ES2317656T3 - Cribado prenatal del sindrome de down utilizando gonadotropina hiperglicosilada. - Google Patents
Cribado prenatal del sindrome de down utilizando gonadotropina hiperglicosilada. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2317656T3 ES2317656T3 ES97943383T ES97943383T ES2317656T3 ES 2317656 T3 ES2317656 T3 ES 2317656T3 ES 97943383 T ES97943383 T ES 97943383T ES 97943383 T ES97943383 T ES 97943383T ES 2317656 T3 ES2317656 T3 ES 2317656T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gonadotropin
- hyperglycosylated
- hcg
- down syndrome
- carbohydrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 67
- 238000009609 prenatal screening Methods 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims abstract description 38
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 97
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 97
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 26
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 20
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 15
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 15
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 14
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 14
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 claims description 10
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 claims description 4
- PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N (16alpha,17betaOH)-Estra-1,3,5(10)-triene-3,16,17-triol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(C(O)C4)O)C4C3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 claims description 3
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 abstract description 29
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 16
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 83
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 24
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 21
- 241000894007 species Species 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 12
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 11
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 10
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000036830 Normal foetus Diseases 0.000 description 3
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010004272 Benign hydatidiform mole Diseases 0.000 description 2
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 2
- 208000006937 Hydatidiform mole Diseases 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 2
- 208000032749 Pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 201000007116 gestational trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006360 Edwards syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- 108030001694 Pappalysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 201000009928 Patau syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000005819 Pregnancy-Associated Plasma Protein-A Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 206010044686 Trisomy 13 Diseases 0.000 description 1
- 208000006284 Trisomy 13 Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000007159 Trisomy 18 Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 210000002718 aborted fetus Anatomy 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 102000045729 human CGA Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012109 statistical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 206010053884 trisomy 18 Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/806—Fertility tests
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/814—Pregnancy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
- Y10S436/818—Human chorionic gonadotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
UN PROCEDIMIENTO PARA LA SELECCION PRENATAL DEL SINDROME DE DOWN REPRESENTA ANALIZAR LA GONADOTROPINA HIPERGLUCOSILADA EN MUESTRAS BIOLOGICAS DE ANALISIS, TALES COMO ORINA, PLASMA O SUERO OBTENIDOS DE MUJERES EMBARAZADAS. LA GONADOTROPINA HIPERGLUCOSILADA COMPRENDE UNA POBLACION VARIANTE DE GONADOTROPINA GOLIONICA, SUBUNIDAD- BE LIBRE DE GONADOTROPINA GOLIONICA, FRAGMENTO DEL NUCLEO- BE Y/O SUBUNIDAD- AL LIBRE QUE MUESTRA D IFERENCIAS EN EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS RESPECTO A LO OBSERVADO EN MUESTRAS OBTENIDAS DE MUJERES EMBARAZADAS QUE TIENEN FETOS NORMALES. LA OBSERVACION CUALITATIVA O CUANTITATIVA DE DIFERENCIAS EN EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS DE LA POBLACION DE GONADOTROPINA HIPERGLUCOSILADA RESPECTO A LAS MUESTRAS DE CONTROL CORRESPONDIENTES QUE CONTIENEN UNA POBLACION DE GONADOTROPINA NORMAL, O LA OBSERVACION DIRECTA DE LA ESPECIE VARIANTE OBSERVADA EN EL SINDROME DE DOWN INDICA QUE EL FETO DE LA MUJER SUFRE EL SINDROME DE DOWN. ENTRE LOS SELECCIONADORES TIPICOS SE INCLUYEN LOS ANALISIS DE LOS CARBOHIDRATOS, INMUNOENSAYOS O COMBINACIONES DE DICHOS PROCEDIMIENTOS. ALGUNAS REACCIONES EMPLEAN UNA LECTINA, COMO POR EJEMPLO LA CONCANAVALINA A REACTIVA A LA MITAD CARBOHIDRATO; OTRAS EMPLEAN ANTICUERPOS DE AL MENOS UNA ESPECIE DE GONADOTROPINA HIPERGLUCOSILADA.
Description
Cribado prenatal del síndrome de Down utilizando
gonadotropina hiperglicosilada.
La presente invención se refiere a un ensayo
para el cribado del síndrome de Down de mujeres embarazadas.
Se ha sugerido un triple cribado de
\alpha-fetoproteína, gonadotropina coriónica y
estrógeno no conjugado en suero para el diagnóstico prenatal del
síndrome de Down (Bennet, JC and Plum, F., Cecil's Textbook of
Medicine, W.B. Saunders, Philadelphia, 1996, p.165). Sin
embargo, permite la detección de entre solamente el 60% y el 65% de
los fetos con el trastorno genético y da un 5% de resultados falsos
positivos. También está limitado al segundo trimestre del embarazo
(entre 15 y 24 semanas de gestación) y ha resultado caro ya que se
han impuesto tarifas de licencia significativas sobre los
laboratorios que realizan análisis de gonadotropina coriónica
humana que utilizan los procedimientos convencionales [Auxter, S.,
Clin. Labor. News 23:1-3 (1997)].
El diagnóstico prenatal definitivo de las
anormalidades cromosómicas fetales que conducen al síndrome de Down,
que afecta 1 de cada 700 nacimientos, implica típicamente, en su
lugar, el cultivo de amniocitos durante la gestación del trimestre
intermedio. El procedimiento implica la aspiración de pequeñas
muestras de fluido amniótico (amniocentesis), el cultivo de las
células fetales comprendidas en el fluido y la determinación del
cariotipo de dichas células y por tanto del feto. Los indicios
principales para la aplicación de este procedimiento de detección
de anormalidades cromosómicas son la edad materna (generalmente se
ofrece a todas las madres mayores de 35 en el momento del parto),
la presencia de una anormalidad cromosómica parental o una historia
materna con una criatura trisómica o de fetos abortados con
cariotipo trisómico. También se ha utilizado en el diagnóstico
prenatal la aspiración transcervical de las vellosidades coriónicas
(muestreo de las vellosidades coriónicas, o CVS).
Aunque los dos procedimientos han demostrado ser
relativamente seguros y fiables, es generalmente aceptado que
implica cierto riesgo, que comprende el riesgo de aborto y, en el
caso de CVS, también el riesgo de hipoplasia de miembros para los
bebes que nacen después del procedimiento. Resultaría preferido
disponer de otros procedimientos de cribado para fetos con el
síndrome de Down en mujeres embarazadas, en particular cribados
sensibles que no sean invasivos. La mayoría de los casos de
síndrome de Down tiene lugar en mujeres más jóvenes embarazadas,
las que están por debajo de los 35 en el momento esperado para el
parto, o en la mayoría de los embarazos. Se necesitan ensayos menos
invasivos que utilicen muestras de suero u orina con el fin de
identificar a los que corren un riesgo elevado de embarazos con
síndrome de Down, que no quiera correr el riesgo de la amniocentesis
o CVS.
La gonadotropina coriónica humana (hCG) es un
hormona glicoproteína segregada en cantidades relativamente
elevadas por las células tropoblásticas de la placenta [Masure,
H.R., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.
53:1014-1020 (1981)]. La hCG está compuesta de
dos subunidades diferentes, \alpha (92 aminoácidos y dos
oligosacáridos N-enlazados) y \beta (145
aminoácidos y dos oligosacáridos N-enlazados y 4
oligosacáridos O-enlazados), unidas no
covalentemente y se detecta en el suero y la orina de las mujeres
embarazadas y en las que tienen enfermedad tropoblástica (lunar
hidatidiforme y coriocarcinoma). Las subunidades \alpha- y
\beta-libres, la hCG degradada y las moléculas de
subunidad-\beta se detectan también en las
muestras de suero y orina [Birken S., et al.,
Endocrinology 122:572-583 (1988)]. Las
moléculas degradadas comprenden hCG cortada y
subunidades-\beta cortadas libres, cada una de
ellas cortada entre los residuos 47 y 48 de la
subunidad-\beta (o menos frecuentemente entre los
residuos 43 y 44 o 44 y 45), subunidades-\beta
cortadas a las que falta toda o parte de la secuencia
C-terminal (\beta93-145) y, un
producto terminal de degradación que comprende dos fragmentos,
secuencia 6-40 y 55-92 de la
subunidad-\beta, unidas por puentes disulfuro,
que se encuentra principalmente en las muestras de orina (Figura 1).
El producto de degradación terminal no comprende partes de
oligosacárido O-enlazados y oligosacáridos
N-enlazados degradados, uno o dos pentasacáridos
N-enlazados en comparación con los dos
undecasacáridos de las subunidades-\beta libres y
de la hCG (Figura 2A). El producto de degradación terminal se
denominó fragmento de nuclear-\beta
[núcleo-\beta, Blithe, D., et al.,
Endocrinology 122:173-180 (1988)], en primer
lugar debido a su tamaño (aprox. 9.000 dalton; hCG tiene 37.000
dalton) y en segundo lugar debido a que retiene la inmunoreactividad
en radioinmunoensayos al antisuero contra hCG\beta o al núcleo de
la subunidad-\beta (en comparación con el
C-terminal u otros) [Birken, et al., y
Masure, et al., citados anteriormente). Durante la mayor
parte del embarazo, el fragmento nuclear-\beta es
la principal molécula relacionada a
subunidad-\beta de la hCG en las muestras de
orina.
La subunidad-\beta libre de
suero u orina tiene tres orígenes: sección directa de los
tropoblastos, disociación lenta de la hCG circulante en subunidades
\alpha- \beta- libres y mediante el corte de la hCG por los
enzimas de los macrófagos y neutrófilos asociados al tejido
tropoblástico y la más rápida disociación de la hCG cortada
circulante (Figura 1). La subunidad-\beta libre
puede ser cortada por enzimas cortantes en la circulación. El
fragmento nuclear-\beta de lo orina parece que se
origina mediante la degradación de la
subunidad-\beta libre cortada en el riñón.
A finales de los 1980, se desarrolló el ensayo
de marcador triple mencionado anteriormente con el fin de cribar
los embarazos de síndrome de Down. Se combinó la edad materna con
las mediciones de hCG, \alpha-fetoproteína y
estriol no conjugado [Bogart, MH., et al., Prenat. Diagn.
7:623-630 (1987)], patente US nº 4.874.693 de
Bogart, Wald, NJ., et al., Br. J. Obstet. Gynaecol.
95:334-341 (1988) y Canick, JA., J. Clin.
Immunolassay 13:30-33 (1990)]. Más
recientemente, se han introducido ensayos de
subunidad-\beta libre en suero y de combinaciones
de
subunidad-\beta-\alpha-fetoproteína
libres como procedimientos alternativos de cribado del síndrome de
Down [Macri, JN., et al., Am. J. Obstet. Cynecol.
163:1248-1253 (1990) y Spencer, K., et
al., Ann. Clin. Biochem. 30:394-401
(1993)]. El mejor ensayo de combinación de
subunidades-\beta libres en suero o el ensayo
óptimo de tres marcadores, detectan solamente entre el 60 y el 65%
de los casos de síndrome de Down, con una proporción del 5% en
falsos negativos. Con estas proporciones de detección y falsos
positivos, se necesita realizar aproximadamente 80 amniocentesis
para detectar un solo caso de síndrome de Down y se pierde un
número significativo de casos de síndrome de Down [Cole, LA, et
al., Prenatal Diagnosis 17:607-614
(1997)]. Existe la necesidad de una mejora en los procedimientos de
cribado prenatal.
La patente US nº 4.874.693 se refiere a un
procedimiento destinado a cuantificar la hormona gonadotropina
coriónica humana (hCG) sola o en combinación con la subunidad alfa
libre de hCG (alfa-hCG).
La patente US nº 5.252.489 se refiere a un
procedimiento destinado a detectar el síndrome de Down fetal
(trisomía 21), trisomía 13, trisomía 18 y otras anormalidades
cromosómicas durante el cribado prenatal mediante el análisis de
muestras de sangre seca de mujeres embarazadas. La patente US nº
5.252.489 se refiere a la medición de la gonadotropina coriónica
humana.
Howanitz JH [Archives of Pathology and
Laboratory Medicine:117(4):369-72, 1993
April] revisa la influencia de las formas de hormonas
polipeptídicas sobre los resultados de los inmunoensayos.
Jauniaux, E., et al., [Journal of
Endocrinology 148(1):27-31, 1996 January]
se refiere a la cantidad total de subunidades alfa y beta
circulantes de la gonadotropina coriónica en las trisomías 21 y 18
del primer trimestre.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un ensayo para el cribado prenatal de los embarazos de
síndrome de Down.
Otro objetivo más específico de la presente
invención consiste en proporcionar un ensayo sensible, no invasivo
de fetos de síndrome de Down en mujeres embarazadas.
Otro objetivo adicional de la presente invención
consiste en proporcionar una mejora del ensayo de marcador triple
que muestra una disminución de la proporción de falsos
positivos.
Estos y otros objetivos se consiguen mediante la
presente invención, que proporciona un nuevo procedimiento de
cribado de la presencia o ausencia de síndrome de Down en los fetos
de mujeres embarazadas que comprende determinar la presencia de
síndrome de Down mediante la observación de gonadotropina
hiperglicosilada en una muestra biológica de ensayo proporcionada
por la mujer embarazada. Esto, típicamente implica medir la
concentración de gonadotropina hiperglicosilada, su
subunidad-\beta libre, su
subunidad-\alpha libre y/o su fragmento
nuclear-\beta en la muestra de ensayo y determinar
la presencia de síndrome de Down mediante la observación de que la
concentración en la población de la muestra de ensayo difiere de la
población normal de gonadotropina hiperglicosilada o
subunidad-\alpha libre o
subunidad-\beta libre o fragmento
nuclear-\beta y/o es la misma que, o similar a,
la población de un síndrome de Down. En una forma de realización
preferida, la muestra de ensayo es orina, saliva, plasma o suero,
la población comprende hCG hiperglicosilada, fragmento
nuclear-\beta, subunidad-\alpha
libre, subunidad-\beta libre y mezclas de las
mismas y cualquier diferencia entre las propiedades observadas en
las muestras normales y las de síndrome de Down reflejan diferencias
observadas en el contenido en carbohidrato de los glicopolipéptidos
y/o glicopéptidos.
Se utiliza generalmente el análisis de
composición o estructural de carbohidratos, inmunoensayo y la
combinación de estos procedimientos. En algunas formas de
realización se determina la hiperglicosilación de la gonadotropina
directamente mediante el ensayo de por lo menos una especie
hiperglicosilada, es decir, hCG modificada,
subunidad-\beta libre,
subunidad-\alpha libre, y/o fragmento
nuclear-\beta. Estas cribas típicamente utilizan
un anticuerpo monoclonal, policlonal, o de fusión a fago contra una
especie de hCG hiperglicosilada o de carbohidrato modificado en un
ELISA, transferencia Western o semejante. En otra forma de
realización, se observan elevados niveles de monosacáridos en las
muestras positivas a síndrome de Down. Otras cribas utilizan
lectinas que se unen a las partes carbohidrato, cromatografía,
ensayos químicos o electroforéticos o de enfoque isoelectroforético
que detectan modificaciones de la glicosilación de la hCG. Las
lectinas se pueden utilizar también con el fin de separar y/o
concentrar antes del inmunoensayo especies de hCG con partes de
carbohidrato aberrantes.
La figura 1 es un dibujo lineal esquemático que
ilustra las estructuras de moléculas relacionadas a hCG. Las
líneas gruesas representan el esqueleto peptídico, los números
indican posiciones de aminoácidos y las líneas delgadas indican la
posición de los puentes de disulfuro. Las letras indican
monosacáridos en cadenas laterales de oligosacáridos. S = ácido
siálico; G = galactosa; A = N-acetilglucosamina; M =
manosa y L = N-acetilgalactosamina.
La Figura 2 muestra un dibujo esquemático de
oligosacáridos N-enlazados. Las estructuras en la
Figura 2A ilustran los oligosacáridos N-enlazados
en hCG del embarazo normal, sus subunidades-\beta
y subunidades-\alpha libres. La estructura de la
Figura 2B muestra un oligosacárido N-enlazado
degradado en un fragmento nuclear-\beta de un
embarazo normal. La estructura en la Figura 2C indica los
oligosacáridos O-enlazados de hCG en un embarazo
normal así como su subunidad-\beta libre. Las
abreviaciones utilizadas son Man se refiere a manosa, Gal se
refiere a galactosa, GlcNac se refiere a
N-acetilglucosamina, Fuc se refiere a fucosa y
GalNAc a N-acetilgalactosamina. Las variables se
indican mediante \pm.
La Figura 3 ilustra oligosacáridos
N-enlazados y O-enlazados en
especies hCG anormales que se encuentran elevadas en el síndrome de
Down y/o trastornos patológicos relacionados tales como
coriocarcinoma. La Figura 3A muestra oligosacáridos
N-enlazados de la gonadotropina hiperglicosilada y
su subunidad-\beta libre y
subunidad-\alpha libre. La Figura 3B muestra
oligosacáridos N-enlazados en el fragmento
nuclear-\beta de gonadotropina hiperglicosilada.
La Figura 3C muestra oligosacáridos O-enlazados en
gonadotropina hiperglicosilada y su
subunidad-\beta libre. Las abreviaciones son las
mismas que se utilizaron en la Figura 2.
La Figura 4 es una gráfica de la reactividad del
anticuerpo monoclonal B152 en un inmunoensayo de hCG
hiperglicosilada en muestras de orina tomadas a los intervalos
periódicos indicados de 130 mujeres embarazadas con fetos normales
(\bullet) y 9 mujeres embarazadas con fetos de síndrome de Down
(\circ). Las medianas se determinaron y las muestras se
expresaron como múltiplos de las medianas de los embarazos normales.
Se ajustó una curva Gausiana logarítmica a las medianas de los
embarazos normales ajustados a la edad gestacional (50 centil).
También se determinó el 95 centil.
La presente invención se basa en la observación
de perfiles aberrantes de carbohidrato en especies hCG
(gonadotropina hiperglicosilada) obtenidas del suero o la orina de
mujeres embarazadas portadoras de fetos con síndrome de Down, pero
no de mujeres portadoras de fetos normales.
En la práctica de la presente invención, la
presencia o ausencia de síndrome de Down en el feto de una mujer
embarazada se determina mediante un procedimiento que comprende un
ensayo de gonadotropina hiperglicosilada en una muestra biológica
de ensayo proporcionada por una mujer embarazada. Esto típicamente
implica la determinación de si la composición o propiedades físicas
de la población de gonadotropina coriónica en la muestra de ensayo
difieren de las de una muestra control correspondiente que comprende
una población de gonadotropina coriónica normal y/o que la muestra
comprende niveles elevados de por lo menos de una especie de la
población de gonadotropina hiperglicosilada observada en el síndrome
de Down.
Tal como se utiliza en la presente memoria
"población de gonadotropina coriónica" comprende gonadotropina
coriónica, subunidad-\alpha,
subunidad-\beta, fragmento
nuclear-\beta y mezclas de los mismos, y
específicamente comprende composiciones anormales de monosacáridos
en sus partes de oligosacárido o están hiperglicosiladas tales como
las observadas en las poblaciones de hCG de síndrome de Down. El
término "gonadotropina hiperglicosilada" comprende
genéricamente estas últimas especies dentro de la población de
gonadotropina coriónica, que comprende gonadotropina
hiperglicosilada, gonadotropina cortada,
subunidad-\alpha,
subunidad-\beta, fragmento
nuclear-\beta y mezclas de uno cualquiera de
estos que muestran perfiles aberrantes de carbohidratos y/o niveles
aberrantes de carbohidratos en comparación con los niveles
normales.
La hCG y los fragmentos
nucleares-\beta se utilizan en muchas formas de
realización. Es una ventaja de la presente invención que el suero
del embarazo comprende grandes cantidades de hCG. La hCG da cuenta
de más del 99% de la inmunoreactividad-\beta
total en el suero del embarazo.
De manera similar, la orina del embarazo
comprende una amplia población de fragmento
nuclear-\beta. Desde luego, la población
nuclear-\beta puede dar cuenta de hasta el 70% de
la inmunoreactividad-\beta total en la orina del
embarazo [Blithe, et al., citado anteriormente]. Así, en una
forma de realización preferida, la presente invención proporciona
un procedimiento de cribado de las especie abundantes, hCG en el
suero y del fragmento nuclear-\beta en la orina y
de las que son de fácil detección utilizando procedimientos
estándares que comprenden inmunoensayos y procedimientos clínicos
semejantes descritos por Birkin, et al., y Blithe et
al., mencionados anteriormente e ilustrados en la presente
memoria, o, debido a las modificaciones observadas en la porción de
carbohidrato de las especies de hCG del síndrome de Down, el
análisis de carbohidratos tales como la utilización de una lectina
específica al carbohidrato, o la utilización de ensayos de la
composición de monosacáridos, electroforesis o enfoque
isoelectroforético destinados a detectar modificaciones de la
glicosilación. Algunas especies modificadas observadas en el
síndrome de Down y embarazos aberrantes relacionados se ilustran en
la Figura 3 y se describen en Elliott, MM, et al.,
[Endocrine J., 7 (1997)]. Se advierte que muchas especies
hiperglicosiladas de hCG de síndrome de Down tienen, en lugar de la
estructura bianternaria sialillactosamina
(NeuAc-Gal-GlcNAc) enlazada a un
núcleo de manosa en la subunidad-\beta de hCG
(Figura 2), estructuras triantenarias con una sialillactosamina
adicional (Figura 3A). Otras características de hiperglicosilación
comprenden niveles incrementados de oligosacáridos
N-enlazados que comprenden fucosa (en oposición a
estar libres de fucosa) y estructuras de hexasacárido en los
lugares de carbohidratos O-enlazados de las
subunidades-\beta (Figura 3C). La
hiperglicosilación está por consiguiente significativamente elevada
en las especies de hCG de síndrome de Down.
Se puede utilizar una muestra biológica
cualquiera en los procedimientos de la presente invención,
comprendiendo, pero no exclusivamente, orina, saliva, suero,
plasma, lágrimas y fluido amniótico. La saliva, orina, plasma o
suero resultan preferidos debido que las muestras son mas
voluminosas y el muestreo no implica riesgo de daño al feto. La
orina obtenida de las mujeres embarazadas en su primer (generalmente
definido como de aproximadamente la semana 9 a la semana 13, 6
días) o segundo trimestre (generalmente definido como
aproximadamente 14 a 28 semanas) es particularmente preferida en
algunas formas de realización. Es una ventaja de la presente
invención que las muestras se puedan analizar en el primer
trimestre, más temprano en el embarazo de lo que se describió en
los procedimientos anteriores para ensayar la disfunción
placentaria tal como se describe en la patente US nº 4.874.693
citada anteriormente (18 a 25 semanas). Un procedimiento de cribado
adecuado para utilización entre las semanas de gestación 11 a 19,
por ejemplo, se ilustra en los Ejemplos siguientes y en la Figura
4.
Los cribados de síndrome de Down de la presente
invención utilizan generalmente análisis de cabohidratos,
inmunoensayos o combinaciones de estos procedimientos con el fin de
detectar la hiperglicosilación de la gonadotropina, pero en la
práctica de la presente invención se puede utilizar cualquier ensayo
que funcione para determinar cualitativamente o cuantitativamente
las modificaciones en la concentración de gonadotropina
hiperglicosilada en las muestras respecto a los niveles normales y/o
detectar partes de carbohidrato de hCG anormales en la población de
gonadotropina de la muestra. Resulta preferido el ensayo directo de
por lo menos un miembro de la población de gonadotropina coriónica
modificada del síndrome de Down. Algunas cribas utilizan lectinas
que ensayan las partes de carbohidrato, cromatografía, ensayos
químicos, electroforesis o enfoque isoeléctrico que detectan
modificaciones de la glicosilación de hCG y/o anticuerpos a la hCG
hiperglicosilada o con carbohidrato modificado.
Los inmunoensayos comprenden, pero sin quedar
limitado a estos, ensayos que utilizan anticuerpos específicos a
gonadotropinas hiperglicosiladas generados mediante procedimientos
estándares y ensayos que utilizan anticuerpos no definidos
específicamente obtenidos mediante inyecciones ciegas de hCG de
síndrome de Down o hCG de coriocarcinoma en animales de ensayo
mediante procedimientos estándares. Se puede utilizar en
inmunoensayos de la presente invención cualquier tipo de fago de
fusión, anticuerpo monoclonal o policlonal, siempre que los
anticuerpos se puedan utilizar de modo reproducible como marcadores
de las modificaciones de las especies de hCG hiperglicosilada del
síndrome de Down sin reconocer las especies normales, o como
mediciones de los diferentes niveles observados en las poblaciones
normales y modificadas, y específicamente comprende anticuerpos a
las partes de carbohidrato modificado de los fragmentos. En el
inmunoensayo descrito a continuación en la presente memoria se
utiliza un anticuerpo referido como B152 que reconoce hCG
hiperglicosilada cortada de un paciente de coriocarcinoma pero no
detecta hCG normal.
En un ensayo inmunométrico típico de la presente
invención, se utiliza un anticuerpo específico para una modificación
de hiperglicosilación tal como el B152 como anticuerpo de captura
con un segundo anticuerpo marcado a hCG,
fragmento-\beta nuclear,
subunidad-\alpha y/o
subunidad-\beta con el fin de proporcionar el
ensayo con su especificidad polipeptídica. El marcaje en el
segundo anticuerpo comprende una etiqueta química cualquiera,
radioactiva, de lantánido, colorante, o genética utilizada en
ensayos de inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), transferencia
Western y otros ensayos inmunométricos e inmunoensayos específicos y
sensibles utilizados en la técnica conocida. Estos comprenden
conjugar el anticuerpo con peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina
que generalmente se miden con facilidad, típicamente utilizando
sustratos colorimétricos, fluorométricos o luminescentes. Las
etiquetas genéticas comprenden luciferasa de luciérnaga, utilizada
debido que la luciferasa produce una molécula bioluminescente
cuando se incuba con su sustrato, luciferina. En las formas de
realización alternativas se utiliza un tercer anticuerpo con el fin
de detectar la presencia de los demás anticuerpos.
Otras formas de realización utilizan el
anticuerpo péptido-específico como anticuerpo de
captura y el anticuerpo específico a la gonadotropina
hiperglicosilada o con carbohidrato modificado y/o a una parte de
carbohidrato anormal del mismo comprende el segundo anticuerpo
marcado en el inmunoensayo descrito anteriormente. Los
inmunoensayos de competición que utilizan anticuerpos tales como el
B152 también se pueden utilizar para detectar competitivamente la
gonadotropina hiperglicosilada. Se pueden utilizar formas de
realización alternativas que utilizan concanavalina A u otras
lectinas carbohidrato-específicas en lugar del
anticuerpo de captura o anticuerpo marcado. Algunas formas de
realización utilizan una lectina o procedimiento cromatográfico con
el fin de extraer hCG de carbohidrato modificado antes de un
inmunoensayo.
El análisis de carbohidrato comprende la
observación cualitativa de las diferencias en las propiedades
físicas entre las poblaciones de hCG normal y de síndrome de Down
descritas a continuación en los Ejemplos de la presente memoria, la
identificación de carbohidratos utilizando lectinas vegetales
específicas a las diferentes modificaciones de las partes de
carbohidrato de la hCG de síndrome de Down obtenidas mediante los
procedimientos estándares de cribado de lectinas, o cualquier otra
forma de procedimiento de huella digital que comprende análisis
cuantitativo o cualitativo de la composición de carbohidratos. Un
ejemplo que utiliza concanavalina A unida a un soporte sólido, que
se une a tres unidades de manosa de la parte de carbohidrato de la
hCG (Figura 2) se utiliza en una forma de realización ilustrada a
continuación en la presente memoria, pero se puede utilizar una
lectina cualquiera que muestre unión diferencial a la especie de
hCG hiperglicosilada en comparación con la hCG normal en los
procedimientos que comprenden la presente invención.
En una forma de realización, por ejemplo, la
presencia o ausencia de síndrome de Down en el feto de una mujer
embarazada se determina mediante un procedimiento que comprende
determinar el contenido en carbohidrato de la hCG en una muestra de
ensayo de orina, saliva, plasma o suero, preferentemente suero u
orina, de la mujer, comparar el contenido en carbohidrato así
obtenido al contenido en carbohidrato de la correspondiente muestra
control que comprende una población de hCG normal y determinar la
presencia de síndrome de Down mediante la observación de que el
contenido en carbohidrato de la población de hCG difiere de el de la
muestra control. Resulta preferido observar un incremento de por lo
menos aproximadamente el 25%, preferentemente de por lo menos
aproximadamente el 50% en el nivel de por lo menos una especie
hiperglicosilada. La observación de especies aberrantes no
observadas en absoluto en las muestras de hCG normal tales como las
descritas en la Figura 3 es particularmente preferida.
En una forma de realización del procedimiento,
la presencia de síndrome de Down se determina mediante la
observación de que el contenido en monosacáridos en la muestra de
ensayo es elevado en comparación con la muestra control. Esto puede
implicar una observación de diferencias en patrones de elución tales
como los descritos más adelante, o un análisis de
N-acetilglucosamina. En un análisis típico se
observa un incremento de por lo menos el 50%.
Por el contrario, las propiedades de la
población de gonadotropina coriónica en una muestra se determinan
utilizando ensayos de electroforesis, enfoque isoelectroforético que
detectan modificaciones de glicosilación de hCG, cromatografía y
combinaciones de estos procedimientos. Los procedimientos
cromatográficos comprenden los que utilizan interacciones
hidrófobas u otra cromatografía de ligando, tal como la que utiliza
Blue Dextran Sepharosa® ilustrada a continuación en la presente
memoria, pero se puede utilizar un procedimiento cualquiera de
comparación de las propiedades físicas de los glicopolipéptidos o
glicopéptidos, por ejemplo, la observación simple cualitativa de
las diferencias en los patrones de elución. Esto comprende de manera
no limitativa, cromatografía de columna, cuentas recubiertas,
placas o tubos de ensayo recubiertos, enlace diferencial,
extracciones y semejantes y combinaciones de estos procedimientos.
Es una ventaja de la presente invención que cuando se ensaya para
el fragmento nuclear-\beta, los marcadores son
pequeños y solubles.
Las poblaciones normales de gonadotropina
coriónica utilizadas como controles en muchos procedimientos de
cribado de la presente invención se pueden obtener o clonar a partir
de mujeres con fetos de cariotipo normal, u obtenerse
comercialmente. El fragmento nuclear-\beta por
ejemplo, se puede extraer de preparaciones de hCG obtenidas de
Organon, Diosynth Division (Oss, Holland) tal como describen Birken,
et al., citado anteriormente.
Los procedimientos de cribado de la presente
invención se pueden utilizar solos o en combinación con otros
procedimientos de cribado. Otros procedimientos de cribado
comprenden, pero sin quedar limitados a ellos, mediciones de
estriol conjugado y/o no conjugado, ensayos de hCG, análisis de
fragmento nuclear-\beta, análisis de
subunidad-\beta libre o de
subunidad-\alpha libre, análisis de
PAPP-A o CA125, análisis de
\alpha-fetoproteína, análisis de inhibina,
observaciones de células fetales en suero y ultrasonidos. Es una
ventaja de la presente invención que el procedimiento pueda
reemplazar las determinaciones de hCG actualmente utilizadas en el
ensayo de marcador triple descrito anteriormente, mejorando de este
modo su sensibilidad y fiabilidad. Tal como se mencionó
anteriormente, la utilización de un procedimiento de la presente
invención como sustituto de los ensayos convencionales de hCG en el
ensayo de marcador triple u otros ensayos, proporciona la ventaja
adicional de un ensayo temprano del síndrome de Down debido a que
las cribas de hCG hiperglicosilada se pueden utilizar en el primer
trimestre del embarazo. Con un diagnostico temprano la mujer tiene
la opción de terminar el embarazo temprano mediante procedimientos
no quirúrgicos, con una mínima mortalidad o pérdida de
fertilidad.
Lo expuesto a continuación se proporciona a
título ilustrativo y explicativo de la presente invención de manera
no limitativa.
Se buscaron asideros adicionales para distinguir
entre el fragmento nuclear-\beta del embarazo
normal y de síndrome de Down. Se purificaron muestras de fragmento
nuclear-\beta de la orina de 6 mujeres embarazadas
del segundo trimestre, 3 con cariotipo normal y 3 de síndrome de
Down, así como también 2 muestras de 2 pacientes diabéticos con
cariotipo normal. Se extrajo fragmento
nuclear-\beta con 2 volúmenes de acetona a 4ºC.
Los precipitados de acetona se recogieron, se secaron y se
suspendieron en tampón fosfato-disolución salina
(PBS). Las muestras se aplicaron a una columna de Blue
Dextran-Sepharosa^{TM} (Pharmacia) se lavaron con
PBS y a continuación se eluyeron consecutivamente con PBS
conteniendo 0,6 M NaCl y a continuación con PBS conteniendo 1,0 M
NaCl. El nivel de fragmento nuclear-\beta se
midió en los eluidos. Las 3 muestras de fragmento
nuclear-\beta de síndrome de Down se eluyeron de
las columnas de Dextran Blue Sepharose en el PBS que comprendía 0,6
M NaCl, mientras que las 5 muestras de cariotipo normal se eluyeron
de la misma columna en la siguiente etapa, con PBS que contenía 1,0
M NaCl. Esto demuestra una diferencia en las propiedades físicas del
fragmento nuclear-\beta de síndrome de Down.
Se realizó el análisis de la secuencia peptídica
N-terminal de los fragmentos purificados obtenidos
de 2 de las muestras individuales de fragmento
nuclear-\beta de síndrome de Down, 1 muestra
control individual de fragmento nuclear-\beta y 1
muestra de fragmento nuclear-\beta purificado de
la orina control reunida. Las muestras purificadas dieron todas
ellas una secuencia de péptido N-terminal idéntica a
la descrita por Birken, et al., citado anteriormente. Las
muestras control individual y la reunida tuvieron una composición
de carbohidrato (residuos: 3 manosa, 0,5 fucosa y 2
N-acetilglucosamina) idéntica a la descrita por
Blithe, et al., mencionado anteriormente, para otras
muestras de fragmentos nucleares-\beta de
cariotipo normal (ver la estructura en Figura 2B. El contenido en
N-Acetil glucosalina se determinó como el producto
de hidrólisis, glucosamina). Las 2 muestras de síndrome de Down,
sin embargo, mostraron composiciones algo diferentes, con
notablemente más residuos de N-acetilglucosamina
(residuos: 3 manosa, 1 fucosa y 3,5
N-acetilglucosamina y 3 manosa, 1 fucosa y 3,2
N-acetilglucosamina, respectivamente; ver estructura
en la Figura 3B). Tal como se muestra en la Figura 1, los
fragmentos nucleares-\beta provienen de la
subunidad-\beta de hCG. Si las partes de
carbohidrato en el fragmento nuclear-\beta
modificado de síndrome de Down comprenden residuos adicionales de
N-acetilglucosamina, se esperaría que la
subunidad-\beta de hCG de la que proviene el
fragmento nuclear-\beta también comprendiese
cantidades diferentes de N-acetilglucosamina y
probablemente cantidades mayores de antenas de sialillactosamina,
dependiendo del modo de degradación de la subunidad. La composición
aberrante en carbohidrato del fragmento
nuclear-\beta de síndrome de Down explica el
perfil de elución aberrante de Blue Dextran Sepharosa^{TM}.
Se examinó la unión de la
subunidad-\beta de la orina a concanavalina A (Con
A) unida a agarosa. Con A se une a oligosacáridos y glicoproteínas
con oligosacáridos de tipo de enlace-N biantenarios
como los que se encuentran en la hCG de los embarazos normales. Las
glicoproteínas se pueden liberar de Con A con un inhibidor
competitivo, \alpha-metilmanósido. Las moléculas
con oligosacáridos triantenarios, por ejemplo hCG hiperglicosilada,
se unen poco a Con A. En consecuencia, se utilizó la unión a Con A
con el fin de realizar cribas de los embarazos con síndrome de
Down.
Se colocó Con A-agarosa, 0,15 ml
en tubos de centrífuga cónicos de 1,5 ml, se añadió 0,5 ml de orina
más 0,5 ml de tampón PBS a pH 7,3. Se agitaron los tubos durante 15
minutos y a continuación se centrifugó a 500 x g para sedimentar el
gel. A continuación se eliminó la orina-PBS no
unida. A continuación se lavaron los geles con 1 ml de PBS. El
lavado libera la proteína débilmente unida. Los tubos se agitaron y
centrifugaron otra vez y se eliminó el lavado. La Con A se eluyó
específicamente con 1 ml de PBS comprendiendo 0,05 M de
\alpha-metilmanósido. Los tubos se agitaron y
centrifugaron otra vez y los eluidos se extrajeron. El lavado y el
eluido se ensayaron a continuación para determinar
subunidad-\beta libre utilizando un
inmunoensayo.
Mientras que la mayoría de la
subunidad-\beta libre en la orina se unió y
solamente se eluyó con \alpha-metilmanósido, un
componente pequeño pero oscilante se unión débilmente y se extrajo
con el lavado de PBS. Se detectó subunidad-\beta
libre (> 0,5 ng/ml) en 18 de 109 (17%) de las muestras control y
en 9 de 15 (60%) de los lavados de las muestras de síndrome de
Down. Se encontraron niveles superiores de
subunidad-\beta libre (>1,7 ng/ml) en 9 de 109
(8%) de las muestras control y 7 de 15 (47%) de los lavados de
muestras de síndrome de Down. Se determinaron las medianas para las
muestras control a diferentes edades de gestación. Debido a que
todas las medianas fueron 0 (<0,5 ng/ml) no hubo una relación
aparente entre el nivel de subunidad-\beta libre
y la edad de gestación. Se utilizó análisis ROC con el fin de
valorar la efectividad de las mediciones independientes de los
niveles de corte. El área bajo la curva ROC fue de 0,68, lo que
indica que una discriminación del 68% entre muestras. Se determinó
la relación entre los niveles de subunidad-\beta
libre en los lavado y en las muestras de orina originales. No se
observó correlación (r^{2} <0,5), lo que indica que son
variables independientes. Los resultados indican una mayor
proporción de moléculas que no se unen a Con A, o moléculas de
oligosacárido modificadas en los embarazos de síndrome de Down.
El fragmento nuclear-\beta
tiene oligosacáridos N-enlazados degradados que
comprenden 2,0 residuos de N-acetilglucosamina y
0,5 fucosa para 3 residuos de manosa (Blithe, DL., et al.,
[Endocrinology 125:2267-2272 (1989) y Endo,
T., et al., Endocrinology
130:2052-2058 (1992)]. Utilizando una extracción
combinada de acetona y etanol y cromatografía por filtración en
gel, blue-Sepharose^{TM}, y
DEAE-Sepharose^{TM}, se purificó el fragmento
nuclear-\beta de dos orinas de embarazos de
síndrome de Down del segundo trimestre y de 2 preparaciones
control. Se realizó el análisis de la secuencia de péptidos
N-terminal (15 ciclos). Las muestras control
comprendieron 2,1 y 2,0 residuos de
N-acetilglucosamina y 0,6 y 0,5 de fucosa por 3,0
residuos de manosa, consistente con las composiciones indicadas por
Blithe et al., y Endo et al., mencionados
anteriormente. Las muestras de síndrome de Down tuvieron
composiciones diferentes, 3,5 y 3,2 residuos de
N-acetilglucosamina y 0,8 y 1,4 residuos de fucosa
por 3,0 residuos de manosa. Esto sugirió estructuras de
oligosacáridos más complejas en los fragmentos
nucleares-\beta de síndrome de Down.
Este ejemplo ilustra un inmunoensayo para
embarazos de síndrome de Down.
Se aislaron y purificaron de la orina de mujeres
embarazadas preparaciones de hCG de embarazos normales individuales
(6 mujeres), de lunar hidatidiforme (3 mujeres) y de coriocarcinoma
(4 mujeres) tal como se ha descrito anteriormente [Kardana, A.,
et al., Endocrinology, 129:1541-1550
(1991)]. En breve, hCG se extrajo de las orinas con acetona seguida
de precipitación con etanol, seguido de cromatografía de exclusión
de tamaño en Sephacryl^{TM} S-200, seguida de
cromatografía de intercambio iónico utilizando
DEAE-Sepharosa^{TM} y, otra vez, cromatografía de
exclusión de tamaño de alta resolución en Sephacryl^{TM}
S-200. Durante los procedimientos de cromatografía,
se prestó atención a la recuperación de todas las fracciones de
hCG.
Se determinaron, tal como se describió
anteriormente [Elliott, M., et al, Endocrine J., vol.
7 (1997); Cole, LA, and Birke, S., Mol. Endocrinol.
2:825-830 (1988)] las secuencias de péptidos y
las estructuras de oligosacáridos N- y O-enlazados
de las múltiples formas de hCG. Se prepararon anticuerpos
monoclonales a hCG no cortada, hCG intacta,
subunidad-\beta libre, fragmento
nuclear-\beta y hCG de coriocarcinoma con
oligosacáridos N- y O-enlazados hiperglicosilados
(hCG lote C5) utilizando las anteriores preparaciones de hCG según
procedimientos estándares [Ausubel, FM., et al., Short
Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., 1992, unidad 11]. En
breve, se inmunizaron ratones con una muestra de hCG, se administró
una segunda inmunización aproximadamente 3 semanas más tarde y se
cosecharon los bazos después de que los niveles de anticuerpos en
sangre mostraron una respuesta adecuada a la muestra. Las células
se fusionaron con células de mieloma y se obtuvieron líneas de
hibridoma. Se reportó la utilización de estos monoclonales para el
análisis de la orina del embarazo en el Third World Conference on
Early Pregnancy, 3-6 de Octubre 1996, abstract nº:
66.
Los monoclonales se utilizaron con el fin de
cribar muestras de orina analizadas utilizando el procedimiento de
Con A del Ejemplo 2. Un monoclonal contra moléculas de hCG
hiperglicosiladas (hCG lote C5) se denominó B152. Reconoció < 1%
de hCG normal pero reconoció el mismo 60% de muestras identificadas
como positivas en el ensayo de lectina.
El monoclonal B152 se utilizó a continuación con
el fin de cribar 139 muestras de orina obtenidas de 130 mujeres
embarazadas portadoras de fetos normales y 9 mujeres portadoras de
fetos con síndrome de Down. Los niveles de gonadotropina
hiperglicosilada se determinaron mediante un inmunoensayo de
sándwich de dos etapas utilizando B152 como anticuerpo de captura y
anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa contra hCG\beta, lote
4001 (Genzyme, San Carlos, CA) como trazador, utilizando
procedimientos de inmunoensayo descritos anteriormente [Elliott,
et al., mencionado anteriormente; Cole, L., et al.,
J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:704-710
(1993)]. La gonadotropina hiperglicosilada pura (lote C7 descrito
en Cole, et al., 1988, citado anteriormente) se utilizó para
estandarizar el ensayo. Se determinaron los niveles de hCG regular
(todas las formas de dímero de hCG) en un ensayo en sándwich de dos
etapas utilizando hCG NIH CR127 como estándar. Los valores de los
niveles de hCG regular y gonadotropina hiperglicosilada se
normalizaron a la concentración de creatinina tal como se escribió
en el Ejemplo 1.
Los datos de las muestras recogidas entre las
semanas 11 y 19 del embarazo se muestran en la gráfica de la Figura
4, en la que \bullet representa los valores de las muestras
normales y \circ representa los valores de síndrome de Down. Los
resultados se analizaron utilizando procedimientos estadísticos
estándar. Las medianas específicas a la edad gestacional para las
130 muestras control se ajusta mejor a una distribución Gausiana
logarítmica, entre el quinto y el noventa y cinco centil, tanto para
los embarazos no afectados como para los datos de síndrome de Down
(expresados como múltiplos de la mediana de la muestra no afectada,
MoM). Con el fin de estimar la eficacia de criba, se determinaron
las medianas y las desviaciones estándares logarítmicas (estimadas
por la diferencia 10 centil a 90 centil de los valores del log. de
MoM, dividida por 2,56) y se registraron las proporciones de
detección observadas (es decir, proporción de casos de síndrome de
Down con niveles que exceden el 95 centil de el de los embarazos no
afectados). La fórmula de la línea de la mediana fue y = 390
(0,826^{x}), en la que y es la mediana y x la edad gestacional.
El logaritmo de la mediana de las muestras control fue -0,007 y el
logaritmo de la desviación estándar fue 0,45. Los 9 casos de
síndrome de Down excedieron el 70 centil de los embarazos no
afectados. La mediana del nivel de gonadotropina hiperglicosilada en
el síndrome de Down fue 4,4 múltiplos de la mediana no afectada
(log. mediana = 0,065). Seis de las 9 muestras de síndrome de Down
(67%), comprendiendo 2 de los 3 casos del primer trimestre y 4 de
los 6 casos del segundo trimestre, excedieron el 95 centil, y 3 de
las 9 muestras (33%) excedieron el 100 centil de los embarazos no
afectados.
Se determinaron los niveles de hCG regular. La
gonadotropina hiperglicosilada correspondió al 3,7% de las
moléculas de hCG regular en el embarazo normal (media de 29 ng/mg y
781 ng/mg creatinina, respectivamente) y al 11% de las moléculas de
hCG regular en las muestras de embarazos de síndrome de Down (media
de 193 ng/mg y 1690 ng/mg creatinina, respectivamente).
Los resultados indican que el monoclonal B152
está probablemente reconociendo las modificaciones del carbohidrato
de hCG y que, por consiguiente, se puede utilizar en un inmunoensayo
de hCG hiperglicosilada en un procedimiento de la invención.
La descripción anterior tiene por objeto mostrar
a los expertos en la materia cómo poner en práctica la presente
invención y no se pretende que detalle todas las modificaciones y
variaciones obvias de la misma que resultarán evidentes para los
expertos en la materia a partir de la descripción. Se pretende, sin
embargo, que todas las modificaciones y variaciones obvias queden
comprendidas en el alcance de la presente invención, que se define
en las reivindicaciones adjuntas. Las reivindicaciones se pretende
que reivindiquen los componentes y las etapas en todas las
secuencias que resulten eficaces para conseguir los objetivos
pretendidos, a menos que el contexto indique lo contrario
específicamente.
Claims (16)
1. Procedimiento para el cribado de la presencia
o ausencia del síndrome de Down en el feto de una mujer embarazada
que comprende determinar la presencia del síndrome de Down mediante
la observación de gonadotropina hiperglicosilada en una muestra
biológica de ensayo proporcionada a partir de la mujer
embarazada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la muestra de ensayo se selecciona de entre el grupo
constituido por orina, plasma, suero y saliva.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicha muestra es orina o suero y la gonadotropina
hiperglicosilada comprende hCG hiperglicosilada y fragmento
nuclear-\beta.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra es de una mujer
embarazada en el primer o segundo trimestre del embarazo.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la gonadotropina hiperglicosilada
se ensaya utilizando un ensayo seleccionado de entre el grupo
constituido por análisis de carbohidrato, inmunoensayo, y
combinaciones de los mismos; o en el que la gonadotropina
hiperglicosilada se ensaya utilizando un anticuerpo a por lo menos
una especie de la población de gonadotropina coriónica que presenta
las partes de carbohidrato aberrante que se observan en el síndrome
de Down.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que se utiliza una lectina específica
a la porción de carbohidrato de la gonadotropina hiperglicosilada
con el fin de separar especies de gonadotropina coriónica que
presentan partes de carbohidrato aberrantes antes del inmunoensayo
y/o en el que el ensayo utiliza una lectina específica a la porción
de carbohidrato modificado en la gonadotropina del síndrome de
Down.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la lectina comprende la concanavalina A.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la observación de
gonadotropina hiperglicosilada se determina utilizando una lectina
específica a la porción de carbohidrato de la gonadotropina
coriónica de síndrome de Down.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la lectina comprende la concanavalina A.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la observación de
gonadotropina hiperglicosilada comprende un ensayo para
monosacáridos o partes de carbohidrato modificadas en la
muestra.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende una comparación de las
propiedades físicas de la población de gonadotropina coriónica en la
muestra de ensayo con una muestra correspondiente que contiene una
población de gonadotropina coriónica normal.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que la comparación se realiza utilizando un procedimiento
seleccionado de entre el grupo constituido por cromatografía,
electroforesis, enfoque isoeléctrico, y combinaciones de los
mismos.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la criba comprende además un
ensayo de estriol y \alpha-fetoproteína.
14. Utilización de gonadotropina
hiperglicosilada en una criba de embarazos como medio destinado a
detectar fetos presentan el síndrome de Down.
15. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el análisis de carbohidratos se selecciona de entre el grupo
constituido por cromatografía, electroforesis, enfoque
isoeléctrico, y combinaciones de los mismos.
16. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el ensayo utiliza ELISA.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2556896P | 1996-09-06 | 1996-09-06 | |
| US25568P | 1996-09-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2317656T3 true ES2317656T3 (es) | 2009-04-16 |
Family
ID=21826817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97943383T Expired - Lifetime ES2317656T3 (es) | 1996-09-06 | 1997-09-05 | Cribado prenatal del sindrome de down utilizando gonadotropina hiperglicosilada. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6429018B1 (es) |
| EP (2) | EP0923730B1 (es) |
| JP (2) | JP3950481B2 (es) |
| AT (1) | ATE412896T1 (es) |
| CA (1) | CA2264840C (es) |
| DE (1) | DE69739072D1 (es) |
| DK (1) | DK0923730T3 (es) |
| ES (1) | ES2317656T3 (es) |
| PT (1) | PT923730E (es) |
| WO (1) | WO1998010282A1 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6500627B1 (en) * | 1998-02-03 | 2002-12-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by HCG assay |
| US6927034B2 (en) * | 1998-02-03 | 2005-08-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for detecting trophoblast malignancy by HCG assay |
| US7198954B1 (en) * | 1999-02-03 | 2007-04-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
| US6994966B2 (en) * | 2000-02-17 | 2006-02-07 | Glycominds Ltd. | Combinatorial complex carbohydrate libraries and methods for the manufacture and uses thereof |
| AU4234900A (en) * | 1999-04-12 | 2000-11-14 | Alexander Krichevsky | Detection of cancer and abnormal pregnancy using monoclonal antibodies specific for hcg isoforms |
| WO2003012445A1 (en) | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods and kits for detecting ita in a biological sample |
| US20030027234A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-06 | Pandian Murugan R. | Methods for detecting Down's syndrome |
| US6627457B2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-09-30 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting pregnancy |
| US7314760B2 (en) * | 2003-06-10 | 2008-01-01 | Stc. Unm | Biochemical test for identifying pregnancies with Down's syndrome fetus |
| GB2404734A (en) * | 2003-08-05 | 2005-02-09 | Secr Defence | A method of screening a sample for abnormally glycosylated and/or expressed proteins |
| US7315787B2 (en) * | 2003-10-07 | 2008-01-01 | Ntd Laboratories, Inc. | Multi-marker screening protocol for fetal abnormalities |
| AT500321B1 (de) * | 2003-12-30 | 2006-02-15 | Red Bull Gmbh | Verfahren zur diagnose des down-syndroms |
| US20050148096A1 (en) * | 2004-01-07 | 2005-07-07 | Cole Laurence A. | Methods for detecting pregnancy |
| US7572639B2 (en) * | 2004-06-03 | 2009-08-11 | Stc.Unm | Method and apparatus for predicting pregnancy outcome |
| US7666683B1 (en) | 2004-10-13 | 2010-02-23 | Stc.Unm | Rapid method of diagnosing a normal pregnancy with high accuracy |
| US20060105411A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Cole Laurence A | Method of detecting early pregnancy at high accuracy by measuring hCG and hyperglycosylated hCG concentrations equally |
| JP2009504659A (ja) * | 2005-08-08 | 2009-02-05 | オンコノン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 抗体組成物、腫瘍性疾患の処置方法、および受胎能の調節方法 |
| US20100267062A1 (en) * | 2007-09-26 | 2010-10-21 | Norbert Frey | Osteopontin as Novel Prognostic Biomarker for Heart Failure |
| WO2009137015A2 (en) * | 2008-05-03 | 2009-11-12 | New York University School Of Medicine | Biomarkers of ionizing radiation |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4874693A (en) | 1986-10-10 | 1989-10-17 | Mark Bogart | Method for assessing placental dysfunction |
| US5506150A (en) * | 1987-07-09 | 1996-04-09 | 3I Research Exploitation Limited | Prenatal screening for down's syndrome |
| US5356817A (en) * | 1988-06-09 | 1994-10-18 | Yale University | Methods for detecting the onset, progression and regression of gynecologic cancers |
| US5445968A (en) * | 1989-01-03 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Purification of human chorionic gonadotropin β-core molecule and preparation of antibodies with specificity for same |
| US5252489A (en) * | 1989-01-17 | 1993-10-12 | Macri James N | Down syndrome screening method utilizing dried blood samples |
| JP3537535B2 (ja) | 1994-07-14 | 2004-06-14 | 株式会社中埜酢店 | 免疫グロブリンｇ結合糖鎖構造に基づく臨床検査方法 |
| US5674727A (en) * | 1994-08-31 | 1997-10-07 | Cole; Laurence A. | Human chorionic gonadotropin beta-subunit nicking enzyme |
-
1997
- 1997-09-05 JP JP51300898A patent/JP3950481B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 WO PCT/US1997/016657 patent/WO1998010282A1/en not_active Ceased
- 1997-09-05 US US09/254,377 patent/US6429018B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 PT PT97943383T patent/PT923730E/pt unknown
- 1997-09-05 EP EP97943383A patent/EP0923730B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 DE DE69739072T patent/DE69739072D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 DK DK97943383T patent/DK0923730T3/da active
- 1997-09-05 AT AT97943383T patent/ATE412896T1/de active
- 1997-09-05 ES ES97943383T patent/ES2317656T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 CA CA002264840A patent/CA2264840C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 EP EP08014397A patent/EP1992944A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-01-25 JP JP2007014847A patent/JP2007163505A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0923730B1 (en) | 2008-10-29 |
| DK0923730T3 (da) | 2009-02-09 |
| PT923730E (pt) | 2008-12-04 |
| ATE412896T1 (de) | 2008-11-15 |
| DE69739072D1 (de) | 2008-12-11 |
| EP1992944A1 (en) | 2008-11-19 |
| EP0923730A1 (en) | 1999-06-23 |
| US6429018B1 (en) | 2002-08-06 |
| JP2007163505A (ja) | 2007-06-28 |
| JP2001506744A (ja) | 2001-05-22 |
| JP3950481B2 (ja) | 2007-08-01 |
| WO1998010282A1 (en) | 1998-03-12 |
| CA2264840A1 (en) | 1998-03-12 |
| CA2264840C (en) | 2006-04-04 |
| EP0923730A4 (en) | 1999-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2317656T3 (es) | Cribado prenatal del sindrome de down utilizando gonadotropina hiperglicosilada. | |
| Ruoslahti et al. | Studies of carcino‐fetal proteins. III. Development of a radioimmunoassay for α‐fetoprotein. Demonstration of α‐fetoprotein in serum of healthy human adults | |
| EP0755515B1 (en) | Method and device for detecting free igfbp-1 | |
| Stenman et al. | Standardization of protein immunoprocedures choriogonadotropin (Cg) | |
| US4874693A (en) | Method for assessing placental dysfunction | |
| CA2372666C (en) | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hcg assay | |
| EP1419384B1 (en) | Methods for detecting pregnancy | |
| US8753825B2 (en) | Methods and kits for detecting ITA in a biological sample | |
| HUSSA et al. | Discordant human chorionic gonadotropin results: causes and solutions | |
| US5514598A (en) | Prenatal detection of meconium | |
| US4116776A (en) | Diagnostic blood test and kit for detecting human chorionic gonadotropin | |
| Birken et al. | Immunochemical measurement of early pregnancy isoforms of HCG: potential applications to fertility research, prenatal diagnosis, and cancer | |
| Norman et al. | Measurement of human chorionic gonadotrophin (hCG): indications and techniques for the clinical laboratory | |
| Alfthan et al. | Specificity and detection limit of ten pregnancy tests | |
| EP0933637B1 (en) | Prenatal detection of chromosomal abnormality | |
| WO2017011876A1 (en) | Glycoform biomarkers | |
| WO1993024838A1 (en) | Screening method for identifying women at increased risk for preterm delivery | |
| EP1914553A1 (en) | Method for identifying women with an increased risk of foetal growth retardation | |
| US7198954B1 (en) | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay | |
| US7871762B2 (en) | Hyperglycosylated hCG (invasive trophoblast antigen) in differential diagnosis of malignant or invasive trophoblastic disease | |
| US20060105411A1 (en) | Method of detecting early pregnancy at high accuracy by measuring hCG and hyperglycosylated hCG concentrations equally | |
| US7314760B2 (en) | Biochemical test for identifying pregnancies with Down's syndrome fetus | |
| Udoji et al. | Chemistry: Diagnostic Problems with Variant Forms of Human Chorionic Gonadotropin | |
| Riley | The diagnostic value of invasive trophoblast antigen (ITA) in early normal and aberrant pregnancy |