ES2316909T3 - Extracto de polvo de establo para proteccion contra alergias. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un extracto de antialérgico a utilizar como medicamento, caracterizado porque el extracto se prepara en las etapas siguientes: a) recogida de polvo de establo seco, b) eventualmente homogeneización del polvo, c) suspensión del polvo, eventualmente homogeneizado, en agua o en una solución tampón acuosa que contenga sales mono o bivalentes, elegidas entre NaCl, Na2SO4, KCl, LiCl, MgCl2 y CaCl2, preferentemente una solución de NaCl al 0,9%, a temperatura ambiente o inferior, d) eventualmente disgregación de los componentes del polvo, e) sedimentación de los componentes sólidos de la suspensión y retirada del sobrenadante acuoso, constituyendo el sobrenadante tras la sedimentación el extracto, f) eventualmente diálisis del sobrenadante acuoso donde durante todo el proceso de preparación no se realiza ninguna aportación de calor.
Description
Extracto de polvo de establo para protección
contra alergias.
La presente invención se refiere a una
composición que contiene toda la potencia protectora, toda la
actividad protectora y todo el efecto protector contra alergias de
un polvo de establo natural, y a un procedimiento para la
preparación de esta composición.
Se denominan alergias las reacciones excesivas
del cuerpo, en particular del sistema inmunitario, a sustancias
extrañas no perjudiciales. Estas reacciones se desarrollan igual que
la respuesta inmunitaria normal contra un agente patógeno. Se
distingue entre varios tipos de respuesta inmunitaria alérgica. Las
reacciones alérgicas de tipo I, entre las que se incluyen el asma
bronquial, la dermatitis atópica, la urticaria, la fiebre del heno
y las alergias alimentarias, son las más extendidas. Aunque estas
enfermedades presentan diferentes síntomas corporales, se basan en
mecanismos inmunológicos similares.
Numerosos estudios prueban que las afecciones
alérgicas van en aumento. Hasta la fecha, las causas del origen y
el desarrollo de las alergias no están claros. Determinados factores
hereditarios desconocidos hasta la fecha y determinadas condiciones
ambientales, tales como la exposición a alérgenos, la vida en la
ciudad, el número de hermanos y algunas infecciones, contribuyen
probablemente a su origen.
Las alergias de tipo I son mediadas por
anticuerpos del grupo E, cuyo origen depende de los linfocitos T
cooperadores del grupo II. En las alergias, estas células Th2 se
presentan con una frecuencia mayor que las células Th1. Los niños
nacen en primer lugar con una respuesta inmunitaria en la que
predominan las células Th2, que durante el primer año de vida se
desplaza hacia una respuesta en la que predominan las células Th1
(respuesta inmunitaria no alérgica), probablemente bajo la
influencia de la carga microbiana. Se supone que las infecciones
frecuentes están relacionadas con una menor respuesta de las
células Th2 y por lo tanto con una menor cantidad de alergias. Así
pues, una carga microbiana pequeña podría llevar a una mayor
frecuencia en la aparición de alergias (hipótesis de la higiene).
Una serie de estudios epidemiológicos en Europa ha demostrado que
los niños que se crían en granjas presentan muchas menos afecciones
alérgicas que los niños que crecen en condiciones de vida no
tradicionales ("efecto campesino"). En la actualidad está
claro que este efecto está relacionado con el contacto frecuente de
los niños con los establos de las granjas, ya que la protección
alérgica más intensa se halló en niños que frecuentaban estos
lugares durante el primer año de vida. Este efecto protector
proviene muy probablemente del contacto con el polvo de establo
(por ejemplo por inhalación). Esto se encuentra relacionado con el
hecho de que el polvo de establo contiene, entre otras cosas,
sustancias de efecto inmunoestimulante procedentes de bacterias,
virus, hongos, plantas y animales, que presumiblemente condicionan
el "efecto campesino" relacionado con la hipótesis de la
higiene. Sin embargo, hasta la fecha se desconoce qué sustancias del
polvo de establo provocan al fin y al cabo el efecto protector.
Las posibilidades para la prevención y la
terapia de afecciones alérgicas son limitadas. Los síntomas pueden
mitigarse relativamente bien mediante numerosos medicamentos, pero
los tratamientos inmunoterapéuticos como la desensibilización
difieren en cuanto a sus resultados. Sobre todo en el asma bronquial
de frecuente aparición, esta terapia resulta más bien ineficaz. La
evitación de alérgenos como medida preventiva tampoco contribuye
con seguridad a reducir la frecuencia de las alergias. En suma, no
existen posibilidades de reducir el riesgo de formación de
alergias.
El documento WO/0149319 revela la posibilidad de
recoger el polvo de establo mediante un filtro de aire directamente
en una solución acuosa, por ejemplo en una solución salina
fisiológica, y utilizarlo luego directamente para la profilaxis de
alergias en niños.
Los microorganismos contenidos en el polvo
pueden también disgregarse o depurarse. En el caso de una
disgregación, el detritus celular, los trozos de membrana, las
organelas y las proteínas aislados(as) = antígenos de
interés. Los fragmentos de disgregación pueden depurarse aun más,
es decir que es posible eliminar los ácidos nucleicos y otros
componentes no deseados mediante centrifugación, métodos
cromatográficos, filtración en gel y/o salificación.
En cambio, según la invención se recoge polvo de
establo seco y se utiliza el sobrenadante líquido de la extracción
acuosa tras una sedimentación.
El documento 96/00579 describe un procedimiento
para la preparación de una suspensión y un extracto de micobacterias
en solución acuosa, en el que el extracto se calienta como mínimo
durante 20 minutos a 121ºC. Esta suspensión, o este extracto, puede
emplearse para la inmunomodulación inespecífica.
El objetivo de la presente invención era la
puesta a disposición de un procedimiento para la preparación de un
medio, y la puesta a disposición de un medio, para profilaxis y
tratamiento de afecciones alérgicas.
Este objetivo se logra mediante un procedimiento
según la reivindicación 1.
El extracto se prepara a partir de polvo de
establo, preferentemente de granjas.
El polvo puede recogerse por medio de cualquier
tipo de sistema de recogida, o sea mediante barrido, aspiración,
limpieza y similares, sin que la invención se vea por ello
limitada.
Tras la recogida, el polvo puede homogeneizarse.
Para ello puede emplearse cualquier tipo de técnica que consiga una
homogeneización uniforme del polvo y especialmente que elimine las
adhesiones y aglutinaciones de polvo. Con este fin resultan
adecuados procedimientos tales como frotación, rotura por golpeo o
machacado, agitación o introducción en una mezcladora, aunque los
procedimientos no se limitan a éstos. Una disgregación del polvo
también puede ser parte integrante del procedimiento según la
invención. Una disgregación de los componentes presentes en el
polvo, tal como por ejemplo células, microorganismos, especialmente
sus esporas y similares, puede realizarse por ejemplo mediante
trituración, aplastamiento y procedimientos similares.
La extracción del polvo se efectúa según la
invención preferentemente mediante agua o una solución acuosa,
prefiriéndose especialmente una solución salina fisiológica o un
tampón acuoso. Un tampón acuoso preferido contiene sales de sodio o
sales mono o bivalentes similares, como por ejemplo
Na_{2}SO_{4}, KCl, LiCl, MgCl_{2} y CaCl_{2}. Se prefiere
muy especialmente la extracción del polvo con una solución salina
fisiológica (NaCl al 0,9%).
Un aspecto importante del procedimiento según la
invención es que durante todo el proceso de tratamiento para la
preparación del extracto se realiza sin aportación alguna de calor
externo. Esto significa que ni los disolventes empleados se
calientan (en el momento del empleo), ni se realiza ninguna
aportación de calor durante el proceso de preparación. El extracto
se prepara más bien a temperatura ambiente o a temperaturas
inferiores. Esto significa que todos los disolventes utilizados
pueden tener la temperatura ambiente (dependiendo de la época del
año y del lugar de preparación entre aprox. 10ºC y 40ºC) o estar
refrigerados, pero no se utilizan en caliente ni el extracto
se
calienta.
calienta.
Tras la absorción del polvo en la solución
acuosa o el agua, esta suspensión se deja reposar o bien se agita,
de modo que las sustancias solubles en agua o susceptibles de
eliminarse del polvo mediante agua puedan pasar a la fase acuosa. A
continuación se eliminan, mediante una etapa de sedimentación, las
partes de polvo que han permanecido en la solución como componentes
sólidos. La etapa de sedimentación no es restrictiva para el
procedimiento según la invención, puede aplicarse cualquier tipo de
sedimentación conocido por el técnico en la materia. Incluso el
dejar reposar la suspensión, de modo que la sedimentación de los
componentes sólidos pueda realizarse por gravedad, puede
considerarse dentro del sentido de la invención. Un tipo preferido
de separación de los componentes sólidos es la centrifugación,
después de la cual se retira el sobrenadante del sedimento. El
sobrenadante, del que se han separado mediante una sedimentación los
componentes sólidos como células, microorganismos o esporas
procedentes del polvo, constituye el extracto según la
invención.
En una forma de realización preferida de la
invención, el extracto puede someterse opcionalmente a una etapa de
diálisis adicional. La diálisis puede realizarse contra el mismo
tipo de disolventes que el ya empleado para la absorción del polvo.
La diálisis se realiza preferentemente contra agua destilada. Un
límite de exclusión preferido en la diálisis es un límite de aprox.
3.000 dalton. De este modo se eliminan del extracto moléculas más
pequeñas.
Un extracto preparado según este procedimiento
se distingue cualitativamente porque, empleándose la misma cantidad
de polvo y la misma cantidad de disolventes, contiene una proporción
de proteína ostensiblemente mayor que los extractos preparados
según procedimientos de extracción usuales, y además la distribución
de proteínas (el patrón de proteínas en un gel SDS) se diferencia
de la de otros extractos. El extracto se distingue además porque
contiene saponinas en una proporción considerable.
El extracto según la invención puede utilizarse
para la profilaxis y el tratamiento de afecciones alérgicas, y en
particular como medicamento o para la preparación de un medicamento
para la profilaxis y el tratamiento de afecciones condicionadas por
una alergia tales como asma bronquial, fiebre del heno, dermatitis
atópica, alergias alimentarias, urticaria y todo tipo de alergias
de contacto. La eficacia del extracto según la invención es
ostensiblemente superior a la de los extractos preparados según
procedimientos usuales, como se muestra en los ejemplos.
La figura 1 muestra el perfil de la separación
de la composición según la invención y de tres extractos de
comparación mediante HPLC.
La figura 2 muestra la separación de la
composición según la invención y de tres extractos de comparación
mediante SDS-PAGE. El gel superior es Coomassie blue
teñido, el inferior muestra una tinción plata de la misma
separación.
La figura 3 muestra un resumen esquemático del
modelo de asma y sensibilización en el ratón de laboratorio Balb/c.
Con una separación de 14 días, los ratones recibieron 2 veces el
alérgeno (ovalbúmina grado VII) por vía intraperitoneal y a
continuación 2 veces en forma de aerosol. Paralelamente, los ratones
inhalaron en una cámara cerrada la composición según la invención
20 minutos todos los días durante 14 días. El día 39 se midió la
función respiratoria del pulmón con el pletismógrafo corporal para
ratones, el día 41 siguen los demás análisis serológicos y
citobiológicos.
La figura 4 muestra los resultados de los
estudios de síntomas de asma en los ratones. AUC significa "area
under the curve" y define la superficie bajo la curva Penh tras
una estimulación de los ratones con 6, 12, 24 y 48 mg/ml de
metacolina. Se comparan ratones que han inhalado PBS como control
negativo (PBS), LPS en una dosis equivalente a la del polvo
de establo como control negativo (LPS), la composición según
la invención (NaCl_{\text{frío}}), un extracto de agua
fría a modo de comparación (H_{2}O_{\text{fría}}), la
fase de metanol del extracto Bligh&Dyer (CHCl_{3}/MeOH)
y PBS sin sensibilización (non sens.).
La figura 5 muestra la modulación de las células
eosinófilas en el lavado broncoalveolar (LBA). Se comparan ratones
que han inhalado PBS como control negativo (PBS), LPS en una
dosis equivalente a la del polvo de establo como control negativo
(LPS), la composición según la invención
(NaCl_{\text{frío}}), un extracto de agua fría a modo de
comparación (H_{2}O_{\text{fría}}), la fase de metanol
del extracto Bligh&Dyer (CHCl_{3}/MeOH) y PBS sin
sensibilización (non sens.).
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La recogida de polvo de sedimentación se realiza
preferentemente en establos para vacas y terneros y zonas de
graneros de granjas en los Alpes llevadas de forma tradicional.
Estas están definidas por su emplazamiento en los valles alpinos
del norte de Suiza, Austria y Alemania y su particular arquitectura,
es decir la proximidad en el espacio del área destinada al establo
y el área destinada a la vivienda. Las muestras del polvo de
sedimentación se toman de las molduras de las puertas de los
graneros, de las molduras de las ventanas, de superficies elevadas
para depositar objetos, de varillajes de pastores eléctricos, de
entablados, de taburetes y de herramientas que haya en el lugar. La
altura de las superficies de recogida debería estar entre 0,5 m y
1,5 m sobre el suelo. No debe recogerse polvo mojado, ni siquiera
húmedo. Las superficies se rascan con la espátula de metal y se
tamiza a través del tamiz doméstico (caperuza portafiltro
ALK-Scherax [tamiz de separación previa] para
aspiradores) al recipiente colector de polvo para polvo de
establo.
Las muestras recogidas se guardan todas en
recipientes colectores cerrados, secas, a temperatura ambiente
(máximo 22ºC) y protegidas de la luz directa del sol.
\vskip1.000000\baselineskip
El polvo de establo se homogeneiza con una
espátula y a continuación en un mortero. A continuación se suspende
el polvo así homogeneizado en una solución acuosa de NaCl al 0,9% (a
22ºC), se disgrega mediante perlas de vidrio a aprox. 4ºC y se
agita cuidadosamente a 22ºC durante otras 6 horas. A continuación se
centrifuga, se retira el sobrenadante, se dializa contra agua y se
liofiliza. El rendimiento de extracto NaCl_{\text{frío}}
(composición según la invención) es de un 9% en peso del polvo de
establo empleado. Para la comparación se prepararon extractos de
polvo de establo con H_{2}O_{\text{fría}} (16,8% en peso),
H_{2}O_{caliente} (20,2% en peso) y CHCl_{3}/MeOH (9% en
peso).
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La composición según la invención se somete, en
comparación con los tres extractos restantes, a un análisis de
huella dactilar mediante HPLC y se caracteriza mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE) en cuanto a la presencia de proteínas
(tinción Coomassie, tinción plata) y lipoglicanos (tinción plata).
Además se cuantifican el azúcar, la proteína (contenido total) y
los ácidos grasos. Para ello se aplican métodos rutinarios
normalizados.
Los extractos se separan para la caracterización
mediante HPLC por medio de una columna Zorbax Bioseries
GF-250 (tampón de Na-fosfato 0,2 M, pH 7,0, isocrático, separación de proteínas según el tamaño, detección a 280 nm). En comparación con los demás extractos de polvo, para la composición según la invención puede reconocerse a 280 nm un perfil de separación característico, que se muestra en la figura 1.
GF-250 (tampón de Na-fosfato 0,2 M, pH 7,0, isocrático, separación de proteínas según el tamaño, detección a 280 nm). En comparación con los demás extractos de polvo, para la composición según la invención puede reconocerse a 280 nm un perfil de separación característico, que se muestra en la figura 1.
La separación de los extractos en la
SDS-PAGE (figura 2) demuestra que la composición
según la invención se diferencia tanto cualitativa como
cuantitativamente de los demás extractos. Esto se refiere tanto a
las proteínas (tinción Coomassie, imagen superior: MGW
30.000-100.000 Da) como a los lipoglicanos (tinción
plata: sustancia(s)
que cubre(n) una gran superficie en el rango MGW 20.000 y por debajo). Además, la tinción plata muestra otras bandas distinguibles que no son teñidas, o son teñidas muy débilmente, por el Coomassie (MGW aprox. 26 kDa, aprox. 14 kDa, aprox. 12 kDa y 2 bandas por debajo). Podría tratarse de proteínas y/o glucoproteínas que se tiñan muy mal con Coomassie (proteínas muy ácidas) y/o sólo se presenten en cantidades pequeñas (la tinción plata es entre 10 y 40 veces más sensible que la tinción Coomassie). En particular, el extracto según la invención contiene una cantidad ostensiblemente mayor de proteínas de pesos moleculares grandes que los extractos de comparación, estando en particular presente en todos los extractos una proteína con aprox. 20 kDa.
que cubre(n) una gran superficie en el rango MGW 20.000 y por debajo). Además, la tinción plata muestra otras bandas distinguibles que no son teñidas, o son teñidas muy débilmente, por el Coomassie (MGW aprox. 26 kDa, aprox. 14 kDa, aprox. 12 kDa y 2 bandas por debajo). Podría tratarse de proteínas y/o glucoproteínas que se tiñan muy mal con Coomassie (proteínas muy ácidas) y/o sólo se presenten en cantidades pequeñas (la tinción plata es entre 10 y 40 veces más sensible que la tinción Coomassie). En particular, el extracto según la invención contiene una cantidad ostensiblemente mayor de proteínas de pesos moleculares grandes que los extractos de comparación, estando en particular presente en todos los extractos una proteína con aprox. 20 kDa.
El contenido en proteína de la composición según
la invención es, con aprox. 140 \mug/mg, el doble mayor que las
cantidades de proteína de los demás extractos, habiéndose partido de
cantidades iniciales iguales de polvo de establo y los mismos
volúmenes en el procedimiento.
El análisis de la composición de azúcares
demostró que en ninguno de los extractos podían hallarse ácidos
urónicos ni heptosas y que todos los extractos contenían glucosamina
y galactosamina. En lo que se refiere a los azúcares neutros, en la
composición según la invención se hallan 34,6 nmoles/mg de ramnosa,
20,9 nmoles/mg de ribosa, 42,0 nmoles/mg de arabinosa, 25,6
nmoles/mg de xilosa, 70,9 nmoles/mg de manosa, 129,7 nmoles/mg de
glucosa y 124,4 nmoles/mg de galactosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Anal. = método de análisis; NZ =
azúcar neutro; US = ácidos urónicos; AZ = aminoazúcares; Rha =
ramnosa; Rib = ribosa; Ara = arabinosa; Xyl = xilosa; Man = manosa;
Glc = glucosa; Gal = galactosa;
Hep = heptosa; GlcA = ácido glucurónico; GalA = ácido galacturónico;
GlcN = glucosamina; GalN =
galactosamina
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede verse en esta tabla 1,
H_{2}O_{caliente} tiene cantidades ostensiblemente mayores de
arabinosa, xilosa, glucosa y galactosa y el extracto
CHCl_{3}/MeOH cantidades mayores de ramnosa y glucosa.
H_{2}O_{\text{fría}} no se diferencia mucho de la composición
según la invención en su composición de azúcares neutros. Estos
resultados indican que la temperatura en la extracción es
conjuntamente y en gran parte responsable de las diferencias
moleculares.
El análisis de los ácidos grasos da como
resultado para la composición según la invención un contenido en
C12:0 de 5,9 nmoles/mg, C14:0 de 30,7 nmoles/mg,
2-OH-C14:0 de 4,3 nmoles/mg,
3-OH-C14:0 de 3,2 nmoles/mg, C16:0
de 13,9 nmoles/mg, C18:0 de 5,6 nmoles/mg y C18:1 de 4,7 nmoles/mg.
En total, esto supone 68,2 nmoles/mg de ácidos grasos.
\vskip1.000000\baselineskip
Como muestra esta tabla 2, la composición según
la invención presenta un contenido ostensiblemente mayor de C14:0 y
C16:0 que los demás extractos acuosos. Estos resultados demuestran
que, además de la temperatura, también la adición de NaCl lleva a
la extracción de diferentes moléculas del polvo de establo.
\vskip1.000000\baselineskip
La potencia protectora total de la composición
según la invención se determina in vivo mediante estudios
funcionales inmunológicos y citobiológicos en el modelo animal
normalizado del ratón.
A continuación se describen en primer lugar los
métodos para la sensibilización y la inducción de asma alérgica en
ratones con ovalbúmina, el tratamiento con extractos de polvo de
establo y el análisis de las reacciones alérgicas e
inflamatorias.
Sensibilización e inducción de asma alérgica
en ratones con ovalbúmina (OVA) - Para la sensibilización de
ratones contra el alérgeno modelo ovalbúmina se utiliza hidróxido de
aluminio (Pierce) como adyuvante. De este adyuvante se sabe que
provoca respuestas inmunitarias caracterizadas por la producción de
citocinas como IL-4, IL-5 e
IL-13 y por la producción de anticuerpos del isotipo
IgE e IgG1 (el isotipo correspondiente en los humanos es IgG4).
La sensibilización de ratones de siete semanas
de edad de la cepa de ratones consanguíneos Balb/c se realiza
mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 20 \mug de
ovalbúmina (grado V de la firma Sigma) y 2,2 mg de hidróxido de
aluminio en un volumen total de 200 \mul de tampón (PBS). En
total, la inyección se realiza dos veces: el día 0 y el día 14.
Para provocar a continuación una reacción
alérgica en el pulmón de los ratones, o sea para provocar el asma
alérgica aguda, los ratones se tratan el día 28 y el día 38
respectivamente durante 20 minutos con aerosol de ovalbúmina. Para
ello se colocan los ratones en una cámara de plexiglás de 11 litros
de capacidad. A la cámara se conecta un inhalador de la firma Pari,
que se carga previamente con una solución de ovalbúmina al 1% y se
acciona con un Pari-Boy-Turbo
Aerosol Generator. Tras la segunda administración de aerosol de OVA
pueden diagnosticarse en los ratones durante algunos días síntomas
del asma alérgica aguda. Entre los síntomas se incluyen:
- 1)
- la reacción intensificada contra metacolina, la hiperreactividad bronquial
- 2)
- la infiltración intensificada de granulocitos eosinófilos y linfocitos en la luz de las vías respiratorias
- 3)
- la producción de anticuerpos específicos de la ovalbúmina de los isotipos IgE e IgG1
- 4)
- la producción de interleucina-5 tras la reestimulación in vitro de linfocitos con ovalbúmina
A continuación se explican más detalladamente
los métodos para la medición de los distintos parámetros.
Medición de la hiperreactividad bronquial
- Un parámetro de diagnóstico decisivo, que se mide en los humanos,
para diagnosticar con seguridad una afección asmática alérgica es la
hiperreactividad bronquial. Se trata de una hipersensibilidad de la
musculatura lisa de los bronquios a estímulos inespecíficos. Para el
diagnóstico en los humanos se administran pequeñas concentraciones
de histamina y a continuación se mide la resistencia de las vías
respiratorias en un pletismógrafo. Las personas asmáticas muestran
una mayor broncoconstricción dependiente de la concentración de
histamina y por lo tanto una mayor resistencia de las vías
respiratorias que las personas sanas.
La medición en los ratones se realiza de forma
muy similar. Para la medición se colocan los ratones en un
pletismógrafo de la firma Buxco, en las cámaras previstas con este
fin. A través de las cámaras fluye una corriente de aire continua y
un comprobador de presión de alta sensibilidad registra breves
variaciones de la presión en la cámara. La inspiración de los
ratones produce una presión negativa y la espiración una
sobrepresión en la cámara. Estas variaciones de presión se
registran de forma continua en función del tiempo y el software
calcula a partir de los valores medidos para cada ciclo respiratorio
el, así llamado, valor Penh. La fórmula mediante la cual se calcula
el valor Penh se desprende de la figura 5. Este valor adimensional
presenta una correlación con la resistencia de las vías
respiratorias. En los ratones hiperreactivos, la resistencia de las
vías respiratorias aumenta en función de la concentración de
metacolina (en los ratones se utiliza para la provocación
metacolina en lugar de histamina, ya que los bronquios de los
ratones no reaccionan a la histamina), lo que se expresa con el
aumento del valor Penh.
La medición de la hiperreactividad bronquial se
realiza 24 horas después de la última exposición a aerosol de OVA.
Para medir la hiperreactividad bronquial, los ratones, tras un
tiempo de habituación de 10 minutos, se ponen en el pletismógrafo
durante 7 minutos en contacto con aerosol de PBS, registrándose al
mismo tiempo el valor Penh. A continuación se exponen durante en
cada caso 7 minutos a concentraciones crecientes de metacolina: 6,
12, 25, 50 mg/ml. Durante cada exposición se mide el valor Penh de
forma continua y se saca la media en períodos de 30 segundos. A
continuación se traza el período en que se alcanza el valor Penh
máximo para una determinada concentración de metacolina, en función
de la concentración de metacolina. De ello resulta una curva
dosis-efecto cuya área bajo la curva es tanto mayor
cuanto más intensamente reaccionan los ratones a la metacolina. El
área bajo la curva presenta por lo tanto una correlación con la
hiperreactividad de los animales y se utiliza para la evaluación
estadística.
Estudio de la composición celular del lavado
broncoalveolar (BAL) - En probandos sanos o ratones no tratados
se observaron sólo unos pocos granulocitos eosinófilos, o incluso
ninguno, en el tejido pulmonar y en la luz de las vías
respiratorias. Los leucocitos hallados en vías respiratorias sanas
son principalmente macrófagos. En conexión con el asma alérgica se
produce, por causas que aún no están totalmente claras, una
infiltración masiva de las vías respiratorias por granulocitos
eosinófilos y en menor medida también linfocitos.
Para estudiar la composición del infiltrado de
leucocitos en las vías respiratorias de ratones se da muerte a los
mismos tres días después de la última exposición a aerosol de OVA.
Se descubre la tráquea y se inserta en la misma una cánula venosa
permanente 24G. A través de ésta se lava la luz de las vías
respiratorias dos veces con 1 ml de tampón isotónico cada vez
(lavado broncoalveolar). El número total de células extraídas del
pulmón con este método se cuenta por microscopio mediante una cámara
de recuento de Neubauer. Acto seguido se centrifugan los leucocitos
del BAL sobre portaobjetos con una citocentrífuga de la firma
Shandon. La tinción de las células se realiza a continuación con el
kit de tinción rápida HAEME de la firma Labor + Technik Eberhard
Lehmann como se describe en los anexos al producto. Una vez
realizada la tinción se cuentan por microscopio 300 células sobre
el portaobjetos, que se clasifican en las distintas subpoblaciones
leucocitarias según los criterios de uso corriente. A continuación
puede calcularse la composición porcentual del BAL.
Medición de anticuerpos específicos de OVA
del isotipo IgE e IgG1 - La sensibilización contra un alérgeno
puede medirse determinando los anticuerpos específicos del alérgeno
de las clases IgG1 e IgE. La cuantificación de los anticuerpos
específicos del alérgeno en el suero de ratones se realiza mediante
un ELISA indirecto. Para ello se extrae sangre de la vena de la
cola de los ratones dos días después de la última administración de
aerosol de OVA. Tras la coagulación de la sangre se obtiene por
centrifugación el suero, que se emplea en el ELISA:
- -
- revestir placas con 5 \mug/ml de OVA en tampón de revestimiento, 100 \mul por pocillo (noche)
- -
- lavar 3 veces, con 250 \mul por pocillo cada vez
- -
- revestir de nuevo con BSA al 1% en tampón de lavado, 250 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar diluciones de suero en tampón de lavado 1/3 1/10 y 1/30, 100 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar anticuerpos anti-IgE biotinilados (Pharmingen, R35-72) diluidos 1/100 en tampón de lavado, 100 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar Extravidin-POD (Sigma) diluida 1/1.000 en tampón de lavado, 100 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar solución de sustrato TMB, 100 \mul por pocillo, 30 minutos
- -
- interrumpir la reacción con 50 \mul de ácido sulfúrico 1 M por pocillo, la placa puede medirse con una longitud de onda de 450 nm
- -
- revestir placas con 5 \mug/ml de OVA en tampón de revestimiento, 100 \mul por pocillo (noche)
- -
- lavar 3 veces, con 250 \mul por pocillo cada vez
- -
- revestir de nuevo con MMP al 5% en tampón de lavado, 250 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar diluciones de suero en tampón de dilución 1/100 1/300 1/1.000 y 1/3.000, 100 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar anticuerpos anti-IgG1 conjugados con AKP (Pharmingen, X56) diluidos 1/1000 en tampón de dilución, 100 \mul por pocillo, 1 hora
- -
- lavar 3 veces
- -
- aplicar solución de sustrato pNPP, 100 \mul por pocillo, 30 minutos
- -
- interrumpir la reacción con 50 \mul de sosa cáustica 1 M por pocillo, la placa puede medirse con una longitud de onda de 405 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
En cada placa ELISA se lleva conjuntamente una
serie de dilución de un suero estándar. En este suero estándar hay
una concentración conocida de anticuerpos específicos de OVA del
isotipo IgG1 e IgE. Comparando los valores de medición del suero de
ratón que presenta una concentración desconocida de IgG1 e IgE
específicos de OVA con la serie de medición del suero de ratón
conocido, puede calcularse la concentración en la muestra
desconocida.
Para el tratamiento de ratones con los distintos
extractos de polvo de establo se colocan éstos en una cámara de
plexiglás de 11 litros de capacidad. La cámara se conecta a un
Pari-Boy Aerosol-Generator como se
describió anteriormente, en el párrafo "Sensibilización e
inducción de asma alérgica en ratones con ovalbúmina (OVA)",
cargándose el inhalador previamente con una solución al 1% de
extractos de polvo de establo. A continuación se tratan los ratones
durante 20 minutos con el aerosol de extracto de polvo de establo.
Los tratamientos se realizan en total 14 veces, en los momentos de
las sensibilizaciones especificados en la figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntomas de asma - El ensayo más extenso
para la comprobación del efecto biológico de la composición según
la invención es el estudio de los síntomas de asma provocados por
alergia en los ratones. La figura 4 muestra que la sensibilidad de
las vías respiratorias en los ratones asmáticos puede reducirse
mediante el tratamiento con el extracto según la invención al nivel
de los ratones sin asma no tratados. Para excluir la posibilidad de
que el efecto biológico de la composición según la invención esté
condicionado por el LPS, se empleó como control LPS puro en una
concentración igual a la medida en los extractos de polvo de
establo. El LPS no es capaz de reducir los síntomas de asma de los
ratones. Por consiguiente, es de suponer que son otras las
sustancias del polvo responsables del efecto biológico observado.
El CHCl_{3}/MeOH es el método de extracción clásico para, tras la
separación de fases, extraer los lípidos en la fase de cloroformo y
otras moléculas con propiedades lipofílicas más débiles en la fase
de metanol. El extracto en metanol (denominado aquí CHCl_{3}/MeOH)
no tiene ninguna influencia preventiva en los síntomas de asma de
los ratones. El polvo de establo extraído en
H_{2}O_{\text{fría}} produce una reducción parcial de los
síntomas, que sin embargo no es tan eficaz como el efecto de la
composición según la invención.
Inflamación en los bronquios - En los
ratones con asma, las células eosinófilas de los bronquios reflejan
el estado de una inflamación asmática. La figura 5 prueba que,
mediante el tratamiento de los ratones con la composición según la
invención, las células eosinófilas, que en los ratones enfermos se
presentan en una cantidad muy elevada, y no encontradas en un caso
normal, se reducen fuertemente en número y sólo se encuentran ya
en cantidades de poca importancia. Igual que en el caso de los
síntomas asmáticos, en los ratones tratados con tampón y LPS no se
observa ninguna variación, el CHCl_{3}/MeOH tiene una pequeña
influencia, el extracto de H_{2}O_{\text{fría}} no llega a
alcanzar el efecto de la composición según la invención.
Sensibilización alérgica - Los síntomas
de asma se provocan en los ratones mediante una sensibilización con
un alérgeno. Por este motivo se investigó si la composición según la
invención influye en los anticuerpos IgE contra el alérgeno
creciente durante la sensibilización. La tabla documenta que los
anticuerpos IgE dirigidos contra la ovalbúmina disminuyen
estadísticamente de forma significativa en comparación con los
ratones no tratados únicamente si se aplica la composición según la
invención, mientras que en los demás controles no disminuyen o al
menos su disminución no es significativa. El aumento de los
anticuerpos IgG1 en la sensibilización con ovalbúmina no presenta
ninguna correlación con los síntomas de asma, pero refleja una
reacción de los linfocitos T de tipo cooperador-2
(Th2), cuyo aumento se observa en las alergias. En la tabla puede
verse que tanto la composición según la invención como los otros
dos extractos de polvo son capaces de reducir la respuesta Th2 del
sistema inmunitario, pero no así el LPS. Por lo tanto, la respuesta
Th2 del sistema inmunitario no es un marcador preciso del efecto
biológico particular de la composición según la invención. Además,
las sustancias activas que actúan en la composición según la
invención parecen estar contenidas también parcialmente en los
demás extractos, excepto en la solución de LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citada por el
solicitante lo es solamente para utilidad del lector, no formando
parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las
referencias han sido cuidadosamente recopiladas, no pueden
excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad
a este respecto.
- \bullet WO 0149319 A [0006]
- \bullet WO 9600579 A [0009]
Claims (7)
1. Procedimiento para la preparación de un
extracto de antialérgico a utilizar como medicamento,
caracterizado porque el extracto se prepara en las etapas
siguientes:
- a)
- recogida de polvo de establo seco,
- b)
- eventualmente homogeneización del polvo,
- c)
- suspensión del polvo, eventualmente homogeneizado, en agua o en una solución tampón acuosa que contenga sales mono o bivalentes, elegidas entre NaCl, Na_{2}SO_{4}, KCl, LiCl, MgCl_{2} y CaCl_{2}, preferentemente una solución de NaCl al 0,9%, a temperatura ambiente o inferior,
- d)
- eventualmente disgregación de los componentes del polvo,
- e)
- sedimentación de los componentes sólidos de la suspensión y retirada del sobrenadante acuoso, constituyendo el sobrenadante tras la sedimentación el extracto,
- f)
- eventualmente diálisis del sobrenadante acuoso
donde durante todo el proceso de
preparación no se realiza ninguna aportación de
calor.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el extracto se prepara a partir de polvo
de establo de granjas.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el extracto se
prepara en las etapas siguientes:
- a)
- recogida de polvo de establo seco,
- b)
- homogeneización del polvo,
- c)
- suspensión del polvo homogeneizado en una solución acuosa de NaCl al 0,9%, a temperatura ambiente o inferior,
- d)
- eventualmente disgregación de los componentes del polvo,
- e)
- sedimentación de los componentes sólidos de la suspensión,
- f)
- retirada del sobrenadante y diálisis del sobrenadante acuoso.
4. Extracto, preparado de acuerdo con un
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Extracto según la reivindicación 4,
caracterizado porque contiene saponina y/o lipoglicanos.
6. Medicamento en forma de extracto según la
reivindicación 4 ó 5.
7. Extracto según una de las reivindicaciones 4
a 6 como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de
afecciones alérgicas, en particular de asma bronquial, fiebre del
heno, dermatitis atópica, alergias alimenticias, urticaria o
alergias de contacto.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| ES04022275T Expired - Lifetime ES2316909T3 (es) | 2004-09-18 | 2004-09-18 | Extracto de polvo de establo para proteccion contra alergias. |
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