ES2317690T3

ES2317690T3 - Genes asociados con el condrosarcoma.

Info

Publication number: ES2317690T3
Application number: ES99909962T
Authority: ES
Inventors: Richard M. Terek
Original assignee: Rhode Island Hospital
Current assignee: Rhode Island Hospital
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: CA2323076A1; DK1062333T3; JP2002506617A; AU2904099A; PT1062333E; AU762987B2; ATE408686T1; EP1062333A1; DE69939583D1; EP1062333B1; US6207812B1; WO1999046382A1; US7211646B2; US20010016649A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos del ID SEC Nº: 1, y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparado con células normales es indicativa de condrosarcoma.

Description

Genes asociados con el condrosarcoma.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a tumores malignos de hueso.

El condrosarcoma, que normalmente aparece al final de la edad adulta y en la vejez, es la segunda forma más común de tumor maligno de hueso. Los tumores de condrosarcoma convencionales se clasifican de la fase I a la fase III, siendo la fase III la más avanzada. Además del condrosarcoma convencional, hay otros tipos de condrosarcomas con características distintivas: condrosarcoma mixoide, mesenquimatoso, de células claras y desdiferenciado (célula fusiforme).

El diagnóstico y clasificación del condrosarcoma han sido problemáticos. Por ejemplo, los criterios usados para distinguir el encondroma benigno del condrosarcoma de grado bajo incluyen parámetros que son difíciles de cuantificar tales como una mayor celularidad y células binucleadas más que ocasionales. Los criterios histológicos no son absolutos, y el diagnóstico se hace con frecuencia teniendo en cuenta características clínicas tales como el dolor, velocidad de crecimiento, localización y características radiológicas. Además, la localización del tumor puede afectar a la evaluación clínica. Por ejemplo, lesiones en la mano pueden aparecer como histológicamente agresivas pero comportarse de forma benigna. Por el contrario, lesiones que se encuentran en la pelvis es muy probable que representen un tumor maligno a pesar de un aspecto histológico relativamente inocuo. A pesar de los intentos de integrar los criterios clinicopatológicos, no ha sido posible predecir qué tumores extenderán la metástasis o reaparecerán.

Rosier y col., J. Surg. Oncol. 65:95-105 (1997) describen MDR-1 y su producto de proteína, la P-glicoproteína.

Nakanishi y col., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 234:206-10 (1997) describen la expresión de la secuencia marcadora correspondiente al factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF).

Gloeckner y col., Base de datos EMBL entrada HSAF2996, nº de acceso AF002996 (1997), describen una secuencia genómica alrededor del gen CP1, pero sin hacer referencia a células de condrosarcoma.

Liang y col., Science 257(5072):967-71 (1992) describen procedimientos de presentación diferencial de ARNm que se pueden usar para aislar genes, pero no proporcionan ningún ejemplo del uso de los procedimientos para estudiar, detectar y/o identificar células de condrosarcoma.

Resumen de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de un nuevo gen que se expresa de forma diferencial en células de condrosarcoma.

Por consiguiente la invención proporciona:

(A) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº: 1 y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con la de células normales es indicativa de condrosarcoma;

(B) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de ID SEC Nº: 2 y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con la de células normales es indicativa de condrosarcoma; y

(C) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico consiste en: la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº: 1 o una variante degenerada de la misma, en la que dicha variante degenerada codifica un polipéptido que consiste en al menos 50 aminoácidos de la secuencia de ID SEC Nº: 2 y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con la de células normales es indicativa de condrosarcoma.

La invención, por lo tanto, presenta un ácido nucleico aislado (p. ej., ADN genómico, ADNc o ADN sintético) que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA) tal como CSA-1 humano. La expresión "asociado a condrosarcoma" se refiere a la propiedad de expresión diferencial en células de condrosarcoma comparado con células de cartílago normales. Por ejemplo, un producto génico CSA se expresa con un nivel mayor o menor detectable comparado con el nivel al que se expresa en células de cartílago normales. Un producto génico CSA puede expresarse sólo en células de condrosarcoma (y no en células de cartílago normales).

La molécula de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 80% a la secuencia de aminoácidos de CSA-1 (ID SEC Nº: 2). Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº: 1 o una variante degenerada de la misma. Por ejemplo, el ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº: 3. La invención también incluye una molécula de ácido nucleico que contiene una cadena que hibrida en condiciones muy restrictivas con un ADN que tiene la secuencia de ID SEC Nº: 1, o su complementaria. Un ADN sustancialmente puro que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia (preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, y lo más preferiblemente al menos un 90%) con el ID SEC Nº: 1, y que codifica un polipéptido que tiene el patrón diferencial de expresión de un polipéptido CSA-1, también queda dentro del alcance de la invención. Para la expresión de un polipéptido CSA, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CSA está operativamente unida a secuencias reguladoras, p. ej., un promotor.

La invención también incluye un polipéptido CSA sustancialmente puro tal como CSA-1 humano o un fragmento del mismo. Los fragmentos de CSA-1, p.ej., un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 8, son útiles como inmunógenos para aumentar los anticuerpos anti-CSA. El polipéptido CSA preferiblemente contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50% idéntica a la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 2. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido es un 75%, 85%, 95%, 98% y lo más preferiblemente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 2. Una célula que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CSA también queda dentro del alcance de la invención, así como un procedimiento para preparar un polipéptido CSA. Dicho procedimiento puede implicar las siguientes etapas: (a) proporcionar una célula que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CSA, y (b) cultivarla en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ácido nucleico.

Por "molécula de ácido nucleico aislada" se entiende una molécula de ácido nucleico que no contiene los genes que, en el genoma natural del organismo, flanquea un gen csa. Por lo tanto, la expresión incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus replicante autónomo; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota; o que existe como una molécula separada (p. ej., un ADNc o un fragmento de ADNc genómico producido mediante PCR o digestión con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. La expresión también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica la secuencia del polipéptido adicional. La expresión excluye segmentos largos de ADN genómico, p. ej., tales como los presentes en clones cósmidos, que contienen un gen de interés, p. ej., un gen csa, flanqueado por uno o más de otros genes que lo flanquean de forma natural en un genoma natural.

Las moléculas de ácido nucleico incluyen tanto ARN como ADN, incluyendo ADNc, ADN genómico y ADN sintético (p. ej., sintetizado químicamente). Si es monocatenaria, la molécula de ácido nucleico puede ser una cadena homosentido o una cadena antisentido. Por lo tanto, la expresión incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota en un sitio distinto del que es su sitio natural; o que existe como una molécula separada (p. ej., un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o digestión por endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica la secuencia de polipéptido adicional.

La hibridación se lleva a cabo usando técnicas estándar tales como las descritas en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1989). "Condiciones restrictivas altas" se refiere a condiciones de hibridación de ADN y lavado caracterizadas por temperatura alta y concentración salina baja, p. ej., condiciones de lavado de 65ºC con una concentración salina de aproximadamente 0,1 X SSC. Condiciones de restricción de "bajas" a "moderadas" se refiere a condiciones de hibridación del ADN y lavado caracterizadas por temperatura baja y concentración salina alta, p. ej. condiciones de lavado menores de 60ºC con una concentración salina de al menos 1,0 X SSC. Por ejemplo, condiciones de restricción altas pueden incluir hibridación a aproximadamente 42ºC y formamida aproximadamente al 50%; un primer lavado a aproximadamente 65ºC, aproximadamente 2 X SSC y SDS al 1%; seguido de un segundo lavado a aproximadamente 65ºC y aproximadamente 0,1% x SSC. Las condiciones de restricción más bajas adecuadas para detectar secuencias de ADN que tienen aproximadamente un 50% de identidad de secuencia con el gen csa-1 se detectan, por ejemplo, por hibridación a aproximadamente 42ºC en ausencia de formamida; un primer lavado a aproximadamente 42ºC, aproximadamente 6 X SSC, y aproximadamente SDS al 1%; y un segundo lavado a aproximadamente 50ºC, aproximadamente 6 x SSC, y aproximadamente SDS al 1%.

Cuando se dice que un polipéptido o molécula de ácido nucleico particular tiene un porcentaje de identidad específico con un polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia de una longitud definida, el porcentaje de identidad es respecto al polipéptido o la molécula de ácido nucleico de referencia. Por lo tanto, un péptido que es un 50% idéntico a un polipéptido de referencia que tiene 100 aminoácidos de longitud puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. También puede ser un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud que es un 50% idéntico al polipéptido de referencia a lo largo de su longitud completa. Por supuesto, muchos otros polipéptidos cumplirán los mismos criterios. Se aplica la misma norma para las moléculas de ácido nucleico.

Para los polipéptidos, la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia en general será de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente de al menos 20 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 25 aminoácidos, y lo más preferiblemente 35 aminoácidos, 50 aminoácidos o 100 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia en general será de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de al menos 60 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 75 nucleótidos, y lo más preferiblemente 100 nucleótidos o 300 nucleótidos.

En el caso de secuencias de polipéptidos que son idénticas en menos del 100% a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas son, preferiblemente pero no necesariamente, sustituciones conservativas para la secuencia de referencia. Las sustituciones conservativas normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina.

La identidad de secuencia se mide usando un programa de análisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705), con los parámetros por defecto especificados en el mismo.

Por "promotor" se entiende una secuencia de ADN mínima suficiente para dirigir la transcripción. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden estar acoplados a otras secuencias o "elementos" reguladores que hacen la expresión de gen dependiente de promotor específico del tipo de célula, específico de tejido o inducible por señales o agentes externos; dichos elementos pueden estar situados en la región 5' ó 3' del gen nativo, o dentro de un intrón. El ADN que codifica un polipéptido CSA puede estar operativamente unido a dichas secuencias reguladoras para la expresión del polipéptido en células procariotas o eucariotas. Por "operativamente unido" se entiende que una secuencia codificadora y una(s) secuencia(s) reguladora(s) están conectadas de forma que permitan la expresión génica cuando las moléculas adecuadas (p. ej., proteínas activadoras de la transcripción) están unidas a la(s)

\hbox{secuencia(s)}

reguladora(s).

Una proteína no tiene sustancialmente componentes asociados naturales cuando se separa de los contaminantes que la acompañan en su estado natural, (proteínas y otras moléculas orgánicas naturales) que la acompañan de forma natural. Normalmente, el polipéptido está sustancialmente puro cuando constituye al menos un 60% en peso de la proteína en la preparación. Preferiblemente, la proteína en la preparación constituye al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 90% y lo más preferiblemente al menos un 99% en peso, del polipéptido CSA-1. Se puede obtener un polipéptido CSA-1 sustancialmente puro, por ejemplo, por extracción de una fuente natural (p. ej., una célula de condrosarcoma); por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido CSA-1; o por síntesis química de la proteína. La pureza se puede medir por cualquier procedimiento adecuado, p. ej., cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC. Por consiguiente, los polipéptidos sustancialmente puros incluyen polipéptidos recombinantes derivados de un eucariota pero producidos en E. coli u otro procariota o en un eucariota distinto del que se obtuvo originalmente el polipéptido.

La invención también presenta especies que se unen al polipéptido CSA, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido CSA, p. ej. un anticuerpo específico de CSA-1. Los anticuerpos específicos para un polipéptido CSA son útiles para diagnosticar el condrosarcoma.

El condrosarcoma se diagnostica midiendo la expresión del gen csa en muestras de tejido de paciente. La expresión de CSA-1 se puede detectar en células de condrosarcoma pero no en células normales (o en algunos otros tipos de tumores que se ensayaron). Por lo tanto, el uso de polipéptidos CSA y de moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido CSA en el diagnóstico y clasificación del condrosarcoma también queda dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un procedimiento para diagnosticar la presencia de una célula de condrosarcoma en una muestra de tejido, se lleva a cabo midiendo la expresión de un gen csa, p. ej., un gen que codifica CSA-1, en la muestra de tejido y en una muestra de control tal como una célula de cartílago no neoplásica normal. Un aumento de la expresión del gen csa en la muestra de tejido, comparado con la muestra de control, indica que la muestra de tejido contiene una célula de condrosarcoma. Un procedimiento para clasificar un tumor de condrosarcoma se puede llevar a cabo determinando el nivel de expresión del gen csa-1 en una muestra de control y compararlo con el nivel de expresión de gen csa-1 en una muestra de control. El nivel de expresión en la muestra de ensayo comparado con la muestra de control es directamente proporcional al grado o fase del tumor, es decir, cuanto mayor es el nivel de expresión de un gen csa más avanzada es la fase del tumor.

Además de evaluar muestras de biopsia de tejido para la expresión del gen csa, la expresión del gen csa se puede detectar in vivo. Por ejemplo, se puede administrar a un paciente una cantidad eficaz para el diagnóstico de una especie de unión específica a CSA-1 marcada de forma detectable, seguido de la determinación de si la especie se une específicamente a células de cartílago del paciente. La unión de especies de unión a CSA-1, p. ej. un anticuerpo específico para CSA-1, fragmento de anticuerpo o compuesto de unión a CSA-1 que no sea anticuerpo, a las células del paciente, es una indicación de la presencia de condrosarcoma en el paciente. El nivel de unión se correlaciona con el grado del condrosarcoma, es decir, una mayor cantidad de unión comparada con un control normal de tumor de grado bajo conocido indica que el tumor del paciente es de un grado alto. Igualmente, se puede llevar a cabo como sigue un procedimiento para detectar un condrosarcoma progresivo en un paciente: (a) administrar sucesivamente a un paciente que se sospecha que tiene un condrosarcoma una cantidad eficaz para el diagnóstico de una especie de unión específica a CSA-1 marcada de forma detectable (p. ej., un anticuerpo marcado con un radioisótopo o un marcador paramagnético), y (b) comparar la cantidad de la especie que se une a células de cartílago del paciente en cada administración sucesiva para detectar un aumento de la unión de la especie de unión a lo largo del tiempo. Un aumento de la unión a lo largo del tiempo es una indicación de condrosarcoma progresivo en dicho paciente. Cuando la etapa de detección es cuantitativa, la cantidad de unión se correlacionaría con y permitiría el diagnóstico de la gravedad de la enfermedad. Un procedimiento de diagnóstico llevado a cabo múltiples veces mediante la administración repetida a intervalos de tiempo espaciados de la especie de unión marcada al paciente, con las administraciones espaciadas p. ej., un día, una semana, un mes,
varios meses o incluso años, es un procedimiento útil para detectar el progreso de la enfermedad en el paciente.

Los compuestos capaces de inhibir la expresión de un polipéptido CSA pueden ser terapéuticamente útiles para tratar el condrosarcoma. Por consiguiente, la invención incluye un procedimiento de cribado de un compuesto candidato para identificar un compuesto capaz de inhibir la expresión de un polipéptido CSA, p. ej. CSA-1, (a) proporcionando una célula de condrosarcoma que expresa un polipéptido CSA, (b) poniendo en contacto la célula con el compuesto candidato, y (c) determinando la cantidad de expresión del polipéptido CSA por la célula. Una disminución de la cantidad de expresión del polipéptido CSA en presencia del compuesto candidato comparado con aquella en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto inhibe la expresión del polipéptido CSA.

La invención también incluye un procedimiento para inhibir la expresión o actividad de CSA-1. Los antagonistas adecuados incluyen una molécula de ácido nucleico que interfiere con la transcripción o traducción de csa-1, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico antisentido y ribozimas. También están incluidos anticuerpos u otras moléculas antagonistas adecuadas que se unen específicamente al polipéptido CSA-1 y "neutralizan" su actividad.

Además de los procedimientos de diagnóstico, como se han descrito antes, la presente invención abarca procedimientos y composiciones para evaluar el tratamiento adecuado y la eficacia del tratamiento de tumores malignos asociados con la expresión de csa-1. Por ejemplo, el csa-1 se puede usar como una sonda para clasificar las células en términos de su nivel de expresión de csa-1, o como cebadores para el diagnóstico por análisis de PCR, en el que se pueden detectar mutaciones y la variación alélica de csa-1.

La invención también incluye animales no humanos transgénicos que expresan CSA-1 humano y mamíferos no humanos transgénicos con una mutación nula en su gen de CSA-1 endógeno. Estos animales pueden servir como modelos nuevos y útiles del condrosarcoma. La invención también incluye un mamífero no humano transgénico, p. ej., un roedor tal como un ratón, cuyas células germinales y células somáticas contienen una mutación nula, p. ej., una deleción, en el ADN que codifica un gen csa. Por "mutación nula" se entiende una alteración en la secuencia de nucleótidos que convierte al gen en incapaz de expresar un producto proteínico funcional. La mutación podría ser en regiones reguladoras de csa o en la secuencia codificadora. Puede, por ejemplo, introducir un codón de parada que da como resultado la producción de un producto génico truncado e inactivo, o puede ser una deleción de toda o una parte sustancial de la secuencia codificadora.

La invención también presenta un ácido nucleico aislado (p. ej., ADN genómico, ADNc o ADN sintético) que codifica un polipéptido asociado a cartílago (CAA) tal como CAA-1. La expresión "asociado a cartílago" se refiere a la propiedad de la expresión diferencial en células del linaje de cartílago comparado con células de otras especificidades de tejidos. Por ejemplo, un producto génico CAA se expresa en células de cartílago normales y en células de condrosarcoma, pero no en células de otras especificidades de tejidos u otros tipos de tumores.

La molécula de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 80% a la secuencia de aminoácidos de CAA-1 (ID SEC Nº: 7). Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos del ID SEC Nº: 6 o una variante degenerada de la misma. Por ejemplo, el ácido nucleico puede tener la secuencia de nucleótidos del ID SEC Nº: 5. La invención también incluye una molécula de ácido nucleico que contiene una cadena que hibrida en condiciones de restricción altas con un ADN que tiene la secuencia del ID SEC Nº: 6, o la complementaria de la misma. Un ADN sustancialmente puro que tiene al menos 50% de identidad de secuencia (preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, y lo más preferiblemente al menos 90%) con el ID SEC Nº: 7, y que codifica un polipéptido que tiene la actividad de CAA-1. Por actividad de CAA-1 se entiende la inhibición de la regulación positiva inducida por el interferón gamma de antígenos HLA clase II. Para la expresión de un polipéptido CAA, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CAA está operativamente unida a secuencias reguladoras, p. ej. un promotor.

La invención también incluye un polipéptido CAA sustancialmente puro tal como CAA-1 humano o un fragmento del mismo. El polipéptido CAA-1 preferiblemente contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 50% a la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 7. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica en un 75%, 85%, 95%, 98% y lo más preferiblemente 100% a la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 7. Una célula que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CAA también queda dentro del alcance de la invención, así como un procedimiento para preparar un polipéptido CAA. Dicho procedimiento implica las siguientes etapas: (a) proporcionar una célula que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CAA, y (b) cultivarla en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ácido nucleico.

La invención también presenta una especie que se une al polipéptido CAA, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido CAA, p. ej., un anticuerpo específico de CAA-1. Los anticuerpos específicos para un polipéptido de CAA son útiles para determinar la especificidad de tejido y para aplicaciones terapéuticas, p. ej., para inhibir la actividad de CAA-1.

Los compuestos capaces de inhibir la expresión de un polipéptido CAA pueden ser terapéuticamente útiles para tratar afecciones, p. ej., artritis reumatoide, asociadas con la inflamación de articulaciones indeseada o patológica. Por consiguiente, la invención incluye un procedimiento de cribado de un compuesto candidato para identificar un compuesto capaz de inhibir la expresión de un polipéptido CAA, p. ej. CAA-1, (a) proporcionando una célula que expresa un polipéptido CAA, (b) poniendo en contacto la célula con el compuesto candidato, y (c) determinando la cantidad de expresión del polipéptido CAA por la célula. Una disminución de la cantidad de expresión del polipéptido CAA en presencia del compuesto candidato, comparada con la producida en ausencia del compuesto candidato, indica que el compuesto inhibe la expresión del polipéptido CAA. Un procedimiento de identificación de un compuesto que inhibe la actividad de CAA-1 se puede llevar a cabo como sigue: (a) se proporciona una célula que expresa un polipéptido CAA, (b) se pone en contacto la célula con el compuesto candidato, y (c) se determina la cantidad de expresión de HLA II por la célula. Una disminución de la cantidad de expresión de HLA II en presencia del compuesto candidato comparada con esta en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto inhibe la expresión de HLA II en la célula.

Los procedimientos para tratar la inflamación indeseada tales como la asociada con la artritis reumatoide y otras artropatías inflamatorias también quedan dentro del alcance de la invención. Dicho procedimiento se puede llevar a cabo administrando a un mamífero que necesite dicha terapia, p. ej., un paciente que padece artritis reumatoide u otra artropatía inflamatoria, una cantidad eficaz de un polipéptido CAA-1. Por ejemplo, el péptido se administra localmente en el sitio de una lesión reumatoide para reducir la inflamación e hinchamiento locales.

La invención también incluye un mamífero no humano transgénico que expresa CAA-1 humano y un mamífero no humano transgénico con una mutación nula en su gen CAA-1 endógeno.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de sus realizaciones preferidas y a partir de las reivindicaciones.

Descripción detallada

Hasta la fecha no se ha asociado una anomalía genética consistente con el condrosarcoma. Los tumores son heterogéneos y a menudo tienen numerosas anomalías en la expresión de genes. Los siguientes ejemplos proporcionan pruebas de un nuevo gen, csa-1, que se expresa en una línea celular de condrosarcoma humano y en neoplasmas cartilaginosos, pero no en el cartílago normal. El nivel de expresión de un polipéptido CSA-1 se correlaciona con el grado histológico del neoplasma, es decir, un aumento de la expresión indica un tumor de grado más alto. La detección de un producto génico CSA-1 o el transcrito de csa-1 es un medio por el cual distinguir una célula neoplásica de una célula de cartílago normal.

Los polipéptidos CSA y polipéptidos CAA se pueden usar terapéuticamente. Por ejemplo, un polipéptido CAA tal como CAA-1 puede funcionar como un supresor de tumor. También se puede administrar el polipéptido CAA-1 a pacientes para reducir la inflamación indeseada tal como la inflamación de articulaciones en la artritis reumatoide.

El CSA-1 tiene una función en la potenciación de la condrogénesis asociada con el condrosarcoma. La transfección de líneas celulares normales o sin expresión con vectores que promueven niveles altos de expresión de un polipéptido CSA, p. ej., CSA-1, seguido de la transformación de una línea celular de grado bajo en una línea celular de grado alto, indica que la expresión de CSA potencia el crecimiento neoplásico. Los inhibidores de la expresión de CSA-1 pueden ralentizar o inhibir el crecimiento neoplásico. La transformación y clasificación de las células transformadas se evalúa examinando cambios en la morfología, proliferación, adhesión y capacidad de invasión.

Se han clonado dos genes nuevos. CSA-1 se expresa en una línea de células tumorales y también en algún condrosarcoma de grado alto, pero no en el cartílago normal, o tumores de grado bajo o intermedio. Un segundo gen, CAA-1, se expresa en el cartílago normal y en una línea de células tumorales de grado intermedio, y como mensajes de tamaño alternativo en una línea celular de grado alto.

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Ejemplo 1 Clonación de genes csa

Se cultivaron líneas celulares de condrosarcoma obtenidas de condrosarcomas humanos de grado I, II y III alternativamente en cultivos de monocapas y en cultivos en suspensión de agarosa usando procedimientos estándar. El ARN celular total se aisló usando técnicas estándar. Se analizaron tres líneas celulares de condrosarcoma humano diferentes (AQ, tumor en fase II; FS, tumor en fase II y MW, tumor en fase I) y cartílago articular normal obtenido de muestras de amputación.

Usando la técnica de presentación diferencial de ARNm, una técnica que amplifica sistemáticamente los ARNm mediante RT-PCR con diferentes grupos de cebadores arbitrarios 5' y cebadores de anclaje oligo-dT 3', se compararon los patrones de ARNm de células y de tipos de células diferentes. Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de secuenciación de poliacrilamida desnaturalizante para presentar los patrones de ARNm que distinguen un tipo de célula de otro. Las bandas que se separaron por electroforesis en gel representan los extremos 3' de los ADNc. Por lo tanto, una banda que está presente en un tipo de célula, p. ej., una línea de células de condrosarcoma o tejido de biopasia de condrosarcoma, pero no en el tejido de cartílago normal o en tejido no cartilaginoso, sugiere que el gen se expresa de forma diferencial en condrosarcomas.

Se generó ADNc usando transcriptasa inversa y un cebador oligo-dT (TTTTTTTTTTTTMN (ID SEC Nº: 4), en el que M puede ser C, G o A; N puede ser C, G, A o T). Después se llevó a cabo una reacción de PCR por triplicado con el mismo cebador oligo-dT y un segundo cebador de la pareja de diez pares de bases aleatorio (RNAmap, GenHunterCorp., Brookline, MA). Esta combinación de cebadores amplificó aproximadamente 100 ADNc de 100-500 pares de bases de longitud. Los ADNc se separaron en un gel de secuenciación. Una banda que está presente en una o más líneas celulares de cáncer y ausente en una célula normal puede representar un oncogén que se expresa en la célula de cáncer pero no en la célula normal. A la inversa, una banda que está ausente en una o más líneas celulares de cáncer y está presente en una célula normal puede representar un gen supresor de tumor que no está siendo expresado debido a una mutación o defecto de regulación.

Se eluyó el ADNc de un ARNm expresado de forma diferencial del gel de secuenciación y se volvió a amplificar en una reacción de PCR con los mismos cebadores usados en la reacción de presentación diferencial y se clonó en un vector pCR^{TM} II (Invitrogen, San Diego, CA). Se identificaron los ARNm específicos que estaban presentes únicamente en células de condrosarcoma y se clonaron los correspondientes ADNc. Los ADNc se secuenciaron usando los cebadores de secuenciación directos e inversos M13, que flanquean el sitio de clonación del vector pCR^{TM}. Algunas secuencias eran idénticas a genes conocidos, p. ej., ciclina D2, una proteína reguladora del ciclo celular, y PTX3, un miembro de la familia de genes pentaxina. Los ADNc nuevos, es decir, los que no tienen similitud de secuencia con genes conocidos, se usaron para la transferencia Northern para confirmar que el gen correspondiente se expresa diferencialmente en células de condrosarcoma. Se usaron veinte de dichas sondas de ADNc para cribar la expresión diferencial del ARNm y se secuenciaron (Tabla 1). Se encontró que un gen nuevo, csa-1, se expresaba diferencialmente en células de condrosarcoma comparado con células de cartílago normal y otros tipos de células tales como células de mama, pulmón y colon.

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TABLA 1

1

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Clonación de csa-1

El gen que codifica CSA-1 se identificó usando la PCR de presentación diferencial como se ha descrito antes. FS8 es una sonda que corresponde a una de las secuencias expresadas diferencialmente identificadas. Como se muestra en la Tabla 1, el gel de presentación diferencial del cual se aisló la sonda FS8 indicaba que este gen no se expresaba en la línea celular AQ. En un ensayo de transferencia Northern, la sonda se hibridaba con un mensaje de aproximadamente 0,85 kb de tamaño en la línea celular FS así como en un condrosarcoma de grado alto. No se detectó mensaje en el cartílago normal, placa de crecimiento bovino, o en condrosarcoma de grado 1 ó 2.

Se encontró que la sonda FS8 (específica para CSA-1), que correspondía al extremo 3' del gen csa-1, tenía una longitud de 250 bases. Se usó la amplificación rápida de 5' del ADNc (5' RACE) para clonar el gen de longitud completa. Se sintetizó un cebador específico del gen que es complementario a la sonda, y se usó como un cebador para sintetizar el ADNc usando ARN de la línea celular FS como molde. El ARN se hizo digerir con Rnasa H, y se añadió un cebador para el anclaje al extremo 3' con TdT y dCTP. Se llevó a cabo la PCR usando el cebador para anclaje a 3' y un segundo cebador específico de gen anidado, dando así ADN bicatenario que es una extensión del fragmento de gen del cual se obtuvo la sonda de presentación diferencial. El fragmento generado por 5'RACE se clonó y
secuenció.

La expresión de CSA-1 en células de condrosarcoma se localizó en el núcleo de las células mediante inmunotinción usando un anticuerpo policlonal de conejo específico para un polipéptido CSA-1.

Se encontró que la secuencia del ADNc de csa-1 de longitud completa (Tabla 2) tenía un marco de lectura abierto (ORF) (Tabla 3 y mostrado en negrilla en la Tabla 2) que codifica un producto génico de 52 aminoácidos, CSA-1 (Tabla 4).

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TABLA 2 ADNc DE CSA-1

2

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TABLA 3 Secuencia codificadora de CSA-1

3

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TABLA 4 Secuencia de aminoácidos de CSA-1

4

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Clonación de caa-1

El gen que codifica CAA-1 también se identificó usando la PCR de presentación diferencial como se ha descrito antes. E1 es una sonda que corresponde a una de las secuencias expresada diferencialmente identificada. Como se muestra en la Tabla 1, E1 se expresaba en cartílago normal, pero no en ninguna de las líneas celulares de condrosarcoma humano ensayadas por la PCR de presentación diferencial. Una transferencia Northern con la sonda E1 mostró la expresión de un mensaje de 2,2 kb en el cartílago articular normal y la línea celular FS. Por el contrario se detectaron 2 transcritos de tamaños alternativos (7,5 kb y 1,2 kb) en la línea celular AQ de grado alto. Estos datos indican que el gen caa-1 puede dividirse o reorganizarse alternativamente en la línea celular AQ. El patrón de expresión indica que CAA-1 funciona como un gen supresor de tumor.

La expresión de CAA-1 se analizó usando transferencia Northern y RT-PCR en osteoblastos de líneas celulares de condrosarcoma humano, cartílago normal, músculo, condrosarcoma primario y un grupo de tumores y tejidos normales. Se llevó a cabo la transferencia Northern con E1 y con una parte generada con 5' RACE de 1,5 kb del gen como sondas. La PCR se llevó a cabo usando cebadores que amplifican 306 pb del gen caa.

La presentación diferencial del ARNm mostró la expresión de un gen en cartílago normal y en las líneas celulares FS y AQ (pero no en la línea celular MW). Se secuenció la sonda de presentación diferencial (E1), se encontró que era novedosa y se usó para análisis de transferencia Northern, que puso de manifiesto un tamaño de mensaje calculado de 2,2 kb en el cartílago normal y FS, pero no en MW, osteoblasto, músculo o placa de crecimiento bovino.

Se llevó a cabo 5'RACE usando cebadores oligonucleótidos complementarios al extremo 5' del clon E1 y dio un fragmento de 1,5 kb. Con el fin de obtener el resto de la parte 5' del gen, se repitió 5' RACE con nuevos cebadores 5' y se clonó un fragmento adicional de 0,5 kb, y se secuenciaron los fragmentos de gen que se superponían.

Se llevó a cabo la transferencia Northern con el fragmento de 1,5 kb y se detectó un mensaje de 2,0 kb en cuatro muestras diferentes del ARN de FS y en un condrosarcoma de grado II (CS) y ARN de FS. El gen de longitud completa tiene 1955 nucleótidos de longitud, que se correlaciona con el tamaño del mensaje visto con transferencia Northern.

TABLA 5 ADNc de CAA-1

5

TABLA 6 Secuencia codificadora de CAA-1

6

TABLA 7 Secuencia de aminoácidos de CAA-1

7

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El marco de lectura abierto (ORF) más largo previsto es de 942 pb. Este ORF empieza con el segundo codón de inicio en el marco, y va precedido por un ORF más corto de 126 pb. La proteína prevista para el ORF largo es de 314 aminoácidos con un peso molecular de 37 kDa. El mensaje calculado era de 2,1 kb, pero se describieron sólo 756 pb de la secuencia, que era el clon más largo aislado de su biblioteca de ADNc.

La expresión de CAA-1 se ha detectado con la PCR en 4/5 de muestras de cartílago normal, 1/2 de condrosarcoma de grado 0, 3/3 de grado I, 3/4 de grado II y 5/5 de grado III. No se detectó expresión en carcinoma de colon, mama, célula renal y gástrico y los tejidos normales correspondientes; sarcoma osteogénico y tejido blando; y tumor de célula gigante.

CAA-1 funciona para regular la respuesta inmunitaria. La regulación de una respuesta inmunitaria, p. ej., inflamación, es crítica para la fisiología de la articulación sinovial normal y la vigilancia de tumores. Los antígenos HLA clase II son necesarios para la presentación del antígeno a las células T, y se ha demostrado que el interferón gamma favorece la expresión de HLA clase II en muchas células normales y tumorales diferentes, incluyendo condrocitos y células del revestimiento sinovial. Además, se ha demostrado que los condrocitos funcionan como células presentadoras de antígeno. CAA-1 funciona como una citoquina que inhibe la regulación positiva inducida por interferón gamma de los antígenos HLA de clase II. Por lo tanto, los condrocitos expresan un gen que modula su propia capacidad, así como células alrededor de la sinovia, para funcionar como células presentadoras de antígeno. El tratamiento de una articulación sinovial con un polipéptido CAA-1 disminuye la expresión de antígenos HLA II. Por lo tanto, se puede administrar localmente un polipéptido CAA-1 para reducir una patología, tal como la asociada con la artritis reumatoide y otras artropatías inflamatorias.

CAA-1 también se expresa en el cartílago neoplásico. CAA-1 inhibe la regulación positiva de HLA clase II inducida por interferón gamma. La expresión de CAA-1 por células tumorales puede ser un mecanismo de escape del inmunorreconocimiento, es decir, la expresión mayor de CAA-1 disminuye la capacidad del hospedante para controlar el crecimiento tumoral mediante mecanismos inmunológicos. El tratamiento del condrosarcoma por inhibición de la expresión de CAA-1 o la función del producto génico CAA-1 potencia la capacidad del sistema inmunitario del hospedante para controlar el crecimiento tumoral por mecanismos inmunológicos.

Ejemplo 2 Producción y purificación del polipéptido recombinante CSA y CAA

Para producir polipéptidos recombinantes, se transfecta en una célula ADN que codifica un polipéptido CSA o CAA en un vector de expresión adecuado. Los procedimientos estándar para transfectar células con un ácido nucleico aislado son conocidos para los expertos en biología molecular. Por ejemplo, se pueden transfectar células procariotas o eucariotas en cultivo con el ADN de la invención operativamente unido a secuencias de control de la expresión adecuadas para la expresión de alto nivel en la célula. Dichas células son útiles para producir grandes cantidades de CSA-1 o CAA-1, que se pueden purificar y usar, p. ej., como un producto terapéutico o para aumentar los anticuerpos anti-CSA-1 y CAA-1.

Por ejemplo, el producto génico recombinante puede expresarse como una proteína de fusión y se puede purificar usando un sistema de expresión y purificación disponible en el comercio, p. ej., el sistema de expresión pFLAG (IBI). Los polipéptidos recombinantes se inyectan en un conejo o roedor para producir anticuerpos como se describe a continuación.

Ejemplo 3 Producción de anticuerpos específicos para polipéptidos CSA o CAA

Los anticuerpos específicos para polipéptidos CSA se pueden obtener por técnicas conocidas en la materia. Dichos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos policlonales se pueden obtener, por ejemplo, por procedimientos descritos en Ghose y col., Methods in Enzymology, Vol. 93, 326-327, 1983. Por ejemplo, se usó un polipéptido CSA-1 (que contiene 23-24 aminoácidos, p. ej. un polipéptido RRQTLSHGSSSPARAC (ID SEC Nº: 8)) como un inmunógeno para estimular la producción de anticuerpos policlonales reactivos contra CSA-1 en el antisuero de un conejo. Se pueden usar procedimientos similares para aumentar el anticuerpo en animales tales como cabras, ovejas y roedores.

Los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención se pueden obtener por el procedimiento conocido descrito por Milstein y Kohlerin, Nature, 256:495-97, 1975, o según la modificación de Gerhard, Monoclonal Antibodies, Plenum Press, 1980, páginas 370-371. Los hibridomas se criban para identificar los que producen anticuerpos que son altamente específicos para un polipéptido CSA. Preferiblemente, el anticuerpo tendrá una afinidad de al menos aproximadamente 10^{8} litros/mol y más preferiblemente, una afinidad de al menos aproximadamente 10^{9} litros/mol. El uso de dichos anticuerpos monoclonales proporciona un medio para obtener mayor sensibilidad en los ensayos de la presente invención, comparado con el uso de anticuerpos policlonales.

Ejemplo 4 Animales transgénicos

Los polipéptidos CSA también pueden expresarse en animales transgénicos. Estos animales representan un sistema modelo para estudiar trastornos que son causados o exacerbados por la expresión aumentada o reducida de un poli-
péptido CSA, y para el desarrollo de agentes terapéuticos que modulan la expresión o actividad de un

\hbox{polipéptido CSA.}

Un animal que no expresa CSA-1 es útil para estudiar la función de CSA-1. La inmunotinción de embriones de ratón con anticuerpo anti-CSA-1 mostró tinción del precursor musculoesquelético. Un transgén csa-1 con una mutación nula da como resultado un animal que no expresa el gen CSA-1, un estado que puede conducir a anomalías del desarrollo puesto que algunos genes expresados por tumores también se expresan durante el desarrollo embriológico normal.

Alternativamente, un animal transgénico que sobreexpresa CSA-1 es útil para estudiar el condrosarcoma en desarrollo. Dicho animal sería una herramienta útil para evaluar el tratamiento de este tumor.

Los animales transgénicos pueden ser animales de granja (cerdos, cabras, ovejas, vacas, caballos, conejos y similares), roedores (tales como ratas, cobayos y ratones), primates no humanos (por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés) y animales domésticos (por ejemplo, perros y gatos). Se prefieren especialmente los ratones transgénicos.

Se puede usar cualquier técnica conocida en la materia para introducir un transgén csa-1 en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Dichas técnicas incluyen, pero no se limitan a microinyección pronuclear (patente de EE.UU. nº 4.873.191); transferencia de genes mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148, 1985); manipulación dirigida de genes en células madre embrionarias (Thompson y col., Cell 56:313, 1989); y electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803, 1983).

Cuando se desea integrar el transgén csa-1 en el sitio cromosómico del gen csa-1 endógeno, se prefiere la manipulación dirigida de genes. Brevemente, cuando se va a usar dicha técnica, se diseñan vectores que contienen algunas secuencias de nucleótidos homólogas a un gen csa-1 endógeno con el propósito de integrarlas mediante recombinación homóloga con secuencias cromosómicas, y alterar la función de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno. El transgén también se puede introducir selectivamente en un tipo particular de célula, inactivando así el gen csa-1 endógeno sólo en ese tipo de célula (Gu y col., Science 265:103, 1984). Las secuencias reguladoras necesarias para dicha inactivación específica de célula dependerán del tipo de célula particular de interés, y será algo evidente para el experto en la materia. Estas técnicas son útiles para preparar "noqueados génicos" que carecen de gen csa o caa funcionales.

Una vez que se han generado los animales transgénicos, se puede ensayar la expresión del transgén recombinante usando técnicas estándar. El cribado inicial se puede llevar a cabo mediante análisis de transferencia Southern o técnicas de PCR para determinar si ha tenido lugar la integración del transgén. El nivel de expresión de ARNm del transgén en el tejido de los animales transgénicos también se puede evaluar usando técnicas que incluyen, pero no se limitan a análisis por transferencia Northern de muestras de tejido obtenidas del animal, análisis de hibridación en el sitio, y RT-PCR. También se pueden evaluar muestras de tejido que expresan el gen csa o caa de forma inmunocitoquímica usando anticuerpos específicos del producto transgénico.

Para una revisión de las técnicas que se pueden usar para generar y evaluar animales transgénicos, los expertos en la técnica pueden consultar Gordon (Intl. Rev. Cytol. 115:171-229, 1989), y pueden obtener más directrices, por ejemplo de: Hogan y col. "Manipulating the Mouse Embryo" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986; Krimpenfort y col., Bio/Technology 9:86, 1991; Palmiter y col., Cell 41:343, 1985; Kraemer y col., "Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo," Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1985; Hammer y col., Nature 315:680, 1985; Purcel y col., Science, 244:1281, 1986; Wagner y col., patente de EE.UU. nº 5.175.385; y Krimpenfort y col., patente de EE.UU. nº 5.175.384.

Ejemplo 5 Diagnóstico de condrosarcoma

La invención incluye un procedimiento para detectar neoplasmas cartilaginosos en una muestra de tejido obtenida de un paciente. La detección de la expresión de csa-1 (midiendo los transcritos génicos o productos génicos) en una muestra de paciente comparada con una muestra de control o del polipéptido CSA-1, predeciría la condrogénesis indicativa, p. ej., de condrosarcoma. El procedimiento de diagnóstico de la invención se lleva a cabo midiendo la expresión del gen csa en un tejido, p. ej. una biopsia, o en un fluido corporal, p. ej., sangre o plasma. La detección de la expresión y determinación del nivel de expresión del gen se mide usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo hibridación en el sitio, análisis de transferencia Northern, o análisis de transferencia Western usando anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de CSA-1. Un aumento del nivel de expresión de csa-1 por célula en la muestra de ensayo de tejido comparado con el nivel por célula en el tejido de control indica la presencia de un condrosarcoma en la muestra de ensayo. Por ejemplo, se podría ensayar la expresión de CSA-1 en el tejido obtenido en una biopsia, p. ej., el nivel de transcrito o de polipéptido CSA-1. Un nivel mayor de transcrito o polipéptido de CSA-1 (comparado con el tejido normal) indica una alta probabilidad de condrosarcoma. Por ejemplo, se usó la PCR para detectar la expresión de csa-1 en 15 muestras de biopsia de condrosarcoma obtenidas de pacientes. Por el contrario, no se detectó expresión de csa-1 en 3 muestras de control normales obtenidas de pacientes.

Los procedimientos descritos anteriormente también se pueden usar para determinar el grado de un tumor. Las técnicas de transferencia Northern y PCR cuantitativa se usan para determinar el nivel de expresión del gen csa. Por ejemplo, la expresión elevada de CSA-1 se correlaciona con un grado más alto del tumor.

Los procedimientos de diagnóstico descritos anteriormente son útiles para identificar pacientes que necesitan intervención terapéutica para reducir o prevenir el condrosarcoma.

Ejemplo 6 Procedimientos de terapia

Los pacientes con condrosarcoma se pueden tratar administrando ácidos nucleicos antisentido de CSA-1 o ribozimas. Otras afecciones malignas, que se caracterizan por un aumento de la expresión de CSA-1, se pueden tratar de una forma similar.

La terapia antisentido se usa para inhibir la expresión de proteínas, p. ej., CSA-1, implicadas en la condrogénesis, p. ej., la asociada con condrosarcoma. Por ejemplo, se introduce directamente una cadena antisentido de csa-1 (ARN o ADN) en las células en una forma que sea capaz de unirse a los transcritos de ARNm. Alternativamente, se puede administrar un vector que contiene una secuencia que una vez dentro de las células objetivo es transcrita en el ARNm antisentido adecuado. Los ácidos nucleicos antisentido que hibridan con el ARNm pueden disminuir o inhibir la producción del producto polipeptídico codificado por un gen por asociación con el transcrito de ARNm normalmente monocatenario, interfiriendo de esta forma en la traducción y por lo tanto, en la expresión de la proteína,

La terapia con ribozimas también se puede usar para inhibir la expresión de genes. Los ribozimas se unen a ARNm específico y después lo cortan en un punto de escisión predeterminado, destruyendo así el transcrito. Estas moléculas de ARN se pueden usar para inhibir la expresión de un gen csa implicado en la condrogénesis asociada con condrosarcoma de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica (Sullivan y col., 1994, J. Invest. Derm. 103:85S-89S; Czubayko y col., 1994, J. Biol. Chem. 269:21358-21363; Mahieu y col, 1994, Blood 84:3758-65; Kobayashi y col. 1994, Cancer Res. 54:1271-1275).

Otro procedimiento terapéutico para inhibir la expresión de proteínas o polipéptidos es la producción de anticuerpos expresados intracelularmente que, cuando se expresan en una célula, se unen y evitan el transporte y expresión en superficie de proteínas objetivo. Los anticuerpos intracelulares pueden expresarse en una célula usando técnicas conocidas (Chen y col., 1994, Hum. Gene Ther. 5:595-601).

La terapia génica se puede llevar a cabo administrando a un paciente un ácido nucleico que codifica un polipéptido terapéutico, p. ej., un gen supresor de tumor tal como caa-1, mediante vectores y/o sistemas de suministro estándar de genes. Los sistemas de suministro de genes adecuados incluyen liposomas, sistemas de suministro mediados por receptor, ADN desnudo, y vectores víricos tales como herpesvirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados, entre otros.

Como se ha discutido anteriormente, la inflamación indeseada o patológica, tal como la asociada con la artritis reumatoide y otras artropatías inflamatorias, se puede tratar inhibiendo la expresión de CAA-1. La terapia antisentido y terapia con ribozimas se puede usar para inhibir la expresión de CAA-1, y la inmunización intracelular usando ADN que codifica un anticuerpo anti-CAA-1 se puede usar para inhibir la función del producto génico.

Una composición terapéutica puede incluir uno o más compuestos, p. ej., ácidos nucleicos o agentes inmunosupresores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica también puede incluir un sistema de suministro de genes como se ha descrito anteriormente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles que son adecuados para administrar a un animal: p. ej., solución salina fisiológica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto es una cantidad que es capaz de producir un resultado médico deseado en un animal tratado, p. ej., la inhibición de la expresión de un gen objetivo, p. ej., una proteína secretada o de superficie celular, o inhibir la actividad celular, p. ej., proliferación, migración, presentación de antígeno, producción de anticuerpos o producción de citoquinas.

Se puede usar la administración parenteral, tal como las vías de suministro intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal, para suministrar el compuesto, siendo la vía preferida la administración intravenosa. Las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. Las dosificaciones del compuesto que se van a administrar variarán (se espera que las dosis de agentes inmunosupresores estén en el intervalo de dosis usadas para la administración de otros agentes inmunosupresores conocidos en la materia). Una dosificación preferida para la administración intravenosa de ácidos nucleicos es de aproximadamente 10^{6} a 10^{22} copias de la molécula de ácido nucleico. Alternativamente, el compuesto se puede administrar por un implante de liberación prolongada puesto cerca del tejido enfermo o un sitio quirúrgico después de eliminar el tejido neoplásico.

Los polipéptidos CSA o polipéptidos CAA, p. ej., un polipéptido CAA-1 se puede administrar al paciente por vía intravenosa en una vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica. Se pueden usar procedimientos estándar de suministro intracelular de péptidos, p. ej. empaquetados en liposomas. Dichos procedimientos son bien conocidos para los expertos en la técnica. Se espera que la administración sea una dosificación intravenosa de aproximadamente 1 a 100 \mumoles del polipéptido de la invención por kg de peso corporal y por día. Las composiciones de la invención son útiles para la administración parenteral, tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal. Alternativamente, un polipéptido CAA, p. ej., CAA-1 se puede administrar como un implante para la liberación lenta en el sitio de una lesión inflamatoria.

El ADN (ADN que codifica csa-1, promotores específicos de célula tumoral y vectores) de la invención se puede introducir en las células objetivo del paciente mediante vectores estándar y/o sistemas de suministro de genes. Los sistemas de suministro de genes adecuados pueden incluir liposomas, sistemas de suministro mediados por receptor, ADN desnudo y vectores víricos tales como herpesvirus, retrovirus y adenovirus, entre otros. Por ejemplo, el ADN de la invención bajo el control de un promotor constitutivo fuerte se puede administrar localmente usando un sistema de suministro de adenovirus.

El ADN de la invención se puede administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica también puede incluir un sistema de suministro de genes como se ha descrito anteriormente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles que son adecuados para la administración a un animal, p. ej. solución salina fisiológica. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad del ácido nucleico de la invención que es capaz de producir un resultado médico deseado en un animal tratado.

Como es conocido en medicina, la dosificación para cualquier paciente dado depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial del cuerpo, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos administrados simultáneamente. Las dosificaciones para los compuestos de la invención variarán, pero una dosificación preferida para la administración intravenosa es de aproximadamente 10^{6} a 10^{22} copias de la molécula de ácido nucleico. La determinación de la dosificación óptima depende de la experiencia del experto en la materia. Los fármacos que inhiben el promotor de CSA-1 también se pueden administrar como se ha descrito antes para disminuir el nivel de expresión de CSA-1 en tejidos.

Ejemplo 7 Identificación de compuestos que disminuyen la expresión de genes csa o caa

Un procedimiento de cribado de compuestos candidatos para identificar compuestos capaces de inhibir la expresión del gen csa, p.ej. csa-1, incluye las siguientes etapas: proporcionar una célula de condrosarcoma; poner en contacto la célula con un compuesto candidato; y determinar la cantidad de expresión de csa-1 en la célula, p. ej., por inmunotinción para detectar un polipéptido CSA-1 o hibridación in situ, PCR o transferencia Northern para detectar transcritos csa-1. Una disminución de la cantidad de expresión de csa-1 en las células expuestas al compuesto candidato comparada con la cantidad de expresión en las células en ausencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la expresión de csa-1 en células de condrosarcoma.

Los compuestos que inhiben la expresión de csa-1 también se pueden identificar poniendo en contacto el promotor de csa-1 unido al gen indicador con un compuesto candidato, y midiendo el nivel de expresión del gen indicador en presencia y ausencia del compuesto. Un nivel reducido de expresión en presencia del compuesto comparado con este en su presencia indica que el compuesto inhibe la expresión de csa-1.

También se pueden usar los procedimientos de cribado descritos anteriormente para identificar compuestos que inhiben la expresión de un gen caa tal como caa-1.

Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones.

<110> Terek, Richard M.

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<120> GENES ASOCIADOS A CONDROSARCOMA

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<130> 04930/021001

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<140> US 09/042.225

<141 > 13-03-1998

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<160> 8

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 164

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(156)

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<400> 1

8

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<210> 2

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<211> 52

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

9

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<210> 3

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<211> 884

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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10

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<210> 4

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<211> 14

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(14)

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttt ttvn

\hfill

14

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<210> 5

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<211> 1946

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(1946)

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 5

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11

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<210> 6

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<211> 915

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(912)

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(915)

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<223> n = A, T, C o G

\newpage

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<400> 6

12

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<210> 7

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<211> 304

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Variante

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<222> (1)...(304)

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<223> Xaa = cualquier aminoácido

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<400> 7

13

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<210> 8

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

14

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos del ID SEC Nº: 1, y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparado con células normales es indicativa de condrosarcoma.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia del ID SEC Nº: 2, y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con células normales es indicativa de condrosarcoma.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido asociado a condrosarcoma (CSA), en la que dicha molécula de ácido nucleico consiste en: la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº: 1 o una variante degenerada de la misma, en la que dicha variante degenerada codifica un polipéptido que consiste en al menos 50 aminoácidos de la secuencia del ID SEC Nº: 2 y en la que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con las células normales es indicativa de condrosarcoma.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una cadena que se hibrida en condiciones de restricción alta con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, o la complementaria a la misma.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende además secuencias reguladoras para la expresión de dicho polipéptido, comprendiendo dichas secuencias reguladoras un promotor.

6. Un polipéptido CSA sustancialmente puro, en el que dicho polipéptido comprende al menos 50 aminoácidos de la secuencia del ID SEC Nº: 2, y en el que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con células normales es indicativa de condrosarcoma.

7. Un polipéptido CSA sustancialmente puro, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 2, y en el que la expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con células normales es indicativa de condrosarcoma.

8. Una célula aislada que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Un procedimiento para preparar un polipéptido CSA, que comprende (a) proporcionar la célula de la reivindicación 8, y (b) cultivarla en condiciones que permitan la expresión de dicha molécula de ácido nucleico, preparando así dicho polipéptido CSA.

10. Un procedimiento para diagnosticar la presencia de una célula de condrosarcoma en una muestra de tejido, que comprende medir la expresión de un gen csa que codifica el polipéptido CSA de la reivindicación 6 ó 7, en dicha muestra de tejido y una muestra de control, en el que un aumento de la expresión de dicho gen csa en dicha muestra de tejido comparada con dicha muestra de control indica que dicha muestra de tejido contiene una célula de condrosarcoma.

11. Un procedimiento para clasificar un tumor de condrosarcoma en una muestra de ensayo de tejido obtenido de paciente, que comprende determinar el nivel de expresión de un gen csa-1 en dicha muestra de ensayo, en el que dicho gen csa-1 codifica el polipéptido CSA de la reivindicación 6 ó 7, y compararlo con el nivel de expresión del gen csa-1 en una muestra de control, en el que el nivel de expresión en dicha muestra de ensayo comparado con dicha muestra de control es directamente proporcional al grado de dicho tumor.

12. Un procedimiento para detectar condrosarcoma en una muestra de tejido de paciente que comprende células de cartílago, que comprende:

(a): administrar a dicha muestra de tejido de paciente una cantidad eficaz para el diagnóstico de una especie que se une específicamente a CSA-1 marcada de forma detectable, seleccionada de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, en el que dicho CSA-1 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al idéntica en al menos un 50% a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y en el que dicha expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con células normales es indicativa de condrosarcoma, y

(b): determinar si dicha especie se une específicamente a células de cartílago de la muestra de tejido de paciente, siendo dicha unión una indicación de la presencia de condrosarcoma en la muestra de tejido de paciente.

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13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el nivel de dicha unión se correlaciona con el grado de dicho condrosarcoma.

14. Un procedimiento de detección de condrosarcoma progresivo en un paciente, que comprende

(a): administrar sucesivamente a una muestra de tejido que comprende células de cartílago procedentes de un paciente que se sospecha que tiene dicho condrosarcoma una cantidad eficaz para el diagnóstico de una especie que se une específicamente a CSA-1 marcada de forma detectable, seleccionada del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, en el que dicho CSA-1 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 50% a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y en el que dicha expresión diferencial de dicho polipéptido CSA comparada con células normales es indicativa de condrosarcoma, y

(b): comparar la cantidad de dicha especie que se une a células de cartílago de la muestra de tejido en sucesivas administraciones para detectar un aumento de la unión de dicha especie de unión a lo largo del tiempo, en el que dicho aumento es indicativo de condrosarcoma progresivo en dicho paciente.

15. Un procedimiento de cribado de un compuesto candidato para identificar un compuesto capaz de inhibir la expresión de un polipéptido CSA, que comprende:

(a): proporcionar una célula de condrosarcoma que expresa el polipéptido CSA de la reivindicación 6 ó 7;

(b): poner en contacto dicha célula con dicho compuesto candidato; y

(c): determinar la cantidad de expresión de dicho polipéptido CSA por dicha célula, en el que una disminución de dicha cantidad en presencia de dicho compuesto candidato comparada con la cantidad en ausencia de dicho compuesto candidato indica que dicho compuesto candidato inhibe la expresión de dicho polipéptido CSA.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el CSA-1 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 2.