ES2317712T3 - Vectores de transformacion de plantas. - Google Patents
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Abstract
Un vector de transformación de plantas basado en la función de Agrobacterium, en el que la región de borde izquierdo comprende más de un borde izquierdo de plásmido Ti para disminuir la posibilidad de la integración de cualquier segmento de ADN no T en cromosomas vegetales.
Description
Vectores de transformación de plantas.
La presente invención se refiere a vectores de
transformación de plantas, más particularmente, a vectores útiles
en la transformación de plantas mediada por Agrobacterium así
como a especies de Agrobacterium que contienen dichos
vectores. La invención se refiere adicionalmente a un método para
transformar plantas usando los vectores. La invención es
particularmente útil para generar plantas transgénicas que se pueden
ingerir como alimento.
Se conoce desde hace tiempo que Agrobacterium
(Agrobacterium tumefaciens) es una bacteria de suelo que causa
la enfermedad del tumor del cuello en muchas plantas dicotiledóneas.
En los años 70, se observó que el plásmido Ti de
Agrobacterium está implicado en la patogenicidad y que el
ADN-T, que es parte del plásmido Ti, se integra en
el genoma de la planta. Más adelante se describió que el
ADN-T contenía los genes de síntesis de hormonas
(citoquininas y auxinas) necesarios para la oncogénesis del tumor de
cuello y que esos genes, aunque procedan de bacterias, se expresan
en plantas. Un grupo de genes que se localiza en la región de
virulencia (región Vir) del plásmido Ti se necesitan para la
escisión del ADN-T y su transferencia a plantas, y
además, las secuencias de borde que se localizan en extremos
opuestos del ADN-T se requieren para la escisión,
que se denominan la secuencia de borde derecho y la secuencia de
borde izquierdo. Agrobacterium rhizogenes, otra especie de
Agrobacterium, tiene un sistema similar que implica al
plásmido Ri.
Expresado más específicamente, las proteínas
producidas en base a los genes localizados en la región vir
(proteínas vir) reconocen las secuencias de borde derecho e
izquierdo para integrar el ADN-T localizado entre
las secuencias de borde en el genoma vegetal. Esta función
proporcionó las bases para la transformación de plantas con un gen
extraño pre-insertado en el ADN-T,
dando de este modo origen al desarrollo de la tecnología de
transformación de plantas mediada por Agrobacterium.
Sin embargo, más recientemente se han publicado
varios informes que describen que, en ciertos tipos de plantas,
algunas veces se observa que el ADN-T no se escinde
en las secuencias de borde y, por lo tanto, puede transferirse
ADN-T al cromosoma vegetal junto con una región
adyacente al ADN-T (Ramanathan et al., Plant
Molecular Biology 28, 1149-1154 (1995) y Kononov
et al., Plant Journal 11, 945-957 (1997)). Si
se co-transfiere un elemento de ADN distinto al
ADN-T, se sospechará que las plantas transgénicas
resultantes tienen características inesperadas, que podrían tener
un impacto negativo en la aceptación pública de productos
alimentarios producidos a partir de plantas transgénicas. El
documento WO 99/01563 A describe un vector de transformación de
plantas basado en la función de Agrobacterium en el que la
(única) secuencia de borde izquierdo se ha modificado (adición de
un gen que codifica un compuesto tóxico, modificación del contenido
de GC o adición de una secuencia de ADN que se une a proteínas de
unión a ADN (para disminuir la posibilidad de la integración de
cualquier ADN no T (mediante prevención de ultralectura). El vector
contiene adicionalmente una secuencia de borde derecho, una región
de ADN-T localizada entre las secuencias de borde y
un origen de replicación que permite la replicación en bacterias.
Se describen adicionalmente métodos para transformar plantas usando
dicho vector y plantas transformadas por ese método. Por lo tanto,
se desea desarrollar un método mediante el cual se pueda asegurar
que no se transferirán secuencias innecesarias de ADN no T de
Agrobacterium a cromosomas vegetales.
Los inventores supusieron que las proteínas
vir de Agrobacterium algunas veces no logran reconocer
las secuencias de borde y esto puede explicar la razón por la que
se transfiere ADN no T al cromosoma vegetal junto con
ADN-T. Aún no se han desarrollado vectores que
puedan suprimir o disminuir la transferencia de un segmento de ADN
no T con vistas a resolver dicho problema.
Basándose en la anterior suposición, los
inventores han realizado estudios intensos para crear vectores para
el uso en transformación mediada por Agrobacterium. Para
disminuir la probabilidad de que un elemento de ADN no T se
transfiera al cromosoma vegetal, los inventores modificaron el
vector con vistas a aumentar la eficacia de las proteínas
vir de Agrobacterium para reconocer la/s secuencia/s
de borde. Como resultado, se ha observado que aunque existen dos
secuencias de borde en el vector de transformación, se puede
disminuir la probabilidad de la integración de ADN no T
proporcionando una pluralidad de secuencias de borde izquierdo. La
presente invención se ha llevado a cabo en base a este
descubrimiento.
La presente invención proporciona un vector de
transformación de planta basado en la función de
Agrobacterium, en el que la secuencia de borde izquierdo se
ha modificado incluyendo más de una secuencia de borde izquierdo
para disminuir la posibilidad de la integración de cualquier
segmento de ADN no T en cromosomas vegetales. Más particularmente,
la invención proporciona un vector de transformación de planta que
comprende una secuencia de borde derecho y una región de borde
izquierdo que incluye más de una secuencia de borde izquierdo que
puede reconocerse por las proteínas vir de
Agrobacterium, una región de ADN-T localizada
entre estas secuencias de borde y en la que se puede insertar un
gen que se tiene que introducir en la planta y un origen de
replicación (ori) que permite la replicación de dicho vector
en bacterias (por ejemplo, Agrobacterium y bacterias para
amplificación de vector), en el que dicho vector disminuye la
posibilidad de integración de cualquier secuencia de ADN no T en
cromosomas vegetales.
La Figura 1 muestra el vector pSLB0 usado en el
Ejemplo; este vector se preparó a partir de pSB11 modificando el
mismo para tener dentro de la región de ADN-T un
casete, para expresar el gen de resistencia a higromicina bajo el
control de un promotor de ubiquitina y un intrón de ubiquitina,
insertando después un casete para expresar el gen GUS que contiene
un intrón de catalasa bajo el control de un promotor de ubiquitina,
en el sitio reconocible por la enzima de restricción StuI; y
La Figura 2 muestra mapas de las áreas de los
vectores pSLB0, pSLB2 y pSLB3 en proximidad de la secuencia de
borde izquierdo (que más adelante en este documento se denomina en
ocasiones LB). Para preparar pSLB2 y pSLB3 se insertó un fragmento
de ADN sintético que tiene dos o tres secuencias de borde izquierdo
en pSLB0 entre la LB y el casete de expresión de GUS en el sitio de
restricción de PvuII. En pSLB2 se insertaron dos secuencias de
borde izquierdo por el fragmento de ADN sintético (la/s secuencia/s
de borde izquierdo insertada/s se denomina más adelante en este
documento sLB) para dar un total de tres LB, y en pSLB3 se
insertaron tres sLB por el fragmento de ADN sintético para dar un
total de cuatro LB.
El vector de la invención tiene modificada la
secuencia de borde izquierdo para funcionar con el fin de disminuir
la posibilidad de la integración de una/s secuencia/s de ADN
innecesaria/s, es decir, una/s secuencia/s de ADN no T en los
cromosomas vegetales. La invención proporciona los vectores que
tienen modificada la secuencia de borde izquierdo para que
comprenda la colocación de más de una secuencia de ADN que se puede
reconocer por proteínas vir (por ejemplo, una secuencia de
borde izquierdo conocida).
Se pueden preparar fragmentos de ADN que
comprenden más de una secuencia de borde izquierdo por diversos
métodos conocidos en base a secuencias de borde conocidas. Por
ejemplo, se puede sintetizar una molécula de ADN monocatenaria que
tenga la misma secuencia que una secuencia de borde izquierdo que
está contenida en un plásmido Ti disponible, preparar la molécula
de ADN bicatenaria a partir de la cadena sencilla y, si es
necesario, enlazar dos o más de tales ADN bicatenarios entre sí. El
fragmento de ADN obtenido se puede insertar después en un vector de
transformación de planta en un sitio de restricción adecuado próximo
cadena arriba/abajo de la secuencia de borde izquierdo existente
localizada cadena abajo de la región de ADN-T. De
esta forma, el vector de la invención puede construirse
fácilmente.
El vector de transformación de planta a partir
del cual se puede preparar el vector de la invención modificando su
secuencia de borde izquierdo debe tener al menos una secuencia de
borde derecho e izquierdo que puedan reconocerse por proteínas
vir, una secuencia de ADN-T localizada entre
las secuencias de borde derecho e izquierdo y en la que puede
insertarse un gen que se tiene que introducir en la planta y un
origen de replicación que pueda funcionar en bacterias para la
replicación del vector (por ejemplo, Escherichia coli). El
vector de transformación de planta preferido tiene un origen de
replicación que puede funcionar en Agrobacterium.
Mientras que se satisfagan estos requerimientos,
pueden modificarse diversos vectores en la secuencia de borde
izquierdo. Por ejemplo, pueden modificarse los diversos vectores
usados en los siguientes métodos de transformación de planta
basados en Agrobacterium:
- (i)
- un vector de clonación intermedio pequeño que tiene secuencias de borde derecho e izquierdo y que tiene un gen extraño insertado en el ADN-T y un plásmido Ti aceptor que tiene la región vir se someten a recombinación homóloga para preparar un vector de plásmido Ti híbrido, y la planta se infecta con Agrobacterium que contiene el vector de plásmido Ti híbrido;
- (ii)
- se inserta un gen extraño en la región de ADN-T de un plásmido Ti pequeño que no tiene región vir (el plásmido se denomina comúnmente un mini plásmido o micro plásmido Ti y tiene capacidad de replicación en muchas bacterias) y el plásmido se introduce en Agrobacterium que alberga un plásmido que tiene la región vir pero no ADN-T y la planta se infecta con el Agrobacterium que contiene los dos plásmidos;
- (iii)
- un vector de clonación intermedio pequeño que tiene una secuencia de borde derecho e izquierdo y que tiene un gen extraño insertado en el ADN-T y un plásmido Ti aceptor que tiene una parte de la región vir (es decir, un gen vir que carece de una parte de la longitud completa de la región vir) se someten a recombinación homóloga para preparar un vector de plásmido Ti híbrido, el vector de plásmido Ti híbrido se introduce en Agrobacterium que tiene introducido en el mismo el plásmido que alberga la región vir (longitud completa) pero que carece de ADN-T y la planta se infecta con el Agrobacterium que contiene los dos plásmidos. Los diversos vectores usados en estos métodos pueden modificarse en la secuencia de borde izquierdo. Los plásmidos Ti pequeños con una modificación en la secuencia de borde izquierdo son fáciles de manipular en operaciones tales como para modificar el gen extraño en ADN-T y, por lo tanto, son una realización preferida del vector de la invención. Los ejemplos de tales plásmidos Ti pequeños incluyen pBI101 y pBI121 (estando ambos disponibles en CLONTECH), así como pSB11 que se usó en el Ejemplo que se describirá más adelante.
El concepto de la invención no sólo es aplicable
al plásmido Ti sino también al plásmido Ri.
El vector de la invención puede contener un gen
marcador en la secuencia de ADN-T que permite
selección del transformante, tal como un gen de resistencia a
antibióticos o un gen de luminiscencia. Para ser específicos,
pueden emplearse genes marcadores usados comúnmente de la manera
habitual y los mismos incluyen genes de resistencia a antibióticos,
tales como los que confieren resistencia a tetraciclina, ampicilina,
kanamicina, neomicina, higromicina y espectinomicina, y genes de
luminiscencia tales como el gen de luciferasa, genes de
\beta-galactosidasa, proteína verde fluorescente
(GFP), \beta-lactamasa y cloranfenicol acetil
transferasa (CAT). Además de estos genes, el vector puede contener
otro gen marcador fuera de la secuencia de ADN-T,
preferiblemente cadena abajo de las secuencias de borde izquierdo.
El gen marcador situado en esa posición es útil para evaluar la
eficacia de las secuencias de borde modificadas.
La expresión "origen de replicación" como
se usa en esta memoria descriptiva significa una región específica
de ADN en la que se inicia la reacción de replicación, denominada
comúnmente Ori.
Para usar el vector de la invención se inserta
un gen extraño para la transformación pretendida en la región de
ADN-T. El gen extraño que se tiene que insertar
contiene habitualmente un promotor que puede funcionar en la planta
hospedadora y el gen estructural que codifica la característica que
se tiene que conferir a la planta enlazado cadena abajo del
promotor. Si es necesario se pueden enlazar más de un gen entre sí
y, adicionalmente o alternativamente, se puede intercalar una
secuencia para mejorar la eficacia de expresión entre el promotor y
el gen estructural cadena abajo antes de la inserción en la región
de ADN-T.
Antes de introducirse en una planta diana, el
vector de la invención que alberga el gen extraño se introduce en
una bacteria de la especie Agrobacterium capaz de infectar la
planta (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens). Con
este propósito pueden emplearse diversos métodos bien conocidos por
el especialista en la técnica. Por ejemplo, el vector puede
transferirse al Agrobacterium por conjugación; si es posible,
el Agrobacterium puede transformarse directamente con el
vector de la invención que contiene el gen extraño.
Pueden emplearse técnicas convencionales para
infectar la planta con el Agrobacterium que contiene el
vector de la invención y las mismas incluyen, por ejemplo, abrir una
herida en parte del cuerpo de la planta e infectar ésta con la
bacteria, infectar el callo con la bacteria,
co-cultivar el protoplasto y la bacteria y
co-cultivar cortes del tejido foliar junto con la
bacteria. Las células transformadas obtenidas por estos métodos
pueden seleccionarse usando el/los marcador/es de selección
adecuado/s o ensayando si las mismas expresan la característica
pretendida. Las células transformadas pueden diferenciarse
adicionalmente por la tecnología de la técnica anterior para
producir un cuerpo de planta recombinante.
Para integrar ese ADN-T que
contiene el gen extraño en el ADN cromosómico en la planta, se
necesita la región vir. La región vir puede
suministrarse por el vector que tiene el gen extraño o por un vector
diferente.
Las células vegetales transformadas con el
vector de la invención pueden diferenciarse por la tecnología de la
técnica anterior para producir un cuerpo de planta recombinante. La
planta transformada puede seleccionarse usando un marcador de
selección adecuado o ensayando si la misma expresa la característica
pretendida.
Puede determinarse si una/s secuencia/s
innecesaria/s de ADN para la transformación pretendida se ha
integrado en los cromosomas vegetales o no por diversos métodos
bien conocidos por el especialista en la técnica. Por ejemplo, se
sintetizan cebadores oligonucleotídicos en base a la/s secuencia/s
de ADN del vector fuera de los bordes y con estos cebadores se
realiza PCR para analizar las secuencias de ADN cromosómico en la
planta transformada. En el caso de transformación con un vector que
contiene un gen marcador fuera de la secuencia de
ADN-T, se puede realizar el análisis ensayando si se
ha expresado el gen marcador.
El vector de la invención se caracteriza por su
función de disminuir la posibilidad de la integración de una/s
secuencia/s de ADN innecesaria/s para la transformación pretendida.
La expresión "disminuir la posibilidad de la integración"
significa que, en comparación con el uso de un vector que no está
modificado en la secuencia de borde izquierdo, la frecuencia de la
integración de la/s secuencia/s de ADN innecesaria/s en cromosomas
del hospedador es baja, o la longitud de la secuencia innecesaria
integrada es corta o no existe tal integración y; adicionalmente o
alternativamente, en comparación con el uso de un vector que no está
modificado en la secuencia de borde izquierdo, la frecuencia de
transformación involuntaria es baja, o la transformación
involuntaria es ligera o no existe tal transformación. La expresión
"secuencia de ADN innecesaria para la transformación
pretendida" significa una parte o un fragmento de la secuencia de
ADN localizada fuera de la secuencia de ADN-T en el
vector (concretamente, ADN no T). No importa si es funcional por sí
misma o codifica un polipéptido o una proteína.
Pueden transformarse diversas plantas por el
método transformante de la invención y las mismas incluyen plantas
monocotiledóneas tales como maíz, sorgo, triticale, cebada, avena,
centeno, trigo, cebolla y arroz y plantas dicotiledóneas tales como
soja, alfalfa, tabaco, colza, girasol, patata, pimienta y tomate. El
método de la invención puede disminuir la posibilidad de la
integración de una/s secuencia/s de ADN innecesaria/s para la
transformación pretendida en los cromosomas vegetales y las plantas
transgénicas obtenidas usando el método de transformación tienen
menos probabilidades de tener características inesperadas. Por lo
tanto, el método de la invención es adecuado para transformar
plantas que se pueden ingerir como alimento por otros organismos y
con respecto a las que existe una particular preocupación acerca de
la posibilidad de que la/s secuencia/s de ADN no T se transferirá/n
a cromosomas vegetales por transformación mediada por
Agrobacterium. El método es el más adecuado para transformar
plantas monocotiledóneas, en particular, arroz.
A menos que se indique de otra manera, la
expresión "planta o plantas" como se usa en la memoria
descriptiva no abarca sólo un cuerpo de planta (individual), sino
también su semilla (germinada o inmadura), parte (hoja, raíz,
tallo, flor, estambre, pistilo o cortes de los mismos), cultivo
celular, callo y protoplasto.
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Ejemplo
Ejemplo
1
El vector plasmídico pSB11 (Nº de Entrada de
Genbank AB027256, Komari et al., Plant Journal 10,
165-174 (1996)) se modificó para tener dentro de la
región de ADN-T un casete para la expresión del gen
de resistencia a higromicina (HPT) mediante un promotor de
ubiquitina y un intrón de ubiquitina (Christensen et al.,
Plant Molecular Biology 18, 675-689 (1992)) y en el
plásmido se insertó un casete para la expresión de un intrón de
catalasa que contenía un gen GUS (Ohta et al., Plant Cell
Physiology 31, 805-813 (1990)) mediante un promotor
de ubiquitina en el sitio reconocible por la enzima de restricción
StuI. El plásmido preparado de este modo se denominó pSLB0 (véase
la Fig. 1 y l SEC ID: Nº 1). La secuencia de nucleótidos de pSLB0 se
muestra como SEC ID: Nº 1.
Después, basándose en la secuencia de
nucleótidos del plásmido Ti pTiAch5 (Nº de Entrada de Genbank
K00548) se prepararon un ADN sintético que contenía un secuencia de
borde izquierdo (más adelante en este documento abreviada como LB)
y el ADN sintético complementario, se hibridaron y procesaron para
formar extremos romos y después se usaron para preparar fragmentos
de ADN que tenían respectivamente dos y tres secuencias LB. Las
secuencias de nucleótidos de los dos ADN sintéticos se muestran como
SEC ID: Nº 2 y SEC ID: Nº 3. Cada uno de los fragmentos de ADN se
insertó en pSLB0 entre LB y el casete de expresión de GUS en el
sitio reconocido por la enzima de restricción PvuII; de esta
manera, se prepararon vectores que tenían más de una LB unida. El
vector que tiene dos de las LB introducidas por el ADN sintético
(que se denomina en ocasiones en este documento sLB) para dar un
total de tres LB se denominó pSLB2 y el vector que tiene tres sLB
introducidas para dar un total de cuatro LB se denominó pSLB3 (para
los mapas de áreas de pSLB0, pSLB2 y pSLB3 en proximidad de las LB
sintéticas, véase la Fig. 2). Cada uno de estos tres plásmidos se
introdujo en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que ya tenía
introducido un vector plasmídico pSB1 (Nº de Entrada en Genbank
AB027255, Komari et al., Plant Journal 10,
165-174 (1996)). Estos se sometieron a los
siguientes ensayos.
Callos obtenidos del embrión inmaduro de la
variedad de arroz "Asanohikari" se transformaron con LBA4404
(pSLB0), LBA4404 (pSLB2) y LBA4404 (pSLB3) de acuerdo con el método
de Hiei et al. (Hiei et al., Plant Journal 6,
271-282 (1994)).
Algunas hojas de las plantas resistentes a
higromicina obtenidas en el Ejemplo 2 se tiñeron con
X-Gluc para comprobar la expresión del gen GUS.
Diecisiete de los 340 individuos vegetales transformados con LBA4404
(pSLB0) expresaron el gen GUS, indicando que el ADN obtenido de
Agrobacterium fuera de las secuencias de borde se había
introducido en el 5% de los individuos vegetales transformados con
el vector convencional que tiene sólo una LB. Por otra parte, el
número de individuos vegetales transformados con LBA4404 (pSLB2) y
LBA4404 (pSLB3) y que expresaron el gen GUS disminuyeron con el
número creciente de LB sintéticas (Tabla 1). Esto indica que la
integración de LB sintéticas en el vector disminuyó la probabilidad
de transferencia de ADN más allá de la secuencia de borde izquierdo
a la planta.
En algunos de los individuos que no expresaron
el gen GUS en (3), el ADN más allá de la secuencia de borde
izquierdo se puede haber introducido en cromosomas vegetales pero no
lo suficientemente lejos para que el promotor de ubiquitina
desencadene la expresión del gen GUS. Para verificar esta
posibilidad en cada grupo de plantas que no expresaron el gen GUS,
aproximadamente 60 transformantes independientes se eligieron
aleatoriamente y se extrajo ADN genómico y se sometió a análisis de
PCR. Los cebadores usados en el análisis de PCR se prepararon para
permitir la amplificación de la región que se extiende desde una
ubicación entre la LB intrínseca y la LB sintética hasta una
ubicación en el gen GUS. Las secuencias de los cebadores se muestran
como la SEC ID: Nº 4 y la SEC ID: Nº 5.
Como resultado de los análisis de PCR, siete de
los 67 individuos vegetales (el 10,4%) transformados con LBA4404
(pSLB0) mostraron amplificación de ADN, poniendo de manifiesto que
cuando se usó el vector convencional que tiene sólo una LB, se
integró ADN obtenido de Agrobacterium diferente al
ADN-T deseado en cromosomas en los transformantes
creados con una frecuencia del 10,4% o mayor. Por el contrario, se
observó que la amplificación de ADN no tuvo lugar en ninguno de los
individuos vegetales transformados con LBA4404 (pSLB2) y LBA4404
(pSLB3) que tenían LB sintéticas.
Los resultados se muestran en las Tablas 1 y
2.
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Como se puede observar a partir de lo anterior,
la presente invención disminuyó la integración de una/s secuencia/s
de ADN fuera de las secuencias de borde en cromosomas vegetales e
hizo posible aumentar la eficacia de introducir sólo el
ADN-T pretendido.
La anterior descripción de la invención se
refiere principalmente al uso de dos o más secuencias de borde
izquierdo, que pueden obtenerse de especies iguales o diferentes de
Agrobacterium. Sin embargo, debe subrayarse que el concepto
fundamental de la invención radica en la modificación de la
secuencia de borde izquierdo en vectores de transformación de
planta para que pueda reconocerse por proteínas vir más
eficazmente para disminuir la integración de cualquier secuencia de
ADN no T innecesaria en cromosomas vegetales. Por lo tanto, la
presente invención abarca todos los vectores que tienen la/s
secuencia/s de borde izquierdo modificada/s capaces de conseguir el
mismo resultado. Adicionalmente a los ejemplos que se han descrito
anteriormente, las secuencias de borde izquierdo modificadas
incluyen lo siguiente: (1) las secuencias que se obtienen a partir
de la secuencia ya existente en plásmidos pertinentes por deleción,
sustitución o adición de uno o más nucleótidos en la secuencia de
borde izquierdo existente para que se reconozca por proteínas
vir más eficazmente; (2) las secuencias que se obtienen a
partir de la secuencia ya existente en el plásmido por deleción,
sustitución o adición de una o más bases en cualquier secuencia
próxima a la secuencia de borde izquierdo existente para que se
reconozca por proteínas vir más eficazmente; (3) las
secuencias que contienen una pluralidad de cualquier secuencia que
puede reconocerse por proteínas vir; y (4) cualquier
combinación de (1) - (3).
<110> Japan Tabacco Inc.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vector de Transformación de
Plantas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> YCT-441
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12982
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencias LB son
1-25 y 55-70.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
Claims (6)
1. Un vector de transformación de plantas basado
en la función de Agrobacterium, en el que la región de borde
izquierdo comprende más de un borde izquierdo de plásmido Ti para
disminuir la posibilidad de la integración de cualquier segmento de
ADN no T en cromosomas vegetales.
2. Un vector de transformación de plantas que
comprende una secuencia de borde derecho que puede reconocerse por
las proteínas vir de Agrobacterium y una región de
borde izquierdo que comprende más de una secuencia de borde
izquierdo que pueden reconocerse por las proteínas vir de
Agrobacterium, una región de ADN-T
localizada entre estas secuencias de borde y en la que puede
insertarse un gen que se tiene que introducir en la planta y un
origen de replicación que posibilita la replicación de dicho vector
en bacterias, en el que dicho vector disminuye la posibilidad de
integración de cualquier segmento de ADN no T en cromosomas
vegetales.
3. El vector de transformación de plantas de
acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de
ADN-T contiene un gen marcador que permite la
selección del transformante.
4. El vector de transformación de plantas de
acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el que el origen de
replicación permite la replicación del vector en bacterias
incluyendo bacterias para amplificación de vector y
Agrobacterium.
5. Un vector de transformación de plantas basado
en la función de Agrobacterium, que comprende dos o tres
secuencias de borde izquierdo insertadas en una región de borde
izquierdo para disminuir la posibilidad de la integración de
cualquier segmento de ADN no T en cromosomas vegetales.
6. Un método para transformar plantas que
comprende usar una célula hospedadora de Agrobacterium que
contiene el vector de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
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|---|---|---|---|
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