ES2317308T3 - Nuevo peptido y composicion farmaceutica que lo contiene. - Google Patents
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Abstract
Péptido que presenta la siguiente secuencia TALRIRATYGEY (SEQ ID Nº1).
Description
Nuevo péptido y composición farmacéutica que lo
contiene.
La presente invención se refiere a un nuevo
péptido, a una composición farmacéutica que comprende este péptido
y a la utilización de tal composición para el tratamiento de las
alteraciones de la piel de orígenes diversos.
Más particularmente, el tratamiento de dichas
alteraciones consiste especialmente en reforzar la unión
dermoepidérmica, la adherencia célula-célula y/o la
adherencia célula-matriz al nivel de la epidermis y
en favorecer la reparación de la superficie cutánea.
La invención se refiere también a un
procedimiento de tratamiento cosmético que comprende la aplicación
sobre la piel de esta composición farmacéutica.
La alteración de la piel más común y más natural
es simplemente la debida al envejecimiento cutáneo.
El envejecimiento cutáneo es un fenómeno
complejo que se debe a numerosos factores intrínsecos (factores
genéticos) y extrínsecos (tales como el sol, la alimentación, la
exposición al humo de cigarrillos...). Clínicamente, se observa la
aparición de arrugas y las arrugas superficiales, una pérdida de
elasticidad cutánea, una relajación de los tejidos cutáneos y
subcutáneos así como una cicatrización menos buena.
Se proponen numerosas vías de investigación para
combatir el envejecimiento cutáneo, entre las cuales la protección
contra el medioambiente (sol, contaminación,...), la activación de
la regeneración celular, el refuerzo de la matriz extracelular
(colágeno y elastina). Recientemente, unos estudios han mostrado la
importancia de la adherencia de las células entre sí por una parte,
y de la adherencia entre las células y la matriz extracelular por
otra parte, en el proceso del envejecimiento cutáneo y por lo tanto
de la necesidad de reforzaras para prevenir, incluso tratar la
relajación de la piel.
Los estudios dermatológicos recientemente
dirigidos hacia la utilización de los péptidos en biología cutánea
(secuencias derivadas del alfa-MSH, algunos
neuropéptidos RGD...) se orientan hacia la búsqueda de péptidos con
una fuerte actividad al nivel cutáneo.
La industria cosmética está también a la espera
permanente de un nuevo péptido capaz de aumentar la adherencia de
las células a la matriz extracelular y/o la adherencia de las
células entre sí.
Las interacciones entre las células y la matriz
extracelular (MEC) desempeñan una función importante en el control
del comportamiento celular. Este control se efectúa por
interacciones específicas entre las moléculas matriciales y las
células al nivel de receptores transmembranares, principalmente de
la familia de las integrinas, cuyo dominio intracelular se conecta
a los constituyentes del citoesqueleto. Esto permite que la matriz
garantice la transmisión de señales intracelulares que modulan
según los casos la adherencia, la migración, la proliferación, la
diferenciación o la apóptosis de las células de la epidermis. Este
control del comportamiento celular es crucial a lo largo del
desarrollo pero también durante las modificaciones tisulares.
Según las moléculas constitutivas y la
organización que se derivan, se distinguen diversos tipos de MEC,
siendo las láminas basales sin duda las más especializadas. Estas
últimas son entramados proteicos continuos sobre los cuales
descansan las diferentes hojas celulares del organismo. Durante
mucho tiempo se las ha definido como estructuras morfológicas
discretas cuya función se limitaba al tabicado de los compartimentos
tisulares. Es solo a lo largo de los últimos 15 años que, a pesar
de su escasa representatividad y su gran insolubilidad, se han
realizado avances significativos en la investigación de su
composición molecular y de sus funciones. Parece que estas
estructuras desempeñan una función fundamental en el control del
comportamiento celular, tanto durante el desarrollo embrionario
como en el mantenimiento de la integridad de los fenotipos celulares
diferenciados.
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La estructura de la piel se compone de:
- -
- un epitelio de revestimiento: la epidermis,
- -
- un tejido conjuntivo: la dermis (capa espesa que determina la morfología de la piel y que contiene los vasos sanguíneos y linfáticos, los nervios), y
- -
- un tejido adiposo: la hipodermis.
\vskip1.000000\baselineskip
Dermis y epidermis están conectadas por una
estructura única y compleja, la unión dermoepidérmica (JDE) o
lámina basal epidérmica. Anatómicamente, corresponde a la zona
comprendida entre las células basales y la epidermis y las capas
más superficiales de la dermis. Es una zona de adherencia que
determina un tabicado entre el epitelio polarizado y el estroma
subyacente, que garantiza el mantenimiento y la cohesión de las
células adyacentes. La JDE compuesta exclusivamente de matriz
extracelular, garantiza dos funciones:
- 1º)
- función mecánica,
- su arquitectura molecular única confiere una gran estabilidad mecánica que le permite garantizar un anclaje sólido de la epidermis;
- 2º)
- función biológica;
- las proteínas de la JDE mantienen con las células basales de la epidermis relaciones estrechas y les transmiten importantes informaciones morfogenéticas mediante receptores de la familia de las integrinas.
La JDE también es un filtro de difusión respecto
de los elementos nutritivos y metabólicos. Permite por lo tanto la
transmisión de las informaciones biológicas.
En el curso del envejecimiento cutáneo, la JDE
se allana y pierde progresivamente sus ondulaciones características,
lo cual reduce considerablemente la interfaz
epidermis-dermis- Además, las redes moleculares se
desorganizan, la estructura proteica se fragiliza y la adherencia
de los queratinocitos basales se reduce.
Por consiguiente, la función mecánica (sostén) y
la función biológica (intercambio de informaciones y de moléculas)
de la JDE se alteran.
Cuando hay herida cutánea, se daña la JDE y sus
moléculas constitutivas se degradan mediante enzimas específicas.
En condiciones favorables, la reepitelización epidérmica se inicia
algunas horas después del traumatismo. En cuanto el epitelio ha
cubierto el lecho de la herida, las proteínas de la JDE vuelven a
aparecer de manera secuencial y ordenada.
Con el envejecimiento cutáneo, cada una de estas
etapas se desarrolla más lentamente. En particular, se ha observado
una disminución de la expresión de las proteínas de adherencia
matricial así como de la de los receptores membranares, que podrá
constituir la principal causa del retraso observado en el proceso de
reconstitución de la JDE y de la extrema fragilidad de los tejidos
cicatrizados en los sujetos de edad avanzada.
La laminina 5 (LN-5) es una
proteína específicamente expresada en las láminas basales de los
epitelios escamosos y de transición especializados como la unión
dermoepidérmica de la piel. La LN-5 es el resultado
del ensamblado heterotrimérico de las subunidades alfa 3, beta 3 y
gamma 3 y se sintetiza exclusivamente por las células epiteliales
en forma de un precursor de 460 kDa. En las condiciones
fisiológicas, cada una de las subunidades a3 y gamma 2 experimenta
una escisión postraducción extracelular de los extremos carboxi- y
amino- terminales respectivamente, desembocando en la forma tisular
madura. Estudios recientes indican que la totalidad de la cadena
gamma 2 precursor es necesaria para la secreción en el momento de la
integración de la LN-4 en la MEC.
La función principal de la LN-5
va resaltada por la existencia de patologías hereditarias o
adquiridas, dando como resultado una anomalía de síntesis y/o de
expresión de una de sus subunidades constitutivas. Estas
enfermedades, denominadas epidermolisis bullosa de unión, conducen
especialmente a una fragilidad de la unión dermoepidérmica de la
piel caracterizada por la formación espontánea de burbujas
epidérmicas. La LN-5 desempeña de este modo una
función crucial e irremplazable en la cohesión
epitelio-mesenquimatosa. La LN-5 es
portadora de señales biológicas determinantes puesto que permite la
adherencia de las células epiteliales adyacentes mediante integrinas
e induce el ensamblaje de las estructuras de adherencia estable que
son las hemidesmosomas.
La solicitud de patente internacional WO
00/66731 a nombre de Biostatum describe la producción de
LN-5 entera en forma recombinante en células
eucariotas (L5r) y documenta su actividad para mejorar la
cicatrización, la proliferación y la adherencia celular. Se
describen otros péptidos derivados de la Laminina-5
en el documento US-B1-6294356
(Jones).
Ahora bien, el solicitante ha encontrado, de
manera sorprendente e inesperada, que una cantidad eficaz de un
péptido de secuencia TALRIRATYGEY, secuencia presente en la cadena
gamma 2 de la LN-5, induce de manera específica la
adherencia de los queratinocitos de la epidermis y otras células
epiteliales. Este péptido permite no solamente el aumento de la
adherencia de las células a la MEC sino también el aumento de la
adherencia de las células entre sí. Por su pequeña dimensión y su
gran estabilidad, el péptido presenta todas las características
requeridas para atravesar adecuadamente la epidermis y alcanzar su
objetivo, la JDE e interaccionar con los queratinocitos basales y
transmitir señales de inducción de adherencia. Fragmento de la
LN-5, permitirá la restauración de su homólogo
nativo deficiente o faltante y tendrá una actividad biológica
inmediata de inducción de la adherencia y de restauración de las
propiedades mecánicas de la JDE. Su procedimiento de fabricación
por síntesis química es sencillo y aplicable a escala industrial. No
recurre a la utilización de cultivos de células de origen animal,
ni a factores de crecimiento y/o de sueros o derivados de sueros. De
pequeña dimensión, es poco o nada el objetivo de degradaciones
proteolíticas específicas y/o no específicas.
De este modo, la invención tiene como primer
objeto un péptido que presenta la siguiente secuencia:
TALRIRATYGEY (SEQ ID Nº1).
TALRIRATYGEY (SEQ ID Nº1).
La presente invención tiene también por objeto
otros péptidos que son el resultado de una o varias modificaciones
de SEQ ID Nº1 tales como la adición, supresión o sustitución de uno
o varios aminoácidos, preferiblemente como se indica en la tabla 1,
y/o de una oligomerización, ciclación o del repliegue de SEQ ID Nº1,
entendiéndose que estas modificaciones no disminuyen en nada la
actividad adhesiva del péptido de referencia, y que incluso lo
mejoran.
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\vskip1.000000\baselineskip
Más particularmente, la adición o la retirada de
uno o varios aminoácidos se puede realizar del lado carboxi y/o del
lado amino-terminal de dicho péptido. La invención
tiene también por objeto cualquier análogo o derivado que pudiese
ser el resultado del injerto de un resto de interés (moléculas
naturales o síntesis, proteínas y/o azúcares) sobre dicho péptido.
Tiene también por objeto cualquier fragmento dermatológicamente
activo del péptido de la invención, modificado o no.
El péptido según la presente invención se
caracteriza porque se obtiene por la síntesis química.
La invención también tiene por objeto una
composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un
péptido según la presente invención.
Por "composición farmacéutica", se entiende
cualquier composición dermatológica apta para ser utilizada confines
cosméticos y/o con fines terapéuticos.
Según una realización ventajosa de la invención,
dicho péptido se solubiliza previamente en uno o diversos
disolventes cosmética o farmacéuticamente aceptables tales como el
agua, propilenglicol, butilenglicol, diglicoles etoxilados o
propoxilados, etanol, propanol o isopropanol.
Según otra realización ventajosa de la
invención, dicho péptido se solubiliza previamente en un vector
farmacéutico como los liposomas o se adsorbe en polímeros orgánicos
en polvo, soportes minerales como el talco y la bentonita, y más
generalmente solubilizado en, o fijado en, cualquier vector
farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención contienen entre el 0,00002 y el 5%, de preferencia entre
el 0,00005 y el 0,1%, más preferencialmente aun entre el 0,0001 y el
0,001% en peso del péptido de la invención, al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable y bien conocido(s) por el experto
en la técnica como por ejemplo disolventes, espesantes, diluyentes,
tensioactivos, antioxidantes, colorantes, conservantes, y/o aromas,
en función de la formulación final de la composición del a
invención.
Los inventores han podido mostrar que
cantidades, incluso muy bajas (del orden del 0,00002% en peso del
péptido de la invención en una composición farmacéutica o
cosmética) eran suficientes para obtener la actividad requerida. La
presente invención describe cantidades máximas del 5% en peso del
péptido de la invención en una composición farmacéutica o
cosmética, por razones económicas. Sin embargo, el experto en la
técnica podrá considerar cantidades superiores al 5% y adaptar la
concentración, si fuese necesario a la obtención de una acción al
menos igual, en función del coste y de la pureza del péptido según
la invención.
Más particularmente, la composición según la
presente invención comprende, además, otro principio
dermatológicamente activo que actúa bien sobre el refuerzo de la
unión dermoepidérmica, la adherencia células-matriz
de la piel, y/o la adherencia célula-célula, o bien
de otro modo sobre la piel según la naturaleza del o de los agentes
utilizados tales como un agente hidratante, un agente relipidante,
un agente sobreengrasante, un agente exfoliante, un agente
queratolítico, un agente antioxidante, un agente calmante, y un
agente suavizante, un agente sedativo, un agente limpiador, un
agente desmaquillante, un agente, un agente antibacteriano, un
agente antiséptico, un agente antiseborréico, un agente
descongestionante, un agente revitalizante, un agente activador de
la renovación celular o uno o varios filtros solares.
Preferencialmente, se destina esta composición a
una aplicación tópica.
Las composiciones de la invención se deben
presentar en una forma dermatológicamente aceptable, es decir,
compatible con la piel, el vello y/o el cabello. Estas composiciones
podrán estar especialmente en forma de cremas, leches, emulsiones
aceite en agua, agua en aceite, emulsiones múltiples, soluciones,
suspensiones, geles acuosos, geles aceitosos, geles
hidroalcohólicos, lociones, barras o también polvos, adaptados a una
aplicación sobre la piel, las mucosas y en particular los labios
y/o el cabello.
Se podrán añadir eventuales compuestos
adicionales activos o no a la composición de la invención y el
experto en la técnica los elegirá de manera que su adición no
altere las propiedades ventajosas de dicha composición.
La invención tiene también por objeto la
utilización del péptido según la presente invención para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a reforzar la
unión dermoepidérmica, la adherencia célula-matriz
y/o la adherencia célula-célula al nivel de la
epidermis y favorecer de este modo la reparación de la
epider-
mis.
mis.
Como se ha indicado anteriormente, la alteración
de la epidermis y de la JDE más comúnmente observada es la que
resulta del envejecimiento cutáneo. Sin embargo, otras alteraciones
de la piel pueden intervenir independientemente del envejecimiento
y pueden por ejemplo ser inducidas por algunas patologías
dermatológicas. A título de ejemplo, se pueden citar, el eczema, la
soriasis, el prurito, las dermitis irritativas, la heliodermia, las
queratosis, las micosis, la ictiosis. Además de los síntomas
específicos de cada una de estas patologías, la piel experimenta
alteraciones a las cuales se propone poner remedio la presente
invención a título de complemento terapéutico. Es obvio que la
presente invención no tiene por objetivo el tratamiento de tales
patologías sino la restauración de la JDE dañada y la adherencia
celular en estas patologías.
De este modo la presente invención permite la
reparación, la regeneración y/o la reestructuración de la piel.
La piel también se puede fragilizar mediante
tratamientos cosméticos o terapéuticos de la piel, que a la vez que
tratan la patología específica, generan efectos secundarios sobre la
piel que conviene tratar independientemente de la propia patología.
Es el caso especialmente del acné, de los tratamientos por
puvaterapia, intervenciones quirúrgicas (dermatológicas u otras),
tratamientos de la piel por láser, dermoabrasión, peelings o
tratamientos de cánceres por radioterapia.
Finalmente, la composición de la invención se
destina también al tratamiento curativo y preventivo no sólo del
envejecimiento cutáneo anteriormente mencionado, tal como las
arrugas, el relajamiento, la pérdida de elasticidad y la
cicatrización menos buena sino también al tratamiento curativo o
preventivo de la xerosis senil, modificaciones del sistema
pigmentario de la piel, empobrecimiento de la red vascular de la
piel, alteración de los faneros, irregularidad del grano de piel y
atrofia cutánea.
En efecto, dichas patologías, fragilizaciones de
la piel y tratamientos diversos generan sobre la piel alteraciones
tales como la disminución de la adherencia de la epidermis y de la
cohesión epidérmica, o también una reestructuración menos buena de
la superficie cutánea.
La invención se refiere finalmente a un
procedimiento de tratamiento cosmético de la piel caracterizado
porque se aplica sobre la piel una composición cosmética que
comprende al menos un péptido según la invención. Dicha composición
cosmética según la invención contiene entre el 0,00002 y el 5%, de
preferencia entre el 0,00005% y el 0,1% y más preferencialmente
entre el 0,001% y el 0,001% en peso de péptido y al menos un
excipiente cosméticamente aceptable.
Según la invención, dicha composición cosmética
también puede comprender al menos otro principio cosméticamente
activo.
Según la presente invención, dicha composición
cosmética se presenta en forma de crema, lecha, emulsión aceite en
agua, emulsión agua en aceite, emulsión múltiple, solución,
suspensión, gel acuoso, gel aceitoso, gel hidroalcohólico, loción,
barra o en polvo.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán en la descripción de los ejemplos dados a título
ilustrativo y no limitativo.
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Figura
1
Figura
2
La adherencia celular dosis dependiente de las
células de la línea HBL100 a los diferentes péptidos 1, 2 y 3. Los
péptidos se han inmovilizado sobre placas de 96 pocillos a las
concentraciones indicadas en la abscisa. Se han depositado
8.10^{4} células en cada pocillo y las placas se han incubado a
37ºC durante 1 hora. Después de diversos lavados, las células
adheridas se han fijado y la adherencia celular se ha medido como se
describe en la parte metodológica. Las células se han observado con
microscopia de contraste de fase y a continuación se han
fotografiado. Barra = 50 \mum.
Figura
3
Adherencia celular dosis dependiente de las
células de la línea HT1080 a los diferentes péptidos 1, 2 y 3. Los
péptidos 1, 2 y 3 se han inmovilizado sobre placas de 96 pocillos a
las concentraciones indicadas en la abscisa. Se han depositado
8.10^{4} células en cada pocillo y las placas se han incubado a
37ºC durante 1 hora. Después de diversos lavados, las células
adheridas se han fijado y la adherencia celular se ha medido como
se describe en la parte metodológica. Las células se han observado
con microscopia de contraste de fase y a continuación se han
fotografiado. Barra = 50 \mum.
Figura
4
Adherencia celular dosis dependiente de las
células de la línea A431 a los diferentes péptidos 1, 2 y 3. Los
péptidos 1, 2 y 3 se han inmovilizado sobre placas de 96 pocillos a
las concentraciones indicadas en la abscisa. Se han depositado
8.10^{4} células en cada pocillo y las placas se han incubado a
37ºC durante 1 hora. Después de diversos lavados, las células
adheridas se han fijado y la adherencia celular se ha medido como se
describe en la parte metodológica. Las células se han observado con
microscopia de contraste de fase y a continuación se han
fotografiado. Barra = 50 \mum.
Figura
5
Adherencia celular dosis dependiente de los
queratinocitos humanos normales a los diferentes péptidos 1, 2 y 3.
Los péptidos 1, 2 y 3 se han inmovilizado sobre placas de 96
pocillos a las concentraciones indicadas en la abscisa. Se han
depositado 10^{5} células en cada pocillo y las placas se han
incubado a 37ºC durante 1 hora. Después de diversos lavados, las
células adheridas se han fijado y la adherencia celular se ha medido
como se describe en la parte metodológica. Las células se han
observado con microscopia de contraste de fase y a continuación se
han fotografiado. Barra = 50 \mum.
Figura
6
Adherencia celular dosis dependiente de
NHK-10 años contra NHK-17 años (A) y
de NHK-11 años contra NHK-60 años
(B) al péptido TALRIRATYGEY. Los péptidos se han inmovilizado sobre
placas de 96 pocillos a las cantidades indicadas en la abscisa. Se
han depositado 3,5.10^{4} células (A) y 4,3.10^{4} células (B)
en cada pocillo y las placas se han incubado a 37ºC durante 1 hora.
Después de diversos lavados, las células adheridas se han fijado y
la adherencia celular se ha medido como se describe en la parte
metodológica. (C) Las células se han observado con microscopia de
contraste de fase y a continuación se han fotografiado. Barra =
50 \mum.
\newpage
Figura
7
Las células HT1080 (A) y las células HBL100 (B)
se cultivaron en placas de 96 pocillos a razón de 10.000 células
por pocillo. Después de 24 horas, los medios de cultivo se retiraron
y se sustituyeron por medio sin suero que contienen las cantidades
de péptido indicadas en las gráficas y el reactivo XTT. A
continuación, las placas se colocaron en una incubadora a 37ºC y se
efectuaron lecturas de la absorbencia a 1 hora, 2 horas 3 horas, 4
horas y 5 horas. Se realizaron muestras pilotos sin péptido en la
misma placa.
Figura
8
Las células A431 se cultivaron en placas de 96
pocillos a razón de 10.000 células por pocillo. Después de 24
horas, los medios de cultivo se retiraron y se sustituyeron por
medio sin suero que contienen las cantidades de péptido indicadas
en las gráficas y el reactivo XTT. A continuación, las placas se
colocaron en una incubadora a 37ºC y se efectuaron lecturas de la
absorbencia a 1 hora, 2 horas 3 horas, 4 horas y 5 horas. Se
realizaron muestras pilotos sin péptido en la misma placa.
Figura
9
Las NHK-10 años y
NHK-71 años se cultivaron en placas de 96 pocillos a
razón de 10.000 células por pocillo. Después de 24 horas, los
medios de cultivo se retiraron y se sustituyeron por medio sin suero
que contienen las cantidades de péptido indicadas en las gráficas y
el reactivo XTT. A continuación, las placas se colocaron en una
incubadora a 37ºC y se efectuaron lecturas de la absorbencia a 1
hora, 2 horas 3 horas, 4 horas y 5 horas. Se realizaron muestras
pilotos sin péptido en la misma placa.
Figura
10
Las NHK se cultivaron en placas de 96 pocillos a
razón de 10.000 células por pocillo. Después de 24 horas, los
medios de cultivo se retiraron y se sustituyeron por medio
KBM-2 que contienen las cantidades de péptido
indicadas. Después de 24 horas de contacto a 37ºC, se sustituyeron
los medios por el reactivo XTT. A continuación, las placas se
colocaron en una incubadora a 37ºC y se efectuaron lecturas de la
absorbencia a las 3 horas. Se realizaron muestras pilotos sin
péptido en la misma placa.
Figura
11
Las NHK se cultivaron en placas de 12 pocillos a
razón de 5.000 células por pocillo. Después de 24 horas de cultivo,
los medios de cultivo se retiraron y se sustituyeron por un medio
nuevo que contiene las cantidades de péptido 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6%
y 0,3% (B-F). Se realizó una muestra piloto sin
péptido (A). La placa se colocó a continuación en una incubadora a
37ºC durante 48 horas. La observación se llevó a cabo con un
microscopio Axiovert 40 Zeiss. Barra, 50 \mum.
Figura
12
Observación con mayor aumento, de las colonias
celulares descritas en la figura 6. La observación se realizó con
microscopio Axiovert 40 Zeiss equipado con un bloque diferencial
PlasDic. Barra, 50 \mum.
Figura
13
(A) Representación esquemática de la laminina 5
y del colágeno IV en la unión dermoepidérmica. (B) Adherencia
celular dosis dependiente de NHK a la laminina 5 y al colágeno IV.
La laminina 5 y el colágeno IV se inmovilizaron sobre placas de 96
pocillos a las cantidades indicadas en la abscisa. Se depositaron
5.10^{4} NHK en cada pocillo y las placas se incubaron a 37ºC
durante 1 hora. Después de diversos lavados, las células adheridas
se fijaron y la adherencia celular se midió como se describe en la
parte metodológica. (C) Las células se observaron con microscopia
de contraste de fase y a continuación se fotografiaron. Barra =
50 \mum.
\newpage
Figura
14
Los péptidos 1, 2 y 3 (cantidades variables
indicadas) y la laminina 5 (cantidad fija 0,2 mg) se coinmovilizaron
sobre placas de 96 pocillo. Se depositaron 5.10^{4} NHK en cada
pocillo y las placas se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Después de
diversos lavados, las células adheridas se fijaron y la adherencia
celular se midió como se describe en la parte metodológica. La
adherencia celular en presencia del péptido se presenta en
porcentaje de la adherencia celular obtenida a la laminina 5 sola.
Las células se observaron con microscopia de contraste de fase y a
continuación se fotografiaron. Barra = 50 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
15
Los péptidos 1, 2 y 3 (cantidades variables
indicadas) y el colágeno IV (cantidad fija 0,06 mg) se
co-inmovilizaron sobre placas de 96 pocillo. Se
depositaron 5.10^{4} NHK en cada pocillo y las placas se incubaron
a 37ºC durante 1 hora. Después de diversos lavados, las células
adheridas se fijaron y la adherencia celular se midió como se
describe en la parte metodológica. La adherencia celular en
presencia del péptido se presenta en porcentaje de la adherencia
celular obtenida al colágeno IV solo. Las células se observaron con
microscopia de contraste de fase y a continuación se fotografiaron.
Barra = 50 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
16
Los péptidos (cantidades variables indicadas) y
la laminina 5 (cantidad fija 0,2 mg) se
co-inmovilizaron sobre placas de 96 pocillo. Se
depositaron 3.10^{4} NHK-8 años y 3.10^{4}
NHK-63 años en cada pocillo y las placas se
incubaron a 37ºC durante 1 hora. Después de diversos lavados, las
células adheridas se fijaron y la adherencia celular se midió como
se describe en la parte metodológica. La adherencia celular en
presencia del péptido se presenta en porcentaje de la adherencia
celular obtenida a la laminina 5 sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
17
Tabla recapitulativa de las dosificaciones de
péptido TALRIRATYGEY no inmovilizado sobre placas de 96
pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
18
Tabla recapitulativa de las dosificaciones de
péptido TALRIRATYGEY no inmovilizado sobre placas de 96
pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
19
Adherencia celular dosis dependiente de las
células HT 1080 al péptido TALRIRATYGEY. Los péptidos se han
inmovilizado sobre placas de 96 pocillos a las cantidades indicadas
en la abscisa. Se han depositado 8.10^{4} células y 15.10^{4}
células en cada pocillo y las placas se han incubado a 37ºC durante
1 hora. Después de diversos lavados, las células adheridas se han
fijado y la adherencia celular se ha medido como se describe en la
parte metodológica. Las células se han observado con microscopia de
contraste de fase y a continuación se han fotografiado. Barra =
50 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
20
Adherencia celular dosis dependiente de las
células HT 1080 al péptido TALRIRATYGEY. Los péptidos se han
inmovilizado sobre placas de 96 pocillos a las cantidades indicadas
en la abscisa. Se han depositado 8.10^{4} células y 15.10^{4}
células en cada pocillo y las placas se han incubado a 37ºC durante
1 hora. Después de diversos lavados, las células adheridas se han
fijado y la adherencia celular se ha medido como se describe en la
parte metodológica. Los valores de las absorbencias a 570 nm se han
indicado en la tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se efectuaron experimentos de adherencia celular
sobre 3 péptidos con células comúnmente utilizadas para los
estudios de adherencia celular como las HT1080 (fibrosarcoma
humano), la HBL100 (epitelio mamario humano) y las A431
(epitelioides de piel) con el fin de probar la especificidad de
adherencia del péptido de la invención.
Además del péptido de la invención (péptido 1),
se sintetizaron dos otros péptidos (péptidos 2 y 3, correspondientes
cada uno a una secuencia de la cadena gamma 2 y de la laminina 5,
ambas diferentes de la secuencia del péptido de la invención) y se
utilizaron como control durante los experimentos de adherencia
celular.
Los péptidos 1 y 2 se sitúan al nivel del
extremo amino-terminal en la región denominada
"brazo corto" de la cadena gamma 2 (figura 1). El brazo corto
de las lamininas comprende secuencias pobres en cisteinas replegadas
en un dominio globular (el dominio L4m). Este dominio va rodeado
por repeticiones ricas en cisteinas dispuestas en bastoncillos (los
dominios LE, 3 dominios LE de cada lado). Estos últimos se componen
de un resto de 50 aminoácidos que presenta una homología con el
factor de crecimiento epidérmico (dominio tipo EGF). El péptido 3
se eligió al nivel del extremo carboxi-terminal. Los
dominios carboxi-terminales I y II se implican en el
ensamblaje de las tres cadenas alfa, beta y gamma y forman una
hélice alfa súper enrollada que forma el brazo largo de la
laminina. La secuencia de interés se localiza en el dominio globular
L4m.
A lo largo de los experimentos de adherencia
celular, se efectuaron efectos dosis-respuestas y se
analizó el fenotipos de las células adheridas con microscopia de
contraste de fase (fotografías).
\vskip1.000000\baselineskip
Número de aminoácidos: 12
Peso molecular: 1413,6
Punto isoeléctrico teórico: 8,25
\vskip1.000000\baselineskip
Composición en aminoácido:
Número total de residuos cargados negativamente
(Asp + Glu): 1
Número total de residuos cargados positivamente
(Arg + Lys): 2
\newpage
Composición atómica:
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula: C63H100B18O19
Número total de átomos: 200
\vskip1.000000\baselineskip
Coeficiente de extinción:
\vskip1.000000\baselineskip
Semivida estimada:
El N-terminal de la secuencia
considerada es T (Thr).
La semivida estimada es: 7,2 horas
(reticulocitos de mamíferos, in vitro).
\vskip1.000000\baselineskip
>20 horas (levaduras, in vivo).
>10 HORAS (Escherichia coli, in
vivo)
\vskip1.000000\baselineskip
Índice de inestabilidad:
El índice de inestabilidad se calculó a
11,86.
Esto clasifica la proteína como estable.
Índice alifático: 81,67
Media de hidropatía: -0,417
\newpage
La síntesis peptídica se efectuó sobre un
Sintetizador Miligen 9050 utilizando una química
Fmoc-Opfp/Hobt. el péptido se analizó a
continuación y se purificó en una columna Vydac C 18 (5 \mum) de
4,6 o 10 mm de diámetro y 250 mm de longitud y a continuación se
caracterizó por espectrometría de masa electrospray en un SCIEX API
165.
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 1: TALRIRATYGEY (SEQ Nº 1)
Posición 344-355 (figura 1)
Péptido 2: GLTKTYTFRLNE (SEQ ID Nº 2)
Posición 309-321 (figura 1)
Péptido 3: DVKNLENIRDNL (SEQ ID Nº 3)
Posición 1169-1180 (Figura
1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan los péptidos 1, 2 y 3 a lo largo de
los experimentos de adherencia celular. Se realiza una gama de 7
concentraciones decrecientes (100 microgramos/ml; 50 microgramos/ml;
25 microgramos/ml; 12,5 microgramos/ml; 6,25 microgramos/ml; 3,125
microgramos/ml y 1,563 microgramos/ml) por dilución sucesiva en PBS
(Solución salina de tampón fosfato, KH_{2}PO_{4} 1,54 mM;
Na_{2}HPO_{4}, 1,42 mM; NaCl 131 mM) a partir de una solución
de partida a 1 mg/ml. Estas soluciones se distribuyeron
inmediatamente sobre placas de cultivo de 96 pocillos (Greinher,
Dutscher, Brumath, Francia) a razón de 100 \mul por pocillo. Las
placas se dispusieron a continuación a +4ºC durante 16 a 18 horas.
Las soluciones se retiraron a continuación por volteo de las placas
y cada pocillo se saturó mediante una solución de
PBS-SAB al 1% (suero de albúmina bovina). Tres
pocillos adicionales sin sustrato experimentaron el mismo
tratamiento y sirvieron de blanco.
Las células epiteliales se separaron de las
cajas de cultivo por una solución de tripsina/EDTA
(0,05-0,02%), y a continuación se suspendieron en un
medio DMEM sin aditivos para las líneas celulares y
KBM-2 sin aditivo para los queratinocitos humanos.
El número de células cultivadas por pocillo se indica en las
leyendas de las gráficas (50.000 a 100.000 células por
pocillo).
Después del cultivo de las células, las placas
multipocillos se dispusieron en una incubadora a 37ºC en atmósfera
de CO_{2} al 5%. Después de una incubación de 30 a 60 minutos, se
observaron las células al microscopio de contraste de fase con el
fin de verificar que el ensayo se desarrolló correctamente. Se
eliminó entonces el medio de adherencia y se lavó cada pocillo con
una solución de PBS estéril con el fin de eliminar las células que
no se hubiesen adherido. Las células restantes, adherentes al
sustrato, se fijan a continuación con la ayuda de una solución de
glutaraldehído al 1% en PBS, durante 15 minutos. Se retiró la
solución de glutaraldehído y se colorearon entonces las células con
una solución de cristal violeta diluido al 1% en agua destilada
durante 30 minutos.
Después de diversos aclarados con agua, se
permeabilizaron las células mediante una solución de tritón al
0,02% durante 15 minutos, con el fin de solubilizar el cristal
violeta. La lectura de la absorbencia se efectuó a 570 nm, con la
ayuda de un lector de placas ELISA Reader (MR500, Dynatech, Guernsey
Channel, Islandia). Cada punto experimental se realizó en tres
ejemplares. el valor del blanco representa la media de la
absorbencia de los 3 pocillos testigos (SAB). Éste se sustrajo de
cada uno de los valores de densidad óptica obtenidos para los
puntos experimentales. A continuación se calcularon las medias de
los tres valores de absorbencia para cada una de los
triplicados.
Los resultados se representaron en forma de
curva, estando en la ordenada, los valores de la absorbencia y en
la abscisa, las diferentes concentraciones en sustrato. Las células
adheridas se fotografiaron por microscopía de contraste de
fase.
En un primer momento se utilizaron las
siguientes células procedentes de las líneas epiteliales
(habitualmente utilizadas para los estudios preliminares de
adherencia celular):
- -
- las células de la línea HT1080 (fibrosarcoma humano), American Type culture collection CCL-121.
- -
- las células de la línea HBL100 (epitelio mamario humano), American Type Culture Collection HTB-124.
- -
- las células de la línea A431 (epiteloides de piel), American Type Culture Collection CRL-1555.
Estas células se mantuvieron en cultivo en un
medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% y 2 mM de
glutamina y se cultivaron a 37ºC en una incubadora con CO_{2} (5%
de CO_{2}, 95% de aire y 98% de humedad).
En un segundo momento se utilizaron
queratinocitos humanos normales. en efecto, al estar los
queratinocitos basales de la epidermis en contacto directo con la
LN-5 en la piel, era necesario ensayar su capacidad
de adherencia sobre el péptido de interés. Los queratinocitos
humanos se obtuvieron a partir de biopsia de prepucio (desecho
operatorio, Pabellón T-bis Hospital Edouard
Herriot). El medio de cultivo utilizado a lo largo de nuestro
trabajo fue el medio definido para el cultivo de queratinocitos
KBM-2 (que contiene: Extracto pituitario bovino 35
mg. hEGF 10 ng/ml, insulina 5 \mug/ml, Hidrocortisona 0,5 \mug
(ml, transferrina 0,1%, epinefrina 0,1%) fabricado por Clonetics y
comercializado por Cambrex (Bélgica) que contiene 0,15 mM de
CaCl_{2}, pH 7,2 a 7,4.
Los queratinocitos se obtuvieron según la
técnica descrita por Boyce y Ham (Cultivation, frozen storage, and
clonal growth of normal human epidermal heratinocytes in serum
free-media, tiss Cult. Meth. 1985,9:
83-93). Los trozos de piel, después de un aclarado
cuidadoso en tampón PBS que contiene antibióticos, se eliminan del
tejido graso situado bajo la dermis con la ayuda de instrumentos
estériles. La piel se corto a continuación en trozos de 3 mm^{2},
los cuales se dispusieron en una solución estéril de tripsina al
0,25% en PBS durante 16 horas a 4ºC. La separación dermis/epidermis
se efectuó con la ayuda de pinzas finas en una caja de Petri que
contenía un medio de cultivo para detener la acción enzimática de la
tripsina. Los fragmentos de epidermis se aspiraron y se descargaron
varias veces con una pipeta para separar las células basales libres.
La suspensión celular obtenido de este modo se centrifugó durante 5
minutos a 1.000 rpm y el resto así obtenido se suspendió en un
volumen conocido de KBM-2 para efectuar un recuento
de las células vivas con la ayuda de un colorante de exclusión:
azul triptano. se cultivaron 3.10^{4} células vivas por cm^{2}
encajas para cultivos de tejidos de 25 cm^{2} (Corning, Polylabo,
Francia). Se cultivaron los queratinocitos a 37ºC en una incubadora
de CO_{2} (5% de CO_{2}, 95% de aire y 98% de humedad). El medio
se cambio cada dos días. El subcultivo tuvo lugar cuando las
células alcanzaron la subconfluencia. El tapiz celular se aclaró
entonces con PBS, y a continuación se cubrió con una solución de
tripsina-EDTA (0,05-0,02%). Después
de una breve incubación a 37ºC, las células se separaron del
soporte plástico. Las células se cultivaron entonces en cajas de
cultivo de 75 cm^{2}. La congelación de las células (3 a 5
millones por ampolla) se realizó en el medio de cultivo utilizado,
en presencia de dimetilsulfoxido (DMSO) y suero bovino al 10% en un
volumen de 1 ml.
Los experimentos de adherencia celular
presentados en las figuras 1 a 5 se efectuaron con las siguientes
cantidades de péptidos inmovilizadas: 0; 0,15; 0,31; 0,62; 1,25;
2,5; 5 y 10 microgramos. Se ensayaron dos lotes diferentes del
péptido 1 en paralelo. Los péptidos 2 y 3 son péptidos de control;
se eligió voluntariamente el péptido 2 en una región cercana al
péptido 1 en el dominio 4 de la cadena gamma 2 y el péptido 3 en una
región alejada. El péptido 1 (péptido de la invención) induce la
adherencia celular de las diferentes líneas epiteliales ensayadas:
HBL100 (figura 2), HT1080 (figura 3) y A431 (figura 4) de manera
creciente en función de la cantidad de péptido inmovilizado que
varía de 0 a 10 microgramos. Este efecto se obtiene también con las
células de la epidermis: los queratinocitos humanos normales
(figura 5). Las células se anclan firmemente sobre el péptido puesto
que han resistido a los diferentes lavados anteriores a su
fijación. Los otros dos péptidos (péptido 2 y 3), elegidos al azar
en la misma proteína, no inducen ninguna adherencia sea cual sea la
cantidad inmovilizada. La adherencia de los queratinocitos humanos
normales es inducida para una cantidad de péptido 1 inmovilizada de
0,15 microgramos y la adherencia máxima se alcanza para una
cantidad de péptido 1 inmovilizada de 0,62 microgramos (figura 5).
La adherencia de las células HBL100 es inducida para una cantidad de
péptido 1 inmovilizada de 0,31 microgramos y la adherencia máxima
se alcanza para una cantidad de péptido 1 inmovilizada de 0,125
microgramos (figura 2). Las adherencia de las células HT1080 se
induce para una cantidad de péptido 1 inmovilizada de 0,15
microgramos y la adherencia máxima se alcanza para una cantidad de
péptido 1 inmovilizada de 0,15 microgramos (figura 3). La
adherencia de las células A431 se induce para una cantidad de
péptido 1 inmovilizada de 0,62 microgramos y la adherencia máxima
se alcanza para una cantidad de péptido 1 inmovilizada de 1,2
microgramos.
Las fotografías obtenidas por microscopía de
contraste de fase confirman los resultados cuantitativos y
confirman la ausencia de células adheridas a los péptidos de
control 2 y 3. Las células adheridas al péptido TALRIRATYGEY
(péptido de la invención) presentan mayoritariamente una morfología
redondeada con frecuentes agrupaciones celulares (figuras 2, 3, 4 y
5). Estas agrupaciones pueden ser el signo de la instauración de
interacciones células-células. Se observa también
la presencia de alargamientos celulares que son los más visibles en
el caso de las HBL100 (figura 2), las HT1080 (figura 3) y los
queratinocitos humanos normales (figura 5). Se les ve difícilmente
en el caso de A431, ya que las células son más pequeñas. Estos
alargamientos celulares pueden ser el signo de una redisposición
del citoesqueleto de la célula en respuesta a la adherencia al
péptido. Los resultados se confirmaron con los queratinocitos
humanos normales (células de la epidermis, figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
aº) Las líneas y queratinocitos humanos normales
(véase ejemplo 1)
bº) Obtención y cultivo de los queratinocitos
jóvenes y mayores
Para obtener queratinocitos procedentes de
biopsias de sujetos muy jóvenes y de sujetos mayores, tomados en el
mismo sitio anatómico, los inventores efectuaron el estudio sobre
biopsias cutáneas de la cara. La zona de la cara situada detrás de
las orejas se eligió con el fin de no estudiar más que el
envejecimiento intrínseco y liberarse de los efectos provocados por
el envejecimiento fotoinducido. Se recogieron desechos operatorios
procedentes de operaciones de cirugía estética (por ejemplo lifting)
en sujetos de edad avanzada y desechos operatorios procedentes de
las intervenciones sobre orejas despegadas en jóvenes. Era
primordial disponer de las biopsias el mismo día de la intervención
para cultivar rápidamente, los queratinocitos de la epidermis. Para
este estudio, se utilizaron las células de biopsias de sujetos
mayores (60, 63 y 71) años y de sujetos jóvenes (8, 10 y 11 años).
Los queratinocitos se obtuvieron según la técnica descrita por Boyce
y Ham, 1985. Los trozos de piel, después de aclarado cuidado en
tampón PBS que contienen antibióticos, se liberaron del tejido
graso situados bajo la dermis con la ayuda de instrumentos
estériles. La piel se corto a continuación en trozos de 3 mm^{2},
los cuales se dispusieron en una solución estéril de tripsina al
0,25% en PBS durante 16 horas a 4ºC. La separación dermis/epidermis
se efectuó con la ayuda de pinzas finas en una caja de Petri que
contiene medio de cultivo para detener la acción enzimática de la
tripsina. Los fragmentos de epidermis se aspiraron y se descargaron
varias veces con una pipeta para separar las células basales libres.
La suspensión celular obtenida de este modo se centrifugó durante 5
minutos a 1.000 revoluciones por minuto y el resto así obtenido se
suspendió en un volumen conocido de medio KBM-2 para
efectuar un recuento de las células vivas con la ayuda de un
colorante de exclusión: el azul tripano 3.10^{4} células vivas se
cultivaron por cm^{2} sobre cajas para cultivo de tejidos de 25
cm^{2} (Corning, Polylabo, Francia). Los queratinocitos se
cultivaron a 37ºC en una incubadora de CO_{2} (5% de CO_{2},
95% de aire y 98% de humedad). El medio se cambió todos los días.
el subcultivo tuvo lugar cuando las células se alcanzaron la
subconfluencia. el tapiz celular se aclaró entonces con PBS, y a
continuación se cubrió con una solución de
Tripsina-EDTA (0,05-0,02%). Después
de una corta incubación a 37ºC, las células se separaron del soporte
plástico. Las células se cultivaron entonces en cajas de cultivo de
75 cm^{2}. La congelación de las células (3 a 5 millones por
ampolla) se realizó en el medio utilizado, en presencia de
dimetilsulfóxido al 10% (DMSO) y suero bovino al 20% bajo un volumen
de 1 ml. Durante la descongelación, las células se cultivaron a
razón de 10.000 células/cm^{2}.
Una gama de 7 cantidades decrecientes de péptido
TALRIRATYGEY se realizó por dilución sucesiva en PBS (Solución
Salina de Tampón Fosfato, KH_{2}PO_{4} 1,54 mM;
Na_{2}HPO_{4}, 1,42 mM; NaCl 131 mM) a partir de una solución
de del péptido a 1 mg/ml. Estas soluciones se distribuyeron
inmediatamente sobre placas de cultivo de 96 pocillos (Greinher,
Dutscher, Brumath, Francia) a razón de 100 \mul por pocillo. Las
placas se dispusieron a continuación a +4ºC durante 16 a 18 horas.
Las soluciones se retiraron a continuación por volteo de las placas
y cada pocillo se saturó mediante una solución de
PBS-SAB al 1% (suero de albúmina bovina). Tres
pocillos adicionales sin sustrato experimentaron el mismo
tratamiento y sirvieron de blanco.
Los queratinocitos procedentes de sujetos
jóvenes o mayores se separaron de las cajas de cultivo por una
solución de tripsina/EDTA (0,05-0,02%), y a
continuación se suspendieron en un medio KBM-2. El
número de células cultivadas por pocillo se indica en las leyendas
de las gráficas. el mismo número de células jóvenes/mayores se
utiliza a lo largo de los experimentos comparativos.
Después del cultivo Después del cultivo de las
células, las placas multipocillos se dispusieron en una incubadora
a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%. Después de una incubación de
30 a 60 minutos, se observaron las células al microscopio de
contraste de fase con el fin de verificar que el ensayo se
desarrolló correctamente. Se eliminó entonces el medio de
adherencia y se lavó cada pocillo con una solución de PBS estéril
con el fin de eliminar las células que no se hubiesen adherido. Las
células restantes, adherentes al sustrato, se fijan a continuación
con la ayuda de una solución de glutaraldehído al 1% en PBS, durante
15 minutos. Se retiró la solución de glutaraldehído y se colorearon
entonces las células con una solución de cristal violeta diluido al
1% en agua destilada durante 30 minutos. Después de importantes
aclarados con agua, se permeabilizaron las células mediante una
solución de tritón al 0,02% durante 15 minutos, con el fin de
solubilizar el cristal violeta. La lectura de la absorbencia se
efectuó a 570 nm, con la ayuda de un lector de placas
ELISA-Reader (MR500, Dynatech, Guernsey Channel,
Islandia). Cada punto experimental se realizó en tres ejemplares. El
valor del blanco representa la media de la absorbencia de los 3
pocillos testigos (SAB). Éste se sustrajo de cada uno de los
valores de densidad óptica obtenidos para los puntos experimentales.
A continuación se calcularon las medias de los tres valores de
absorbencia para cada una de los triplicados.
Los resultados se representaron en forma de
curva, estando en la ordenada, los valores de la absorbencia y en
la abscisa, las diferentes concentraciones en sustrato. Las células
adheridas se fotografiaron por microscopía de contraste de
fase.
Sabiendo que el envejecimiento cutánea se
caracteriza por una deficiencia de las interacciones
células-matriz extracelular, era necesario
verificar la capacidad de los queratinocitos procedentes de sujetos
mayores para poder adherirse al péptido de interés. Se efectuaron
dos experimentos comparativos de adherencia celular
"NHK-jóvenes contra NHK mayores" al péptido
TALRIRATYGEY (figura 6). Los experimentos se realizaron con las
cantidades de péptido; 0, 0,08; 0,15; 0, 30; 0,6; 1,25; 2,50 y 5
microgramos depositados por pocillo. Para cada uno de estos dos
experimentos, el número de NHK-jóvenes y
NHK-mayores fue idéntico a para poder comparar el
resultado obtenido. Se efectuó un experimento con queratinocitos
procedentes de una biopsia cutánea de un niño de 10 años y de los
de un adulto de 71 años (figura 6A), el otro experimento se efectuó
con queratinocitos procedentes de una biopsia cutánea de un niño de
11 años y de los de un adulto de 60 años (figura 6B). El péptido
TALRIRATYGEY induce la adhesión celular de las
NHK-jóvenes y de las NHK-mayores de
manera dosis dependiente. Se constata, en los dos experimentos, que
un mayor número de NHK-jóvenes (aproximadamente 2
veces más) se adhirieron respecto de las
NHK-mayores. Este resultado indica que el receptor
celular que reconoce el péptido TALRIRATYGEY podría disminuir con
la edad. El punto interesante es que se expresa siempre de manera
significativa y que es funcional puesto que el efecto
dosis-respuesta del péptido respecto de las
NHK-mayores es idéntico al efecto dosis obtenido
con las NHK-jóvenes. Las fotos obtenidas en
microscopía de contraste de fase confirman los resultados
cuantitativos. Los NHK-jóvenes adheridos al péptido
TALRIRATYGEY presentan mayoritariamente una morfología redondeada
con frecuentes agrupaciones celulares (como se describe en el
ejemplo 1), se observan menos células en el caso de las
NHK-mayores. La adherencia de las
NHK-jóvenes se induce para la cantidad de péptido
depositada 0,08 \mug y la de las NHK-mayores para
una cantidad depositada que varía entre 0,08 y 0,15 \mug. La placa
de adherencia se alcanza en la horquilla de 0,3 a 0,6 microgramos
de péptido depositado por pocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
aº) Las líneas y queratinocitos humanos normales
(véase ejemplo 1)
bº) Obtención y cultivo de los queratinocitos
jóvenes y mayores (véase ejemplo 2)
El efecto del péptido sobre la proliferación
celular se analizó con la ayuda de un ensayo colrimétrico (Cell
Proliferation Kit XTT, Roche diagnostics, Meylan, Francia) sobre las
células utilizadas para los ensayos de adherencia celular, a saber:
las células HT1080, A431, HBL 100 y los queratinocitos humanos
normales procedentes de sujetos jóvenes y de sujetos mayores.
La reacción química del ensayo se basa en la
producción de NADPH de las células vivas que permite la reducción
de las sales de tetrazolio XTT amarillos en sales de formazan
naranja. La medición de la absorbencia se efectuó a 490 nm con la
ayuda de un lector de placas ELISA-Reader. Las
células se cultivaron en placas de 96 pocillos a razón de 10.000
células por pocillo (6 pocillos/condición) en medio de cultivo
KBM-2. Después de 24 horas de cultivo a 37ºC en
presencia de CO_{2} al 5%, los medios de cultivo se eliminaron y
se sustituyeron por medio sin suero que contiene las cantidades de
péptido indicadas en las gráficas y el reactivo del ensayo. Las
placas se depositaron a continuación en una incubadora a 37ºC y se
efectuaron lecturas de la absorbencia a 1 h, 2 h, 3 h, 4 h y 5
horas. Se realizaron muestras pilotos sin péptido en la misma placa.
Los resultados se presentaron en dos formas:
- -
- en forma de curva que muestra la evolución de la absorbencia en función del tiempo
- -
- o en forma del porcentaje de la viabilidad de las células puestas en presencia del péptido respecto de las muestras piloto sin péptido. en este caso, se calculó la viabilidad celular según la fórmula
% de viabilidad
= (Ausencia células con péptido/ausencia células piloto) x
100.
Los queratinocitos se cultivaron en placas de 12
(Costar) a razón de 5.000 células por pocillo en medio
KBM-2. Después de 24 horas de cultivo 37ºC en
presencia de CO_{2} al 5%, los medios de cultivo se retiraron y se
sustituyeron por medio KBM-2 que contiene las
cantidades de péptido indicadas en las figuras (se efectuó un
control sin péptido). Después de 24 horas de cultivo, se añadió la
misma cantidad de péptido al medio de cultivo y el experimento se
detuvo después de 24 horas suplementarias de cultivo. El análisis
microscópico se efectuó sin fijación previa con un microscopio
Axiover 40 Zeiss acoplado a una cámara Coolsnap (Roper Scientific,
Evry, Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de analizar el efecto del
péptido TALRIRATYGEY sobre la proliferación celular los inventores
en un primer tiempo analizaron el efecto de 2 concentraciones
diferentes 0,5 y 1% sobre las células HT1080, HBL100 y A431
(figuras 7, 8 y 9). Las células se cultivaron en placas de 96
pocillos a razón de 10.000 células por pocillo. Después de 24
horas, los medios de cultivo se retiraron y se sustituyeron por
medio sin suero que contiene las cantidades de péptido indicadas en
las gráficas y el reactivo del ensayo. A continuación, las placas
se colocaron en una incubadora a 37ºC y se efectuaron lecturas de la
absorbencia a 1 hora, 2 horas 3 horas, 4 horas y 5 horas. Se
realizaron muestras pilotos en la misma placa. Se observó un aumento
moderado pero regular de la proliferación de las células de la
línea HT1080 (figura 7A), de la línea HBL100 (figura 7B) y de la
línea A431 (Figura 8) a lo largo del tiempo para alcanzar a la
Sénima hora un aumento medio del 8% respecto del control. Se
ensayaron tiempos más largos y no mostraron efecto más pronunciado.
No se observó ninguna diferencia entre las dos concentraciones de
péptido ensayadas cualquiera que fuese el tipo celular ensayado. El
ensayo se realizó a continuación con NHK-jóvenes y
NHK-mayores (figura 9). Las cantidades de péptido
añadidas se redujeron (0,05% y 0,1) con el objetivo de realizar el
ensayo en una gama de concentraciones más cercana a las condiciones
de utilización del péptido a lo largo de los ensayos de adherencia.
De nuevo, se observó un aumento moderado y regular de la
proliferación para alcanzar a la 5ésima hora un aumento medio que
no sobrepasa el 7% respecto del control. No se observó ninguna
diferencia, ni entre las dos concentraciones utilizadas, ni en
función de la edad de las células. Se efectuó una última serie de
experimentos con los NHK sobre una gama más amplia de
concentraciones del péptido y sobre un tiempo más largo (24 horas)
(figura 10). Los resultados se presentaron en forma del porcentaje
de la viabilidad de las células puestas en presencia del péptido
durante 24 horas respecto de las muestras piloto sin péptido. En
este experimento, se observa un aumento de la proliferación celular
que varía entre el 6 y el 13% en función de la concentración del
péptido añadida (0,004% al 0,37%).
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido TALRIRATYGEY induce la adherencia
celular cuando se fija a las placas de 96 pocillos (Ejemplos 1 y
2). Quisimos saber si era capaz de actuar sobre el comportamiento de
los queratinocitos cuando se añade al medio de cultivo. Para esto,
las NHK se cultivaron en placas de 12 pocillos a razón de 5.000
células por pocillo. Después de 24 horas de cultivo, los medios de
cultivo se retiraron y se sustituyeron por un medio nuevo que
contiene las cantidades de péptido 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6% y 0,3%
(B-F). Se realizó una muestra piloto sin péptido en
la misma placa. La placa se colocó a continuación en una incubadora
a 37ºC y la operación se repitió una vez para 24 horas de cultivo
suplementario. En el pocillo piloto (sin adición de péptido), los
NHK siguen aun aislados, para la mayoría, y empiezan a unirse en
colonia (figura 11A). Se constata que los NHK cultivados en
presencia del péptido se unieron ya en colonias de mayor dimensión
identificables (figura 11B-F). La observación de
las colonias con mayor aumento (figura 12) muestra que las células
cultivadas en presencia de péptido forman un tapiz celular unido y
cohesivo. No se observa diferencia morfológica entre las células
cultivadas en presencia del péptido (figura 12B,C) y las células
control (figura 12A). sin embargo la adición del péptido en el
medio de los NHK permitió la formación de colonias cohesivas más
rápidamente. Este efecto puede ser consecuencia del pequeño aumento
de la proliferación celular inducida por el péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
aº) Las líneas y queratinocitos humanos normales
(véase ejemplo 1)
bº) Obtención y cultivo de los queratinocitos
jóvenes y mayores (véase ejemplo 2)
Una gama de cantidades decreciente de LN5
(preparada en el laboratorio) y de COL4 (BD Biosciences, Le Pont de
Claix, Francia) se realizaron por dilución sucesiva en PBS. Estas
soluciones se distribuyeron inmediatamente en placas de cultivo de
96 pocillos (Costar) a razón de 100 \mul por pocillo. El
desarrollo del experimento es idéntico al que se describe en el
ejemplo 2). Los resultados se representaron en forma de curva, con
en la ordenada, los valores de la absorbencia representativa de la
adherencia, y en la abscisa, las diferentes cantidades de sustrato
depositadas en los pocillos. Las células adheridas se fotografiaron
con un microscopio de contraste de fase.
\vskip1.000000\baselineskip
La red molecular de base de la unión
dermoepidérmica (JDE) se constituye por ensamblaje de las moléculas
de colágeno IV (COL4). Esta red molecular conduce a la formación de
una red de mallas flojas, estructura poligonal que sirve de
estructura para enlazar las otras proteínas de la hoja basal (figura
13A). Se forma una segunda red molecular de laminina. La laminina 5
(LN5) es la glicoproteína cuantitativamente más importante de la
unión dermoepidérmica, es el componente de los filamentos de
anclaje. LA LN5 desempeña una función crucial e irremplazable en la
adherencia de la epidermis mediante interacciones con las
integrinas. Con el objetivo de analizar el efecto del péptido
TALRIRATYGEY en el contexto de la JDE, los inventores efectuaron
experimentos de co-inmovilización del péptido con
LN5 y COL4 y analizaron las capacidades de adherencia de los
queratinocitos. En un primer tiempo, para definir las condiciones
experimentales, se efectuaron los experimentos de adherencia al
sustrato (LN5 y COL 4) solos. Los experimentos se realizaron con las
cantidades de péptido: 0; 0,03; 0,06, 0,125; 0,25; 0,5, 1 y 2
microgramos por pocillo. Como se ha descrito ampliamente en la
bibliografía y se ha ilustrado en la figura 13B, las 2 proteínas
ensayadas inducen la adherencia de los NHK pero la LN5 es un
sustrato mucho mejor. Las fotografías obtenidas con microscopia de
contraste de fase confirman los resultados cuantitativos y muestran
que la LN5 induce la formación de un tapiz celular epitelial
mientras que el COL4 induce una menor adherencia (figura 13C). Para
la continuación de los experimentos, se seleccionó una cantidad de
sustrato (LN5 y COL4) inductora de una adherencia media en las
curvas presentadas figura 13B: 0,2 microgramo de LN5 y 0,03
microgramo de COL4.
Para analizar el efecto del péptido sobre la
adherencia celular a las proteínas de la JDE, el péptido
TALRIRATYGEY (péptido 1) se co-inmovilizó con la LN5 (figura 14) y el COL4 (figura 15). La cantidad de proteína matricial (LN5 y COL4) fija y la cantidad de péptido variable se indican en las gráficas (figuras 14 y 15). Los péptidos 2 y 3 (descritos en el ejemplo 1) se utilizaron como control a lo largo de este experimento. Los ensayos de adherencia se efectuaron con NHK en las mismas condiciones que en el experimento presentado figura 13 (50.000 células por pocillo). Para analizar el efecto de adherencia unido a la presencia del péptido, se efectuó un control sin péptido y representa el 100% de adherencia (LN5 sola o COL4 solo). Los resultados se expresaron a continuación en porcentaje de este control.
TALRIRATYGEY (péptido 1) se co-inmovilizó con la LN5 (figura 14) y el COL4 (figura 15). La cantidad de proteína matricial (LN5 y COL4) fija y la cantidad de péptido variable se indican en las gráficas (figuras 14 y 15). Los péptidos 2 y 3 (descritos en el ejemplo 1) se utilizaron como control a lo largo de este experimento. Los ensayos de adherencia se efectuaron con NHK en las mismas condiciones que en el experimento presentado figura 13 (50.000 células por pocillo). Para analizar el efecto de adherencia unido a la presencia del péptido, se efectuó un control sin péptido y representa el 100% de adherencia (LN5 sola o COL4 solo). Los resultados se expresaron a continuación en porcentaje de este control.
Como se presenta en la figura 14, el péptido
TALRIRATYGEY aumenta de manera progresiva y significativa la
adherencia de NHK a la LN5. La adherencia a la LN5 es de media el
doble para una cantidad de péptido de 0,21 a 0,87 \mug/pocillo.
Este efecto es específico puesto que no se observa para los péptidos
de control 2 y 3. Las fotografías obtenidas por microscopia de
contraste de fase confirman los resultados cuantitativos y muestran
que la LN5 utilizada sola a 0,2 mg induce una adherencia media. el
aporte del péptido P1 induce la formación de un tapiz celular
confluente mientras que los péptidos P2 y P3 no modifican la
adherencia obtenida con la LN5 sola. El mismo experimento realizado
con el Col4 (figura 15) no muestra efecto significativo del péptido
TALRIRATYGEY sobre la adherencia de los queratinocitos al COL4.
El conjunto de estos resultados indica que el
péptido TALRIRATYGEY potencia la adherencia de NHK a la LN5 cuando
estas 2 proteínas están presentes conjuntamente.
El efecto del péptido TALRIRATYGEY sobre la
adherencia a la LN5 se verificó con NHK-mayores
(figura 16). Se ensayaron NHK-jóvenes en paralelo y
se utilizaron 20.000 células/pocillo en los dos casos
(NHK-mayores siempre son limitantes ya que se
obtienen en menor cantidad). De manera general, los resultados
obtenidos a lo largo de este experimento son menos pronunciados que
los obtenidos durante el experimento presentado figura 14 ya que
(1) el número de células es inferior (30.000 en lugar de 50.000) y
(2) la gama de péptido ensayada es también inferior. Sin embargo,
se observó el efecto de potenciación del péptido TALRIRATYGEY sobre
la adherencia de NHK-mayores a la LN5. Este efecto,
menos pronunciado que el efecto obtenido con
NHK-jóvenes, se une verosímilmente a la disminución
de la adherencia de NHK-mayores al péptido
TALRIRATYGEY con la edad
(figura 6).
(figura 6).
\newpage
Ejemplo
5
El péptido se construyó, como se describe en el
ejemplo 1. La síntesis peptídica se efectuó sobre un Sintetizador
Milligen 9050 utilizando una química Fmoc-Opfp/Hobt.
El péptido se separó a continuación de la resina y se desprotegió
utilizando una solución TFA (ácido trifluoroacético) que contenía
scavengers (fenol, agua, etanoditiol y tioanisol). El péptido se
analizó a continuación y se purificó sobre una columna Vydac C18, 5
mn de 4,6 o 10 mm de diámetro y 250 mm de longitud y a continuación
se caracterizó por espectrometría de masa electrospray sobre un
SCIEX API 165.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido se diluyó en PBS estéril. Las
muestras que contenían el péptido a dosificar se liofilizaron por
evaporación. Se depositaron en un reactor y experimentaron un vacío
pronunciado con el fin de eliminar las moléculas de oxígeno
susceptibles de oxidar algunos aminoácidos. La hidrólisis de los
enlaces peptídicos se efectuó con la ayuda de una mezcla de ácido
clorhídrico (HCL 6N, 2/3), ácido trifluoroacético (TFA, 1/3) en un
recinto a 150ºC durante 45 minutos. La hidrólisis en fase gaseosa
permite evitar las contaminaciones por iones presentes en los
ácidos. Las muestras se secaron a continuación y se solubilizaron en
un tampón apropiado a la cromatografía cambiadora de iones (citrato
de sodio). La cromatografía cambiadora de iones permitió separar
los aminoácidos según su fuerza iónica, y a su salida de columna,
reaccionan con un reactivo, la ninhidrina, para formar un complejo
coloreado con las aminas primarias (violeta, legible a 570 nm). La
ninhidrina reacciona también con las aminas secundarias (prolina,
hidroxiprolina) para formar un compuesto amarillo legible a 440 nm.
Dios cromatogramas distintos permiten el análisis de las
muestras.
Un analizador semiautiomático Beckmann 6.300
optimizado para este análisis, asociado al software Beckman Gold
que permite la cuantificación de los cromatogramas. Los resultados
se trasfirieron a continuación a una tabla
MS-Excell sobre la cual una macro permitió el
cálculo de las composiciones relativas.
\vskip1.000000\baselineskip
aº) Las líneas y queratinocitos humanos normales
(véase ejemplo 1)
bº) Obtención y cultivo de los queratinocitos
jóvenes y mayores (véase ejemplo 2)
\vskip1.000000\baselineskip
4º) Ensayo de adherencia celular (véase
ejemplo 2)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos de adherencia celular
efectuados con el péptido necesitan una primera etapa de
inmovilización del péptido sobre las placas de cultivo de 96
pocillos. Esta etapa se efectúa mediante un contacto de la solución
que contiene el péptido con la superficie de plástico durante 18
horas a +4ºC. Las soluciones se eliminaron a continuación por
aspiración y el péptido se inmovilizó en la superficie, listo para
interactuar con las células aportadas durante el ensayo de
adherencia celular propiamente dicho. Según las propiedades
fisicoquímicas de los péptidos o proteínas utilizados, se
inmovilizó un porcentaje más o menos importante sobre el soporte.
Por lo tanto fue preciso determinar con precisión el porcentaje de
inmovilización del péptido TALRIRATYGEY con el fin de conocer la
cantidad real de péptido inductora de la adherencia.
La figura 17 reúne los datos obtenidos durante
los experimentos de puesta a punto de las condiciones de
dosificación del péptido depositado sobre las placas de 96 pocillos
y no inmovilizado. Se realizaron 5 experimentos con cantidades
decrecientes de péptidos que van de 5 \mug a 0,7 \mug. Para cada
condición, la cantidad de péptido indicada se depositó en 3
pocillos diferentes (100 \mul/pocillo) de una placa de 96
pocillos. Después de un contacto de 18 horas a +4ºC, se recogieron
los sobrenadantes y se depositaron en tubos destinados a la
dosificación por el procedimiento de determinación de la composición
en aminoácidos. Se volvieron a depositar dos muestras idénticas de
la solución utilizada para los depósitos en las mismas condiciones.
Los primeros experimentos realizados con 5, 19 \mug muestran de
entrada que la cantidad de péptido inmovilizada es muy baja. Los
resultados obtenidos en esta condición no pudieron ser explotados ya
que los valores determinados en los sobrenadantes era a veces
superiores a los de la solución de partida. Esto significaba de
entrada que la diferencia entre cantidad de partida y sobrenadante
era demasiado pequeña para poder ser detectada, y se encontraba
seguramente comprendida en el intervalo del desvío de media de las
dosificaciones de la solución de partida. Se volvió por lo tanto a
iniciar el experimento con cantidades más bajas de péptido: 3,55
\mug; 2,56 \mug; 1,23 \mug y 0,73 \mug depositadas en los
pocillos. Las cantidades de péptido eran satisfactorias para
realizar el experimento puesto que se obtuvieron para estas 4
condiciones resultados equivalentes. La cantidad de péptido que
queda en el sobrenadante después de la inmovilización es
aproximadamente el 90% de la cantidad de péptido aportado.
En un segundo tiempo, se eligieron 2 cantidades
de péptidos diferentes (Q1 y Q2) para efectuar una dosificación
sobre un mayor número de muestras (figura 8). se depositaron
directamente dos muestras de Q1 (2 x 100 \mul) y dos muestras de
Q2 (2 x 100 \mul) en los tubos especiales destinados a la
dosificación de las dos soluciones de partida por la técnica de
determinación de los aminoácidos. Cinco pocillos diferentes de la
placa de 96 pocillos recibieron la cantidad Q1 (volumen 100 \mul)
y otros cinco pocillos recibieron la cantidad Q2 (volumen 100
\mul). Después de un contacto de 18 horas a +4ºC, se recogieron
los 5 sobrenadantes de los pocillos Q1 y Q2 en los tubos de vidrio
especiales para la dosificación de los aminoácidos. Todas las
muestras, soluciones de partida y sobrenadantes se dosificaron al
mismo tiempo. La dosificación permitió dosificar una cantidad media
de 2,44 \mug en Q1. La dosificación de los 5 sobrenadantes
permitió determinar una cantidad media de 2,212 \mug que se había
quedado en solución, que muestra que quedan el 90,7% del péptido en
la solución después de la inmovilización. Esto significa que sólo
se inmovilizó el 9,3% del péptido. Se dio un porcentaje equivalente
para la cantidad Q2 cuya cantidad media de partida fue de 1,09
\mug. Después de la etapa de inmovilización, la dosificación
permitió determinar la cantidad media de 1,002 \mug en los
sobrenadantes lo cual significa que el 92% de la cantidad de
péptido no se inmovilizó.
El conjunto de estos resultados permite concluir
que entre el 8 y 9% sólo de la cantidad de péptido aportada al
pocillo al principio se inmoviliza finalmente.
Al ser esta cantidad muy inferior a la aportada
al pocillo al inicio, esto permite determinar con precisión la
cantidad mínima de péptido realmente activa.
Para determinar la cantidad mínima de péptido
activa, se utilizó un segundo enfoque y se aumentó el número de
células adherentes con el objetivo de obtener un tapiz celular
confluente. Las células HT1080 se eligieron para este experimento
ya que presentan el mismo perfil de adherencia que los
queratinocitos. Las condiciones del ensayo de adherencia son las
mismas que lo que se ha descrito anteriormente. Se presentan las
curvas de adherencia al péptido, en dos condiciones de cultivo
celular, en las gráficas de la figura 19. Se ensayaron dos cultivos
celulares: 80.000 células por pocillo (volumen de 100 \mul) y
150.000 células por pocillo (volumen 100 \mul). Como se muestra
en la figura 19, las 2 curvas de adherencia son paralelas y alcanzan
la placa de adherencia para la misma cantidad de péptido
inmovilizada. La diferencia observada entre las dos curvas está
unida a la diferencia de intensidad de la absorbencia que es
superior en el caso en que hay el doble de células. Unas imágenes
ilustran a la derecha el tapiz celular homogéneo y confluente
obtenido en el caso en que se cultivaron 150.000 células. Las
células están unidas y se asocian las unas a las otras. Se observa
que el péptido induce el esparcimiento celular y el establecimiento
de uniones célula-célula, dos garantes de una buena
comunicación celular.
A partir de estas condiciones, se analizó la
zona ascendente de la curva para conocer la cantidad mínima de
péptido que permite una adhesión significativa (figura 19). El
cultivo a 150.000 células por pocillo revela que la cantidad mínima
de péptido que induce una adherencia significativa se sitúa entre
0,08 \mug y 0,015 \mug.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
6
Composición
Nº1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Composición
Nº2
Composición
Nº3
Composición
Nº4
<110> Laboratorios de Anjou
\hskip1cmCentre National de la Recherche Scientifique - CNRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo péptido y composición
farmacéutica que lo contiene.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 348154/D22277
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 04/08383
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-07-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Laminina 5 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Laminina 5 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Laminina 5 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
Claims (15)
1. Péptido que presenta la siguiente secuencia
TALRIRATYGEY (SEQ ID Nº1).
2. Péptido según la reivindicación 1
caracterizado porque se obtiene por síntesis química.
3. composición farmacéutica caracterizada
porque comprende al menos un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3, caracterizada porque la composición
contiene entre el 0,00002% y el 5%, de preferencia entre el
0,00005% y el 0,1% y más preferencialmente entre el 0,0001 y el
0,001% en peso de péptido y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque comprende, además,
al menos otro principio dermatológicamente activo.
6. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque se
presenta en forma de crema, leche, emulsión aceite en agua,
emulsión agua en aceite, emulsión múltiple, solución, suspensión,
gel acuoso, gel aceitoso, gel hidroalcohólico, loción, barra o
polvo.
7. Uso del péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a reforzar la unión dermoepidérmica, la
adherencia célula-célula y/o la adherencia
célula-matriz al nivel de la epidermis y a favorecer
la reparación de la epidermis.
8. Uso según la reivindicación 7,
caracterizado porque dicha composición farmacéutica es tal
como se define en una de las reivindicaciones 3 a 6.
9. Uso según la reivindicación 7 ó 8,
caracterizado porque dicha composición se destina al
tratamiento de las alteraciones de la piel inducidas por patologías
dermatológicas.
10. Uso según la reivindicación 7 ó 8,
caracterizado porque dicha composición se destina al
tratamiento de las alteraciones de la piel fragilizadas por
tratamientos cosméticos o terapéuticos.
11. Uso según la reivindicación 7 ó 8,
caracterizado porque dicha composición se destina al
tratamiento curativo o preventivo del envejecimiento cutáneo tal
como las arrugas, el relajamiento, la pérdida de elasticidad, la
cicatrización menos buena, la xerosis senil, modificaciones del
sistema pigmentario de la piel, empobrecimiento de la red vascular
de la piel, y alteración de los faneros.
12. Procedimiento de tratamiento cosmético de
la piel caracterizado porque se aplica sobre la piel una
composición cosmética que comprende al menos un péptido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
13. Procedimiento de tratamiento cosmético de
la piel según la reivindicación 12 caracterizado porque dicha
composición contiene entre el 0,00002% y el 5%, de preferencia
entre el 0,00005% y el 0,1% y más preferiblemente entre el 0,0001 y
el 0,001% en peso de péptido y al menos un excipiente cosméticamente
aceptable.
14. Procedimiento de tratamiento cosmético de la
piel según uno cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13,
caracterizado porque comprende, además, al menos otro
principio cosméticamente activo.
15. Procedimiento de tratamiento cosmético de la
piel según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14,
caracterizado porque dicha composición se presenta en forma
de crema, leche, emulsión aceite en agua, emulsión agua en aceite,
emulsión múltiple, solución, suspensión, gel acuoso, gel aceitoso,
gel hidroalcohólico, loción, barra o polvo.
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| FR0408383 | 2004-07-29 | ||
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| JP4377522B2 (ja) * | 2000-05-09 | 2009-12-02 | 株式会社ヤクルト本社 | 安定な酸性乳飲料、その製造方法およびこれに使用する酸性乳飲料用添加剤 |
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