takabatake, T. et al., FEBS Letters 410:485-489, 1997). De manera interesante recientemente ha sido aislado un segundo gen Ptch murino, Pitch-2 (Motoyama, J. et al., Nature Genetics 18:104-106, 1998), aunque no se ha establecido su función como receptor Hh. Además, se ha identificado un fragmento de 215 aminoácidos de una segunda proteína Ptch humana (patente WO nº 99/29854). Con el fin de caracterizar Ptch-2 y compararla con Ptch con respecto a la función biológica de los diversos miembros de la familia Hh, los solicitantes han aislado el gen Ptch-2 humano. El análisis bioquímico de Ptch y Ptch-2 demuestra que ambos se unen a la totalidad de los miembros de la familia Hh con afinidad similar y que ambas moléculas pueden formar un complejo con Smo. Sin embargo, los patrones de expresión de Ptch-2 y Ptch no se solapan. Aunque Ptch se expresa en todo el embrión de ratón, Ptch-2 se encuentra principalmente en espermatocitos que requieren Desert Hedgehog (Dhh) para su desarrollo correcto, sugiriendo que Ptch-2 media en la actividad de Dhh en el testículo. La localización cromosómica de Ptch-2 es el cromosoma lp33-34, una región delecionada en algunos tumores de la células germinales, planteando la posibilidad de que Ptch-2 sea un supresor tumoral en células diana Dhh.
Descripción resumida de la invención
En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido patched-2, comprendiendo la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a); y codificando un polipéptido que presenta la capacidad de unirse a Desert Hedgehog (Dhh) y de afectar a la señalización de Dhh. La identidad de secuencia es de 95%. En un aspecto, el ácido nucleico aislado presenta una identidad de secuencia de 95% con un polipéptido que presenta los residuos aminoácidos 1 a aproximadamente 1.203 de la fig. 1. En un aspecto adicional, la molécula de ácido nucleico aislada comprende ADN codificante de un polipéptido patched-2 humano que presenta los residuos aminoácidos 1 a aproximadamente 1.203 de la fig. 1. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante del mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el depósito ATCC nº 209778 y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh (denominación: pRK7.hptc2.Flag-1405); alternativamente la secuencia codificante del clon pRK7.HPTC2.Flag-1405, depositada bajo el número de acceso ATCC 209778. En todavía un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende secuencia codificante del gen patched-2 humano del ADNc en el depósito ATCC nº 209778 (denominación: pRK7.HPTC2.Flag-1405).
En una realización adicional, la invención proporciona un vector, la invención proporciona un vector que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido patched-2 que comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de (a); y codificante de un polipéptido patched-2 humano y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh. También se proporciona una célula huésped que comprende dicho vector. A título de ejemplo, las células huésped pueden ser células de mamífero (por ejemplo células CHO), células procarióticas (por ejemplo E. coli) o células de levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae). Además se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos patched-2 y comprende el cultivo de células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión de patched-2 y la recuperación de las mismas a partir del cultivo celular.
En todavía otra realización, la invención proporciona un polipéptido patched-2 aislado que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2) y que presenta la capacidad de unirse y de afectar a la señalización de Dhh. En particular, la invención proporciona un polipéptido patched-2 humano de secuencia nativa aislado que comprende los residuos 1 a aproximadamente 1.203 de la figura 1. Se encuentran específicamente incluidos los polipéptidos patched-2 humanos con o sin la metionina de inicio. Alternativamente, la invención proporciona un polipéptido patched-2 humano codificado por el ADNc depositado bajo el número de acceso de depósito ATCC 209778 que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh.
En todavía otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden un polipéptido patched-2 fusionado con un polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende un polipéptido patched-2 fusionado con una secuencia de etiqueta epítopo o con una región constante de una inmunoglobulina.
En la presente invención se describen etiquetas de secuencia expresada (EST) que comprenden las secuencias de nucleótidos identificadas en la fig. 2A (905531) (SEC ID nº 3) y en la fig. 2B (1326258) (SEC ID nº 5).
Asimismo, se describen en la presente invención formas alternativamente procesadas de patched-2 humano que presentan actividad biológica de patched-2.
En todavía otra realización, la invención proporciona un procedimiento para utilizar patched-2 para el tratamiento de trastornos que se encuentran mediados por lo menos en parte por Hedgehog (Hh), especialmente Desert Hedgehog (Dhh). En particular, el cáncer testicular. También se da a conocer un procedimiento para utilizar antagonistas o agonistas de patched-2 para tratar trastornos o para crear una condición fisiológica deseable mediante el bloqueo de la señalización de Hh, especialmente la señalización de Dhh (por ejemplo la anticoncepción).
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Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el nucleótido (SEC ID nº 1) y secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID nº 2) de una secuencia nativa de Ptch-2 humana.
La figura 2A muestra EST 905531 (SEC ID nº 3) y la fig. 2B muestra EST 1326258 (SEC ID nº 5) alineados con Ptch humano (SEC ID nº 18). Estas ESTs se utilizaron en la clonación de Ptch-2 de longitud completa humana (SEC ID nº 1).
La figura 3 muestra una comparación entre Ptch humana (SEC ID nº 4) y Ptch-2 (SEC ID nº 2). Los huecos introducidos para la alineación óptima se indican mediante una línea de puntos. Los aminoácidos idénticos se indican en cajas. Los 12 dominios transmembranales se indican mediante cajas sombreadas, la totalidad de los cuales se encuentran conservados entre las dos secuencias. Los resultados de la alineación entre las dos secuencias indican una identidad de 53%. La diferencia más significativa es un dominio intracelular C-terminal más corto en Ptch-2 (SEC ID nº 2) comparado con Ptch humano (SEC ID nº 4).
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La figura 4 muestra una transferencia northern de Ptch-2 (SEC ID nº 2) que indica que la expresión se limita a los testículos. Las múltiples transferencias northern de tejido fetal y adulto humano eran de fragmentos de sonda correspondientes a la región 3' no traducida de Ptch-2 murino.
La figura 5 muestra una localización cromosómica de dos clones BAC que se aislaron mediante cribado por PCR con sondas derivadas de patched-2 humano. Ambas sondas se localizaron mediante FISH en el cromosoma I humano p33-34.
La figura 6 es una hibridación in situ que compara la expresión de Ptch (SEC ID nº 4), Ptch-2 (SEC ID nº 2) y Fused (FuRK) (SEC ID nº 10). Magnificación reducida de sección de testículo hibridada con Ptch-2 de cadena sentido (SEC ID nº 11) (d) y con sonda de cadena antisentido (SEC ID nº 12) (e), respectivamente. La fig. 6(f) muestra una magnificación reducida de una sección de testículo hibridada con FuRK (ácido nucleico codificante de SEC ID nº 10). Barra de escala: a, b, c: 0,05 mm; d, e, f: 0,33 mm.
La figura 7A es un gráfico logarítmico que compara la unión de Ptch-2 (SEC ID nº 2) a Dhh (SEC ID nº 13) y a Shh (SEC ID nº 14). Unión competitiva de células de Shh-^{125}I murino recombinante a células 293 que sobreexpresan Ptch (SEC ID nº 4) o Ptch-2 (SEC ID nº 2). No se observó unión detectable a células falsamente transfectadas (datos no mostrados). La figura 7B es una transferencia western que ilustra la coinmunoprecipitación de Ptch etiquetado con epítopo (SEC ID nº 4) o de Ptch-2 (SEC ID nº 2) con Smo etiquetado con epítopo (SEC ID nº 15). Se llevó a cabo la inmunoprecipitación con anticuerpos contra Ptch etiquetado con Flag (SEC ID nº 4) y se realizó el análisis en un gel de acrilamida al 6% con anticuerpos contra Smo etiquetados con Myc (SEC ID nº 15). Podían detectarse complejos de proteínas tanto para Ptch (SEC ID nº 4) como Ptch-2 (SEC ID nº 2) con Smo (SEC ID nº 15), Ptch (SEC ID nº 4) y Ptch-2 (SEC ID nº 2), que se expresaban a niveles similares, tal como muestra la inmunoprecipitación con anticuerpos contra la etiqueta Flag y la transferencia western utilizando el mismo anticuerpo anti-Flag.
La figura 8 es una comparación de las secuencias de Ptch-2 humano (SEC ID nº 2) y Ptch-2 murino (SEC ID nº 7), que indica que existe una identidad de aproximadamente 91% entre las dos secuencias.
La figura 9 es una hibridación in situ que demuestra la acumulación de ARNm de Ptch (SEC ID nº 4) y de Ptch-2 (SEC ID nº 2), detectada mediante hibridación in situ en células basales de ratones transgénicos E18 que sobreexpresaban SMO-M2 (SEC ID nº 16) (Xie et al., Nature 391:90-92, 1998).
La figura 10 es una secuencia parcial que representa el clon 3A (SEC ID nº 8), un fragmento parcial de patched-2 que se aisló inicialmente a partir de una biblioteca procedente de cerebro fetal.
La figura 11 es una secuencia parcial que representa el clon 16.1 (SEC ID nº 9), un fragmento parcial de patched-2 aislada a partir de un biblioteca procedente de testículo.
Descripción detallada de las realizaciones preferentes 1. Definiciones
Los términos "patched-2" y "polipéptido patched-2" tal como se utilizan en la presente invención comprenden patched-2 de secuencia nativa y variantes de patched-2 (que se definen adicionalmente en la presente invención) que presentan actividad biológica de patched-2. Patched-2 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tal como tipos de tejido testicular o a partir de otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos de recombinación o de síntesis.
La expresión "patched-2 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que patched 1 humano de origen natural. Dicho patched-2 de secuencia nativa puede aislarse a partir de un origen natural o puede producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. La expresión "patched-2 de vertebrado de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas naturales de patched-2 humano, formas variantes normales (por ejemplo formas alternativamente procesadas) y variantes alélicas naturales de patched-2 humano. De esta manera, en una realización de la invención, patched-2 de secuencia nativa es un Ptch-2 nativo maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2) con o sin la metionina de inicio en la posición 1.
La expresión "variante de patched-2" se refiere a un patched-2 humano activo que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 95% con el Ptch-2 humano (SEC ID nº 2), presentando la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en la fig. 1 para un patched-2 humano de secuencia nativa de longitud completa. Entre dichas variantes de patched-2 se incluyen, aunque sin limitación, polipéptidos de patched-2 en los que se añaden o se delecionan uno o más residuos aminoácidos en el extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia de la fig. 1 (SEC ID nº 2).
Asimismo, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido patched-2 que comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de (a), y codificante de un polipéptido que presenta la capacidad de unirse a Desert Hedgehog (Dhh) y de afectar a la señalización de Dhh. Además, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante del mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el depósito ATCC nº 209778 y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh (denominación: pRK7.hptc2.Flag-1405), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" referida a las secuencias de patched-2 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia patched-2 tras la alineación de las secuencias y la introducción de huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencias. La alineación con fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible para el público, tal como el programa BLAST-2 en el que los parámetros se han fijado en los valores por defecto del mismo. Los expertos en la materia podrán determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" referida a las secuencias patched-2 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que es idéntico a los nucleótidos en la secuencia de patched-2 tras la alineación de la secuencias y la introducción de huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de las secuencias. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de las secuencias de ácidos nucleicos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentra comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como el programa BLAST en el que los parámetros se han fijado en los valores por defecto del mismo. Los expertos en la materia podrán determinar los parámetros correctos para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la máxima alineación a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan.
La expresión "etiquetado con epítopo" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido patched-2 o una parte del mismo, unido a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido patched-2. El polipéptido etiqueta también es bastante único, de manera que el anticuerpo no reacciona cruzadamente en grado sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente presentan por lo menos seis residuos aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 residuos aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 residuos).
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" se refiere a moléculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente la inmunoadhesina comprende la fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada, que es diferente que el sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2, IgE, IgD o IgM). La inmunoadhesión informada en la literatura incluye fusiones del receptor de células T* [Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940, 1987], CD4' [Capron et al., Nature 337:525-531, 1989; Traunecker et al., Nature 339:68-70, 1989; Zettmeisst et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353, 1990; Bym et al., Nature 344:667-670, 1990], L-selectina (receptor mensajero) [Watson et al., J. Cell Biol. 110:2221-2229, 1990; Watson et al., Nature 349:164-167, 1991], CD44 [Aruffo et al., Cell 61:1303-1313, 1990], CD28* y B7* [Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730, 1991], CTL-4* [Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569, 1991], CD22' [Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144, 1991], receptor TNF [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539, 1991; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886, 1991; Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489, 1991], receptores NP [Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067, 1991], cadena \alpha de receptor IgE [Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115, resumen nº 1448, 1991], receptor HGF [Mark, M.R. et al., J. Biol. Chem. 267(36):26166-26171, 1992], en el que el asterisco (*) indica que el receptor es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas.
La "astringencia" de las reacciones de hibridación resulta fácilmente determinable por un experto ordinario en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado y de la concentración de sales. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para la correcta hibridación, mientras que sondas más cortas requieren temperaturas inferiores. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de hibridarse nuevamente cuando se encuentran presentes cadenas complementarias en un ambiente próximo aunque inferior a la T''' de las mismas (temperatura de fusión). Cuanto más elevado sea el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, más eleva es la temperatura relativa que puede utilizarse. En consecuencia, se infiere que a temperaturas relativas más elevadas se tiende a que las condiciones de reacción resulten más astringentes, mientras que a temperaturas inferiores este efecto es menor. Además, la astringencia también es inversamente proporcional a las concentraciones de sales. Para detalles adicionales y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Muscular Biology, 1995.
Las "condiciones astringentes", tal como se define en la presente invención pueden identificarse como aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC, (2) utilizar durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo 50% (vol./vol.) de formamida con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC, (3) utilizan 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de elevada astringencia consistente de 0,1 x SSC que contenía EDTA a 55ºC.
El término "aislado", en caso de que se utilice para describir los diversos polipéptidos dados a conocer en la presente invención, se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural que son materiales que típicamente interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica: (1) en grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia N-terminal o interna de aminoácidos mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o preferentemente tinción de plata. La expresión "polipéptido aislado" incluye un polipéptido in situ dentro de células recombinantes, debido a que por lo menos un componente del ambiente natural de patched-2 de vertebrado no se encuentra presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico patched-2 "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se encuentra habitualmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico patched-2. Una molécula de ácido nucleico patched-2 aislada es diferente de la forma o ambiente en la que se encuentra naturalmente. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico patched-2 aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico patched-2 nativa correspondiente tal como existe en las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión en una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.
Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" cuando se encuentra situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN de un polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia, o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se posiciona de manera que facilite la traducción. Generalmente, "operablemente ligado" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, que son contiguas y se encuentran en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no necesariamente son contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen estos sitios, los adaptadores oligonucleótidos o línkers sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales individuales (incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas), composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab, F(ab')_{2} y Fv), con la condición de que muestren la actividad biológica deseada.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de un población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonales se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales resultan ventajosos en el aspecto de que son sintetizados por el cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo, obteniéndose a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante le procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante [ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567, Cabilly et al.].
Entre los anticuerpos monoclonales de la presente invención específicamente se incluye los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada [patente US nº 4.816.567; Cabilly et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984].
Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos ligantes de antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Mayoritariamente los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos procedentes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante); tal como ratón, rata o conejo, que presentan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos no humanos correspondientes sustituyen los residuos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias de marco. Estas modificaciones s llevan a cabo para afinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente de dos dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regios FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992, y patente US nº 5.225.539 (Winter), publicada el 6 de julio de 1993.
Los términos "activo" o "actividad" para los fines de la presente invención se refieren a una o más formas de patched-2 que conservan las actividades biológicas y/o inmunológicas de patched-2 nativo o de origen natural. Es decir la capacidad de unirse a Dhh y de afectar, por ejemplo, bloqueando, o de otra manera modulando, la señalización de Desert hedgehog (Dhh). Por ejemplo, la regulación de la patogénesis del cáncer testicular, la formación de espermatocitos masculinos y el carcinoma de células basales.
El término "antagonista" se utiliza en la presente invención en el sentido más amplio, incluyendo cualquier molécula que bloquee, evite, inhiba o neutralice el funcionamiento normal de patched-2 en la ruta de señalización hedgehog (Hh). Una forma particular de antagonista incluye una molécula que interfiere con la interacción entre DHh y patched-2. Alternativamente, un antagonista también puede ser una molécula que incremente los niveles de patched-2. De manera similar, el término "agonista" se utiliza en la presente invención incluyendo cualquier molécula que potencie, intensifique o estimule la unión de un Hh a patched-2 en la ruta de señalización Hh u de otra manera la regula positivamente (por ejemplo bloqueando la unión de Ptch-2 (SEC ID nº 2) a Smo (SEC ID nº 17). Entre las moléculas adecuadas que afectan a la interacción proteína-proteína de Hh y patched-2 y las proteínas de unión de dicha interacción se incluyen fragmentos de ésta última o moléculas bioorgánicas pequeñas, por ejemplo peptidomiméticos, que evitan o intensifican, según sea el caso, la unión de Hh a patched-2. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen proteínas, péptidos, glucoproteínas, glucopéptidos, glucolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas bioorgánica, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y los metabolitos de los mismo, secuencias de control transcripcional y traduccional, y similares. Otra forma preferente de antagonista incluye oligonucleótidos antisentido que inhiben la transcripción correcta de patched-2 de tipo salvaje.
El término "modulación" o "modulando" significa regulación positiva o negativa de una ruta de señalización. Entre los procesos celulares bajo el control de la transducción de señales se pueden incluir, aunque sin limitarse a ellos, la transcripción de genes específicos, las funciones celulares normales, tales como el metabolismo, proliferación, diferenciación, adhesión, apóptosis y supervivencia, así como procesos anormales, tales como la transformación, el bloqueo de la diferenciación y la metástasis.
Las técnicas de "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" tal como se utilizan en la presente invención se refieren de manera general a un procedimiento en el que cantidades minúsculas de un trozo específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN se amplifican tal como se describe en la patente US nº 4.683.195, publicada el 28 de julio de 1987. Generalmente, debe encontrarse disponible la información de secuencia desde los extremos de la región de interés o más allá, de manera que puedan diseñarse los cebadores oligonucleótidos; estos cebadores serán de secuencia idéntica o similar a cadenas opuestas del molde que debe amplificarse. Los nucleótidos 5' terminales de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. Las secuencias de PCR forman ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, bacteriófago o secuencias de plásmido, etc. (ver generalmente Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; editor Erlich., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989)). Tal como se utiliza en la presente invención, la PCR se considera un ejemplo, aunque no el único, de un ensayo de muestra de ácidos nucleicos, que comprende la utilización de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácidos nucleicos para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico.
II. Composiciones y procedimientos de la invención A.Patched-2 de longitud completa
La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos nuevamente identificadas y aisladas codificantes de polipéptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud como patched-2. En particular, los solicitantes han identificado y aislado ADNc codificante de un polipéptido patched-2 humano, tal como se da a conocer en más detalle en los Ejemplos, posteriormente. Utilizando los programas informáticos de alineación de secuencias BLAST, BLAST-2 y FastA (fijados a los parámetros por defecto). Los solicitantes han descubierto que una patched-2 humana de secuencia nativa de longitud completa (es decir, Ptch-2 en la figura 3, SEC ID nº 2) presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de 53% con una patched humana (es decir, Ptch, SEC ID nº 4). Además, una patched-2 de longitud completa humana (es decir, Ptch-2, SEC ID nº 2) presenta una identidad de secuencia de aproximadamente 91% con Ptch-2 murina (SEC ID nº 7) (fig. 8). Por consiguiente, en la actualidad se cree que la patched-2 humana (es decir, Ptch-2, SEC ID nº 2) dada a conocer en la presente solicitud es un miembro nuevamente identificado de la cascada de señalización hedgehog de mamífero, específicamente Desert hedgehog.
La secuencia nativa de longitud completa del gen patched-2 humano, o partes de la misma, pueden utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de longitud completa o para aislar todavía otros genes homólogos de vertebrado (por aquellos codificantes de variantes naturales de patched-2 o patched-2 de otra especie) que presenten una identidad de secuencia deseada con la secuencia de patched-2 humana dada a conocer en la fig. 1 (SEC ID nº 2). Opcionalmente, la longitud de las sondas se encuentra comprendida entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 bases. LAs sondas de hibridación pueden derivarse de la secuencia de nucleótidos de la fig. 1 (SEC ID nº 1) o de secuencias genómicas, incluyendo promotores, elementos intensificadores e intrones de patched-2 de vertebrado de secuencia nativa. A título de ejemplo, un procedimiento de cribado comprenderá aislar la región codificante del gen patched-2 de vertebrado utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con una diversidad de marcajes, incluyendo radionucleótidos, tales como ^{32}P o ^{35}S, o con marcajes enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina. Las sondas marcadas que presentan una secuencia complementaria a la del gen patched-2 de vertebrado de la presente invención pueden utilizarse para cribar bibliotecas de ADN, ADN genómico o ARNm humanos para determinar con qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida la sonda.
B. Variantes de patched-2
Además de la secuencia nativa de longitud completa patched-2 descrita en la presente invención, se contempla que puedan prepararse variantes de patched-2. Las variantes de patched-2 pueden prepararse mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en un ADN conocido de patched-2, o mediante la síntesis de los polipéptidos patched-2 deseados. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos post-traduccionales de patched-2.
Pueden realizarse variaciones en patched-2 de secuencia nativa de longitud completa o en diversos dominios de patched-2 descritos en la presente invención, por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas proporcionadas, por ejemplo, en la patente US nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones codificantes de patched-2 que resulten en un cambio en la secuencia de aminoácidos de patched-2 en comparación con patched-2 de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de patched-2. Pueden encontrarse directrices para determinar qué residuo aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar adversamente la actividad deseada mediante la comparación de la secuencia de patched-2 con la de moléculas de proteína conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos realizados en las regiones de elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos. Las inserciones o deleciones opcionalmente pueden ser de entre 1 y 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y sometiendo a ensayo las variantes resultantes para la actividad en el ensayo in vitro descrito en los Ejemplos, posteriormente.
Las variaciones pueden llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos de la técnica, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótido (sitio-dirigida), el escaneo de alaninas y la mutagénesis por PCR. Puede llevarse a cabo mutagénesis sitio-dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487, 1987], mutagénesis por inserción de casete [Wells et al., Gene 34:315, 1985], mutagénesis por restricción-selección [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415, 1986] u otras técnicas conocidas, sobre el ADN clonado para producir el ADN variante de patched-2 de vertebrado.
También puede utilizarse el análisis de escaneo de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferentes se encuentran aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina típicamente es un aminoácido preferente de escaneo de entre dicho grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de las variantes. La alanina también es típicamente preferente debido a que es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se encuentra en posiciones tanto enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co., N.Y.; Chothia, J. Mol. Biol. 150:1, 1976]. Si la sustitución de alaninas no rinde cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.
En la comparación entre secuencias de patched humano y patched-2 ilustradas en la figura 3 (es decir, Ptch, SEC ID nº 4, y Ptch-2, SEC ID nº 2), los doce dominios transmembranales se identifican en gris, mientras que los residuos idénticos se señalan con cajas. Los huecos se indican mediante guiones (-) y se insertan para maximizar la puntuación de identidad total entre las dos secuencias.
C. Modificaciones de patched-2
Las modificaciones covalentes de patched-2 se encuentran incluidas dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoácidos diana de patched-2 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con residuos N-terminales o C-terminales de patched-2. La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil, por ejemplo, para reticular patched-2 con una matriz de soporte o superficie insoluble en agua para la utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-patched-2, y viceversa. Entre los agentes reticulantes utilizadas comúnmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazo-acetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxi-succinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azido-salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidilo, tales como 3,3'-ditiobis-(succinimidil-propionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimdo-1,8-octano y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)-ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo en los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Proteins, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86, 1983], la acetilación de la amina N-terminal y l amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de patched-2 comprende unir el polipéptido patched-2 a uno de entre una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera descrita en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337. Dichas modificaciones se esperaría que incrementasen la vida media de las moléculas en circulación en un sistema de mamífero. La vida media extendida de las moléculas de patched-2 podría resultar útil bajo determinadas circunstancias, por ejemplo en el caso de que se administre variante de patched-2 como agente terapéutico.
El patched-2 de la presente invención también puede modificarse de manera que forme una molécula quimérica que comprende patched-2 unido a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de patched-2 con un polipéptido etiqueta, que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epítopo generalmente se sitúa en el extremo amino-terminal o carboxi-terminal de patched-2. La presencia de dichas formas etiquetadas con epítopo de patched-2 puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta epítopo permite purificar fácilmente patched-2 mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epítopo. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de patched-2 con una inmunoglobulina o con una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Habitualmente el extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos contigua de un receptor de patched-2 se fusiona con el extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos contigua de una región constante de inmunoglobulina, en lugar de la región o regiones variables, sin embargo las fusiones N-terminales también resultan posibles.
Típicamente, dichas fusiones conservan por lo menos dominios CH2 y CH3 de bisagra funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. También se llevan a cabo fusiones con el extremo C-terminal de la parte Fc de un dominio constante o inmediatamente N-terminales respecto a la CHI de la cadena pesada o a la región correspondiente de la cadena ligera. Habitualmente lo anterior se consigue mediante la construcción de la secuencia de ADN apropiada y expresándola en cultivo celular recombinante. Alternativamente, pueden sintetizarse inmunoadhesinas según procedimientos conocidos.
El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; son bien conocidos sitios particulares y pueden seleccionarse con el fin de optimizar las características de actividad biológica, secreción o unión de las inmunoadhesinas.
En una realización preferente, el extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos contigua que comprende el sitio o sitios de unión de patched-2 en el extremo N-terminal, con la parte C-terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo la inmunoglobulina G1 (IgG-1). Tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, resulta posible fusionar la región constante de cadena pesada completa con la secuencia que contiene el sitio o sitios de unión. Sin embargo, más preferentemente, una secuencia que se inicia en la región de bisagra inmediatamente cadena arriba del sitio de corte con papaína (que define Fc de IgG químicamente; residuo 216, considerando que el primer residuo de la región constante de cadena pesada es 114 [Kobat et al., supra], o sitios análogos u otras inmunoglobulinas) se utiliza en la fusión. Aunque anteriormente se creía que en las inmunoadhesinas resultaría necesaria la cadena ligera de inmunoglobulina para la secreción eficiente de las proteínas de fusión de proteína heteróloga-cadena pesada, se ha descubierto que incluso las inmunoadhesinas que contiene la cadena pesada de IgGI completa resultan eficientemente secretadas en ausencia de cadena ligera. Debido a que la cadena ligera no resulta necesaria, la secuencia de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina utilizada en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención puede carecer de un sitio de unión de cadena ligera. Lo anterior puede conseguirse eliminando o alterando suficientemente elementos de secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina a los que habitualmente se une la cadena ligera, de manera que ya no resulta posible dicha unión. De esta manera, el dominio CH1 puede eliminarse completamente en determinadas realizaciones de las quimeras patched-2/inmunoglobulina.
En una realización particularmente preferente, la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio o dominios extracelulares de patched-2 se fusiona con la región bisagra y CH2, CH3; o a los dominios CH1, de bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4.
En algunas realizaciones, las moléculas de patched-2/inmunoglobulina (inmunoadhesinas) se ensamblan en forma de monómeros, dímeros o multímeros, y particularmente en forma de dímeros o tetrámeros. Generalmente, dichas inmunoadhesinas ensambladas presentan estructuras unitarias conocidas similares a aquéllas de las inmunoglobulinas correspondientes. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas (un dímero de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina) es la forma en la que existen IgG, IgA e IgE. Se repite una unidad de cuatro cadenas en las inmunoglobulinas de elevado peso molecular; IgM generalmente existe en forma de pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas que se mantienen unidades mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en una forma multimérica en el suero. En el caso de los multímeros, cada unidad de cuatro cadenas puede ser igual o diferente.
No resulta necesario que la parte inmunoglobulina completa de las quimeras patched-2/inmunoglobulina proceda de la misma inmunoglobulina. Pueden combinarse diversas partes de diferentes inmunoglobulinas, y pueden prepararse variantes y derivados de inmunoglobulinas nativas tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria con respecto a patched-2, con el fin de optimizar las propiedades de las moléculas de inmunoadhesina. Por ejemplo, se descubrió que los constructos de inmunoadhesina en los que la bisagra de IgG-1 había sido sustituida por la de IgG3 eran funcionales y mostraban una farmacocinética comparable a la de las inmunoadhesinas que comprenden la cadena pesada de IgG-I completa.
Los diversos polipéptidos etiqueta y los anticuerpos respectivos de los mismos son bien conocidos de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta de HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165, 1988]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985] y la etiqueta glucoproteína D (gD) del virus del herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990]. Entre otros polipéptidos de etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210, 1988], el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science 255:192-194, 1992], un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991] y el péptido etiqueta proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397, 1990]. Una etiqueta preferente es la etiqueta HA del virus influenza.
D. Preparación de patched-2
La descripción posterior se refiere principalmente ala producción de un patched-2 particular mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de patched-2. Evidentemente se contempla que puedan utilizarse procedimientos alternativos que son bien conocidos de la técnica, para preparar patched-2. Por ejemplo, la secuencia de patched-2, o partes de la misma, puede producirse mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 1969: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963]. Puede llevarse a cabo la síntesis de proteínas in vitro utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática puede conseguirse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Pueden sintetizarse químicamente de manera separada diversas partes de patched-2 de vertebrado y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir patched-2 de longitud completa.
1. Aislamiento de ADN codificante de patched-2 de vertebrado
Puede obtenerse ADN codificante de patched-2 a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree presenta el ARNm de patched-2 y que lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de patched-2 humano puede obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen codificante de patched-2 de vertebrado también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.
Pueden cribarse bibliotecas con sondas (por ejemplo anticuerpos contra patched-2 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándares, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen codificante de patched-2 de vertebrado es la utilización de metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los Ejemplos, posteriormente, describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente inequívocas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido preferentemente se marca de manera que pueda detectarse tras la hibridación con ADN en la biblioteca que se está cribando. Son bien conocidos de la técnica procedimientos de marcaje, e incluyen la utilización de marcajes radioactivos, tales como ATP marcados con ^{32}P, la biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como GenBank u otras bases de datos privadas de secuencias. La identidad de secuencias (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa puede determinarse mediante alineación de secuencias utilizando programas de software informático, tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN, DNAstar e INHERIT, que utilizan diversos algoritmos para medir la homología.
Pueden obtenerse ácidos nucleicos con secuencia codificante de proteína mediante cribado de ADNc o de bibliotecas genómicas seleccionadas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida dada a conocer en la presente invención por primera vez y, en caso necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión de cebadores, tal como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de ARNm que podrían no haberse transcrito inversamente para formar ADNc.
2. Selección y transformación de células huésped
Se transfectan o se transforman células huésped con vectores de expresión o de clonación indicados en la presente invención para la producción de patched-2 y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas. El experto en la materia podrá seleccionar las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en: Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, editor (IRL Press, 1991) y en Sambrook et al., supra.
Los procedimientos de transfección son conocidos para el experto ordinario en la materia, por ejemplo CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, se lleva a cabo trasformación utilizando técnicas estándares apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para procariotas o para otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. Se utiliza la infección con Agrobacterium tumefaciens para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene 23:315, 1983 y en la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457, 1978. Se han descrito los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero en la patente US nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, y en Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o con policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537, 1990, y Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988.
Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen procariotas, levaduras o células eucarióticas superiores Entre los procariotas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo enterobacteriáceas, tales como E. coli. Se encuentran públicamente disponibles diversas cepas de E. coli, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC nº 31.446), E. coli X1776 (ATCC nº 31.537), E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27.325) y K5772 (ATCC nº 53.635).
Además de los procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras resultan huéspedes de clonación o de expresión adecuados para vectores codificantes de patched-2 de vertebrado. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado comúnmente.
Se derivan células huésped adecuadas para la expresión de patched-2 de vertebrado a partir de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Entre los ejemplos más específicos se incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC nº CR 1651), la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977), células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), células pulmonares humanas (W138, ATCC nº CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065) y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC nº CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera comprendida dentro de los conocimientos de la técnica.
3. Selección y utilización de un vector replicable
El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genómico) codificante de patched-2 puede insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Se encuentran disponibles para el público diversos vectores. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia apropiada de ácido nucleico puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, se inserta ADN en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas de la técnica. Entre los componentes de vector generalmente se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, uno o más de entre una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuadas que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de ligación estándares, que son conocidas para el experto en la materia.
Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu resulta adecuado para levaduras, y resultan útiles diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) para vectores de clonación en células de mamífero. Un vector de expresión replicable preferente es el plásmido pRK5 (Holmes et al., Science 253:1278-1280, 1991).
Los vectores de expresión y de clonación típicamente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que: (a) proporcionan resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo el gen codificante de la D-alanina racemasa para los bacilos.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico de patched-2, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada en el caso de que se utilice DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. Un gen de selección adecuado para la utilización en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene 7:141, 1979; Tschemper et al., Gene 10:157, 1980]. El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics 85:12, 1977].
Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor operablemente ligado a la secuencia de ácido nucleico de patched-2 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una diversidad de potenciales células huésped son bien conocidos. Entre los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas de \beta-lactamasa y de promotor lactosa [Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980; patente EP nº 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983]. Los promotores para la utilización en sistema bacterianos también contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada a ADN codificante de patched-2.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para la utilización con huéspedes levaduras se incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980, u otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:49, 1968; Holland, Biochemistry 7:4900, 1978], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de que la transcripción se encuentra controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en la patente EP nº 73.657.
La transcripción de patched-2 a partir de vectores en células huésped de mamífero se encuentra controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de genomas de virus, tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus 40 del simio (SV40), por promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina y por promotores de choque térmico, con la condición de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.
La inserción de una secuencia intensificadora en el vector puede incrementar la transcripción de un ADN codificante de patched-2 por eucariotas superiores. Los intensificadores son elementos de ADN de acción en cis, habitualmente de entre aproximadamente 10 y 300 pb, que actúan sobre un promotor incrementando la transcripción del mismo. En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utiliza un intensificador de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus. El intensificador puede insertarse en el vector en una posición 5' o 3' respec-
to a la secuencia codificante de patched-2, aunque preferentemente se localiza en un sitio 5' respecto a promotor.
Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, células de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se encuentran disponibles comúnmente de las regiones 5', y ocasionalmente 3', no traducidas de ADNs o ADNcs eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos en forma de fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm codificante de patched-2.
Todavía otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de patched-2 en cultivo recombinante de células de vertebrado se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281:40-46, 1979; patentes EP nº 117.060 y nº 117.058.
4. Detección de la amplificación/expresión génica
La amplificación y/o expresión génicas pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern-transferencia northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980), transferencia por puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo con el dúplex unido a una superficie, de manera que, tras la formación del dúplex sobre la suerficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y el ensayo de cultivos celulares o líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipépto patched-2 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena al ADN de patched-2 y codificante de un epítopo específico de anticuerpo.
5. Purificación de polipéptido
Pueden recuperarse formas de patched-2 a partir de lisados de células huésped. Debido a que patched-2 se encuentra unido a membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton X-100) o mediante corte enzimático. Las células utilizadas en la expresión de patched-2 pueden romperse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como el ciclado congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica o con agentes de lisado celular.
Puede desearse purificar patched-2 a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los procedimientos siguientes son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento o una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A-sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo de patched-2. Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos de la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción utilizado y el patched-2 particular producido.
E. Usos de patched-2 (1) Patched-2 es un receptor específico para Desert hedgehog (Dhh)
Se ha implicado la ruta de señalización de hedgehog (Hh) en la formación de estructuras embrionarias en mamíferos y en invertebrados. El receptor transmembranal multipaso patched es un regulador negativo de la ruta de Hh, reprimiendo la molécula de señalización de serpentina smoothened (Smo). Los datos han demostrado que la pérdida de Patched conduce a la desregulación de la ruta de Hh, conduciendo la formación de estructuras aberrantes en los embriones, y carcinoma en el adulto.
El segundo gen patched humano nuevamente identificado por los solicitantes, denominado patched-2 (por ejemplo Ptch-2, SEC ID nº 2), presenta una topología de 12 dominios transmembranales similar a la de patched, y puede unirse a todos los miembros de la familia Hh y puede acomplejarse con Smo (por ejemplo SEC ID nº 17). Sin embargo, los patrones de expresión de patched-2 y de patched no se solapan. Patched-2 se expresa principalmente en los espermatocitos en desarrollo, que se encuentran directamente soportados por las células de Sertoli productoras de Desert Hedgehog, lo que sugiere que patched-2 es un receptor para Desert Hedgehog.
En el túbulo adulto, las células de Sertoli, que son células secretorias inusualmente grandes, atraviesan el túbulo seminífero desde la lámina basal hasta el aspecto luminal, enviando protrusiones citoplasmáticas que rodean las células germinales. Estos contactos son particularmente estrechos durante la espermatogénesis, en la que las espermátidas redondas haploides se diferencia produciendo el altamente especializado esperma mótil. Unas uniones estrechas entre células de Sertoli contiguas compartimentalizan el túbulo en una región basal, que contiene espermatogonios mitóticos y espermatocitos tempranos, y un compartimiento adluminal, que contiene espermatocitos meióticos y espermátidas en maduración. De hecho, una línea celular derivada de células de Sertoli dan soporte a la progresión meiótica de células germinales en cultivo, lo que es consistente con la idea de que los factores derivados de células de Sertoli contribuyen a la maduración de las células germinales (Rassoulzadegan, M. et al., Cell 75:997-1006, 1993). La pérdida de actividad de Dhh resulta en un fenotipo recesivo ligado al sexo. Los ratones hembra homocigóticos para la mutación eran completamente viables y fértiles, mientras que los ratones macho eran viables pero estériles. Un examen somero indica que, tan pronto como 18,5 dpc, los testículos de los machos mutantes son notablemente más pequeños que aquellos en compañeros de camada heterocigóticos (Bitgood et al., Curr. Biol. 6(3):298-304, 1996). De esta manera, las células de Sertoli es probable que regulen independientemente los estadios mitóticos y meióticos del desarrollo de las células germinales durante el desarrollo postnatal. Por lo tanto, debido a que patched-2 aparentemente es un receptor para Dhh (SEC ID nº 13), las moléculas que modulan la unión de Dhh (SEC ID nº 13) a patched-2 afectarían a la activación de la señalización de Dhh (SEC ID nº 13) y de esta manera presentarían utilidad en el tratamiento de condiciones que se encuentran moduladas por Dhh (SEC ID nº 13) (por ejemplo el cáncer testicular). Los antagonistas o agonistas de patched-2 pueden utilizarse para tratar trastornos o crear una condición fisiológica deseable mediante el bloqueo de la señalización de Dhh (por ejemplo la anticoncepción y el tratamiento de la infertilidad).
(2) Usos generales de patched-2
Las secuencias de nucleótidos (o el complemento de las mismas) codificantes de patched-2 presentan diversas aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapaje cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de patched-2 también resultará útil para la preparación de polipéptidos patched-2 mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente invención.
El gen patched-2 de secuencia nativa de longitud completa, o partes del mismo, pueden utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de longitud completa o para aislar todavía otros genes (por ejemplo aquellos codificantes de variantes naturales de patched-2), que presentan una identidad de secuencia deseada en comparación con la secuencia de patched-2 dada a conocer en la fig. 1 (SEC ID nº 1). Opcionalmente, la longitud de las sondas es de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de la secuencia de nucleótidos de la fig. 1 (SEC ID nº 1) o a partir de secuencias genómicas, incluyendo promotores, elementos intensificadores de intrones de patched-2 de secuencia nativa. A título de ejemplo, un procedimiento de cribado comprende aislar la región codificante del gen patched-2 utilizando la secuencia conocida de ADN para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con una diversidad de marcajes, incluyendo radionucleótidos, tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcajes enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina. Las sondas marcadas que presentan una secuencia complementaria a la del gen patched-2 de la presente invención pueden utilizarse para cribar bibliotecas de ADNc, ADN genómico o ARNm humanas para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en más detalle en los Ejemplos, posteriormente.
Las sondas también pueden utilizarse en técnicas de PCR para generar un pool de secuencias para la identificación de secuencias de patched-2 estrechamente relacionadas.
También pueden utilizarse secuencias de nucleótidos codificantes de patched-2 para construir sondas de hibridación para el mapaje del gen, que codifica patched-2 y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucléotidos proporcionadas en la presente invención pueden maparse cromosómicamente y localizarse en qué regiones específicas de un cromosoma se encuentran utilizando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de ligamiento frente a marcadores cromosómicos conocidos y el cribado de hibridación con bibliotecas.
Los polipéptidos patched-2 pueden utilizarse en ensayos para identificar las demás proteínas o moléculas implicadas en el acomplejamiento con patched-2, que finalmente resulta en la modulación de la señalización de hedgehog. Alternativamente, estas moléculas pueden modular la unión de patched-2 a Dhh (SEC ID nº 13). Mediante dichos procedimientos pueden identificarse los inhibidores de la interacción de unión. Además, el sustrato de patched-2 puede utilizarse para aislar las proteínas acomplejantes correlativas. Pueden diseñarse ensayos de cribado para encontrar compuestos líder que imiten la actividad biológica del patched-2 nativo o para encontrar aquellos que actúan como sustrato para patched-2. Entre dichos ensayos de cribado se incluyen ensayos que permiten el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciendo que resulten particularmente adecuados para identificar candidatos a fármaco de molécula pequeña. Estos inhibidores de molécula pequeña podrían bloquear la acción enzimática de patched-2, y de esta manera inhibir la señalización de hedgehog. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que se encuentran bien caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican patched-2 o las formas modificadas de los mimos también pueden utilizarse para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, resultan útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Los animales transgénicos o "knock out" son animales no humanos. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón o una rata) es un animal que presenta células que contienen un transgén, que se introdujo en el animal o en un antepasado del animal en una etapa prenatal, por ejemplo en una etapa embrionaria. Un transgén es una secuencia de ADN que se ha integrado en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla un animal transgénico. En una realización, puede utilizarse ADNc codificante de patched-2 para clonar ADN genómico codificante de patched-2 de acuerdo con técnicas establecidas y utilizarse las secuencias genómicas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN codificante de patched-2. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se ha convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes US nº 4.736.866 y nº 4.870.009. Típicamente, células particulares son dianas para la incorporación de transgén patched-2 con intensificadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia del transgén codificante de patched-2 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden utilizarse para examinar el efecto de la expresión incrementada de ADN codificante de patched-2. Dichos animales pueden utilizarse como animales de ensayo para reactivos que se cree proporcionan protección frente a, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas a su sobreexpresión.
Pueden utilizarse homólogos no humanos de patched-2 de vertebrado para construir un animal "knock out" para patched-2 que presente un gen defectivo o alterado codificante de patched-2 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno codificante de patched-2 y ADN genómico alterado codificante de patched-2 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc codificante de patched-2 para clonar ADN genómico codificante de patched-2 de acuerdo con técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico codificante de patched-2 puede delecionarse o sustituirse por otro gen, tal como un gen codificante de un marcador seleccionable que puede utilizarse para realizar el seguimiento de la integración. Típicamente se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5' como en el extremo 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51:503, 1987, para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias no humanas (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell 69:915, 1992]. A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal no humano (por ejemplo un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [ver, por ejemplo, Bradley, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, editor (IRL, Oxford, 1987), páginas 113 a 152]. Seguidamente, puede implantarse un embrión quimérico en una hembra nodriza pseudoembarazada adecuada y llevar al embrión a término para crear un animal "knock out". La progenie que porta el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y utilizarse para criar animales en los que la totalidad de las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales knockout pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente a determinadas condiciones patológicas y porque desarrollan condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido
patched-2.
La supresión o inhibición (antagonismo) de la señalización de Dhh también es un objetivo de las estrategias terapéuticas. Debido a que patched-2 puede combinarse con todos los miembros de la familia hedgehog (es decir Shh, Dhh, Ihh), las moléculas antagonistas que evitan la unión de las moléculas hedgehog a Ptch-2 (SEC ID nº 2) presentan utilidad terapéutica. Por ejemplo, la señalización de SHh es conocido que se activa en el carcinoma de células basales; Dhh (SEC ID nº 13) es conocido que se encuentra implicado en la regulación de la espermatogénesis. El inhibidor o antagonista de la señalización de Hh resultaría un terapéutico eficaz en el tratamiento del carcinoma de células basales o en la anticoncepción masculina, respectivamente.
La estimulación de la señalización de Dhh (agonismo) también es un objetivo de estrategias terapéuticas. Debido a que Ptch-2 (SEC ID nº 2) también se une a los demás miembros de la familia Hh, Ihh y Shh, la señalización de Dhh resultaría útil en estados de enfermedad o trastornos caracterizados por la señalización inactiva o insuficiente de Hh. Por ejemplo trastornos degenerativos del sistema nervioso, por ejemplo la enfermedad de Parkinson, los déficit de memoria, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Lou Gehrig, la enfermedad de Huntington, la esquizofrenia, la apoplejía y la drogadicción. Además, los agonistas de patched-2 podrían utilizarse para tratar enfermedades intestinales, enfermedades óseas, enfermedades de la piel, enfermedades de los testículos (incluyendo infertilidad), úlceras, enfermedades pulmonares, enfermedades del páncreas, diabetes y osteoporosis.
F. Anticuerpos anti-patched-2
También se dan a conocer en la presente invención anticuerpos anti-patched-2 de vertebrado. Entre los anticuerpos ejemplares se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
1. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos anti-patched-2 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Pueden prepararse anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizador y, si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizador y/o adyuvante se inyectan en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizador puede incluir el polipéptido patched-2 o una proteína de fusión del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizador con una proteína que es conocido que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, hemocianina de lapa americana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse e incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin experimentación indebida.
2. Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos anti-patched-2 pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando procedimientos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975. En un procedimiento de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado típicamente se inmuniza con un agente inmunizador para inducir que los linfocitos produzcan, o sean capaces de producir, anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizador. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizador típicamente incluye el polipéptido patched-2 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente se utilizan linfocitos sanguíneos periféricos ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o de nódulo linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agentede fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, páginas 59 a 103, 1986]. Las líneas celulares inmortalizadas habitualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPR.
Las líneas celulares inmortalizadas preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, que soportan un nivel elevado estable de expresión de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Son líneas celulares inmortalizadas más preferentes las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, páginas 51 a 63, 1987].
El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma seguidamente puede someterse a ensayo para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra patched-2. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220, 1980.
Tras identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma de ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o de líquido ascites mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de
afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en l patente US nº 4.816.567. El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Tras el aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo mediante la sustitución de la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murias homólogas [patente US nº 4.816.567; Morrison et al., supra] o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo, o puede sustituirse por el dominio variable de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera y de cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc, de manera que se impide el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo aminoácido o se delecionan de manera que impidan el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro también resultan adecuados para preparar anticuerpos monoclonales. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede conseguirse utilizando técnicas rutinarias conocidas de la técnica.
3. Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos anti-patched-2 además pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son las inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias ligantes de antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o de marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos dominios variable en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponde a aquéllas de una inmunoglobulina no huma, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado típicamente también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos de la técnica. Generalmente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que típicamente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988] mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se han sustituido por residuos procedentes de sitios análogo en anticuerpos
de roedores.
También pueden producirse anticuerpos humanos utilizando diversas técnicas conocidas de la técnica, incluyendo bibliotecas de expresión fágica [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, y Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991].
4. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que presentan especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para patched-2 de vertebrado, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.
Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos de la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera, en las que las dos cadenas pesadas presentan diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature 305:537-539, 1983]. Debido a que la distribución de cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas es aleatoria, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de los que únicamente uno presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991].
Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión de anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones de bisagra CH2 y CH3. Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs codificantes de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.
5. Anticuerpos heteroconjugados
También se dan a conocer en la presente invención anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que dichos anticuerpos dirigen células del sistema inmunológico a células no deseadas [patente US nº 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [patente WO nº 91/00360; patente WO nº 92/200373, patente EP nº 03089]. Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos de la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos que implica agentes entrecruzantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuros mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este fin se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la patente US nº 4.676.980.
G. Usos de los anticuerpos anti-patched-2
Los anticuerpos anti-patched-2 presentan diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-patched-2 pueden utilizarse en ensayos diagnósticos para patched-2, por ejemplo mediante la detección de su expresión en células, tejidos o suero específicos. Pueden utilizarse diversas técnicas de ensayo diagnóstico conocidas de la técnica, tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos de sándwich directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación llevados a cabo en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., páginas 147 a 158, 1987]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos diagnósticos pueden marcarse con un grupo detectable. El grupo detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína-rodamina o luciferina o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido de la técnica para conjugar el anticuerpo con el grupo detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature 144:945, 1962; David et al., Biochemistry 13:1014, 1974; Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981; y Nygren, J. Histochem. y Cytochem. 30:407, 1982.
Los anticuerpos anti-patched-2 también resultan útiles para la purificación por afinidad de patched-2 a partir de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este procedimiento, los anticuerpos contra patched-2 se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos de la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene patched-2 que debe purificarse, y después el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente la totalidad del material en la muestra excepto patched-2, que se encuentra unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará patched-2 del anticuerpo.
El carcinoma de células basales (BCC) es el cáncer humano más común. Se ha descubierto que la ruta de señalización de Hh se encuentra activada en todos los BCCs. La pérdida de la función de patched se cree que conduce a la actividad no regulada de Smo y que es responsable de aproximadamente la mitad de los BCCs. Debido a que patched es una diana de la ruta Hh misma, se han detectado niveles incrementados de ARNm de patched en el BCC [Gailani et al., Nature Genet. 14:78-81, 1996], así como en modelos animales de BCC (Oro et al., Science 276:817-821, 1997; Xié et al., Nature 391:90-92, 1998]. La activación anormal de la señalización de Sh, tal como la que se produce en el BCC, se examinó con el fin de confirmar si la expresión de patched-2 se encontraba incrementada. Tal como se muestra en la fig. 9, una hibridación in situ para Ptch (SEC ID nº 4) y Ptch-2 (SEC ID nº 2) en ratones transgénicos para Smo-M2 (SEC ID nº 16) (Xie et al., supra), aunque más reducida que para Ptch, todavía era elevada en células tuomrales. Esto sugiere que los anticuerpos terapéuticos dirigidos contra Ptch-2 (SEC ID nº 2) podrían resultar útiles para el tratamiento del BCC.
Los anticuerpos anti-patched-2 también presentan utilidades similares a aquéllas articuladas bajo la sección anterior titulada "E. Usos de patched-2". Dependiendo de si los anticuerpos anti-patched-2 se unen a receptores de patched-2 de manera que inhiben la señalización de Hh (antagonista) o si inhiben el acomplejamiento de patched-2 con Smo (SEC ID nº 17) y de esta manera eliminan el efecto inhibidor normal de Smo (SEC ID nº 17) sobre la señalización de Hh (agonista), el anticuerpo presentará utilidades correspondientes a aquéllas articuladas anteriormente para patched-2.
H. Antagonistas de patched-2
Pueden utilizarse convenientemente varios enfoques para crear compuestos antagonistas y agonistas de patched-2. Resulta adecuado cualquier enfoque en el que pueda dirigirse la molécula antagonista hasta el interior de la célula, interfiriendo o impidiendo el funcionamiento normal del patched-2 de tipo salvaje. Por ejemplo, los inhibidores competitivos, incluyendo los receptores patched-2 mutantes que impiden que patched-2 de tipo salvaje se una correctamente a otras proteínas necesarias para la señalización de Dhh y Hh. Las propiedades adicionales de dichas moléculas antagonistas o agonistas son fácilmente determinables por un experto ordinario en la materia, tal como el tamaño, la carga y la hidrofobicidad adecuados para el transporte transmembranal.
En el caso de que deban identificarse o evaluarse miméticos u otros homólogos de mamífero de patched-2, las células se exponen al compuesto de ensayo y se comparan con controles positivos expuestos únicamente a patched-2 humano, y a controles negativos no expuestos ni al compuesto ni al ligando natural. En el caso de que deban identificarse o evaluarse antagonistas o agonistas de la modulación de señal de patched-2, las células se exponen al compues-
to en presencia del ligando natural y se comparan a los controles que no han sido expuestos al compuesto de ensayo.
Pueden utilizarse ensayos de detección como cribado primario para evaluar la actividad de inhibición/intensifica-
ción de la señalización de Hh de los compuestos antagonistas/agonistas. Los ensayos también pueden utilizarse para evaluar la potencia relativa de un compuesto mediante el ensayo de un abanico de concentraciones, en un intervalo de entre 100 mM y 1 pM, por ejemplo, y calculando la concentración a la que el nivel de fosforilación o la transducción de señales se reduce o se incrementa en 50% (IC_{50}) en comparación con los controles.
Pueden llevarse a cabo ensayos para identificar compuestos que afectan a la señalización de Hh de sustratos patched-2. Específicamente, pueden llevarse a cabo ensayos para identificar compuestos que incrementan la actividad de fosforilación de patched-2 o pueden llevarse a cabo ensayos para identificar compuestos que reducen la señalización de Hh de sustratos patched-2. Estos ensayos pueden llevarse a cabo en células completas o en extractos celulares. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de cribado bioquímico, los inmunoensayos, los ensayos basados en células, etc. Dichos formatos de ensayos son bien conocidos de la técnica.
Los ensayos de cribado de la presente invención pueden utilizarse en el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, y resultan particularmente adecuados para identificar candidatos a fármaco de molécula pequeña.
(1) Moléculas antagonistas y agonistas
Para cribar para antagonistas y/o agonistas de la señalización de patched-2, la mezcla de ensayo se incuba bajo condiciones en las que, excepto por la presencia del agente farmacológico candidato, patched-2 induce la señalización hedgehog con una actividad de referencia. Los componentes de la mezcla pueden añadirse en cualquier orden que proporcione la actividad hedgehog necesaria. Puede llevarse a cabo la incubación a cualquier temperatura que facilite la unión óptima, típicamente entre aproximadamente 4ºC y 40ºC, más comúnmente entre aproximadamente 15ºC y 40ºC. Los periodos de incubación de manera similar se seleccionan para la unión óptima, aunque también se minimizan para facilitar el cribado de alto rendimiento rápido, y típicamente se encuentran comprendidos entre aproximadamente 0,1 y 10 horas, preferentemente menos de 5 horas, más preferentemente menos de 2 horas. Tras la incubación, se determina de cualquier manera conveniente el efecto del agente farmacológico candidato sobre la señalización de patched-2. Para los ensayos de tipo unión libre de células, con frecuencia se utiliza una etapa de separación para separar los componentes unidos y no unidos. La separación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante precipitación (por ejemplo precipitación con TCA, inmunoprecipitación, etc.), la inmovilización (por ejemplo sobre un sustrato sólido), seguido de lavado. La proteína unida convenientemente se detecta aprovechando un marcaje detectable unido a la misma, por ejemplo mediante la medición de la emisión radioactiva, la densidad óptica o electrónica o mediante detección indirecta utilizando, pro ejemplo, conjugados con anticuerpo.
Un procedimiento de cribado para antagonistas y/o agonistas de patched-2 adecuados implica la aplicación de Dhh y opcionalmente otros ligandos hedgehog. Dicho ensayo de cribado podría comparar la hibridación in situ en presencia y en ausencia del antagonista y/o agonista candidato en un tejido que expresa patched-2, así como la confirmación o ausencia de desarrollo celular modulado por patched-2. Típicamente estos procedimientos implican exponer un patched-2 inmovilizado (tal como se ha definido anteriormente) a una molécula que se sospecha que se une al mismo, y determinar el nivel de activación cadena abajo de unión de ligando de constructos informadores y/o evaluando si la molécula activa o no (o bloquea la activación) de patched-2. Con el fin de identificar dichos ligandos de unión de patched-2, patched-2 puede expresarse sobre la superficie de una célula y utilizarse para cribar bibliotecas de compuestos candidatos sintéticos o compuestos de origen natural (por ejemplo a partir de fuentes endógenas, tales como suero o células).
Entre las moléculas adecuadas que afectan a la interacción proteína-proteína de patched-2 y las proteínas de unión del mismo se incluyen fragmentos de los últimos o moléculas pequeñas, por ejemplo peptidomiméticos, que inhibirán la interacción ligando-receptor. Dichas moléculas pequeñas, que habitualmente presentan un peso molecular inferior a 10 K, preferentemente son terapéuticos debido a que son más probablemente permeables a las células, son menos susceptibles a la degradación por diversos mecanismos celulares, y no son tan capaces de inducir una respuesta inmunológica como las proteínas. Entre las moléculas pequeñas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Muchas compañías farmacéuticas presentan bibliotecas extensivas de dichas moléculas, que pueden cribarse convenientemente mediante la utilización de los ensayos dados a conocer en la presente invención. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen proteínas, péptidos, glucoproteínas, glucopéptidos, glucolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y metabolitos de los mismos, secuencias de control transcripcional y traduccional, y similares.
Una técnica preferente para identificar moléculas que se unen a patched-2 utiliza un sustrato quimérico (por ejemplo patched-2 etiquetado con epítopo o inmunoadhesina patched-2) unido a una fase sólida, tal como el pocillo de una placa de ensayo. Puede medirse la unión de las moléculas candidatas, que opcionalmente se marcan (por ejemplo se marcan radioactivamente), al receptor inmovilizado. Alternativamente, puede medirse la competición para diversas rutas de Hh, especialmente Dhh (SEC ID nº 13). Durante el cribado para antagonistas y/o agonistas, puede exponerse patched-2 a un sustrato de patched-2 seguido del antagonista y/o agonista putativo, o añadirse simultáneamente proteína de unión a patched-2 y antagonista y/o agonista, y evaluarse la capacidad del antagonista y/o agonista de bloquear la activación de patched-2.
(2) Ensayo de detección
Los polipéptidos patched-2 resultan útiles en ensayos para identificar compuestos líder para agentes terapéuticamente activos que modulan la señalización hedgehog de receptor/ligando de patched-2. Específicamente, pueden identificarse convenientemente compuestos líder que impiden la formación de complejos de señalización de patched-2 o que impiden o atenúan la señalización hedgehog modulada por patched-2 (por ejemplo la unión a
patched-2).
Pueden utilizarse diversos procedimientos conocidos de la técnica para identificar, evaluar o someter a ensayo la inhibición de la actividad de las proteínas patched-2. Debido a que se cree que patched-2 es un receptor de Dhh (SEC ID nº 13), aunque también se une a Shh (SEC ID nº 14) y a 1hh (SEC ID nº 29), también pueden utilizarse técnicas que es conocido que se utilizan para identificar moduladores de ligando/receptor. En general, dichos ensayos implican exponer células diana en cultivo a los compuestos y: (a) analizar bioquímicamente los lisados celulares para evaluar el nivel y/o identidad de unión, o (b) puntuar los cambios fenotípicos o funcionales en células tratadas en comparación con las células de control que no se expusieron a la sustancia de ensayo. Dichos ensayos de cribado se describen en las patentes US nº 5.602.171, nº 5.710.173 y WO nº 96/35124 y nº 96/40276.
(a) Técnicas bioquímicas de detección
El análisis bioquímico puede evaluarse mediante una diversidad de técnicas. Una mezcla de ensayo típica que puede utilizarse contiene patched-2 y una proteína ligando a la que patched-2 se encuentra asociada normalmente (por ejemplo Dhh (SEC ID nº 13)) habitualmente en una forma aislada parcialmente pura o pura. Uno de dichos componentes o ambos puede ser patched-2 u otro péptido o polipéptido que puede, por ejemplo, proporcionar o intensificar la unión de proteína-proteína, mejorar la estabilidad bajo condiciones de ensayo, etc. Además, uno de los componentes habitualmente comprende o se encuentra acoplado a un marcaje detectable. El marcaje puede permitir la detección directa mediante la medición de la radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc., o la detección indirecta, por ejemplo en forma de etiqueta epítopo, enzima, etc. La mezcla de ensayo adicionalmente puede comprender un agente farmacológico candidato y opcionalmente una diversidad de otros componentes, tales como sales, tampones, proteínas portadoras, por ejemplo albúmina, detergentes, inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc., que facilitan la unión, incrementan la estabilidad, reducen las interacciones no específicas o de fondo, o que mejoran la eficiencia o la sensibilidad del ensayo.
También pueden utilizarse los procedimientos de detección siguientes en un sistema libre de células en el que el lisado celular que contiene la molécula de sustrato transductor de señales y patched-2 se mezclan con un compuesto de la invención. Para evaluar la actividad del compuesto, la mezcla de reacción puede analizarse mediante la técnica de SDS-PAGE o puede añadirse al anticuerpo de anclaje específico de sustrato unido a un soporte sólido, y se lleva a cabo un procedimiento de detección tal como se ha descrito anteriormente en el sustrato separado o capturado, para evaluar la presencia o la ausencia de un ligando de unión a patched-2. Los resultados se comparan a aquellos obtenidos con mezclas de reacción en las que no se ha añadido el compuesto. El sistema libre de células no requiere el ligando natural ni conocimiento de su identidad. Por ejemplo, Posner et al. (la patente US nº 5.155.031 describe la utilización de receptor de insulina como sustrato y adipocitos de rata como células diana para demostrar la capacidad del pervanadato de inhibir la actividad de PTP). En otro ejemplo, Burke et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 204:129-134, 1994, describe la utilización de receptor de insulina autofosforilado y PTP1B recombinante en la evaluación de la actividad inhibidora de un mimético fosfotirosilo.
(i) Detección de células completas
Una técnica común implica incubar células con patched-2 y ligando marcado radioactivamente, lisar las células, separar los componentes celulares proteicos del lisado utilizando una técnica de gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), en una o dos dimensiones, y detectar mediante la exposición de película de rayos X la presencia de proteínas marcadas. La detección también puede llevarse a cabo sin utilizar marcaje radioactivo. En dicha técnica, los componentes proteicos (por ejemplo separados mediante SDS-PAGE) se transfieren a una membrana de nitrocelulosa en la que se detecta la presencia de complejos de patched-ligando utilizando un anticuerpo anti-ligando.
Alternativamente, el anticuerpo anti-ligando de patched-2 puede conjugarse con un enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, y detectarse mediante la adición posterior de un sustrato colorimétrico para el enzima. Una alternativa adicional implica detectar el anticuerpo anti-ligando de patched-2 mediante la reacción con un segundo anticuerpo que reconoce el anticuerpo anti-ligando de patched-2, marcando este segundo anticuerpo con un grupo radioactivo o un enzima, tal como se ha descrito anteriormente. Se describen ejemplos de estas técnicas y otras similares en Hansen et al., Electrophoresis 14:112-126, 1993; Campbell et al., J. Biol. Chem. 268:7427-7434, 1993; Donato et al., Cell Growth Diff. 3:258-268, 1992; Katagiri et al., J. Immunol. 150:585-593, 1993. Además, el anticuerpo anti-ligando de patched-2 puede detectarse mediante el marcaje del mismo con una sustancia radioactiva, seguido del escaneo de la nitrocelulosa marcada para detectar la radioactividad o la exposición de película de rayos X.
Pueden desarrollarse procedimientos de detección adicionales que resultan referentes respecto a aquellos descritos anteriormente. Especialmente para la utilización en el cribado de alto rendimiento, se espera que dichos procedimientos muestren buena sensibilidad y especificidad, rango lineal extendido, señal de fondo reducida, fluctuación mínima, compatibilidad con otros reactivos y compatibilidad con sistemas de manipulación automatizados.
Puede estudiarse la eficacia in vivo del tratamiento de la presente invención contra tumores inducidos químicamente en diversos modelos roedores. Pueden introducirse líneas de células tumorales propagadas in vitro, en roedores experimentales, tal como ratones mediante inyección, por ejemplo por la vía subcutánea. Las técnicas para la inducción química de tumores en animales experimentales son bien conocidas de la técnica.
(ii) Ensayos de quinasa
Debido a que patched-2 es un regulador negativo de la señalización de Hh, que al resultar activado por Hh libera el efecto inhibidor normal sobre Smo, puede medirse la inhibición de la unión de patched-2 a Smo mediante la activación de diversos sustratos de quinasa asociados a la señalización de Hh. En el caso de que los procedimientos de cribado de la presente invención para antagonistas/agonistas de patched-2 se lleven a cabo en forma de ensayo ex vivo, la quinasa diana (por ejemplo fused) puede ser polipéptido sustancialmente purificado. El sustrato de quinasa (por ejemplo MBP, Glt) es un sustrato sustancialmente purificado, que en el ensayo se fosforila en una reacción con una fuente de fosfato sustancialmente purificada que es catalizada por la quinasa. El grado de fosforilación se determina midiendo la cantidad de sustrato fosforilado en la reacción. Puede utilizarse una diversidad de posibles sustratos, incluyendo la quinasa misma, en cuyo caso la reacción de fosforilación medida en el ensayo es la autofosforilación. También pueden utilizarse sustratos exógenos, incluyendo sustratos estándares de proteína, tales como la proteína básica de mielina (MBP; sustratos proteína de levadura; sustratos péptido sintéticos y sustratos de polímero). De entre estos, MBP y otros sustratos proteína estándares pueden considerarse preferentes. Sin embargo, pueden identificarse otros sustratos que son superiores respecto a: la afinidad para la quinasa, perturbación mínima de la cinética de reacción, la posesión de sitios de reacción únicos u homogéneos, la facilidad de manipulación y la recuperación posterior a la reacción, el potencial de fuerte generación de señales y la resistencia o el carácter de inerte frente a los compuestos de ensayo.
La medición de la cantidad de sustrato fosforilado en el ensayo ex vivo de la invención puede llevarse a cabo por medio de inmunoensayo, radioensayo u otros procedimientos bien conocidos. En una medición de inmunoensayo, puede utilizarse un anticuerpo (tal como un anticuerpo anti-fosfoserina/treonina de cabra o de ratón) que es específico para grupos fosforilados formados durante la reacción. Utilizando técnicas ELISA bien conocidas, el complejo de anticuerpo fosfoserina/treonina propio sería detectado con un anticuerpo adicional unido a un marcaje capaz de desarrollar una señal medible (tal como por ejemplo un marcaje fluorescente o radioactivo). Además, los ensayos de tipo ELISA en placas de microtitulación pueden utilizarse para someter a ensayo sustratos purificados (Peraldi et al., J. Biochem. 285:71-78, 1992; Schraag et al., Anal. Biochem. 211:233-239, 1993; Cleavland, Anal. Biochem. 190:249-253, 1990; Farley, Anal. Biochem. 203:151-157, 1992, y Lozaro, Anal. Biochem. 192:257-261, 1991.
Por ejemplo, los esquemas de detección pueden medir el agotamiento de sustrato durante la reacción de quinasa. Inicialmente, la fuente de fosfato puede marcarse radioactivamente con un isótopo, tal como ^{32}P o ^{33}P, y la cantidad de fosforilación de sustrato puede medirse determinando la cantidad de marcaje radioactivo incorporado en el sustrato durante la reacción. La detección puede conseguirse con: (a) placas que contienen líquido de centelleo disponibles comercialmente y perlas utilizando un contador beta, tras la adsorción a un filtro o a una superficie de pocillo de microtitulación, o (b) medios fotométricos tras la unión a un ensayo de proximidad por centelleo o a una placa de centelleo (Weemink y Kijken, J. Biochem. Biophys. Methods 31:49, 1996; Braunwalder et al., Anal. Biochem. 234:23, 1996; Kentrup et al., J. Biol. Chem. 271:3488, 1996, y Rusken et al., Meth. Enzymol. 200:98, 1991.
Preferentemente, el sustrato se une a una superficie de soporte sólido por medio de una unión no específica o, preferentemente, una unión específica. Dicha unión permite la separación del sustrato fosforilado de la fuente de fosfato marcada no incorporada (tal como adenosín-trifosfato previamente a la detección de señales). En una realización, el sustrato puede inmovilizarse físicamente previamente a la reacción, tal como mediante la utilización de la placa Nunc^{TM} de unión elevada a proteínas (Hanke et al., J. Biol. Chem. 271:695, 1996) o placas Wallac ScintiStrip^{TM} (Braunwalder et al., Anal. Biochem. 234:23, 1996). El sustrato también puede inmovilizarse tras la reacción mediante captura sobre, por ejemplo, fosfocelulosa P81 (para péptidos básicos), PEI/ácido, resina de molibdato o DEAE, o precipitación con TCA sobre papel 3 MM de Whatman^{TM} (Tiganis et al., Arch. Biochem. Biophys. 325:289, 1996; Morawetz et al., Mol. Gen. Genet. 250:17, 1996; Budde et al., Int. J. Pharmacognosy 33:27, 1995, y Casnellie, Meth. Enz. 200:115, 1991). Todavía otra posibilidad es la unión del sustrato a la superficie de soporte, tal como mediante conjugación con parejas de unión, tales como glutatión y estreptavidina (en el caso de GST y biotina), respectivamente), que se han unido al soporte, o mediante anticuerpos específicos para las etiquetas que de manera similar se encuentran unidas al soporte.
Pueden desarrollarse procedimientos de detección adicionales que resultan preferentes respecto a aquellos descritos anteriormente. Especialmente para la utilización con el cribado de alto rendimiento, se espera que dichos procedimientos podrían mostrar una buena sensibilidad y especificidad, un rango lineal extendido, una señal de fondo reducido, una fluctuación mínima, compatibilidad con otros agentes y compatibilidad con sistemas de manipulación automatizados.
La eficacia in vivo del tratamiento de la presente invención puede estudiarse frente a tumores químicamente inducidos en diversos modelos de roedor. Las líneas celulares tumorales propagadas en cultivos celulares in vitro pueden introducirse en roedores experimentales, por ejemplo en ratones mediante inyección, por ejemplo por la vía subcutánea. Las técnicas para el tratamiento químico de tumores en animales experimentales son bien conocidas de la
técnica.
(b) Técnicas biológicas de detección
La capacidad de los compuestos antagonistas/agonistas de modular la actividad de patched-2, que modula él mismo la señalización hedgehog, también puede medirse evaluando los cambios morfológicos o funcionales asociados a la unión de ligando. Puede aplicarse cualquier técnica cualitativa o cuantitativa conocida de la técnica para observar y medir los procesos celulares que se encuentre bajo el control de patched-2. La actividad de los compuestos de la invención también puede evaluarse en animales utilizando modelos experimentales de trastornos causados o relacionados a la señalización hedgehog disfuncional. Por ejemplo, la señalización Dhh ineficaz en ratones conduce a ratones viables aunque estériles. Además, la señalización correcta de Shh resulta crítica para el desarrollo embrionario murino en el notocordio y en la placa del suelo, tubo neural, estructuras de extremidades distales, columna espinal y costillas. La señalización de Shh incorrecta también se correlaciona con ciclopia. Cualquiera de estas propiedades fenotípicas podría evaluarse y cuantificarse en un ensayo de cribado para antagonistas y/o agonistas de patched-2. Los estados de enfermedad asociados a la sobreexpresión de hedgehog se asocian con carcinoma de células basales, mientras que la señalización de Shh inactiva conduce a un desarrollo neural incorrecto.
Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse en la formulación de un abanico de dosis para la utilización en seres humanos. La dosis de compuestos de la invención debe encontrarse comprendida dentro de un intervalo de concentraciones circulantes con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y de la vía de admi-
nistración.
(2) Oligonucleótidos antisentido
Otra clase de antagonistas implica la utilización de técnicas de terapia génica, incluyendo la administración de oligonucleótidos antisentido. Entre las técnicas de terapia génica aplicables se incluyen la administración única o múltiple de ADN o ARNm terapéuticamente eficaces. Los ARNs y ADNs antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de determinados genes in vivo. Pueden importarse oligonucleótidos antisentido cortos de referencia en células, donde actúan como inhibidores, a pesar de las reducidas concentraciones intracelulares de los mismos causadas por la incorporación restringida a través de la membrana celular (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146, 1986). Los oligonucleótidos antisentido pueden modificarse para incrementar la incorporación de los mismos, por ejemplo mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster de carga negativa por grupos no cargados.
Existe una diversidad de técnicas conocidas para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere al interior de células en cultivo in vitro, ex vivo o in vivo en las células del huésped pretendido. Entre las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico al interior de las células de mamífero in vitro se incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, etc. Entre las técnicas de transferencia génica in vivo actualmente preferentes se incluyen la transfección con vectores víricos (típicamente retrovíricos) y la transfección mediada por proteína de cubierta vírica-liposoma (Dzau et al., Trends Biotech. 11:205-210, 1993). En algunas situaciones resulta deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que reconozca las células, tal como un anticuerpo específico para una proteína membranal de superficie celular asociada a endocitosis que puede utilizarse para dirigir y/o facilitar la incorporación, por ejemplo proteínas de cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos de proteínas que experimentan internalización durante el ciclo, y proteínas que se dirigen a una localización intracelular y incrementen la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, en Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414, 1990. Para una revisión de protocolos conocidos de reconocimiento génico y terapia génica, ver Anderson et al., Science 256:808-813, 1992.
La expresión de patched-2 puede reducirse proporcionando a células que expresan patched-2 una cantidad de ARN o ADN antisentido de patched-2 eficaz para reducir la expresión de la proteína patched-2.
I. Usos diagnósticos
Otro uso de compuestos tales como patched-2 y anticuerpos patched-2 y anti-patched-2 indicados en la presente invención es la ayuda en el diagnóstico de si un trastorno se encuentra controlado, en algún grado, por patched-2 o señalización hedgehog. Por ejemplo, las células del carcinoma de células basales se asocian a la señalización hedgehog activa, la formación de espermatocitos se asocia con la señalizacion Dhh y patched defectivo y la supresión de patched-2 pueden encontrarse asociados a carcinomas testiculares.
Un ensayo diagnóstico para determinar si un trastorno particular se encuentra controlado por señalización hedgehog modulada por patched-2 puede llevarse a cabo a partir de las etapas siguientes: (1) cultivo de células o tejidos de ensayo, (2) administrar un compuesto que pueda impedir la unión de patched-2 a Smo (SEC ID nº 17), activando de esta manera la ruta de señalización Hh, y (3) medir la magnitud de la señalización Hh. Las etapas pueden llevarse a cabo utilizando técnicas estándares a la luz de la presente exposición. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas estándares para el aislamiento de células o tejidos y su cultivo, o in vivo.
Los compuestos de grado variable de selectividad resultan útiles para diagnosticar el papel de patched-2. Por ejemplo, los compuestos que inhiben patched-2 además de otra forma de quinasa pueden utilizarse como compuesto de ensayo inicial para determinar si uno de entre varios ligandos de señalización controlar el trastorno. A continuación, los compuestos selectivos pueden utilizarse para eliminar adicionalmente el posible papel de otros ligandos en el control del trastorno. Los compuestos de ensayo deberían ser más potentes en la inhibición de la actividad de unión de ligando-patched que en la acción de un efecto citotóxico (por ejemplo una IC_{50}/LD_{50} superior a uno). La IC_{50} y la LD_{50} pueden medirse mediante técnicas estándares, tales como un ensayo MTT, o mediante la medición de la cantidad de LDH liberado. El grado de IC_{50}/LD_{50} de un compuesto debe tomarse en consideración durante la evaluación del ensayo diagnóstico. Por ejemplo, cuando más elevada sea la proporción IC_{50}/LD_{50}, más relativa es la información. También pueden utilizarse como parte del ensayo diagnóstico, controles apropiados que consideren el posible efecto citotóxico de un compuesto, por ejemplo el tratamiento de células no asociadas a un trastorno proliferativo celular (por ejemplo células de control) con un compuesto de ensayo. Los procedimientos diagnósticos descritos en la presente invención implican el cribado para agentes que modulan los efectos de patched-2 sobre la señalización hedgehog. Entre las técnicas de detección ejemplares se incluyen el marcaje radioactivo y la inmunoprecipitación (patente US nº 5.385.915).
J. Composiciones y dosis farmacéuticas
Las formulaciones terapéuticas de las composiciones indicadas en la presente invención se preparan para el almacenamiento en forma de formulaciones liofilizada o de soluciones acuosas mediante la mezcla de la molécula patched-2, un agonista y/o antagonista con el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores "farmacéuticamente aceptables" o "fisiológicamente aceptables" opcionales utilizados típicamente en la técnica (la totalidad de los cuales se denominan "excipientes"). Por ejemplo agentes tamponadores, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos varios (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, editor A. Osol, 1980). Dichos aditivos deben ser no tóxicos para el receptor a las dosis y concentraciones utilizadas.
Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH dentro del intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Preferentemente se encuentran presentes a una concentración comprendida entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 50 mM. Entre los agentes tamponadores adecuados se incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones citrato (por ejemplo mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones succinato (por ejemplo mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones tartrato (por ejemplo mezclas de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones fumarato (mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.) tampones gluconato (por ejemplo mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico, etc.), tampón oxalato (por ejemplo mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico- gluconato potásico, etc.), tampones lactato (por ejemplo mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.) y tampones acetato (por ejemplo mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). Además, pueden mencionarse los tampones fosfato, los tampones histidina y las sales trimetilamina, tales como Tris.
Se añaden conservantes para retrasar el crecimiento microbiano, y se añaden en cantidades comprendidas entre 0,2% y 1% (p/v). Entre los conservantes adecuados se incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabén, propilparabén, cloruro de octadecildietilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo cloro, bromo, yodo), cloruro de hexametonio, alquilparabenes, tales como metil o propilparabén, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.
Se encuentran presentes isotonificadores, en ocasiones denominados "estabilizadores", para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas indicadas en la presente invención y entre ellas se incluyen los alcoholes de azúcar polihídrico, preferentemente los alcoholes de azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihídricos pueden encontrarse presentes en una cantidad comprendida entre 0,1% y 25% en peso, preferentemente entre 1% y 5%, considerando las cantidades relativas de los demás ingredientes.
Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes con funciones comprendidas entre agente de carga y un aditivo que solubiliza los agentes terapéuticos o ayuda a evitar la desnaturalización o la adherencia a las paredes del recipiente. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídrico (listados anteriormente); aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles, tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores azufrados, tales como urea, glutatión, ácido tiocítico, tioglicolato sódico, tioglicerol, \alpha-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir <10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero humo, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glcosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa, sacarosa, y trisacáridos, tales como rafinosa; polisacáridos, tales como dextrano. Los estabilizadores pueden encontrarse presentes en el intervalo de entre 0,1 y 10.000 partes en peso por cada parte en peso de proteína activa.
Los surfactantes o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") se encuentran presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por agitación, que también permite que la formulación se exponga a tensiones de cizalla superficial sin que se produzca la desnaturalización de la proteína. Entre los surfactantes no iónicos adecuados se incluyen los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), los polioles Pluronic® y los polioxietilén sorbitán monoéteres (Tween®-20, Tween®-80, etc.). Los surfactantes no iónicos se encuentran presentes en el intervalo de entre aproximadamente 0,05 mg/ml y aproximadamente 1,0 mg/ml, preferentemente entre aproximadamente 0,07 mg/ml y aproximadamente 0,2 mg/ml.
Entre los diversos excipientes se incluyen agentes de carga (por ejemplo almidón), agentes quelantes (por ejemplo EDTA), antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes.
La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Por ejemplo, puede resultar deseable proporcionar adicionalmente un agente inmunosupresor. Dichas moléculas convenientemente se encuentran presentes en combinación en cantidades que resultan eficaces para el fin pretendido.
Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, editor A. Osal, 1980.
Las formulaciones que deben utilizarse par ala administración in vivo deben ser estériles. Ello se consigue fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen los compuestos de la invención, encontrándose dichas matrices en la forma de productos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente US nº 3.773.919), copolímeros ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de coopolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque algunos polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los compuestos encapsulados de la invención permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlaces S-S intermoleculares mediante el intercambio de tiodisulfuros, la estabilización puede conseguirse mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, la liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la utilización de aditivos apropiados y el desarrollo de composiciones de matriz de polímero específicas.
La cantidad de polipéptido, anticuerpo o fragmento del mismo, terapéutico que resultará eficaz en el tratamiento de un trastorno o condición particular dependerá de la naturaleza del trastorno o condición, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares. En caso posible, resulta deseable determinar la curva de dosis-respuesta y las composiciones farmacéuticas indicadas en la presente invención en primer lugar in vitro, y después en sistemas modelos animales útiles previamente al ensayo en seres humanos. Sin embargo, basándose en el conocimiento común de la técnica, una composición farmacéutica eficaz en la modulación de la señalización de Dhh y Hh puede proporcionar una concentración local de proteína patched-2 comprendida entre aproximadamente 10 y 1.000 ng/ml, preferentemente de entre 100 y 800 ng/ml y más preferentemente comprendida entre aproximadamente 200 ng/ml y 600 ng/ml de Ptch-2 (SEC ID nº 2).
Puede administrarse una solución acuosa de polipéptido, anticuerpo o fragmento de los mismos terapéutico mediante inyección subcutánea. Cada dosis puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 50 \mug por kilogramo de peso corporal, o más preferentemente, entre aproximadamente 3 \mug y aproximadamente 30 \mug por kilogramo de peso corporal.
El programa de dosificación para la administración subcutánea puede variar entre una vez a la semana y diariamente, dependiendo de varios factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la severidad de la enfermedad y la sensibilidad del sujeto al agente terapéutico.
El polipéptido patched-2 puede comprender una secuencia de aminoácidos o subsecuencia de la misma tal como se indica en la fig. 1, una secuencia activa de aminoácidos derivada de la misma, o una secuencia funcionalmente equivalente debido a que dicha subsecuencia se cree que comprende la parte funcional del polipéptido patched-2.
Si el sujeto manifiesta efectos secundarios no deseados, tales como elevación de la temperatura, síntomas de tipo resfriado o gripe, fatiga, etc., podría resultar deseable administrar una dosis inferior a intervalos más frecuentes. Puede administrarse uno o más fármacos adicionales en combinación con patched-2 para aliviar dichos efectos secundarios no deseados, por ejemplo un agente antipirético, antiinflamatorio o analgésico.
Los ejemplos siguientes se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.
Ejemplos
Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los ejemplos siguientes y en toda la especificación con los números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Ejemplo 1 Introducción
En la superficie celular, la función de Hh aparentemente se encuentra mediada por un complejo receptor multicomponente que implica Ptch y Smo (SEC ID nº 17), dos proteínas multi-transmembranales inicialmente identificadas como genes de polaridad de los segmentos en Drosophila y posteriormente caracterizados en vertebrados (Nakano, Y. et al., Nature 341:508-513, 1989; Goodrich et al., Gene Dev. 10:301-312, 1996; Marigo et al., Develop. 122:1225-1233, 1996; van den Heuvel et al., Nature 382:547-551, 1996; Alcedo et al., Cell 86:221-23, 1996; Stone et al., Nature 384:129-34, 1996). La evidencia tanto genética como bioquímica apoya la existencia de un complejo receptor en el que Ptch (SEC ID nº 4) es la subunidad de unión de ligando, y en el que Smo (SEC ID nº 17), una molécula de tipo receptor acoplada a proteína G, es el componente de señalización (Stone et al., Nature 384:129-134, 1996; Marigo et al., Nature 384:176-179, 1996; Chen et al., Cell 87:553-63, 1996). Tras la unión de Hh a Ptch (SEC ID nº 4), se alivia el efecto inhibidor normal de Ptch (SEC ID nº 4) sobre Smo (SEC ID nº 17), permitiendo que Smo (SEC ID nº 17) transduzca la señal de Hh a través de la membrana plasmática.
Resultados
Todavía no se ha establecido si el complejo de receptor PTCHISMO media en la acción de la totalidad de los 3 Hh de mamífero o si existen componentes específicos. Recientemente se ha aislado un segundo gen Patched murino, mPatched-2 (SEC ID nº 7) [Motoyama et al., Nature Genet. 18:104-106, 1998] aunque su función como receptor Hh no ha sido establecida. Con el fin de caracterizar patched-2 (SEC ID nº 2) y compararlo con Patched (SEC ID nº 4) con respecto a la función biológica de los diversos miembros de la familia de Hh, los presentes inventores cribaron bases de datos EST con la proteína Patched (SEC ID nº 4) e identificaron 2 candidatos EST para un nuevo gen patched humano. Se clonó un ADNc de longitud completa codificante de Ptch-2 humano (SEC ID nº 2) a partir de una biblioteca de testículo. El codón ATG de inicio define un marco de lectura abierto de 3.612 nucleótidos codificante de una proteína de 1.204 aminoácidos de longitud con un peso molecular teórico de aproximadamente 131 kDa. La identidad total entre Ptch humano (SEC ID nº 4) y Ptch-2 (SEC ID nº 2) es de 54% (fig. 1), mientras que la identidad entre PTCH-2 3 humano y Ptch-2 de ratón recientemente descrito (SEC ID nº 7) es de 90% (fig. 8). La diferencia estructural más evidente entre las dos proteínas Patched humanas es un dominio citoplasmático C-terminal truncado en Ptch-2 (SEC ID nº 2). Además, únicamente uno de los dos sitios de glucosilación presente en Ptch (SEC ID nº 4) se encuentra conservado en Ptch-2 (SEC ID nº 2).
Para determinar si Patched-2 es un receptor Hh y si las dos moléculas Patched son capaces de discriminar entre los diversos ligandos Hh mediante unión específica. Los solicitantes transfectaron células de riñón embrionario 293 humanas con constructos de expresión Ptch (SEC ID nº 4) o Ptch-2 (SEC ID nº 2) y analizaron las células para la unión de Shh, Dhh e Ihh. Tal como se muestra en la figura 7A, la unión de ^{125}I-Shh puede encontrarse sometida a competición con un exceso de Shh, Dhh o Ihh (SEC ID nº 14, 13 y 29), respectivamente. El análisis de Scatchard de las curvas de desplazamiento indicó que la totalidad de los Hh presentaba una afinidad similar para Ptch (SEC ID nº 4) (Shh, 1,0 nM (SEC ID nº 14); Dhh, 2,6 nM (SEC ID nº 13); Ihh, 1,0 nM (SEC ID nº 29) y Ptch-2 (SEC ID nº 2) (Shh, 1,8 nM (SEC ID nº 14); Dhh, 0,6 nM (SEC ID nº 13); Ihh, 0,4 nM (SEC ID nº 29), indicando que tanto PTCH (SEC ID nº 4) como PTCH-2 (SEC ID nº 2) pueden actuar como receptores fisiológicos para las 3 proteínas Hh de mamífero.
A continuación, los solicitantes determinaron si Patched-2 2, al igual de Patched, forma un complejo físico con Smo (SEC ID nº 17). Los constructos de expresión para Ptch (SEC ID nº 4) o Ptch-2 (SEC ID nº 2) etiquetados con Flag se cotransfectaron transitoriamente en células 293 con Smo etiquetado con Myc (SEC ID nº 17). Tal como se ha descrito con anterioridad [Stone et al, Nature 384:129-34, 1996], en células que expresan Ptch (SEC ID nº 4) y Smo (SEC ID nº 15), Ptch (SEC ID nº 4) puede inmunoprecipitarse con anticuerpos contra Smo etiquetado con epítopo (SEC ID nº 15) (fig. 7B). De manera similar, patched-2 puede inmunoprecipitarse con anticuerpos contra Smo etiquetado con epítopo (SEC ID nº 15) en el caso de que las dos proteínas se coexpresen en células 293. Conjuntamente, estos resultados sugieren un modelo en el que Patched-2 forma un complejo receptor Hh multicomponente con Smo (SEC ID nº 17) similar al descrito para PTCH (Stone et al., supra). Resulta interesante que estos resultados también demuestran que la cola C-terminal larga que falta en Patched-2 no resulta necesaria para la interacción con Smo (SEC ID nº 17), como ya sugería el análisis de Patched truncado (Stone et al., supra). Sin embargo, sigue resultando posible que la ausencia de un dominio C-terminal afecta a la capacidad de Patched-2 de bloquea la señalización por Smo (SEC ID nº 17) o diferencia la señalización de Patched de la de Patched-2.
Para investigar adicionalmente si Patched-2 podía mediar en la acción de una molécula Hh específica basándose en su perfil de expresión, los solicitantes compararon el patrón de expresión de Ptch (SEC ID nº 4) y Ptch-2 (SEC ID nº 2). En primer lugar, el análisis de transferencia northern utilizando una sonda específica para Ptch-2 (SEC ID nº 1) reveló niveles elevados de ARNm de PTCH2 en el testículo (fig. 4). Mediante este procedimiento, no se detectó expresión de Ptch-2 (SEC ID nº 1) en ningún otro tejido analizado, incluyendo tejidos embrionarios (datos no mostrados). Este perfil es muy diferente del observado para Ptch (SEC ID nº 18), que no se encontró en el testículo mediante transferencia northern, aunque sí en un gran número de tejidos adultos y embrionarios (Goodrich et al., Genes Dev. 10:301-312, 1996). Se llevó a cabo un análisis más detallado del patrón de expresión de Ptch (SEC ID nº 18) y Ptch-2 (SEC ID nº 1) mediante hibridación in situ con particular atención al testículo. Tal como se ha descrito anteriormente (Motoyama et al., supra), se detectaron niveles reducidos de Ptch-2 (SEC ID nº 1) en células epiteliales de dientes y piel en desarrollo (datos no mostrados). Se expresan niveles elevados de ARNm codificante de Ptch-2 (SEC ID nº 2) en el interior del túbulo seminífero, en los espermatocitos primarios y secundarios (fig. 6B, 6E), mientras que únicamente pueden detectarse niveles reducidos de ARNm codificante de Ptch (SEC ID nº 4) en las células de Leydig localizadas en el intersticio de los túbulos seminíferos (fig. 6A). Los espermatocitos primarios y secundarios se encuentran en contacto estrecho con las células de Sertoli de soporte, la fuente de Dhh (SEC ID nº 13) en el testículo [Bitgood et al., Curr. Biol. 6:298-304, 1996]. Para determinar cuál de los 2 receptores es el mediador más relevante de la actividad de Dhh (SEC ID nº 13) en el testículo, los presentes inventores analizaron el perfil de expresión de FuRK (SEC ID nº 10), una quinasa relacionada con Fused que se cree que es un componente de la ruta de señalización de Hh. Es consistente con la idea de que Patched-2 es la diana de Dhh en el testículo, la observación de los presentes inventores de que FuRK (SEC ID nº 10) se expresa únicamente en células germinales, en las que se colocaliza con Ptch-2 (SEC ID nº 2) (figura 4c,f). Dhh (SEC ID nº 13) resulta necesario para la diferenciación correcta de las células germinales, debido a que los ratones macho deficientes en Dhh son estériles debido a la carencia de esperma maduro (Bitgood et al., supra). Los datos de los presentes inventores sugieren que Dhh (SEC ID nº 13) actúa directamente sobre las células germinales a través de Ptch-2 (SEC ID nº 2), mientras que la función de Ptch (SEC ID nº 4) expresado a niveles reducidos sobre las células de Leydig productoras de testosterona no está clara.
Comentario
Se ha informado de la pérdida de heterocigosidad (LOH) para Patched a frecuencia elevada en carcinoma de células basales familiar y también esporádico [Johnson et al., Science 272:1668-71, 1996; Hahn et al., Cell 85:841-51, 1996; Gailani et al., Nature Genetics 14:78-81; Xie et al., Cancer Res. 57:2369-72, 1997], sugiriendo que funcionan como supresor tumoral. De acuerdo con el modelo de receptor descrito anteriormente, la pérdida de función de Patched puede resultar en la señalización aberrante por Smo (SEC ID nº 17), conduciendo a la hiperproliferación de la capa de células basales de la piel. Si, tal como se ha sugerido anteriormente, Patched-2 media en la función de Dhh, La pérdida de Patched-2 podría conducir a la formación de tumores en tejidos en los que la actividad de Smo (SEC ID nº 17) está controlada por Patched-2. El gen codificante de Ptch-2 (SEC ID nº 2) se localizó mediante hibridación fluorescente in situ y mediante PCR utilizando un panel de radiación de híbridos en el cromosoma humano 1p33-34 (datos no mostrados). Resulta interesante que un análisis reciente de las anormalidades cromosómicas recurrentes en tumores testiculares, incluyendo los seminomas, reveló una deleción de la región 1p32-36 [Summersgill et al., Br. J. Cancer 77:305-313, 1998]. La pérdida de esta región, que incluye el locus Patched-2, era consistente en 36% de los casos de tumor de células germinales. Estos datos plantean la posibilidad de que, tal como Patched en el carcinoma de células basales y el meduloblastoma, Patched-2 podría ser un supresor tumoral en células diana Dhh (SEC ID nº 13), tales como espermatocitos, implicando adicionalmente la señalización de Hh en el cáncer.
En resumen, los datos de los presentes inventores demuestran que tanto Patched como Patched-2 son receptores Hh genuinos y que ambos son capaces de formar un complejo con Smo (SEC ID nº 17). Aunque los datos de unión indican que Patched y Patched-2 no discriminan entre los diversos ligandos de Hh a partir de diferencias de afinidad, la diferente distribución en tejidos de estos dos receptores sugiere que, in vivo, Patched podría ser el receptor primario para Shh, mientras que Patched-2 mediaría principalmente en la señalización de Dhh. La función de la expresión de Patched en las células de Leydig en ausencia de algunos de los componentes de señalización de Hh sigue sin explicación. De manera similar, resulta interesante determinar si Patched-2 desempeña un papel cuando se expresa en células que expresan Shh presentes en dientes y piel en desarrollo [Motoyama et al., Nature Genet. 18:104-106, 1998]. Finalmente, la existencia de Patched-2 plantea la cuestión de si existen receptores de patched-2 adicionales, en particular uno que medie en la función de Ihh (SEC ID nº 29).
Materiales y métodos 1. Aislamiento de clones de ADNc de patched humano
Se buscó en una base de datos de ADN de etiqueta de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) para un homólogo humano del gen patched-2 de polaridad de los segmentos de Drosophila. Se identificaron dos ESTs (Incyte nº 905531 y 1326258) como potenciales candidatos. Con el fin de identificar bibliotecas de ADNc humano que contenían clones de patched-2 humano, en primer lugar se cribaron bibliotecas de ADNc humano en pRK5 mediante PCR utilizando los cebadores siguientes:
1
Se seleccionó una biblioteca de pulmón fetal y se enriqueció para clones de ADNc de patched-2 mediante la extensión de ADN monocatenario procedente de bibliotecas de plásmidos cultivadas en huésped dut/ung utilizando el cebador 3'-905531(A) en una reacción que contenía 10 \mul de tampón 10x de PCR (Klentaq®), 1 \mul de DNT (200 \muM), 1 \mul de biblioteca de ADN (200 ng), 0,5 \mul de cebador, 86,5 \mul de H_{2}O y 1 \mul de Klentaq® (Clontech) añadido tras un "hot start". La reacción se desnaturalizó durante 1 minuto a 95ºC, se hibridó durante 1 minuto a 60ºC, después se extendió durante 20 minutos a 72ºC. El ADN se extrajo con fenol/CHCl_{3}, se precipitó con etanol, después se transformó mediante electroporación en bacterias huésped DH10B (Gibco/BRL). Se sembraron réplicas de colonias de cada transformación sobre membranas de nilón y se cribaron con una sonda oligo solapante derivada de la secuencia EST (nº 905531) con la secuencia siguiente:
2
Se marcó la sonda oligo con [\gamma-^{32}P]-ATP y polinucleótido quinasa de T4. Los filtros se hibridaron durante la noche a 42ºC en formamida al 50%, 5xSSC, solución de Denhardt 10X, fosfato sódico 0,05 M (pH 6,5), pirofosfato sódico al 0,1%, ADN de esperma de salmón sonicado 50 \mug/ml. A continuación, los filtros se enjuagaron en 2x SSC y se lavaron en 0,1xSSC, SDS al 0,1%, después se expusieron a películas de rayos X Kodak®. Utilizando este procedimiento, se aisló un clon parcial a partir de la biblioteca de cerebro fetal (clon 3A, fig. 10) (SEC ID nº 8). Con el fin de aislar la secuencia 5' faltante, se cribó una biblioteca de testículo (ver análisis de transferencia northern, infra). El conjunto de cebadores utilizado para amplificar una sonda de 204 pb a partir del clon 3A para sondear la biblioteca de testículo era:
3
Se purificó la sonda amplificada mediante extracción de un gel de agarosa y se marcó con un kit de marcaje de cebadores aleatorios (Boehringer Mannheim). Se aislaron varios clones, incluyendo uno (clon 16.1, fig. 11) que contenía una potencial metionina de inicio. Se reconstruyó un ADNc de longitud completa codificante de un patched-2 mediante el ensamblado de varios de estos clones. El ADNc de longitud completa codificante de Ptch-2 humano (fig. 1, SEC ID nº 1) presentaba un marco de lectura abierto de 3.612 nucleótidos de longitud codificante de una proteína de 1.204 aminoácidos con un peso molecular teórico de 144 kDa. La alineación con Ptch humano (SEC ID nº 4) revelo una identidad de 53% entre las dos moléculas a nivel de aminoácidos (fig. 3). La totalidad de los 12 dominios transmembranales se encontraban conservados. La diferencia más significativa era un dominio intracelular C-terminal más corto en Ptch-2 (SEC ID nº 2) en comparación con Ptch (SEC ID nº 4).
2. Análisis de transferencia northern
Con el fin de determinar la mejor fuente de tejido para el aislamiento del ADNc completo de Patched-2 de longitud completa, así como para determinar el perfil de expresión del mismo, los presentes inventores se sondearon transferencias northern de múltiples tejidos humanos (Clontech) con un fragmento de 752 pb amplificado a partir de la región 3' no traducida de Patched-2 utilizando los cebadores siguientes:
4
El fragmento resultante se purificó en gel y se marcó mediante cebado aleatorio. Los filtros se hibridaron en solución de hibridación ExpressHyb® (Clontech) en presencia de 1 x 106 cpm/ml de sonda marcada con ^{32}P a 42ºC durante la noche. Los filtros se lavaron en 2 x SSC a temperatura ambiente durante 10 minutos y se lavaron en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 42ºC durante 30 minutos, después se expusieron a película de rayos X durante la noche. La fig. 4 muestra que el mensaje de Ptch-2 se expresa a nivele elevados únicamente en los testículos.
3. Localización cromosómica
Los cebadores TM2 (SEC ID nº 25) y UTR2 (SEC ID nº 26) indicados anteriormente se utilizaron para cribar la biblioteca BAC de Genome Systems (St. Louis, MO). Se obtuvieron dos clones BAC individuales a partir de dicha biblioteca y la localización cromosómica de ambos clones utilizando FISH indicó que Ptch-2 (SEC ID nº 2) se localizaba en el cromosoma humano 1p33-34 (fig. 5). Se ha informado de la incidencia con elevada frecuencia de pérdida de heterocigosidad (LOH) de Patched en el carcinoma de células basales. La pérdida de función de Patched se cree que conduce a la señalización constitutiva de Smoothened (Smo) (SEC ID nº 17), resultando la hiperproliferación de la capa basal de la dermis. Un mecanismo similar puede conducir a la formación de tumores de las células germinales. Este modelo propone que la primera etapa de la progresión de un tumor de las células germinales es una pérdida inicial de ADN de un precursor de las células germinales, conduciendo a una célula germinal neoplásica que seguidamente forma un seminoma [De Jong et al., Cancer Genet. Cytogenet. 48:143-167, 1990].A partir del seminoma invasivo, se desarrollan todas las demás formas de tipos de tumor de las células germinales. Aproximadamente 80% de todos los tumores de células germinales se correlacionan con un isocromosoma 12p (i12p) y se encuentran a una frecuencia mayor en no seminomas que en seminomas [Rodríguez et al., Cancer Res. 52:2285-2291, 1992]. Sin embargo, el análisis de las anormalidades cromosómicas recurrentes en tumores testiculares, incluyendo los seminomas, reveló una deleción de la región 1 p32-36. La pérdida de esta región era consistente en 36% de los casos de tumor de células germinales en un estudio reciente [Summersgill et al., B. J. Cancer 57:305-313, 1998]. Se ha informado de una deleción similar del cromosoma lp32-36 a una frecuencia de 28% en oligodendrogliomas (Bello et al., Int. J. Cancer 57:172-175, 1994). Aunque en este estudio no se ha examinó en detalle la expresión de Ptch-2 (SEC ID nº 2) en el cerebro, se cree que Ptch-2 (SEC ID nº 2) es el receptor de Dhh (ver posteriormente) y anteriormente se había informado de la expresión de Dhh en células de Schwann murinas [Bitgood et al., Develop. Biol. 172:126-138, 1995]. Debido a que Ptch-2 (SEC ID nº 2) se localiza en el cromosoma l33-34, es posible que Patched-2 regule la señalización de Smo (SEC ID nº 17) en células diana Dhh y que la pérdida de la función de Patched-2 conduzca a la señalización anormal de Smo (SEC ID nº 17) en estas células y a la posterior formación de tumor.
4. Hibridación in situ
Se cortaron secciones de testículo de ratón de 16 \mum y se procesaron para la hibridación in situ mediante el procedimiento descrito en Phillips et al., Science 250:290-294, 1990. Se generaron sondas de ARN marcadas con ^{33}P-UTP tal como se describe en Melton et al., Nucleic Acids Res. 12:7035-7052, 1984. Se sintetizaron sondas sentido y antisentido a partir de la región 3' no codificante de Patched o Patched-2 de ratón y de un fragmento de ADNc de FuRK de ratón correspondiente a la región codificante de los aminoácidos 317 a 486 de la secuencia humana utilizando T3 y T7, respectivamente.
\newpage
PTCH:
5
PTCH2:
6
Se sintetizaron FuRK de cadena sentido y de cadena antisentido a partir de un fragmento de ADN fusionado de ratón utilizando T3 y T7, respectivamente, correspondientes a la región codificante de los residuos aminoácidos 317 a 486 de la molécula humana.
La figura 6 ilustra que, aunque tanto Ptch (SEC ID nº 4) como Ptch-2 (SEC ID nº 2) se expresan en el testículo, su patrón de expresión no se solapa. Ptch (SEC ID nº 4) se expresa en las células de Leydig del intersticio, mientras que Ptch-2 (SEC ID nº 2) se expresa en los espermatocitos primarios y secundarios.
La expresión de Patched-2 específicamente en los espermatogonios en desarrollo sugiere que Patched-2 es la diana inmediata de Dhh (SEC ID nº 13). Dhh (SEC ID nº 13) se expresa en células de Sertoli y los ratones deficientes en Dhh (SEC ID nº 13) son estériles debido a un defecto en la producción de esperma [Bitgood et al., Curr. Biol. 6:298-304, 1996]. Aunque este efecto sobre las células germinales se creía que era indirecto y mediada por Patched presente en células de Leydig, los datos de los presentes inventores sugieren que Dhh actúa directamente sobre las células germinales a través de Patched-2. Ello queda demostrado adicionalmente por la localización de FuRK SEC ID nº 10), una quinasa intracelular homóloga a Fused de Drosophila e implicada en la transducción de la señal Hedgehog (Hh). Tal como se muestra en la figura 6, FuRK (SEC ID nº 10) se colocaliza con Ptch-2 (SEC ID nº 2) en células germinales y no con Ptch (SEC ID nº 4) en células de Leydig, sugiriendo que Patched-2 y no Patched serán capaces de transducir la señal Dhh. Estos resultados sugieren que Patched-2 es un receptor de Dhh.
Los niveles de ARNm de Ptch-2 en ratones transgénicos para Smo-M2 (SEC ID nº 16) [una mutación Smo que resulta en fenotipos autónomos similares a BCC, Xie et al., Nature 391:90-92, 1998] pueden incrementarse con la activación anormal de la ruta de señalización de Hh. Tal como se indica en la fig. 9, los niveles de Ptch-2 (SEC ID nº 2) eran elevados en las células tumorales (aunque más bajos que los niveles de Ptch (SEC ID nº 4)). Ello sugiere que los anticuerpos dirigidos contra Ptch-2 (SEC ID nº 2) pueden resultar útiles en los tratamiento del BCC.
5. Inmunoprecipitación con Smo
La unión de Patched-2 a Smo (SEC ID nº 17) se evaluó mediante cotransfección utilizando un sistema de transfección transitoria de un Smo etiquetado con epítopo myc (SEC ID nº 15) y un constructo de expresión de Patched o Patched-2 etiquetado con epítopo FLAG en células 93 utilizando técnicas estándares (Gorman, C., DNA Cloning: Practical Approach, editor Clover, DM, vol. 11, páginas 143 a 190, IRL Press, Washington, D.C.). Transcurridas 36 horas de la transfección, las células se lisaron en NP-40 al 1% y se inmunoprecipitaron durante la noche con el anticuerpo 9E10 anti-myc o con anticuerpo M2 anti-FLAG (IBI-Kodak) seguido de proteína A-sefarosa, y después se separaron en un gel de poliacrilamida al 6% desnaturalizado. Las proteínas se detectaron mediante transferencia a nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpos contra los epítopos Flag o Myc utilizando el sistema de detección ECL (Amersham). La figura 7B indica que tanto Ptch (SEC ID nº 4) como Ptch-2 (SEC ID nº 2) se expresan al mismo nivel (IP Flag, Blot Flag) y que al igual que Ptch (SEC ID nº 4), Ptch-2 (SEC ID nº 2) forma un complejo físico con Smo (SEC ID nº 17). Estos resultados sugieren que, al igual que Patched, Patched-2 controla la señalización de Hh mediante su interacción con Smo (SEC ID nº 17).
6. Unión de Hh
Para determinar si Patched-2 era capaz de unirse a los diversos ligandos de hedgehog, se transfectaron células 293 con Ptch (SEC ID nº 4) o Ptch-2 (SEC ID nº 2) utilizando procedimientos estándares. Se incubaron las células con 100 pM de Shh-^{125}I (fragmento aminoterminal de 19 kD de Shh murino (SEC ID nº 14)) en presencia o en ausencia de un exceso de Shh (SEC ID nº 14) o Dhh (SEC ID nº 13) no marcado durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras alcanzar el equilibrio, las células unidas por ligando se centrifugaron a través de un gradiente continuo de sacarosa para separar el ligando no incorporado y después se contó en un contador de centelleo. La figura 7A muestra que tanto Dhh (SEC ID nº 13) como Shh (SEC ID nº 14) se unen a Ptch (SEC ID nº 4) y a Ptch-2 (SEC ID nº 2). Las concentraciones variables de competidor frío indican que los dos ligandos presentan una afinidad similar para Ptch (SEC ID nº 4) y Ptch-2 (SEC ID nº 2).
Ejemplo 2 Expresión de patched-2 en E. coli
La secuencia de ADN codificante de patched-2 humano se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse una diversidad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado a partir de E. coli; ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), que contiene gene para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector se digiere con enzima de restricción y se desfosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por PCR se ligan en el vector. El vector preferentemente incluye las secuencias que codifican para un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los seis primeros codones STII, secuencia polihis y sitio de corte de enteroquinasa), la región codificante de patched-2 de vertebrado, el terminador transcripcional lambda y un gen argU.
A continuación, se utiliza la mezcla de ligación para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas de LB y seguidamente se seleccionan las colonias resistentes a antibióticos. El ADN de plásmido puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Pueden cultivarse durante la noche clones seleccionados en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de durante la noche puede utilizarse posteriormente para inocular un cultivo a escala más grande. A continuación, las células se cultivan hasta una densidad óptica deseada, manteniendo activado el promotor de expresión.
Tras cultivar las células durante varias horas más, se recolectan las células mediante centrifugación. El pellet celular obtenido mediante centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos de la técnica, y la proteína patched-2 de vertebrado solubilizada seguidamente puede purificarse utilizando una columna quelante de metales bajo condiciones que permitan la unión fuerte de la proteína.
Ejemplo 3 Expresión de patched-2 en células de mamífero
El vector, pRK5 (ver la patente EP nº 307.247, publicada el 15 de marzo e 1989) se utiliza como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de patched-2 de vertebrado se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de patched-2 de vertebrado utilizando procedimientos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-patched-2.
En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC nº CCL 1573) se cultivan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejido medio, tal como DMEM suplementado con suero de feto bovino y opcionalmente componentes nutritivos y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-patched-2 con aproximadamente 1 \mug de ADN codificante del gen ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell 31:543, 1982] y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4},5 mM y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja sedimentar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se separa por aspiración y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en FBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio libre de suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 2 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se elimina y se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de cisteína-^{35}S y 200 \muCi/ml de metionina-^{35}S. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro rotativo y se carga sobre un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido patched-2 de vertebrado. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se somete a ensayo en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, puede introducirse patched-2 de vertebrado en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12:7575, 1981. Las células 293 se cultivan hasta la máxima densidad en un matraz rotatorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-patched-2. En primer lugar las células se concentran en el matraz giratorio y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el pellet celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido y se reintroducen en el matraz giratorio que contiene medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Tras aproximadamente cuatro días, se centrifuga el medio condicionado y se filtra para eliminar las células y los residuos. La muestra que contiene patched-2 de vertebrado expresada seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía de columna.
En otra realización, puede expresarse patched-2 de vertebrado en células CHO. El plásmido pSVi-patched-2 puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio sustituirse por medio de cultivo (solo) medio que contiene un marcaje radioactivo, tal como metionina-^{35}S. Tras determinar la presencia de polipéptido patched-2 de vertebrado, el medio de cultivo puede sustituirse por medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después el medio condicionado se recolecta. El medio que contiene patched-2 de vertebrado expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento selecciona.
También puede expresarse en células CHO huésped patched-2 de vertebrado etiquetado con epítopo. El gen patched-2 de vertebrado puede subclonarse separándolo del vector pRK5. El subclón de inserción puede someterse PCR para fusionarlo en el mismo marco de lectura de una etiqueta epítopo seleccionada, tal como la etiqueta poli-His, en un vector de expresión. La inserción patched-2 de vertebrado etiquetada con poli-his seguidamente puede subclonarse en un vector controlado por SV40 que contenga un marcador de selección, tal como DHFR para la selección de los clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector controlado por SV40. El marcaje puede llevarse a cabo, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar que se ha producido la expresión. El medio de cultivo que contiene patched-2 de vertebrado etiquetado con poli-his expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato.
Ejemplo 4 Expresión de patched-2 de vertebrado en levaduras
El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de patched-2 de vertebrado en levaduras.
En primer lugar, se construyen vectores de expresión levaduras para la producción intracelular o la secreción de patched-2 de vertebrado a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN codificante de patched-2 de vertebrado, un péptido de señal seleccionado y el promotor se insertan en sitios de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de patched-2 de vertebrado. Para la secreción, puede clonarse ADN codificante de patched-2 de vertebrado insertándolo en el plásmido seleccionado, conjuntamente con ADN codificante del promotor ADH2/GAPDH, la secuencia secretoria de factor alfa de levadura/secuencia líder y secuencias líder (en caso necesario) para la expresión de patched-2 de vertebrado.
Seguidamente, las células de levadura, tales como la levadura de cepa AB110, pueden transformarse con los plásmidos de expresión indicados anteriormente y cultivarse en medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformada pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con azul de Coomassie.
Posteriormente puede aislarse y purificarse patched-2 de vertebrado recombinante mediante la eliminación de las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y después concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene patched-2 de vertebrado puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.
Ejemplo 5 Expresión de Patched-2 de vertebrado en células de insecto infectadas por baculovirus
El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de patched-2 de vertebrado en células de insecto infectadas por baculovirus.
El gen patched-2 de vertebrado es patched-2 cadena arriba de una etiqueta epítopo contenida dentro de un vector de expresión baculovirus. Entre dichas etiquetas epítopo se incluyen etiquetas poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (por ejemplo regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una diversidad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, se amplifica patched-2 de vertebrado o la parte deseada de patched-2 de vertebrado (tal como la secuencia codificante del dominio extracelular de un proteína transmembranal) mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción (seleccionados) flanqueantes y subclonarse para insertarlo en el vector de expresión.
Se genera un baculovirus recombinante mediante la cotransfección del plásmido anteriormente indicado y de ADN vírico BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC nº CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Tras 4 a 5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteínas se lleva a cabo tal como describen O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press, 1994.
A continuación, puede purificarse patched-2 de vertebrado etiquetado con poli-his expresado, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato de la manera siguiente. Se preparan extractos a partir de células Sf9 infectadas por virus recombinante tal como describen Rupert et al., Nature 362:175-179, 1993. Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9, MgCl_{2} 12,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10%, NP-40 al 0,1%, KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se clarifican mediante centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de Ni^{2+}-NTA agarosa (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 2 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a un caudal de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base de A_{280} con tampón de carga, momento en el que se inicia la recolección de fracciones puntuales. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye no específicamente la proteína unida. Tras alcanzar nuevamente la línea base A_{280}, la columna se revela con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia western con Ni^{2+}-NTA-conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen patched-2 de vertebrado etiquetado con His_{10} eluidas se agrupan y se dializan frente al tampón de carga.
Alternativamente, la purificación de patched-2 de vertebrado etiquetado con IgG (o con Fc) puede llevarse a cabo utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de proteína A o de proteína.
Ejemplo 6 Preparación de anticuerpos que se unen a patched-2 de vertebrado
El presente ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a patched-2 de vertebrado.
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas de la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen patched-2 de vertebrado purificado, proteínas de fusión que contienen patched-2 de vertebrado y células que expresan patched-2 de vertebrado recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarla el experto en la materia sin experimentación indebida.
Se inmunizan ratones, tales como Balb/c, con el inmunógeno patched-2 de vertebrado (por ejemplo partes extracelulares o células expresaban ptch-2) se emulsionaron en adyuvante de Freund completo y se inyectaron subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad de entre 1 y 100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas plantares de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados reciben un refuerzo 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir un refuerzo mediante inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital para el análisis en ensayos ELISA para detectar anticuerpos de patched-2 de vertebrado.
Tras detectar un título de anticuerpos adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden recibir una inyección intravenosa final de patched-2 de vertebrado. Tres o cuatro días después, los ratones se sacrificaron y se recogieron las células de bazo. A continuación, las células de bazo se unieron con patched-2 (utilizando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como P3X63AgU.I., disponible de ATCC, nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden sembrarse en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células sin patched-2, los híbridos de mieloma y los híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se criban en una ELISA para la reactividad contra patched-2 de vertebrado. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra patched-2 de vertebrado se encuentra comprendido dentro de los conocimientos del experto en la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascites que contiene los anticuerpos monoclonales anti-patched-2 de vertebrado. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraces de cultivo de tejido o botellas de cultivo giratorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en el ascites puede conseguirse mediante precipitación con sulfato amónico seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad tras la unión del anticuerpo a proteína A o a proteína G.
Ejemplo 7 Ensayo de luciferasa gli
Puede utilizarse el ensayo siguiente para medir la activación del factor de transcripción GLI, el homólogo de mamífero de Drosophila cubitus interruptus (Ci). Se ha demostrado que GLI es un factor de transcripción activado tras la estimulación de SHh en las células.
Se introdujeron nueve (9) copias de un sitio de unión de GLI presente en el intensificador HNF3\beta (Sasaki et al., Development 124:1313-1322, 1997) delante de un promotor mínimo timidina quinasa que controla el gen informador de luciferasa en el plásmido pGL3 (Promega). La secuencia de unión GLI es: TCGACAAGCAGGGAACACCCAAG
TAGAAGCTC (p9XGliLuc) (SEC ID nº 31), mientras que la secuencia de control negativo es: TCGACAAGCAGG
GAAGTGGGAAGTAGAAGCTC (p9XmGliLuc) (SEC ID nº 32). Estos constructos se cotransfectaron con Ptch-2 de longitud completa y Smo en células C3H10T1/2 cultivadas en F12:DMEM (50:50), FCS al 10% inactivado por calor. El día antes de la transfección, se inocularon 1 x 10^{5} células por pocillo en placas de 6 pocillos, en 2 ml de medio. El día siguiente, se contransfectó 1 \mug de cada constructo por duplicado con 0,025 mg ptk de plásmido de luciferasa de Renilla utilizando lipofectamina (Gibco-BRL) en 100 \mul de OptimMem (con GlutaMAX) siguiendo las instrucciones del fabricante durante 3 horas a 37ºC. A continuación, se añadió suero (20%, 1 ml) a cada pocillo y las células se incubaron durante 3 horas adicionales a 37ºC. Seguidamente las células se lavaron dos veces con PBS, después se incubaron durante 48 horas a 37ºC en 2 ml de medio. Después cada pocillo se lavó con PBS y las células se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis pasiva (Promega) durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador. El lisado se transfirió a tubos eppendorf sobre hielo, se centrifugó en una centrífuga refrigerada durante 30 segundos y el sobrenadante se reservó sobre hielo. Para cada medida, se añadieron 20 \mul de lisado celular a 100 \mul de LARII (reactivo de ensayo de luciferasa, Promega) en un tubo de polipropileno y se midió la actividad lumínica de luciferasa. La reacción se detuvo mediante la adición de tampón Stop and Glow (Promega), mezclado mediante pipeteado 3 a 5 veces y se midió la actividad lumínica de luciferasa de Renilla con el luminómetro.
Depósito de material
Los materiales siguientes han sido depositados en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):
7
Dicho depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y el reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Lo anterior garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. El depósito será puesto a disposición del público por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la publicación de la patente US pertinente o tras abrir al público cualquier solicitud de patente US o extranjera, la que sea la primera, y garantiza la disponibilidad de la progenie para la persona que determine el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con la norma 35 USC \NAK 122 y las reglas del Comisario según las mismas (incluyendo 37 CFR \NAK 114, con referencia particular a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que, en caso de que un cultivo de los materiales depositados muriese, se perdiese o fuera destruido estando en cultivo bajo condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente sustituidos, tras notificarse de ello, por otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para la práctica de la invención en contra de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con la legislación en materia de patentes del mismo.
La memoria escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no debe considerarse limitada en su alcance por el constructo depositado, debido a que la realización depositada pretende ser una única ilustración de determinados aspectos de la invención. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente memoria es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe interpretarse como limitativa del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4030
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0.1cm
8 
\hskip0.1cm
9 
\hskip0.1cm
10 
\hskip0.1cm
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
12 
\hskip0.1cm
13 
\hskip0.1cm
14 
\hskip0.1cm
15 
\hskip0.1cm
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 20, 27, 135, 156, 210
\vskip0.400000\baselineskip
<223> base desconocida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<223> base desconocida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13-14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> base desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
21 
\hskip0.1cm
22 
\hskip0.1cm
23 
\hskip0.1cm
24 
\hskip0.1cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4004
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
26 
\hskip0.1cm
27 
\hskip0.1cm
28 
\hskip0.1cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2082
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
30 
\hskip0.1cm
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
32 
\hskip0.1cm
33 
\hskip0.1cm
34 
\hskip0.1cm
35 
\hskip0.1cm
36 
\hskip0.1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
40 
\hskip0.1cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
42 
\hskip0.1cm
43 
\hskip0.1cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-803
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
45 
\hskip0.1cm
46 
\hskip0.1cm
47 
\hskip0.1cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-793
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\hskip0.1cm
49 
\hskip0.1cm
50 
\hskip0.1cm
51 
\hskip0.1cm
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 793
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
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<400> 17
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\hskip0.1cm
53 
\hskip0.1cm
54 
\hskip0.1cm
55 
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\hskip0.1cm
56 
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\hskip0.1cm
57 
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<210> 19
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 19
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\hskip0.1cm
58 
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<210> 20
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 20
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\hskip0.1cm
59 
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<210> 21
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia artificial 1-45
\newpage
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<400> 21
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\hskip0.1cm
60 
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<210> 22
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
61 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-21
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip0.1cm
62 
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial 1-21
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<400> 24
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\hskip0.1cm
63 
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<210> 25
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-18
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
64 
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<210> 26
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia artificial 1-20
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<400> 26
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\hskip0.1cm
65 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip0.1cm
66 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
68 
\hskip0.1cm
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
71 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial 1-32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.1cm
72

Claims (26)

1. Ácido nucleico aislado que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido patched-2 que comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de (a), y codificante de un polipéptido que presenta la capacidad de unirse a Desert Hedgehog (Dhh) y de afectar a la señalización de Dhh.
2. Ácido nucleico aislado que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con: (a) una molécula de ADN codificante el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el depósito ATCC nº 20977 y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh (denominación: pRK7.hptc2.Flag-1405), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que comprende la secuencia codificante de patched-2 humano del ADNc en el depósito ATCC nº 209778 (denominación: pRK7.hptc2.Flag-1405).
4. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.
5. Vector según la reivindicación 4 operablemente ligado a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.
6. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 4.
7. Célula huésped según la reivindicación 6 que procede de un mamífero.
8. Célula huésped según la reivindicación 7, en la que dicha célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
9. Célula huésped según la reivindicación 6, que es procariótica.
10. Célula huésped según la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula de E. coli.
11. Célula huésped según la reivindicación 6, en la que dicha célula es una célula de levadura.
12. Célula huésped según la reivindicación 11, que es Saccharomyces cerevisiae.
13. Procedimiento para producir un polipéptido patched-2, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 9 bajo condiciones adecuadas para la expresión de patched-2 de vertebrado y recuperar patched-2 a partir del cultivo celular; en el que dicho polipéptido patched-2 presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2) y presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh.
14. Polipéptido patched-2 humano aislado que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2) y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh.
15. Polipéptido según la reivindicación 14, que presenta la secuencia nativa aislada del polipéptido patched-2 humano que comprende los residuos aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2).
16. Polipéptido patched-2 humano aislado de secuencia nativa codificado por el ADNc depositado bajo el número de acceso ATCC 209778 (denominación: pR7.hptc2.Flag-1405) que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh.
17. Molécula quimérica que comprende el polipéptido patched-2 humano según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga.
18. Molécula quimérica según la reivindicación 17, en la que dicha secuencia aminoácidos heteróloga es una secuencia de etiqueta epítopo.
19. Molécula quimérica según la reivindicación 17, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región constante de una inmunoglobulina.
20. Procedimiento de cribado para antagonistas o agonistas de la actividad biológica de patched-2, que comprende:
(a) exponer células diana en cultivo que expresan patched-2 a un compuesto candidato y a Dhh, y
(b) analizar las células para la unión de Dhh a patched-2, o
(c) registrar los cambios fenotípicos o funcionales en las células tratadas,
y comparar los resultados con célula de control no expuestas al compuesto candidato,
en el que patched-2 es un polipéptido con una identidad de secuencia de por lo menos 95% con la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2) y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh.
21. Procedimiento de cribado para antagonistas o agonistas de la actividad biológica de patched-2, que comprende:
(a) exponer un polipéptido patched-2 y Dhh a un compuesto candidato, y
(b) analizar la unión de Dhh al polipéptido patched-2, y comparar los resultados a reacciones de control no expuestas al compuesto candidato,
en el que dicho polipéptido patched-2 presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% con la secuencia de aminoácidos 1 a 1.203 de la fig. 1 (SEC ID nº 2) y que presenta la capacidad de unirse a Dhh y de afectar a la señalización de Dhh.
22. Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 en la preparación de un anticuerpo específico para el polipéptido patched-2.
23. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
24. Utilización según la reivindicación 23, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
25. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
26. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o heteroconjugado.
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