ES2316563T3 - Antigenos de moraxella (branhamella) catarrhalis. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado elegido entre: a. un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12; b. un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12; c. un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12; d. un polinucleótido que comprende la SEQ ID Nº: 11, y e. un polinucleótido que es complementario con un polinucleótido de (a), (b), (c), o (d).
Description
Antígenos de Moraxella (Branhamella)
catarrhalis.
La presente invención se refiere a
polipéptidos, más particularmente a polipéptidos de de Moraxella
(Branhamella) catarrhalis que se puede usar para prevenir,
diagnosticar y/o tratar la infección por Moraxella (Branhamella)
catarrhalis.
Moraxella (Branhamella) catarrhalis es un
diplococo Gram-negativo que provoca infecciones del
tracto respiratorio en seres humanos. M. catarrhalis está
ahora aceptada como la tercera causa más común de otitis media en
menores y niños, después Streptococcus pneumoniae y
Haemophilus influenzae. M. catarrhalis ha estado
también asociada a varios otros tipos de infección, incluyendo
sinusitis, tos persistente, laringitis aguda en adultos, queratitis
supurativa, conjuntivitis de los neonatos, y enfermedades invasivas
en el huésped inmunocomprometido.
Ya que aproximadamente el 90% de las cepas de
M. catarrhalis son resistentes a antibióticos
(\beta-lactamasa positiva) y que la otitis media
recurrente está asociada a una alta morbilidad, existe una necesidad
del desarrollo de una vacuna que protegerá los huéspedes de la
infección por M. catarrhalis. Una infección por M.
catarrhalis induce una respuesta inmune contra los antígenos
encontrados en la superficie de las células bacterianas. Sin
embarga, muchas de estas proteínas de superficie no están todavía
caracterizadas, ni se ha determinado la respuesta inmune que da
como resultado la protección de la infección por cepas
diferentes.
Para desarrollar una vacuna que protegerá a los
huéspedes de la infección por M. catarrhalis, los esfuerzos
se han concentrado principalmente sobre las proteínas de la membrana
externa tal como la proteína de alta masa molecular llamada
proteína A de la superficie ubicua (UspA). Esta proteína se
considera un candidato de vacuna prometedor debido a que un
anticuerpo monoclonal y los anticuerpos policlonales se mostraron
que ambos eran bactericidas y protectores en el modelo de
eliminación pulmonar murino. Sin embargo, esta proteína se ha
mostrado que es altamente variable entre las diferentes cepas de
M. catarrhalis. Además de esta proteína, otras proteínas de
M. catarrhalis han generado interés como candidatos de
vacuna potenciales. La proteína de unión de transferrina que posee
epítopos conservados expuestos sobre la superficie bacteriana. Sin
embargo, existía divergencia en el grado de reactividad cruzada del
anticuerpo con la proteína entre una cepa u otra. Otros
investigadores se han también centrado en la proteína CD de 45 kDa
(OMP CD). La proteína está altamente conservada entre las cepas de
M. catarrhalis, sin embargo los adultos con enfermedad
pulmonar obstructiva crónica muestran variabilidad en la respuesta
inmune contra la OMP CD. El documento WO 00/78968 describió una
secuencia genómica de
M. catarrhalis.
M. catarrhalis.
Por lo tanto permanece una necesidad no
satisfecha de polipéptidos de M. catarrhalis que se puedan
usar para prevenir, diagnosticar y/o tratar infección por
Moraxella (Branhamella) catarrhalis.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido
que comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12, como
se define en las reivindicaciones anexas. También se describe en el
presente documento se aíslan polinucleótidos que codifican
polipéptidos que tienen al menos un 70% de identidad con un segundo
polipéptido que comprende una secuencia elegida entre las SEQ ID
Nºs: 2, 4, 6, 8, 10, 14 o sus fragmentos o análogos.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia establecida
en la SEQ ID Nº: 12, como se define en las reivindicaciones anexas.
También se describen polipéptidos elegidos entre las SEQ ID Nº: 2,
4, 6, 8, 10, 14 o sus fragmentos o análogos.
En otros aspectos, se proporcionan, como se
define en las reivindicaciones anexas, polipéptidos codificados por
los polinucleótidos de la invención, composiciones farmacéuticas,
vectores que comprenden polinucleótidos de la invención unidos de
manera operativa a una región de control de expresión, así como
células huésped transfectadas con dichos vectores y procedimientos
para producir los polipéptidos que comprenden el cultivo de dichas
células huésped en condiciones adecuadas para la expresión.
La Figura 1 representa la secuencia de ADN del
gen BVH-MC2 de la cepa ETSU C-2 de
M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 1. la parte subrayada de la
secuencia representa la región que codifica el péptido guía.
La Figura 2 representa la secuencia de
aminoácidos del polipéptido BVH-MC2 de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 2. La
secuencia subrayada representa el péptido guía de 30 restos de
aminoácidos.
La Figura 3 representa la secuencia de ADN
parcial del gen BVH-MC2 de la cepa ETSU 658 de
M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 3.
La Figura 4 representa la secuencia de
aminoácidos parcial del polipéptido BVH-MC2 de la
cepa ETSU 658 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 4.
La Figura 5 representa la secuencia de ADN
parcial del gen fBVH-MC2 de la cepa
ETSUT-25 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº:
5.
La Figura 6 representa la secuencia de
aminoácidos parcial del polipéptido BVH-MC2 de la
cepa ETSU T-25 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº:
6.
La Figura 7 representa la secuencia parcial de
ADN del gen BVH-MC2 de la cepa M-12
de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 7.
La Figura 8 representa la secuencia de ADN
parcial del polipéptido BVH-MC2 de la cepa
M-12 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 8.
La Figura 9 representa la secuencia de ADN del
gen BVH-MC3 de la cepa ETSU C-2 de
M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 9. la parte subrayada de la
secuencia representa la región que codifica el péptido guía.
La Figura 10 representa la secuencia de
aminoácidos del polipéptido BVH-MC3 de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 10. La
secuencia subrayada representa el péptido guía de 46 restos de
aminoácidos.
La Figura 11 representa la secuencia de ADN del
gen BVH-MC4 de la cepa ETSU C-2 de
M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 11.
La parte subrayada de la secuencia representa la
región que codifica el péptido guía.
La Figura 12 representa la secuencia de
aminoácidos del polipéptido BVH-MC4 de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 12. La
secuencia subrayada representa el péptido guía de 42 restos de
aminoácidos.
La Figura 13 representa la secuencia de ADN del
gen BVH-MC5 gene de la cepa ETSU C-2
de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 13. La parte subrayada de la
secuencia representa la región que codifica el péptido guía.
La Figura 14 representa la secuencia de
aminoácidos del polipéptido BVH-MC5 de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis; SEQ ID Nº: 14. La
secuencia subrayada representa el péptido guía de 60 restos de
aminoácidos.
La Figura 15 muestra la comparación de las
secuencias de nucleótidos parcial de los genes
BVH-MC2 de las cepas de ETSU C-2,
ETSU 658, ETSU T-25, y M-12 de M.
catarrhalis mediante el uso del programa del software de
análisis de secuencias ClustalWfrom MacVector (version 6.5). Debajo
de la alineación, existe una línea de consenso donde * y espacios
en blanco representan respectivamente nucleótidos idénticos y
diferencias entre secuencias.
La Figura 16 muestra la comparación de las
secuencia de aminoácidos predicha de los marcos abiertos de lectura
parciales de BVH-MC2 de las cepas de ETSU
C-2, ETSU 658, ETSU T-25, y
M-12 de M. catarrhalis mediante el uso del
programa del software de análisis de secuencias ClustalWfrom
MacVector (versión 6.5). Debajo de la alineación, existe una línea
de consenso donde los caracteres * representan restos de
aminoácidos idénticos.
La presente invención proporciona
polinucleótidos purificados y aislados, que codifican polipéptidos
de Moraxella que se pueden usar para prevenir, diagnosticar
y/o tratar infección por Moraxella. Estos polinucleótidos se
definen en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos un 70% de identidad a un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas. También se describen
fragmentos o análogos de los mismos.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 80% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas. También se describen en el
presente documento fragmentos o análogos de los mismos.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 95% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas. También se describen en el
presente documento fragmentos o análogos de los mismos.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 70% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 80% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 95% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia establecida
en la SEQ ID Nº: 12 o sus fragmentos o análogos, como se define en
las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de
aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 12.
También se describe en el presente documento un
polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una parte de un
polipéptido que comprende una secuencia elegida entre las SEQ ID Nº:
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o sus fragmentos o análogos.
También se describe en el presente documento un
polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una parte de un
polipéptido que comprende una secuencia elegida entre las SEQ ID Nº:
2, 4, 6, 8, 10, 12 ó 14.
También se describen en el presente documento
epítopos que llevan partes de un polipéptido que comprende una
secuencia elegida entre las SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12 14 o sus
fragmentos o análogos.
También se describen en el presente documento
epítopos que llevan partes de un polipéptido que comprende una
secuencia elegida entre las SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ó 14.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 70% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 80% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12, como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 90% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 95% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia establecida en la SEQ ID Nº: 12 como se
define en las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia establecida
en la SEQ ID Nº: 12.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende un
polinucleótido elegido entre:
(a) un polinucleótido que codifica un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida
en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un
anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que
comprende la SEQ ID Nº: 12;
(b) un polinucleótido que codifica un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida
en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un
anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido que comprende
la SEQ ID Nº: 12;
(c) un polinucleótido que codifica un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida
en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un
anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido que comprende
la SEQ ID Nº: 12;
(d) un polinucleótido que codifica un
polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido
capaz de producir un anticuerpo que específicamente se une a un
polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en el presente
documento:
(e) un polinucleótido que codifica un
polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de
unión para un polipéptido que comprende una secuencia elegida
entre: SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o sus fragmentos o
análogos;
(f) un polinucleótido que codifica un epítopo
que lleva una parte de un polipéptido que comprende una secuencia
elegida entre las SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o sus fragmentos
o análogos.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona:
(g) un polinucleótido que comprende la SEQ ID
Nº:11.
(h) un polinucleótido que es complementario con
un polinucleótido de (a), (b), (c), (d), o (g).
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en el presente documento
fragmentos y análogos de (a) a (d) y (g).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido
elegido entre:
(a) un polipéptido que tiene al menos 70% de
identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID
Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que
específicamente se une a un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº:
12.
(b) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID
Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que
específicamente se une a un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº:
12.
(c) un polipéptido que tiene al menos 95% de
identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID
Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que
específicamente se une a un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº:
12.
(d) un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº:
12, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se
une de manera específica a un polipéptido que comprende la SEQ ID
Nº: 12.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en el presente
documento:
(e) un polipéptido que es capaz de inducir
anticuerpos que tienen especificidad de unión para un polipéptido
que comprende una secuencia elegida entre la SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14 o sus fragmentos o análogos;
(f) un epítopo que lleva una parte de un
polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID Nº: 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14 o sus fragmentos o análogos;
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona:
(g) el polipéptido de (a), (b), (c) o (d) en el
que el resto Met N-terminal está suprimido;
(h) el polipéptido de (a), (b), (c) o (d), en el
que la secuencia de aminoácidos secretora está suprimida.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen fragmentos y análogos de
las secuencias descritas anteriormente.
Los expertos en la técnica apreciarán que la
invención incluye moléculas de ADN, es decir polinucleótidos y sus
secuencias complementarias que codifican análogos tales como
mutantes, variantes, homólogos y derivados de tales polipéptidos en
la medida en la que están abarcadas por las reivindicaciones anexas,
como se describe en el presente documento en la presente solicitud
de patente. La invención también incluye moléculas de ARN que
corresponden a las moléculas de ADN de la invención. Además de las
moléculas de ADN y ARN, la invención incluye los polipéptidos y
anticuerpos monoespecíficos correspondientes que se unen de manera
específica a tales polipéptidos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que son antigénicos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que son inmunogénicos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que pueden producir una respuesta inmune en un huésped.
Como se define en las reivindicaciones anexas,
la presente invención también se refiere a polipéptidos que son
capaces de inducir anticuerpos que tienen especificidad de unión a
los polipéptidos de la presente invención. Un anticuerpo que
"tiene especificidad de unión" es un anticuerpo que reconoce y
se une al polipéptido seleccionado pero que no reconoce
sustancialmente y se une a otras moléculas en una muestra, por
ejemplo, una muestra biológica, que naturalmente incluye el
polipéptido seleccionado. La unión específica se puede medir usando
un ensayo ELISA en el que se usa el polipéptido seleccionado como
antígeno.
De acuerdo con la presente invención,
"protección" en los estudios biológicos se define mediante un
incremento significativo en la curva, tasa o período de
supervivencia, Los análisis estadísticos que usan el ensayo de
grado Log para comparar las curvas de supervivencia y ensayo exacto
de Fisher para comparar las tasas de supervivencia y números de
días hasta la muerte, respectivamente, pueden ser útiles para
calcular los valores de P y determinar si las diferencias entre los
dos grupos es estadísticamente significativo. Se considera que los
valores de P de 0,05 no son significativos.
También se describen en el presente documento
fragmentos antigénicos/inmunogénicas del polipéptidos de la
invención, o de sus análogos. Los fragmentos de la presente
invención deben incluir una o más de tales regiones de epítopos o
ser suficientemente similares a tales regiones para retener sus
propiedades antigénicas/inmunogénicas. De este modo, para los
fragmentos de acuerdo con la presente invención el grado de
identidad es quizás irrelevante, ya que pueden ser un 100%
idénticos a una parte particular de un polipéptido o su análogo
como se describe en el presente documento. La presente descripción
además proporciona fragmentos que tienen al menos 10 restos de
aminoácidos contiguos de las secuencias de polipéptidos de la
presente invención. En una realización de la presente invención,
existe un fragmento antigénico/inmunogénico que comprende al menos
15 restos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID Nº: 12, siendo el
fragmento capaz de producir un anticuerpo que específicamente se une
a un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12; se prefiere al
menos 20 restos de aminoácidos contiguos.
Los expertos en la técnica apreciarán que los
análogos de los polipéptidos de la invención también encontrarán
uso en el contexto de la presente invención, es decir como material
antigénico/inmunogénico. De este modo, por ejemplo las proteínas o
polipéptidos que incluyen una o más adiciones, supresiones,
sustituciones o similares están abarcados por la presente
invención, en la medida que estén abarcados por las
reivindicaciones anexas.
Como se usa en el presente documento,
"fragmentos", "análogos" o "derivados" de los
polipéptidos de la invención incluyen los polipéptidos en los que
uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos por un
resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente
conservado) y que puede ser natural o no natural. En una
realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la
invención tendrán aproximadamente 80% de identidad con las
secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos y
como se define en las reivindicaciones anexas. Esto es, 80% de los
restos son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos
tendrán más de 80% de identidad. En una realización adicional,
polipéptidos tendrán más de 85% de identidad. En una realización
adicional, polipéptidos tendrán más de 90% de identidad. En una
realización adicional, polipéptidos tendrán más de 95% de
identidad. En una realización adicional, polipéptidos tendrán más de
99% de identidad. En una realización adicional, análogos de
polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20
sustituciones de restos de aminoácidos, modificaciones o supresiones
y más preferiblemente menos de 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas sustituciones son las que tienen una
influencia mínima en la estructura secundaria y naturaleza
hidropática del polipéptido. Las sustituciones preferidas son las
que se conocen en la técnica como conservada, es decir los restos
sustituidos comparten propiedades químicas tales como
hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales. Estos incluyen
sustituciones tales como los descritos por Dayhoff, M. en Atlas of
Protein Sequence y Structure 5, 1978 y by Argos, P. en EMBO J. 8,
779 - 785, 1989. Por ejemplo, aminoácidos, o bien naturales o no
naturales, que pertenecen a los siguientes grupos representan
cambios conservadores:
ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;
cys, ser, tyr, thr;
val, ile, leu, met, ala, phe;
lys, arg, orn, his; y
phe, tyr, trp, his.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustituciones preferidas también incluyen
sustituciones de los aminoácidos L por los correspondientes
enantiómeros D.
\newpage
En un planteamiento alternativo, los análogos
pueden ser polipéptidos, de fusión, que incorporan restos que
hacen la purificación más fácil, por ejemplo mediante el marcado de
manera eficaz del polipéptido deseado. Puede ser necesario eliminar
la "marca" o puede ser el caso que el propio polipéptido de
fusión retenga la suficiente antigenicidad para que sea útil.
El porcentaje de homología se define como la
suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de identidad de
similitud o conservación de tipo de aminoácido.
En una realización, análogos de polipéptidos de
la invención tendrán aproximadamente 70% de identidad con las
secuencias ilustradas en las figuras o sus fragmentos y como se
define en las reivindicaciones anexas. Esto es 70% de los restos
son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán
más de un 80% de identidad. En una realización adicional, los
polipéptidos tendrán más de 85% de identidad. En una realización
adicional, polipéptidos tendrán más de 90% de identidad. En un
realización, los polipéptidos tendrán más de 95% de identidad. En
una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 99%
de identidad. En una realización adicional, los análogos de
polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20
sustituciones de restos de aminoácidos, modificaciones o supresiones
y más preferiblemente menos de 10.
En una realización, análogos de polipéptidos de
la invención tendrán aproximadamente 70% de homología con las
secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos y
como se define en las reivindicaciones anexas. En una realización
adicional, los polipéptidos tendrán más de 80% de homología. En una
realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 85% de
homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán
más de un 90% de homología. En una realización adicional, los
polipéptidos tendrán más de 95% de homología. En una realización
adicional, los polipéptidos tendrán más de 99% de homología. En una
realización adicional, los análogos de polipéptidos de la invención
tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones de restos de
aminoácidos, sustituciones, modificaciones o supresiones y más
preferiblemente menos de 10.
Se puede usar un programa tal como CLUSTAL para
comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara las
secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima mediante
la inserción de los espacios en cualquier secuencia según sea
apropiado. Es posible calcular la identidad de aminoácidos u
homología para una alineación óptima. Un programa de tipo de BLASTx
alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un
valor para el ajuste. De esta manera es posible obtener una
comparación donde se encuentran varias regiones de similitud,
teniendo cada una, una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis
de identidad se contemplan en la presente invención.
En un planteamiento alternativo, los análogos o
derivados pueden ser polipéptidos de fusión, que incorporan restos
que pueden hacer la purificación más fácil, por ejemplo mediante
marcado de manera eficaz de la proteína o polipéptido deseado,
puede ser necesario eliminar la "marca" o puede ser el caso que
el polipéptido de fusión mantenga la suficiente antigenicidad para
que sea útil.
También se sabe que es posible seleccionar un
polipéptido antigénico para las regiones de identidad de epítopos,
es decir las regiones que son responsables de la antigenicidad o
inmunogenicidad de polipéptido. Los procedimientos para llevar a
cabo tal selección se conocen bien en la técnica. De este modo, los
fragmentos de la presente invención deben incluir una o más de
tales regiones de epítopos o ser suficientemente similares a tales
regiones para retener sus propiedades
antigénicas/inmunogénicas.
De este modo, para los fragmentos de acuerdo con
la presente invención el grado de identidad es quizás irrelevante,
ya que pueden ser un 100% idénticos a una parte parcial de un
polipéptido análogo al que se describe en el presente
documento.
De este modo, lo que es importante para
análogos, derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de
la antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido de los
que se derivan.
También están incluidos polipéptidos que tienen
condensados a ellos otros compuestos que alteran las propiedades
biológicos o farmacológicos de los polipéptidos es decir polietilen
glicol (PEG) para incrementar la semivida; secuencias de
aminoácidos guías o secretoras para facilitar la purificación;
secuencias prepo- y pro-; y (poli)sacá-
ridos.
ridos.
Además, en aquellas situaciones en las que las
regiones de aminoácidos se encuentra que son polimórficas, puede
ser deseable variar una o más aminoácidos particulares para imitar
más eficazmente los epítopos diferentes de las cepas de
Moraxella diferentes.
Además, los polipéptidos de la presente
invención mediante la -NH_{2} acilación terminal (por ejemplo.
mediante acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, carboxi
amidación terminal, por ejemplo, con amoníaco o metilamina) para
proporcionar estabilidad, hidrofobicidad aumentada para ligarse o
unirse a un soporte u otra molécula.
También se contemplan hetero y homo multímeros
de polipéptidos de los fragmentos de polipéptidos y análogos. Estas
formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos
que se han reticulado con reticuladores, tales como
avidina/biotina, gluteraldehído o
dimetil-superimidato. Tales formas poliméricas
también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias en
tándem o invertidas contiguas, producidas a partir de los ARNm
multicistrónicos generados por tecnología de ADN recombinante.
En una realización adicional, la presente
invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden uno o más polipéptidos o sus fragmentos o análogos como
se define en las figuras de la presente solicitud, y como se define
en las reivindicaciones anexas.
También se describen en el presente documento
polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que
tienen una secuencia elegida entre las SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14 o sus fragmentos o análogos; con la condición que los
polipéptidos estén ligados como para formar un polipéptido
quimérico.
En una realización adicional, la presente
invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden dos o más polipéptidos que comprenden una secuencia
elegida entre SEQ ID Nº: 12 con la condición que los polipéptidos
estén ligados como para formar un polipéptido quimérico.
Preferiblemente, un fragmento, análogo o
derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una
región antigénica es decir al menos un epítopo.
Con el fin de lograr la formación de polímeros
antigénicos (es decir multímeros sintéticos), se pueden utilizar
polipéptidos que tienen grupos bishaloacetilo, nitroarilhaluros, o
similares, donde los reactivos son específicos para los grupos
tio. Por lo tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los
diferentes polipéptidos puede ser un enlace sencillo o se puede
componer de un grupo de enlace de al menos dos, típicamente al menos
cuatro, y no más de 16, pero usualmente no más de aproximadamente
14 átomos de carbono.
En una realización particular, fragmentos y
análogos de polipéptidos de la invención no contienen un resto de
partida, tal como metionina (Met) o valina (Val). Preferiblemente,
los polipéptidos no incorporarán una secuencia guía o secretora
(secuencia de señal). La parte de señal de un polipéptido de la
invención se puede determinar de acuerdo con las técnicas
biológicas moleculares establecidas. En general, el polipéptido de
interés se puede aislar a partir un cultivo de Moraxella y
secuenciar posteriormente para determinar el resto inicial de la
proteína madura y por lo tanto la secuencia del polipéptido
maduro.
Se entiende que los polipéptidos se pueden
producir y/o usar sin su codón de partida (metionina o valina)
y/o sin su péptido guía para favorecer la producción y purificación
de los polipéptidos recombinantes. Se sabe que los genes de
clonación sin secuencias que codifican los péptidos guía
restringirán los polipéptidos al citoplasma de E. coli y
facilitarán su recuperación (Glick, B.R. y Pasternak, J.J. (1998)
Manipulation of gene expresión in prokaryotes. En "Molecular
biotechnology: Principles y applications of recombinant DNA", 2ª
edición, ASM Press, Washington DC, p.109 - 143).
De acuerdo con otro aspecto de la invención,
también se proporcionan (i) una composición de materia que contiene
un polipéptido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o
adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un
polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante;
(iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un
vehículo, diluyente o adyuvante; (iv) un uso de los polipéptidos de
la invención en la fabricación de un medicamento para inducir una
respuesta inmune contra Moraxella, en un huésped, mediante
la administración al huésped, de una cantidad inmunológicamente
eficaz de un polipéptido de la invención para producir una
respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta inmune protectora a
Moraxella; y particularmente, (v) un uso de los polipéptidos
de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir
y/o tratar una infección por Moraxella, mediante la
administración de una cantidad profiláctica o terapéutica de un
polipéptido de la invención a un huésped en necesidad.
También se describen (i) una composición de
materia que contiene un polinucleótido de la invención,
conjuntamente con un vehículo, diluyente o adyuvante; (ii) una
composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de la
invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iii) un
procedimiento para inducir una respuesta inmune contra
Moraxella, en un huésped, mediante la administración al
huésped de una cantidad inmunológicamente eficaz de un
polinucleótido de la invención para producir una respuesta inmune,
por ejemplo, una respuesta protectora inmune a Moraxella; y
particularmente, (iv) un procedimiento para prevenir y/o tratar una
infección por Moraxella mediante la administración de una
cantidad profiláctica o terapéutica de un polinucleótido de la
invención a un huésped en necesidad.
Antes de la inmunización, los polipéptidos de la
invención también se pueden acoplar o conjugar a proteínas vehículo
tal como toxina de tétanos, toxina de difteria, antígeno de
superficie del virus de hepatitis B, antígeno VPl de virus de
poliomielitis o cualquier otra toxina o antígeno vírico o bacteriano
o cualesquiera proteínas adecuadas para estimular el desarrollo de
una respuesta inmune más fuerte. Este acoplamiento o conjugación se
puede realizar de manera química o genética. Una descripción más
detallada de la conjugación péptido - vehículo está disponible en
Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S.,
"Synthetic Polipéptidos as antigens" en Laboratory Techniques
in Biochemistry y Molecular Biology, Vol.19 (ed.) Burdou, R.H.
& Van Knippenberg P.H. (1988), Elsevier
New York.
New York.
\newpage
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos
de Moraxella de la invención en una mezcla con un adyuvante
farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes adecuados incluyen (1)
formulaciones de aceite en agua tales como MF59^{TM}, SAF^{TM},
Ribi^{TM}; (2) adyuvante completo o incompleto de Freund; (3)
sales es decir AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2},
AlNH4(SO_{4})_{2}, Al(OH)_{3},
AlPO_{4}, sílice, caolín; (4) derivados de saponina tales como
Stimulon^{TM} o partículas generadas a partir de ellos ISCOMs
(complejos inmunoestimuladores); (5) citocinas tales como
interleucinas, interferones, factor estimulador de la colonia de
macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral
(TNF); (6) otras sustancias tales como polinucleótidos de carbono,
es decir poli IC y poli AU, toxina de cólera destoxificada (CTB) y
toxina lábil al calor de E. coli para la inducción de la
inmunidad mucosal. Una descripción más detallada de adyuvante está
disponible en una revisión por M.Z.I Khan et al. en
Pharmaceutical Research, vol. 11, No. 1 (1994) p 2 - 11, y también
en otra revisión por Gupta et al., en Vaccine, Vol. 13, No.
14, p 1263 -1276 (1995) y en el documento WO 99/24578. Los
adyuvantes preferidos incluyen QuilA^{TM}, QS21^{TM},
Alhydrogel^{TM} y Adjuphos^{TM}.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección,
infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u
oral.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se usan para la profilaxis de infección por Moraxella y/o
enfermedades y síntomas mediadas por la infección por
Moraxella como se describe en Manual of Clinical
Microbiology, P.R. Murray (Ed, principal), E.J. Baron, M.A.
Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. ASM Press, Washington, D.C.
edición 7ª, 1999, 1773 p. En una realización, las composiciones
farmacéuticas de la presente invención se usan para el tratamiento
o profilaxis de otitis media, sinusitis, tos persistente, laringitis
aguda, queratitis supurativa, conjuntivitis de neonatos. En una
realización, las composiciones de vacuna de la invención se usan
para el tratamiento o profilaxis de infección por Moraxella
y/o enfermedades y síntomas mediados por Infección por
Moraxella. En una realización adicional, la infección por
Moraxella es Moraxella catarrhalis.
En una realización adicional, la invención
proporciona el uso de las composiciones de la invención en la
fabricación de un medicamento para profilaxis o tratamiento de
infección por Moraxella en un huésped susceptible de
infección por Moraxella que comprende la administración a
dicho huésped de una cantidad profiláctica o terapéutica de una
composición de la invención. Como se usa en la presente solicitud,
el término "huésped" incluye mamíferos. En una realización
adicional, el mamífero es un ser humano.
En una realización particular, las composiciones
farmacéuticas se administran a los huéspedes en riesgo de
infección por Moraxella tales como neonatos, lactantes,
niños, ancianos y huéspedes inmunodeprimidos.
En una realización particular, las composiciones
farmacéuticas se administran a aquellos huéspedes en riesgo de
infección por Moraxella tales como adultos.
Las composiciones farmacéuticas están
preferiblemente en forma de monodosis de aproximadamente 0,001 a 100
\mug/kg (antígeno/peso corporal) y más preferiblemente 0,01 a 10
\mug/kg y lo más preferiblemente 0,1 a 1 \mug/kg 1 a 3 veces
con un intervalo de aproximadamente intervalos de 1 a 6 semanas
entre inmunizaciones.
Las composiciones farmacéuticas están
preferiblemente en forma de monodosis de aproximadamente 0,1 \mug
a 10 mg y más preferiblemente de 1 \mug a 1 mg y lo más
preferiblemente de 10 a 100 \mug 1 a 3 veces con un intervalo de
aproximadamente 1 a 6 semanas de intervalo entre inmunizaciones.
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por la
secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia establecida en
la SEQ ID Nº: 12.
En una realización, el polinucleótido de la
invención es el que se ilustra en la SEQ ID Nº:11 que puede incluir
los marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican los polipéptidos
de la invención.
Se apreciará que las secuencias de
polinucleótidos ilustradas en las figuras se puede alterar con
codones degenerados que todavía codifican los polipéptidos de la
invención como se define en las reivindicaciones anexas. En
consecuencia con la presente invención además proporciona
polinucleótidos que se hibridan con las secuencias de
polinucleótidos descritas anteriormente en el presente documento (o
sus secuencias complementarias) que tienen un 70% de identidad
entre secuencias. En una realización, al menos un 80% de identidad
entre secuencias. En una realización, al menos 85% de identidad
entre secuencias. En una realización, al menos 90% de identidad
entre secuencias. En una realización adicional, los polinucleótidos
se pueden hibridar en condiciones rigurosas es decir que tienen al
menos 95% de identidad. En una realización adicional, más de 97% de
identidad.
Las condiciones rigurosas adecuadas para
hibridación se pueden determinar fácilmente por los expertos en la
técnica (véase por ejemplo Sambrook et al., (1989) Molecular
cloning : A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.;
Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editado por Ausubel
F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional, la presente
invención proporciona polinucleótidos que se hibridan en condiciones
rigurosas a o bien
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) el complemento de una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido;
comprendiendo dicho polipéptido la SEQ ID Nº:
12.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en el presente documento
polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a o
bien
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) al complemento de una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido;
comprendiendo dicho polipéptido al menos 10
restos contiguos de aminoácidos de un polipéptido que comprende una
secuencia elegida entre la SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ó 14 o
sus fragmentos o análogos.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en el presente documento
polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a o
bien
(a) una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
(b) el complemento de una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido;
en el que dicho polipéptido comprende al menos
10 restos contiguos de aminoácidos de un polipéptido que comprende
una secuencia elegida entre las SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ó
14.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional, el polinucleótido
de la invención es el que se ilustra en la SEQ ID Nº:11.
Como fácilmente apreciarán los expertos en la
técnica, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.
La presente invención también incluye
polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos descritos en
la presente solicitud.
Como también se describe en el presente
documento, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la
invención, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos, se
pueden usar en un procedimiento de inmunización de ADN. Esto es, se
pueden incorporar en un vector que se puede replicar y expresar tras
la inyección produciendo por lo tanto el polipéptido antigénico
in vivo. Por ejemplo se pueden incorporar polinucleótidos en
un vector plásmido bajo el control del promotor de CMV que es
funcional en células eucarióticas. Preferiblemente el vector se
inyecta por vía intramuscular.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un
procedimiento para producir polipéptidos de la invención mediante
técnicas recombinantes mediante la expresión de un polinucleótido
que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y recuperando
el producto de polipéptido expresado. Como alternativa, los
polipéptidos se pueden producir de acuerdo con técnicas sintéticas
establecidas es decir síntesis en fase de solución o fase sólida de
oligopéptidos que están ligados para producir el polipéptido
completo (ligamiento de bloque).
Los procedimientos generales para la obtención y
evaluación de polinucleótidos y polipéptidos se describen en las
siguientes referencias: Sambrook et al, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current
Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel F.M. et
al., John Wiley y Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols,
from Molecular Cloning to Genetic Engineering, Editado por White
B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 páginas; Protein
Purification, Principles y Practices, Scopes R.K.,
Springer-Verlag, New York, 3ª Edition, 1993, 380
páginas; Current Protocols in Immunology, Editado por Coligan J.E.
et al., John Wiley & Sons Inc., New York.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir un polipéptido que comprende el cultivo
de una célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para
la expresión de dicho polipéptido.
Para la producción recombinante, se transfectan
células huésped con vectores que codifican los polipéptidos de la
invención, y después se cultivan en un medio nutriente modificado
según sea apropiado para la activación de promotores, elegir
transformantes o amplificar los genes. Los vectores adecuados son
aquellos que son viables y replicables en el huésped elegido e
incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y
sintéticas por ejemplo, plásmidos bacterianos, ADN de fago,
baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de las
combinaciones de plásmidos y ADN de fago. La secuencia de
polipéptidos se puede incorporar en el vector en el sitio apropiado
usando enzimas de restricción de manera que esté ligado de manera
operativa a una región de control de expresión que comprende un
promotor, sitio de unión a ribosoma (región de consenso o secuencia
de Shine-Dalgarno), y de manera opcional un operador
(elemento de control). Se pueden seleccionar componente
individuales de la región de control de expresión que son apropiados
para un huésped y vector dado de acuerdo con los principios de
biología molecular establecidos (Sambrook et al, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1989; Current Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel
F.M. et al., John Wiley y Sons, Inc. New York). Los promotores
adecuados incluyen pero no se limitan al promotor LTR o SV40,
promotores lac, tac o trp de E. coli y el promotor PL del
fago lambda. Los vectores preferiblemente incorporarán un origen de
replicación así como marcadores de selección, es decir gen de
resistencia a ampicilina. Los vectores bacterianos adecuados
incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10 phagescript,
psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, p.NH16a, pNH18A, pNH46A,
ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540,
pRIT5 y vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44,
pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células huésped pueden ser
bacterias es decir E. coli, Bacillus subtilis,
Streptomyces; fungal es decir Aspergillus niger,
Aspergillus nidulins; levaduras es decir Saccharomyces o
eucariótico es decir CHO, COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo,
las células se cultivan típicamente mediante centrifugación después
se rompe mediante medios físicos o químicos (si el polipéptido
expresado no se secreta en el medio) y el extracto bruto resultante
retenido para aislar el polipéptido de interés. La purificación del
polipéptido del medio de cultivo o lisado se puede lograr mediante
las técnicas establecidas dependiendo de las propiedades del
polipéptido es decir usando precipitación por sulfato de amonio o
etanol, extracción en ácido, cromatografía de intercambio aniónico
o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxiapatita y
cromatografía de lecitina. La purificación final se puede lograr
usando HPLC.
Los polipéptidos se pueden expresar con o sin
una secuencia guía o de secreción. En el caso anterior la guía se
puede retirar usando un procedimiento después de la traducción
(véanse los documentos US 4,431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397)
o se pueden retirar de manera química posteriormente para purificar
el polipéptido expresado.
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De acuerdo con un aspecto adicional, los
polipéptidos de Moraxella de la invención se pueden usar en
un ensayo de diagnóstico para la infección por Moraxella, en
particular infección por Moraxella catarrhalis. Son posibles
varios procedimientos de diagnóstico, por ejemplo la detección del
organismo Moraxella en una muestra biológica, se puede
seguir el siguiente procedimiento
a) incubar un reactivo de anticuerpo o su
fragmento con un polipéptido de Moraxella de la invención
con la muestra biológica para formar una mezcla; y
b) detectar de manera específica el anticuerpo
unido o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de
Moraxella.
\vskip1.000000\baselineskip
Como alternativa, un procedimiento para la
detección de anticuerpo específico para un antígeno de
Moraxella en una muestra biológica que contiene o es
sospechosa de contener dicho anticuerpo se puede realizar como
sigue:
a) incubar uno o más polipéptidos de
Moraxella de la invención o sus fragmentos con la muestra
biológica para formar una mezcla; y
b) detectar el antígeno específicamente unido o
fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo
específico para Moraxella.
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica reconocerán que el
ensayo de diagnóstico puede tener varias formas, incluyendo un
ensayo inmunológico tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación de
látex, esencialmente para determinar si los anticuerpos específicos
para la proteína están presentes en un organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ADN que codifican los
polipéptidos de la invención se pueden usar también para diseñar
sondas de ADN para uso en la detección de la presencia de
Moraxella en una muestra biológica sospechosa de contener
tal bacteria. El procedimiento de detección descrito en el presente
documento comprende:
a) obtener la muestra biológica de un
huésped;
b) incubar una o más sondas de ADN que tienen
una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o
sus fragmentos con la muestra biológica de una mezcla; y
c) detectar la sonda de ADN unida
específicamente en la mezcla que indica la presencia de la bacteria
Moraxella.
\vskip1.000000\baselineskip
Como también se describe en el presente
documento, también se pueden usar las sondas de ADN para detectar
la Moraxella circulante es decir ácidos nucleicos de
Moraxella en una muestra, por ejemplo usando una reacción en
cadena de la polimerasa, como un procedimiento para diagnosticar las
infecciones por Moraxella. La sonda se puede sintetizar
usando técnicas convencionales y se pueden inmovilizar sobre una
fase sólida, o se pueden marcar con una marca detectable. Una sonda
de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene
una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 6
nucleótidos contiguos de los polipéptidos de Moraxella de la
invención. En un ejemplo adicional, la sonda de ADN preferida será
un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos
aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de
Moraxella de la invención. En un caso adicional, la sonda de
ADN preferida será un oligómero que tiene una secuencia
complementaria a al menos aproximadamente 30 nucleótidos contiguos
de los polipéptidos de Moraxella de la invención. En un caso
adicional, la sonda de ADN preferida será un oligómero que tiene una
secuencia complementaria a al menos aproximadamente 50 nucleótidos
contiguos de los polipéptidos de Moraxella de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro procedimiento de diagnóstico para la
detección de Moraxella en un huésped comprende:
a) marcar un reactivo de anticuerpo con un
polipéptido de la invención o su fragmento con una marca
detectable;
b) administrar el anticuerpo marcado o fragmento
marcado al huésped; y
c) detectar el anticuerpo marcado unido de
manera específica o fragmento marcado en el huésped que indica la
presencia de Moraxella.
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Como alternativa, un procedimiento para la
detección de anticuerpo específico para un antígeno de
Moraxella en una muestra biológica que contiene o es
sospechosa de contener dicho anticuerpo se puede realizar como
sigue:
a) obtener una muestra biológica de un
huésped;
b) incubar uno o más polipéptidos de
Moraxella de la invención o sus fragmentos con la muestra
biológica para formar una mezcla; y
c) detectar el antígeno unido o fragmento unido
de manera específica en la mezcla que indica la presencia de
anticuerpo específico para Moraxella.
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica reconocerán que el el
ensayo de diagnóstico puede tomar varias formas, que incluye un
ensayo inmunológico tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación de
látex, esencialmente para determinar si los anticuerpos específicos
para la proteína están presentes en un organismo.
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Las secuencias de ADN que codifican los
polipéptidos de la invención se pueden usar también para diseñar
sondas de ADN para uso en la detección de la presencia de
Moraxella en una muestra biológica sospechosa de contener
tal bacteria. El procedimiento de detección de este caso de la
descripción comprende:
a) obtener la muestra biológica de un
huésped;
b) incubar una o más sondas de ADN que tienen
una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o
sus fragmentos con la muestra biológica de una mezcla; y
c) detectar la sonda de ADN unida
específicamente en la mezcla que indica la presencia de la bacteria
Moraxella.
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De acuerdo con un aspecto, la presente
descripción proporciona el uso de un anticuerpo para el tratamiento
y/o profilaxis de infecciones por Moraxella.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de los polipéptidos de Moraxella de la invención como
inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para la
diagnosis y en particular el tratamiento de Infección por
Moraxella. Los anticuerpos adecuados se puede determinar
usando procedimientos de selección apropiados, por ejemplo mediante
la medición de la capacidad de un anticuerpo particular para
proteger contra infección por Moraxella en un modelo de
ensayo. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón
descrito en los ejemplos en el presente documento. El anticuerpo
puede ser un anticuerpo completo o su fragmento de unión a antígeno
y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El
anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente
de origen mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o
humano. Puede ser un anticuerpo natural o su fragmento, o si se
desea, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. El
término anticuerpo o fragmento recombinante significa anticuerpo o
fragmento de anticuerpo que se produjo usando técnicas de biología
molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo puede ser
policlonal, o preferiblemente monoclonal. Puede ser específico para
un número de epítopos asociado a los polipéptidos de
Moraxella pero es preferiblemente específico para uno.
De acuerdo con un aspecto, la presente
descripción proporciona el uso de un anticuerpo para la profilaxis
y/o tratamiento de infecciones por Moraxella.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de los polipéptidos de Moraxella de la invención como
inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para la
diagnosis y en particular el tratamiento de infección por
Moraxella. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar
usando procedimientos de selección adecuados, por ejemplo mediante
la medición de la capacidad de un anticuerpo particular de proteger
de manera pasiva contra la infección por Moraxella en un
modelo de ensayo. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de
ratón descrito en los ejemplos en el presente documento. El
anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o su fragmento de unión
a antígeno y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina.
El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal,
específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen
murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o su
fragmento, o si se desea, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo
recombinante que se produjo usando técnicas de biología molecular.
El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo puede ser policlonal, o
preferiblemente monoclonal. Puede ser específico para un número de
epítopos asociado a los polipéptidos de Moraxella pero es
preferiblemente específico para uno.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de los anticuerpos dirigidos a los polipéptidos de la invención
para la inmunización pasiva. Se pueden usar los anticuerpos
descritos en la presente solicitud.
También se describe en el presente documento un
procedimiento para la inmunización, mediante el que un anticuerpo
inducido por un polipéptido de la invención se administra a un
huésped en una cantidad suficiente para proporcionar una
inmunización pasiva.
En una realización adicional, la invención
proporciona el uso de una composición farmacéutica de la invención
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico
o terapéutico de infección por Moraxella.
En una realización adicional, la invención
proporciona un kit que comprende un polipéptido de la invención
para la detección o diagnosis de infección por Moraxella.
Salvo que se defina de otra manera, todos los
términos científicos y técnicos en el presente documento tienen el
mismo significado que el que se entiende de manera común por los
expertos en la técnica a los que esta invención pertenece. En caso
de conflicto, la presente memoria descriptiva, que incluye las
definiciones, tendrá autoridad. Además, los materiales,
procedimientos, y ejemplos se ilustran y no se pretende que sean
limitantes.
Se entiende que la presente invención se refiere
a la SEQ ID Nº:11 y la SEQ ID Nº: 12. Sin embargo, la referencias a
otros números de SEQ ID Nº: se mantienen en los siguientes ejemplos
para ayudar a la comprensión de la invención.
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Ejemplo
1
Este ejemplo ilustra la clonación y
características moleculares del gen BVH-MC2 y
polipéptido correspondiente.
La región codificante del gen
BVH-MC2 de M. catarrhalis (SEQ ID Nº:
1) se amplificó mediante PCR (DNA Termal Cycler GeneAmp PCR system
2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de la cepa
ETSU C-2 de M. catarrhalis usando los
siguientes oligos que contenían las extensiones de base para la
adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y
XhoI (CTCGAG): DMAR544 (5'-
CATCAGTGCATATGAATACGACACACCAT
CACACG-3'); DMAR545 (5'- GAGTTATTCTCGAGTTTGTCCAAATTTGGCTTAGTTTTAC-3'). Los productos de PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se digirieron con NdeI y XhoI (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET21b(+) (Novagen, Madison, WI) se digirió con NdeI y XhoI y se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR de NdeI-XhoI se ligaron al vector de expresión NdeI-XhoI pET21b(+). Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli strain DH5\alpha [\Phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta (lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{K}-m_{K}+) deoR thi-1 supE44 \lambda^{-}gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. ADN Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 - 135). Plásmido (rpET21b(+))de pET21b(+) que contiene el gen BVH-MC2 se purificó usando el kit QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).
CACACG-3'); DMAR545 (5'- GAGTTATTCTCGAGTTTGTCCAAATTTGGCTTAGTTTTAC-3'). Los productos de PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se digirieron con NdeI y XhoI (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET21b(+) (Novagen, Madison, WI) se digirió con NdeI y XhoI y se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR de NdeI-XhoI se ligaron al vector de expresión NdeI-XhoI pET21b(+). Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli strain DH5\alpha [\Phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta (lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{K}-m_{K}+) deoR thi-1 supE44 \lambda^{-}gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. ADN Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 - 135). Plásmido (rpET21b(+))de pET21b(+) que contiene el gen BVH-MC2 se purificó usando el kit QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó que el marco abierto de lectura
(ORF) que codifica el polipéptido BVH-MC2 contiene
1467 pares de bases y codifica a 488 restos de aminoácidos
polipéptido con un pI de 6.08 y una masa molecular predicha de
53754,35 Da. El análisis de la secuencia de los restos de
aminoácidos predicha (SEQ ID Nº: 2) usando el sofware Spscan
(Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group)
sugirió la existencia de 30 restos de aminoácido del péptido señal
(MDTDMKHLTKHRLSAAIIGVLLFISPSVQA), que termina con un sitio de
escisión localizado entre los restos de alanina y asparagina.
Para confirmar la presencia mediante
amplificación por PCR del gen BVH-MC2 (SEQ ID Nº:
1), se usaron las siguientes 4 cepas de M. catarrhalis: se
proporcionaron los aislamientos clínicos de M. catarrhalis
ETSU C-2, ETSU T-25, y ETSU 658 por
la East Tennessee State University; la cepa de M. catarrhalis
M-12 fue proporcionada por el centro de
investigación de infección del centro hospitalario de la universidad
Laval. Se usó el E. coli XL1-Blue MRF' en
estos experimentos como un control negativo. El gen
BVH-MC2 (SEQ ID Nº: 1) se amplificó mediante PCR
(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose,
CA) a partir del ADN genómico de las cuatro cepas de M.
catarrhalis, y la cepa de E. coli de control que usa los
cebadores de oligonucleótidos DMAR544 y DMAR545 (Tabla 1). Se
realizó la PCR con 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a
51ºC y 1 min 20 segundos a 72ºC y un período de alargamiento final
de 7 min a 72ºC. Los productos de PCR se fraccionaron por tamaño en
gel de agarosa al 1% y se visualizaron mediante tinción con bromuro
de etidio. Los resultados de estas amplificaciones de PCR se
presentan en la Tabla 2. El análisis de los productos de
amplificación reveló que el gen BVH-MC2 (SEQ ID Nº:
1) estaba presente en el genoma de las 4 cepas de M.
catarrhalis ensayadas. No se detectó ninguno de tales productos
cuando el ADN de control de E. coli se sometió a
amplificaciones mediante PCR con estos cebadores de
oligonucleótidos.
La secuenciación de genes de
BVH-MC2 adicionales a partir de las otras cepas
confirmaron el alto nivel de conservación molecular de este gen
entre las cepa de M. catarrhalis. La región de codificación
respectiva del gen BVH-MC2 de M. catarrhalis
de las cepas ETSU 658 (SEQ ID Nº: 3), ETSU T-25
(SEQ ID Nº: 5), y M-12 (SEQ ID Nº: 7) se
amplificaron mediante PCR usando los cebadores de oligonucleótidos
DMAR544 y DMAR545 como se describe anteriormente. Los productos de
PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción
en gel de QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del
fabricante (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN
(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City,
CA). La secuencia total se puede obtener de la misma manera que en
el Ejemplo 1. Las secuencias de aminoácidos predichas de las cepas
ETSU C-2 (SEQ ID Nº: 2), ETSU 658 (SEQ ID Nº: 4),
ETSU T-25 (SEQ ID Nº:6), y M-12 (SEQ
ID Nº: 8) se presentan respectivamente en las siguientes figuras 2,
4, 6, y 8. Las figuras 15 y 16 respectivamente muestran las
secuencias de nucleótidos de consenso y de aminoácidos predichas
establecidas para M. catarrhalis BVH-MC2. la
comparación por parejas de las secuencias predichas de polipéptidos
de BVH-MC2 revelaron un 100% de identidad. Este
último resultado demuestra claramente el alto nivel de la
conservación molecular de los polipéptidos BVH- MC2 entre los
aislamientos de
M. catarrhalis.
M. catarrhalis.
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Ejemplo
2
Este ejemplo ilustra las características de
clonación y moleculares del gen BVH-MC3 y
polipéptido correspondiente.
La región que codifica el gen de M.
catarrhalis BVH-MC3 (SEQ ID Nº: 9) se
amplificó mediante PCR (DNA Termal Cycler GeneAmp PCR system 2400
Perkin Elmer, San Jose, CA) del ADN genómico de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis usando los
siguientes oligos que contenían las extensiones base para la adición
de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG):
DMAR592 y DMAR593, que se presentan en la Taba 1. Los procedimientos
usados para la clonación de BVH-MC3 en un vector
de expersión y secuenciación son similares a los procedimientos
descritos en el Ejemplo 1.
Se determinó que el marco abierto de lectura
(ORF) que codifica BVH- MC3 contiene 1656 pares de bases y codifica
un polipéptido de 551 restos de aminoácidos con un pI predicho de
4,68 y una masa molecular predicha de 58910,13 Da. El análisis de
la secuencia de los restos de aminoácidos (SEQ ID Nº: 10) que usa el
software Spscan Paquete Wisconsin Sequence Analysis; Genetics
Computer Group) sugirió la existencia de un péptido de señal re 46
restos de aminoácidos (MSLINKLNER
ITPHVLTSIKNQDGDNADKSNLLTAFYTIFAGRLSN), que termina con el sitio de
escisión localizado entre un resto de asparigina y ácido
glutámico.
El gen BVH-MC3 se mostró que
estaba presente después de la amplificación por PCR usando los
cebadores de oligonucleótidos DMAR592 y DMAR593 en las 4 cepas de
M. catarrhalis ensayadas (Tabla 2). Los procedimientos
usados para la amplificación por PCR del gen BVH-MC3
eran similares a los procedimientos presentados en el Ejemplo 1. No
se detectó ninguno de tales productos cuando el ADN de control de
E. coli se sometía a idéntica amplificación de PCR con estos
cebadores de oligonucleótidos.
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Ejemplo
3
Este ejemplo ilustra las características de
clonación y moleculares del gen BVH-MC4 y
polipéptido correspondiente.
La región codificante del gen
BVH-MC4 de M. catarrhalis (SEQ ID Nº: 11) se
amplificó mediante PCR (DNA Termal Cycler GeneAmp PCR system 2400
Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis usando los siguientes
oligos que contenían las extensiones de base para la adición de los
sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG) : RIOS71
y RIOS72, que se presentan en la Tabla 1. Los procedimientos usados
para la clonación de BVH-MC4 en un vector de
expresión y secuenciación son similares a los procedimientos
presentados en el Ejemplo 1.
Se determinó que el marco abierto de lectura
(ORF) que codifica BVH-MC4 contiene 1251 pares de
bases y codifica un polipéptido de 416 restos de aminoácidos con
un pI predicho de 4,84 y una masa molecular predicha de 46125,11
Da. El análisis de la secuencia de los restos de aminoácidos (SEQ ID
Nº: 12) que usa el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis
Package; Genetics Computes Group) sugirió la existencia de un
péptido señal de 42 restos de aminoácidos
(MDTKHIQQNWLLPDGVADVLFTDAQKQESLRDALLFVLTAHG), que termina con un
sitio de escisión localizado entre un resto de glicina y
tirosina.
El gen BVH-MC4 se mostró que
estaba presente después de la amplificación por PCR usando los
cebadores de oligonucleótidos RIOS71 y RIOS72 en las 4 cepas de
M. catarrhalis ensayadas (Tabla 2). Los procedimientos usados
para la amplificación por PCR del gen BVH-MC4 eran
similares a los procedimientos presentados en el Ejemplo 1. No se
detectó ninguno de tales productos cuando el ADN de control de
E. coli se sometió a amplificaciones mediante PCR con estos
cebadores de oligonucleótidos.
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Ejemplo
4
Este ejemplo ilustra las características de
clonación y moleculares del gen BVH-MC5 y
polipéptido correspondiente.
La región codificante del gen
BVH-MC5 de M. catarrhalis (SEQ ID Nº: 13) se
amplificó mediante PCR (DNA Termal Cycler GeneAmp PCR system 2400
Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis usando los siguientes
oligos que contenían las extensiones de base para la adición de los
sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG):
RIOS59 y RI4S60, que se presentan en la Tabla 1. Los procedimientos
usados para la clonación de BVH-MC5 en un vector de
expresión y secuenciación son similares a los procedimientos
presentados en el Ejemplo 1.
Se determinó que el marco abierto de lectura
(ORF) que codifica BVH-MC5 contiene 639 pares de
bases y codifica un polipéptido de 212 restos de aminoácidos con un
pI predicho de 7,45 y una masa molecular predicha de 24020,08 Da.
El análisis de la secuencia de los restos de aminoácidos (SEQ ID Nº:
14) que usa el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis
Package; Genetics Computer Group) sugirió la existencia de un
péptido señal de 60 restos de aminoácidos
(MNNFVYQLQSFWYELNQVNRHTIAQSPKYIQLTVLGLIVMIIGIFGWLLAIL PTIQKL
NA), que termina con un sitio de escisión localizado entre dos restos de alanina.
NA), que termina con un sitio de escisión localizado entre dos restos de alanina.
El gen BVH-MC5 se mostró que
estaba presente después de la amplificación por PCR usando los
cebadores de oligonucleótidos RIOS59 y RIOS60 en las 4 cepas de
M. catarrhalis ensayadas (Tabla 2). Los procedimientos usados
para la amplificación por PCR del gen BVH-MC5 eran
similares a los procedimientos presentados en el Ejemplo 1. No se
detectó ninguno de tales productos cuando el ADN de control de
E. coli se sometió a amplificaciones mediante PCR con estos
cebadores de oligonucleótidos.
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Ejemplo
5
Este ejemplo ilustra la clonación de los genes
de M. catarrhalis en el plásmido pCMV-GH de
CMV.
Las regiones codificantes de ADN que codifican
un polipéptidos de M. catarrhalis se insertaron en fase
cadena abajo de un gen de la hormona de crecimiento humana (hGH)
que estaba en el control de la transcripción del promotor de
citomegalovirus (CMV) en el vector del plásmido
pCMV-GH (Tang et al., Nature, 1992, 356:
152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en células de
E. coli pero se activan tras la administración del plásmido
en células eucarióticas. El vector también incorporó el gen de
resistencia a ampicilina.
Las regiones codificantes de los genes
BVH-MC2 (SEQ ID Nº: 1), BVH- MC3 (SEQ ID Nº: 9),
BVH-MC4 (SEQ ID Nº: 11), y BVH-MC5
(SEQ ID Nº: 13) sin sus regiones de péptido guía se amplificaron
mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin
Elmer, San Jose, CA) a partir del ADN genómico de la cepa ETSU
C-2 de M. catarrhalis usando los cebadores
de oligonucleótidos que contenían extensiones de base para la
adición de los sitios de restricción BamHI (GGATCC),
BglII (AGATCT), SalI (GTCGAC), o HindIII (AAGCTT) que
se describen en la Tabla 1. Los productos de PCR se purificaron a
partir gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick
de QIAgen (Chatsworth, CA), digeridos con enzimas de restricción
(Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Baie d'Urfe, Canadá). El vector
pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston,
Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)
se digirió con BamHI, BglII, SalI, o
Hindi y se purificó en gel de agarosa usando el kit de
extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los
fragmentos de ADN digeridos se ligaron al vector pCMV- GH digerido
para crear los polipéptidos de fusión
hGH-BVH-MC2,
hGH-BVH-MC3,
hGH-BVH-MC4, y
hGH-BVH-MC5 bajo el control del
promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron en la cepa
de E. coli
DH5\alpha[\Phi80dlacZ\DeltaM15\Delta(lacZYA-argF)U169
endA1 recA1
hsdR17(r_{K}-m_{K}+) deoR
thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1]
(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de
Simanis (Hanahan, D. ADN Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 -
135). Los plásmidos de pCMV recombinantes se purificaron usando el
kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos de las
inserciones de ADN se versificaron mediante la secuenciación de
ADN.
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Ejemplo
6
Este ejemplo ilustra el uso de ADN para producir
una respuesta inmune a antígenos de polipéptidos de M.
catarrhalis.
\newpage
Un grupo de 8 ratones hembras BALB/c Charles
River, St-Constant, Québec, Canadá) se inmunizaron
mediante inyección intramuscular de100 \mul tres veces a
intervalos de dos - tres semanas con 50 \mug de
pCMV-GH recombinante que codifica los genes BVHMC2
(SEQ ID Nº: 1), BVH-MC3 (SEQ ID Nº: 9),
BVH-MC4 (SEQ ID Nº: 11), y BVH-MC5
(SEQ ID Nº: 13) en presencia de 50 \mug del factor estimulador de
las colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF)-que expresan el plásmido
pCMV-GHGM-CSF (Laboratorio del Dr.
Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of
Texas, Dallas, Texas). Como control, se inyectó un grupo de ratones
con 50 \mug de pCMV-GH en presencia de 50
\mug de
pCMV-GH-GM-CSF. Se
recogieron muestras de sangre a partir del seno orbital antes de
cada inmunización y siete días después de la tercera inyección y
se determinaron las respuestas de anticuerpo en suero mediante
ELISA usando los polipéptidos recombinantes de M. catarrhalis
marcados con His-Tag como antígeno de
revestimiento. La producción y purificación de estos polipéptidos
recombinantes de M. catarrhalis marcados con
His-Tag se presentan en el Ejemplo 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Este ejemplo ilustra la producción y
purificación de polipéptidos recombinantes de M.
catarrhalis.
El plásmido pET21b(+) recombinante con los genes
BVH-MC2 (SEQ ID Nº: 1),
BVH-MC3 (SEQ ID Nº: 9),
BVH-MC4 (SEQ ID Nº: 11), y
BVH-MC5 (SEQ ID Nº: 13) se usaron para
transformar mediante electroporación (Gene Pulser II aparato,
BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) la cepa de E.
coli AD494 (DE3) [\Deltaara-leu7697
\DeltalacX74 \DeltaphoA PvuII phoR
\DeltamalF3 F' [lac+(lacIg) pro]
trxB::Kan (DE3)] (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de
E. coli, el promotor T7 que controla la expresión del
polipéptido recombinante es se reconoce específicamente por la ARN
polimerasa de T7 (presente en el profago \lambdaDE3) cuyo gen
está bajo el control del promotor lac que se puede inducir por la
isopropil-\beta-d-tio-galactopiranósido
(IPTG). Se desarrolló el transformante AD494(DE3)/rpET21b(+)
a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB broth (peptona 10 g/l,
extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contiene 100 \mug de
carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville,
Canadá) por ml hasta que la A_{600} alcanzó un valor de 0,5. Con
el fin de inducir la producción de los polipéptidos recombinantes
de M. catarrhalis marcados con His, las células se incubaron
durante 3 horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración
final de 1 mM. Las células inducidas a partir de 500 ml de cultivo
se sedimentaron mediante centrifugacion y se congelaron a
-70ºC.
-70ºC.
La purificación de los polipéptidos
recombinantes a partir de la fracción citoplásmica soluble de AD494
(DE3)/
rpET21b(+) inducida por IPTG se realizó mediante cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia de His\cdotTag (6 restos de histidina consecutivos) que se unen a cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados sobre la resina de quelación de metal His\cdotBind. En resumen, las células sedimentadas obtenidas a partir de 500 ml de cultivo inducido pos IPTG se volvió a suspender en tapón de lisis (20 mM Tris, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,9) que contenía 1 mM PMSF, se sonicó y se centrifugó a 12.000 X g durante 20 min para eliminar los desechos. El sobrenadante se depositó sobre una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá). Los polipéptidos recombinantes de M. catarrhalis marcados por His se eluyeron con 250 mM imidazol-500 mM NaCl- 20 mM Tris pH 7,9. la retirada de la sal e y imidazol de la muestra se realizó mediante diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de polipéptidos recombinantes obtenidos a partir de la fracción soluble de E. coli se estimó mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
rpET21b(+) inducida por IPTG se realizó mediante cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia de His\cdotTag (6 restos de histidina consecutivos) que se unen a cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados sobre la resina de quelación de metal His\cdotBind. En resumen, las células sedimentadas obtenidas a partir de 500 ml de cultivo inducido pos IPTG se volvió a suspender en tapón de lisis (20 mM Tris, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,9) que contenía 1 mM PMSF, se sonicó y se centrifugó a 12.000 X g durante 20 min para eliminar los desechos. El sobrenadante se depositó sobre una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá). Los polipéptidos recombinantes de M. catarrhalis marcados por His se eluyeron con 250 mM imidazol-500 mM NaCl- 20 mM Tris pH 7,9. la retirada de la sal e y imidazol de la muestra se realizó mediante diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de polipéptidos recombinantes obtenidos a partir de la fracción soluble de E. coli se estimó mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
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Ejemplo
8
Este ejemplo ilustra la reactividad de
polipéptidos recombinantes de M. catarrhalis marcados con His
con amígdalas palatinas y el suero recogido de los ratones de los
ratones después de inmunización con preparaciones antigénicas de
M. catarrhalis.
Como se muestra en la Tabla 3, los polipéptidos
recombinantes de BVH- MC2, BVH-MC3, y
BVH-MC4 marcados con His se reconocieron en
inmunotransferencias mediante los anticuerpos presentes en las
amígdalas palatinas. Se indica que los seres humanos, que
normalmente están en contacto con M. catarrhalis
desarrollan anticuerpos que son específicos para estos
polipéptidos. Estos anticuerpos particulares humanos pueden estar
implicados en la protección contra la infección por M.
catarrhalis. Además, las inmunotransferencias también revelaron
que el suero recogido de los ratones inmunizados con polipéptidos
de membrana enriquecidos con preparación antigénica de M.
catarrhalis que indujeron la eliminación de pulmón
significativa en un modelo de ratón también desarrolló anticuerpos
que reconocieron los polipéptidos recombinantes de
BVH-MC2 marcados por His. Estos resultados indican
que este polipéptido estaba presente en la preparación antigénica de
M. catarrhalis que protegían a los ratones contra la
infección y que inducía anticuerpos que reaccionan con el
recombinante polipéptido marcado con His BVHMC2.
Ejemplo
9
Este ejemplo ilustra la accesibilidad a
anticuerpos de los polipéptidos BVH-MC2,
BVH-MC3, BVH-MC4, y
BVH-MC5 en la superficie de la cepa de M.
catarrhalis.
Se hicieron crecer las bacterias en caldo Brain
Heart Infusion (BHI) que contenía 0,25% de dextrosa a 37ºC en una
atmósfera de 8% de CO_{2} proporcionando una DO_{490 \ nm} de
0,650 (-10^{8} UFC/ml). Las diluciones de anti-
BVH-MC2,
anti-BVH-MC3,
anti-BVH-MC4,
anti-BVH-MC5, o suero control se
añadieron después y se dejó que se unieran a las células, que se
incubaron durante 2 h a 4ºC con rotación. Se lavaron las muestras 4
veces en tampón de bloqueo [solución salina tamponada con fosfato
(PBS) que contenía 2% de albúmina sérica bovina (BSA)], y después
se añadió 1 ml de fragmento anti- ratón IgG Fc (gamma) conjugado a
fluoresceína (FITC) de cabra específico diluido en tampón de
bloqueo. Después de una incubación adicional de 60 min a
temperatura ambiente con rotación en la oscuridad, se lavaron las
muestras 4 veces en tampón de bloqueo y se fijaron con 0,25% de
formaldehído en tampón PBS durante 18 h a 4ºC. Las células se
lavaron 2 veces en tampón PBS y se volvieron a suspender en 0,5 ml
de tampón PBS. Las células se mantuvieron en la oscuridad a 4ºC
hasta que se analizaron mediante citometría de flujo (Epics® XL;
Beckman Coulter, Inc.). El análisis de citometría de flujo reveló
que los anticuerpos específicos de BVHMC2-,
BVH-MC3-, BVH- MC4-, y BVH-MC5
reconocían de manera eficaz sus epítopos de superficie expuestos
correspondiente sobre la cepa de M. catarrhalis (ETSU
C-2) ensayada (Tabla 4). Se determinó que más del
70% de las 10.000 células de Moraxella analizadas se marcaron
con los anticuerpos presentes en el suero específico. Estas
observaciones demuestran claramente que estos polipéptidos son
accesibles a en la superficie donde se pueden reconocer fácilmente
por los anticuerpos. Los anticuerpos Anti-M. catarrhalis se
mostró que juegan un papel importante en la protección frente a
infección por M. catarrhalis.
\newpage
Ejemplo
10
Este ejemplo ilustra las actividades
bactericidas de suero de ratón anti- BVH-MC2.
Las bacterias se sembraron sobre una placa de
agar chocolate y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de 8% de
CO_{2} durante 18 h. Las células bacterianas se volvieron a
suspender después en tampón de bacteriolisis [10% de solución
salina equilibrada de Hanks (HBSS) y 1% de caseína hidrolizada, pH
7,3] a una DO_{490 \ nm} de 0,25 y se diluyó hasta 8 x 10^{4}
UFC/ml. El ensayo bactericida se realizó mezclando 25 \mul de la
suspensión bacteriana con 50 \mul de suero de ensayo inactivado
por calor y 15 \mul de HBSS e incubando durante 15 min a 37ºC,
8% de CO_{2} con agitación (200 rpm). El suero que contenía
complemento de conejo se añadió después hasta una concentración
final de 10%, y se incubó la mezcla durante 60 minutos adicionales
a 37ºC, 8% de CO_{2} con agitación (200 rpm). Al final del
período de incubación, el número de bacterias viables se determinó
mediante siembra de 10 \mul de la mezcla de ensayo sobre placa de
agar de chocolate. Las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera
de 8% de CO_{2} durante 18 - 24 h. El control consistía en
bacterias incubadas con suero inactivado por calor recogido de
ratones antes de la inmunización y complemento de conejo.
El % de lisis se determinó mediante la siguiente
formula matemática:
A = UFC obtenidas cuando las bacterias se
incubaron con suero inmune.
B = UFC obtenidas con el suero antes de la toma
de muestras de sangre.
La cepa ETSU 658 de M. catarrhalis se usó
para evaluar la actividad bactericida del suero. El porcentaje de
lisis de 71,3 se determinó para el suero de ratón recogido después
de la inmunización con el polipéptido purificado recombinante
BVH-MC2 (SEQ ID Nº: 2) (Tabla 5).
Ejemplo
11
Este ejemplo ilustra las actividades
bactericidas de suero de ratón anti- BVH-MC3.
Las bacterias se sembraron sobre placas de agar
chocolate y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de 8% de CO_{2}
durante 18 h. Las células bacterianas se volvieron a suspender
después en tampón de bacteriolisis [10% de solución salina
equilibrada de Hanks (HBSS) y 1% de caseína hidrolizada, pH 7,3] a
una DO_{490 \ nm} de 0,25 y se diluyó hasta 8 x 10^{4} UFC/ml.
El ensayo bactericida se realizó mezclando 25 \mul de la
suspensión bacteriana con 50 \mul de suero de ensayo inactivado
por calor y 15 \mul de HBSS e incubando durante 15 min a 37ºC,
8% de CO_{2} con agitación (200 rpm). El suero que contenía
complemento de conejo se añadió después hasta una concentración
final de 10%, y se incubó la mezcla durante 60 minutos adicionales
a 37ºC, 8% de CO_{2} con agitación (200 rpm). Al final del
período de incubación, el número de bacterias viables se determinó
mediante siembra de 10 \mul de la mezcla de ensayo sobre placa de
agar de chocolate. Las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera
de 8% de CO_{2} durante 18 - 24 h. El control consistía de
bacterias incubadas con suero inactivado por calor recogido de
ratones antes de la inmunización y complemento de conejo. La cepa
ETSU 658 de M. catarrhalis se usó para evaluar la actividad
bactericida de suero. El % de lisis se determinó mediante la
siguiente formula matemática:
A = UFC obtenidas cuando las bacterias se
incubaron con suero inmune.
B = UFC obtenidas con el suero antes de la toma
de muestras de sangre.
Los anticuerpos bactericidas se encontró que
estaban presentes en el suero recogido de los 7 ratones que se
habían inmunizado con el polipéptido BVH- MC3 recombinante (Tabla
6). No se registró ninguna actividad bactericida en el suero
recogido de los ratones de control (datos no mostrados).
Ejemplo
12
Este ejemplo ilustra la protección de ratones
frente a infección por M. catarrhalis inducida mediante la
inmunización con polipéptido recombinante de
BVH-MC3.
Se inmunizaron grupos de ratones hembra BALB/c
(Charles River) por vía subcutánea cinco veces a intervalos de dos
semanas con 20 \mug de polipéptido de afinidad
BVH-MC3 recombinante de M. catarrhalis
marcado con His en la presencia de un 10% de adyuvante QuilA
(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control, con
adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogieron muestras de sangre del
seno orbital el día 0, 14, 28, 42, y 56 antes de cada inmunización
y 14 días (día 70) después de la quinta inyección. Una semana más
tarde los ratones se sometieron a prueba de provocación por vía
intrapulmonar con aproximadamente 1x10^{6} UFC de la cepa ETSU
658 de M. catarrhalis. Las muestras del inóculo de la prueba
de provocación con M. catarrhalis se sembraron sobre placas
de agar chocolate para determinar las UFC y para verificar la dosis
de la prueba de provocación. Se sacrificaron los ratones mediante
una inyección peritoneal de pentobarbital de sodio (Euthanyl^{TM})
el 5º día después de la inyección. Los pulmones intactos se
extirparon y se homogeneizado en un homogeneizador de tejidos. El
homogenato de tejidos se evaluó para determinar la eliminación de
bacterias mediante la siembra de las diluciones en serie para la
determinación de UFC. El % de eliminación se determinó mediante la
siguiente formula matemática:
A = UFC obtenidas con los ratones inmunizados
con el polipéptido BVH-MC3
B = UFC obtenidas en los ratones de control
Como se muestra en la Tabla 7, una reducción de
54% en el número de bacterias vivas se determinó para los ratones
inmunizados con el polipéptido BVH-MC3 de manera
comparativa con los ratones en el grupo control. De este modo, la
inmunización con el polipéptido BVH-MC3 promovió la
rápida eliminación de una cepa heteróloga de M. catarrhalis
de los pulmones de los ratones.
<110> Shire Biochem Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antígenos de Moraxella
(Branhamella) Catarrhalis
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 74872-83
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/290,653
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 551
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 639
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
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<210> 27
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<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Shire Biochem Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moraxella (Branhamella)
Catarrhalis Antigens
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 74872-83
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/290,653
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1299
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<212> ADN
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<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 433
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<212> PRT
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<213> Moraxella catarrhalis
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1299
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 433
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<212> PRT
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<213> Moraxella catarrhalis
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 1656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
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<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 551
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<212> PRT
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<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 639
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
Claims (24)
1. Un polinucleótido aislado elegido entre:
a. un polinucleótido que codifica un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a
la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo
el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que específicamente
se une a un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12;
b. un polinucleótido que codifica un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a
la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo
el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que específicamente
se une al polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12;
c. un polinucleótido que codifica un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a
la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo
el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que específicamente
se une al polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12;
d. un polinucleótido que comprende la SEQ ID Nº:
11, y
e. un polinucleótido que es complementario con
un polinucleótido de (a), (b), (c), o (d).
2. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, polinucleótido que codifica un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la
secuencia establecida en la SEQ IQ NO: 12, siendo el polipéptido
capaz de producir un anticuerpo que específicamente se une al
polipéptido que comprende la SEQ ID Nº: 12.
3. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 1, polinucleótido que codifica un polipéptido que
comprende la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir
un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido que
comprende la SEQ ID Nº: 12.
4. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 1, polinucleótido que codifica un polipéptido que
consta de la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de producir
un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido que
comprende la SEQ ID Nº: 12.
5. El polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, siendo dicho polinucleótido ADN.
6. El polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, siendo dicho polinucleótido ARN.
7. Un polinucleótido aislado que se hibrida en
condiciones rigurosas a o bien
a. una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o
b. al complemento de una secuencia de ADN que
codifica dicho polipéptido;
comprendiendo dicho polipéptido la SEQ ID Nº:
12.
8. A vector que comprende el polinucleótido de
la reivindicación 5, en el que dicho ADN está unido de manera
operativa a una región de control de expresión.
9. Una célula huésped transfectada con el
vector de la reivindicación 8.
10. Un procedimiento para producir un
polipéptido codificado por el polinucleótido aislado de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, comprendiendo dicho
procedimiento el cultivo de la célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 9 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho
polipéptido.
11. Un polipéptido aislado elegido entre.
a. un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos
establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de
producir un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido
que comprende la SEQ ID Nº: 12;
b. un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos
establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de
producir un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido
que comprende la SEQ ID Nº: 12,
c. un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos
establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido capaz de
producir un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido
que comprende la SEQ ID Nº: 12;
d. un fragmento antigénico/inmunogénico que
comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de un polipéptido que
comprende la SEQ ID Nº: 12, en el que el fragmento es capaz de
producir un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido
que comprende la SEQ ID Nº 12;
e. el polipéptido de (a), (b), (c), o (d), en el
que el resto Met N-terminal está suprimido, y
f. el polipéptido de (a), (b), (c), o (d), en el
que la secuencia de aminoácidos secretora está suprimida.
12. El polipéptido aislado de la reivindicación
11, en el que el polipéptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos que
comprende la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido aislado capaz de
producir un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido que
comprende la SEQ ID Nº 12.
13. El polipéptido aislado de la reivindicación
11, polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos
establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido aislado capaz
de producir un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido
que comprende la SEQ ID Nº 12.
14. El polipéptido aislado de la reivindicación
11, polipéptido aislado que consta de la secuencia de aminoácidos
establecida en la SEQ ID Nº: 12, siendo el polipéptido aislado capaz
de producir un anticuerpo que se une de manera específica al
polipéptido que comprende la SEQ ID Nº 12.
15. Un polipéptido quimérico que comprende dos o
más polipéptidos aislados, comprendiendo cada uno de los dos o más
polipéptidos aislados comprende la secuencia de aminoácidos
establecida en la SEQ ID Nº: 12.
16. Una composición farmacéutica que comprende
(a) el polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14 o el polipéptido quimérico de acuerdo con
la reivindicación 15 y (b) un vehículo, diluyente o adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
17. El uso de un polipéptido aislado de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el polipéptido
quimérico de acuerdo con la reivindicación 15 en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de
infección por Moraxella en un huésped.
18. El uso del polipéptido aislado de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el polipéptido
quimérico de acuerdo con la reivindicación 15 en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de
otitis media, sinusitis, tos persistente, laringitis aguda,
queratitis supurativa, conjuntivitis de neonatos, y enfermedad
invasiva en un huésped.
19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 y 18 en el que el huésped es un neonato, un
lactante o niño.
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 y 18 en el que el huésped es un adulto.
21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 y 18 en el que el huésped es un huésped
inmunodeprimido.
22. Un kit que comprende el polipéptido aislado
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el
polipéptido quimérico de acuerdo con la reivindicación 15 para la
detección o diagnosis de infección por Moraxella.
23. Un procedimiento para detectar
Moraxella en una muestra biológica, que comprende
a) incubar un anticuerpo o fragmento de unión a
antígeno del mismo que específicamente se une al polipéptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el
polipéptido quimérico de acuerdo con la reivindicación 15 con la
muestra biológica para formar una mezcla; y
b) detectar el anticuerpo unido de manera
específica o fragmento de unión a antígeno unido en la mezcla, que
indica la presencia de Moraxella en la muestra biológica.
24. Un procedimiento para la detección de un
anticuerpo específico para un antígeno de Moraxella en una
muestra biológica que contiene o es sospechosa de contener dicho
anticuerpo, comprendiendo dicho procedimiento
a. incubar uno o más polipéptidos aislados de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el
polipéptido quimérico de acuerdo con la reivindicación 15 con la
muestra biológica para formar una mezcla; y
b. detectar el polipéptido unido específicamente
o polipéptido quimérico unido en la mezcla, que indica la presencia
de anticuerpo específico de Moraxella.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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