ES2317664T3 - Homologos de motilina. - Google Patents
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Abstract
Una molécula polipeptídica aislada que comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia polipeptídica que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 24 al resto 37; (b) una secuencia polipeptídica que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 24 al resto 41; (c) una secuencia polipeptídica que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 24 al resto 117; (d) una secuencia polipeptídica que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 1 al resto 37; y (e) una secuencia polipeptídica que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 1 al resto 117; polipéptido que es capaz de estimular la motilidad gástrica o la absorción de glucosa.
Description
Homólogos de motilina.
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Muchos de los péptidos reguladores que son
importantes en el mantenimiento de la homeostasis nutricional se
encuentran en el entorno gastrointestinal. Estos péptidos pueden ser
sintetizados en el sistema digestivo y actuar localmente, pero
también pueden ser identificados en el cerebro. Además, también se
encuentra lo inverso, es decir, los péptidos se sintetizan en el
cerebro pero se halla que regulan células en el tracto
gastrointestinal. Este fenómeno ha sido denominado "eje del
cerebro-intestino" y es importante para dar la
señal de saciedad, regular la temperatura corporal, y otros procesos
fisiológicos que requieren una retroalimentación entre el cerebro y
el intestino.
Las hormonas peptídicas del intestino incluyen
gastrina, colecistoquinina (CCK; del inglés,
cholecystokinin), secretina, péptido
inhibitorio gástrico (GIP; del inglés, gastric
inhibitory peptide), polipéptido intestinal
vasoactivo (VIP; del inglés, vasoactive intestinal
polypeptide), motilina, somatostatina, péptido pancreático
(PP), sustancia P y neuropéptido Y (NPY), y utilizan diversos
mecanismos de acción diferentes. Por ejemplo, la gastrina, la
motilina y la CCK actúan como hormonas de tipos endocrino y
neurocrino. Se cree que otras, tales como la gastrina y el GIP,
actúan exclusivamente de un modo endocrino. Otros modos de acción
incluyen una combinación de acciones endocrinas, neurocrinas y
paracrinas (somatostatina), una acción exclusivamente neurocrina
(NPY), y una combinación de acciones neurocrinas y paracrinas (VIP y
Sustancia P). La mayoría de las acciones de las hormonas
intestinales son mediadas por receptores unidos a membrana y activan
sistemas de segundo mensajero. Para una revisión de los péptidos
intestinales, véase Mulvihill et al. en Basic and
Clinical Endocrinology, páginas 551-570, 4ª
edición, compilado por F. S. Greenspan y J. D. Baxter, Appleton y
Lange, Norwalk, Connecticut, EE.UU., 1994.
Muchos de estos péptidos intestinales son
sintetizados como moléculas precursoras inactivas que requieren
múltiples escisiones peptídicas para resultar activadas. La familia
conocida como familia de "glucagón-secretina",
que incluye VIP, gastrina, secretina, motilina, glucagón y galanina,
ejemplifica péptidos regulados por múltiples escisiones y
modificaciones postraduccionales.
La motilina es un péptido de 22 aminoácidos
hallado en el tejido intestinal de especies de mamífero (W.
Domschke, Digestive Diseases 22 (5):
454-461, 1977). Se han identificado las secuencias
de DNA y de aminoácidos de la premotilina porcina (Patente de
EE.UU. nº 5.006.469). La motilina ha sido identificada como un
factor capaz de aumentar la motilidad gástrica, afectando a la
función secretora del estómago al estimular la secreción de pepsina
(Brown et al., Canadian J. of Physiol. Pharmacol.
49: 399-405, 1971), y una evidencia reciente
sugiere un papel en la regulación mioeléctrica del estómago y el
intestino delgado. Los aumentos cíclicos de motilina se han
correlacionado con la fase III del complejo mioeléctrico
interdigestivo y con la contracción del duodeno por el hambre (Chey
et al. en Gut Hormones, compilado por S. R. Bloom,
páginas 355-358, Edinburgh, Churchill Livingstone,
1978; Lee et al., Am J. Digestive Diseases 23:
789-795, 1978; e Itoh et al., Am J.
Digestive Diseases 23: 929-935, 1978). Se
ha demostrado que la motilina y los compuestos análogos de motilina
producen la contracción del músculo liso gastrointestinal pero no de
otros tipos de células musculares lisas (Strunz et al.,
Gastroenterology 68, 1485-1491,
1975).
La presente invención se dirige a una nueva
proteína secretada con homología con respecto a la motilina, de la
que se ha hallado que es transcrita en el sistema gastrointestinal.
El descubrimiento de este nuevo péptido es importante para la
elucidación ulterior de cómo el organismo mantiene su homeostasis
nutricional y para el desarrollo de terapias que
intervengan en esos procesos, así como para otros usos que resultarán evidentes a partir de las enseñanzas presentes.
intervengan en esos procesos, así como para otros usos que resultarán evidentes a partir de las enseñanzas presentes.
La presente invención proporciona una molécula
polipeptídica aislada que comprende una secuencia polipeptídica
seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 24 al resto 37;
(b) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 24 al resto 41;
(c) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 24 al resto 117;
(d) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 1 al resto 37; y
(e) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 1 al resto 117;
polipéptido que es capaz de
estimular la motilidad gástrica o la absorción de
glucosa.
La presente invención también proporciona una
molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
\global\parskip0.870000\baselineskip
(a) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
70 al nucleótido 111;
(b) secuencias nucleotídicas degeneradas de
(a);
(c) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
70 al nucleótido 120;
(d) secuencias nucleotídicas degeneradas de
(c);
(e) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
70 al nucleótido 351;
(f) secuencias nucleotídicas degeneradas de
(e);
(g) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
1 al nucleótido 111;
(h) secuencias nucleotídicas degeneradas de (g);
y
(i) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
1 al nucleótido 351;
polinucleótido que codifica un
polipéptido capaz de estimular la motilidad gástrica o la absorción
de
glucosa.
La presente invención proporciona además un
anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que consiste
en la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 2 o a un fragmento de
dicho polipéptido, fragmento que consiste en una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) del resto 24 al resto 117 de la ID. SEC. nº
2; y
(b) del resto 24 al resto 37 de la ID. SEC. nº
2.
La presente invención también proporciona un
método para producir un anticuerpo, que comprende las operaciones
siguientes: inocular en un animal un polipéptido seleccionado del
grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que consiste en la secuencia
de aminoácidos de la ID. SEC. nº 2, de los restos 24 a 117; y
(b) un polipéptido que consiste en la secuencia
de aminoácidos de la ID. SEC. nº 2, de los restos 24 a 37;
polipéptido que provoca una
respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo, y aislar
el anticuerpo del
animal.
La presente invención proporciona además una
composición farmacéutica que comprende un polipéptido purificado
como el definido en la Reivindicación 1, en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona además un
vector de expresión que comprende los siguientes elementos
operativamente unidos:
un promotor de transcripción;
un polinucleótido como el definido en la
Reivindicación 3; y
un terminador de transcripción.
La presente invención también proporciona una
célula en cultivo en la que se ha introducido un vector de expresión
como el anteriormente definido, célula que expresa el polipéptido
codificado por el polinucleótido.
Más aún, la presente invención proporciona el
uso de un polipéptido como el definido en la Reivindicación 1,
polipéptido que consiste en los restos 24 a 37 de la ID. SEC. nº 2,
para la fabricación de un medicamento para estimular la motilidad
gástrica, polipéptido que, en uso, aumenta el tiempo de tránsito o
el vaciamiento gástrico de una sustancia ingerida.
La presente invención proporciona así un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con respecto a la
secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 24
al resto 37.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una molécula polinucleotídica aislada como la definida en las
reivindicaciones, que codifica un polipéptido, seleccionada del
grupo que consiste en: (a) moléculas polinucleotídicas que
consisten en una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la ID.
SEC. nº 1, del nucleótido 70 al nucleótido 111; y (b) secuencias
nucleotídicas degeneradas de (a).
\global\parskip0.950000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un polipéptido aislado como el definido en las
reivindicaciones, seleccionado del grupo que consiste en: (a)
moléculas polipeptídicas que consisten en una secuencia de
aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 24 al
resto 37.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un vector de expresión como el definido en las
reivindicaciones, que comprende los siguientes elementos
operativamente unidos: un promotor de transcripción; un segmento de
DNA seleccionado del grupo que consiste en: (a) moléculas
polinucleotídicas que consisten en una secuencia de nucleótidos
como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido 70 al
nucleótido 111, y (b) secuencias nucleotídicas degeneradas de (a);
y un terminador de transcripción.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una célula en cultivo como la definida en las
reivindicaciones, en la que se ha introducido un vector de
expresión que comprende los siguientes elementos operativamente
unidos: un promotor de transcripción; un segmento de DNA
seleccionado del grupo que consiste en: (a) moléculas
polinucleotídicas que consisten en una secuencia de nucleótidos
como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido 70 al
nucleótido 111, y (b) secuencias nucleotídicas degeneradas de (a);
y un terminador de transcripción; célula que expresa el polipéptido
codificado por el segmento de DNA.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende un
polipéptido purificado como el definido en las reivindicaciones, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos como la
mostrada en la ID. SEC. nº 2, del resto 24 al resto 117.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para producir un polipéptido zsig33, que
comprende: cultivar una célula en la que se ha introducido un
vector de expresión como el definido en las reivindicaciones de
modo que dicha célula exprese un polipéptido codificado por el
segmento de DNA; y recuperar el polipéptido.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona el uso, como se define en las reivindicaciones, de un
polipéptido que consiste en los restos 24-37 de la
ID. SEC. nº 2, para la fabricación de un medicamento para estimular
la motilidad gástrica, polipéptido que, en uso, aumenta el tiempo de
tránsito o el vaciamiento gástrico de una sustancia ingerida.
Antes de describir con detalle la presente
invención, puede ser útil definir ciertos términos aquí
utilizados.
El término "ortólogo" significa un
polipéptido o proteína obtenida de una especie, que es el
equivalente funcional de un polipéptido o proteína de una especie
diferente. Las diferencias de secuencia entre ortólogos son el
resultado de la evolución de las especies.
Los "parálogos" son proteínas distintas,
aunque estructuralmente relacionadas, generadas por un organismo.
Se cree que los parálogos surgen a través de duplicaciones génicas.
Por ejemplo, la \alpha-globina, la
\beta-globina y la mioglobina son parálogas entre
sí.
La expresión "variante alélica" significa
cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el
mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a
través de mutaciones y puede dar lugar a un polimorfismo fenotípico
dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser
silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden
codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos
alteradas. La expresión "variante alélica" se usa también aquí
para significar una proteína codificada por una variante alélica de
un gen.
La frase "vector de expresión" significa
una molécula de DNA, lineal o circular, que comprende un segmento
que codifica un polipéptido de interés, operativamente unido a
segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Dichos
segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y
terminadoras y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de
replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador,
una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de
expresión proceden generalmente de DNA plasmídico o vírico, o pueden
contener elementos de ambos.
El término "aislado", cuando se aplica a
una molécula polinucleotídica, significa que el polinucleótido ha
sido extraído de su entorno genético natural y, por ello, carece de
otras secuencias de codificación extrañas o indeseadas, y está en
una forma adecuada para uso en sistemas para la producción de
proteínas genéticamente construidas. Dichas moléculas aisladas son
aquéllas que son separadas de su ambiente natural e incluyen clones
de cDNA y genómicos. Las moléculas de DNA aisladas de la presente
invención carecen de otros genes con los que están normalmente
asociadas, pero pueden incluir regiones 5' y 3' no traducidas
presentes en la naturaleza, tales como promotores y terminadores.
La identificación de regiones asociadas será evidente para quien
tiene una experiencia normal en la técnica (véase, por ejemplo,
Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).
Cuando se aplica a una proteína, el término "aislado" indica
que la proteína se halla en un estado distinto del de su ambiente
nativo, tal como separada de sangre y tejido animal. En una forma
preferida, la proteína aislada carece sustancialmente de otras
proteínas, particularmente de otras proteínas de origen animal. Se
prefiere obtener la proteína en una forma muy purificada, es decir,
con una pureza superior a 95%, más preferiblemente una pureza
superior a 99%.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La expresión "operativamente unido", cuando
hace referencia a segmentos de DNA, significa que los segmentos
están dispuestos de modo que actúan de acuerdo con sus fines
previstos; por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y
continúa por todo el segmento de codificación hasta el
terminador.
El término "polinucleótido" significa un
polímero, de cadena sencilla o doble, de bases
desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5'
al 3'. Los polinucleótidos incluyen RNA y DNA, y pueden ser aislados
de fuentes naturales, sintetizados in vitro o preparados a
partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas.
La expresión "complementos de moléculas
polinucleotídicas" significa moléculas polinucleotídicas que
tienen una secuencia de bases complementaria y una orientación
inversa con respecto a una secuencia de referencia. Por ejemplo, la
secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria de 5' CCCGTGCAT 3'.
La expresión "secuencia nucleotídica
degenerada" significa una secuencia de nucleótidos que incluye
uno o más codones degenerados (en comparación con una molécula
polinucleotídica de referencia que codifica un polipéptido). Los
codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos
pero codifican el mismo resto de aminoácido (es decir, tanto el
triplete GAU como el GAC codifican Asp).
El término "promotor" significa una porción
de un gen que contiene secuencias de DNA que proporcionan la unión
de la RNA polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las
secuencias promotoras se hallan comúnmente, aunque no siempre, en
las regiones no codificadoras 5' de los genes.
La expresión "secuencia señal secretora"
significa una secuencia de DNA que codifica un polipéptido (un
"péptido secretor") que, como componente de un polipéptido más
grande, dirige al polipéptido más grande a través de una ruta
secretora de una célula en la que es sintetizado. El polipéptido más
grande es comúnmente escindido para que se separe el péptido
secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora.
El término "receptor" significa una
proteína asociada a la célula, que se une a una molécula bioactiva
(es decir, un ligando) y media en el efecto del ligando sobre la
célula. Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una
estructura de múltiples dominios que comprende un dominio
extracelular que se une al ligando y un dominio efector
intracelular que está típicamente implicado en la transducción de
señales. La unión del ligando al receptor da lugar a un cambio
conformacional en el receptor, que causa una interacción entre el
dominio efector y otra(s) molécula(s) en la célula.
Esta interacción conduce a su vez a una alteración en el metabolismo
de la célula. Los procesos metabólicos que están ligados a
interacciones de receptor-ligando incluyen
transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos de
la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular,
movilización de lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de
lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. La mayoría de los
receptores nucleares también presentan una estructura de múltiples
dominios, incluyendo un dominio amino-terminal de
transactivación, un dominio de unión a DNA y un dominio de unión al
ligando. En general, los receptores pueden estar unidos a la
membrana o ser citosólicos o nucleares; y pueden ser monómeros (por
ejemplo, el receptor de la hormona estimuladora del tiroides y el
receptor beta-adrenérgico) o multímeros (por
ejemplo, el receptor de PDGF, el receptor de la hormona del
crecimiento,
el receptor de IL-3, el receptor de GM-CSF, el receptor de G-CSF, el receptor de eritropoyetina y el receptor de IL-6).
el receptor de IL-3, el receptor de GM-CSF, el receptor de G-CSF, el receptor de eritropoyetina y el receptor de IL-6).
La expresión "pareja de
complemento/anticomplemento" significa grupos no idénticos que
forman una pareja estable y no covalentemente asociada bajo las
condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o
estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja de
complemento/anticomplemento. Otras parejas de
complemento/anticomplemento ejemplares incluyen parejas de
receptor/ligando, parejas de anticuerpo/antígeno (o hapteno o
epítopo), parejas de polinucleótidos sentido/antisentido, y
similares. Cuando es deseable la subsiguiente disociación de la
pareja de complemento/anticomplemento, la pareja de
complemento/anticomplemento tiene preferiblemente una afinidad de
unión < 10^{9} M^{-1}.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento de una nueva secuencia de DNA humana que codifica un
nuevo polipéptido secretado que presenta homología con la motilina,
del cual el compuesto homólogo más cercano es la motilina porcina
(mostrada en las ID. SEC. números 3 y 4). La motilina es un miembro
de una familia de polipéptidos que regulan la fisiología
gastrointestinal. La familia de polipéptidos importantes en cuanto
a la regulación gastrointestinal a la que pertenece la motilina
incluye glucagón, gastrina, galanina y el péptido intestinal
vasoactivo (VIP). Estos polipéptidos son sintetizados en una forma
precursora que requiere múltiples pasos de procesamiento hasta la
forma activa. Cuando el procesamiento acarrea la separación de una
secuencia señal seguida de la escisión de uno o más péptidos
accesorios para que se libere el péptido activo, la motilina, el
VIP y la galanina son particularmente relevantes para el polipéptido
de la presente invención. El péptido activo resultante es
generalmente pequeño (10-30 aminoácidos) y puede
requerir otras modificaciones postraduccionales, tales como
amidación, sulfatación o modificación de restos glutámicos con
ácido pirrolidonacarboxílico.
Un análisis de la distribución tisular del mRNA
que corresponde a este nuevo DNA mostró que la expresión era máxima
en el estómago, seguida de unos niveles de expresión evidentes
aunque disminuidos en el intestino delgado y el páncreas. La EST
también está presente en bancos de cDNA de pulmón. El polipéptido ha
sido denominado zsig33.
Los nuevos polinucleótidos y polipéptidos zsig33
de la presente invención fueron inicialmente identificados buscando
secuencias que poseyeran una supuesta señal de secreción en una base
de datos de ESTs. Se descubrió una secuencia de EST y se previó que
estaba relacionada con la familia de la motilina. La secuencia de
EST procedía de un banco pancreático fetal.
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El nuevo polipéptido codificado por el cDNA de
longitud completa tiene 117 aminoácidos. La prevista secuencia
señal tiene 23 restos de aminoácido (los restos de aminoácido 1 a 23
de la ID. SEC. nº 2). Se previó que el péptido activo tendría 16
restos de aminoácido (los restos de aminoácido 24 a 41 de la ID.
SEC. nº 2), con una escisión C-terminal detrás del
resto de aminoácido 41 de la ID. SEC. nº 2 (Ser). Sin embargo,
muchos de los péptidos del intestino-cerebro
requieren múltiples escisiones. Por ejemplo, el péptido progastrina
tiene 101 aminoácidos y es escindido por el extremo N para dar
lugar a péptidos sucesivamente más pequeños (G34, G17 y G14)
(Sugano et al., J. Biol. Chem. 260:
11.724-11.729, 1985). Otros péptidos que requieren
múltiples pasos de procesamiento incluyen el glucagón, en el que la
escisión C-terminal da lugar al péptido 1 similar
al glucagón y el péptido 2 similar al glucagón, y la galanina, cuyo
procesamiento acarrea la escisión de un péptido
C-terminal conocido como GMAP. Por lo tanto, se
sintetizó un péptido adicional basándose en una escisión detrás del
aminoácido 37 de la ID. SEC. nº 2 (Gln), y resultó un péptido de 14
amino-
ácidos con actividad biológica [del resto de aminoácido 24 (Gly) al resto de aminoácido 37 (Gln) de la ID. SEC. nº 2].
ácidos con actividad biológica [del resto de aminoácido 24 (Gly) al resto de aminoácido 37 (Gln) de la ID. SEC. nº 2].
El péptido C-terminal
(aminoácidos 42 a 117 de la ID. SEC. nº 2) puede tener también
cierta actividad especializada. El procesamiento del péptido activo
para la motilina (mostrado en la ID. SEC. nº 4) da lugar a la
liberación de un péptido C-terminal de 70
aminoácidos, del resto de aminoácido 50 (Ser) al resto de aminoácido
119 (Lys), conocido como péptido asociado a la motilina (MAP; del
inglés, motilin-associated peptide). Adelman
et al. (Patente de EE.UU. nº 5.006.469) han propuesto la
hipótesis de que el MAP desempeña un papel en la regulación de la
digestión, el apetito y la absorción de nutrientes.
Los aminoácidos muy conservados del polipéptido
zsig33 pueden ser utilizados como una herramienta para identificar
nuevos miembros de la familia. Por ejemplo, se puede utilizar la
transcripción inversa-reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR; del inglés, reverse
transcription-polymerase chain reaction)
para multiplicar secuencias que codifican el motivo conservado a
partir de RNA obtenido de una diversidad de fuentes tisulares.
Utilizando secuencias de la presente invención, se han identificado
dos de tales dominios conservados. El primer dominio se encuentra
en los restos de aminoácido 31 a 36 de la ID. SEC. nº 2, donde el
motivo identificado es Glu X Gln Arg X Gln, siendo X cualquier
resto de aminoácido (mostrado en la ID. SEC. nº 5), y el segundo
dominio se encuentra en los restos de aminoácido 78 a 84 de la ID.
SEC. nº 2, donde el motivo identificado es Ala Pro X Asp X Gly Ile,
siendo X cualquier resto de aminoácido (mostrado en la ID. SEC. nº
6). En particular, los cebadores muy degenerados diseñados a partir
de estas secuencias son útiles para este fin.
Los expertos en la técnica reconocerán enseguida
que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible
una considerable variación de secuencias entre estas moléculas
polinucleotídicas que codifican la ID. SEC. nº 2, incluyendo todas
las secuencias de RNA al sustituir T por U. De este modo, la
presente invención contempla polinucleótidos que codifican el
polipéptido zsig33 y sus equivalentes de RNA. En la Tabla 1 se
exponen los códigos de una letra utilizados para representar
posiciones nucleotídicas degeneradas. Las "resoluciones" son
los nucleótidos representados mediante una letra del código. El
"complemento" indica el código para el(los)
nucleótido(s) complementario(s).
Por ejemplo, el código Y significa C o T, y su complemento R significa A o G, siendo A complementario de T y siendo G complementario de C.
Por ejemplo, el código Y significa C o T, y su complemento R significa A o G, siendo A complementario de T y siendo G complementario de C.
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En la Tabla 2 se exponen los codones degenerados
que abarcan todos los posibles codones para un aminoácido dado.
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Quien tiene una experiencia normal en la técnica
apreciará que se introduce cierta ambigüedad a la hora de
determinar un codón degenerado, representativo de todos los posibles
codones que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, en ciertas
circunstancias, el codón degenerado para serina (WSN) puede
codificar arginina (AGR) y, en ciertas circunstancias, el codón
degenerado para arginina (MGN) puede codificar serina (AGY). Existe
una relación similar entre los codones que codifican fenilalanina y
leucina. De esta manera, algunos polinucleótidos abarcados por la
secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos
variantes, pero quien tiene una experiencia normal en la técnica
puede identificar fácilmente dichas secuencias variantes por
referencia a la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 2. Las
secuencias variantes pueden ser fácilmente examinadas en cuanto a
su funcionalidad, como aquí se
describe.
describe.
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En realizaciones preferidas de la invención, los
polinucleótidos aislados se hibridarán con regiones de tamaño
similar de la ID. SEC. nº 1, o con una secuencia complementaria de
las mismas, bajo condiciones rigurosas. En general, las condiciones
rigurosas se seleccionan de modo que la temperatura sea
aproximadamente 5ºC menor que el punto de fusión térmica (Tm) de la
secuencia específica en una fuerza iónica y un pH definidos. El Tm
es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la
cual el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda
perfectamente correspondiente. Son condiciones rigurosas típicas
aquéllas en que la concentración de sal es al menos aproximadamente
0,02 M en un pH de 7 y la temperatura es al menos aproximadamente
60ºC.
Como se indicó previamente, los polinucleótidos
aislados de la presente invención incluyen DNA y RNA. Los métodos
para aislar DNA y RNA son bien conocidos en la técnica. Se prefiere
generalmente aislar el RNA del estómago, aunque también se puede
preparar DNA utilizando RNA de otros tejidos o se puede aislar como
DNA genómico. Se puede preparar RNA total utilizando una extracción
con guanidina\cdotHCl seguida de un aislamiento por
centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin et al.,
Biochemistry 18: 52-94, 1979). Se
prepara poli(A)+ RNA a partir del RNA total usando el método
de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:
1408-1412, 1972). Se prepara DNA complementario
(cDNA) a partir de poli(A)+ RNA usando métodos conocidos. Los
polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig33 son luego
identificados y aislados mediante, por ejemplo, hibridación o
PCR.
En la presente solicitud se describen
polipéptidos y polinucleótidos equivalentes de otras especies
(ortólogos). Son de particular interés los polipéptidos zsig33 de
otras especies de mamífero, incluyendo proteínas murinas, de rata,
porcinas, ovinas, bovinas, caninas, felinas, equinas y de otros
primates. Los ortólogos de las proteínas humanas pueden ser
clonados usando información y composiciones proporcionadas por la
presente solicitud, en combinación con técnicas de clonación
convencionales. Por ejemplo, se puede clonar un cDNA usando mRNA
obtenido de un tipo tisular o celular que exprese la proteína. Las
fuentes de mRNA adecuadas pueden ser identificadas al sondar
transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de las
secuencias aquí descritas. Luego se prepara un banco a partir del
mRNA de una línea tisular o celular positiva. Un cDNA que codifica
el ortólogo zsig33 puede ser luego aislado mediante una diversidad
de métodos, tal como sondando con un cDNA humano completo o parcial
o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las
secuencias descritas. También se puede clonar un cDNA utilizando la
reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullis, Patente de
EE.UU. nº 4.683.202), usando cebadores diseñados a partir de las
secuencias aquí descritas. En un método adicional, se puede
utilizar el banco de cDNA para transformar o transfectar células
huésped, y la expresión del cDNA de interés puede ser detectada con
un anticuerpo hacia zsig33. También se pueden aplicar técnicas
similares al aislamiento de clones genómicos.
Los expertos en la técnica reconocerán que la
secuencia descrita en la ID. SEC. nº 1 y el polipéptido codificado
por ella representan un único alelo del gen zsig33 humano y el
polipéptido, y que se espera que tengan lugar variación alélica y
corte y empalme alternativos. Se pueden clonar variantes alélicas
sondando bancos de cDNA o genómicos de diferentes individuos de
acuerdo con procedimientos estándares. Se describen aquí variantes
alélicas de la secuencia de DNA mostrada en la ID. SEC. nº 1,
incluyendo aquéllas que contienen mutaciones silentes y aquéllas en
que las mutaciones dan lugar a cambios en la secuencia de
aminoácidos, así como las proteínas que son el producto de la
variación alélica de la ID. SEC. nº 2.
En la presente solicitud también se describen
polipéptidos zsig33 aislados que son sustancialmente homólogos a
los polipéptidos de la ID. SEC. nº 2 y sus ortólogos. La expresión
"sustancialmente homólogo" se usa aquí para significar
polipéptidos que tienen 50%, preferiblemente 60%, más
preferiblemente al menos 80%, de identidad de secuencia con
respecto a las secuencias mostradas en la ID. SEC. nº 2 o sus
ortólogos. Más preferiblemente, dichos polipéptidos tendrán una
identidad de al menos 90%, y muy preferiblemente de 95% o más, con
respecto a la ID. SEC. nº 2 o sus ortólogos. El porcentaje de
identidad de secuencias es determinado por métodos convencionales.
Véanse, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio.
48: 603-616 (1986), y Henikoff y Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10.915-10.919 (1992). En resumen, se alinean dos
secuencias de aminoácidos para optimizar las calificaciones de
alineación usando una penalización de apertura de hueco de 10, una
penalización de extensión de hueco de 1 y la matriz de calificación
"blossom 62" de Henikoff y Henikoff (ibídem), mostrada
en la Tabla 3 (los aminoácidos se indican mediante los códigos de
una letra estándares).
Luego se calcula el porcentaje de identidad de
la manera siguiente:
La identidad de secuencia de moléculas
polinucleotídicas es determinada mediante métodos similares usando
una relación como la anteriormente descrita.
Las proteínas y polipéptidos sustancialmente
homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones,
supresiones o adiciones de aminoácido. Estos cambios son
preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de
aminoácido conservativas (véase la Tabla 4) y otras sustituciones
que no afectan significativamente a la plegadura ni a la actividad
de la proteína o el polipéptido; pequeñas supresiones, típicamente
de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas prolongaciones
amino- o carboxilo-terminales, tal como un resto
amino-terminal de metionina, un pequeño péptido
conector de hasta aproximadamente 20-25 restos, o
una pequeña prolongación que facilita la purificación (una etiqueta
de afinidad), tal como un tramo de polihistidina, proteína A
(Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985;
Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991),
glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:
31, 1988), proteína ligante de maltosa (Kellerman y Ferenci,
Methods Enzymol. 90: 459-463, 1982;
Guan et al., Gene 67: 21-30,
1987), tiorredoxina, ubiquitina, proteína ligante de celulosa,
polimerasa de T7, u otro epítopo antigénico o dominio de unión.
Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and
Purification 2: 95-107 (1991). Los DNAs
que codifican etiquetas de afinidad se pueden obtener de proveedores
comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, New
Jersey, EE.UU.; y New England Biolabs, Beverly, Massachusetts,
EE.UU.).
Además de los 20 aminoácidos estándares,
aminoácidos no estándares (tales como
4-hidroxiprolina,
6-N-metil-lisina,
ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y
\alpha-metilserina) pueden sustituir a restos de
aminoácido de zsig33. Restos de aminoácido de zsig33 pueden ser
sustituidos por un número limitado de aminoácidos no conservativos,
aminoácidos que no son codificados por el código genético y
aminoácidos artificiales. Los "aminoácidos artificiales" han
sido modificados después de la síntesis proteica y/o tienen
su(s) cadena(s) lateral(es) con una estructura
química diferente de la de los aminoácidos estándares. Los
aminoácidos artificiales pueden ser químicamente sintetizados o,
preferiblemente, son comercialmente asequibles, e incluyen ácido
pipecólico, ácido tiazolidinacarboxílico, deshidroprolina, 3- y
4-metilprolina, y
3,3-dimetilprolina.
Los aminoácidos esenciales de los polipéptidos
zsig33 de la presente invención pueden ser identificados de acuerdo
con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis
dirigida al sitio y mutagénesis por barrido de alaninas (Cunningham
y Wells, Science 244: 1081-1085,
1989). En la segunda técnica, se introducen mutaciones únicas de
alanina en cada resto de la molécula y se examinan las moléculas
mutantes resultantes en cuanto a su actividad biológica (por
ejemplo, estimulación de la contractilidad de las células
gastrointestinales, modulación de la incorporación de nutrientes
y/o secreción de enzimas digestivas) para identificar los restos de
aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Véase
también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:
4699-4708, 1996. Mediante el análisis físico de la
estructura, según se determina mediante técnicas tales como
resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de
electrones y marcación por fotoafinidad, junto con la mutación de
los aminoácidos del supuesto sitio de contacto, se pueden también
determinar los sitios de la interacción
ligando-receptor. Véanse, por ejemplo, de Vos et
al., Science 255: 306-312, 1992;
Smith et al., J. Mol. Biol. 224:
899-904, 1992; y Wlodaver et al., FEBS
Lett. 309: 59-64, 1992. También se
pueden inferir las identidades de los aminoácidos esenciales
mediante un análisis de homologías con miembros relacionados de la
familia de glucagón-secretina de las hormonas
peptídicas del intestino-cerebro.
Se pueden hacer y examinar múltiples
sustituciones de aminoácidos utilizando métodos conocidos de
mutagénesis y exploración, tales como los descritos por
Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:
53-57, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). En
resumen, estos autores describen métodos para mutar aleatoria y
simultáneamente dos o más posiciones de un polipéptido, seleccionar
el polipéptido funcional y secuenciar luego los polipéptidos
mutados para determinar el espectro de las sustituciones admisibles
en cada posición. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la
presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al.,
Biochem. 30: 10.832-10.837, 1991;
Ladner et al., Patente de EE.UU. nº 5.223.409; y Huse,
Publicación WIPO WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región
(Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner
et al., DNA 7: 127, 1988).
Se pueden combinar métodos de mutagénesis como
los anteriormente descritos con métodos de exploración automatizados
de alta eficacia, para detectar la actividad de polipéptidos
mutados y clonados en células huésped. Las moléculas de DNA mutadas
que codifican polipéptidos activos (por ejemplo, estimulación de la
contractilidad de las células gastrointestinales, modulación de la
incorporación de nutrientes y/o secreción de enzimas digestivas)
pueden ser recuperadas de las células huésped y ser rápidamente
secuenciadas utilizando un equipo moderno. Estos métodos permiten
la rápida determinación de la importancia de restos de aminoácido
individuales en un polipéptido de interés y pueden ser aplicados a
polipéptidos de estructura desconocida.
Utilizando los métodos anteriormente discutidos,
quien tiene una experiencia normal en la técnica puede identificar
y/o preparar una diversidad de polipéptidos que sean sustancialmente
homólogos a los restos 24 a 37 de la ID. SEC. nº 2 o variantes
alélicas de los mismos y que conserven las propiedades de la
proteína de tipo silvestre. Dichos polipéptidos pueden incluir
también segmentos polipeptídicos adicionales como los anteriormente
descritos de forma general.
Los polipéptidos de la presente invención,
incluyendo proteínas de longitud completa y fragmentos de las
mismas, pueden ser producidos de acuerdo con técnicas
convencionales en células huésped genéticamente creadas. Son
células huésped adecuadas aquellos tipos celulares que pueden ser
transformados o transfectados con DNA exógeno y ser desarrollados
en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células
eucarióticas superiores en cultivo. Se prefieren las células
eucarióticas, particularmente células de organismos multicelulares
en cultivo. Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU., 1989, y Ausubel et
al. (redactores), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, EE.UU., 1987,
describen técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e
introducir DNA exógeno en una diversidad de células huésped.
En general, una secuencia de DNA que codifica un
polipéptido zsig33 de la presente invención está operativamente
unida a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, que
incluyen generalmente un promotor y un terminador de transcripción
dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá
comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes
de replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que,
en ciertos sistemas, se pueden proporcionar marcadores
seleccionables en vectores distintos, y se puede obtener la
replicación del DNA exógeno por integración en el genoma de la
célula huésped. La selección de los promotores, terminadores,
marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una
cuestión de diseño rutinario dentro del nivel de experiencia normal
en la técnica. Muchos de dichos elementos son descritos en la
bibliografía y son asequibles a través de proveedores
comerciales.
Para dirigir un polipéptido zsig33 a la ruta
secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal
secretora (también conocida como secuencia líder, preprosecuencia o
presecuencia) en el vector de expresión. La secuencia señal
secretora puede ser la del polipéptido zsig33 o puede proceder de
otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o ser
sintetizada de novo. La secuencia señal secretora se une a la
secuencia de DNA de zsig33 en el marco de lectura correcto. Las
secuencias señal secretoras están comúnmente dispuestas en 5' con
respecto a la secuencia de DNA que codifica el polipéptido de
interés, aunque ciertas secuencias señal pueden estar dispuestas en
otra parte de la secuencia de DNA de interés (véanse, por ejemplo,
Welch et al., Patente de EE.UU. nº 5.037.743; y Holland
et al., Patente de EE.UU. nº 5.143.830).
Las células de mamífero en cultivo son también
huéspedes preferidos en la presente invención. Los métodos para
introducir DNA exógeno en células huésped de mamífero incluyen
transfección mediada por fosfato cálcico (Wigler et al.,
Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell
Genetics 7: 603, 1981; Graham y Van der Eb,
Virology 52: 456, 1973), electroporación (Neumann
et al., EMBO J. 1: 841-845,
1982), transfección mediada por DEAE-dextrano
(Ausubel et al., redactores, Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, EE.UU.,
1987), transfección mediada por liposomas
(Hawley-Nelson et al., Focus
15: 73, 1993); Ciccarone et al., Focus
15: 80, 1993), y vectores víricos (A. Miller y G. Rosman,
BioTechniques 7: 980-90, 1989; Q.
Wang y M. Finer, Nature Med. 2:
714-16, 1996). La producción de polipéptidos
recombinantes en células de mamífero en cultivo es descrita, por
ejemplo, por Levinson et al., Patente de EE.UU. nº 4.713.339;
Hagen et al., Patente de EE.UU. nº 4.784.950; Palmiter et
al., Patente de EE.UU. nº 4.579.821; y Ringold, Patente de
EE.UU. nº 4.656.134. Las células de mamífero en cultivo preferidas
incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC nº CRL
1650), COS-7 (ATCC nº CRL 1651), BHK 570 (ATCC nº
CRL 10314), 293 (ATCC nº CRL 1573; Graham et al., J. Gen.
Virol. 36: 59-72, 1977) y ovárica de
hámster chino (por ejemplo, CHO-K1, ATCC nº CCL 61).
En la técnica se conocen adecuadas líneas celulares adicionales,
que son asequibles de depositarías públicas tales como la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC; del inglés, American Type Culture
Collection), Rockville, Maryland, EE.UU. En general, se prefieren
promotores de transcripción potentes, tales como promotores del
virus 40 de simios (SV-40; del inglés, simian
virus 40) o de citomegalovirus. Véase, por ejemplo, la
Patente de EE.UU. nº 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen
los de genes de la metalotioneína (Patentes de EE.UU. números
4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío principal de
adenovirus.
Se usa generalmente la selección por fármacos
para seleccionar las células de mamífero en cultivo en las que se
ha insertado DNA extraño. A dichas células se hace comúnmente
referencia como "transfectantes". A las células que han sido
cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar
el gen de interés a su progenie se hace referencia como
"transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido
es un gen que codifica resistencia al antibiótico neomicina. La
selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo
neomicina, tal como G-418 o similar. Pueden usarse
también sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión
del gen de interés, un procedimiento al que se hace referencia como
"multiplicación". La multiplicación se lleva a cabo cultivando
transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y
aumentando luego la cantidad de agente selectivo para seleccionar
las células que producen niveles elevados de los productos de los
genes introducidos. Un marcador seleccionable y multiplicable
preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia
al metotrexato. Pueden usarse también otros genes de resistencia a
fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a
múltiples fármacos, y puromicina acetiltransferasa). Se pueden usar
marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal
como la proteína fluorescente verde, o proteínas de la superficie
celular tales como CD4, CD8, MHC de Clase I y fosfatasa alcalina
placentaria, para separar las células transfectadas de las células
no transfectadas mediante un medio tal como separación celular
activada por fluorescencia (FACS; del inglés, fluorescence
activated cell sorting) o tecnología de
separación con glóbulos magnéticos.
También se pueden utilizar otras células
eucarióticas superiores como huéspedes, incluyendo células
vegetales, células de insecto y células aviares. El uso de
Agrobacterium rhizogenes como un vector para que se expresen
genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et
al., J. Biosci. (Bangalore) 11:
47-58, 1987. Guarino et al., Patente de
EE.UU. nº 5.162.222, y la publicación WIPO WO 94/06463 describen la
transformación de células de insecto y la producción de
polipéptidos extraños en ellas. Las células de insecto pueden ser
infectadas con un baculovirus recombinante, comúnmente procedente
del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa
californica (AcNPV; del inglés, Autographa
californica nuclear polyhedrosis
virus). El DNA que codifica el polipéptido zsig33 es
insertado en el genoma baculovírico en lugar de la secuencia de
codificación del gen de la polihedrina de AcNPV mediante uno de dos
métodos. El primero es el método tradicional de recombinación
homóloga de DNA entre AcNPV de tipo silvestre y un vector de
transferencia que contiene el zsig33 flanqueado por secuencias de
AcNPV. Se infectan células de insecto adecuadas, por ejemplo,
células SF9, con AcNPV de tipo silvestre y se transfectan con un
vector de transferencia que comprende un polinucleótido zsig33
operativamente unido a un promotor, un terminador y secuencias
flanqueadoras del gen de la polihedrina de AcNPV. Véanse L. A. King
y R. D. Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory
Guide, Londres, Chapman & Hall; D. R. O'Reilly et
al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual,
New York, EE.UU., Oxford University Press, 1994; y C. D.
Richardson, redactor, Baculovirus Expression Protocols. Methods
in Molecular Biology, Totowa, New Jersey, EE.UU., Humana Press,
1995. La recombinación natural en una célula de insecto dará lugar
a un baculovirus recombinante que contiene zsig33 conducido por el
promotor de la polihedrina. Se preparan reservas víricas
recombinantes mediante métodos comúnmente usados en la técnica.
En el segundo método para preparar un
baculovirus recombinante se usa un sistema basado en transposones
descrito por Luckow (V. A. Luckow et al., J. Virol.
67: 4566-79, 1993). Este sistema se vende en
el kit Bac-to-Bac (Life
Technologies, Rockville, Maryland, EE.UU.). En este sistema se
utiliza un vector de transferencia, pFastBac1^{TM} (Life
Technologies), que contiene un transposón Tn7 para introducir el DNA
que codifica el polipéptido zsig33 en un genoma de baculovirus
mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado
"bácmido". El vector de transferencia pFastBac1^{TM} usa el
promotor de la polihedrina de AcNPV para conducir la expresión del
gen de interés, zsig33 en este caso. Sin embargo, se puede modificar
pFastBac1^{TM} en un grado considerable. Se puede quitar el
promotor de la polihedrina y se puede sustituir por el promotor de
la proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor
Pcor, p6.9 o MP), que se expresa antes en la infección baculovírica
y del que se ha mostrado que es ventajoso para la expresión de
proteínas secretadas. Véanse M. S. Hill-Perkins y
R. D. Possee, J. Gen. Virol. 71:
971-6, 1990; B. C. Bonning et al., J. Gen.
Virol. 75: 1551-6, 1994; y G. D.
Chazenbalk y B. Rapoport, J. Biol. Chem. 270:
1543-9, 1995. En dichas construcciones de vectores
de transferencia se puede usar una versión corta o larga del
promotor de la proteína básica. Además, se pueden construir vectores
de transferencia que sustituyan las secuencias señal secretoras de
zsig33 nativas por secuencias señal secretoras derivadas de
proteínas de insecto. Por ejemplo, en las construcciones se puede
usar una secuencia señal secretora de glucosil transferasa
ecdisteroide (EGT; del inglés, ecdysteroid
glucosyltransferase), melitina de abeja (Invitrogen,
Carlsbad, California, EE.UU.) o gp67 de baculovirus (PharMingen, San
Diego, California, EE.UU.), para sustituir la secuencia señal
secretora de zsig33 nativa. Además, los vectores de transferencia
pueden incluir una fusión en marco con un DNA que codifica una
etiqueta epitópica en el extremo C o N del polipéptido zsig33
expresado, tal como, por ejemplo, una etiqueta epitópica
Glu-Glu (T. Grussenmeyer et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985).
Usando una técnica conocida en este campo técnico, se transforma
E. coli con un vector de transferencia que contiene zsig33 y
se explora en cuanto a bácmidos que contengan un gen LacZ
interrumpido, indicativo de un baculovirus recombinante. El DNA
bacmídico que contiene el genoma de baculovirus recombinante es
aislado usando técnicas habituales y es usado para transfectar
células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo, células Sf9.
Posteriormente se produce el virus recombinante que expresa zsig33.
Se preparan reservas víricas recombinantes mediante métodos
comúnmente usados en la técnica.
El virus recombinante se usa para infectar
células huésped, típicamente una línea celular procedente del gusano
cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda. Véase, en
general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles
and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington,
Distrito de Columbia, EE.UU., 1994. Otra línea celular adecuada es
la línea celular High FiveO^{TM} (Invitrogen) procedente de
Trichoplusia ni (Patente de EE.UU. nº 5.300.435). Se usan
medios exentos de suero comercialmente asequibles para desarrollar
y mantener las células. Son medios adecuados: Sf900 II^{TM} (Life
Technologies) y ESF 921^{TM} (Expression Systems) para las
células Sf9; y Ex-cellO405^{TM} (JRH Biosciences,
Lenexa, Kansas, EE.UU.) y Express FiveO^{TM} (Life Technologies)
para las células de T. ni. Las células son cultivadas desde
una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5
x 10^{5} células hasta una densidad de 1-2 x
10^{6} células, momento en que una reserva vírica recombinante es
añadida con una multiplicidad de infección (MOI; del inglés,
multiplicity of infection) de 0,1 a 10, más
típicamente próxima a 3. Las células infectadas con el virus
recombinante producen típicamente el polipéptido zsig33
recombinante a las 12-72 horas después de la
infección y lo secretan al medio con una eficacia variable. El
cultivo se recolecta normalmente a las 48 horas después de la
infección. Se utiliza una centrifugación para separar las células
del medio (sobrenadante). El sobrenadante que contiene el
polipéptido zsig33 es filtrado a través de filtros microporosos,
normalmente con un tamaño de poro de 0,45 \mum. Los
procedimientos usados son generalmente descritos en manuales de
laboratorio asequibles (L. A. King y R. D. Possee, ibídem;
D. R. O'Reilly et al., ibídem; C. D. Richardson,
ibídem). La subsiguiente purificación del polipéptido zsig33
a partir del sobrenadante puede realizarse usando métodos aquí
descritos.
También se pueden usar células fúngicas,
incluyendo células de levadura, y particularmente células de los
géneros Saccharomyces y Pichia, en la presente
invención, tal como para producir fragmentos de zsig33 o fusiones
polipeptídicas. Por ejemplo, Kawasaki, Patente de EE.UU. nº
4.599.311; Kawasaki et al., Patente de EE.UU. nº 4.931.373;
Brake, Patente de EE.UU. nº 4.870.008; Welch et al., Patente
de EE.UU. nº 5.037.743; y Murray et al., Patente de EE.UU.
nº 4.845.075, describen métodos para transformar células de levadura
con DNA exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de
las mismas. Las células transformadas son seleccionadas mediante el
fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la
resistencia a fármacos o la capacidad para crecer en ausencia de un
nutriente concreto (por ejemplo, leucina). Un sistema vector
preferido para uso en levadura es el sistema vector POT1
descrito por Kawasaki et al. (Patente de EE.UU. nº
4.931.373), que permite que las células transformadas sean
seleccionadas mediante crecimiento en medios que contienen glucosa.
Los promotores y terminadores adecuados para uso en levadura
incluyen los de genes de enzimas glicolíticas (véanse, por ejemplo,
Kawasaki, Patente de EE.UU. nº 4.599.311; Kingsman et al.,
Patente de EE.UU. nº 4.615.974; y Bitter, Patente de EE.UU. nº
4.977.092) y de genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse también las
Patentes de EE.UU. números 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y
4.661.454. En la técnica se conocen sistemas de transformación para
otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha,
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces
fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia guillermondii,
Pichia methanolica y Candida maltosa. Véanse, por
ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol.
132: 3459-3465, 1986, y Cregg, Patente de
EE.UU. nº 4.882.279. Pueden utilizarse células de Aspergillus
de acuerdo con los métodos de McKnight et al., Patente de
EE.UU. nº 4.935.349, que se incorpora aquí por referencia. Sumino
et al., Patente de EE.UU. nº 5.162.228, describen métodos
para transformar Acremonium chrysogenum. Lambowitz, Patente
de EE.UU. nº 4.486.533, describe métodos para transformar
Neurospora.
Las células huésped transformadas o
transfectadas son cultivadas de acuerdo con procedimientos
convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y
otros componentes necesarios para el crecimiento de las células
huésped escogidas. En la técnica se conoce una diversidad de medios
adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, medios
que incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los
medios pueden también contener componentes tales como factores de
crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento
seleccionará generalmente las células que contienen el DNA
exógenamente añadido, mediante, por ejemplo, selección por fármacos
o deficiencia de un nutriente esencial que es complementado por el
marcador seleccionable llevado por el vector de expresión o
introducido en la célula huésped por cotransfección. Las células de
P. methanolica son cultivadas en un medio que comprende
fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y oligonutrientes a una
temperatura de aproximadamente 25ºC a 35ºC. Los cultivos líquidos
son provistos de una aireación suficiente por un medio convencional,
tal como el sacudimiento de pequeños matraces o el burbujeo en
fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P.
methanolica es YEPD [D-glucosa al 2%, peptona
Bacto^{TM} (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EE.UU.) al 2%,
extracto de levadura Bacto^{TM} (Difco Laboratories) al 1%,
adenina al 0,004% y L-leucina al 0,006%].
Los polipéptidos zsig33 recombinantes expresados
pueden ser purificados usando fraccionamiento y/o métodos y medios
para purificación convencionales. Para el fraccionamiento de las
muestras, se pueden usar la precipitación con sulfato amónico y la
extracción con ácidos o agentes caotrópicos. Las operaciones de
purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión
por tamaños, cromatografía de resolución rápida en estado líquido
para proteínas y cromatografía de alta eficacia en estado líquido y
fase inversa. Los medios de intercambio aniónico adecuados incluyen
dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices
especiales, y similares. Se prefieren los derivados de PEI, DEAE,
QAE y Q, siendo particularmente preferido el DEAE
Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, New
Jersey, EE.UU.). Los medios cromatográficos ejemplares incluyen los
medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, tales como
Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl Butyl
650 (Toso Haas, Montgomeryville, Pennsylvania, EE.UU.),
Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; y resinas
poliacrílicas tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares.
Los soportes sólidos adecuados incluyen glóbulos de vidrio, resinas
basadas en sílice, resinas celulósicas, glóbulos de agarosa,
glóbulos de agarosa reticulada, glóbulos de poliestireno, resinas
de poliacrilamida reticulada y similares, que son insolubles bajo
las condiciones en que se van a usar. Estos soportes pueden ser
modificados con grupos reactivos que permiten la fijación de
proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo,
grupos hidroxilo y/o restos de hidrato de carbono. Los ejemplos de
químicas de copulación incluyen activación con bromuro de
cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida,
activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con
hidrazida, y derivados carboxílicos y amínicos para químicas de
copulación con carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien
conocidos y ampliamente usados en la técnica, y son asequibles de
proveedores comerciales. Los métodos para unir polipéptidos
receptores a medios de soporte son bien conocidos en la técnica. La
selección de un método concreto es una cuestión de diseño rutinario
y viene determinada en parte por las propiedades del soporte
elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles
& Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia,
1988.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser aislados por explotación de su pequeño tamaño y su bajo pI. Por
ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden unir a
intercambiadores aniónicos en valores de pH bajos. Otros métodos de
purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas por
cromatografía de afinidad sobre lectina y cromatografía de
intercambio iónico (Methods in Enzymol., volumen 182,
"Guide to Protein Purification", redactado por M. Deutscher,
Acad. Press, San Diego, 1990, páginas 529-39).
Alternativamente, se puede construir una fusión del polipéptido de
interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, polihistidina,
proteína ligante de maltosa, o un dominio inmunoglobulínico), para
facilitar la purificación.
Se pueden usar ventajosamente procedimientos
para la replegadura (y, opcionalmente, la reoxidación) de proteínas.
Se prefiere purificar la proteína hasta una pureza > 80%, más
preferiblemente hasta una pureza > 90% y, aún más
preferiblemente, > 95%, y se prefiere particularmente un estado
farmacéuticamente puro, es decir, más de 99,9% puro con respecto a
macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y
ácidos nucleicos, y exento de agentes infecciosos y pirógenos.
Preferiblemente, una proteína purificada está sustancialmente
exenta de otras proteínas, particularmente de otras proteínas de
origen animal.
Los polipéptidos zsig33 o los fragmentos de los
mismos pueden ser también preparados mediante síntesis química. Los
polipéptidos zsig33 pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados
o no glicosilados; con o sin grupos PEG covalentemente unidos;
amidados o no amidados; y sulfatados o no sulfatados; y pueden
incluir o no un resto inicial del aminoácido metionina. Por
ejemplo, los polipéptidos zsig33 pueden ser también sintetizados
mediante síntesis exclusiva en fase sólida, métodos parciales en
fase sólida, condensación de fragmentos o síntesis clásica en
disolución. Los polipéptidos se preparan preferiblemente mediante
síntesis peptídica en fase sólida, como describe, por ejemplo,
Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. La
síntesis se lleva a cabo con aminoácidos que tienen protegido el
extremo amínico alfa. Los aminoácidos trifuncionales con cadenas
laterales lábiles son también protegidos con grupos adecuados para
evitar que se produzcan reacciones químicas indeseadas durante la
ensambladura de los polipéptidos. El grupo protector del amino alfa
es selectivamente eliminado para permitir que tenga lugar la
reacción subsiguiente en el extremo amínico. Las condiciones para
la eliminación del grupo protector del amino alfa no eliminan los
grupos protectores de las cadenas laterales.
Los grupos protectores del amino alfa son
aquellos conocidos por ser útiles en el campo de la síntesis gradual
de polipéptidos. Se incluyen grupos protectores de tipo acilo (por
ejemplo, formilo, trifluoroacetilo y acetilo), grupos protectores
de tipo arilo (por ejemplo, biotinilo), grupos protectores de tipo
uretano aromático [por ejemplo, benciloxicarbonilo (Cbz),
benciloxicarbonilo sustituido y
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc)], grupos
protectores de uretano alifático [por ejemplo,
t-butiloxicarbonilo (tBoc), isopropiloxicarbonilo y
ciclohexiloxicarbonilo], y grupos protectores de tipo alquilo (por
ejemplo, bencilo y trifenilmetilo). Los grupos protectores
preferidos son tBoc y
Fmoc.
Fmoc.
Los grupos protectores de cadenas laterales
seleccionados deben permanecer intactos durante la copulación y no
deben ser eliminados durante la desprotección del grupo protector
del extremo amínico ni bajo las condiciones la copulación. Los
grupos protectores de cadenas laterales deben ser además eliminables
tras la compleción de la síntesis utilizando condiciones de
reacción que no alteren el polipéptido acabado. En la química de
tBoc, los grupos protectores de cadenas laterales para aminoácidos
trifuncionales se basan sobre todo en bencilo. En la química de
Fmoc, se basan sobre todo en terc-butilo o
tritilo.
En la química de tBoc, los grupos protectores de
cadenas laterales preferidos son tosilo para la arginina,
ciclohexilo para el ácido aspártico, 4-metilbencilo
(y acetamidometilo) para la cisteína, bencilo para el ácido
glutámico, la serina y la treonina, benciloximetilo (y
dinitrofenilo) para la histidina,
2-Cl-benciloxicarbonilo para la
lisina, formilo para el triptófano y 2-bromobencilo
para la tirosina. En la química de Fmoc, los grupos protectores de
cadenas laterales preferidos son
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(Pmc) o
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
(Pbf) para la arginina, tritilo para la asparagina, la cisteína, la
glutamina y la histidina, terc-butilo para el ácido
aspártico, el ácido glutámico, la serina, la treonina y la tirosina,
y tBoc para la lisina y el triptófano.
Para la síntesis de fosfopéptidos, se utiliza la
incorporación directa del grupo fosfato o su incorporación después
de la ensambladura. En la estrategia de incorporación directa, el
grupo fosfato sobre la serina, la treonina o la tirosina puede ser
protegido mediante metilo, bencilo o terc-butilo en
la química de Fmoc, o mediante metilo, bencilo o fenilo en la
química de tBoc. En la química de Fmoc también se puede utilizar la
incorporación directa de fosfotirosina sin protección del fosfato.
En la estrategia de incorporación después de la ensambladura, los
grupos hidroxilo no protegidos de la serina, la treonina o la
tirosina son derivatizados en fase sólida con
di-terc-butil-, dibencil- o
dimetil-N,N'-diisopropilfosforamidita
y son luego oxidados con hidroperóxido de
terc-butilo.
La síntesis en fase sólida se lleva normalmente
a cabo desde el extremo carboxílico copulando el aminoácido con
amino alfa protegido (cadena lateral protegida) con un soporte
sólido adecuado. Se forma un enlace éster cuando la fijación se
hace a una resina clorometílica, clorotritílica o hidroximetílica, y
el polipéptido resultante tendrá un grupo carboxilo libre en el
extremo C. Alternativamente, cuando se usan una resina amídica tal
como una resina de bencidrilamina o de
p-metilbencidrilamina (para la química de tBoc), y
una resina amídica Rink o una resina PAL (para la química de Fmoc),
se forma un enlace amídico y el polipéptido resultante tendrá un
grupo carboxamida en el extremo C. Estas resinas, basadas en
poliestireno o poliamida o injertadas con polietilenglicol, con o
sin un asa o un conector, con o sin el primer aminoácido fijado, son
comercialmente asequibles, y sus preparaciones han sido descritas
por Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª
edición; Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, EE.UU., 1984);
Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3 (1986); y
Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis: A
Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1989.
El aminoácido C-terminal, con la
cadena lateral, si fuera necesario, y el grupo amino alfa
protegidos, es fijado a una resina hidroxilmetílica usando diversos
agentes activadores que incluyen diciclohexilcarbodiimida (DCC),
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) y
carbonildiimidazol (CDI). Puede ser fijado directamente a la resina
clorometílica o clorotritílica en su forma de sal de
cesio-tetrametilamonio o en presencia de
trietilamina (TEA) o diisopropiletilamina (DIEA). La fijación del
primer aminoácido a una resina amídica es igual que la formación de
un enlace amídico durante las reacciones de copulación.
Después de la fijación al soporte de resina, el
grupo protector del amino alfa es eliminado utilizando diversos
reactivos que dependen de la química de protección (por ejemplo,
tBoc y Fmoc). El grado de eliminación de Fmoc puede ser determinado
a 300-320 nm o mediante una célula de conductividad.
Después de la eliminación del grupo protector del amino alfa, los
restantes aminoácidos protegidos son gradualmente copulados en el
orden requerido para obtener la secuencia deseada.
Para las reacciones de copulación, se pueden
utilizar diversos agentes activadores, que incluyen DCC, DIPCDI,
hexafluorofosfato de
2-cloro-1,3-dimetilimidio
(CIP), hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio
(BOP) y su compuesto análogo de pirrolidina (PyBOP),
hexafluorofosfato de
bromo-tris-pirrolidino-fosfonio
(PyBroP), hexafluorofosfato de
O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio
(HBTU) y su compuesto análogo de tetrafluoroborato (TBTU) o su
compuesto análogo de pirrolidina (HBPyU), y hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio
(HATU) y su compuesto análogo de tetrafluoroborato (TATU) o su
compuesto análogo de pirrolidina (HAPyU). Los aditivos catalíticos
más comunes usados en las reacciones de copulación incluyen
4-dimetilaminopiridina (DMAP),
3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(HODhbt), N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt). Cada aminoácido protegido se utiliza en exceso (> 2,0
equivalentes), y las copulaciones se llevan normalmente a cabo en
N-metilpirrolidona (NMP) o en DMF, CH_{2}Cl_{2}
o mezclas de los mismos. El grado de compleción de la reacción de
copulación puede ser determinado en cada etapa mediante, por
ejemplo, la reacción con ninhidrina de la manera descrita por
Kaiser et al., Anal. Biochem. 34: 595,
1970.
Después de la ensambladura completa del péptido
deseado, el péptido es escindido de la resina con un reactivo con
agentes supresores apropiados. Los péptidos de Fmoc son normalmente
escindidos y desprotegidos mediante TFA con agentes supresores (por
ejemplo, H_{2}O, etanoditiol, fenol y tioanisol). Los péptidos de
tBoc son normalmente escindidos y desprotegidos con HF líquido
durante 1-2 horas a una temperatura de -5 a 0ºC, lo
que escinde el polipéptido de la resina y elimina la mayor parte de
los grupos protectores de cadenas laterales. Se usan normalmente
agentes supresores, tales como anisol, sulfuro de dimetilo y
p-tiocresol, con el HF líquido para evitar que los
cationes formados durante la escisión alquilen y acilen los restos
de aminoácido presentes en el polipéptido. El grupo formilo del
triptófano y el grupo dinitrofenilo de la histidina han de ser
eliminados, respectivamente, por piperidina y tiofenilo en DMF
antes de la escisión con HF. El grupo acetamidometilo de la
cisteína puede ser eliminado mediante acetato de mercurio (II) y,
alternativamente, mediante yodo, trifluoroacetato de talio (III) o
tetrafluoroborato de plata, los cuales oxidan simultáneamente la
cisteína hasta cistina. Otros ácidos fuertes utilizados para la
escisión y desprotección de péptidos de tBoc incluyen el ácido
trifluorometanosulfónico (TFMSA) y el trifluoroacetato de
trimetilsililo (TMSOTf).
La actividad de las moléculas de la presente
invención puede ser medida utilizando una diversidad de ensayos que
permiten medir la estimulación de la contractilidad de las células
gastrointestinales, la modulación de la incorporación de nutrientes
y/o la secreción de enzimas digestivas. Son particularmente
interesantes los cambios en la contractilidad de las células
musculares lisas; por ejemplo, la respuesta contráctil de segmentos
de duodeno de mamífero o de otro tejido de músculos lisos
gastrointestinales (Depoortere et al., J. Gastrointestinal
Motility 1: 150-159, 1989). En un ensayo
ejemplar in vivo se utiliza un micrómetro ultrasónico para
medir los cambios dimensionales, radialmente entre comisuras y
longitudinalmente con respecto al plano de la base valvular (Hansen
et al., Society of Thoracic Surgeons 60:
S384-390, 1995).
En el marco clínico, la motilidad gástrica se
mide generalmente como el tiempo requerido para el vaciamiento
gástrico y el subsiguiente tiempo de tránsito a través del tracto
gastrointestinal. Los barridos de vaciamiento gástrico son bien
conocidos por los expertos en la técnica y, en pocas palabras,
comprenden el uso de un agente oral de contraste, tal como bario, o
una comida radiomarcada. Se pueden medir independientemente sólidos
y líquidos. Se radiomarca un alimento o líquido de ensayo con un
isótopo (por ejemplo, ^{99m}Tc) y, después de la ingestión o la
administración, se miden el tiempo de tránsito a través del tracto
gastrointestinal y el vaciamiento gástrico mediante visualización
utilizando cámaras gamma (Meyer et al., Am. J. Dig.
Dis. 21: 296, 1976; Collins et al., Gut 24: 1117,
1983; Maughan et al., Diabet. Med. 13,
Supp. 5: S6-10, 1996; y Horowitz
et al., Arch. Intern. Med. 145:
1467-1472, 1985). Estos estudios pueden ser llevados
a cabo antes y después de la administración de un agente de
promotilidad para cuantificar la eficacia del fármaco.
Los ensayos en que se mide la capacidad de los
polipéptidos zsig33 para afectar a la proliferación o la
diferenciación celulares son bien conocidos en la técnica. Por
ejemplo, los ensayos en que se mide proliferación incluyen ensayos
tales como la quimiosensibilidad al colorante rojo neutro (Cavanaugh
et al., Investigational New Drugs 8:
347-354, 1990), la incorporación de nucleótidos
radiomarcados (Cook et al., Analytical Biochem.
179: 1-7, 1989), la incorporación de
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) al DNA de células en proliferación (Portsmann et al.,
J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985)
y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods
65: 55-63, 1983; Alley et al.,
Cancer Res. 48: 589-601, 1988;
Marshall et al., Growth Reg. 5:
69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer
Res. 48: 4827-4833, 1988). Los ensayos en
que se mide diferenciación incluyen, por ejemplo, la medición de
marcadores de la superficie celular asociados con la expresión de un
tejido específica de la fase, la actividad enzimática, la actividad
funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB 5:
281-284, 1991; Francis, Differentiation
57: 63-75, 1994; y Raes, Adv. Anim. Cell
Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989).
Se pueden utilizar ensayos para medir otras
respuestas celulares, que incluyen quimiotaxis, adhesión, cambios
en la afluencia a canales iónicos, regulación de los niveles de
segundos mensajeros y liberación de neurotransmisores. Dichos
ensayos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, en
"Basic & Clinical Endocrinology Series", Volumen 3,
Cytochemical Bioassays: Techniques & Applications,
Chayen, compilado por Chayen y Bitensky, Dekker, New York, EE.UU.,
1983.
A la vista de la distribución tisular observada
para zsig33, los agonistas (incluyendo el ligando/sustrato/cofactor,
etc. naturales) y los antagonistas tienen un enorme potencial en
las aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Los
compuestos identificados como agonistas de zsig33 son útiles para
promover la estimulación de la contractilidad de las células
gastrointestinales, la modulación de la incorporación de nutrientes
y/o la secreción de enzimas digestivas in vivo e in
vitro. Por ejemplo, los compuestos agonistas son útiles como
componentes de medios definidos para cultivo celular y regulan la
incorporación de nutrientes y, por lo tanto, son útiles para
promover específicamente el crecimiento y/o desarrollo de células
gastrointestinales tales como las células G y las células
enterocromafines, y la mucosa epitelial del estómago, el duodeno, el
yeyuno próximo, el antro y el fundus.
La familia de los péptidos del
intestino-cerebro ha sido asociada con funciones
neurológicas y del sistema nervioso central. Por ejemplo, se ha
mostrado que el NPY, un péptido con receptores tanto en el cerebro
como en el intestino, estimula el apetito cuando se administra al
sistema nervioso central (Gehlert, Life Sciences 55
(6): 551-562, 1994). Se ha identificado
inmunorreactividad hacia motilina en diferentes regiones del
cerebro, particularmente el cerebelo, y en la hipófisis (Gasparini
et al., Hum. Genetics 94 (6):
671-674, 1994). Se ha hallado que la motilina
coexiste con el neurotransmisor ácido
\gamma-aminobutírico en el cerebelo
(Chan-Patay, Proc. Sym. 50th Anniv. Meet. Br.
Pharmalog. Soc.: 1-24, 1982). Estudios
fisiológicos han proporcionado cierta evidencia de que la motilina
ejerce un efecto sobre la conducta relativa a la comida (Rosenfield
et al., Phys. Behav. 39 (6):
735-736, 1987), el control de la vejiga y la
liberación de la hormona del crecimiento hipofisaria. Se ha
mostrado que otros péptidos del intestino-cerebro,
tales como la CCK, la encefalina, el VIP y la secretina, están
implicados en el control de la presión sanguínea, la frecuencia
cardíaca, la conducta y la modulación del dolor, además de ser
activos en el sistema digestivo. Por lo tanto, podría esperarse que
zsig33, o cierta porción del mismo, presentara cierta asociación
neurológica.
Usando cambios específicos del sitio en las
secuencias de aminoácidos y de DNA de la presente invención, se
pueden preparar compuestos análogos que sean antagonistas, agonistas
o agonistas parciales (Macielay et al., Peptides: Chem.
Struct. Biol., página 659, 1996). Los antagonistas son útiles
para estados clínicos asociados con una hipermotilidad
gastrointestinal, tales como la diarrea y la enfermedad de Crohn.
Los antagonistas son también útiles como reactivos de investigación
para caracterizar sitios de interacción de
ligando-receptor.
También se puede utilizar un polipéptido que se
une al ligando de zsig33 para la purificación del ligando. El
polipéptido es inmovilizado en un soporte sólido, tal como glóbulos
de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas,
resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada o
materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso.
Los métodos para unir polipéptidos a soportes sólidos son conocidos
en la técnica e incluyen química de aminas, activación con bromuro
de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida,
activación con epóxido, activación con sulfhidrilo y activación con
hidrazida. El medio resultante será generalmente configurado en
forma de columna, y los fluidos que contienen el ligando serán
hechos pasar a través de la columna una o más veces para permitir
que el ligando se una al polipéptido receptor. El ligando es luego
eluido utilizando cambios en la concentración de sal, agentes
caotrópicos (guanidina\cdotHCl) o el pH para romper la unión de
ligando-
receptor.
receptor.
Se puede emplear ventajosamente un sistema de
ensayo en que se usa un receptor (o un anticuerpo o un miembro de
una pareja de complemento/anticomplemento) que se une al ligando o
un fragmento ligante del receptor, y un instrumento biosensor
comercialmente asequible (BIAcore^{TM}, Pharmacia Biosensor,
Piscataway, New Jersey, EE.UU.). Dicho receptor, anticuerpo,
miembro de una pareja de complemento/anticomplemento o fragmento es
inmovilizado en la superficie de un chip receptor. El uso de este
instrumento es descrito por Karlsson, J. Immunol. Methods
145: 229-40, 1991, y por Cunningham y Wells,
J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Un
receptor, anticuerpo, miembro o fragmento es fijado covalentemente,
usando una química de aminas o sulfhidrilos, a fibras de dextrano
que están fijadas a una película de oro dentro de la célula de
flujo. Se hace pasar una muestra de ensayo a través de la célula.
Si está presente un ligando, epítopo o miembro opuesto de la pareja
de complemento/anticomplemento en la muestra, se unirá al receptor,
anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, lo que causará
un cambio en el índice de refracción del medio que se detecta como
un cambio en la resonancia del plasmón superficial de la película
de oro. Este sistema permite la determinación de velocidades de
asociación y disociación, a partir de las cuales puede calcularse
la afinidad de unión, y la valoración de la estequiometría de la
unión.
Los polipéptidos receptores que se unen al
ligando pueden ser también usados en otros sistemas de ensayo
conocidos en la técnica. Dichos sistemas incluyen el análisis de
Scatchard para determinación de la afinidad de unión (véase
Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:
660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham
et al., Science 253: 545-48,
1991; Cunningham et al., Science 245:
821-25, 1991).
\newpage
También se pueden utilizar polipéptidos zsig33
para preparar anticuerpos que se unan específicamente a epítopos,
péptidos o polipéptidos de zsig33. Los métodos para preparar
anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la
técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor,
New York, EE.UU., 1989; y J. G. R. Hurrell, redactor, Monoclonal
Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press,
Inc., Boca Raton, Florida, EE.UU., 1982). Como resultará evidente
para quien tiene experiencia normal en la técnica, se pueden generar
anticuerpos policlonales a partir de una diversidad de animales de
sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros,
gallinas, conejos, ratones y ratas.
La inmunogenicidad de un polipéptido zsig33
puede ser aumentada por medio del uso de un agente adyuvante, tal
como alúmina (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o
incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para inmunización
también incluyen polipéptidos de fusión, tales como las fusiones de
zsig33 o de una porción del mismo con un polipéptido
inmunoglobulínico o con la proteína ligante de maltosa. El
inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula de longitud
completa o una porción de la misma. Si la porción polipeptídica es
de "tipo hapteno", dicha porción puede ser ventajosamente
unida o enlazada a un vehículo macromolecular [tal como hemocianina
de lapa Fissurella (KLH; del inglés, keyhole
limpet hemocyanin), albúmina sérica bovina (BSA; del
inglés, bovine serum albumin) o toxoide
tetánico] para la inmunización.
Cómo se utiliza aquí, el término
"anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y
fragmentos ligantes de antígeno tales como los fragmentos
proteolíticos F(ab')_{2} y Fab. También se incluyen
anticuerpos intactos o fragmentos genéticamente construidos, tales
como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena
única y similares, así como péptidos y polipéptidos ligantes de
antígeno sintéticos. Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar
injertando sólo regiones determinantes de la complementariedad
(CDRs; del inglés, complementarity determining
regions) no humanas en regiones constantes y de entramado
humanas, o incorporando los dominios variables no humanos completos
(opcionalmente "encubriéndolos" con una superficie de tipo
humano por sustitución de restos expuestos, siendo el resultado un
anticuerpo "enchapado"). En algunos casos, los anticuerpos
humanizados pueden conservar restos no humanos en los dominios de
entramado de regiones variables humanas para potenciar unas
características ligantes apropiadas. Por medio de la humanización
de anticuerpos, se puede aumentar la semivida biológica y se reduce
el potencial de reacciones inmunes negativas tras la administración
a seres humanos. Las técnicas alternativas para generar o
seleccionar anticuerpos aquí útiles incluyen la exposición in
vitro de linfocitos a la proteína o péptido zsig33, y la
selección de bancos de presentación de anticuerpos en fagos o
vectores similares (por ejemplo, por medio del uso de una proteína
o péptido zsig33 inmovilizada o marcada).
Se define que los anticuerpos se unen
específicamente si se unen a un polipéptido zsig33 con una afinidad
de unión (K_{a}) de 10^{6} M^{-1} o mayor, preferiblemente de
10^{7} M^{-1} o mayor, más preferiblemente de 10^{8} M^{-1}
o mayor, y muy preferiblemente de 10^{9} M^{-1} o mayor. La
afinidad de unión de un anticuerpo puede ser fácilmente determinada
por quien tiene una experiencia normal en la técnica (por ejemplo,
mediante un análisis de Scatchard).
Para detectar anticuerpos que se unen
específicamente a proteínas o péptidos zsig33, se puede utilizar una
diversidad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica. En
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (redactores),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, se describen con detalle
ensayos ejemplares. Los ejemplos representativos de dichos ensayos
incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo,
radioinmunoprecipitación, ensayo de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked
immunosorption assay), ensayo de transferencia Western
o de transferencia en forma de punto, ensayo de inhibición o
competición, y ensayo sándwich. Además, los anticuerpos pueden ser
explorados en cuanto a su unión a la proteína o péptido zsig33
mutante frente a la de tipo silvestre.
Los anticuerpos hacia zsig33 pueden ser
utilizados para etiquetar células que expresan zsig33, para aislar
zsig33 mediante purificación por afinidad; para ensayos diagnósticos
para determinar los niveles circulantes de polipéptidos zsig33;
para detectar o cuantificar el zsig33 soluble como marcador de una
patología o enfermedad subyacente; en métodos analíticos en que se
emplea FACS; para explorar bancos de expresión; para generar
anticuerpos antiidiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o
como antagonistas para bloquear la actividad de zsig33 in
vitro e in vivo. Las etiquetas o marcadores directos
adecuados incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores,
inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores
quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las
etiquetas o marcadores indirectos se pueden caracterizar por el uso
de biotina-avidina u otras parejas de
complemento/anticomplemento como productos intermedios. También se
pueden conjugar directa o indirectamente los presentes anticuerpos
con fármacos, toxinas, radionucleidos y similares, y se pueden
utilizar estos productos de conjugación para aplicaciones
diagnósticas o terapéuticas in vivo.
Las moléculas de la presente invención pueden
ser utilizadas para identificar y aislar receptores que median en
la función de zsig33. Por ejemplo, se pueden inmovilizar proteínas y
péptidos de la presente invención en una columna y se pueden
desarrollar preparaciones de membranas a lo largo de la columna
(Immobilized Affinity Ligand Techniques, redactado por
Hermanson et al., Academic Press, San Diego, California,
EE.UU., 1992, páginas 195-202). También se pueden
radiomarcar (Methods in Enzymol., volumen 182, "Guide to
Protein Purification", redactado por M. Deutscher, Acad. Press,
San Diego, 1990, 721-737) o marcar por fotoafinidad
(Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:
483-514, 1993, y Fedan et al., Biochem.
Pharmacol. 33: 1167-1180, 1984) las
proteínas y péptidos, y se pueden identificar proteínas específicas
de la superficie celular.
Los polipéptidos, el ácido nucleico y/o los
anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados en el
tratamiento de trastornos asociados con la contractilidad de las
células gastrointestinales, la secreción de enzimas digestivas y
ácidos, la motilidad gastrointestinal, el reclutamiento de enzimas
digestivas; la inflamación, particularmente en lo que afecta al
sistema gastrointestinal; la enfermedad por reflujo y la regulación
de la absorción de nutrientes. Los estados específicos que se
beneficiarán del tratamiento con moléculas de la presente invención
incluyen pero no se limitan a, gastroparesis diabética,
gastroparesis posquirúrgica, vagotomía, seudoobstrucción intestinal
idiopática crónica y enfermedad por reflujo gastroesofágico. Otros
usos adicionales incluyen el vaciamiento gástrico para estudios
radiológicos, la estimulación de la contracción de la vesícula
biliar y la antrectomía.
Los efectos motores y neurológicos de las
moléculas de la presente invención les hacen útiles para el
tratamiento de la obesidad y de otros trastornos metabólicos en que
la retroalimentación neurológica modula la absorción nutricional.
Las moléculas de la presente invención son útiles para regular la
saciedad, la absorción y el metabolismo de la glucosa, y trastornos
gastrointestinales asociados con neuropatías.
Las moléculas de la presente invención son
también útiles como aditivos para preparaciones antihipoglucémicas
que contienen glucosa y como potenciadores de la adsorción para
fármacos orales que requieren una acción rápida de nutrientes.
Además, las moléculas de la presente invención pueden ser utilizadas
para estimular la liberación de insulina provocada por glucosa.
Para uso farmacéutico, las proteínas de la
presente invención pueden ser formuladas para distribución
parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, e inhalación
nasal de acuerdo con métodos convencionales. La administración
intravenosa puede ser por infusión o inyección en bolo a lo largo de
un periodo típico de una a varias horas. En general, las
formulaciones farmacéuticas pueden incluir una proteína zsig33 en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como
disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa al 5% en
agua o similar. Las formulaciones pueden incluir además uno o más
excipientes, conservantes, agentes solubilizadores, agentes tampón,
albúmina para evitar la pérdida de proteínas en las superficies de
los viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en
la técnica y se describen en, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, redactado por Gennaro, Mack Publishing
Co., Easton, Pennsylvania, EE.UU., 1990. Las dosis terapéuticas
estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 \mug/kg de peso
del paciente por día, preferiblemente de 0,5-20
\mug/kg por día, siendo determinada la dosis exacta por el clínico
de acuerdo con normas aceptadas teniendo en cuenta la naturaleza y
la gravedad del estado que se trata, las características del
paciente etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de
la experiencia normal en la técnica. Las proteínas pueden ser
administradas para un tratamiento agudo, durante una semana o menos,
a menudo durante un periodo de uno a tres días, o pueden ser
utilizadas en un tratamiento crónico, durante varios meses o años.
Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de zsig33 es una
cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente
significativo en la motilidad gástrica y en los parámetros
utilizados para medir cambios en la absorción nutricional. Los
ensayos específicos para realizar dichas mediciones son conocidos
por quienes tienen una experiencia normal en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La exploración de una base de datos de cDNA en
cuanto a cDNAs que contuvieran una secuencia de secreción reveló
una etiqueta de secuencia expresada (EST; del inglés,
expressed sequence tag) que tenía homología con
la motilina. El cDNA es de un banco de cDNA pancreático fetal
humano.
La confirmación de la secuencia de la EST se
realizó mediante análisis de secuencias del cDNA a partir del cual
se originó la EST. Este cDNA estaba contenido en un plásmido y fue
cortado utilizando sitios de clonación. Los análisis revelaron que
el cDNA abarcaba la región de codificación completa del DNA que
codifica zsig33.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo transferencias Northerns
usando transferencias tisulares múltiples humanas y transferencias
Master de RNA humano en forma de punto, de Clontech (Palo Alto,
California, EE.UU.). La sonda era el oligonucleótido ZC12,494 (ID.
SEC. nº 7), de aproximadamente 40 pares de bases (bp; del inglés,
base pairs). La sonda fue terminalmente marcada
utilizando polinucleótido quinasa de T4 (Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) y el tampón directo para
polinucleótido quinasa de T4 (Life Technologies, Inc.). La sonda fue
purificada usando columnas de empuje NUCTRAP (Stratagene, La Jolla,
California, EE.UU.). Se utilizó la disolución EXPRESSHYB (Clontech)
para la prehibridación y como una disolución de hibridación para las
transferencias Northern. La hibridación tuvo lugar a 42ºC, y las
transferencias se lavaron en SSC 2X y SDS al 0,05% a temperatura
ambiental, lo que fue seguido de un lavado en SSC 1X y SDS al 0,1%
a 71ºC. Se observó un transcrito de aproximadamente 600 bp en forma
de señal intensa en el estómago, viéndose señales más débiles en el
páncreas y el intestino
delgado.
delgado.
Se anestesiaron dos machos de rata
Sprague-Dawley de aproximadamente 12 semanas de edad
(Harlan, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) con uretano y se expusieron
sus estómagos por medio de una pequeña incisión abdominal. Se
pusieron dos cristales transductores de 2,4 mm (Sonometrics,
Ontario, Canadá) en la porción antral del estómago de modo que se
pudieran determinar las contracciones circulares como un cambio en
la distancia entre los dos cristales. Los cristales se fijaron con
adhesivo tisular VETBOND (3M, St. Paul, Minnesota, EE.UU.).
Se aplicaron tópicamente 10 \mul de
acetilcolina 1 \muM al estómago, entre los dos cristales, y
resultó un aumento rápido, aunque transitorio, de la distancia
entre los dos cristales. 10 \mul de norepinefrina (NE) en
concentración 1 \muM causó una reducción de la distancia entre los
dos cristales. La amplitud de la disminución provocada por NE era
aproximadamente el 50% del aumento de distancia provocado por la
acetilcolina. Ambas respuestas fueron transitorias.
Un testigo negativo de 10 \mul de disolución
salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate
buffered saline) aplicada tópicamente entre los
cristales no causó efecto alguno.
Se disolvió un péptido zsig33 de 14 aminoácidos
[del resto de aminoácido 24 (Gly) al resto de aminoácido 37 (Gln)
de la ID. SEC. nº 2] en PBS y se aplicaron tópicamente 10 \mul de
la disolución para una concentración final de 1 \mug, 10 \mug o
100 \mug. El zsig33 en una cantidad de 1 \mug provocaba un
aumento y una disminución rítmicos y continuos de la distancia
entre cristales. Parecía que este efecto era dependiente de la
dosis, con respuestas aumentadas tanto en frecuencia como en
amplitud cuando se examinaron las contracciones con 10 \mug y 100
\mug.
Se adaptaron ocho hembras de ratón ob/ob de
aproximadamente 6 semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine,
EE.UU.) a un programa de alimentación diario de 4 horas durante dos
semanas. Después de dos semanas en el programa de alimentación, los
ratones recibieron 100 \mug de un péptido zsig33 de 14 aminoácidos
[del resto de aminoácido 24 (Gly) al resto de aminoácido 37 (Gln)
de la ID. SEC. nº 2] en 100 \mul de BSA estéril al 0,1% mediante
sonda gástrica oral inmediatamente después de su periodo de comida
(posprandialmente). Treinta minutos más tarde, los ratones fueron
estimulados oralmente con un volumen de 0,5 ml de glucosa al 25%. Se
realizaron sangrías retroorbitales para determinar los niveles
séricos de glucosa. Se extrajo sangre antes de la administración de
zsig33, antes de la estimulación oral con glucosa, y 1, 2, 4 y 20
horas después de la estimulación con
glucosa.
glucosa.
Cuando se administró oralmente el péptido zsig33
en una cantidad de 100 \mug 30 minutos antes de la estimulación
oral con glucosa, se vio una absorción postprandial aumentada de
glucosa.
Se sintetizó un péptido
zsig33-1, correspondiente a del resto de aminoácido
24 (Gly) al resto de aminoácido 37 (Gln) de la ID. SEC. nº 2,
mediante una síntesis peptídica en fase sólida utilizando el
sintetizador peptídico modelo 431A (Applied Biosystems/Perkin
Elmer, Foster City, California, EE.UU.). Como resina de soporte
inicial, se utilizó una resina de Fmoc-glutamina
(0,63 milimoles/g; Advanced Chemtech, Louisville, Kentucky, EE.UU.).
Para la síntesis se usaron cartuchos de 1 milimol de aminoácido
(Anaspec, Inc, San Jose, California, EE.UU.). Como reactivos de
síntesis se usó una mezcla de hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt),
N,N-diisopropiletilamina,
N-metilpirrolidona, diclorometano (todos de Applied
Biosystems/Perkin Elmer) y piperidina (Aldrich Chemical Co., St.
Louis, Missouri, EE.UU.).
Se utilizó el software Peptide Companion
(Peptides International, Louisville, Kentucky, EE.UU.) para predecir
el potencial de agregación y el nivel de dificultad para la
síntesis del péptido zsig33-1. La síntesis se llevó
a cabo utilizando programas de copulación individuales de acuerdo
con las especificaciones del fabricante.
El péptido fue escindido de la fase sólida
siguiendo el procedimiento estándar para escisión con TFA (de
acuerdo con el manual para escisión de péptidos, Applied
Biosystems/Perkin Elmer). La purificación del péptido se realizó
por cromatografía de alta eficacia en estado líquido y fase inversa
usando una columna C18 semipreparativa de 10 \mum (Vydac,
Hesperial, California, EE.UU.). Se recogieron las fracciones eluidas
de la columna y se analizaron en cuanto a una masa y una pureza
correctas mediante espectrometría de masas con electropulverización.
Se recogieron dos conjuntos del material eluido. Los resultados del
análisis mediante espectrometría de masas indicaron que ambos
conjuntos contenían la forma purificada de zsig33 con una masa de
1600 dáltones. Esta era la masa esperada, por lo que los conjuntos
fueron combinados, congelados y liofilizados.
Se mapeó zsig33 en el cromosoma 3 utilizando el
conjunto "GeneBridge 4" de híbridos por radiación (Research
Genetics, Inc., Huntsville, Alabama, EE.UU.) comercialmente
asequible. El conjunto GeneBridge 4 de híbridos por radiación
contiene DNAs de cada uno de 93 clones híbridos por radiación, más
dos DNAs testigo (el donante HFL y el receptor A23). Un servidor
WWW públicamente disponible
(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)
permite mapear en relación con el Whitehead Institute/MIT Center en
cuanto al mapa de híbridos por radiación del genoma humano del
Genome Research (el mapa de híbridos por radiación del
"WICGR"), que se construyó con el conjunto GeneBridge 4 de
híbridos por radiación.
Para el mapeo de zsig33 con el conjunto
"GeneBridge 4" de híbridos por radiación, se dispusieron 20
\mul de mezclas de reacción en una placa de microtitulación de 96
pocillos (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.) y se utilizaron
en un termociclador "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Cada
una de las 95 mezclas de reacción PCR consistía en 2 \mul de
tampón KlenTaq 10X para reacciones PCR (Clontech Laboratories, Inc.,
Palo Alto, California, EE.UU.), 1,6 \mul de mezcla de dNTPs (2,5
mM cada uno, Perkin-Elmer, Foster City, California,
EE.UU.), 1 \mul de cebador sentido, ZC13,166 (ID. SEC. nº 8), 1
\mul de cebador antisentido, ZC13,167 (ID. SEC. nº 9), 2 \mul
de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, Alabama,
EE.UU.), 0,4 \mul de mezcla de polimerasas Advantage Klentaq 50X
(Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de DNA de un clon híbrido
individual o de testigo, y ddH_{2}O para un volumen total de 20
\mul. Las mezclas de reacción fueron cubiertas con una cantidad
igual de aceite mineral y fueron selladas. Las condiciones del
ciclador de PCR fueron las siguientes: 1 ciclo inicial de 5 minutos
de desnaturalización a 95ºC, 35 ciclos de 1 minuto de
desnaturalización a 95ºC, 1 minuto de hibridación a 64ºC y 1,5
minutos de extensión a 72ºC, seguidos de 1 ciclo final de extensión
de 7 minutos a 72ºC. Las mezclas de reacción fueron sometidas a
separación mediante electroforesis en un gel de agarosa NuSieve GTG
al 3% (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, EE.UU.).
Los resultados mostraron que zsig33 mapea a
10,43 cR_3000 del marcador estructural AFMA216ZG1 en el mapa de
híbridos por radiación del cromosoma 3 del WICGR. Los marcadores
estructurales proximales y distales eran AFMA216ZG1 y D3S1263,
respectivamente. La utilización de marcadores circundantes permite
situar a zsig33 en la región 3p26.1 del mapa integrado del
cromosoma 3 de la base de datos LDB (The Genetic Location Database,
Universidad de Southampton, servidor WWW:
http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/).
Se evaluó el efecto del péptido zsig33
(aminoácidos 24 a 37 de la ID. SEC. nº 2), tópicamente aplicado,
sobre el tránsito de rojo fenol a través de los estómagos de machos
de rata Sprague-Dawley (Harlan, Indianápolis,
Indiana, EE.UU.) en ayunas. Las ratas (6 animales de 8 semanas de
edad) fueron dejadas en ayunas 24 horas antes de ser anestesiadas
con uretano (0,5 ml/100 gramos de disolución al 25%). Tras ser
anestesiados, los animales fueron sondados gástricamente a través
de la boca con 1 ml de disolución de rojo fenol (50 mg/ml en una
disolución de metilcelulosa al 2%).
Se expuso el estómago de cada animal por medio
de una pequeña incisión abdominal y, cinco minutos después de la
sonda, se aplicó tópicamente 1 \mug de péptido zsig33 o de un
testigo de 14 aminoácidos de un péptido de secuencia mixta al
estómago. La cantidad de rojo fenol que quedaba en el estómago fue
determinada midiendo la densidad óptica del contenido del estómago
extraído, 30 minutos después de la sonda.
El péptido zsig33 reducía la cantidad de rojo
fenol que quedaba en el estómago en aproximadamente un 25% en
comparación con el péptido mixto, lo que indica que el péptido
zsig33 potenciaba el vaciamiento gástrico en esas ratas.
Se adaptaron dieciseis hembras de ratón ob/ob de
8 semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, EE.UU.) a un
programa especial de alimentación diario de 4 horas durante dos
semanas. Se dejó que se alimentaran diariamente ad libitum
de 7:30 a 11:30 horas de la mañana. Después de dos semanas en el
programa de alimentación, los ratones fueron divididos en dos
grupos de 8. A un grupo se le administró 1,0 \mug de
zsig33-1 (péptido de 14 aminoácidos)/ratón y al
otro el vehículo (un péptido de secuencia mixta de 14 aminoácidos)
en 100 \mul de BSQA estéril al 0,1% mediante sonda gástrica oral
justo antes de recibir el alimento y al final del período de
alimentación de 4 horas. Los ratones recibieron inyecciones dos
veces al día durante catorce días, tiempo durante el cual se
midieron diariamente la ingesta de alimentos y el peso corporal. El
día 14, inmediatamente después de la segunda sonda gástrica oral
con el péptido zsig33-1, se estimularon oralmente
los ratones con un volumen de 0,5 ml de glucosa al 25%.
Inmediatamente antes de la administración del péptido
zsig33-1 o del vehículo (t = 30 minutos), y también
0, 1, 2 y 4 horas después de la estimulación con glucosa, se
realizaron sangrías retroorbitales para determinar los niveles
séricos de glucosa.
Los resultados indicaron que
zsig33-1, cuando se administró oralmente en una
cantidad de 1 \mug/ratón, no produjo efecto alguno sobre las
mediciones diarias de peso corporal y de ingesta de alimentos, ni
sobre el aclaramiento de glucosa según se determinó el día 14.
Se preparó una transferencia Northern usando
mRNA de las fuentes siguientes:
1. RNA de la línea celular SW480 de
adenocarcinoma colorrectal humano (Clontech, Palo Alto, California,
EE.UU.).
2. RNA de tejido de intestino delgado humano
(Clontech).
3. RNA de tejido de estómago humano
(Clontech).
4. Línea celular de músculo liso intestinal
humano (Hism; ATCC nº CRL-1692; American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland,
EE.UU.).
5. Línea celular de colon humano normal (FHC;
ATCC nº CRL-1831; American Type Culture
Collection).
6. Línea celular de intestino delgado fetal
normal humano (FHs74 Int.; ATCC nº CCL241; American Type Culture
Collection).
Se aislaron los RNAs totales de Hism, FHC y
FHs74 Int por el método del guanidinio-ácido (Chomczynski et
al., Anal. Biochem. 162: 156-159,
1987). Se seleccionaron los RNAs poliA^{+} eluyendo el RNA total a
través de una columna que retiene RNAs poliA^{+} (Aviv et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:
1408-1412, 1972). Se sometieron 2 \mug de RNA
poliA^{+} de cada muestra a separación en un gel de agarosa al
1,5% en formaldehído 2,2 M y tampón de fosfato. Se transfirieron
los RNAs a una membrana Nytran (Schleicher y Schuell, Keene, New
Hampshire, EE.UU.) en SSC 20X durante la noche. Se trató la
transferencia en el aparato UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La
Jolla, California, EE.UU.) ajustado a 0,12 julios. Luego se trató la
transferencia en una estufa a 80ºC durante una hora.
Usando el cDNA de longitud completa (mostrado en
la ID. SEC. nº 1) multiplicado por PCR, se radiomarcaron
aproximadamente 50 ng de DNA de zsig33 y 42,5 \mul de agua con
^{32}P-dCTP usando un kit de glóbulos Rediprime
(Amersham, Arlington Heights, Illinois, EE.UU.) de acuerdo con las
especificaciones del fabricante. Se hibridó la transferencia en
EXPRESSHYB (Clontech) a 55ºC durante la noche. Se lavó la
transferencia a temperatura ambiental en SSC 2X y SDS al 0,1%,
luego a 65ºC en SSC 2X y SDS al 0,1%, y finalmente a 65ºC en SSC
0,1X y SDS al 0,1%. Los resultados mostraron que zsig33 se
hibridaba con RNA estomacal y no con otros RNAs de otros orígenes
tisulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron una Transferencia II de un
conjunto de tumores humanos - Northern Territory^{TM} (Invitrogen,
San Diego, California, EE.UU.) y una Transferencia de un conjunto
de tumores de estómago humanos - Northern Territory^{TM}
(Invitrogen) en cuanto a los patrones de expresión de RNA de
zsig33.
La transferencia del conjunto de tumores humanos
contenía 20 \mug de RNA total por carril y fue desarrollada en un
gel desnaturalizante de formaldehído al 1%. La transferencia
contenía RNA de tumor esofágico, esófago normal, tumor de estómago,
estómago normal, tumor de colon, colon normal, tumor rectal y recto
normal. La transferencia del conjunto de tumores de estómago
contenía RNA total aislado de tejidos tumorales y normales humanos
de cuatro donantes diferentes. Se utilizaron 20 \mug de RNA en
cada carril de muestra, y en los carriles se alternaba un grupo
normal y tumoral de cada donante.
Se prepararon sondas que eran el oligonucleótido
ZC12,494 (ID. SEC. nº 7) de aproximadamente 40 bp. Las sondas
fueron terminalmente marcadas usando polinucleótido quinasa de T4
(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) y el
tampón directo para polinucleótido quinasa de T4 (Life Technologies,
Inc.). Las sondas fueron purificadas usando columnas de empuje
NUCTRAP (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.). Tanto la
transferencia de tumores como la transferencia de estómago fueron
tratadas de la misma manera. Se utilizó la disolución EXPRESSHYB
(Clontech) para la prehibridación y como una disolución de
hibridación para las transferencias Northern. La hibridación tuvo
lugar a 42ºC, y las transferencias se lavaron en SSC 0,1X y SDS al
0,01% a 60ºC, lo que fue seguido de un lavado en SSC 0,1X y SDS al
0,1% a 70ºC. Los resultados indican claramente que zsig33 se
expresa exclusivamente en tejido normal de estómago tanto en el
conjunto de tumores humanos como en el conjunto de tumores de
estómago humanos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: ZymoGenetics. Inc.
\hskip3,9cm 1201 Eastlake Avenue East
\hskip3,9cm Seattle
\hskip3,9cm WA
\hskip3,9cm USA
\hskip3,9cm 98102
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: HOMÓLOGOS DE MOTILINA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ZymoGenetics. Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1201 Eastlake Avenue East
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 98102
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Diskette
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ PARA Windows, Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUR PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sawislak, Deborah A
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 37.438
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 97-04PC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 206-442-6672
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 206-442-6678
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 351 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...351
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...69
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido maduro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 70...351
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interna
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 546 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 40...396
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interna
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otra
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: ZC12494
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: NINGUNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
-
10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
-
11
Claims (15)
1. Una molécula polipeptídica aislada que
comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que
consiste en:
(a) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 24 al resto 37;
(b) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 24 al resto 41;
(c) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 24 al resto 117;
(d) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 1 al resto 37; y
(e) una secuencia polipeptídica que consiste en
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la ID. SEC. nº 2,
del resto 1 al resto 117;
polipéptido que es capaz de
estimular la motilidad gástrica o la absorción de
glucosa.
2. Una composición farmacéutica que comprende un
polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 1, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Una molécula polinucleotídica aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que
consiste en:
(a) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
70 al nucleótido 111;
(b) secuencias nucleotídicas degeneradas de
(a);
(c) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
70 al nucleótido 120;
(d) secuencias nucleotídicas degeneradas de
(c);
(e) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
70 al nucleótido 351;
(f) secuencias nucleotídicas degeneradas de
(e);
(g) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
1 al nucleótido 111;
(h) secuencias nucleotídicas degeneradas de (g);
y
(i) la secuencia de nucleótidos que consiste en
una secuencia como la mostrada en la ID. SEC. nº 1, del nucleótido
1 al nucleótido 351;
polinucleótido que codifica un
polipéptido capaz de estimular la motilidad gástrica o la absorción
de
glucosa.
4. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 3, en que el polinucleótido es DNA.
5. Un vector de expresión que comprende los
siguientes elementos operativamente unidos:
un promotor de transcripción;
un polinucleótido de acuerdo con la
Reivindicación 3; y
un terminador de transcripción.
6. Una célula en cultivo en la que se ha
introducido un vector de expresión de acuerdo con la Reivindicación
5, célula que expresa el polipéptido codificado por el
polinucleótido.
\newpage
7. Un método para producir un polipéptido, que
comprende:
cultivar una célula en la que se ha introducido
un vector de expresión de acuerdo con la Reivindicación 5, por lo
que dicha célula expresa un polipéptido codificado por el segmento
de DNA; y
recuperar el polipéptido.
8. Uso de un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en los restos
24 a 37 de la ID. SEC. nº 2, para la fabricación de un medicamento
para estimular la motilidad gástrica, polipéptido que, en uso,
aumenta el tiempo de tránsito o el vaciamiento gástrico de una
sustancia ingerida.
9. Uso de la Reivindicación 8, en el que se mide
el tiempo de tránsito o el vaciamiento gástrico utilizando una
sustancia radiomarcada.
10. Un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 2 o a un fragmento de dicho polipéptido, en el que el
fragmento consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste en:
(a) del resto 24 al resto 117 de la ID. SEC. nº
2; y
(b) del resto 24 al resto 37 de la ID. SEC. nº
2.
11. El anticuerpo de la Reivindicación 10, en
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
12. Un método para producir un anticuerpo, que
comprende las operaciones siguientes: inocular en un animal un
polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que consiste en la secuencia
de aminoácidos de la ID. SEC. nº 2, de los restos 24 a 117; y
(b) un polipéptido que consiste en la secuencia
de aminoácidos de la ID. SEC. nº 2, de los restos 24 a 37;
en el que el polipéptido provoca
una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo, y
aislar el anticuerpo del
animal.
13. Un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido de los restos de aminoácido 24 a 117 de la ID. SEC.
nº 2.
14. El anticuerpo de la Reivindicación 13, en
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
15. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en los restos 24
a 37 de la ID. SEC. nº 2, para estimular la motilidad gástrica,
polipéptido que, en uso, aumenta el tiempo de tránsito o el
vaciamiento gástrico de una sustancia ingerida.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41102097P | 1997-03-24 | 1997-03-24 | |
| US822897 | 1997-03-24 | ||
| US08/822,897 US6380158B1 (en) | 1997-03-24 | 1997-03-24 | Motilin homologs |
| US411020P | 1997-03-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2317664T3 true ES2317664T3 (es) | 2009-04-16 |
Family
ID=40227538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98911928T Expired - Lifetime ES2317664T3 (es) | 1997-03-24 | 1998-03-23 | Homologos de motilina. |
Country Status (4)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0975760B1 (es) |
| AT (1) | ATE421585T1 (es) |
| DE (1) | DE69840496D1 (es) |
| ES (1) | ES2317664T3 (es) |
-
1998
- 1998-03-23 AT AT98911928T patent/ATE421585T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 DE DE69840496T patent/DE69840496D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 EP EP98911928A patent/EP0975760B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 ES ES98911928T patent/ES2317664T3/es not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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