ES2317163T3 - Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreduccion. - Google Patents
Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreduccion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2317163T3 ES2317163T3 ES05254051T ES05254051T ES2317163T3 ES 2317163 T3 ES2317163 T3 ES 2317163T3 ES 05254051 T ES05254051 T ES 05254051T ES 05254051 T ES05254051 T ES 05254051T ES 2317163 T3 ES2317163 T3 ES 2317163T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- enzyme
- redox
- reagent
- sample
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
- G01N33/521—Single-layer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Un procedimiento para caracterizar una enzima de un sistema reactivo redox que comprende: (a)aplicar una muestra que comprende una primera enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima a una célula electroquímica que comprende una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de dicho sistema reactivo redox y (b)detectar una señal eléctrica producida por dicha célula.
Description
Procedimiento y composiciones para caracterizar
una enzima de un sistema reactivo de oxidoreducción.
La detección de analitos en fluidos o muestras
fisiológicos, por ejemplo, sangre o productos derivados de la
sangre, es de importancia siempre creciente en la sociedad de hoy en
día. Los ensayos de detección de analitos encuentran su utilización
en una variedad de aplicaciones, incluyendo pruebas en un
laboratorio clínico, pruebas domiciliarias, etc., donde los
resultados de dichas pruebas desempeñan un papel prominente en la
diagnosis y gestión de una variedad de afecciones. Los analitos de
interés incluyen la glucosa para la gestión de la diabetes, el
colesterol, y similares. Como respuesta a esta importancia creciente
de la detección de analitos, se han desarrollado una variedad de
protocolos y dispositivos de detección de analitos tanto para un uso
clínico como domiciliario.
Un tipo de procedimiento que se emplea para la
detección de analitos es un procedimiento electroquímico. En dichos
procedimientos, se coloca una muestra de líquido acuoso en una zona
de reacción en una célula electroquímica que comprende al menos dos
electrodos, a saber, un electrodo de referencia y otro de trabajo.
Se permite que el componente que ha de ser analizado reaccione
directamente con un electrodo, o directamente o indirectamente con
un reactivo redox para formar una sustancia susceptible de ser
oxidada (o susceptible de reducción) en una cantidad
correspondiente a la concentración del componente que ha de ser
analizado, o sea, el analito. Luego se estima la cantidad de la
sustancia susceptible de ser oxidada (o susceptible de reducción)
presente de manera electroquímica y relacionada con la cantidad de
analito presente en la muestra inicial.
En muchos de dichos enfoques electroquímicos a
la detección de analitos, se emplea un sistema de producción de
señal de oxidación de analitos que comprende un componente de enzima
y un componente mediador, en el que el componente de enzima oxida
el analito de interés y luego transfiere un electrón a un mediador
que, a su vez, transfiere el electrón a un electrodo en la célula
electroquímica, generando de ese modo una señal eléctrica de la que
se puede determinar la concentración de analito.
Al diseñar los ensayos y sistemas
electroquímicos de detección de analitos, es deseable emplear una
enzima específica para analitos. Por ejemplo, para la determinación
de glucosa, la forma soluble de la glucosa dehidrogenasa (en lo
sucesivo llamada s-GDH) dependiente de la quinona de
pirroloquinolina (PQQ) es una enzima que puede ser empleada en un
sistema de producción de señal de oxidación de glucosa. La
s-GDH es un aceptor pobre de electrones y es, por
lo tanto, insensible de manera beneficiosa a la presencia de oxígeno
en las muestras de fluido.
Sin embargo, una desventaja de la
s-GDH que se da de forma natural o de "tipo
salvaje" es que oxida no solo la glucosa, sino también otros
azúcares reductores incluyendo la maltosa, la galactosa, la lactosa,
la manosa, la xilosa, y la ribosa. La reactividad de la
s-GDH hacia los azúcares distintos de la glucosa
puede, en algunos casos, afectar a la precisión de la determinación
de los niveles de glucosa en sangre en algunos pacientes
diabéticos. Por ejemplo, los pacientes sometidos a diálisis
peritoneal tratados con icodextrina (un polímero de glucosa) pueden
contener niveles altos de maltosa en su sangre.
Esta falta de especificidad de la
s-GDH ha llevado a un esfuerzo para mejorar la
especificidad de la s-GDH al generar formas
"mutantes" de la enzima, por ejemplo, donde se han llevado a
cabo una o más sustituciones de aminoácido. Sin embargo, antes de
que puedan ser empleadas dichas enzimas "alteradas", deben ser
probadas para determinar su idoneidad para ser usadas en ensayos de
detección de analitos.
Aunque requieren mucho tiempo, han sido
utilizados ensayos espectrofotométricos para determinar la actividad
de la s-GDH, pero solo son utilizados en
condiciones limitantes de las enzimas. En la patente U.S. 6.103.509
y en la solicitud de patente europea nº EP 1 176 202 A1 se describe
un ensayo espectrofotométrico que utiliza
2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) y metosulfato de
fenacina (PMS) como mediadores artificiales.
Sin embargo, las típicas tiras reactivas
comerciales de glucosa que utilizan s-GDH no
utilizan condiciones limitantes de enzimas porque la enzima está
presente en exceso para garantizar un rendimiento a largo plazo de
la tira. Las proteínas recombinantes, por ejemplo, las formas
mutantes de s-GDH, únicamente se producen
normalmente en pequeñas cantidades. Probar la reactividad de estas
formas mutantes de s-GDH implica hacer tiras
revestidas con enzimas y probar cada lote de tiras con sangre total
o plasma enriquecido con glucosa y cada azúcar posible interferente
(o sea, reductor) en múltiples concentraciones. La producción de
tiras reactivas revestidas con cada forma mutante de
s-GDH requiere grandes cantidades de cada mutante,
exige mucho tiempo y mucho trabajo y requiere que los técnicos
prueben las tiras con sangre o plasma humano, posibles riesgos
biológicos.
En consecuencia, se necesita un ensayo rápido y
barato que sea limitante de sustratos para determinar si la
producción en masa de una enzima mutante en particular, por ejemplo,
la s-GDH, está justificada debido a su
especificidad mejorada de la glucosa sobre la s-GDH
de tipo salvaje. Este ensayo también debería ser aplicable a
muestras que no contengan sangre enriquecida con glucosa o azúcares
interferentes más que a muestras de sangre total o plasma
enriquecido con azúcares reductores. Por lo tanto, aún se necesita
en el campo un procedimiento que sea rápido y sencillo de utilizar
para determinar la especificidad hacia los carbohidratos de las
formas mutantes de s-GDH que utilizan pequeñas
cantidades de enzima y que modele condiciones limitantes de
sustratos en una tira reactiva típica basada en electroquímica para
medir un analito (por ejemplo, glucosa) en una muestra de fluido
(por ejemplo, sangre total o plasma). Además, también se desea un
procedimiento rápido y sencillo para medir la actividad de la
enzima.
Los documentos de patentes U.S.: 5.484.708;
5.723.284; 5.834.224; 5.942.102; 5.912.199; 5.997.817; 6.059.946;
6.083.710; 6.103.509; 6.121.009; 6.134.461; 6.179.979; 6.193.973;
6.231.531; 6.284.125; 6.340.428; 6.444.115 y 6.716.577; al igual
que otros documentos de patentes: US 2003/0104595; WO 99/49307; WO
97/18465; WO 01/57510; WO 01/57238; WO 02/48707; WO 02/50609; WO
02/06788; EP0969097; EP1176202; JP091403378A; y GB 2 304 628.
Se proporcionan los procedimientos y
composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo
redox. Al poner en práctica los presentes procedimientos, se aplica
una muestra que incluye una enzima de un sistema reactivo redox y
una cantidad conocida de sustrato a una célula electroquímica que
incluye una composición de reactivo libre de enzimas que tiene un
mediador de sistema reactivo redox. También se proporcionan las
tiras reactivas electroquímicas que incluyen las presentes células
electroquímicas, y los sistemas y kits que incluyen las
mismas. La presente invención encuentra un uso en una variedad de
distintas aplicaciones, incluyendo aplicaciones de caracterización
de sistema reactivo redox.
Se obtendrá una mejor comprensión de las
características y ventajas de la presente invención al hacer
referencia a la siguiente descripción detallada que expone
realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios
de la invención, y los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 es un diagrama de flujo que ilustra
una secuencia de pasos en un proceso conforme a una realización
ejemplar de la presente invención para probar formas mutantes de
s-GDH;
las Figuras 2A y 2B son vistas despiezada y
superior, respectivamente, de una tira reactiva como puede ser
utilizada en los procesos ejemplares conforme a la presente
invención;
la Fig. 3 es un diagrama de flujo que ilustra
una secuencia de pasos en un proceso conforme a una realización
ejemplar de la presente invención para medir la actividad de
s-GDH de tipo salvaje y mutantes de la misma;
la Fig. 4 es un gráfico que muestra la tendencia
absoluta de la s-GDH de tipo salvaje y dos formas
mutantes de s-GDH (Asn452Thr y Asp167Glu) a un
control que no contiene ningún azúcar interferente como una función
de la concentración de xilosa que utiliza una tira reactiva
convencional revestida con enzimas;
la Fig. 5 es un gráfico que muestra la respuesta
como una función de la concentración de azúcar para una tira
reactiva convencional revestida con enzimas en las que la enzima es
s-GDH de tipo salvaje;
la Fig. 6 es un gráfico que muestra la respuesta
como una función de la concentración de azúcar utilizando
s-GDH de tipo salvaje en un proceso conforme a la
presente invención;
la Fig. 7 es un gráfico que muestra la respuesta
como una función de la concentración de azúcar utilizando una forma
mutante de s-GDH, Asn452Thr, en un proceso conforme
a la presente invención;
la Fig. 8 es un gráfico que muestra la respuesta
como una función de la concentración de azúcar utilizando una forma
mutante de s-GDH, Asp167Glu, en un proceso conforme
a la presente invención;
la Fig. 9 es un gráfico que muestra una curva
estándar para s-GDH de tipo salvaje obtenido en un
proceso conforme a la presente invención;
la Fig. 10 es un gráfico que muestra la curva
estándar ilustrada en la Fig. 9 como un trazado de doble
recíproco.
Se proporcionan los procedimientos y
composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo
redox. Al poner en práctica los presentes procedimientos, se aplica
una muestra que incluye una enzima de un sistema reactivo redox y
una cantidad conocida de sustrato a una célula electroquímica que
incluye una composición de reactivo libre de enzimas que tiene un
mediador de sistema reactivo redox. También se proporcionan tiras
reactivas electroquímicas que incluyen las presentes células
electroquímicas, y los sistemas y kits que incluyen las
mismas. La presente invención encuentra su uso en una variedad de
distintas aplicaciones, incluyendo aplicaciones de caracterización
de sistema reactivo redox.
El alcance de la presente invención será
establecido por las reivindicaciones adjuntas.
En esta especificación y en las reivindicaciones
adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y
"la" incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto
indique claramente lo contrario. A no ser que se defina de otra
manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el
presente documento tienen el mismo significado que entiende
normalmente una persona de de dominio normal de la técnica a la que
pertenece esta invención.
Donde se proporciona un rango de valores, se
comprende que cada valor que interviene, a la décima de la unidad
del límite inferior a no ser que el contexto dicte claramente lo
contrario, entre el límite superior e inferior de ese rango, y
cualquier otro valor declarado o que interviene en ese rango, está
incluido en la invención. Los límites superior e inferior de estos
rangos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en
los rangos más pequeños, y están también incluidos en la invención,
sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el rango
declarado. Donde el rango declarado incluye uno de los límites, o
ambos, los rangos excluyen a cualquiera de esos límites incluidos,
o ambos, y también están incluidos en la invención.
A no ser que se definan de otra forma, los
términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento
tienen el mismo significado que puede entender una persona de
dominio normal de la técnica a la que pertenece esta invención.
Aunque esta invención se puede utilizar en la práctica o probar con
cualquier procedimiento, dispositivo y material similares o
equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen
ahora los procedimientos, los dispositivos y los materiales
preferidos.
Todas las publicaciones mencionadas en el
presente documento están incorporadas aquí por referencia con el
propósito de describir y revelar las líneas, los vectores y las
metodologías de las células, que están descritos en las
publicaciones, que pueden ser utilizadas en conexión con la
invención descrita ahora.
Como se ha resumido anteriormente, la presente
invención proporciona procedimientos y composiciones para
caracterizar una enzima. Al describir adicionalmente la presente
invención, se reseñan primero los presentes procedimientos y las
aplicaciones específicas representativas de la misma con mayor
detalle, seguidos de un repaso de las composiciones y sistemas
representativos que encuentran su uso al poner en práctica los
presentes procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha resumido anteriormente, la presente
invención proporciona procedimientos para caracterizar una enzima.
Con caracterizar una enzima se quiere decir determinar una
característica o un parámetro de la enzima. La característica puede
ser una característica que es inherente a la enzima, por ejemplo, su
selectividad de sustrato, o una característica que, al menos en
parte, depende de su entorno, como la concentración de la enzima en
un medio fluido dado, la actividad de una enzima en un medio fluido
dado, etc. Por supuesto, la característica puede ser un producto
tanto de factores inherentes como del entorno. Las características
representativas específicas que pueden ser determinadas utilizando
los procedimientos de la presente invención están descritas con
mayor detalle a continuación.
Los procedimientos incluyen aplicar una enzima
de sistema reactivo redox que contiene una muestra a una célula
electroquímica y detectar una señal eléctrica generada por la
célula, en la que la señal detectada es empleada luego para
caracterizar la enzima de sistema reactivo redox en la muestra.
Una característica de ciertas realizaciones
representativas es que la muestra que entra en contacto con la
célula electroquímica incluye una enzima de un sistema reactivo
redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima, mientras
que la célula electroquímica a la que se aplica la muestra incluye
una composición de reactivo libre de enzimas que incluye un
componente mediador del sistema reactivo redox del que es un miembro
la enzima de la muestra. Se describirán ahora la muestra y los
componentes de la célula electroquímica empleados en estas
realizaciones de los presentes procedimientos por separado con mayor
detalle.
La muestra que está en contacto con la célula
electroquímica al poner en práctica los presentes procedimientos es
una que incluye una enzima de un sistema reactivo redox y una
cantidad conocida de un sustrato o al menos un sustrato potencial
para la enzima, o sea, un sustrato de enzima.
El componente de enzima de la muestra, en muchas
realizaciones, es una enzima o una pluralidad de enzimas que
trabajan en concierto para oxidar un analito de interés. En otras
palabras, el miembro de enzima puede estar formado de una única
enzima oxidante de analito o una colección de dos o más enzimas que
trabajan en concierto para oxidar un analito dado de interés,
permitiendo la generación de una señal electroquímica en una célula
electroquímica, como se describe a continuación. Las enzimas de
interés incluyen oxidasas, dehidrogenasas, lipasas, quinasas,
diaforasas, quinoproteínas y similares. Las enzimas representativas
más específicas de interés incluyen, sin estar limitadas por ellas:
glucosa oxidasa, glucosa dehidrogenasa, colesterol esterasa,
colesterol oxidasa, lipoproteína lipasa, glicerol quinasa,
glicerol-3-fosfato oxidasa, lactato
oxidasa, lactato dehidrogenasa, piruvato oxidasa, alcohol oxidasa,
bilirrubina oxidasa, uricasa y similares. En ciertas realizaciones
de interés, la enzima es una glucosa dehidrogenasa, tal como una
s-GDH o un mutante de la misma, como se describe con
mayor detalle a continuación.
En ciertas realizaciones, el componente de
enzima puede estar presente en una concentración que varía entre
aproximadamente 35 hasta aproximadamente 450, normalmente desde
aproximadamente 80 hasta aproximadamente 270 \muM.
La muestra empleada en los presentes
procedimientos también incluye una cantidad conocida de un sustrato
de enzima. El sustrato de enzima puede ser un sustrato conocido
para la enzima presente en la muestra o un sustrato candidato para
la enzima presente en la muestra. Por ejemplo, donde la enzima es
una glucosa dehidrogenasa, el sustrato en la muestra puede ser
glucosa (que se sabe que es un sustrato para la enzima) u otro
azúcar, por ejemplo, la maltosa, que se sabe que también es un
sustrato para la enzima o bien se sospecha que es un sustrato para
la enzima. Por cantidad conocida se quiere decir que la muestra
tiene una cantidad o concentración definida o predeterminada de
sustrato. En ciertas realizaciones, la concentración del sustrato de
la enzima en la muestra varía desde aproximadamente 0 hasta
aproximadamente 50 mM (aproximadamente 0 hasta aproximadamente 900
mg/dL), normalmente desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 45
mM (aproximadamente 0 hasta aproximadamente 810 mg/dL). En ciertas
realizaciones cuando el sustrato de enzima está definidamente
presente, la concentración del sustrato de enzima en la muestra
varía desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 50 mM (por
ejemplo, desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 900
mg/dL), normalmente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente
45 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente
810 mg/dL).
En ciertas realizaciones, la muestra de medio
fluido también incluye una coenzima, que activa el componente de
enzima. Un ejemplo de una coenzima de interés es la quinona de
pirroloquinolina (PQQ). Otros cofactores de interés incluyen, sin
estar limitadas por ellos: dinucleótido de nicotinamida adenina
(NAD), dinucleótido de flavina adenina (FAD), citocromo, y
similares, dependiendo del tipo de enzima aplicada al reactivo de
prueba. En ciertas realizaciones, la concentración de cualquier
coenzima puede variar desde aproximadamente 60 hasta
aproximadamente 670 \muM, normalmente desde aproximadamente 100
hasta aproximadamente 430 \muM.
En ciertas realizaciones, las muestras incluyen
además uno o más cofactores de enzima. Los cofactores de enzima de
interés incluyen cationes metálicos divalentes, por ejemplo,
Ca^{2+}, Mg^{2+}, etc. La concentración de cualquier cofactor
puede variar desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5
mM.
Como se ha resumido anteriormente, al poner en
práctica los presentes procedimientos la muestra se aplica a una
célula electroquímica que incluye una composición de reactivo libre
de enzimas. Se conocen una variedad de distintos tipos de
configuración de célula electroquímica, incluyendo aquellas
descritas en los documentos de patentes U.S.: 5.723.284; 5.834.224;
5.942.102; 5.972.199; 5.997.817; 6.083.710; 6.121.009; 6.134.461;
6.193.873; y 6.716.577; al igual que en otros documentos de
patentes: WO 99/49307; WO 97/18465; WO 01/57510; WO 01/57238; WO
02/48707; WO 02/50609; EP 0 969 097A2 y GB 2 304 628. Cualquiera de
estas u otras células electroquímicas conocidas a los expertos en
la técnica pueden ser modificadas para incorporar las presentes
composiciones.
La célula electroquímica de la presente
invención está presente en una tira reactiva electroquímica. En las
Figuras 2A y 2B se proporciona una representación de la tira
reactiva electroquímica conforme a la presente invención. La Figura
2A proporciona una vista ampliada de la tira reactiva electroquímica
que está formada por un electrodo de trabajo y un electrodo de
referencia separados por una capa separadora que tiene un sección
vaciada que define la zona o área de reacción en la tira montada, en
la que estos elementos están descritos adicionalmente a
continuación. La Figura 2B muestra la misma tira reactiva de forma
montada. Cada uno de los diversos componentes serán descritos ahora
con mayor detalle a continuación.
Las presentes tiras reactivas electroquímicas
que comprenden las composiciones de reactivo incluyen un electrodo
de trabajo y un electrodo de referencia. Normalmente, los electrodos
de trabajo y de referencia están configurados en forma de tiras
rectangulares alargadas. Típicamente, la longitud de los electrodos
varía desde aproximadamente 1,9 hasta aproximadamente 4,5 cm,
normalmente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 2,8 cm. La
anchura de los electrodos varía desde aproximadamente 0,38 hasta
aproximadamente 0,76 cm, normalmente desde aproximadamente 0,51
hasta aproximadamente 0,67 cm. Los electrodos de referencia tienen
típicamente un grosor que varía desde aproximadamente 10 hasta 100
nm y normalmente desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 22
nm. En ciertas realizaciones, la longitud de uno de los electrodos
es menor que la longitud del otro electrodo, en las que en ciertas
realizaciones es aproximadamente 0,32 cm más corto.
Los electrodos de trabajo y de referencia están
caracterizados además porque al menos la superficie de los
electrodos que da a la zona de reacción en la tira es de un material
conductor, por ejemplo, un metal u otro material conductor, en la
que los materiales representativos de interés incluyen, sin estar
limitadas por ellos: paladio, oro, platino, plata, iridio, carbono,
impurezas de óxido de estaño, acero inoxidable y similares. En
ciertas realizaciones, el material conductor es oro o paladio.
Aunque en principio el electrodo completo puede estar hecho del
material conductor, cada uno de los electrodos está formado
normalmente de un material de soporte inerte en cuya superficie hay
presente una capa fina del componente de material conductor del
electrodo. Se puede emplear cualquier material de soporte inerte
conveniente en los presentes electrodos, en los que normalmente el
material es un material rígido que es capaz de proporcionar un
soporte estructural al electrodo y, sucesivamente, a la tira
reactiva electroquímica en su conjunto. Los materiales adecuados que
se pueden emplear sustrato de soporte incluyen plásticos, por
ejemplo PET, PETG, poliimida, policarbonato, poliestireno, silicio,
cerámica, vidrio y similares.
Una característica de las presentes tiras
reactivas electroquímicas es que los electrodos de trabajo y de
referencia como se han descrito anteriormente están frente por
frente y están separados solo por una pequeña distancia, de forma
que la distancia entre el electrodo de trabajo y el de referencia en
la zona o área de reacción de la tira reactiva electroquímica es
extremadamente pequeña. Esta separación mínima de los electrodos de
trabajo y de referencia en las presentes tiras reactivas es un
resultado de la presencia de una capa separadora fina colocada o
interpuesta entre los electrodos de trabajo y de referencia. El
grosor de esta capa separadora varía normalmente desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 \mum, normalmente
desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 \mum. La capa
separadora está cortada de forma que se proporciona una zona o área
de reacción con al menos un puerto de entrada hasta dentro de la
zona de reacción, y normalmente también un puerto de salida fuera
de la zona de reacción. En las Figuras 2A y 2B se puede ver una
configuración representativa de una capa separadora. Aunque la capa
separadora está mostrada en estas figuras como que tiene una corte
circular de área de reacción con respiraderos o puertos de entrada y
salida laterales, son posibles otras configuraciones, por ejemplo,
áreas de reacción con forma cuadrada, oval, triangular, rectangular,
irregular, etc. La capa separadora puede estar fabricada de
cualquier material conveniente, en la que los materiales adecuados
representativos incluyen PET, PETG, poliimida, policarbonato y
similares, en la que las superficies de la capa separadora pueden
ser tratadas de forma que sean adhesivas con respecto a sus
electrodos respectivos y mantengan de ese modo la estructura de la
tira reactiva electroquímica. De interés particular es el uso de
una tira adhesiva de doble cara troquelada como la capa
separadora.
Las presentes tiras reactivas electroquímicas
incluyen una zona o área de reacción que está definida por el
electrodo de trabajo, el electrodo de referencia y la capa
separadora, en la que estos elementos han sido descritos
anteriormente. Específicamente, los electrodos de trabajo y de
referencia definen la parte superior e inferior del área de
reacción, mientras que la capa separadora define las paredes del
área de reacción. El volumen del área de reacción es de al menos
aproximadamente 0,1 \mul, normalmente al menos aproximadamente 1
\mul y más normalmente al menos aproximadamente 1,5 \mul, en el
que el volumen puede ser tan grande como 10 \mul o más. Como se
ha mencionado anteriormente, el área de reacción incluye normalmente
al menos un puerto de entrada, y en muchas realizaciones también
incluye un puerto de salida. El área de corte transversal de los
puertos de entrada y de salida puede variar siempre que sea lo
suficientemente grande como para proporcionar una entrada o salida
efectiva de fluido desde el área de reacción, pero normalmente varía
desde aproximadamente 9 \times 10^{-5} hasta aproximadamente 5
\times 10^{-3} cm^{2}, normalmente desde aproximadamente 5
\times 10^{-4} hasta aproximadamente 2,5 \times 10^{-3}
cm^{2}.
En la zona de reacción hay presente una
formulación de reactivo libre de enzimas, en la que la formulación
de reactivo está presente normalmente en un formato seco. Por libre
de enzimas se quiere decir que la formulación no incluye al menos
la enzima de sistema reactivo redox que está presente en la muestra
que ha de ser sometida a ensayo en la célula electroquímica. Como
tal, si la muestra que ha de ser aplicada a la célula electroquímica
incluye una glucosa dehidrogenasa, la formulación de reactivo
presente en la célula electroquímica no incluye una glucosa
dehidrogenasa, y en muchas realizaciones no incluye ninguna
enzima.
Una característica de las formulaciones de
reactivo libres de enzimas presentes en las células electroquímicas
es la presencia de un mediador redox, que puede comprender uno o más
agentes mediadores. El mediador actúa como un intermediario que
facilita la transferencia de electrones desde la enzima (que ha
tomado uno o más electrones del analito durante la oxidación del
analito) hasta el electrodo. Se pueden utilizar una variedad de
distintos agentes mediadores conocidos en la técnica, incluyendo
ferricianuro, etosulfato de fenacina, metosulfato de fenacina,
fenilenodiamina, N,N,N',N'-tetrametil
fenilenodiamina, metosulfato de
1-metoxi-fenacina,
2,5-dimetil-1,4-benzoquinona,
2,6-dimetil-1,4-benzoquinona,
2,5-dicloro-1,4-benzoquinona,
derivados de ferroceno, complejos de bipiridilo de osmio, complejos
de rutenio y similares. En las realizaciones representativas, el
mediador redox es ferricianuro.
Otro componente de la composición de reactivo es
un componente tampón mediador estabilizador. Los presentes
componentes tampón mediadores estabilizadores pueden estar formados
de uno o más, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más, agentes tampón
distintos, en los que el componente tampón estabiliza el mediador
durante el almacenaje de la composición en forma seca, de manera
que se reduce poco o nada del mediador antes de su uso, por ejemplo,
durante su almacenaje.
En una realización, los agentes tampón son
ácidos policarboxílicos. Por ácidos policarboxílicos se quiere
decir que los agentes tampón incluyen dos o más mitades funcionales
de ácido carboxílico, en el que el número de distintas mitades
funcionales de ácido carboxílico puede variar desde aproximadamente
2 hasta aproximadamente 10, por ejemplo, desde aproximadamente 2
hasta aproximadamente 8, incluyendo desde aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 6. Los grupos o mitades funcionales de ácido
carboxílico de los presentes agentes tampón pueden estar fijados a
un número de distintas estructuras, incluyendo estructuras
alifáticas, alicíclicas, aromáticas y heterocíclicas. La presencia
de más de un grupo de ácido carboxílico puede tener el efecto
beneficioso de proporcionar al menos un valor pKa para el tampón en
el rango deseado. Los ácidos policarboxílicos específicos de
interés incluyen, sin estar limitados a ellos: el ácido melítico, el
ácido citracónico, el ácido maleico, y similares, etc.
Donde la composición de reactivo es una
formulación seca de reactivo, por ejemplo, como puede estar presente
en una tira reactiva electroquímica como se describe con mayor
detalle a continuación, la cantidad de componente tampón presente
en la composición seca varía típicamente desde aproximadamente 0,01
hasta aproximadamente 40,00, normalmente desde aproximadamente 1
hasta aproximadamente 10% peso/peso.
La composición de reactivo puede incluir además
uno o más de los siguientes componentes adicionales: un agente
humectante, un estabilizador de detergente, un modificador de
viscosidad o combinaciones de los mismos.
Se puede añadir un agente humectante, en algunas
realizaciones en combinación con un detergente, a la composición de
reactivo para facilitar un revestimiento uniforme de la composición
de reactivo sobre la tira reactiva electroquímica. También se
pueden utilizar una pluralidad de uno o más de la combinación de
agentes. Los agentes utilizados pueden mejorar la disolución de los
reactivos de ensayo al igual que mejorar las propiedades de
absorción de una tira de relleno capital. Los agentes incluyen los
conocidos en la técnica, por ejemplo, polímeros, agentes
antiespumantes y agentes tensoactivos. Los tipos representativos de
tensoactivos/detergentes de interés incluyen, tampón: Triton,
Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl y Pluronic. Los agentes adecuados
incluyen materiales Pluronic que son copolímeros en bloque de óxido
de polietileno y óxido de polipropileno. Ejemplos de materiales
Pluronic incluyen el Pluronic P103, que tiene buenas propiedades
humectantes, y el Pluronic F87 Prill, que tiene buenas propiedades
detergentes. Tanto el Pluronic P103 como el F87 Prill también tienen
una temperatura de cristalización superior a 80ºC, lo que es
deseable, dado que esta propiedad evita un cambio de fase en la
composición durante el proceso de secado.
También pueden añadirse estabilizadores a la
composición de reactivo para ayudar a estabilizar la enzima y
evitar la desnaturalización de la proteína. El estabilizador también
puede ayudar a estabilizar el estado redox del mediador, en
particular, del mediador oxidado redox. Ejemplos de agentes
estabilizadores incluyen, sin estar limitados a ellos:
carbohidratos (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, manitol y lactosa),
aminoácidos, proteínas (como la BSA y la albúmina) y compuestos
orgánicos como el EDTA y similares.
También se pueden añadir modificadores de
viscosidad al reactivo para modificar la reología líquida del
reactivo. Ejemplos de dichos agentes incluyen el ácido
poli(acrílico), el alcohol de poli(vinilo), el
dextrano, la BSA y similares.
Para poner en práctica los presentes
procedimientos, el primer paso es introducir una cantidad de medio
fluido o de muestra en la zona de reacción de una célula
electroquímica, por ejemplo, de una tira reactiva electroquímica.
El periodo de tiempo entre la preparación de la muestra y la
aplicación a la zona de reacción puede variar, pero en ciertas
realizaciones representativas varía desde aproximadamente 30
segundos hasta aproximadamente 8 horas, como desde aproximadamente
5 minutos hasta aproximadamente 60 minutos. La cantidad de muestra
que se introduce en la zona de reacción de la célula electroquímica
puede variar, pero normalmente varía desde aproximadamente 0,05
hasta aproximadamente 10 \mul, normalmente desde aproximadamente
0,5 hasta aproximadamente 1,6 \mul. La muestra puede ser
introducida en la zona de reacción utilizando cualquier protocolo
conveniente, en el que la muestra puede ser inyectada en la zona de
reacción, se permite que sea absorbida en la zona de reacción, y
similares, como convenga.
Después de la aplicación de la muestra a la zona
de reacción, se lleva a cabo una medición electroquímica utilizando
los electrodos de referencia y de trabajo. La medición
electroquímica que se toma puede variar dependiendo de la
naturaleza particular del ensayo y del dispositivo con el que se
emplea la tira reactiva electroquímica, por ejemplo, dependiendo de
si el ensayo es culombimétrico, amperométrico o potenciométrico.
Normalmente, la medida electroquímica medirá la carga
(culombimétrico), la corriente (amperométrico) o el potencial
(potenciométrico), normalmente en un periodo de tiempo dado después
de la introducción de la muestra en la zona de reacción. Los
procedimientos para realizar la medición electroquímica descrita
anteriormente se describen adicionalmente en las patentes U.S.
n^{os}: 4.224.125; 4.545.382; y 5.266.179; al igual que en WO
97/18465; WO 99/49307.
Después de la detección de la señal
electroquímica generada en la zona de reacción como se ha descrito
anteriormente, la señal se emplea para caracterizar la enzima de la
muestra de alguna forma, por ejemplo, para determinar la
especificidad de la enzima hacia el sustrato, para determinar la
concentración de la enzima en la muestra aplicada en la célula,
etc., en la que estas dos aplicaciones representativas están
descritas con mayor detalle a continuación. En ciertas
realizaciones, los pasos de medición de la señal electroquímica y
los pasos de caracterización de la enzima, como se han descrito
anteriormente, los lleva a cabo de manera automática un dispositivo
diseñado para trabajar con la tira reactiva para llevar a cabo
dichos pasos después de la aplicación de una muestra en la célula
electroquímica. En la patente U.S. nº 6.193.873 se describe
adicionalmente un dispositivo de lectura representativo para poner
en práctica de manera automática al menos algunos de estos
pasos.
Como se ha indicado anteriormente, los presentes
procedimientos encuentran su uso en una variedad de distintas
aplicaciones, en las que las aplicaciones representativas en las que
los presentes procedimientos encuentran su uso son aplicaciones de
caracterización de enzimas, como se ha descrito anteriormente.
Una primera aplicación representativa de
caracterización de enzima que se puede lograr con los presentes
procedimientos es determinar la especificidad de una primera enzima
hacia el sustrato o el analito al compararse con una o más enzimas
adicionales; por ejemplo, la especificidad de una glucosa
dehidrogenasa mutante para glucosa según se compara con otros
azúcares reductores, por ejemplo, la maltosa, en la que la
especificidad se determina con respecto a una segunda glucosa
dehidrogenasa, por ejemplo, dehidrogenasa de tipo salvaje.
Al poner en práctica estas aplicaciones
representativas de la presente invención, se prepara un conjunto de
muestras de fluido que incluye al menos enzimas primera y segunda
combinadas con sustratos de enzima primero y segundo y cada muestra
preparada se prueba individualmente en una célula electroquímica.
Por probar individualmente se quiere decir que cada muestra del
conjunto se prueba en su propia célula electroquímica o en una
aparte.
En algunas de estas realizaciones, el conjunto
de muestras que se prepara y que luego se aplica individualmente a
una célula electroquímica conforme a los presentes procedimientos
incluye al menos:
- (i)
- una muestra que contiene una enzima de sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un primer sustrato de enzima;
- (ii)
- una muestra que contiene la primera enzima de sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un segundo sustrato de enzima;
- (iii)
- una muestra que contiene una segunda enzima de sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida del primer sustrato de enzima; y
- (iv)
- una muestra que contiene una segunda enzima de sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida del segundo sustrato de enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, el ensayo de
especificidad incluye probar cada una de las enzimas a distintas
concentraciones de los sustratos primero y segundo de enzima, por
ejemplo, a una pluralidad de distintas concentraciones de las
enzimas primera y segunda. En dichas realizaciones, se preparan y se
prueban al menos las siguientes muestras adicionales:
- (i)
- una muestra que contiene la primera enzima de sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida del primer sustrato de enzima;
- (ii)
- una muestra que contiene la primera enzima de sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida del segundo sustrato de enzima;
- (iii)
- una muestra que contiene la segunda enzima de sistema reactivo redox y la segunda concentración conocida del primer sustrato de enzima; y
- (iv)
- una muestra que contiene la segunda enzima de sistema reactivo redox y la segunda concentración conocida del segundo sustrato de enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización representativa de estas
aplicaciones es la evaluación de distintas enzimas
s-GDH con respecto a la especificidad de sustrato,
o sea, la capacidad de emplear glucosa pero no azúcares reductores
competidores como un sustrato. Esta realización se ilustra
adicionalmente en la Fig. 1. La Fig. 1 es un diagrama de flujo de
un proceso 100 para probar s-GDH de formas de tipo
salvaje y mutantes conforme a una realización ejemplar de la
presente invención. El proceso 100 incluye proporcionar una célula
electroquímica, como se expone en el paso 110. Se proporciona una
célula electroquímica típica tal como la que puede ser utilizada con
los procesos conforme a la presente invención en forma de una tira
reactiva 200, como se muestra en las vistas ampliada y superior en
las FIGURAS 2A y 2B, respectivamente. La tira reactiva 200 incluye
un electrodo 202 de trabajo y un electrodo 204 de referencia
separados mediante una capa separadora 206. El electrodo 202 de
trabajo incluye una banda de reactivo seco 208 que incluye un
mediador de tampón, un tensoactivo y un agente estabilizador. La
capa separadora 206 incluye una sección vaciada que define la zona
de reacción en la célula electroquímica 210 en la tira montada.
Como se ha reseñado anteriormente, los
materiales adecuados para el electrodo 204 de referencia incluyen
los enumerados anteriormente para el electrodo 202 de trabajo. El
material para el electrodo 204 de referencia en un formato opuesto
de electrodo es normalmente paladio u oro. En un formato de célula
electroquímica en el que los electrodos son coplanares, el
electrodo 204 de referencia es normalmente de carbono.
El electrodo 204 de referencia está normalmente
revestido con un estabilizador que contiene una mitad de sulfuro en
su estructura molecular. El revestimiento también puede incluir un
grupo hidrófilo y un separador entre la mitad que contiene sulfuro
y el grupo hidrófilo. Ejemplos de compuestos útiles en los
revestimientos del electrodo 204 de referencia incluyen, sin estar
limitados a ellos, el ácido sulfónico
2-mercaptoetano, el
2-mercaptoetanol, la
2-mercaptoetilamina, el ácido
3-mercaptopropriónico, el tiofeno, el
4-carboxitiofeno, la cisteína, la homocisteína y la
cistina. El electrodo 204 de referencia está compuesto normalmente
de oro revestido con ácido sulfónico
2-mercaptoetano.
El reactivo seco 208 puede usarse de
revestimiento en el electrodo 208 de trabajo mediante el
recubrimiento realizado mediante ranura como se describe en la
solicitud de patente europea EP 1324038A2, cuya revelación está
incorporada en el presente documento por referencia. Otros
procedimientos para revestir con un reactivo incluyen, sin estar
limitados a ellos, la inyección de tinta y el revestimiento mediante
percutores.
La capa separadora 206 está cortada de forma que
se proporciona una zona de reacción con al menos un puerto de
entrada en la zona de reacción y normalmente un puerto de salida
fuera de la zona de reacción. En las FIGURAS 2A y 2B se muestra que
la capa separadora 206 tiene un corte circular de área de reacción
con respiraderos laterales de entrada y de salida. Otras
configuraciones del área de reacción incluyen, sin estar limitadas
a ellas, áreas de reacción con forma cuadrada, oval, triangular,
rectangular e irregular. La capa separadora 206 puede estar
fabricada de cualquier material adecuado incluyendo, sin estar
limitado ellos, PET, PETG, poliimida y policarbonato, con lo que
las superficies de la capa separadora 206 pueden ser tratadas para
que sean así adhesivas. La capa separadora 206 es normalmente un
adhesivo de doble cara troquelado.
El mediador puede ser ferricianuro; etosulfato
de fenacina; metosulfato de fenacina; fenilenodiamina;
N,N,N',N'-tetrametil fenilenodiamina; metosulfato
de 1-metoxi-fenacina;
2,5-dimetil-1,4-benzoquinona;
2,6-dimetil-1,4-benzoquinona;
2,5-dicloro-1,4-benzoquinona;
derivados de ferroceno; complejos de bipiridilo de osmio; complejos
de rutenio; o similares. Los agentes tampón adecuados tienen poca
afinidad, si es que la tienen, hacia los cationes divalentes de
metal (por ejemplo, Ca2+) y pueden ser de citraconato, citrato,
málico, maleico, fosfato, tampones de Good o similares. Además, la
solución tampón puede contener tensoactivos o agentes humectantes
que incluyen Triton, Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl o Pluronic; y
los agentes estabilizadores incluyen la sacarosa, la trehalosa o el
manitol. En la realización preferida el mediador es ferricianuro, el
tampón es el citraconato, el tensoactivo es Pluronic, y el agente
estabilizador es la sacarosa.
A continuación, como se expone en el paso 120 en
el proceso 100, se mezcla s-GDH de tipo salvaje o al
menos una forma mutante de la misma en una solución tampón con una
coenzima, un cofactor y concentraciones variables de un primer
azúcar reductor (por ejemplo, la glucosa). El primer azúcar reductor
puede ser, sin estar limitada a ellas, glucosa, galactosa, maltosa,
xilosa o lactosa. La coenzima puede ser PQQ y el cofactor puede ser
calcio.
La s-GDH empleada en el proceso
conforme a la presente invención, incluyendo el proceso 100 y 300
(véase más abajo), puede ser cualquier forma nativa o mutante de
s-GDH en la que se ha hecho al menos una
modificación en la secuencia de aminoácido de la enzima nativa,
pero no está limitada a llevar a cabo una o más sustituciones o
eliminaciones de aminoácido para mejorar la especificidad de la
glucosa. Se pueden utilizar las técnicas conocidas por los expertos
en la técnica para llevar a cabo estas modificaciones a la
s-GDH y se exponen en la patente U.S. nº 6.103.509
y en la solicitud de patente europea nº EP 1 176 202 A1 mencionadas
anteriormente, en las que los procedimientos generales para hacer
mutantes de una enzima de tipo salvaje son perfectamente conocidos
por los expertos en la técnica.
Como se ha expuesto en el paso 130 de la Fig. 1,
se añaden las soluciones de enzima/azúcar cada una en células
electroquímicas distintas que contienen un mediador tampón, un
agente tensoactivo y un agente estabilizador. A continuación, se
mide la respuesta de corriente y se traza como una función de la
concentración de azúcar, como se expone en los pasos 140. Mantener
a la solución de enzima/azúcar separada del mediador antes de medir
la respuesta de corriente es beneficioso debido a la rápida tasa de
reacción entre la enzima y el mediador. Si se mezclan la enzima y
el mediador antes de añadir la solución a la célula electroquímica,
la reacción estará completa o cerca de estar completa antes de que
se pueda medir la respuesta de corriente. Se repiten entonces los
pasos 110 hasta 140 para al menos un azúcar reductor adicional y al
menos una forma mutante de s-GDH adicional, como se
expone en el paso 150 (véanse los Ejemplos 2-4). El
al menos un azúcar reductor adicional puede ser, sin estar limitado
a ellas, la galactosa, la maltosa, la xilosa o la lactosa. A
continuación, se selecciona una forma mutante de
s-GDH con una respuesta reducida al al menos un
azúcar adicional, como se expone en los pasos 160 y 170.
De esta forma, se puede determinar fácilmente la
especificidad de la s-GDH mutante con respecto a la
s-GDH de tipo salvaje.
En otra aplicación representativa, los presentes
procedimientos se emplean para determinar la concentración o la
actividad de una enzima en una muestra de fluido. Al poner en
práctica estos procedimientos, se aplica una muestra de fluido que
contiene una cantidad desconocida de enzima y una cantidad conocida
de sustrato a una célula electroquímica. Después de la aplicación,
se utiliza la señal eléctrica detectada para determinar la
concentración de analito en la muestra aplicada, por ejemplo, al
comparar dicha señal eléctrica detectada con una referencia.
La Fig. 3 es un diagrama de flujo que ilustra
una secuencia de pasos en un proceso 300 conforme a la presente
invención para medir la actividad de s-GDH de tipo
salvaje y mutantes de la misma en una muestra. El proceso 300
incluye proporcionar una célula electroquímica que contiene un
mediador secado en tampón con un tensoactivo y un estabilizador,
como se expone en el paso 310. A continuación, se mezclan
concentraciones crecientes de s-GDH de tipo salvaje
o una forma mutante de s-GDH con una cantidad
constante de glucosa, como se expone en el paso 320. Entonces se
añade cada muestra de enzima/glucosa a una célula electroquímica
distinta, como se expone en el paso 330. Como se expone en el paso
340, se mide la respuesta de corriente para cada muestra y la
respuesta se traza como una función de la concentración de enzimas
para crear una curva estándar, que se puede emplear como referencia
en los pasos subsiguientes. A continuación, se repiten los pasos 310
hasta 340 para al menos un lote adicional de s-GDH
de tipo salvaje o de forma mutante, como se expone en el paso 350.
Como se expone en el paso 360, entonces se lee la concentración de
enzimas de el al menos un lote adicional de s-GDH
de tipo salvaje o de forma mutante de la curva estándar o de
referencia, por ejemplo, al comparar la señal detectada con la
referencia.
La presente invención también proporciona
sistemas para ser utilizados al poner en práctica los presentes
procedimientos, en lo que los sistemas incluyen al menos una muestra
o medio fluido que incluye una enzima de sistema reactivo redox y
una célula electroquímica que incluye una composición de reactivo
libre de enzimas, como se ha descrito anteriormente.
Los presentes sistemas también pueden incluir un
dispositivo para ser utilizado al someter de manera electroquímica
a ensayo una muestra utilizando las presentes composiciones de
reactivo.
Los dispositivos o medidores de los presentes
sistemas son normalmente dispositivos electroquímicos de medición.
Los presentes medidores incluyen normalmente: (a) un medio para
aplicar un potencial eléctrico a una célula electroquímica en la
que se ha introducido una muestra; y (b) un medio para medir la
corriente de la célula en la célula. En los documentos de patente
U.S.: 5.723.284; 5.834.224; 5.942.102; 5.972.199; 5.997.817;
6.083.710; 6.121.009; 6.134.461; y 6.193.873 al igual que en otros
documentos de patente: WO 99/49307; WO 97/18465; WO 01/57510; WO
01/57238; WO 02/48707; WO02/50609; EP 0 969 097A2 y GB 2 304 628 se
describen medidores o dispositivos electroquímicos
representativos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Para desarrollar un ensayo para análisis de
formas mutantes de s-GDH con especificidades
variables de azúcar, primero se prueba la respuesta de
s-GDH de tipo salvaje y formas mutantes con azúcares
reductores en un formato convencional de tira reactiva de glucosa
revestida con enzimas. Idealmente, el ensayo analítico imita la
respuesta mostrada con tiras revestidas convencionalmente con
enzimas sometidas a ensayo con sangre total o plasma enriquecido
con un azúcar reductor. Cada una de las formas mutantes de
s-GDH probadas contuvieron una sustitución de
aminoácido: Asn452Thr y Asp167Glu. Se hicieron las tiras reactivas
mediante un proceso basado en una banda de papel en la que el
electrodo de trabajo (oro) estaba revestido con recubrimiento
realizado mediante ranura con una solución de reactivo tampón que
contenía aproximadamente 50 hasta 500 kU/ml de s-GDH
de tipo salvaje o mutante, PQQ con una relación de 2 a 1 de PQQ a
GDH, 2 mM de CaCl_{2}, 750 mM de ferricianuro, 67 mM de
citraconato con un pH de 6,8, 0,1% de Pluronic y 75 mM de sacarosa.
Se ajustó la concentración de s-GDH de tipo salvaje
o mutante en la solución de reactivo de forma que se usaron
aproximadamente 13 unidades de actividad por célula electroquímica;
por lo tanto, las unidades de actividad por ml de solución de
reactivo variaron dependiendo de las unidades de actividad por
gramo de enzima utilizada. La actividad de cada enzima estaba basada
en un ensayo de espectrofotometría utilizando DCIP
(2,6-diclorofenolindofenol) y PES (etosulfato de
fenacina) en 50 mM de tampón de PIPES (piperacina, N, N' bis-(ácido
2-etanosulfónico)) con un pH de 6,8. En el ensayo,
se monitorizó el cambio en la absorción de DCIP a 600 nm y se hizo
referencia a la velocidad decreciente de absorción como la
velocidad de reacción de la enzima. La actividad enzimática por la
que se reduce 1 mmol de DCIP en un minuto fue definida como 1
Unidad. El coeficiente de absorción molar de DCIP con un pH de 6,8
fue de 17,4 mM-1. Se utilizó un analizador
centrífugo COBAS FARA II para el ensayo de espectrofotometría.
Se utilizó una fuente de energía IR para secar
el reactivo en el electrodo de trabajo, como se describe en la
solicitud de patente europea nº EP1324038, que está incorporada en
el presente documento por referencia. Las células electroquímicas
(o tiras reactivas) se formaron adhiriendo al electrodo de trabajo
reactivo seco a un contraelectrodo de oro que contenía MESA seco
para evitar la contaminación del contraelectrodo.
\newpage
Se enriqueció sangre total a aproximadamente 80
mg/dL (o 4,4 mM) de glucosa endógena con un nivel terapéutico alto
(aproximadamente 60 mg/dL o 4 mM) o con tres veces un nivel
terapéutico alto (aproximadamente 180 mg/dL o 12 mM) del azúcar
interferente xilosa. Se dosificaron las muestras enriquecidas sobre
las tiras reactivas y se determinó la concentración de glucosa
mediante cronoamperometría, en la que se aplicó un potencial de
-0,3 V durante 10 segundos, y a continuación se aplicó un potencial
de +0,3 V durante 5 segundos. Se calculó la tendencia absoluta para
una muestra de control sin nada de xilosa para cada enzima y se
expresó como una función de la concentración de xilosa, como se
muestra en la Fig. 4. Hubo una correlación lineal entre la
tendencia absoluta y el azúcar interferente xilosa para
s-GDH de tipo salvaje y el mutante Asn452Thr,
indicando que tanto la s-GDH de tipo salvaje y el
Asn452Thr reconocen la xilosa al igual que la glucosa. Sin embargo,
el mutante Asp167Glu exhibió una respuesta reducida con la xilosa.
Ambas formas mutantes también demostraron correlaciones lineales
entre tendencia absoluta y galactosa o maltosa (datos no mostrados),
indicando que se reconocen estos carbohidratos al igual que la
glucosa. Así, un ensayo utilizado para analizar formas mutantes de
s-GDH debería dar resultados similares a los
obtenidos en la Fig. 4 en la que solo el Asp167Glu exhibió una
respuesta reducida a la xilosa.
Los resultados mostrados en la Fig. 4 no
incluyeron probar en todo el rango fisiológicamente relevante de
concentración de azúcar (o sea, hasta 720 mg/dL o 40 mM); por lo
tanto, se llevaron a cabo más pruebas de tiras reactivas
convencionales revestidas con s-GDH de tipo salvaje
para expandir el rango de concentración de azúcar. El plasma con
aproximadamente 80 mg/dL (o 4,4 mM) de glucosa endógena fue
enriquecido con hasta 40 mM de cada uno de los cinco azúcares
reductores: glucosa, maltosa, xilosa, galactosa y lactosa. Se
dosificaron las muestras enriquecidas sobre las anteriores tiras
reactivas y se determinó la concentración de glucosa mediante
cronoamperometría, como anteriormente. Se trazó la respuesta de
corriente medida como una función de la concentración de azúcar
como se muestra en la Fig. 5. Como en la Fig. 4, con menos de
aproximadamente 10 mM, la s-GDH de tipo salvaje
reacciona realmente bien con cada uno de los cinco azúcares
reductores probados. Sin embargo, cuando se probaron con el ensayo
espectrofotométrico de DCIP/PES descrito anteriormente, la
s-GDH tiene una baja reactividad con la xilosa y la
galactosa en el mismo rango de concentraciones de azúcar (resultados
no mostrados), indicando que el ensayo espectrofotométrico no puede
ser utilizado para tiras reactivas convencionales revestidas con
enzimas. Como se ha mencionado anteriormente, el ensayo
espectrofotométrico utiliza condiciones limitantes de las enzimas,
mientras que las tiras reactivas revestidas convencionalmente con
enzimas utilizan la enzima en exceso; explicando así la diferencia
en respuesta al azúcar con cada formato de ensayo.
Se midió la respuesta de la
s-GDH de tipo salvaje a azúcares reductores
utilizando células electroquímicas (o sea, tiras reactivas) hechas
mediante un proceso basado en una banda de papel en la que el
electrodo de trabajo (oro) estaba revestido con recubrimiento
realizado mediante ranura con una solución de reactivo tampón que
contenía aproximadamente 750 mM de ferricianuro, 67 mM de
citraconato con un pH de 6,8, 0,1% de Pluronics y 75 mM de
sacarosa. Como en el Ejemplo 1, se utilizó una fuente de energía IR
para secar el reactivo sobre el electrodo de trabajo. Se formaron
células electroquímicas al adherir el electrodo de trabajo con el
reactivo secado a un contraelectrodo de oro que contenía MESA
secado para evitar la contaminación del contraelectrodo.
Se mezcló s-GDH de tipo salvaje
en 67 mM de citraconato con un pH de 6,8 con PQQ con una relación de
2 a 1 de PQQ a GDH y 2 mM de CaC12 con concentraciones
fisiológicamente relevantes (hasta aproximadamente 40 mM o 720
mg/dL) de uno de los siguientes azúcares: glucosa, xilosa,
galactosa, maltosa o lactosa. Se ajustó la concentración de la
s-GDH de tipo salvaje en cada solución de forma que
se utilizaron aproximadamente 13 unidades de actividad por célula
electroquímica. Se dosificó cada solución que contenía enzima/azúcar
en una célula electroquímica que contenía ferricianuro secado,
citraconato, Pluronics y sacarosa pero ninguna enzima (véase más
arriba para las concentraciones). Se midió la respuesta de corriente
y se trazó la media de tres determinaciones como una función de la
concentración de azúcar, como se muestra en la Fig. 6. Los
resultados fueron similares a los obtenidos con las tiras
revestidas con s-GDH en el Ejemplo 1 (véase la Fig.
4) con concentraciones de xilosa menores de 10 mM en las que la
enzima reaccionó realmente bien con la glucosa y la xilosa. También
se obtuvieron resultados similares a los obtenidos en la Fig. 5 con
todos los azúcares reductores. Así, el ensayo modela la respuesta
obtenida con las tiras reactivas convencionales revestidas con
enzimas de tipo salvaje con las siguientes ventajas: (1) las tiras
revestidas con enzimas no tienen que ser fabricadas con cada forma
de enzima, ahorrando por lo tanto tiempo y recursos (equipo y
técnicos) y se utilizan menos enzimas; y (2) se pueden utilizar
muestras basadas en tampón que contienen concentraciones variables
de azúcar reductor en vez de sangre total o plasma, de riesgo
biológico, enriquecido con azúcar.
Se midió la respuesta de Asn452Thr a azúcares
reductores utilizando el mismo lote de células electroquímicas como
se ha descrito en el anterior Ejemplo 2 (o sea, con células que
contenían ferricianuro secado, citraconato, Pluronics y sacarosa
pero sin ninguna enzima). Se mezcló Asn452Thr con concentraciones
fisiológicamente relevantes (hasta aproximadamente 40 mM o 720
mg/dL) de uno de los siguientes azúcares: glucosa, xilosa,
galactosa, maltosa o lactosa. Se ajustó la concentración de
Asn452Thr de forma que se utilizaron aproximadamente
1-3 unidades de actividad por célula
electroquímica. Se dosificó cada solución que contenía enzima/azúcar
en una célula electroquímica que contenía ferricianuro secado,
citraconato, Pluronics y sacarosa pero ninguna enzima. Se midió la
respuesta de corriente y se trazó como una función de la
concentración de azúcar como se muestra en la Fig. 7. Los
resultados fueron similares a los obtenidos con las tiras revestidas
con Asn452Thr en el Ejemplo 1 (véase la Fig. 4) a menos de 10 mM de
xilosa (o sea, a aproximadamente tres veces el nivel terapéutico
alto) en los que al igual que la enzima de tipo salvaje, Asn452Thr
reacciona igual de bien con la glucosa y la xilosa. Los datos
también muestran que esta forma mutante de s-GDH
reacciona igualmente bien con todos los azúcares probados a menos
de 10 mM de azúcar. Así, el ensayo imita los resultados obtenidos
con las tiras revestidas con Asn452Thr con las ventajas expuestas
anteriormente.
Se midió la respuesta del Asp167Glu a azúcares
reductores como se ha descrito en el anterior Ejemplo 3. Se mezcló
Asp167Glu con concentraciones fisiológicamente relevantes (hasta
aproximadamente 40 mM o 720 mg/dL) de uno de los siguientes
azúcares: glucosa, xilosa, galactosa, maltosa o lactosa; y se
dosificó en una célula electroquímica que contenía ferricianuro
secado, citraconato, Pluronics y sacarosa, pero ninguna enzima. Se
midió la respuesta de corriente y se trazó como una función de la
concentración de azúcar como se muestra en la Fig. 8. Los
resultados fueron similares a los obtenidos de las tiras revestidas
con Asp167Glu en el Ejemplo 1 (véase la Fig. 4) a menos de 10 mM de
xilosa (o sea, a aproximadamente tres veces el nivel terapéutico
alto) en los que esta forma mutante de s-GDH exhibe
una respuesta reducida a la xilosa. Esta mutación también reacciona
igualmente bien con todos los otros azúcares reductores probados.
Así, de nuevo, el ensayo imita de forma beneficiosa los resultados
obtenidos con las tiras revestidas con Asp167Glu pero en un formato
rápido y sencillo de usar.
Los ejemplos anteriores demuestran que se puede
utilizar el procedimiento para modelar el rendimiento de la tira
revestida con enzimas y se puede utilizar para analizar formas
mutantes de s-GDH para una respuesta frente a los
azúcares.
Los siguientes ejemplos demuestran cómo utilizar
el procedimiento para medir la actividad de enzima.
Se generó una curva estándar (véase la Fig. 9)
para s-GDH de tipo salvaje al dosificar células
electroquímicas que contenían ferricianuro secado, citraconato,
Pluronics y sacarosa, pero ninguna enzima (véase más arriba para
las concentraciones) con concentraciones crecientes de
s-GDH de tipo salvaje que variaron desde
aproximadamente 0-10 mg/ml. Se mantuvo la
concentración de glucosa en 450 mg/dL. Los expertos en la técnica
reconocerán que también se puede construir una curva estándar para
cualquier forma mutante de s-GDH.
Se construyó un trazado de doble recíproco (o
sea, 1/respuesta como una función de 1/concentración de enzima) a
partir de la curva estándar en la Fig. 9 y éste se muestra en la
Fig. 10. Existe una fuerte correlación lineal (r2=0,9986) entre la
respuesta de la célula electroquímica y la cantidad de
s-GDH de tipo salvaje. Se puede determinar
fácilmente la concentración de un lote de prueba de enzima midiendo
la respuesta de corriente y leyendo la concentración en la curva
estándar.
La generación de una curva estándar para
s-GDH en un formato electroquímico permite de forma
beneficiosa la medición de la actividad de las enzimas captadas
utilizadas para fabricar las tiras reactivas convencionales,
midiendo la estabilidad de las enzimas revestidas en tiras secas y
resolviendo los problemas potenciales de revestimiento de tiras
relacionados con la actividad enzimática.
Los anteriores resultados y exposición
demuestran que la presente invención proporciona formas convenientes
y rentables para caracterizar enzimas de sistema reactivo redox.
Las ventajas de la presente invención incluyen un menor coste y la
capacidad para hacer ensayos sin utilizar sangre o productos
sanguíneos. Como tal, la presente invención representa una
contribución significativa a la técnica.
Claims (13)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Un procedimiento para caracterizar una enzima de un sistema reactivo redox que comprende:- (a)
- aplicar una muestra que comprende una primera enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima a una célula electroquímica que comprende una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de dicho sistema reactivo redox; y
- (b)
- detectar una señal eléctrica producida por dicha célula.
- 2. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que dicha enzima es una enzima oxidante.
- 3. El procedimiento conforme a la reivindicación 2, en el que dicha enzima oxidante está escogida entre una oxidasa y una dehidrogenasa.
- 4. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, 2 o 3, en el que dicha muestra comprende además un cofactor de enzima.
- 5. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en el que dicho procedimiento comprende además utilizar dicha señal eléctrica detectada para determinar la especificidad del analito de dicha primera enzima de un sistema reactivo redox.
- 6. El procedimiento conforme a la reivindicación 5, en el que dicho procedimiento comprende detectar señales eléctricas producidas en al menos las siguientes muestras: (i) una muestra que contiene una primera enzima de un sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un primer sustrato de enzima; (ii) una muestra que contiene dicha primera enzima de un sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un segundo sustrato de enzima; (iii) una muestra que contiene una segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida de dicho primer sustrato de enzima; y (iv) una muestra que contiene dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida de dicho segundo sustrato de enzima.
- 7. El procedimiento conforme a la reivindicación 6, en el que dicho procedimiento comprende además detectar señales eléctricas producidas en las siguientes muestras:
- (i)
- una muestra que contiene dicha primera enzima de un sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida de dicho primer sustrato de enzima;
- (ii)
- una muestra que contiene dicha primera enzima de un sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida de dicho segundo sustrato de enzima;
- (iii)
- una muestra que contiene dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha segunda concentración conocida de dicho primer sustrato de enzima; y
- (iv)
- una muestra que contiene dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha segunda concentración de dicho segundo sustrato de enzima.
- 8. El procedimiento conforme a la reivindicación 7, en el que dicha especificidad determinada de analito de dicha primera enzima de un sistema reactivo redox es relativa a dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox.
- 9. El procedimiento conforme a la reivindicación 8, en el que dicha primera enzima de un sistema reactivo redox es una enzima que no se da de forma natural de un sistema reactivo redox.
- 10. El procedimiento conforme a la reivindicación 8, en el que dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox es una enzima que se da de forma natural de un sistema reactivo redox.
- 11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además utilizar dicha señal eléctrica detectada para determinar la actividad de dicha enzima en dicha muestra.
- 12. Una célula electroquímica que comprende un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia que están separados mediante una capa separadora para definir una zona de reacción; y una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de sistema reactivo redox que está presente en la zona de reacción de la célula electroquímica.
- 13. Un sistema que comprende:
- (a)
- una célula electroquímica que comprende una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de sistema reactivo redox; y
- (b)
- un medio fluido que comprende una enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US883629 | 1992-05-13 | ||
| US10/883,629 US20060003400A1 (en) | 2004-06-30 | 2004-06-30 | Methods and compositions for characterizing a redox reagent system enzyme |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2317163T3 true ES2317163T3 (es) | 2009-04-16 |
Family
ID=34941778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05254051T Expired - Lifetime ES2317163T3 (es) | 2004-06-30 | 2005-06-29 | Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreduccion. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060003400A1 (es) |
| EP (1) | EP1612275B1 (es) |
| JP (1) | JP2006017720A (es) |
| KR (1) | KR20060048711A (es) |
| CN (1) | CN1725006A (es) |
| AT (1) | ATE415484T1 (es) |
| AU (1) | AU2005202515A1 (es) |
| CA (1) | CA2510965A1 (es) |
| CY (1) | CY1108840T1 (es) |
| DE (1) | DE602005011203D1 (es) |
| DK (1) | DK1612275T3 (es) |
| ES (1) | ES2317163T3 (es) |
| MX (1) | MXPA05006415A (es) |
| NO (1) | NO20053177L (es) |
| PL (1) | PL1612275T3 (es) |
| PT (1) | PT1612275E (es) |
| RU (1) | RU2005116827A (es) |
| SG (1) | SG118412A1 (es) |
| SI (1) | SI1612275T1 (es) |
| TW (1) | TW200613726A (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101139104B1 (ko) | 2006-04-19 | 2012-04-30 | 파나소닉 주식회사 | 바이오센서 |
| JP5489092B2 (ja) * | 2006-04-19 | 2014-05-14 | パナソニックヘルスケア株式会社 | バイオセンサ |
| BRPI0813241A2 (pt) * | 2007-06-28 | 2014-12-23 | Kraft Foods Global Brands Llc | Método in vitro para determinar o índice glicêmico para um produto alimentício de teste. |
| CN101796403B (zh) * | 2007-09-07 | 2014-08-20 | 东丽株式会社 | 液体展开用板 |
| US8008037B2 (en) | 2008-03-27 | 2011-08-30 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Matrix composition with alkylphenazine quaternary salt and a nitrosoaniline |
| US8987000B2 (en) * | 2013-03-29 | 2015-03-24 | LaMotte Chemical Products Company | Reagent for detection and assessment of free chlorine in aqueous solution |
| JP6925933B2 (ja) | 2017-10-25 | 2021-08-25 | アークレイ株式会社 | アスコルビン酸測定用電極およびバイオセンサ |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3323973A1 (de) * | 1983-07-02 | 1985-01-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Erythrozyten-rueckhaltesubstrate |
| DE4311464A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase |
| IL118432A (en) * | 1996-05-27 | 1999-12-31 | Yissum Res Dev Co | Electrochemical and photochemical electrodes and their use |
| JPH10243786A (ja) * | 1997-03-03 | 1998-09-14 | Koji Hayade | 改変型グルコース脱水素酵素 |
| EP0987544B1 (en) * | 1998-04-02 | 2007-10-17 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Substrate determining method |
| GB2337122B (en) * | 1998-05-08 | 2002-11-13 | Medisense Inc | Test strip |
| GB2351153B (en) * | 1999-06-18 | 2003-03-26 | Abbott Lab | Electrochemical sensor for analysis of liquid samples |
| US6444115B1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-09-03 | Lifescan, Inc. | Electrochemical method for measuring chemical reaction rates |
| US6780584B1 (en) * | 2000-09-27 | 2004-08-24 | Nanogen, Inc. | Electronic systems and component devices for macroscopic and microscopic molecular biological reactions, analyses and diagnostics |
| AU1596602A (en) * | 2000-10-27 | 2002-05-06 | Peter Kratzsch | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| US6767441B1 (en) * | 2001-07-31 | 2004-07-27 | Nova Biomedical Corporation | Biosensor with peroxidase enzyme |
| JP4001864B2 (ja) * | 2001-08-03 | 2007-10-31 | ナノバイオデザイン リミテッド | キメラタンパク質及び電子伝達法におけるその使用 |
| US6749887B1 (en) * | 2001-11-28 | 2004-06-15 | Lifescan, Inc. | Solution drying system |
| US20040072263A1 (en) * | 2002-04-19 | 2004-04-15 | Baylor College Of Medicine | Quantitative measurement of proteins using genetically-engineered glucose oxidase fusion molecules |
| US20040053425A1 (en) * | 2002-04-19 | 2004-03-18 | Baylor College Of Medicine | Quantitative measurement of proteins using genetically-engineeredglucose oxidase fusion molecules |
| US7291256B2 (en) * | 2002-09-12 | 2007-11-06 | Lifescan, Inc. | Mediator stabilized reagent compositions and methods for their use in electrochemical analyte detection assays |
-
2004
- 2004-06-30 US US10/883,629 patent/US20060003400A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-06-01 RU RU2005116827/15A patent/RU2005116827A/ru not_active Application Discontinuation
- 2005-06-09 AU AU2005202515A patent/AU2005202515A1/en not_active Abandoned
- 2005-06-15 MX MXPA05006415A patent/MXPA05006415A/es not_active Application Discontinuation
- 2005-06-27 SG SG200504108A patent/SG118412A1/en unknown
- 2005-06-28 CA CA002510965A patent/CA2510965A1/en not_active Abandoned
- 2005-06-28 NO NO20053177A patent/NO20053177L/no not_active Application Discontinuation
- 2005-06-29 DK DK05254051T patent/DK1612275T3/da active
- 2005-06-29 DE DE602005011203T patent/DE602005011203D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-06-29 CN CNA200510081064XA patent/CN1725006A/zh active Pending
- 2005-06-29 EP EP05254051A patent/EP1612275B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2005-06-29 PT PT05254051T patent/PT1612275E/pt unknown
- 2005-06-29 SI SI200530604T patent/SI1612275T1/sl unknown
- 2005-06-29 KR KR1020050057142A patent/KR20060048711A/ko not_active Withdrawn
- 2005-06-29 TW TW094121736A patent/TW200613726A/zh unknown
- 2005-06-29 PL PL05254051T patent/PL1612275T3/pl unknown
- 2005-06-29 AT AT05254051T patent/ATE415484T1/de active
- 2005-06-29 JP JP2005190277A patent/JP2006017720A/ja active Pending
- 2005-06-29 ES ES05254051T patent/ES2317163T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-02-26 CY CY20091100220T patent/CY1108840T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20053177D0 (no) | 2005-06-28 |
| HK1084979A1 (en) | 2006-08-11 |
| CN1725006A (zh) | 2006-01-25 |
| TW200613726A (en) | 2006-05-01 |
| EP1612275A1 (en) | 2006-01-04 |
| JP2006017720A (ja) | 2006-01-19 |
| DK1612275T3 (da) | 2009-03-16 |
| PL1612275T3 (pl) | 2009-05-29 |
| RU2005116827A (ru) | 2006-11-20 |
| US20060003400A1 (en) | 2006-01-05 |
| SG118412A1 (en) | 2006-01-27 |
| CA2510965A1 (en) | 2005-12-30 |
| SI1612275T1 (sl) | 2009-06-30 |
| EP1612275B1 (en) | 2008-11-26 |
| KR20060048711A (ko) | 2006-05-18 |
| CY1108840T1 (el) | 2014-07-02 |
| DE602005011203D1 (de) | 2009-01-08 |
| NO20053177L (no) | 2006-01-02 |
| MXPA05006415A (es) | 2006-01-31 |
| ATE415484T1 (de) | 2008-12-15 |
| PT1612275E (pt) | 2009-01-20 |
| AU2005202515A1 (en) | 2006-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schaffar | Thick film biosensors for metabolites in undiluted whole blood and plasma samples | |
| ES2592268T3 (es) | Método para análisis electroquímico rápido | |
| US7291256B2 (en) | Mediator stabilized reagent compositions and methods for their use in electrochemical analyte detection assays | |
| ES2663784T3 (es) | Métodos para analizar una muestra en presencia de interferentes | |
| ES2547493T3 (es) | Sensores de ensayo de múltiples regiones y potenciales, procedimientos, y sistemas | |
| ES2254368T3 (es) | Procedimientos y dispositivos electroquimicos para usar en la determinacion de concentraciones de analito corregidas con el hematocrito. | |
| JP4352153B2 (ja) | 薄型分析用具 | |
| ES2883115T3 (es) | Tira reactiva de dos electrodos que compensan la interferencia | |
| CN101970680B (zh) | 用于电化学检测的改良的试剂组合物 | |
| KR20060089464A (ko) | 전기화학적 바이오센서 | |
| US11851685B2 (en) | Zwitterion buffer containing compositions and uses in electroanalytical devices and methods | |
| JP4717637B2 (ja) | 試薬部の配置を改良した分析用具および分析方法 | |
| ES2317163T3 (es) | Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreduccion. | |
| CA2658023A1 (en) | Biosensor | |
| US20220112536A1 (en) | Oxygen-insensitive electrochemical biosensor and methods of use thereof | |
| HK1084979B (en) | Methods and compositions for characterizing a redox reagent system enzyme | |
| HK1062032B (en) | Mediator stabilized reagent compositions and methods for their use in electrochemical analyte detection assays |