ES2317929T3

ES2317929T3 - Atcr-1, una aciltransferasa humana y sus usos.

Info

Publication number: ES2317929T3
Application number: ES01964339T
Authority: ES
Inventors: Rosanna Kapeller-Libermann; Thomas Joseph Logan
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-08-21
Filing date: 2001-08-21
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2021-08-21
Also published as: WO2002016592A2; DE60136832D1; US20100009384A1; US20060121518A1; WO2002016592A3; ATE416253T1; EP1320591B1; AU2001285204A1; US7820403B2; US20030044948A1; EP1320591A2; US7410785B2; US7052888B2

Abstract

Método para identificar un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama, que comprende: a) poner en contacto una primera muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 ó 3. b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra que se hibrida con la sonda; c) poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 ó 3; d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra que se hibrida con la sonda; e) comparar el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra, en el que una disminución del nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama.

Description

ATCR-1, una aciltransferasa humana y sus usos.

Antecedentes de la invención

Las aciltransferasas comprenden una gran familia de enzimas que regulan los procesos biológicos al catalizar la transferencia de grupos acilo a una amplia variedad de sustratos biológicos y químicos, incluidas proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (E.C. Webb ed., Enzyme Nomenclature, págs. 178-201, \ccirculo1992 Academic Press, Inc. San Diego, CA).

La biosíntesis de los lípidos complejos implica reacciones de acilación específicas catalizadas por las aciltransferasas. Los lípidos son biomoléculas ubicuas que desempeñan un función decisiva en la estructura y metabolismo de las células. Por ejemplo, los triacilgliceroles son la principal forma de almacenamiento de la energía; el colesterol es un componente de las membranas celulares y un precursor de las hormonas esteroideas y de los ácidos biliares; los glucolípidos y los fosfolípidos son componentes principales de las membranas biológicas; y el araquidonato es un precursor de mediadores intercelulares pleiotrópicos, entre ellos, las prostaglandinas, las prostaciclinas, los tromboxanos y los leucotrienos.

La biosíntesis de novo de los glicerofosfolípidos, que incluyen los fosfolípidos y el triacilglicerol, implica la esterificación del glicerol-3-fosfato con un acil-CoA en la posición sn-1 mediante la glicerol-3-fosfato-aciltransferasa (GPAT) para formar 1-acilglicerol-3-fosfato (ácido lisofosfatídico). El ácido lisofosfatídico se esterifica luego en la posición sn-2 con un acil-CoA mediante la 1-acilglicerol-3-fosfato-aciltransferasa (AGPAT) para formar 1,2-diacilglicerol-3-fosfato (ácido fosfatídico). Finalmente, el ácido fosfatídico se puede convertir en fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol y cardiolipina mediante un CDP-diacilglicerol intermedio. Alternativamente, el ácido fosfatídico se puede desfosforilar para formar diacilglicerol, que se utiliza para la síntesis del triacilglicerol, así como los fosfolípidos, que incluyen la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina.

La glicerol-3-fosfato-aciltransferasa (GPAT) es la primera etapa ejecutada y, presuntamente, la limitante de la velocidad de la biosíntesis de los glicerofosfolípidos (Wilkison, W. O. y Bell, R. M. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1348:3-9; Dircks, L. y Sul H. S. (1999) Prog. Lipid Res. 38:461-479). Se han detectado dos isoformas de esta enzima en los mamíferos, una isoforma mitocondrial y otra del retículo endoplásmico, que se puede diferenciar mediante la diferente sensibilidad a la N-etilmaleimida (NEM). El tratamiento de la GPAT mitocondrial con agentes modificadores de argininas, fenilglioxal y ciclohexanodiona, inactivó la enzima (Dircks, L. et al.(1999) J. Biol. Chem. 274:34728-34). La expresión de la GPAT mitocondrial se encuentra bajo el control nutricional y hormonal en los tejidos lipógenos tales como el hígado y el tejido adiposo, puesto que está regulada durante la diferenciación de los adipocitos (Yet, S-F et al. (1993) Biochemistry 32:9486-91; Yet, S-F et al. (1995) Biochemistry 34:7303-10).

Las aciltransferasas también desempeñan una función importante en la reorganización de los ácidos grasos de los fosfolípidos, así como en el metabolismo de los lípidos bioactivos (Yamashita, A. et al. (1997) J. Biochem. 122:1-16). La reorganización de los ácidos grasos es clave para los procesos fisiológicos que incluyen la regulación de las propiedades fisicoquímicas de las membranas, por ejemplo, la fluidez de las membranas, y la regulación de la distribución y la acumulación de los ácidos grasos biológicamente activos, por ejemplo, ácido araquidónico. La bicapa fosfolipídica de las membranas biológicas sirve de barrera de permeabilidad para compartimentar funciones especializadas en la célula, e interviene en las funciones celulares tales como el transporte de iones y de metabolitos, el transporte de electrones y la transducción de señales. Además, la acilación de las proteínas celulares puede tener consecuencias funcionales importantes, tales como la modulación de la localización subcelular (por ejemplo, localización membranaria) y la señalización. Por lo tanto, las aciltransferasas contribuyen a la capacidad que tienen las células para crecer y diferenciarse, proliferar, adherirse y moverse, y para interaccionar y comunicarse con otras células.

Compendio de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos miembros de la familia de las aciltransferasas, denominados en la presente invención como moléculas de ácido nucleico y de proteína de la "aciltransferasa-1" o "ACTR-1". En particular, las moléculas de la aciltransferasa de la presente invención son moléculas de glicerol-3-fosfato-aciltransferasa y, en consecuencia, se pueden denominar intercambiablemente como proteína y moléculas proteicas GPAT. El ácido nucleico y las moléculas proteicas de ACTR-1 de la presente invención son útiles como agentes moduladores para regular numerosos procesos celulares, por ejemplo, el metabolismo celular (por ejemplo, el metabolismo energético o lipídico, en particular el metabolismo de los triglicéridos y/o fosfolípidos), la homeostasia energética, la transducción de señales inter- e intracelular y la proliferación, crecimiento, diferenciación y/o migración celulares. En consecuencia, en un aspecto, esta invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican proteínas ACTR-1 o porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de ácido nucleico
adecuados como cebadores o sondas de hibridación para detectar ácidos nucleicos que codifican la ACTR-1.

En una realización, la invención describe una molécula aislada de ácido nucleico que incluye la secuencia nucleotídica representada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3. En otra realización, la invención describe una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO:2.

Aún en otras realizaciones, la invención describe moléculas aisladas de ácido nucleico que incluyen secuencias nucleotídicas que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, idénticas al 60%) a la secuencia nucleotídica representada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3. La invención además describe moléculas de ácido nucleico que incluyen al menos 30 nucleótidos contiguos de la secuencia nucleotídica representada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3. En otra realización, la invención describe moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que incluye una secuencia aminoacídica que es esencialmente idéntica (por ejemplo, idéntica al 60%) a la secuencia aminoacídica representada en la SEQ ID NO:2. También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican variantes alélicas del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO:2. Además de las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos completos, la presente invención también describe moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos o antigénicos, de los polipéptidos de longitud completa de la presente invención (por ejemplo, fragmentos que incluyen al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2). En otras realizaciones más, la invención describe moléculas de ácido nucleico que son complementarias a las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria, antisentido a ellas o que se hibridan en condiciones rigurosas con las
mismas.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona vectores que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican la ACTR-1). Tales vectores pueden opcionalmente incluir secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos heterólogos. También se describen células hospedadoras que incluyen tales vectores (por ejemplo, células hospedadoras que incluyen vectores adecuados para producir moléculas de ácido nucleico y polipéptidos que contienen ACTR-1.

En otro aspecto, la invención describe polipéptidos de ACTR-1 aislados y/o fragmentos biológicamente activos o antigénicos de los mismos. Las realizaciones ejemplares describen un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos representada como la SEQ ID NO:2, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos al menos un 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos representada como la SEQ ID NO:2, un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia nucleotídica al menos un 60% idéntica a la secuencia nucleotídica representada como la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3. También se ofrecen fragmentos de polipéptidos de longitud completa descritos en la presente memoria (por ejemplo, fragmentos que incluyen al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia representada como la SEQ ID NO:2), así como las variantes alélicas del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos representada como la SEQ ID NO:2.

Los polipéptidos de ACTR-1 y/o los fragmentos biológicamente activos o antigénicos de los mismos son útiles, por ejemplo, como reactivos o dianas en los ensayos aplicables al tratamiento y/o diagnóstico de los trastornos de ACTR-1 o dependientes de ACTR-1. En una realización, un polipéptido de ACTR-1 o fragmento del mismo tiene una actividad ACTR-1. En otra realización, un polipéptido de ACTR-1 o fragmento del mismo tiene, al menos, uno o más de los dominios y/o motivos siguientes: un dominio aciltransferásico, un motivo catalítico de aciltransferasa, un motivo distintivo de aciltransferasa y un dominio transmembranario y, opcionalmente, tiene una actividad ACTR-1. En un aspecto relacionado, la invención describe anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a uno cualquiera de los polipéptidos, tal y como se describe en la presente memoria) así como polipéptidos de fusión que incluyen todo o un fragmento de un polipéptido descrito en la presente memoria.

La presente invención describe además métodos para detectar polipéptidos de ACTR-1 y/o moléculas de ácido nucleico de ACTR-1, ofreciendo tales métodos, por ejemplo, una sonda, cebador o anticuerpo descrito en la presente memoria. También se describen kits para detectar polipéptidos de ACTR-1 y/o moléculas de ácido nucleico de ACTR-1. En un aspecto relacionado, la invención ofrece métodos para identificar compuestos que se unen a y/o modulan la actividad de un polipéptido de ACTR-1 o una molécula de ácido nucleico de ACTR-1 descrito en la presente memoria. También se describen métodos para modular una actividad ACTR-1.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-C describe la secuencia nucleotídica del ADNc de la ACTR-1 humana y la correspondiente secuencia de aminoácidos. La secuencia nucleotídica corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 3003 de la SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos corresponde a los 828 aminoácidos de la SEQ ID NO:2. La región codificante sin las regiones 5' ó 3' sin traducir del gen de la ACTR-1 humana se muestra en la SEQ ID NO:3.

La Figura 2 describe un análisis estructural, de hidrofobia y de antigenicidad de la proteína ACTR-1 humana.

La Figura 3 describe los resultados de una búsqueda que se realizó en la base de datos HMM y que dio lugar a la identificación de un "dominio aciltransferásico" en la proteína ACTR-1 humana (SEQ ID NO:2).

La Figura 4A-G describe los resultados de una búsqueda que se realizó en la base de datos ProDom y que dio lugar al alineamiento local de la proteína ACTR-1 humana con las proteínas aciltransferásicas.

La Figura 5A-C describe un alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de la proteína ACTR-1 humana (SEQ ID NO:2) con las secuencias de aminoácidos de la glicerol-3-fosfato-aciltransferasa de ratón y rata (números de acceso de GenBank^{TM} AAA37647 y AAB71605, presentadas como la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:11, respectivamente). Se generó el alineamiento mediante el algoritmo Clustal que es parte del programa informático MegAlign^{TM}. Los parámetros para el alineamiento múltiple son los siguientes: Penalización por hueco (Gap Penalty) = 10; Penalización por la longitud del hueco (Gap Length Penalty) = 10. Los parámetros de alineamiento de dos en dos son los siguientes: K-tupla = 1; Penalización por hueco (Gap Penalty) = 3; Ventana = 5; Diagonales guardadas = 5; Tabla de ponderación por aminoácido = PAM250.

La Figura 6 describe un alineamiento de los restos de aminoácidos de diferentes motivos catalíticos y/o motivos distintivos acetiltransferásicos.

La Figura 7 es un gráfico que describe la expresión relativa de ACTR-1 en diferentes tejidos humanos determinada mediante análisis por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con TaqMan®.

La Figura 8 es un gráfico que describe la expresión relativa de ACTR-1 en distintos tejidos humanos determinada mediante el análisis por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con TaqMan®.

La Figura 9 es un gráfico que describe la expresión relativa de ACTR-1 en diferentes tejidos de hígado, de corazón y adiposo determinada mediante el análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con TaqMan®.

La Figura 10A es un gráfico que describe la regulación de la colestiramina sobre la expresión de ACTR-1 en un modelo animal de mono tití. La figura 10B es un gráfico que describe los resultados de una validación por transferencia en ranura de la regulación de ACTR-1 por la colestiramina en el modelo animal de mono tití.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos miembros de la familia de las aciltransferasas, denominados en la presente invención como moléculas de ácido nucleico y proteicas de la "aciltransferasa-1" o "ACTR-1". Basándose en su homología con las glicerol-3-fosfato-aciltransferasas de ratón y rata (véase, por ejemplo, la Figura 5), las proteínas ACTR-1 de la presente invención se pueden citar intercambiablemente como proteína y/o moléculas de ácido nucleico de GPAT. Estas moléculas son miembros nuevos de una familia de enzimas que son capaces de catalizar la transferencia de un grupo acilo a moléculas biológicas (por ejemplo, lípidos, polipéptidos) y, por lo tanto, desempeñar un papel o función en una serie de procesos metabólicos y celulares, por ejemplo, acilación de lípidos y proteínas, comunicación intra- o intercelular (por ejemplo, transducción de la señal), expresión génica, respuestas hormonales, respuestas inmunitarias, homeostasia energética (por ejemplo, el metabolismo de las moléculas bioquímicas necesarias para la producción o almacenamiento de la energía) y/o la proliferación, crecimiento, diferenciación, homeostasia o migración celulares. En particular, las moléculas de ACTR-1 de la invención son capaces de catalizar la transferencia de un acil-CoA a la posición sn-1 del glicerol-3-fosfato, es decir, durante la síntesis de triglicéridos. Por lo tanto, las moléculas de ACTR-1 de la presente invención proporcionan nuevas dianas diagnósticas y agentes terapéuticos para controlar los trastornos asociados a la ACTR-1 o asociados a la aciltransferasa y/o los trastornos asociados a los triglicéridos, tal y como se define en la presente memoria.

La terminología "familia", cuando se refiere a las proteínas y las moléculas de ácido nucleico de la invención, pretende significar dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural común o motivo y que tiene suficiente homología con la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos tal y como se define en la presente memoria. Tales miembros de familia se pueden producir de forma natural o no natural, y pueden ser de la misma o de diferentes especies. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano así como otras proteínas diferentes de origen humano o, alternativamente, puede contener homólogos de origen no humano, por ejemplo, proteínas de rata o de ratón. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.

Por ejemplo, la familia de proteínas de ACTR-1 de la presente invención comprende, al menos, un "dominio aciltransferásico". Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "dominio aciltransferásico" incluye un dominio proteico que tiene al menos unos 100 a 300 restos de aminoácidos y una puntuación de coincidencias de al menos 80 cuando se compara con un modelo oculto de Markov (HMM) de aciltransferasa, por ejemplo, n.º de acceso de Pfam PF01553. Preferiblemente, un dominio aciltransferásico incluye una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de unos 130 a 270, 160 a 240, 190 a 210 o, más preferiblemente, unos 198 restos de aminoácidos, y una puntuación de coincidencias de al menos 90, 100, 110, 120 o, más preferiblemente, 126. Para identificar la presencia de un dominio aciltransferásico en una proteína ACTR-1, y determinar que una proteína de interés tiene un perfil determinado, se interroga una base de datos de dominios proteicos conocidos (por ejemplo, la base de datos HMM) con la secuencia de aminoácidos de la proteína. Al dominio aciltransferásico (HMM) se le ha asignado el número de acceso PF01553 en PFAM (http://pfam.wustl.edu/). Se realizó una búsqueda en la base de datos HMM que dio lugar a la identificación de un dominio aciltransferásico en la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana en aproximadamente los restos 215 a 412 de la SEQ ID NO:2. Los resultados de la búsqueda se representan en la
Figura 3.

Preferiblemente, un "dominio aciltransferásico" tiene al menos unos 100 a 300 restos de aminoácidos y tiene una "actividad de dominio aciltransferásico", por ejemplo, la capacidad de interaccionar con una molécula de sustrato (por ejemplo, un lípido, proteína o ácido nucleico), de transferir un grupo acilo a un sustrato, de modular los mecanismos de señalización inter- y/o intracelulares, de modular el metabolismo celular (por ejemplo, el metabolismo lipídico) y/o de modular el crecimiento, diferenciación, homeostasia y/o migración celular. En una realización preferida, un dominio aciltransferásico cataliza la transferencia de un grupo acilo a un sustrato, por ejemplo, un sustrato seleccionado entre el grupo que consiste en: glicerol-3-fosfato, 1-acilglicerol-3-fosfato (ácido lisofosfatídico) y dihidroxiacetona-fosfato.

En consecuencia, identificar la presencia de un "dominio aciltransferásico" puede incluir aislar un fragmento de una molécula de ACTR-1 (por ejemplo, un polipéptido de ACTR-1) y analizar la capacidad del fragmento para mostrar una de las actividades del dominio aciltransferásico anteriormente mencionadas.

Se puede encontrar una descripción de la base de datos Pfam en Sonhammer et al. (1997) Proteins 28:405-420, y se puede encontrar una descripción detallada de los HMM en, por ejemplo, Gribskov et al.(1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314.

En otra realización, los miembros de la familia de proteínas de ACTR-1 incluyen, al menos, un "motivo catalítico de aciltransferasa" en la molécula proteica o la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula proteica. Las aciltransferasas comprenden varias regiones conservadas que contribuyen a la catálisis, denominadas en la presente memoria como "motivos catalíticos de aciltransferasa I, II y III". Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "motivo catalítico de aciltransferasa" incluye los patrones distintivos de los "motivos catalíticos de aciltransferasa I, II y III", tal y como se describe en la presente memoria.

El "motivo catalítico de aciltransferasa I" se caracteriza por unos restos de glicina y arginina conservados que se cree que son importantes para la actividad catalítica (Lewin, T. M. et al. (1999) Biochemistry 38:5764-71; Dircks, L. y Sul H. S. (1999) Prog. Lipid Res. 38: 461-479), y en una realización tiene el patrón distintivo siguiente:

F-[PLI]-E-G-[TG]-R-[SX]-[RX]: (SEQ ID NO:4)

ACTR-1 tiene tal patrón distintivo en torno a los restos de aminoácidos 313 a 320 de la SEQ ID NO:2.

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En otra realización, el motivo catalítico de aciltransferasa I tiene el patrón distintivo siguiente:

I-F-L-E-G-T-R: (SEQ ID NO:5)

ACTR-1 tiene tal patrón distintivo en torno a los aminoácidos 312 a 318 de la SEQ ID NO:2.

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El "motivo catalítico de aciltransferasa II" se caracteriza por restos de histidina y aspartato conservados que se cree que son importantes para la actividad catalítica (Lewin, T. M. et al. (1999) Biochemistry 38:5764-71; Dircks, L. y Sul H. S. (1999) Prog. Lipid Res. 38: 461-479), y en una realización tiene el patrón distintivo siguiente:

H-X(4)-D: (SEQ ID NO:6)

ACTR-1 tiene tal patrón distintivo en torno a los aminoácidos 230 a 235 de la SEQ ID NO:2 (H-R-S-H-I-D).

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En otra realización, el motivo II catalítico de aciltransferasa tiene el patrón distintivo siguiente:

H-[RQ]-S-X-[LYIM]-D: (SEQ ID NO:7)

ACTR-1 tiene tal patrón distintivo en torno a los aminoácidos 230 a 235 de la SEQ ID NO:2.

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El "motivo catalítico de aciltransferasa III" se caracteriza por un resto de prolina conservado que se cree que es importante para la actividad catalítica (Lewin, T. M. et al. (1999) Biochemistry 38:5764-71), y en una realización tiene el patrón distintivo siguiente:

[VI]-[PX]-[IVL]-[IV]-P-[VI]: (SEQ ID NO:8)

ACTR-1 tiene tal patrón distintivo en torno a los aminoácidos 347 a 352 de la SEQ ID NO:2.

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En otra realización, los miembros de la familia de proteínas de ACTR-1 incluyen, al menos, un "motivo distintivo de aciltransferasa" en la molécula proteica o la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula proteica. El "motivo distintivo de aciltransferasa" se caracteriza por unos restos de fenilalanina y arginina conservados que se cree que son importantes para la unión al sustrato (Lewin, T. M. et al. (1999) Biochemistry 38:5764-71; Heath, R. y Rock, C. O. (1999) J. Bacteriol. 181:1944-46), y en una realización tiene el patrón distintivo siguiente:

G-X-[IF]-F-I-[RD]-R: (SEQ ID NO:9)

ACTR-1 tiene tal patrón distintivo en torno a los aminoácidos 272 a 278 de la SEQ ID NO:2.

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Los patrones distintivos o los patrones de consenso descritos en la presente memoria se describen de acuerdo con la designación siguiente: todos los aminoácidos se indican según la designación universal con una única letra; "x" determina cualquier aminoácido; x(n) determina un número n de aminoácidos, por ejemplo, x(2) se refiere a 2 aminoácidos cualesquiera, por ejemplo, x(1-3) determina entre uno y tres aminoácidos cualesquiera; y los aminoácidos entre corchetes indican cualquiera de los aminoácidos dentro de los corchetes, por ejemplo, [RK] indica que puede ser R (arginina) o bien K (lisina).

En otra realización más, los miembros de la familia de proteínas ACTR-1 incluyen, al menos, un "dominio transmembranario" en la proteína o en la correspondiente molécula de ácido nucleico. Tal y como se emplea en la presente memoria, la terminología "dominio transmembranario" incluye una secuencia de aminoácidos de una longitud de unos 15 restos de aminoácidos que atraviesa la membrana plasmática. Más preferiblemente, un dominio transmembranario incluye al menos unos 20, 25, 30, 35, 40 ó 45 restos de aminoácidos y abarca la membrana plasmática. Los dominios transmembranarios son ricos en restos hidrófobos y típicamente tienen una estructura de hélice alfa. En una realización preferida, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembranario son hidrófobos, por ejemplo, leucinas, isoleucinas, tirosinas o triptófanos. Los dominios transmembranarios se describen en, por ejemplo, Zagotta, W. N. et al. (1996) Annual Rev. Neurosci. 19: 235-263. Se predice que los restos de aminoácidos 177 a 194, 330 a 354, 472 a 494 y 576 a 594 de la proteína ACTR-1 humana (SEQ ID NO:2) comprenden un dominio transmembranario.

Las proteínas aisladas de la presente invención, preferiblemente las proteínas de ACTR-1, tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o están codificadas por una secuencia nucleotídica suficientemente homóloga a la SEQ ID NO:1 ó 3. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "suficientemente homóloga" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número mínimo o suficiente de nucleótidos o restos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de tal forma que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos comparten dominios o motivos estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, en la presente memoria se definen como suficientemente homólogas las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes que tienen una homología o identidad de al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a lo largo de las secuencias de aminoácidos de los dominios y que contienen al menos uno y preferiblemente dos dominios o motivos estructurales. Además, en la presente memoria se definen como suficientemente homólogas las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos que comparten una homología o identidad de al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más y que comparten una actividad funcional común.

En una realización preferida, una proteína ACTR-1 incluye al menos uno o más de los dominios y/o motivos siguientes: un dominio aciltransferásico, un motivo catalítico de aciltransferasa, un motivo distintivo de aciltransferasa y un dominio transmembranario, y tiene una secuencia de aminoácidos con una homología o identidad de al menos aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2. En otra realización preferida más, una proteína ACTR-1 incluye al menos uno o más de los dominios y/o motivos siguientes: un dominio aciltransferásico, un motivo catalítico de aciltransferasa, un motivo distintivo de aciltransferasa y un dominio transmembranario, y está codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas a una molécula complementaria del ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3. En otra realización preferida, una proteína ACTR-1 incluye al menos uno o más de los dominios y/o motivos siguientes: un dominio aciltransferásico, un motivo catalítico de aciltransferasa, un motivo distintivo de aciltransferasa y un dominio transmembranario, y tiene una actividad de ACTR-1.

Tal y como se utiliza intercambiablemente en la presente memoria, una "actividad de ACTR-1", "actividad biológica de ACTR-1" o "actividad funcional de ACTR-1" incluye una actividad que una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de ACTR-1 ejerce o media en una célula que responde a ACTR-1 o un sustrato de ACTR-1, que se determina in vivo o in vitro de acuerdo con las técnicas estándares. En una realización, una actividad de ACTR-1 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de ACTR-1. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "molécula diana" o "asociado de unión" es una molécula con la que se une o interacciona una proteína ACTR-1 en la naturaleza, de tal forma que se consiga una función mediada por ACTR-1. Una molécula diana de ACTR-1 puede ser una molécula no ACTR-1 o una proteína o polipéptido de ACTR-1 de la presente invención. En una realización ejemplar, una molécula diana de ACTR-1 es un sustrato de ACTR-1 (por ejemplo, glicerol-3-fosfato y/o acil-CoA). Una actividad de ACTR-1 también puede ser una actividad indirecta, tal como una señalización celular o actividad metabólica mediada por la interacción de la proteína de ACTR-1 con un sustrato o ligando de ACTR-1.

En una realización preferida, una actividad de ACTR-1 es al menos una de las actividades siguientes: i) interacción con un sustrato o molécula diana de ACTR-1 (por ejemplo, que no sea una proteína ACTR-1, por ejemplo, un lípido); ii) conversión de un sustrato o molécula diana de ACTR-1 en un producto (por ejemplo, transferencia de un grupo acilo al sustrato o la molécula diana); iii) modulación de la biosíntesis y o el metabolismo de los lípidos (por ejemplo, fosfolípido y triacilglicerol); iv) modulación de la reorganización de los ácidos grasos de los fosfolípidos; v) modulación de la señalización intra- o intercelular y/o de la transcripción génica (por ejemplo, directa o indirectamente); vi) modulación de la proliferación, crecimiento, homeostasia, diferenciación y/o migración celular; vii) modulación de la homeostasia energética (por ejemplo, el metabolismo de las moléculas bioquímicas necesarias para la producción o el almacenamiento de energía); y viii) modulación del anabolismo y/o catabolismo de las biomoléculas metabólicamente importantes. En otra realización preferente, una actividad de ACTR-1 es una actividad glicerol-3-fostato-aciltransferásica.

La presente invención también proporciona métodos y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad cardiovascular o la alteración que afecta al corazón y los vasos sanguíneos mediante los cuales la sangre se bombea y se pone en circulación por el cuerpo. "Tratamiento", tal y como se utiliza en la presente memoria, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o la administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o estirpe celular de un paciente, el cual tiene una enfermedad o trastorno, un síntoma de enfermedad o trastorno o una predisposición hacia una enfermedad o trastorno, con el objetivo de curar, cicatrizar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, perfeccionar, mejorar o afectar a la enfermedad o trastorno, los síntomas de la enfermedad o el trastorno o la predisposición a una enfermedad o trastorno. Un agente terapéutico incluye, pero sin limitarse a ellos, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos antisentido descritos en la presente memoria. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "enfermedad cardiovascular" o "trastorno cardiovascular" incluye una enfermedad o trastorno que afecta al aparato cardiovascular, por ejemplo, el corazón o los vasos sanguíneos, por ejemplo, arterioesclerosis, en particular, aterosclerosis. También se proporcionan métodos y composiciones para el tratamiento de los trastornos del metabolismo de los triglicéridos y/o de los fosfolípidos, que incluyen, pero sin limitarse a ellas, la hipertrigliceridemia y la obesidad.

La presente invención da a conocer métodos para identificar la presencia de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de ACTR-1 asociada a un trastorno cardiovascular o a un trastorno de metabolismo de los triglicéridos. Además, la invención proporciona métodos para identificar un sujeto en riesgo de trastorno cardiovascular, o de un trastorno del metabolismo de los triglicéridos, al detectar la presencia de una molécula del ácido nucleico o polipéptido de ACTR-1.

La invención también proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno cardiovascular o trastorno de metabolismo de los triglicéridos, caracterizado por la expresión del ácido nucleico de ACTR-1 o de la actividad de la proteína ACTR-1 aberrantes, al analizar la capacidad del compuesto para modular la expresión de un ácido nucleico de ACTR-1 o la actividad de una proteína ACTR-1. Además, la invención da a conocer un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno cardiovascular o trastorno de metabolismo de los triglicéridos, caracterizado por la expresión aberrante del ácido nucleico de ACTR-1 o la actividad aberrante de la proteína ACTR-1, al administrar al sujeto un modulador de ACTR-1 que es capaz de modular la actividad de la proteína ACTR-1 o la expresión del ácido nucleico de ACTR-1.

En una realización preferida, las moléculas de ACTR-1 de la presente invención son útiles en los métodos para identificar moduladores o son útiles por sí mismas como composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad o trastorno que surge del mal funcionamiento de la regulación de la biosíntesis de los triacilgliceroles (triglicéridos) y de los fosfolípidos (por ejemplo, ateroesclerosis) ya que las moléculas de esta invención están muy relacionadas con (por ejemplo, son ortólogos de) la glicerol-3-fosfato-aciltransferasa mitocondrial (mGPAT) murina y de roedores, compartiendo estas proteínas una homología de secuencia de más del 90%. Existen dos formas principales de GPAT en los tejidos de los mamíferos: microsómica y mitocondrial (Bell, R. M., y Coleman, R. A. (1983) en The Enzymes (Boyer, P. D., ed) pág. 87-89, Academic Press, Nueva York). En el hígado, el 50% de la actividad de GPAT se encuentra en la fracción mitocondrial, mientras que en la mayor parte de los otros tejidos, la actividad de GPAT microsómica es de unas 10 veces la de la fracción mitocondrial (Schlossman, D. M., y Bell, R. M. (1976) J. Biol. Chem. 251, 5738-5744). Se ha demostrado que la GPAT, por lo general, desempeña una función fundamental en la regulación de la biosíntesis de los triacilgliceroles y de los fosfolípidos (Bell, R. M., y Coleman, R. A. supra). La concentración de triacilgliceroles está además implicada en la enfermedad cardiovascular, incluida pero sin limitarse a ella, la ateroesclerosis. Por ejemplo, el aumento de la concentración de triacilgliceroles es un factor de riesgo importante para padecer cardiopatía ateroesclerótica (Coleman R. A. et al. (2000) Annu Rev Nutr 20:77-103) y también está implicada en la hipertensión arterial (Orchard T. J. (2001) Diabetes Care 24:1053-9).

La secuencia nucleotídica de un ADNc de ACTR-1 humano aislado y la secuencia de aminoácidos predicha codificada por el ADNc de ACTR-1 se muestran en la Figura 1 y la SEQ ID NO:1 y 2, respectivamente.

El gen de la ACTR-1 humana, que tiene aproximadamente 3003 nucleótidos de longitud, codifica una proteína que tiene una masa molecular de aproximadamente 91 kDa y que tiene aproximadamente 828 restos de aminoácidos de longitud.

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Se describen diferentes aspectos de la invención con más detalle en los subapartados siguientes:

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas

Un aspecto de la invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas ACTR-1 o porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para ser utilizados como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican la ACTR-1 (por ejemplo, el ARNm de ACTR-1) y fragmentos para ser utilizados como cebadores de PCR para la amplificación o la mutación de moléculas de ácido nucleico de ACTR-1. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "molécula de ácido nucleico" pretende incluir las moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y las moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y los análogos del ADN o del ARN que se generan mediante análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

La terminología "molécula de ácido nucleico aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, la terminología "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el que el ADN genómico está asociado de forma natural. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está desprovisto de las secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (a saber, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se obtiene el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico de ACTR-1 aislada puede contener menos de unas 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias nucleotídicas que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se obtiene el ácido nucleico. Además, una molécula del ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3, o una porción de la misma, se puede aislar mediante las técnicas estándares de biología molecular y la información de la secuencia dada a conocer en la presente memoria. Utilizando toda o una parte de la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 ó 3 como sondas de hibridación, las moléculas de ácido nucleico de ACTR-1 se pueden aislar mediante técnicas de hibridación y clonación estándares (por ejemplo, tal y como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2.ª, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarque toda o parte de la SEQ ID NO:1 ó 3 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados sobre la secuencia de la SEQ ID NO:1 ó 3.

Se puede amplificar un ácido nucleico de la invención utilizando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico como molde y los cebadores oligonucleotídicos adecuados según las técnicas de amplificación por PCR estándares. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector adecuado y caracterizar mediante el análisis de la secuencia del ADN. Además, se pueden preparar los oligonucleótidos que corresponden a las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 mediante técnicas sintéticas estándares, por ejemplo, mediante un sintetizador de ADN automático.

En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3. Este ADNc puede comprender secuencias que codifican la proteína ACTR-1 humana (por ejemplo, la "región codificante", de los nucleótidos 341 a 2827), así como secuencias sin traducir en 5' (nucleótidos 1 a 340) y las secuencias sin traducir en 3' (nucleótidos 2828 a 3003) de la SEQ ID NO:1. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender sólo la región codificante de la SEQ ID NO:1 (por ejemplo, los nucleótidos 341 a 2827, que corresponden a la SEQ ID NO:3). Por consiguiente, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la SEQ ID NO:3 y los nucleótidos 1 a 340 de la SEQ ID NO:1. En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO:3 y los nucleótidos 2828 a 3003 de la SEQ ID NO:1. En otra realización, la molécula de ácido nucleico consiste en la secuencia nucleotídica representada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3.

En otra realización más, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3, o una porción de cualquiera de estas secuencias nucleotídicas. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3, de tal forma que pueda hibridarse a la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3, por lo que forma un dúplex estable.

En otra realización más, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una secuencia nucleotídica que es idéntica al menos en un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3 (por ejemplo, a la secuencia nucleotídica completa) o una porción o complemento de cualquiera de estas secuencias nucleotídicas. En una realización, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos (o no es más grande de) 50 a 100, 100 a 250, 250 a 500, 500 a 750, 750 a 1000, 1000 a 1250, 1250 a 1500, 1500 a 1750, 1750 a 2000, 2000 a 2250, 2250 a 2500, 2500 a 2750 o más nucleótidos de longitud y que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas a una molécula complementaria de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 ó 3.

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender sólo una porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 ó 3, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de una proteína ACTR-1, por ejemplo, una porción biológicamente activa de una proteína ACTR-1. La secuencia nucleotídica determinada a partir de la clonación del gen de ACTR-1 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para ser utilizados en la identificación y clonación de otros miembros de la familia de ACTR-1, así como homólogos de ACTR-1 de otras especies. La sonda/cebador (por ejemplo, oligonucleótido) por regla general comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido típicamente comprende una región de una secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones rigurosas a, al menos, unos 12 ó 15, preferiblemente unos 20 ó 25, más preferiblemente unos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia sentido de la SEQ ID NO:1 ó 3 de una secuencia antisentido de la SEQ ID NO:1 ó 3 o de una variante alélica natural o mutante de la SEQ ID NO:1 ó 3.

Sondas o cebadores ejemplares tienen, al menos (o no son más grandes de) 12 ó 15, 20 ó 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más nucleótidos de longitud y/o comprenden nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico aislada descrita en la presente memoria. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención sondas o cebadores que comprenden nucleótidos contiguos o consecutivos de una molécula de ácido nucleico aislada descrita en la presente memoria, pero con la diferencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 bases dentro de la secuencia de la sonda o del cebador. Las sondas basadas en las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 se pueden utilizar para detectar (por ejemplo, detectar específicamente) transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas. En las realizaciones preferentes, la sonda además comprende un grupo marcador unido a ésta, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. En otra realización, se dan a conocer un conjunto de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para utilizarlos en una PCR, que se puede utilizar para amplificar una región seleccionada de una secuencia de ACTR-1, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita en la presente memoria. Los cebadores deben tener al menos 5, 10 ó 50 pares de bases de longitud y menos de 100, o menos de 200 pares de bases de longitud. Los cebadores deben ser idénticos, o diferir en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 bases cuando se comparan con una secuencia descrita en la presente memoria o con la secuencia de una variante que se produce de forma natural. Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de prueba diagnóstica para identificar células o tejidos que expresan indebidamente una proteína ACTR-1, tal como al medir una cantidad de un ácido nucleico que codifica una ACTR-1 en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectar los niveles de ARNm de ACTR-1 o determinar si se ha mutado o eliminado del genoma un gen de ACTR-1.

Se puede preparar un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de una proteína ACTR-1" mediante el aislamiento de una porción de la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de ACTR-1 (las actividades biológicas de las proteínas ACTR-1 se describen en la presente memoria), la expresión de la porción codificada de la proteína ACTR-1 (por ejemplo, mediante la expresión recombinante in vitro) y la evaluación de la actividad de la porción codificada de la proteína ACTR-1. En una realización ejemplar, la molécula de ácido nucleico tiene al menos 50 a 100, 100 a 250, 250 a 500, 500 a 700, 750 a 1000, 1000 a 1250, 1250 a 1500, 1500 a 1750, 1750 a 2000, 2000 a 2250, 2250 a 2500, 2500 a 2750 o más nucleótidos de longitud y que codifica una proteína que tiene una actividad de ACTR-1 (tal y como se describe en la presente memoria).

La invención abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3 debido a la degeneración del código genético y, por lo tanto, que codifican las mismas proteínas ACTR-1 que las codificadas por la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO:1 ó 3.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 en al menos 1, pero no más de, 5, 10, 20, 50 ó 100 restos de aminoácidos. En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana. Si se necesita un alineamiento para esta comparación, se deben alinear las secuencias para proporcionar la homología máxima.

Las variantes del ácido nucleico se pueden producir de forma natural, tales como las variantes alélicas (mismo locus), los homólogos (diferente locus) y los ortólogos (diferente organismo) o se pueden producir de forma no natural. Se pueden fabricar variantes que no se producen de forma natural mediante técnicas de mutagénesis, incluidas las que se aplican a los polinucleótidos, las células o los organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. Se puede producir variación en la región codificante, o en la no codificante, o en ambas. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácidos tanto conservativas como no conservativas (cuando se compara con el producto codificado).

Las variantes alélicas son resultado de, por ejemplo, los polimorfismos de secuencia del ADN dentro de una población (por ejemplo, la población humana) que conllevan cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas ACTR-1. Puede existir tal polimorfismo genético en los genes de la ACTR-1 entre los individuos de una población debido a la variación alélica natural. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína ACTR-1, preferiblemente un proteína ACTR-1 de mamíferos, y además puede incluir secuencias reguladoras no codificantes e intrones.

En consecuencia, en una realización, la invención ofrece moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una variante alélica que se produce de forma natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en la que la molécula de ácido nucleico se hibrida a una molécula complementaria de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:1 ó 3, por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas.

Las variantes alélicas de ACTR-1, por ejemplo ACTR-1 humana, incluyen proteínas de ACTR-1 tanto funcionales como no funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes que se producen de forma natural a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína ACTR-1 que mantienen la capacidad de unirse a un ligando o sustrato de ACTR-1, transferir un grupo acilo a un sustrato de ACTR-1 y/o modular el metabolismo de moléculas bioquímicas, la transducción de señales y/o los mecanismos de proliferación, crecimiento y/o diferenciación. Las variantes alélicas funcionales por regla general contendrán sólo la sustitución conservativa de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o la sustitución, deleción o inserción de restos que no son decisivos en regiones de la proteína que tampoco son decisivas.

Las variantes alélicas no funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína de ACTR-1 que se producen de forma natural, por ejemplo, la ACTR-1 humana, que carecen de la capacidad de unirse o interaccionar con un ligando o sustrato de ACTR-1, transferir un grupo acilo a un sustrato de ACTR-1 y/o modular alguna de las actividades de ACTR-1 descritas en la presente memoria. Las variantes alélicas no funcionales contendrán típicamente una sustitución, deleción, o inserción no conservativas, o el truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o una sustitución, inserción, o deleción de restos decisivos o regiones decisivas de la proteína.

La presente invención además da a conocer ortólogos no humanos (por ejemplo, ortólogos no humanos de la proteína ACTR-1 humana). Los ortólogos de la proteína de ACTR-1 humana son proteínas que se aíslan de organismos no humanos y que poseen los mismos mecanismos de unión al sustrato o ligando de ACTR-1, actividad aciltransferásica, y/o modulación de las propiedades de proliferación, diferenciación, señalización, homeostasia y/o metabolismo de la proteína ACTR-1 humana. Los ortólogos de la proteína ACTR-1 humana se pueden identificar fácilmente ya que comprenden una secuencia de aminoácidos que es esencialmente homóloga a la SEQ ID NO:2.

Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de ACTR-1 y, por lo tanto, que tienen una secuencia nucleotídica que difiere de las secuencias de ACTR-1 de la SEQ ID NO:1 ó 3 se pretende que estén dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se puede identificar otro ADNc de ACTR-1 a partir de la secuencia nucleotídica de la ACTR-1 humana. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas ACTR-1 de diferentes especies y, por lo tanto, que tienen una secuencia nucleotídica que difiere de las secuencias de ACTR-1 de la SEQ ID NO:1 ó 3, se pretende que estén dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se puede identificar un ADNc de ACTR-1 de ratón o de mono a partir de la secuencia nucleotídica de una ACTR-1 humana.

Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales y homólogos de los ADNc de ACTR-1 de la invención se pueden aislar basándose en su homología con los ácidos nucleicos de ACTR-1 descritos en la presente memoria mediante los ADNc descritos en la presente memoria, o una porción de los mismos, como una sonda de hibridación de acuerdo con las técnicas de hibridación estándares en condiciones de hibridación rigurosas. Se pueden aislar además moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales y homólogos de los ADNc de ACTR-1 de la invención al cartografiarlos en el mismo cromosoma o locus que el gen de ACTR-1.

Se pueden identificar ortólogos, homólogos y variantes alélicas mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, mediante hibridación a una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención, por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas). En una realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención tiene, al menos, 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3. En otra realización, el ácido nucleico tiene, al menos, 50 a 100, 100 a 250, 250 a 500, 500 a 750, 750 a 1000, 1000 a 1250, 1250 a 1500, 1500 a 1750, 1750 a 2000, 2000 a 2250, 2250 a 2500, 2500 a 2750, 2750 o más nucleótidos de longitud.

Tal y como se utiliza en de la presente memoria, la terminología "se hibrida en condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridación y el lavado en las que las secuencias nucleotídicas que son significativamente idénticas u homólogas una a otra permanecen hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son de tal forma que las secuencias son idénticas, al menos, en un 70%, más preferiblemente al menos en un 80%, incluso más preferiblemente al menos en un 85% o 90% la una a la otra permanecen hibridadas entre sí. Los expertos en la técnica conocen tales condiciones rigurosas y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), apartados 2, 4 y 6. Se pueden encontrar más condiciones rigurosas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), capítulos 7, 9 y 11. Un ejemplo preferente y no limitante de condiciones de hibridación rigurosas incluye la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio a 4X (SSC), a unos 60 a 70ºC (o alternativamente hibridación en SSC a 4X más formamida al 50% a unos 42 a 50ºC) seguidos de uno o más lavados en SSC a 1X, a unos 65 a 70ºC. Un ejemplo preferente y no limitante de condiciones de hibridación muy rigurosas incluye la hibridación en SSC a 1X, a unos 65 a 70ºC (o alternativamente hibridación en SSC a 1X más formamida al 50% a unos 42 a 50ºC) seguidos de uno o más lavados en SSC a 0,3X, a unos 65 a 70ºC. Un ejemplo preferente y no limitante de condiciones de hibridación poco rigurosas incluye la hibridación en SSC a 4X, a unos 50 a 60ºC (o, alternativamente, hibridación en SSC a 6X más formamida al 50% a unos 40 a 45ºC) seguidos de uno o más lavados en SSC a 2X, a unos 50 a 60ºC. Los intervalos intermedios de los valores citados anteriormente, por ejemplo, a 65ºC a 70ºC o a 42ºC a 50ºC también pretenden estar incluidos en la presente invención. El SSPE (SSPE 1X es NaCl a 0,15 M, NaH_{2}PO_{4} a 10 mM y EDTA a 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir al SSC (SSC 1X es NaCl a 0,15 M y citrato de sodio a 15 mM) en los tampones de hibridación y de lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos cada uno tras los cuales se completa la hibridación. La temperatura de hibridación para los híbridos que se preveían que tenían menos de 50 pares de bases de longitud deben ser de 5 a 10ºC menos que la temperatura de fusión (T_{f}) del híbrido, en el que la T_{f} se determina según las ecuaciones que siguen. Para híbridos de menos de 18 pares de base de longitud, T_{f}(ºC) = 2(n.º de bases A + T) + 4(n.º de bases G + C). Para los híbridos entre 18 y 49 pares de bases, T_{f}(ºC) = 81,5 + 16,6(log_{10}[Na+]) + 0,41(% G+C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na^{+}] es la concentración de los iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na^{+}] para el SSC 1X = 0,165 M). Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden añadir otros reactivos a los tampones de hibridación y/o lavado para disminuir la hibridación inespecífica de las moléculas de ácido nucleico a las membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o de nilón, que incluyen, pero sin limitare a ellos, bloqueantes (por ejemplo, SAB o ADN de arrastre de salmón o del esperma de arenque), detergentes (por ejemplo, SDS), quelantes (por ejemplo, EDTA), Ficoll, PVP y similares. Cuando se utilizan membranas de nilón en particular, un ejemplo adicional y no limitante preferente de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en NaH_{2}PO_{4} entre 0,25 y 0,5 M, SDS al 7%, a unos 65ºC, seguidos de uno o más lavados con NaH_{2}PO_{4} a 0,02 M, SDS al 1% a 65ºC (véase por ejemplo, Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995) o, alternativamente, SSC a 0,2 X y SDS al 1%.

Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de la SEQ ID NO:1 ó 3 corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce de forma natural. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico "que se produce de forma natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia nucleotídica que aparece en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

Además de las variantes alélicas que se producen de forma natural de las secuencias de ACTR-1 que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará además que se pueden introducir cambios mediante mutación en las secuencias nucleotídicas de la SEQ ID NO:1 ó 3, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas ACTR-1 codificadas, sin alterar la capacidad funcional de las proteínas ACTR-1. Por ejemplo, en la secuencia de la SEQ ID NO:1 ó 3 se pueden realizar sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos "no esenciales". Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar de la secuencia de tipo salvaje de ACTR-1 (por ejemplo, la secuencia de la SEQ ID NO:2) sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un resto de aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Por ejemplo, restos de aminoácidos que están conservados entre las proteínas ACTR-1 de la presente invención, por ejemplo, los presentes en un dominio aciltransferásico, un motivo catalítico de aciltransferasa, o un motivo distintivo de aciltransferasa, se predice que no se prestan particularmente a la alteración. Además, probablemente no se presten a la alteración otros restos de aminoácidos que se conservan entre las proteínas ACTR-1 de la presente invención y otros miembros de la familia de las aciltransferasas (Lewin, T. M. et al., supra).

En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas ACTR-1 que contienen cambios en los restos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Tales proteínas ACTR-1 difieren en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.º 2, aunque conservan la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos homóloga en al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la SEQ ID NO:2, por ejemplo, con la longitud completa de la SEQ ID NO:2.

Se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína ACTR-1 homóloga a la proteína de la SEQ ID NO:2 al introducir sustituciones, adiciones o deleciones de uno o más nucleótidos en la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3, de tal forma que en la proteína codificada se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir mutaciones en la SEQ ID NO:1 ó 3 mediante técnicas estándares, tales como la mutagénesis específica de sitio y la mutagénesis por PCR. Preferiblemente, se realizan sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más restos de aminoácidos que se predijo que no son esenciales. Una "sustitución conservativa de aminoácido" es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales \beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un resto de aminoácido que se predice que no es esencial en una proteína ACTR-1 se reemplaza preferiblemente con otro resto de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante de ACTR-1, tal como mediante la mutagénesis de saturación, y se pueden cribar los mutantes resultantes por la actividad biológica de ACTR-1 para identificar los mutantes que conservan la actividad. Después de la mutagénesis de la SEQ ID NO:1 ó 3, la proteína codificada se puede expresar de manera recombinante y se puede determinar la actividad de la proteína.

En una realización preferente, se puede ensayar una proteína ACTR-1 mutante por su capacidad para: i) interaccionar con un sustrato o molécula diana de ACTR-1 (por ejemplo, algo que no sea una proteína ACTR-1, por ejemplo, un lípido); ii) convertir un sustrato o molécula diana de ACTR-1 en un producto (por ejemplo, transferencia de un grupo acilo al sustrato o la molécula diana); iii) modular la biosíntesis y/o metabolismo de los lípidos; iv) modular la reorganización de los ácidos grasos de los fosfolípidos; v) modular la señalización intra- o intercelular y/o la transcripción génica (por ejemplo, directa o indirectamente); vi) modular la proliferación, crecimiento, homeostasia, diferenciación y/o migración celular; vii) modular la homeostasia energética (por ejemplo, el metabolismo de las moléculas bioquímicas necesarias para la producción o el almacenamiento de energía); y viii) modular el anabolismo y/o catabolismo de las biomoléculas metabólicamente importantes.

Además de las proteínas ACTR-1 codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido a éstas. En una realización ejemplar, la invención da a conocer una molécula de ácido nucleico aislada que es el antisentido de una molécula de ácido nucleico de ACTR-1 (por ejemplo, es el antisentido de la hebra codificante de una molécula de ácido nucleico de ACTR-1). Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia nucleotídica que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de ARNm. En consecuencia, el ácido nucleico antisentido se puede unir mediante puentes de hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante completa de ACTR-1, o sólo a una porción de ésta. En una realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a "secuencias de la región codificante" de la hebra codificante de una secuencia nucleotídica que codifica una ACTR-1. La terminología "secuencias de la región codificante" se refiere a la región de la secuencia nucleotídica que comprende codones que se traducen en restos de aminoácidos (por ejemplo, las secuencias de la región codificante de la ACTR-1 humana que corresponde a la SEQ ID NO:3). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificante" de la hebra codificante de una secuencia nucleotídica que codifica una ACTR-1. La terminología "región no codificante" se refiere a secuencias en 5' y/o 3' que flanquean las secuencias de la región codificante y que no se traducen en aminoácidos (también se denominan regiones sin traducir en 5' y 3').

Dadas las secuencias de la cadena codificante que codifican una ACTR-1 descritas en la presente memoria (por ejemplo, la SEQ ID NO:3), los ácidos nucleicos antisentido de la invención se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Waston y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a las secuencias de la región codificante del ARNm de ACTR-1, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido sólo a una porción del ARNm de ACTR-1. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, unos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o más nucleótidos de longitud. Se puede construir un ácido nucleico antisentido de la invención mediante síntesis química y reacciones enzimáticas de ligación con procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente mediante los nucleótidos que se producen de forma natural o nucleótidos modificados de muy distintas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido; por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos con sustituciones de acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N^{6}-isopententiladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N^{6}-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N^{6}-isopentiladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, se puede producir biológicamente el ácido nucleico antisentido utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado el ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico introducido tendrá la orientación antisentido a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en el subapartado siguiente).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención normalmente se administran a un sujeto o se generan in situ de tal forma que se hibriden, o se unan, al ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína ACTR-1 de forma que inhiben la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación se puede realizar mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, mediante interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice. Un ejemplo de una vía de administración de moléculas de ácidos nucleicos antisentido de la invención incluye la inyección directa en un tejido. Alternativamente, se pueden modificar moléculas de ácido nucleico antisentido para que actúen selectivamente sobre determinadas células y administrarlas sistémicamente después. Por ejemplo, para la administración sistémica, se pueden modificar las moléculas antisentido de tal forma que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular determinada, por ejemplo, uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. También se pueden dirigir las moléculas de ácido nucleico antisentido a las células mediante los vectores descritos en la presente memoria. Para conseguir suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte de pol II o pol III.

En otra realización más, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula \alpha-anomérica de ácido nucleico. Una molécula \alpha-anomérica de ácido nucleico forma híbridos bicatenarios específicos con el ARN complementario en los que, a diferencia de unidades \beta usuales, las hebras circulan en paralelo (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-O-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett.215:327-330).

En otra realización más, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el que tienen una región complementaria. Por lo tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas en cabeza de martillo [descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591]) se pueden utilizar para escindir catalíticamente los ARNm transcritos de ACTR-1, por lo que inhiben la traducción del ARNm de ACTR-1. Se puede diseñar una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica una ACTR-1 basándose en la secuencia nucleotídica de un ADNc de ACTR-1 descrito en la presente memoria (es decir, SEQ ID NO:1 ó 3). Por ejemplo, se puede construir un derivado del ARN L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia nucleotídica del sitio activo es complementaria a la secuencia a escindir en un ARNm que codifica una ACTR-1. Véase, por ejemplo, Cech et al. Patente de EE.UU. n.º 4.987.071; y Cech et al. Patente de EE.UU. n.º 5.116.742. Alternativamente, se puede utilizar un ARNm de ACTR-1 para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleásica específica de un conjunto de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:
1411-1418.

Alternativamente, se puede inhibir la expresión génica de ACTR-1 al actuar selectivamente sobre secuencias nucleotídicas complementarias a la región reguladora de ACTR-1 (por ejemplo, promotor y/o potenciadores de ACTR-1; por ejemplo, los nucleótidos 1 a 340 de la SEQ ID NO:1) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen de ACTR-1 en las células diana. Véase, a grandes rasgos, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992). Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L. J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.

En otra realización, se pueden modificar las moléculas de ácido nucleico de ACTR-1 de la presente invención en el grupo de la base, en el resto de azúcar o en el esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, se puede modificar el esqueleto de fosfatos y desoxirribosas de las moléculas de ácido nucleico para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase, Hyrup, B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23). Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" se refieren a imitaciones de ácidos nucleicos, por ejemplo, imitaciones de ADN, en las que el esqueleto de fosfatos y desoxirribosas se reemplaza por un esqueleto pseudopeptídico y sólo se conservan las cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que el esqueleto neutro de los PNA permite la hibridación específica al ADN y al ARN en condiciones de fuerza iónica baja. Se puede realizar la síntesis de oligómeros PNA utilizando protocolos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida tal y como se describe en Hyrup, B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675.

Se pueden utilizar PNA de moléculas de ácido nucleico de ACTR-1 en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Por ejemplo, se pueden utilizar los PNA como agentes antisentido o antígenos para la modulación específica de la secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la parada de la transcripción o de la traducción o inhibiendo la replicación. También se pueden utilizar los PNA de las moléculas de ácido nucleico de ACTR-1 en el análisis de mutaciones de un único par de bases en un gen, (por ejemplo, mediante pinzamiento por PCR dirigida por PNA); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se utilizan en combinación con otras enzimas (por ejemplo, nucleasas S1 [Hyrup, B. et al. (1996) supra]); o como sondas o cebadores para la secuenciación o hibridación del ADN (Hyrup, B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) supra).

En otra realización, se pueden modificar los PNA de ACTR-1 (por ejemplo, para mejorar su estabilidad o captación celular), al adherirle grupos lipófilos u otros grupos cooperadores al PNA, mediante la formación de quimeras de PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de administración del fármaco conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar quimeras de PNA-ADN de moléculas de ácido nucleico de ACTR-1 que pueden combinar las propiedades ventajosas del PNA y el ADN. Tales quimeras permiten que las enzimas que reconocen el ADN (por ejemplo, ARNasa H y ADN polimerasas) interaccionen con la porción de ADN mientras que la porción de PNA proporcionaría unas afinidad de unión y especificidad elevadas. Las quimeras de PNA-ADN se pueden unir mediante conectores de longitudes adecuadas seleccionados en términos de apilamiento de las bases, número de enlaces entre las nucleobases, y orientación (Hyrup, B. et al. (1996) supra). Se puede realizar la síntesis de las quimeras PNA-ADN tal y como se describe en Hyrup, B. et al. (1996) supra y Finn, P. J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63. Por ejemplo, se puede sintetizar una cadena de ADN sobre un soporte sólido mediante la química estándar de acoplamiento con fosforamidita y análogos de nucleósidos modificados, por ejemplo, la fosforamidita de 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxitimidina se puede utilizar como una conexión entre el PNA y el extremo 5' del ADN. (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acid Res 17:5973-88). Luego se acoplan los monómeros de PNA de forma escalonada para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA en 5' y un segmento de ADN en 3' (Finn, P. J. et al. (1996) supra). Alternativamente, se pueden sintetizar moléculas quiméricas con un segmento de ADN en 5' y un segmento de PNA en 3' (Peterser, K. H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).

En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos anexionados tales como péptidos (por ejemplo, para actuar selectivamente sobre los receptores de las células hospedadoras in vivo) o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; la publicación PCT n.º WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT n.º WO 89/10134). Además, se pueden modificar los oligonucleótidos con agentes de escisión que se desencadenan con la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al.(1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, se puede conjugar el oligonucleótido con otra molécula (por ejemplo, un péptido, agente de entrecruzamiento activado con la hibridación, transportador, o agente de escisión activado con la hibridación).

II. Proteínas ACTR-1 aisladas y anticuerpos anti-ACTR-1

Un aspecto de la invención se refiere a proteínas y polipéptidos de ACTR-1 aislados o recombinantes y porciones biológicamente activas de los mismos, así como fragmentos polipeptídicos adecuados para utilizarlos como inmunógenos para generar anticuerpos anti-ACTR-1. En una realización, se pueden aislar proteínas nativas de ACTR-1 de origen celular o tisular mediante un esquema de purificación adecuado mediante técnicas estándares de purificación de proteínas. En otra realización, se producen proteínas de ACTR-1 mediante técnicas de ADN recombinante. De forma alternativa a la expresión recombinante, se puede sintetizar químicamente una proteína o polipéptido de ACTR-1 mediante técnicas estándares de síntesis de péptidos.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está esencialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva la proteína ACTR-1, o esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La terminología "esencialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína ACTR-1 en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de la que se aísla o se produce por recombinación. En una realización, la terminología "esencialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína ACTR-1 que tienen menos de aproximadamente el 30% (por peso seco) de proteínas diferentes a la ACTR-1 (que también se denominan en la presente memoria una "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente el 20% de proteínas diferentes a la ACTR-1, aún más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% de proteínas diferentes a la ACTR-1 y, lo más preferiblemente, menos de aproximadamente el 5% de proteínas diferentes a la ACTR-1. Cuando la proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma se produce por recombinación, también es preferible que esté sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de la proteína.

La terminología "esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de la proteína ACTR-1 en la que la proteína se separa de los precursores químicos u otros productos químicos de la síntesis de la proteína. En una realización, la terminología "esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de la proteína ACTR-1 que tienen menos de aproximadamente el 30% (por peso seco) de precursores químicos o de productos químicos que no son ACTR-1, más preferiblemente menos de aproximadamente el 20% de precursores químicos o de productos químicos que no son ACTR-1, aún más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% de precursores químicos o de productos químicos que no son ACTR-1 y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% de precursores químicos o de productos químicos que no son ACTR-1.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "porción biológicamente activa" de una proteína ACTR-1 incluye un fragmento de una proteína ACTR-1 que participa en una interacción entre una molécula de ACTR-1 y una molécula diferente a ACTR-1 (por ejemplo, un sustrato de ACTR-1). Porciones biológicamente activas de una proteína ACTR-1 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a las secuencias de aminoácidos de la ACTR-1, o derivadas de ellas, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO:2, que incluyen suficientes restos de aminoácidos que muestran al menos una actividad de una proteína ACTR-1. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína ACTR-1, por ejemplo, actividad aciltransferásica, modulación del metabolismo celular (por ejemplo, metabolismo lipídico), modulación de la señalización intra- o intercelular, y/o mecanismos de modulación de crecimiento, homeostasia, proliferación, migración y/o diferenciación celulares. Una porción biológicamente activa de una proteína ACTR-1 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 198, 200, 250, 300 o más aminoácidos de longitud. Se pueden utilizar porciones biológicamente activas de una proteína ACTR-1 como dianas para desarrollar agentes que modulen una actividad mediada por la ACTR-1, por ejemplo, actividad aciltransferásica, modulación del metabolismo celular (por ejemplo, metabolismo lipídico), modulación de la señalización intra- o intercelular, y/o mecanismos de modulación de crecimiento, homeostasia, proliferación, migración y/o de diferenciación celular.

En una realización, una porción biológicamente activa de una proteína ACTR-1 incluye al menos uno o más de los dominós y/o motivos siguientes: un dominio aciltransferásico, un motivo catalítico de aciltransferasa, un motivo distintivo de aciltransferasa y un dominio transmembranario. Además, otras porciones biológicamente activas, en las que se eliminan otras regiones de la proteína, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluarles una o más de las actividades funcionales de una proteína ACTR-1 nativa.

Otro aspecto de la invención describe fragmentos de la proteína que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, por ejemplo, para utilizarlos como inmunógenos. En una realización, un fragmento comprende al menos 5 aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos contiguos o consecutivos) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2. En otra realización, un fragmento comprende al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos contiguos o consecutivos) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.

En una realización preferida, una proteína ACTR-1 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la proteína ACTR-1 es esencialmente idéntica a la SEQ ID NO:2, y conserva la actividad funcional de la proteína de la SEQ ID NO:2, pero aún difiere en la secuencia de aminoácidos debido a la variación alélica natural o a la mutagénesis, tal y como se describe en detalle en el subapartado I anterior. En otra realización, la proteína de ACTR-1 es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la SEQ ID NO:2.

En otra realización, la invención describe una proteína ACTR-1 que está codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia nucleotídica idéntica al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a una secuencia nucleotídica de la SEQ ID n.º 1 ó 3, o una secuencia complementaria de la misma. Esta invención describe además una proteína ACTR-1 que está codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas a una secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3, o un complemento de la misma.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias con el propósito de compararlas óptimamente (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para obtener un alineamiento óptimo y se pueden pasar por alto las secuencias no homólogas para los propósitos de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80% o 90% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia a la secuencia de aminoácidos de ACTR-1 de la SEQ ID NO:2 que tiene 828 restos de aminoácidos, se alinean de al menos 248, preferiblemente al menos 331, más preferiblemente al menos 414, incluso más preferiblemente al menos 497 e incluso más preferiblemente de al menos 580, 662 ó 745 restos de aminoácidos). Luego se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos de las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición es ocupada en la primera secuencia por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que en la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal y como se utiliza en la presente memoria, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácidos o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede realizar mediante un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP del paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando tanto una matriz Blosum 62 como una matriz PAM250, y una ponderación del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y una ponderación de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización preferida, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias nucleotídicas con el programa GAP del paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), con una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación del hueco de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un ejemplo preferido y no limitante de parámetros a utilizar junto con el programa GAP incluye una matriz de ponderación Blosum 62 con una penalización del hueco de 12, una penalización de la extensión del hueco de 4 y una penalización del hueco por cambio de fase de 5.

En otra realización, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos mediante el algoritmo de Meyers y Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0 o versión 2.0U), con una tabla PAM120 de ponderación de restos, una penalización de la longitud del hueco de 12 y una penalización del hueco de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y de proteínas de la presente invención además se pueden utilizar además como una "secuencia de búsqueda" para interrogar las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Se pueden realizar tales búsquedas utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Se pueden realizar búsquedas BLAST de nucleótidos con el programa NBLAST (puntuación = 100, longitud de palabra = 12) para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a moléculas de ácidos nucleicos de ACTR-1 de la invención. Se pueden realizar búsquedas BLAST de proteínas con el programa XBLAST (puntuación = 50, longitud de palabra = 3) para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de la proteína ACTR-1 de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con el propósito de hacer la comparación, se puede utilizar Gapped BLAST tal y como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por omisión de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST and NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La invención también proporciona proteínas ACTR-1 quiméricas o de fusión. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "proteína quimérica" o una "proteína de fusión" de ACTR-1 comprende un polipéptido ACTR-1 que está operativamente unido a un polipéptido diferente de ACTR-1. Un "polipéptido ACTR-1" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a ACTR-1, mientras que un "polipéptido diferente de ACTR-1" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es esencialmente homóloga a la proteína de ACTR-1, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína ACTR-1 y que se deriva del mismo organismo o de otro diferente. Dentro de una proteína de fusión de ACTR-1, el polipéptido ACTR-1 puede corresponder a toda la proteína ACTR-1 o una porción de la misma. En una realización preferida, una proteína de fusión de ACTR-1 comprende al menos una porción biológicamente activa de una proteína ACTR-1. En otra realización preferida, una proteína de fusión de ACTR-1 comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína ACTR-1. Dentro de la proteína de fusión, la terminología "operativamente unido" pretende referirse a que el polipéptido ACTR-1 y el polipéptido diferente de ACTR-1 están fusionados en fase el uno al otro. Se puede fusionar el polipéptido diferente de ACTR-1 al extremo amino o al extremo carboxilo del polipéptido ACTR-1.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-ACTR-1 en la que la secuencia de ACTR-1 se fusiona al extremo carboxilo de la secuencia de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de la ACTR-1 recombinante. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína ACTR-1 que contiene una secuencia de señal heteróloga en su extremo amino. En determinadas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamíferos), la expresión y/o secreción de ACTR-1 se puede aumentar con el uso de una secuencia de señal heteróloga.

Las proteínas de fusión de ACTR-1 de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas y administrarlas a un sujeto in vivo. Se pueden utilizar las proteínas de fusión de ACTR-1 para alterar la biodisponibilidad de un sustrato de ACTR-1. Puede ser terapéuticamente útil la utilización de proteínas de fusión de ACTR-1 para el tratamiento de las alteraciones causadas por, por ejemplo, i) la modificación o mutación aberrante de un gen que codifica una proteína ACTR-1; ii) la regulación errónea del gen de ACTR-1; y iii) la modificación postraduccional aberrante de una proteína ACTR-1.

Además, las proteínas de fusión de ACTR-1 de la invención se pueden utilizar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-ACTR-1 en un sujeto, para purificar sustratos de ACTR-1, y en los ensayos de detección para identificar moléculas que inhiben o potencian la interacción de ACTR-1 con un sustrato de ACTR-1.

Preferiblemente, se produce una proteína quimérica o de fusión de ACTR-1 de la invención mediante técnicas estándares de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan en fase entre sí conforme a las técnicas convencionales, por ejemplo, al emplear extremos romos o cohesivos para la ligación, digestión con enzimas de restricción para asegurar que los extremos son los adecuados, rellenado de los extremos cohesivos cuando sea necesario, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación enzimática. En otra realización, se puede sintetizar el gen de fusión mediante técnicas convencionales, incluidos los sintetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, los fragmentos génicos se pueden amplificar por PCR con cebadores de anclaje que generan protuberancias complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente se pueden alinear y volver a amplificar para generar una secuencia génica quimérica (v. por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión que están disponibles comercialmente ya codifican una mitad de la fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica ACTR-1 en tal vector de expresión de tal forma que la mitad de fusión se una en fase a la proteína ACTR-1.

La presente invención también se refiere a variantes de las proteínas ACTR-1 que funcionan como agonistas de ACTR-1 (imitadores) o como antagonistas de ACTR-1. Se pueden generar variantes de las proteínas ACTR-1 mediante mutagénesis, por ejemplo, mutación o truncamiento puntual singular de una proteína ACTR-1. Un agonista de las proteínas ACTR-1 puede conservar esencialmente las mismas actividades biológicas de la forma natural de una proteína ACTR-1, o un subgrupo de las actividades. Un antagonista de una proteína ACTR-1 puede inhibir una o más de las actividades de la forma natural de la proteína ACTR-1, por ejemplo, modulando competitivamente una actividad mediada por ACTR-1 de una proteína ACTR-1. Por lo tanto, se pueden desencadenar efectos biológicos específicos mediante el tratamiento con una variante de función limitada. En una realización, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de actividades biológicas de la forma natural de la proteína tiene menos efectos secundarios sobre el sujeto que el tratamiento con la forma natural de la proteína ACTR-1.

En una realización, se pueden identificar variantes de una proteína ACTR-1 que funciona como agonista de ACTR-1 (imitadores) o como antagonistas de ACTR-1 mediante el rastreo de genotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína ACTR-1 en busca de una actividad agonista o antagonista de la proteína ACTR-1. En una realización, se genera una genoteca heterogénea de variantes de ACTR-1 mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y está codificada por una genoteca heterogénea. Se puede producir una genoteca heterogénea de variantes de ACTR-1, por ejemplo, al ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos con secuencias génicas de tal forma que un conjunto degenerado de posibles secuencias de ACTR-1 se pueda expresar como polipéptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, para exposición en bacteriófagos) que contiene el conjunto de secuencias de ACTR-1 en ésta. Existen una serie de métodos que se pueden utilizar para producir genotecas de variantes de ACTR-1 potenciales a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. Se puede realizar una síntesis química de una secuencia de genes degenerados en un sintetizador de ADN automático y, a continuación, se liga el gen sintético en un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite disponer, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias posibles de ACTR-1. En la técnica se conocen métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (véase, por ejemplo, Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annual Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res 11:477.

Además, las genotecas de fragmentos de una secuencia que codifica una proteína ACTR-1 se pueden utilizar para generar una población heterogénea de fragmentos de ACTR-1 para rastrear y seleccionar posteriormente variantes de una proteína ACTR-1. En una realización, se puede generar una genoteca de fragmentos de secuencias codificantes al tratar un fragmento de PCR bicatenario de una secuencia codificante de ACTR-1 con una nucleasa en condiciones en las que se produce una mella sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir parejas sentido/antisentido de diferentes productos mellados, retirando porciones monocatenarias de los duplex que se vuelven a formar mediante el tratamiento con nucleasa S1, y ligando la genoteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Con este método se puede obtener una genoteca de expresión que codifica fragmentos de la proteína ACTR-1 del extremo amino, del extremo carboxilo e internos de diferentes tamaños.

Se conocen varios métodos en la técnica para detectar productos génicos en las genotecas combinatorias fabricadas por mutación puntual o truncamiento, y para rastrear genotecas de ADNc en busca de los productos génicos que tienen una propiedad determinada. Tales técnicas se adaptan para rastrear rápidamente las genotecas generadas mediante mutagénesis combinatoria de las proteínas ACTR-1. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que son adecuadas para los análisis de alto rendimiento, para rastrear grandes genotecas incluyen típicamente clonar la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar las células adecuadas con la genoteca de vectores resultantes y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis recursiva en conjunto (REM por su nombre en inglés), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, se puede utilizar en combinación con los análisis de detección para identificar variantes de la ACTR-1 (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering. 6(3):327-331).

En una realización, se pueden explotar los ensayos con células para analizar una genoteca heterogénea de ACTR-1. Por ejemplo, se puede transfectar una genoteca de vectores de expresión en una estirpe celular, por ejemplo, una estirpe celular de adipocitos o preadipocitos, que normalmente responde a ACTR-1 de un modo particular dependiente del sustrato de ACTR-1. Luego, las células transfectadas se ponen en contacto con la ACTR-1 y se puede detectar el efecto de la expresión del mutante sobre la señalización debido al sustrato de la ACTR-1, por ejemplo, midiendo la concentración de restos acilados en el sustrato, o la modulación del metabolismo, dependiente de la ACTR-1, de moléculas bioquímicas (por ejemplo, lípidos), transducción de señales, o mecanismos de proliferación y/o diferenciación celular. A continuación se puede recuperar el ADN plasmídico de las células que reflejan la inhibición o, alternativamente, la potenciación de la señalización por el sustrato de la ACTR-1, y caracterizar adicionalmente los distintos clones.

Se puede utilizar una proteína ACTR-1 aislada o una porción o fragmento de la misma como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a la ACTR-1 mediante técnicas estándares para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se puede utilizar una proteína ACTR-1 completa o, alternativamente, la invención proporciona fragmentos peptídicos antigénicos de la ACTR-1 para utilizarlos como inmunógenos. El péptido antigénico de la ACTR-1 comprende al menos 8 restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 y abarca un epítopo de la ACTR-1 de tal forma que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con la ACTR-1. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos de aminoácidos, más preferiblemente, al menos 15 restos de aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 20 restos de aminoácidos, y lo más preferiblemente, al menos 30 restos de aminoácidos.

Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de la ACTR-1 que se localizan en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas, así como regiones muy antigénicas (véase, por ejemplo, la Figura 2).

Típicamente se utiliza un inmunógeno de la ACTR-1 para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunógena adecuada puede contener, por ejemplo, una proteína ACTR-1 expresada por recombinación o un polipéptido de ACTR-1 sintetizado químicamente. La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como adyuvante de Freund completo o incompleto, o un inmunoestimulante similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de ACTR-1 inmunógena induce una respuesta policlonal de anticuerpos anti-ACTR-1.

En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-ACTR-1. La terminología "anticuerpo" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como ACTR-1. Ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')_{2} que se pueden generar al tratar el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a ACTR-1. La terminología "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene sólo una especie de un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo determinado de la ACTR-1. Por lo tanto, una composición de anticuerpo monoclonal típica muestra una afinidad de unión única por una determinada proteína ACTR-1 con la que inmunorreacciona.

Se pueden preparar anticuerpos anti-ACTR-1 policlonales tal y como se describió anteriormente al inmunizar un sujeto adecuado con un inmunógeno de ACTR-1. Se puede monitorizar la valoración del anticuerpo anti-ACTR-1 en el sujeto inmunizado a lo largo del tiempo mediante técnicas estándares, tales como el enzimoinmunoensayo absorbente (ELISA) con la ACTR-1 inmovilizada. Si se desea, se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, de la sangre) las moléculas del anticuerpo dirigidas contra la ACTR-1 y purificarlas adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tal como cromatografía con proteína A para obtener la fracción de IgG. Pasado un tiempo adecuado tras la inmunización, por ejemplo, cuando la valoración del anticuerpo anti-ACTR-1 es la más alta, se pueden obtener células productoras de anticuerpo del sujeto y utilizarlas para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándares, tales como la técnica de hibridomas originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497 (véase también Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Mol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72), la técnica de hibridomas con EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96) o técnicas de triomas. Se conoce bien la tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales (véase en general Kenneth, R. H. en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet 3:231-36). Brevemente, una estirpe celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de la ACTR-1 tal y como se describió anteriormente, y se rastrean los sobrenadantes del cultivo de las células del hibridoma resultante en busca de un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una a la ACTR-1.

Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos que se utilizan para fusionar linfocitos y estirpes celulares inmortalizadas se pueden aplicar para el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-ACTR-1 (véase, por ejemplo, Galfre, G et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., supra; Lerner (1981) supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, supra). Además, el experto en la técnica se dará cuenta de que también resultarían útiles muchas variaciones de tales métodos. Típicamente, la estirpe celular inmortal (por ejemplo, una estirpe celular de mieloma) se deriva a partir de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden fabricar hibridomas murinos al fusionar linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunógena de la presente invención con una estirpe celular de ratón inmortalizada. Las estirpes celulares inmortales preferentes son las estirpes celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Se puede utilizar cualquiera de las numerosas estirpes celulares de mieloma como un homólogo de fusión de acuerdo con las técnicas estándares, por ejemplo, las estirpes de mieloma P3-NS 1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag 14. Estas estirpes de mieloma están disponibles. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón en polietilenglicol ("PEG"). A continuación las células de hibridoma que se obtienen de la fusión se seleccionan en el medio de HAT, que mata las células de mieloma fusionadas infructuosamente y sin fusionar (los esplenocitos sin fusionar mueren a los pocos días porque no están transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan al rastrear los sobrenadantes de cultivo del hibridoma en busca de los anticuerpos que se unen a la ACTR-1, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA
estándar.

Una alternativa a la preparación de hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales es la identificación de un anticuerpo anti-ACTR-1 monoclonal y su aislamiento mediante el rastreo de una genoteca de inmunoglobulinas combinatorias recombinantes (por ejemplo, una genoteca de exposición de anticuerpos en bacteriófagos) con una ACTR-1 para que de ese modo se aíslen los miembros de la genoteca de inmunoglobulinas que se unen a la ACTR-1. Los kits para generar y rastrear genotecas de exposición en bacteriófagos están disponibles comercialmente (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, n.º de catálogo 27-9400-01; y el SurfZAP^{TM} Phage Display Kit de Stratagene, n.º de catálogo 240612). Además, se pueden encontrar ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para utilizarlos en la generación y rastreo de una genoteca de exposición de anticuerpos en, por ejemplo, Ladner et al. Patente de EE.UU. nº 5.223.409; Kang et al. publicación internacional PCT nº WO 92/18619; Dower et al. publicación internacional PCT nº WO 91/17271; Winter et al. publicación internacional PCT nº WO 92/20791; Markland et al. publicación internacional PCT nº WO 92/15679; Breitling et al. publicación internacional PCT nº WO 93/01288; McCafferty et al. publicación internacional PCT nº WO 92/01047; Garrard et al. publicación internacional PCT nº WO 92/09690; Ladner et al. publicación internacional PCT nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.

Además, los anticuerpos anti-ACTR-1 recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas, que se pueden fabricar mediante técnicas de ADN recombinante estándares, se encuentran dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Robinson et al. Solicitud de Patente Internacional n.º PCT/US86/02269; Akira, et al.. Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al. publicación internacional PCT nº WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de EE.UU. nº 4.816.567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter, Patente de EE.UU. nº 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Se puede utilizar un anticuerpo anti-ACTR-1 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar la ACTR-1 mediante técnicas estándares, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-ACTR-1 puede facilitar la purificación de la ACTR-1 natural de células y de la ACTR-1 producida por recombinación expresada en células hospedadoras. Además, se puede utilizar un anticuerpo anti-ACTR-1 para detectar la proteína ACTR-1 (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante de células) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína ACTR-1. Se pueden utilizar anticuerpos anti-ACTR-1 a modo de diagnóstico para monitorizar la cantidad de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas para, por ejemplo, determinar la eficacia de una pauta terapéutica determinada. Se puede facilitar la detección acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y ecuorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

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III. Vectores de expresión recombinante y células hospedadoras

Otro aspecto de la invención hace referencia a los vectores, por ejemplo, vectores de expresión recombinante, que contienen una molécula de ácido nucleico de ACTR-1 o vectores que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ACTR-1 (o una porción de la misma). Tal como se utiliza en la presente memoria, la terminología "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico a la que está unida. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse autónomamente en una célula hospedadora en la que son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de los mamíferos) se integran en el genoma de una célula hospedadora una vez que se han introducido en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma hospedador. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que se unen operativamente. Tales vectores se denominan "vectores de expresión" en la presente memoria. Por lo general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, se pueden utilizar intercambiablemente "plásmido" y "vector", ya que el plásmido es habitualmente la forma más utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados incapaces de replicarse autónomamente), que tienen funciones equi-
valentes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas a partir de las células hospedadoras que se van a utilizar para la expresión, que están operativamente unidas a la secuencia del ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente unido" pretende significar que la secuencia nucleotídica de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). La terminología "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos del control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica sólo en algunas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada y similares. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en las células hospedadoras de tal modo que produzcan proteínas o péptidos, incluidas proteínas o péptidos de fusión, y codificadas por ácidos nucleicos como los descritos en la presente memoria (por ejemplo, proteínas ACTR-1, formas mutantes de las proteínas ACTR-1, proteínas de fusión y similares).

En consecuencia, una realización ejemplar da a conocer un método para producir una proteína, preferiblemente una proteína ACTR-1, al cultivar en un medio adecuado una célula hospedadora de la invención (por ejemplo, una célula hospedadora de mamífero tal como una célula de mamífero no humana) que contiene un vector de expresión recombinante, de tal forma que se produce la proteína.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para que expresen proteínas ACTR-1 en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, se pueden expresar proteínas ACTR-1 en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (mediante vectores de expresión baculovíricos), células de levadura o células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel (1990) supra. Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, mediante las secuencias reguladoras del promotor de T7 y la polimerasa de T7.

La expresión de las proteínas en los procariotas se realiza la mayoría de las veces en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o sin fusionar. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada en éstos, normalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para 3 propósitos: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a purificar la proteína recombinante al actuar como un ligado en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de la fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión de la fracción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la fracción de fusión después de purificar la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, la trombina y la enterocinasa. Los vectores típicos de expresión de fusiones incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión-S-transferasa (GST), la proteína E de unión a la maltosa, o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Se pueden utilizar proteínas de fusión purificadas en los ensayos de actividad de ACTR-1 (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos en detalle a continuación) o para generar anticuerpos específicos contra las proteínas ACTR-1, por ejemplo. En una realización preferida, se puede utilizar una proteína de fusión ACTR-1 en un vector de expresión retrovírico de la presente invención para infectar células de médula ósea, que posteriormente se trasplantan en receptores irradiados. A continuación se examina la enfermedad del sujeto receptor después de que haya pasado un tiempo suficiente (por ejemplo, seis (6) semanas).

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles de no fusión incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET-11d (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185:60-89). La expresión del gen diana en el vector pTrc se basa en la transcripción con la ARN polimerasa del hospedador desde un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana en el vector pET-11d se basa en la transcripción desde un promotor de fusión T7 gn10-lac gracias a la coexpresión de una ARN polimerasa vírica (T7 gn1). Esta polimerasa vírica la suministran cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un probacteriófago residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para aumentar al máximo la expresión de la proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria hospedadora a la que se ha alterado la capacidad para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol. 185:119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de tal forma que los codones específicos de cada aminoácido sean los utilizados preferiblemente en E. coli (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res 20:2111-2118). Tal alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención se puede realizar mediante técnicas de síntesis de ADN estándares.

En otra realización, el vector de expresión de ACTR-1 es un vector de expresión en levaduras. Ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y picZ (InVitrogen Corp., San Diego, CA).

Alternativamente, las proteínas ACTR-1 se pueden expresar en células de insecto mediante los vectores de expresión baculovíricos. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en las células de insecto cultivadas (e.g., células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

En otra realización más, se expresa un ácido nucleico de la invención en células de mamíferos mediante un vector de expresión de mamíferos. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufinan et al. (1987) EMBO J 6:187-195). Cuando se utiliza en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión a menudo las proporcionan elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores que se utilizan corrientemente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 de simios. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para las células procariotas como las eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2.ª, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otras realizaciones, el vector de expresión recombinante de mamíferos es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferencialmente en un tipo determinado de células (por ejemplo, para expresar el ácido nucleico se utilizan elementos reguladores específicos del tejido). En la técnica se conocen los elementos reguladores histoespecíficos. Ejemplos no limitantes de promotores histoespecíficos incluyen el promotor de la albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos del tejido linfoide (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular los promotores de los receptores de los linfocitos T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de las neuronas (e.g., el promotor del neurofilamiento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), promotores específicos del tejido adiposo (Patente de EE.UU. nº 5.476.926; Patente Internacional WO 92/06104), y promotores específicos de la glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de la leche; Patente de EE.UU. nº 4.873.316 y publicación de la Solicitud Europea nº 264.166). También se incluyen promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores Hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de la \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

La invención da a conocer además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está operativamente unida a una secuencia reguladora de tal forma que permite la expresión (mediante la transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm de ACTR-1. Se pueden elegir secuencias reguladoras operativamente unidas a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en numerosos tipos de células, por ejemplo, promotores víricos y/o potenciadores, o se pueden elegir secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva del ARN antisentido histoespecífica o específica del tipo celular. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de plásmido, fagómido o virus atenuado recombinantes en el que los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora muy eficaz, cuya actividad se puede determinar por el tipo de célula en el cual se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido, véase Weintraub, H. et al., "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis", Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

Otro aspecto de la invención se refiere a las células hospedadoras en el que se introduce la molécula de ácido nucleico de ACTR-1 de la invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de ACTR-1 dentro de un vector (por ejemplo, un vector de expresión recombinante) o una molécula de ácido nucleico de ACTR-1 que contiene secuencias que le permiten recombinar por homología en un sitio específico del genoma de la célula hospedadora. La terminología "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria. Se entiende que tal terminología se refiere no sólo a la célula particular en cuestión, sino a la descendencia o la posible descendencia de tal célula. Dado que se pueden producir determinadas modificaciones en las sucesivas generaciones debido a influencias de mutaciones o medioambientales, tal descendencia no puede, de hecho, ser idéntica a la célula original, pero se sigue incluyendo dentro del alcance de la terminología tal y como se utiliza en la presente memoria.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, se puede expresar una proteína ACTR-1 en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, levadura o células de mamíferos (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los expertos en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas.

El ADN del vector se puede introducir en las células procarióticas o eucarióticas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal y como se emplea en la presente memoria, la terminología "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una serie de técnicas reconocidas en la técnica anterior para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, que incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediante DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2.ª, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de las células de mamífero, se sabe que, según el vector de expresión y la técnica de transfección utilizados, el ADN extraño sólo se acaba integrando en el genoma en una pequeña fracción de células. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a anticuerpos) se introduce generalmente en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores de selección preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Se puede introducir un ácido nucleico que codifica un marcador de selección en una célula hospedadora sobre el mismo vector que también codifica una proteína ACTR-1, o se puede introducir en un vector diferente. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante selección con el fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen del marcador de selección sobrevivirán, mientras que las otras morirán).

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariótica o eucariótica, se puede utilizar para producir (es decir, expresar) una proteína ACTR-1. En consecuencia, la invención da a conocer adicionalmente los métodos para producir una proteína ACTR-1 mediante las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una proteína ACTR-1) en un medio adecuado de tal forma que se produzca una proteína ACTR-1. En otra realización, el método comprende además aislar una proteína ACTR-1 del medio o de la célula hospedadora.

Las células hospedadoras de la invención también se pueden utilizar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula hospedadora de la invención es un ovocito fertilizado o célula troncal embrionaria en que se han introducido las secuencias codificantes de ACTR-1. A continuación se pueden usar tales células hospedadoras para crear animales transgénicos no humanos en los que las secuencias de ACTR-1 exógenas se han introducido en su genoma, o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado las secuencias endógenas de ACTR-1. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de una proteína ACTR-1 y para identificar y/o evaluar los moduladores de la actividad de ACTR-1. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o ratón, en la que una o más de las células del animal incluyen un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios y similares. Un transgén es un ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, de tal modo que dirige la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o de tejidos del animal transgénico. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que se ha alterado un gen endógeno de ACTR-1 mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula del ADN exógeno introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.

Se puede crear un animal transgénico de la invención al introducir un ácido nucleico que codifica ACTR-1 en el pronúcleo macho de un ovocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección o infección retrovírica, y permitir que el ovocito se desarrolle en un animal de acogida hembra pseudoembarazada. La secuencia del ADNc de ACTR-1 de la SEQ ID NO:1 se puede introducir como un transgén en el genoma de un animal no humano. Alternativamente, se puede utilizar como transgén un homólogo no humano de un gen de ACTR-1 humano, tal como un gen de ACTR-1 de rata o ratón. Alternativamente, se puede aislar un homólogo del gen de ACTR-1, tal como otro miembro de la familia de ACTR-1, sobre la base de la hibridación con las secuencias del ADNc de ACTR-1 de la SEQ ID NO:1 ó 3 (descritas adicionalmente en el subapartado I anterior) y utilizarlo como transgén. También se pueden incluir en el transgén las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación, para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Una(s) secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de tejido se puede(n) unir operativamente a un transgén de ACTR-1 para dirigir la expresión de una proteína ACTR-1 a determinadas células. Los métodos para generar animales transgénicos a través de la manipulación y la microinyección de embriones, particularmente animales tales como ratones, se han convertido en métodos convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. nos. 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder et al., en la Patente de EE.UU. nº 4.873.191 de Wagner et al. y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se utilizan métodos similares para producir otros animales transgénicos. Se puede identificar un animal transgénico fundador basándose en la presencia de un transgén de ACTR-1 en su genoma y/o expresión del ARNm de ACTR-1 en tejidos o células de los animales. Entonces, se puede utilizar un animal transgénico fundador para engendrar más animales que lleven el transgén. Además, los animales transgénicos que llevan un transgén que codifica una proteína ACTR-1 pueden engendrar otros animales transgénicos que llevan otros transgenes.

Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de ACTR-1 en la que se introducido una deleción, adición o sustitución para, de este modo, alterar el gen ACTR-1, por ejemplo, destruir su funcionalidad. El gen de ACTR-1 puede ser un gen humano (por ejemplo, el ADNc de la SEQ ID n.º 3) pero más preferiblemente, es un homólogo no humano de un gen de ACTR-1 humano (por ejemplo, un ADNc aislado mediante hibridación rigurosa con la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1). Por ejemplo, se puede utilizar un gen de ACTR-1 de ratón para construir una molécula de ácido nucleico para recombinación homóloga, por ejemplo, un vector, adecuada para alterar un gen de ACTR-1 endógeno en el genoma de ratón. En una realización preferida, se diseña la molécula de ácido nucleico para recombinación homóloga de tal forma que, al realizarse la recombinación homóloga, se destruye la función del gen de ACTR-1 endógeno (a saber, ya no codifica una proteína funcional; también se cita como vector "genosupresor"). Alternativamente, se puede diseñar la molécula de ácido nucleico para recombinación homóloga de tal forma que, al tener lugar la recombinación homóloga, se muta el gen de ACTR-1 endógeno o si no se altera, aunque aún codifique una proteína funcional (por ejemplo, se puede alterar la región reguladora cadena arriba para alterar en consecuencia la expresión de la proteína ACTR-1 endógena). En la molécula del ácido nucleico para recombinación homóloga, la porción alterada del gen de ACTR-1 está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por la secuencia de ácido nucleico adicional del gen de ACTR-1 para permitir que se produzca una recombinación homóloga entre el gen de ACTR-1 exógeno portado por la molécula de ácido nucleico para recombinación homóloga y un gen de ACTR-1 endógeno en una célula, por ejemplo, una célula troncal embrionaria. La secuencia de ácido nucleico de ACTR-1 flanqueante adicional tiene una longitud suficiente para que se produzca la recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Por regla general, en la molécula de ácido nucleico para recombinación homóloga se incluyen varios kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como en el 3') (véase, por ejemplo, Thomas, K.R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de los vectores para la recombinación homóloga). La molécula de ácido nucleico para recombinación homóloga se introduce dentro de una célula, por ejemplo, una estirpe de célula troncal embrionaria (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las que el gen de ACTR-1 introducido se ha recombinado de manera homóloga con el gen de ACTR-1 endógeno (véase, por ejemplo, Li, E. et al. (1992) Cell 69:915). A continuación, las células seleccionadas se pueden inyectar en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, E. J. ed. (IRL, Oxford, 1987) págs 113-152). Luego, se puede implantar un embrión quimérico en un animal de acogida hembra pseudogestante y llevar la gestación del embrión a término. La descendencia que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células reproductoras se puede utilizar para engendrar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente por la transmisión del transgén a través de las células reproductoras. Los métodos para construir moléculas de ácido nucleico para recombinación homóloga, por ejemplo, vectores, o animales con recombinaciones homólogas se describen más detalladamente en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en las publicaciones de Patente Internacional PCT WO 90/11354 de Le Mouellec et al.; WO 91/01140 de Smithies et al.; WO 92/0968 de Zijlstra et al.; y WO 93/04169 de Berns et al.

En otra realización, se pueden producir animales transgénicos no humanos que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de tal sistema es el sistema de la recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1. Para una descripción del sistema de la recombinasa cre/loxP, véase, por ejemplo, Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema recombinasa es el sistema de la recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355). Si se utiliza un sistema de recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgén, se necesitan animales que contengan transgenes que codifican tanto la recombinasa Cre como una proteína determinada. Se pueden proporcionar tales animales mediante la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, apareando dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que codifica una proteína determinada y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa.

También se pueden producir clones de animales transgénicos no humanos descritos en la presente memoria según los métodos descritos en Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813 y las publicaciones de Patente Internacional PCT nos. WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen, un célula, por ejemplo, una célula somática, del animal transgénico se puede aislar e inducir para que salga del ciclo de crecimiento y entre en la fase G_{O}. A continuación, se puede fusionar la célula quiescente, por ejemplo, mediante pulsos eléctricos, a un ovocito enucleado de un animal de la misma especie de la que se ha aislado la célula quiescente. Luego, se cultiva el ovocito reconstruido de tal forma que se desarrolla en la mórula o blastocito, y después se transfiere a un animal hembra de acogida pseudogestante. La descendencia nacida de este animal de acogida hembra será un clon del animal del que se aísla la célula, por ejemplo, la célula somática.

IV. Composiciones farmacéuticas

Las moléculas de ácido nucleico de ACTR-1, las proteínas ACTR-1, los fragmentos de la misma, los anticuerpos anti-ACTR-1 y los moduladores de ACTR-1 (también mencionados en la presente memoria como "compuestos activos") de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones por regla general comprenden la molécula de ácido nucleico, la proteína o el anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "excipiente farmacéuticamente aceptable" pretende incluir a alguno y a todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, fármacos antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica la utilización de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Excepto en la medida en que algún medio o fármaco convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla la utilización del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula de tal modo que sea compatible con su pretendida vía de administración. Ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los compuestos siguientes: un diluyente estéril tal como agua para la inyección, disolución salina, aceites fijos (no volátiles), polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tamponantes tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede ajustar el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encapsular en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis múltiples fabricados en vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones, y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersión o disoluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los excipientes adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida hasta el punto de que se pueda aspirar e inyectar con una jeringuilla. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe estar al resguardo de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El excipiente debe ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de las partículas en el caso de la dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. Se puede prevenir la acción de los microorganismos mediante varios antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. Se puede prolongar la absorción de las composiciones inyectables al incluir en la composición un fármaco que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, un fragmento de una proteína ACTR-1 o un anticuerpo anti-ACTR-1) en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se necesite, y después esterilizar por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, lo que produce un polvo del ingrediente activo más algún ingrediente deseado adicional a partir de una disolución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

Las composiciones orales incluyen por lo general un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, se puede incorporar el compuesto activo con excipientes y utilizarlos en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. También se pueden preparar composiciones orales utilizando un vehículo líquido como un colutorio, en el que el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se hace chasquear y se expectora o se traga. Se pueden incluir agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como una celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un saborizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, se administran los compuestos en forma de un pulverizador en aerosol a partir de un dispensador o contenedor presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se utilizan penetrantes adecuados para permeabilizar la barrera. Por lo general, tales penetrantes se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fucsídico. La administración transmucosa se puede conseguir con pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, se formulan los compuestos activos en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como generalmente se conoce en la técnica.

También se pueden preparar los compuestos en forma de supositorio (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de coco u otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.

En una realización, se preparan los compuestos activos con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formas farmacéuticas serán evidentes para los expertos en la técnica. También se pueden obtener los materiales comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden utilizar como vehículos farmacéuticamente aceptables las suspensiones liposómicas (incluidos los liposomas dirigidos hacia las células infectadas con anticuerpos monoclonales contra los antígenos víricos). Se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal y como se describe en la Patente de EE.UU. nº 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosis para la fácil administración y la uniformidad de la dosis. La forma de unidad de dosis tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente individuales como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el excipiente farmacéutico necesario. La especificación para las formas de las unidades de dosis de la invención vienen dictadas, y dependen directamente de ellas, por las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de formulación tal como un compuesto activo para el tratamiento de los individuos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o en animales experimentales, por ejemplo para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Se prefieren compuestos que muestran unos índices terapéuticos grandes. Mientras que se pueden utilizar compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, hay que procurar diseñar un sistema de administración que dirija específicamente tales compuestos al sitio del tejido afectado para que se minimice el posible daño a las células sin infectar y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos de células y en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosis para el uso en los humanos. La dosis de dichos compuestos preferiblemente se encuentra en el intervalo de las concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, se puede estimar inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de los ensayos de cultivos de células. Se puede formular una dosis en modelos de animales para conseguir un intervalo de concentración en el plasma en circulación que incluye la CI50 (a saber, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición semimáxima de los síntomas) que se determina en el cultivo de células. Se puede utilizar tal información para determinar de modo más preciso las dosis útiles en los humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

Tal y como se define en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido (a saber, una dosis eficaz) oscila de unos 0,001 a 30 mg/kg de masa corporal, preferiblemente unos 0,01 a 25 mg/kg de masa corporal, más preferiblemente, unos 0,1 a 20 mg/kg de masa corporal e incluso más preferiblemente unos 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg ó 5 a 6 mg/kg de masa corporal. El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis requerida para tratar un sujeto con eficacia, incluidos, pero sin limitarse a ellos, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto, y la presencia de otras enfermedades. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido o anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.

En un ejemplo preferente, se trata un sujeto con anticuerpo, proteína o polipéptido en el intervalo de entre unos 0,1 a 20 mg/kg de masa corporal, una vez a la semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 a 8 semanas, más preferiblemente entre unas 3 a 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante unas 4, 5 ó 6 semanas. También se apreciará que la dosis eficaz del anticuerpo, proteína o polipéptido utilizado para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el ciclo de un tratamiento determinado. Se pueden producir cambios en la dosis y pueden ser evidentes por los resultados de los ensayos diagnósticos tal y como se describe en la presente memoria.

La presente invención abarca los agentes que modulan expresión o actividad. Un agente puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña. Por ejemplo, tales moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitarse a ellos, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos e inorgánicos (es decir, que incluyen compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen una masa molecular de menos de unos 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen una masa molecular de menos de unos 5000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen una masa molecular de menos de unos 1000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen una masa molecular de menos de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. Se entiende que la dosis adecuada de agentes de molécula pequeña depende de numerosos factores dentro del campo de conocimiento del médico, veterinario o investigador experto en la técnica. La(s) dosis de la molécula pequeña variará(n), por ejemplo, según la identidad, tamaño y estado del sujeto o muestra a tratar, lo que depende además de la vía por la cual se administra la composición, si es aplicable, y del efecto que el profesional desee que la molécula pequeña tenga sobre el ácido nucleico o el polipéptido de la invención.

Las dosis ejemplares incluyen cantidades de miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de sujeto o peso de la muestra (por ejemplo, aproximadamente 1 \mug/kg a unos 500 mg/kg, unos 100 \mug/kg a unos 5 mg/kg, o aproximadamente 1 \mug/kg a unos 50 \mug/kg. Más aún, se entiende que las dosis adecuadas de una molécula pequeña dependerán de la potencia de la molécula pequeña con respecto a la expresión o la actividad a modular. Tales dosis adecuadas se pueden determinar mediante los ensayos descritos en la presente memoria. Cuando una o más de estas moléculas pequeñas se debe administrar a un animal (por ejemplo, un humano) para modular la expresión o la actividad de un polipéptido o ácido nucleico de la invención, un médico, veterinario o investigador puede, por ejemplo, recetar una dosis relativamente baja primero y posteriormente aumentar la dosis hasta obtener una respuesta adecuada. Además, se comprende que el nivel de la dosis específica para cualquier sujeto animal determinado dependerá de una serie de factores, incluidos la actividad del compuesto específico empleado, la edad, la masa corporal, la salud general, el género y la dieta del sujeto, el momento de la administración, la vía de administración, la velocidad de excreción, la posible combinación farmacológica y el grado de expresión o la actividad a modular.

En algunas realizaciones de la invención, se administra un modulador de la actividad de ACTR-1 en combinación con otros fármacos (por ejemplo, una molécula pequeña), o junto con otra pauta terapéutica complementaria. Por ejemplo, en una realización, se utiliza un modulador de la actividad de ACTR-1 para tratar una alteración metabólica, por ejemplo, una alteración asociada a un metabolismo lipídico aberrante. En consecuencia, se puede utilizar la modulación de la actividad de ACTR-1 junto con, por ejemplo, fármacos reductores de los lípidos.

Además, se puede conjugar un anticuerpo (o un fragmento del mismo) a una mitad terapéutica tal como citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier fármaco que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colcquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitarse a ellos, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina [anteriormente daunomicina] y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina [antiguamente actinomicina], bleomicina, mitramicina y antramicina [AMC]) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Se pueden utilizar los conjugados de la invención para modificar una respuesta biológica determinada, y no se interpretará que la parte de fármaco se limita a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la parte de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica; una proteína tal como el factor de la necrosis tumoral, el interferón alfa, el interferón beta, factor de crecimiento del nervio, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, el activador tisular del plasminógeno; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"),factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores del crecimiento.

Las técnicas para conjugar tal porción terapéutica a anticuerpos se conocen bien: véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pág. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et al. (eds.), pág. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pág. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pág. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Alternativamente, se puede conjugar un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo tal y como describe Segal en la Patente de EE.UU. nº 4.676.980.

Se pueden introducir las moléculas de ácido nucleico de la invención en vectores y utilizarlos como vectores para genoterapia. Los vectores para genoterapia se pueden administrar a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase la Patente de Estados Unidos nº 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al.) (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector para genoterapia puede incluir el vector para genoterapia en un diluyente aceptable o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incluye el vehículo de administración del gen. Alternativamente, cuando el vector de administración del gen completo pueda producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración del gen.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración.

V. Usos y métodos de la invención

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, fragmentos de proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos y pequeñas moléculas descritos en la presente memoria se pueden utilizar en uno o más de los métodos siguientes: a) ensayos de detección; b) medicina predictiva (e.g., ensayos diagnósticos, ensayos pronosticadores, estudios clínicos de monitorización y farmacogenética); y c) métodos de tratamiento (por ejemplo, terapéutico y preventivo). Tal y como se describe en la presente memoria, una proteína ACTR-1 de la invención tiene una o más de las actividades siguientes: i) interacción con una molécula diana o sustrato de ACTR-1 (por ejemplo, una proteína que no sea ACTR-1, un lípido, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN), una hormona, un neurotransmisor); ii) conversión de una molécula diana o sustrato de ACTR-1 en un producto (por ejemplo, transferencia de un grupo acilo al sustrato o la molécula diana); iii) modulación de la biosíntesis de lípidos (por ejemplo, fosfolípidos); iv) modulación de la reorganización de los ácidos grasos de los fosfolípidos; v) modulación de la señalización intra- o intercelular y/o de la transcripción génica (por ejemplo, directa o indirectamente); vi) modulación de la proliferación, crecimiento, homeostasia, diferenciación y/o migración celular; vii) modulación de la homeostasia energética (por ejemplo, el metabolismo de las moléculas bioquímicas necesarias para la producción o el almacenamiento de energía); y viii) modulación del anabolismo y/o catabolismo de las biomoléculas metabólicamente importantes.

Las moléculas aisladas del ácido nucleico de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, para expresar la proteína ACTR-1 (por ejemplo, a través de un vector de expresión recombinante en una célula hospedadora en aplicaciones genoterápicas), para detectar el ARNm de ACTR-1 (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen de ACTR-1, y para modular la actividad de ACTR-1, como se describe con más detalle más adelante. Se pueden utilizar las proteínas ACTR-1 para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de un sustrato de ACTR-1 o la producción de inhibidores de ACTR-1, por ejemplo, trastornos asociados a la aciltransferasa.

Tal y como se utiliza intercambiablemente en la presente memoria, un "trastorno asociado a la aciltransferasa" o un "trastorno asociado a la ACTR-1" incluye un trastorno, enfermedad o estado que está causado o caracterizado por una regulación incorrecta (por ejemplo, activación o represión) de la actividad aciltransferasa o una actividad mediada por la ACTR-1. Los trastornos asociados a la aciltransferasa pueden afectar de modo perjudicial las funciones celulares tales como la homeostasia de lípidos y/o energía; la función del tejido, tal como la función del tejido adiposo, la función hepática o la función cardíaca; respuestas sistémicas en un organismo, tales como respuestas hormonales (por ejemplo, respuesta de insulina).

Los trastornos asociados a la ACTR-1 incluyen trastornos metabólicos tales como trastornos de homeostasia energética, por ejemplo, diabetes, disminución de la tolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, hiperglucemia, hipercolesterolemia, hiperlipoproteinemia, hipertrigliceridemia y/o hiperlipidemia, lo mismo que las complicaciones diabéticas incluyen ateroesclerosis, accidente cerebrovascular, retinopatía, nefropatía y nefropatía periférica. Los trastornos metabólicos asociados a la ACTR-1 también incluyen trastornos del peso y trastornos de la regulación del apetito, por ejemplo, obesidad, caquexia, anorexia y bulimia.

Los trastornos asociados o relacionados con la ACTR-1 también incluyen trastornos que afectan a tejidos en los que se expresa la proteína ACTR-1.

Además, se pueden usar las proteínas ACTR-1 para detectar los sustratos de ACTR-1 que se producen de forma natural, para detectar fármacos o compuestos que modulan la actividad de la expresión de ACTR-1, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de la proteína ACTR-1 o producción de formas de la proteína ACTR-1 que tienen una actividad menor, aberrante o indeseada en comparación con la proteína ACTR-1 de tipo salvaje (por ejemplo, un trastorno asociado con la ACTR-1).

Además, se pueden utilizar los anticuerpos anti-ACTR-1 de la invención para detectar y aislar proteínas ACTR-1, regular la biodisponibilidad de las proteínas ACTR-1 y modular la actividad ACTR-1.

A. Ensayos de detección

La invención proporciona un método (también mencionado en la presente memoria como un "ensayo de detección") para identificar moduladores, a saber, compuestos o fármacos candidatos o de prueba (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a las proteínas ACTR-1, que tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresión de ACTR-1 o la actividad ACTR-1, o que tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre, por ejemplo, los niveles de un sustrato o producto de ACTR-1.

En una realización, la invención da a conocer ensayos para detectar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de una proteína ACTR-1 o polipéptido o porción biológicamente activa de la misma. En otra realización, la invención da a conocer ensayos para detectar compuestos candidatos o de prueba que se unen o que modulan la actividad de una proteína ACTR-1, o polipéptido o porción biológicamente activa de la misma. Los compuestos de prueba de la presente invención se pueden obtener mediante cualquiera de los numerosos abordajes de los métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluidas: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase líquida o en fase sólida paralelas tratables espacialmente; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de biblioteca "una perla-un compuesto"; y métodos de bibliotecas sintéticas que utilizan selección con cromatografía de afinidad. El método de bibliotecas biológicas se limita a peptidotecas, mientras que los otros cuatro métodos se aplican a peptidotecas, bibliotecas de oligómeros no peptídicos o de moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:45).

Ejemplos de métodos para la síntesis de moleculotecas se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo, en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci: USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.

Las colecciones de compuestos se pueden presentar en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, Patente de EE.UU. nº 5.223.409), esporas (Ladner, Patente de EE.UU. nº '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o en bacteriófagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner supra).

En una realización, un ensayo es un ensayo con células en el que una célula que expresa una proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad que el compuesto de prueba tiene para modular la actividad de la ACTR-1. Se puede determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de ACTR-1 al monitorizar, por ejemplo: i) interacción con un sustrato de ACTR-1 o molécula diana (por ejemplo, un lípido); ii) conversión de un sustrato o molécula diana de ACTR-1 en un producto (por ejemplo, transferencia de un grupo acilo al sustrato o la molécula diana); iii) modulación de la biosíntesis de lípidos (por ejemplo, fosfolípidos); iv) modulación de la reorganización de los ácidos grasos de los fosfolípidos; v) modulación de la señalización intra- o intercelular y/o de la transcripción génica (por ejemplo, directa o indirectamente); vi) modulación de la proliferación, crecimiento, homeostasia, diferenciación y/o migración celular; vii) modulación de la homeostasia energética (por ejemplo, el metabolismo de las moléculas bioquímicas necesarias para la producción o el almacenamiento de energía); y viii) modulación del anabolismo y/o catabolismo de las biomoléculas metabólicamente importantes. En una realización, se puede evaluar la actividad ACTR-1 en un ensayo para la actividad aciltransferasa tal y como se describe, por ejemplo, en Yet, S-F et al. (1993) Biochemistry 32:9486-91, Yet, S-F et al. (1995) Biochemistry 34:7303-10, y Bhat, BG et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1439: 415-23.

También se puede determinar la capacidad que el compuesto de prueba tiene para modular la unión de ACTR-1 a un sustrato o para unirse a ACTR-1. Se puede determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la unión de ACTR-1 a un sustrato, por ejemplo, al acoplar el sustrato de ACTR-1 a un radioisótopo o etiqueta enzimática de tal forma que la unión del sustrato de ACTR-1 a ACTR-1 se pueda determinar al detectar la marcación del sustrato de ACTR-1 en un complejo. Alternativamente, la ACTR-1 se puede unir con un radioisótopo o etiqueta enzimática para monitorizar la capacidad que un compuesto de prueba tiene para modular la unión de ACTR-1 a un sustrato de ACTR-1 en un complejo. Se puede determinar la capacidad que el compuesto de prueba tiene para unirse a ACTR-1, por ejemplo, al acoplar el compuesto a un radioisótopo o marcación enzimática de tal forma que se pueda determinar la unión del compuesto a ACTR-1 al detectar el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, se pueden marcar los compuestos (por ejemplo, sustratos de ACTR-1) con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, directamente o indirectamente, y detectar el radioisótopo al contar directamente la radioemisión o al contar el centelleo. Alternativamente, los compuestos se pueden marcar enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y se puede detectar la etiqueta enzimática al determinar la conversión de un sustrato adecuado en un producto.

También se encuentra dentro del alcance de esta invención la determinación de la capacidad de interacción con ACTR-1 que tiene un compuesto (por ejemplo, un sustrato de ACTR-1) sin que ninguno de los interactuantes esté marcado. Por ejemplo, se puede utilizar un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con ACTR-1 sin marcar ni el compuesto ni la ACTR-1. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912. Tal y como se utiliza en esta memoria, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide con un sensor potenciométrico activado por luz (LAPS) la velocidad a la que una célula acidifica su entorno. Los cambios en esta velocidad de acidificación se pueden utilizar como un indicador de la interacción entre un compuesto y la
ACTR-1.

En otra realización, un ensayo es un ensayo con células que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de ACTR-1 (por ejemplo, un sustrato de ACTR-1) con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la molécula diana de ACTR-1. Se puede determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una molécula diana de ACTR-1, por ejemplo, determinando la capacidad que tiene la proteína ACTR-1 para unirse o interaccionar con la molécula diana de ACTR-1.

Se puede determinar la capacidad que tiene la proteína ACTR-1 o un fragmento biológicamente activo de la misma para unirse o interaccionar con una molécula diana de ACTR-1 mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una realización preferente, se puede determinar la capacidad que tiene la proteína ACTR-1 para unirse o interaccionar con una molécula diana de ACTR-1 al determinar la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, se puede determinar la actividad de la molécula diana al detectar la inducción de una molécula diana acilada, al detectar la actividad catalítica/enzimática de la molécula diana en presencia de un sustrato adecuado, al detectar la inducción de un gen indicador (que comprende un elemento regulador que responde a la diana operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa) o al detectar una respuesta celular regulada por la diana (a saber, proliferación celular, diferenciación, transducción de señales y/o actividad metabólica).

En otra realización más, un ensayo de la presente invención es un ensayo sin células en la que una proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad que tiene el compuesto de prueba para unirse a la proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma. Porciones biológicamente activas preferentes de las proteínas ACTR-1 a utilizar en ensayos de la presente invención incluyen fragmentos que participan en interacciones con moléculas que no son ACTR-1, por ejemplo, fragmentos que muy probablemente se localicen en la superficie (véase, por ejemplo, la Figura 2). La unión del compuesto de prueba a la proteína ACTR-1 se puede determinar directa o indirectamente tal y como se describió anteriormente. En una realización preferente, el ensayo incluye poner en contacto la proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a ACTR-1 para formar una mezcla para ensayo, poner en contacto la mezcla para ensayo con una compuesto de prueba y determinar la capacidad que tiene el compuesto de prueba para interaccionar con una proteína ACTR-1, en el que determinar la capacidad que tiene el compuesto de prueba para interaccionar con una proteína ACTR-1 comprende determinar la capacidad que tiene el compuesto de prueba para unirse preferiblemente a ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma cuando se compara con el compuesto conocido.

En otra realización, el ensayo es un ensayo sin células en el que una proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad que tiene el compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma. Se puede determinar la capacidad que tiene el compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína ACTR-1, por ejemplo, al determinar la capacidad que tiene la proteína ACTR-1 para unirse a una molécula diana de ACTR-1 mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. Se puede determinar la capacidad de la proteína ACTR-1 para unirse a una molécula diana de ACTR-1 mediante una tecnología tal como el análisis de interacción biomolecular (BIA, por su nombre en inglés Biomolecular Interaction Analysis) en tiempo real. Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin tener que marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore). Se pueden utilizar los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (RPS) como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En una realización alternativa, se puede determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína ACTR-1 al determinar la capacidad de la proteína ACTR-1 para modular adicionalmente la actividad de un efector vía abajo de una molécula de diana de ACTR-1.Por ejemplo, se puede determinar la actividad de la molécula efectora sobre una diana adecuada o la unión del efector a una diana adecuada tal y como se describió anteriormente.

En otra realización, el ensayo sin células implica poner en contacto la proteína ACTR-1 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a una proteína ACTR-1 para formar una mezcla para ensayo, poner en contacto la mezcla para ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad que tiene el compuesto de prueba para interaccionar con la proteína ACTR-1, en el que determinar la capacidad que tiene el compuesto de prueba para interaccionar con la proteína ACTR-1 comprende determinar la capacidad que tiene la proteína ACTR-1 para modular o unirse preferiblemente la actividad de una molécula diana de ACTR-1.

Los ensayos sin células de la presente invención son manejables cuando se utilizan con formas de proteínas aisladas solubles y/o unidas a la membrana (por ejemplo, proteínas ACTR-1 o porciones biológicamente activas de las mismas). En el caso de ensayos sin células en los que se utiliza una forma de una proteína aislada unida a la membrana puede ser deseable utilizar un solubilizante de tal manera que la forma unida a la membrana de la proteína aislada se mantenga en disolución. Ejemplos de tales solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, isotridecipoli(etilenglicoleter)_{n}, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO) o sulfonato de N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano.

En más de una realización de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar bien la ACTR-1 o su molécula diana para facilitar la separación de las formas complejadas de formas sin complejar de una o ambas proteínas, así como para dar cabida a la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a una proteína ACTR-1, o la interacción de una proteína ACTR-1 con un sustrato o molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato se puede realizar en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede dar a conocer una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/ACTR-1 o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/diana se pueden absorber en perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microvaloración modificadas con glutatión que, luego, se combinan con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y o bien la proteína diana no absorbida o bien la proteína ACTR-1, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para la sal y el pH). Después de la incubación, se lavan las perlas o los pocillos de las placas de microvaloración para retirar los compuesto que no se unieron, se inmoviliza la matriz en el caso de las perlas, y se determina el complejo directa o indirectamente, por ejemplo, tal y como se describió anteriormente. Alternativamente, se pueden disociar los complejos de la matriz, y determinar mediante técnicas estándares el nivel de unión a ACTR-1 o la actividad.

También se pueden utilizar otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los ensayos de detección de la invención. Por ejemplo, se puede inmovilizar una proteína ACTR-1 o un sustrato o molécula diana de ACTR-1 mediante la conjugación de biotina y estreptavidina. Se puede preparar proteína ACTR-1, sustratos o moléculas diana biotinilados a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando la tecnología conocida en la técnica anterior (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e inmovilizarlos en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos que reaccionan con la proteína ACTR-1 o con moléculas diana, pero que no interfieren con la unión de la proteína ACTR-1 a su molécula de diana, se pueden derivar a los pocillos de la placa, y se atrapan la diana o la proteína ACTR-1 sin unir en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos mediante anticuerpos reactivos con la proteína ACTR-1 o una molécula diana, así como inmunoensayos que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada a la proteína ACTR-1 o a la molécula diana.

En otra realización, se identifican moduladores de la expresión de ACTR-1 en un método en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm o la proteína de ACTR-1 en la célula. El nivel de expresión del ARNm o de la proteína ACTR-1 en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm o la proteína de ACTR-1 en ausencia del compuesto candidato. A continuación, se puede identificar el compuesto candidato como un modulador de la expresión de ACTR-1 basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm de ACTR-1 o de la proteína ACTR-1 es mayor (estadísticamente significativo) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un estimulador de la expresión del ARNm de ACTR-1 o de la proteína ACTR-1. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm de ACTR-1 o de la proteína ACTR-1 es menor (estadísticamente significativo) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un inhibidor de la expresión del ARNm de ACTR-1 o de la proteína ACTR-1. El nivel de la expresión del ARNm de ACTR-1 o de la proteína ACTR-1 en las células se puede determinar mediante los métodos descritos en la presente memoria para detectar el ARNm de ACTR-1 o la proteína ACTR-1.

Aún en otro aspecto de la invención, las proteínas ACTR-1 se pueden utilizar como "proteínas de cebo" en un ensayo de doble híbrido o en un ensayo de triple híbrido (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Mol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent WO 94/10300) para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con ACTR-1 ("proteínas de unión a ACTR-1" o "ACTR-1-bp") y que están implicadas en la actividad de ACTR-1. Probablemente, tales proteínas de unión a ACTR-1 también están implicadas en la propagación de señales mediante las proteínas ACTR-1 o las dianas de ACTR-1 como, por ejemplo, elementos vía abajo de una vía de señalización mediada por ACTR-1. Alternativamente, tales proteínas de unión a ACTR-1 pueden ser inhibidores de la ACTR-1.

El sistema de doble híbrido está basado en la naturaleza modular de la mayor parte de los factores de transcripción, que consisten en dominios de unión al ADN y dominios de activación separables. Brevemente, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes. En una construcción, el gen que codifica la proteína ACTR-1 se fusiona a un gen que codifica el dominio de unión al ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN, de una genoteca de secuencias ADN, que codifica una proteína sin identificar ("presa" o "muestra") se fusiona a un gen que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas cebo y presa son capaces de interaccionar, in vivo, y formar un complejo dependiente de ACTR-1, los dominios de unión al ADN y de activación del factor de transcripción se encontrarán muy próximos entre sí. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que está operativamente unido al sitio regulador transcripcional que responde al factor de transcripción. Se puede detectar la expresión del gen indicador y se pueden aislar las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional y utilizarlas para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interacciona con la proteína ACTR-1.

En otro aspecto, la invención pertenece a una combinación de dos o más de los ensayos descritos en la presente invención. Por ejemplo, se puede identificar un modulador utilizando un ensayo con células o un ensayo sin células, y se puede confirmar in vivo la capacidad del agente para modular la actividad de una proteína ACTR-1, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para un trastorno metabólico, por ejemplo, obesidad (ratón ob/ob; Zhang, Y et al. (1994) Science 372:425-432) o diabetes, o para la transformación celular y/o la oncogenia.

Esta invención se refiere adicionalmente a nuevos agentes identificados mediante los ensayos de detección descritos anteriormente. En consecuencia, se encuentra dentro del alcance de esta invención la utilización adicional un fármaco identificado tal y como se describe en la presente memoria en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, un agente identificado tal y como se describe en la presente memoria (por ejemplo, un modulador de ACTR-1, una molécula de ácido nucleico antisentido de ACTR-1, un anticuerpo específico de ACTR-1, o un asociado de unión a ACTR-1) se puede utilizar en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con tal agente. Alternativamente, se puede utilizar un agente identificado tal y como se describe en la presente memoria en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. Además, esta invención concierne a usos de agentes nuevos para los tratamientos identificados mediante los ensayos de detección descritos anteriormente, tal y como se describe en la presente memoria.

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B. Ensayos de detección

Se pueden utilizar porciones o fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas en la presente memoria (y las correspondientes secuencias génicas completas) de numerosas maneras como reactivos polinucleotídicos. Por ejemplo, se pueden utilizar estas secuencias para: i) cartografiar los respectivos genes en un cromosoma; y, por lo tanto, localizar las regiones génicas asociadas a la enfermedad genética; ii) identificar un individuo entre una muestra biológica diminuta (tipificación de tejido); y iii) ayudar en la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en los subapartados que siguen.

1. Cartografía cromosómica

Una vez que se ha aislado la secuencia (o una porción de la secuencia) de un gen, se puede utilizar esta secuencia para cartografiar la ubicación del gen en un cromosoma. Este procedimiento se llama cartografía cromosómica. En consecuencia, se pueden utilizar porciones o fragmentos de las secuencias nucleotídicas de ACTR-1, descritas en la presente memoria, para cartografiar la posición de los genes de ACTR-1 en un cromosoma. La cartografía de las secuencias de ACTR-1 en los cromosomas es una primera etapa importante para correlacionar estas secuencias con los genes a los que se asocia.

Brevemente, se pueden cartografiar los genes de ACTR-1 en los cromosomas al preparar cebadores de PCR (preferiblemente, de 15 a 25 pb de longitud) a partir de las secuencias nucleotídicas de ACTR-1. Se puede utilizar el análisis computarizado de las secuencias de ACTR-1 para predecir cebadores que no se extiendan más de un exón en el ADN genómico, lo que complica el procedimiento de amplificación. Luego, se pueden utilizar estos cebadores para detectar por PCR los híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo se amplificará un fragmento en los híbridos que contienen el gen humano correspondiente a las secuencias de ACTR-1.

Los híbridos de células somáticas se preparan fusionando células somáticas de diferentes mamíferos (por ejemplo, células humanas y de ratón). Ya que los híbridos de las células humanas y de ratón crecen y se dividen, van perdiendo gradualmente los cromosomas humanos en orden aleatorio, pero conservan los cromosomas de ratón. Al utilizar medios en los que las células de ratón no pueden crecer, ya que carecen de una enzima particular, pero en los que las células humanas pueden crecer, se conservará el único cromosoma humano que contiene el gen que codifica la enzima necesaria. Al utilizar diferentes medios, se pueden establecer grupos de estirpes celulares híbridas. Cada estirpe celular en un grupo contiene bien un único cromosoma humano o bien una pequeña cantidad de cromosomas humanos, y un conjunto completo de cromosomas de ratón, lo que permite cartografiar con facilidad determinados genes en cromosomas humanos específicos. (D'Eustachio P. et al. (1983) Science 220:919-924). También se pueden producir híbridos de células somáticas que contienen sólo fragmentos de cromosomas humanos utilizando cromosomas humanos con translocaciones y deleciones.

La cartografía por PCR de los híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar una secuencia determinada a un cromosoma particular. Se pueden asignar tres o más secuencias al día con un único termociclador. Utilizando las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 para diseñar cebadores oligonucleotídicos, se puede conseguir la sublocalización con grupos de fragmentos de cromosomas específicos. Otras estrategias de cartografía que se puede utilizar de modo similar para cartografiar una secuencia de ACTR-1 en su cromosoma incluye la hibridación in situ (descrito en Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6223-27), la detección previa de los cromosomas marcados por clasificación en flujo, y la selección previa por la hibridación con genotecas de ADNc específicas del cromosoma.

La hibridación fluorescente in situ (FISH, por su nombre en inglés) de una secuencia de ADN a sus cromosomas en metafase en extensión se puede utilizar adicionalmente para proporcionar una posición cromosómica determinada en una etapa. Se pueden generar extensiones cromosómicas utilizando células cuya división se ha bloqueado en metafase mediante un producto químico tal como demecolcina que altera el huso mitótico. Los cromosomas se pueden tratar brevemente con tripsina y, luego, se pueden teñir con Giemsa. En cada cromosoma se revela un patrón de bandas claras y oscuras, por lo que los cromosomas se pueden identificar individualmente. Se puede utilizar la técnica FISH con una secuencia de ADN con tan solo 500 ó 600 bases. Sin embargo, los clones mayores de 1000 bases tienen más probabilidad de unirse a una única posición cromosómica con una intensidad de señal suficiente para una detección sencilla. Preferentemente, 1000 bases o, más preferentemente 2000 bases, serán suficientes para conseguir buenos resultados en un tiempo razonable. Para una revisión de esta técnica, véase, Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988).

Se pueden usar los reactivos de la cartografía cromosómica individualmente para marcar un único cromosoma o un único sitio en ese cromosoma, o se pueden utilizar grupos de reactivos para marcar varios sitios y/o varios cromosomas. De hecho se prefieren reactivos que correspondan a regiones no codificantes de los genes para propósitos de cartografía. Las secuencias codificantes tienen más probabilidades de conservarse dentro de familias de genes, lo que aumenta la probabilidad de hibridaciones cruzadas durante la cartografía de los cromosomas.

Una vez que se ha cartografiado una secuencia en una posición cromosómica determinada, se puede correlacionar la posición física de la secuencia sobre el cromosoma con los datos de la cartografía genética. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en McKusick, V., Mendelian Inheritance in Man, disponible en internet a través de la biblioteca médica de la Johns Hopkins University Welch). La relación entre un gen y una enfermedad, cartografiados en la misma región cromosómica, se puede identificar a través del análisis de ligamiento (herencia simultánea de genes físicamente adyacentes) descritos en, por ejemplo, Egeland, J. et al. (1987) Nature 325:783-787.

Además, se pueden determinar las diferencias en la secuencia del ADN entre los individuos afectados y sin afectar con una enfermedad asociados al gen de ACTR-1. Si se observa una mutación en alguno o todos los individuos afectados pero no en ninguno de los individuos sin afectar, entonces la mutación probablemente sea el agente causante de la enfermedad en concreto. La comparación de los individuos afectados y sin afectar generalmente implica primero buscar las alteraciones estructurales en los cromosomas, tal como deleciones o translocaciones, que son visibles a partir de diseminación de cromosomas o detectables por PCR sobre esa secuencia de ADN. Finalmente, se puede realizar la secuenciación completa de genes de varios individuos para confirmar la presencia de una mutación y para diferenciar mutaciones de polimorfismos.

2. Tipificación de tejido

Las secuencias de ACTR-1 de la presente invención también se pueden utilizar para identificar individuos a partir de muestras biológicas minúsculas. El ejército de los Estados Unidos, por ejemplo, se está planteando utilizar los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP por su nombre en inglés) para identificar a su personal. En esta técnica, se digiere un ADN genómico de un individuo con una o más enzimas de restricción, y se hibrida en una transferencia de tipo Southern para producir bandas únicas que lo identifiquen. Este método no padece la limitaciones actuales de las chapas de identificación que se pueden perder, cambiar o robar, lo que hace que la identificación positiva sea difícil. Las secuencias de la presente invención son útiles como marcadores de ADN adicionales para los RFLP (descrito en la Patente de EE.UU. nº 5.527.057).

Además, se pueden usar las secuencias de la presente invención para proporcionar una técnica alternativa que determina la secuencia real del ADN base a base de determinadas porciones del genoma de un individuo. Por lo tanto, las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 descritas en la presente memoria se pueden utilizar para preparar dos cebadores de PCR desde los extremos 5' y 3' de las secuencias. A continuación, se pueden utilizar estos cebadores para amplificar el ADN de un individuo y posteriormente secuenciarlo.

Los grupos de secuencias de ADN correspondientes de individuos, preparados de este modo, pueden proporcionar identificaciones individuales únicas, ya que cada individuo tendrá un conjunto único de tales secuencias de ADN debido a las diferencias alélicas. Las secuencias de la presente invención se pueden utilizar para obtener tales secuencias de identificación a partir de individuos y a partir de tejido. Las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 de la invención únicamente representan porciones del genoma humano. En las regiones codificantes de estas secuencias se produce una cierta variación alélica, que es mayor en las regiones no codificantes. Se estima que una variación alélica entre distintos humanos se produce con una frecuencia de aproximadamente una vez por cada 500 bases. Cada una de las secuencias descritas en la presente memoria puede, hasta cierto punto, utilizarse como un estándar frente al cual se puede comparar el ADN de un individuo con el propósito de identificarlo. Dado que la mayoría de los polimorfismos se producen en las regiones no codificantes, se necesitan menos secuencias para diferenciar los individuos. Las secuencias no codificantes de la SEQ ID NO:1 pueden proporcionar una identificación individual positiva cómoda con un grupo de quizás 10 a 1000 cebadores, produciendo cada uno de ellos una secuencia amplificada no codificante de 100 bases. Si se utilizan secuencias codificantes predichas, tales como las de la SEQ ID NO:3, una cifra más adecuada de cebadores para una identificación individual positiva sería 500 a 2000.

Si se utiliza un grupo de reactivos de las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 descritas en la presente memoria para generar una base de datos de identificación única para un individuo, estos mismos reactivos se pueden utilizar posteriormente para identificar el tejido de ese individuo. Con la utilización de una identificación única en la base de datos, se puede realizar una identificación positiva del individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido muy pequeñas.

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3. Utilización de secuencias parciales de ACTR-1 en la biología forense

En la biología forense también se pueden utilizar las técnicas de identificación basadas en ADN. La biología forense es un ámbito científico que emplea el genotipado de las pruebas biológicas que se encuentran en la escena de un crimen como un medio para identificar positivamente, por ejemplo, un autor de un crimen. Para realizar esta identificación, se puede utilizar la tecnología de PCR para amplificar las secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas, tal como tejidos, por ejemplo cabello o piel, o líquidos corporales, por ejemplo sangre, saliva o semen encontrado en la escena de un crimen. A continuación, la secuencia amplificada se puede comparar con un estándar, lo que permite identificar el origen de la muestra biológica.

Las secuencias de la presente invención se pueden utilizar para proporcionar reactivos polinucleotídicos, por ejemplo, cebadores de PCR dirigidos específicamente a un locus específico en el genoma humano, lo que puede mejorar la fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en el ADN, por ejemplo, proporcionado otro "marcador de identificación" (por ejemplo otra secuencia de ADN que es única para un individuo determinado). Tal y como se mencionó anteriormente, para la identificación se puede utilizar la información de la secuencia real de las bases como una alternativa exacta a los patrones formados por los fragmentos generados por las enzimas de restricción. Las secuencias dirigidas específicamente a las regiones no codificantes de la SEQ ID NO:1 son particularmente adecuadas para este uso porque la mayoría de los polimorfismos se producen en las regiones no codificantes, lo que facilita la distinción de los individuos con esta técnica. Ejemplos de reactivos polinucleotídicos incluyen las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 o porciones de las mismas, por ejemplo, fragmentos derivados de las regiones no codificantes de la SEQ ID NO:1 que tienen una longitud de al menos 20 bases, preferiblemente al menos 30 bases.

Las secuencias nucleotídicas de ACTR-1 descritas en la presente memoria se pueden utilizar además para proporcionar reactivos polinucleotídicos, por ejemplo, sondas marcadas o marcables que se pueden utilizar en, por ejemplo, una técnica de hibridación in situ, para identificar un tejido específico, por ejemplo, un tejido que expresa ACTR-1. Esto puede ser muy útil en los casos en los que un médico forense solo cuenta con un tejido de origen desconocido. Los grupos de tales sondas de ACTR-1 se pueden utilizar para identificar el tejido por especie y/o por tipo de
órgano.

De un modo similar, estos reactivos, por ejemplo cebadores o sondas de ACTR-1, se pueden utilizar para detectar sistemáticamente la contaminación del cultivo del tejido (es decir, detectar la presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un cultivo).

C. Medicina predictiva

La presente invención también concierne al ámbito de la medicina predictiva en la que se utilizan ensayos diagnósticos, ensayos pronosticadores y la monitorización de estudios clínicos con propósitos pronosticadores (predictivos) para, de ese modo, tratar preventivamente a un individuo. En consecuencia, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos diagnósticos para determinar la expresión de la proteína ACTR-1 y/o del ácido nucleico así como la actividad de ACTR-1, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células o tejido) para de ese modo determinar si un individuo padece una enfermedad o alteración, o si está en peligro de desarrollar una alteración, asociado a la expresión o actividad no deseada de ACTR-1. La invención también da a conocer ensayos pronosticadores (o predictivos) para determinar si un individuo corre el riesgo de desarrollar un trastorno asociado a la proteína ACTR-1, su actividad o la expresión del ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden analizar mutaciones en un gen de ACTR-1 en una muestra biológica. Se pueden utilizar tales ensayos con propósitos pronosticadores o predictivos para de esta forma tratar preventivamente un individuo antes del comienzo de un trastorno caracterizado por, o asociado a, la proteína ACTR-1, su actividad o la expresión del ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención se refiere a monitorizar la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre la expresión o la actividad de ACTR-1 en los ensayos clínicos.

Éstos y otros fármacos se describen con más detalle en los apartados siguientes.

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1. Ensayos diagnósticos

Un método ejemplar para detectar la presencia o ausencia de proteína, polipéptido o ácido nucleico de ACTR-1 en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto a analizar y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar la proteína, polipéptido o ácido nucleico de ACTR-1 (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica la proteína ACTR-1 de tal forma que se detecta la presencia de la proteína ACTR-1 o su ácido nucleico en la muestra biológica. En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método para detectar la presencia de actividad ACTR-1 en una muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de la actividad ACTR-1 de tal forma que se detecta la presencia de la actividad ACTR-1 en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar el ARNm o el ADN genómico de ACTR-1 es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridarse con el ARNm o el ADN genómico de ACTR-1. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico completo de ACTR-1, de tal forma que el ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 ó 3, o una porción de la misma, como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones rigurosas al ARNm o al ADN genómico de ACTR-1. En la presente memoria se describen otras sondas adecuadas para utilizarlas en los ensayos diagnósticos de la invención.

Un agente preferido para detectar la proteína ACTR-1 es un anticuerpo capaz de unirse a la proteína ACTR-1, preferiblemente un anticuerpo con una etiqueta detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, más preferiblemente, monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}). La terminología "marcado", en relación con la sonda o el anticuerpo, pretende englobar la marcación directa de la sonda o del anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como la marcación indirecta de la sonda o el anticuerpo mediante la reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Ejemplos de marcación indirecta incluyen detectar un anticuerpo primario mediante un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y la marcación terminal con biotina de una sonda de ADN de tal manera que se pueda detectar con estreptavidina marcada con fluorescencia. La terminología "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y líquidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y líquidos presentes dentro de un sujeto. Es decir, se puede utilizar el método de detección de la invención para detectar ARNm, proteína o ADN genómico de ACTR-1 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para detectar ARNm de ACTR-1 incluyen hibridaciones de tipo Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para detectar una proteína ACTR-1 incluyen los enzimoinmunoensayos (ELISA), análisis de inmunotransferencia, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para detectar ADN genómico de ACTR-1 incluyen hibridaciones de tipo Southern. Además, las técnicas in vivo para detectar una proteína ACTR-1 incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti-ACTR-1 marcado. Por ejemplo, se puede marcar el anticuerpo con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se puede detectar mediante técnicas estándares diagnósticas por imagen.

La presente invención también da a conocer ensayos diagnósticos para identificar la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos una característica entre i) modificación aberrante o mutación de un gen que codifica una proteína ACTR-1; ii) expresión aberrante de un gen que codifica una proteína ACTR-1; iii) regulación errónea del gen; y v) modificación postraduccional aberrante de una proteína ACTR-1, en la que una forma de tipo salvaje del gen codifica una proteína con una actividad ACTR-1. "Expresión errónea o expresión aberrante", tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a un patrón de la expresión génica del ARN o la proteína de tipo no salvaje. Incluye, pero sin limitarse a ello, la expresión a niveles de tipo no salvaje (por ejemplo, sobre- o subexpresión); un patrón de expresión que difiere del tipo salvaje en términos del tiempo o etapa en la que se expresa el gen (por ejemplo, aumento o disminución de la expresión [en comparación con el tipo salvaje] en un periodo o etapa de desarrollo predeterminado); un patrón de expresión que difiere del tipo salvaje en términos de disminución de la expresión (en comparación con el tipo salvaje) en un tipo de célula o tipo de tejido predeterminados; un patrón de expresión que difiere del tipo salvaje en términos de tamaño del ayuste, secuencia de aminoácidos, modificación postraduccional o actividad biológica del polipéptido expresado; un patrón de expresión que difiere del tipo salvaje en términos del efecto de un estímulo medioambiental o estímulo extracelular sobre la expresión del gen (por ejemplo, un patrón de aumento o disminución de la expresión [en comparación con el tipo salvaje] en presencia de un aumento o disminución en la potencia del estímulo).

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto a analizar. Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto a analizar o moléculas de ADN genómico del sujeto a analizar. Una muestra biológica preferente es una muestra de suero aislada de un sujeto por medios convencionales.

En otra realización, los métodos implican además obtener una muestra biológica de control de un sujeto de control, poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar la proteína, el ARNm o el ADN genómico de ACTR-1, de tal forma que la presencia de la proteína, el ARNm o el ADN genómico de ACTR-1 se detecta en la muestra biológica, y comparar la presencia de la proteína, el ARNm o el ADN genómico de ACTR-1 en la muestra de control con la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de ACTR-1 en la muestra a analizar.

La invención también abarca los kits para detectar la presencia de ACTR-1 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar una proteína o ARNm de ACTR-1 en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de ACTR-1 en la muestra; y medios para comparar la cantidad de ACTR-1 en la muestra con un estándar. El compuesto o agente se puede empaquetar en un contenedor adecuado. Además, el kit puede comprender además instrucciones para utilizar el kit para detectar la proteína o ácido nucleico de ACTR-1.

2. Ensayos pronosticadores

Adicionalmente, los métodos diagnósticos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para identificar sujetos que tienen o corren el riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante o indeseada de ACTR-1. Tal y como se usa en la presente memoria, la terminología "aberrante" incluye una expresión o actividad de ACTR-1 que se desvía de la expresión o actividad de ACTR-1 de tipo salvaje. La expresión o actividad aberrante incluye el aumento o la disminución de la expresión o actividad, así como la expresión o actividad que no sigue el patrón de expresión del desarrollo de tipo salvaje o el patrón de expresión subcelular. Por ejemplo, la expresión o actividad de ACTR-1 aberrante pretende incluir los casos en los que una mutación en el gen de ACTR-1 causa que se subexprese o sobreexprese el gen de ACTR-1 y situaciones en las que tales mutaciones dan lugar a una proteína ACTR-1 no funcional o una proteína que no funciona como la de tipo salvaje, por ejemplo, una proteína que no interacciona con un sustrato de ACTR-1, o una que interacciona con un sustrato que no es ACTR-1. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "indeseada" incluye un fenómeno indeseado implicado en una respuesta biológica tal como la proliferación celular desregulada o la susceptibilidad a las crisis. Por ejemplo, la terminología indeseado incluye una expresión o actividad de ACTR-1 que es indeseable en un sujeto.

Los ensayos descritos en la presente memoria, tales como los ensayos diagnósticos anteriores o los ensayos siguientes, se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene o que corre el riesgo de desarrollar un trastorno asociado a una regulación errónea de la actividad de la proteína ACTR-1 o la expresión de su ácido nucleico, tal como un trastorno metabólico, un trastorno cardiovascular, un trastorno de proliferación, crecimiento o diferenciación celular, un trastorno del sistema nervioso central, un trastorno hormonal o un trastorno inflamatorio o del sistema inmunitario. Alternativamente, los ensayos pronosticadores se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene o que corre el riesgo de desarrollar un trastorno asociado a una regulación errónea de la actividad de la proteína ACTR-1 o la expresión de su ácido nucleico, tal como un trastorno metabólico, un trastorno cardiovascular, un trastorno de proliferación, crecimiento o diferenciación celular, un trastorno del sistema nervioso central, un trastorno hormonal o un trastorno inflamatorio o del sistema inmunitario. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método para identificar una enfermedad o trastorno asociado a una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada en la que se obtiene una muestra a analizar de un sujeto y se detecta una proteína o ácido nucleico de ACTR-1 (por ejemplo, ARNm o ADN genómico), en el que la presencia de la proteína ACTR-1 o el ácido nucleico es diagnosticadora de un sujeto que tiene o corre el riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado a una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "muestra a analizar" se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra a analizar puede ser un líquido biológico (por ejemplo, suero), una muestra de células o un tejido.

Además, los ensayos pronosticadores descritos en la presente memoria se pueden utilizar para determinar si a un sujeto se le puede administrar un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro fármaco candidato) para tratar una enfermedad o trastorno asociado a una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada. Por ejemplo, tales métodos se pueden utilizar para determinar si un sujeto se puede tratar con eficacia con un fármaco para un trastorno metabólico, un trastorno cardiovascular, un trastorno de proliferación, crecimiento o diferenciación celular, un trastorno del sistema nervioso central, un trastorno hormonal o un trastorno inflamatorio o del sistema inmunitario. Por lo tanto, la presente invención da a conocer métodos para determinar si un sujeto se puede tratar con eficacia con un fármaco para un trastorno asociado a una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada, en los que se obtiene una muestra a analizar o se detecta la expresión o actividad de la proteína o del ácido nucleico de ACTR-1 (por ejemplo, en la que la abundancia de la proteína ACTR-1 o la expresión de su ácido nucleico es diagnóstica de un sujeto al que se le puede administrar el fármaco para tratar un trastorno asociado a una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada).

Los métodos de la invención también se pueden utilizar para detectar alteraciones genéticas en un gen de ACTR-1, por lo que se determina si un sujeto con el gen alterado corre el riesgo de desarrollar un trastorno caracterizado por una regulación errónea de la actividad de la proteína ACTR-1 o la expresión de su ácido nucleico, tal como un trastorno metabólico, un trastorno cardiovascular, un trastorno de proliferación, crecimiento o diferenciación celular, un trastorno del sistema nervioso central, un trastorno hormonal o un trastorno inflamatorio o del sistema inmunitario. En las realizaciones preferentes, los métodos incluyen detectar, en una muestra de células del sujeto, la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos una de una alteración que afecta a la integridad de un gen que codifica una proteína ACTR-1, o la expresión errónea del gen de ACTR-1. Por ejemplo, se pueden detectar tales alteraciones genéticas averiguando la existencia de al menos una de 1) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen de ACTR-1; 2) una adición de uno o más nucleótidos a un gen de ACTR-1; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen de ACTR-1, 4) una reorganización cromosómica de un gen de ACTR-1; 5) una alteración de la transcripción del ARN mensajero de un gen de ACTR-1; 6) modificación aberrante de un gen de ACTR-1, tal como el patrón de metilación del ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de ayuste de tipo no salvaje de un ARN mensajero transcrito de un gen de ACTR-1; 8) un nivel que no es el de tipo salvaje de una proteína ACTR-1; 9) pérdida de un alelo de un gen de ACTR-1; y 10) la modificación postraduccional inadecuada de una proteína ACTR-1. Tal y como se describe en la presente memoria, hay un gran número de ensayos conocidos en la técnica que se pueden utilizar para detectar alteraciones en un gen de ACTR-1. Una muestra biológica preferente es una muestra de tejido o de suero aislada de un sujeto por medios convencionales.

En algunas realizaciones, la detección de la alteración implica el empleo de una sonda o cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. nos. 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR anclada o RACE-PCR o, alternativamente, en una reacción en cadena de ligación (LCR) (véase, por ejemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), el último de los cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen de ACTR-1 (véase Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:675-682). Este método puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un sujeto, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra del ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan específicamente a un gen de ACTR-1 en condiciones tales que se produce la hibridación y la amplificación del gen de ACTR-1 (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o determinar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se anticipa que puede ser deseable utilizar la PCR y/o LCR como una etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas utilizadas para detectar mutaciones descritas en la presente memoria.

Los métodos de amplificación alternativos incluyen: la replicación automantenida de secuencia (Guatelli, J. C. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D. Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi, P. M. et al.(1988) Bio-Technology 6: 1197) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para detectar las moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en poca cantidad.

En una realización alternativa, se pueden identificar mutaciones en un gen de ACTR-1 a partir de una célula de muestra mediante las alteraciones de los patrones de escisión de las enzimas de restricción. Por ejemplo, el ADN de la muestra y del control se aísla, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, se determinan los tamaños de la longitud de los fragmentos mediante electroforesis en gel y se comparan. Las diferencias en el tamaño de los fragmentos entre el ADN de la muestra y del control indica que existen mutaciones en el ADN de la muestra. Además, el empleo de ribozimas específicas de secuencia (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.498.531) se puede utilizar para evaluar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o pérdida de un sitio de escisión de la ribozima.

En otras realizaciones, se pueden identificar las mutaciones genéticas en ACTR-1 al hibridar ácidos nucleicos de la muestra y del control, por ejemplo, ADN o ARN, con matrices de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin, M. T. et al. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nature Medicine 2:753-759). Por ejemplo, se pueden identificar las mutaciones genéticas en ACTR-1 en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas con luz tal y como se describe en Cronin, M. T. et al. (1996) supra. Brevemente, se puede utilizar una primera matriz de sondas de hibridación para la detección a lo largo de grandes porciones de ADN en una muestra y un control que identifiquen los cambios de base entre las secuencias al fabricar matrices lineales de sondas solapantes secuenciales. Esta etapa permite identificar mutaciones puntuales. Esta etapa va seguida de una segunda matriz de hibridaciones que permite caracterizar mutaciones específicas utilizando matrices de sondas especializadas más pequeñas complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutaciones se compone de conjuntos de sondas paralelas, una complementaria al gen de tipo salvaje y la otra complementaria al gen mutante.

En otra realización, se puede utilizar una cualquiera de las muchas reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen de ACTR-1 y detectar mutaciones al comparar la secuencia de la ACTR-1 de la muestra con la correspondiente secuencia de tipo salvaje (control). Ejemplos de reacciones de secuenciación incluyen las basadas en las técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) o Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463). También se contempla que se puede utilizar cualquiera de los muchos procedimientos de secuenciación automática cuando se llevan a cabo los ensayos diagnósticos (Naeve, C. W. (1995) Biotechniques 19:448), incluida la secuenciación mediante espectrometría de masas (véase, por ejemplo, la publicación de Patente Internacional PCT nº WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr.36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).

Otros métodos para detectar mutaciones en el gen de ACTR-1 incluyen métodos en los que se utiliza la protección frente a los agentes de escisión para detectar bases mal apareadas en los heterodúplex de ARN/ARN o ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230:1242). Por regla general, la técnica de "escisión de apareamientos erróneos" comienza proporcionando heterodúplex formados al hibridar ARN o ADN (marcado) que contiene la secuencia de ACTR-1 de tipo salvaje con ARN o ADN potencialmente mutante obtenido de una muestra de tejido. Los dúplex bicatenarios se tratan con un agente que escinde regiones bicatenarias del dúplex de tal forma que existirá debido a las los apareamientos erróneos de las bases entre las hebras de control y de la muestra. Por ejemplo, se pueden tratar los dúplex ARN/ADN con ARNasa y los híbridos ADN/ADN tratados con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones discordantes. En otras realizaciones, se pueden tratar los dúplex ADN/ADN o ARN/ADN con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina para digerir las regiones discordantes. Después de la digestión de las regiones discordantes, se separa el material resultante por tamaños sobre geles desnaturalizantes de poliacrilamida para determinar el sitio de la mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, el ADN o el ARN de control se puede marcar para su detección.

En otra realización más, la reacción de escisión del apareamiento erróneo emplea una o más proteínas que reconocen las bases mal apareadas en el ADN bicatenario (también llamadas enzimas de "reparación de apareamientos erróneos en el ADN") en sistemas definidos para detectar y cartografiar mutaciones puntuales en los ADNc de ACTR-1 obtenidos de las muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde la A en los apareamientos erróneos G/A y la timidina-ADN-glucosilasa de las células HeLa escinde la T en los apareamientos erróneos G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662). De acuerdo con una realización ejemplar, una sonda basada en una secuencia de ACTR-1, por ejemplo, una secuencia de ACTR-1 de tipo salvaje, se hibrida a un ADNc u otro producto de ADN de una o varias células a analizar. Se trata el dúplex con una enzima de reparación de apareamientos erróneos en el ADN, y los productos de la escisión, si los hay, se pueden detectar mediante protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.459.039.

En otras realizaciones, se utilizarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar las mutaciones en los genes de ACTR-1. Por ejemplo, se pueden utilizar los polimorfismos conformacionales monocatenarios (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre los ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144;. y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Los fragmentos de ADN monocatenarios de los ácidos nucleicos de ACTR-1 de la muestra y del control se desnaturalizarán y se dejará que se renaturalicen. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía según la secuencia, y la alteración resultante de la movilidad electroforética permite incluso la detección de un único cambio de base. Los fragmentos de ADN se pueden marcar o detectar con sondas marcadas. Se puede aumentar la sensibilidad del análisis utilizando ARN (en vez de ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el método en cuestión utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas bicatenarias heterodúplex distintas sobre la base de los cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet.7:5).

En otra realización, el movimiento de los fragmentos del mutante o del tipo salvaje en los geles de poliacrilamida que contienen un gradiente desnaturalizante se analiza por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 3 13:495). Cuando se utiliza la DGGE como método de análisis, se modificará el ADN para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo, mediante la adición por PCR de una pinza GC de casi 40 pb de ADN rico en GC y de elevado punto de fusión. En otra realización se utiliza un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar las diferencias de movilidad del ADN del control y de la muestra (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

Ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, pero sin limitarse a ellas, la hibridación específica de oligonucleótidos, la amplificación específica o la extensión específica de cebadores. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos en los que se coloca la mutación conocida en el centro y luego se hibridan al ADN diana en condiciones que permiten la hibridación sólo si se da un apareamiento perfecto (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Tales oligonucleótidos específicos de alelos se hibridan al ADN diana amplificado por PCR o a otras mutaciones diferentes cuando los oligonucleótidos están unidos a la membrana de hibridación y se hibridan con el ADN diana marcado.

Alternativamente, se puede utilizar la tecnología de amplificación específica de alelo que depende de la amplificación selectiva por PCR junto con la presente invención. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación específica pueden llevar la mutación de interés en el centro de la molécula (por lo que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el extremo del extremo 3' de un cebador donde, en condiciones adecuadas, puede prevenirse el apareamiento erróneo o reducirse la extensión de la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Además, puede ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear una detección basada en la escisión (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se anticipa que en algunas realizaciones, también se puede realizar la amplificación utilizando la Tag ligasa para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). En tales casos, se producirá la ligación sólo si hay una concordancia perfecta en el extremo 3' de la secuencia en 5', lo que posibilita a detección de la presencia de una mutación conocida en un sitio específico al buscar la presencia o ausencia de amplificación.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar, por ejemplo, mediante la utilización de kits de diagnóstico preempaquetados que comprenden, al menos, un ácido nucleico de sonda o un reactivo de anticuerpo descrito en la presente memoria, que se puede utilizar de manera conveniente, por ejemplo, en situaciones clínicas para diagnosticar los pacientes que muestran síntomas o antecedentes familiares de una enfermedad o dolencia relacionada con un gen de ACTR-1.

Además, en los ensayos pronosticadores descritos en la presente memoria se puede utilizar cualquier tipo de célula o tejido en los que se exprese ACTR-1.

3. Monitorización de los efectos durante los ensayos clínicos

La monitorización de la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos) sobre la expresión o actividad de una proteína ACTR-1 (por ejemplo, la modulación de los mecanismos de señalización celular, la modulación del metabolismo lipídico o la modulación de la proliferación y/o diferenciación celular) se pueden aplicar no sólo en el cribado básico de fármacos, sino también en los ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de detección tal y como se describe en la presente memoria para aumentar la expresión del gen de ACTR-1, la cantidad de proteínas ACTR-1 o la inducción de la actividad de ACTR-1 se puede monitorizar en ensayos clínicos de sujetos que muestran una disminución de la expresión del gen de ACTR-1, la cantidad de la proteína ACTR-1 o una represión de la actividad de ACTR-1. Alternativamente, la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de detección para disminuir la expresión del gen de ACTR-1, la cantidad de la proteína ACTR-1 o reprimir la actividad de ACTR-1 se puede monitorizar en ensayos clínicos de sujetos que muestran un aumento de la expresión del gen de ACTR-1, la cantidad de la proteína ACTR-1 o una inducción de la actividad de ACTR-1. En tales ensayos clínicos, la expresión o la actividad de un gen de ACTR-1 y, preferiblemente, otros genes que han estado implicados en, por ejemplo, un trastorno asociado a ACTR-1, se puede utilizar como una "lectura" o como marcadores del fenotipo de una célula determinada.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, se pueden identificar los genes, incluido ACTR-1, que se modulan en las células mediante el tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, fármaco o pequeña molécula) que modula la actividad de ACTR-1 (por ejemplo, identificados en un ensayo de detección tal y como se describe en la presente memoria). Por lo tanto, para estudiar el efecto de los fármacos sobre los trastornos asociados a ACTR-1 (por ejemplo, trastornos caracterizados por una pérdida de la regulación de la actividad aciltransferasa, del metabolismo lipídico, de la señalización celular y/o los mecanismos de crecimiento, proliferación o diferenciación celular), por ejemplo, en un ensayo clínico, se pueden aislar las células, y preparar el ARN y analizar sus niveles de expresión de ACTR-1 y de otros genes implicados en el trastorno asociado a ACTR-1, respectivamente. Los niveles de la expresión génica (por ejemplo, un patrón de expresión génica) se pueden cuantificar mediante análisis por transferencia de tipo Northern o RT-PCR, tal y como se describe en la presente memoria, o alternativamente al medir la cantidad de la proteína producida, mediante uno de los métodos tal y como se describe en la presente memoria, o midiendo los niveles de la actividad de ACTR-1 u otros genes. De este modo, el patrón de expresión génica puede servir como un marcador, indicativo de la respuesta fisiológica de las células frente al agente. En consecuencia, se puede determinar este estado de respuesta antes, y en diferentes momentos durante el tratamiento del individuo con el agente.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un método para monitorizar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro fármaco candidato identificado mediante los ensayos de detección descritos en la presente memoria) que incluye las etapas de i) obtener una muestra preadministrativa a partir de un sujeto antes de administrarle el agente; (ii) detectar el nivel de expresión de una proteína, ARNm o ADN genómico de ACTR-1 en la muestra preadministrativa; iii) obtener una o más muestras posadministrativas del sujeto; iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico de ACTR-1 en las muestras posadministrativas; v) comparar el nivel de expresión o la actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico de ACTR-1 en la muestra preadministrativa con la proteína, ARNm o ADN genómico de ACTR-1 en la muestra o muestras posadministrativa(s);
y vi) alterar la administración del fármaco al sujeto en consonancia. Por ejemplo, puede ser deseable aumentar la administración del agente para aumentar la expresión o la actividad de ACTR-1 a niveles mayores de los detectados, a saber, para aumentar la eficacia del agente. Alternativamente, puede ser deseable disminuir la administración del agente para disminuir la expresión o la actividad de ACTR-1 a niveles menores de los detectados, a saber, para disminuir la eficacia del agente. De acuerdo con tal realización, se puede usar la expresión o actividad de ACTR-1 como un indicador de la eficacia de un agente, incluso en ausencia de una respuesta fenotípica observable.

D. Métodos de tratamiento

La presente invención proporciona métodos tanto preventivos como terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de (o susceptible a) padecer un trastorno o tener un trastorno asociado a la ACTR-1, por ejemplo, un trastorno asociado con una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada. Respecto a los métodos de tratamiento profilácticos y terapéuticos, tales tratamientos se pueden adaptar o modificar específicamente, basándose en el conocimiento obtenido del ámbito de la farmacogenómica. "Farmacogenómica", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la aplicación de tecnologías de genómica, tales como secuenciación génica, genética estadística y análisis de la expresión génica, a los fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, la terminología se refiere al estudio de cómo los genes del paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, "fenotipo de respuesta al fármaco" o "genotipo de respuesta al fármaco" de un paciente). Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona métodos para fabricar a medida un tratamiento preventivo o terapéutico para un individuo con moléculas de ACTR-1 de la presente invención o moduladores de ACTR-1 de acuerdo con el genotipo de respuesta del fármaco que tiene el individuo. La farmacogenómica permite al profesional clínico o al médico dirigir los tratamientos preventivos o terapéuticos a pacientes que más se beneficiarán del tratamiento y para evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con el fármaco.

1. Métodos preventivos

En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir en un sujeto una enfermedad o afección asociada a una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada, al administrar al sujeto una ACTR-1 o un agente modulador de la expresión de ACTR-1 o al menos una actividad ACTR-1. Los sujetos que corren el riesgo de padecer una enfermedad causada por una expresión o actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada, o fomentada por esto, se pueden identificar mediante, por ejemplo, alguno o un conjunto de ensayos diagnósticos o pronosticadores que se describen en la presente memoria. La administración de un profiláctico se puede producir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de ACTR-1, de tal forma que se previene una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrasa su avance. Según el tipo de aberración de ACTR-1, se puede tratar el sujeto con, por ejemplo, una ACTR-1, un agonista de ACTR-1 o antagonista de ACTR-1. Se puede determinar el agente adecuado según los ensayos de detección descritos en la presente memoria.

2. Métodos terapéuticos

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos de modulación de la expresión o actividad de ACTR-1 con propósitos terapéuticos. En consecuencia, en una realización ejemplar, el método modulador de la invención implica poner en contacto una célula capaz de expresar ACTR-1 con un agente que modula una o más de las actividades de la actividad de la proteína ACTR-1 asociada a la célula, de tal forma que se modula la actividad de ACTR-1 en la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína ACTR-1 puede ser un agente tal y como se describe en la presente memoria, tal como un ácido nucleico o una proteína, una molécula diana de una proteína ACTR-1 (por ejemplo, un sustrato de ACTR-1) que se produce de forma natural, un anticuerpo contra ACTR-1, un agonista o antagonista de ACTR-1, un peptidomimético de un agonista o antagonista de ACTR-1 u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más actividades de ACTR-1. Ejemplos de tales agentes estimulantes incluyen la proteína ACTR-1 activa y que se haya introducido en la célula una molécula de ácido nucleico que codifique la ACTR-1. En otra realización, el agente inhibe una o más actividades de ACTR-1. Ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido de ACTR-1, anticuerpos anti-ACTR-1 e inhibidores de ACTR-1. Estos métodos moduladores se pueden realizar in vitro (por ejemplo, al cultivar la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, al administrar el agente a un sujeto). Así pues, la presente invención da a conocer métodos para tratar a un individuo afectado por una enfermedad o trastorno caracterizado por una expresión o actividad aberrante o indeseada de una proteína o molécula de ácido nucleico de ACTR-1. En una realización, el método implica administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de cribado descrito en la presente memoria) o una combinación de agentes que modula (por ejemplo, induce o disminuye) la expresión o la actividad de ACTR-1. En otra realización, el método implica administrar una proteína o molécula de ácido nucleico de ACTR-1 como terapia para compensar la expresión o actividad de ACTR-1 aberrante, reducida o indeseada.

La estimulación de la actividad ACTR-1 es deseable en situaciones en las que ACTR-1 está subexpresada de forma anormal y/o en las que la inducción de la actividad de ACTR-1 probablemente tiene un efecto beneficioso. Por ejemplo, la estimulación de la actividad de ACTR-1 es deseable en situaciones en las que ACTR-1 está reprimida y/o en las que la inducción de la actividad de ACTR-1 probablemente tiene un efecto beneficioso. Asimismo, la inhibición de la actividad de ACTR-1 es deseable en situaciones en las que ACTR-1 se induce anormalmente y/o en las que la disminución de la actividad de ACTR-1 probablemente tiene un efecto beneficioso.

3. Farmacogenómica

Las moléculas de ACTR-1 de la presente invención, así como los agentes, o moduladores que tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad de ACTR-1 (por ejemplo, expresión génica de ACTR-1) que se identificó mediante un ensayo de detección descrito en la presente memoria se pueden administrar a individuos para tratar (preventiva o terapéuticamente) trastornos asociados a ACTR-1 (por ejemplo, trastornos caracterizados por una actividad aciltransferásica aberrante, un trastorno metabólico, un trastorno cardiovascular o un trastorno de proliferación, crecimiento o diferenciación celular) asociado a una actividad de ACTR-1 aberrante o indeseada. Junto con tal tratamiento, se puede tener en cuenta la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto extraño o fármaco). Las diferencias en el metabolismo de los agentes terapéuticos pueden conducir a una toxicidad grave o fracaso terapéutico al alterarse la relación entre la dosis y la concentración sanguínea del fármaco farmacológicamente activo. Por consiguiente, un médico o profesional clínico puede tener en cuenta la aplicación del conocimiento obtenido en estudios de farmacogenómica relevantes a la hora de determinar si hay que administrar una molécula de ACTR-1 o un modulador de ACTR-1 así como personalizar la dosis y/o posología terapéutica del tratamiento con una molécula de ACTR-1 o modulador de ACTR-1.

La farmacogenómica trata variaciones hereditarias clínicamente significativas en respuesta a fármacos debido a la alteración de la disposición del fármaco y la efectos anormales en personas afectadas. Véase, por ejemplo, Eichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 y Linder, M. W. et al. (1997) Clin. Chem.43(2):254-266. En general, se pueden diferenciar dos tipos de alteraciones farmacogenéticas. Alteraciones genéticas transmitidas como un único factor que altera el modo en el que los fármacos actúan sobre el cuerpo (alteración de la acción del fármaco) o alteraciones genéticas transmitidas como factores únicos que afectan al modo en el que el cuerpo actúa sobre los fármacos (alteración del metabolismo del fármaco). Estas alteraciones farmacogenéticas se pueden producir como defectos genéticos raros o como polimorfismos que se producen de forma natural. Por ejemplo, la deficiencia en glucosa-6-fosfato metiltransferasa (G6PD) es una enzimopatía heredada frecuente en la que la principal complicación clínica es la hemólisis después de la ingestión de fármacos oxidantes (antipalúdicos, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y el consumo de habas.

Un método farmacogenómico para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco, conocido como "asociación de todo el genoma", reside principalmente en una cartografía de alta resolución del genoma humano que consiste en marcadores relacionados con genes ya conocidos (por ejemplo, cartografía del marcador génico "bialélico" que consiste en 60.000 a 100.000 sitios polimórficos o variables sobre el genoma humano, cada uno de los cuales tiene dos variantes). Tal cartografía genética de alta resolución se puede comparar con un mapa del genoma de cada uno de un número estadísticamente significativo de pacientes que participan en un estudio farmacológico de fase II/III para identificar marcadores relacionados con la observación de un efecto secundario o respuesta determinada al fármaco. Alternativamente, se puede generar tal mapa de alta resolución a partir de una combinación de unos diez millones de polimorfismos mononucleotídicos (SNP) conocidos en el genoma humano. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "SNP" es una alteración común que se produce en una base de un único nucleótido en una porción de ADN. Por ejemplo, se puede producir un SNP una vez por cada 1000 bases de ADN. Un SNP puede estar implicado en un proceso patológico; sin embargo, la inmensa mayoría puede no estar asociado a una enfermedad. Dados los mapas genéticos basados en la recidiva de tales SNP, los individuos se pueden agrupar en categorías genéticas según el patrón particular de los SNP en su genoma en particular. De tal modo, las posologías de tratamiento se pueden adaptar para grupos de individuos genéticamente similares al tener en cuanta las características que pueden ser comunes entre tales individuos genéticamente similares.

Alternativamente, se puede utilizar un método denominado el "método del gen candidato" para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco. De acuerdo con este método, si se conoce un gen que codifica una diana de un fármaco (por ejemplo, una proteína ACTR-1 de la presente invención), todas las variantes habituales de ese gen se pueden identificar con facilidad en la población y se puede determinar si tener una versión del gen frente a otra está asociado a una respuesta farmacológica particular.

Como una realización ilustrativa, la actividad de las enzimas metabolizantes del fármaco es un determinante principal de la intensidad y duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de los polimorfismos genéticos de las enzimas que metabolizan fármacos (por ejemplo, la enzima N-metiltransferasa 2 (NAT 2) y las enzimas del citocromo P450 CYP2D6 y CYP2C19) ha proporcionado una explicación a porqué algunos pacientes no obtienen los efectos esperados del fármaco o muestran una respuesta farmacológica exagerada y toxicidad grave después de tomar la dosis estándar y segura del fármaco. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población: el metabolizador rápido (MR) y el metabolizador lento (ML). La prevalencia del ML es diferente entre las poblaciones diferentes. Por ejemplo, el gen que codifica CYP2D6 es muy polimórfico y se han identificado varias mutaciones en el ML que conducen a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores lentos de CYP2D6 y CYP2C19 con bastante frecuencia experimentan una respuesta al fármaco exagerada y efectos secundarios cuando reciben dosis estándares. Si un metabolito es el resto terapéutico activo, el ML no muestra ninguna respuesta terapéutica, como se demuestra por el efecto analgésico de la codeína mediada por la morfina, el metabolito formado por CYP2D6. El otro extremo son los llamados metabolizadores ultrarrápidos que no responden a dosis estándares. Recientemente, se ha identificado que la base molecular del metabolismo ultrarrápido, que reside en la amplificación del gen
CYP2D6.

Alternativamente, un método denominado "perfil de expresión génica" se puede utilizar para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco. Por ejemplo, la expresión génica de un animal que recibe una dosis de un fármaco (por ejemplo, una molécula de ACTR-1 o un modulador de ACTR-1 de la presente invención) puede ofrecer una indicación de si están funcionando las vías génicas relacionadas con la toxicidad.

La información generada a partir de más de uno de los métodos de farmacogenómica anteriores se puede utilizar para determinar la dosis adecuada y las pauta terapéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o selección del fármaco, puede evitar reacciones adversas o fracaso terapéutico y, por lo tanto, mejorar la eficacia terapéutica o preventiva cuando se trata a un sujeto con una molécula de ACTR-1 o un modulador de ACTR-1, tal como un modulador identificado por uno de los ensayos de detección ejemplares descritos en la presente memoria.

4. Utilización de las moléculas de ACTR-1 como marcadores indirectos

Las moléculas de ACTR-1 de la invención también son útiles como marcadores de los trastornos o estados patológicos, como marcadores de precursores de estados patológicos, como marcadores de predisposición a los estados patológicos, como marcadores de la actividad del fármaco o como marcadores del perfil farmacogenómico de un sujeto. Utilizando los métodos descritos en la presente memoria, se puede detectar la presencia, ausencia y/o cantidad de moléculas de ACTR-1 de la invención y se pueden correlacionar con uno o más estados biológicos in vivo. Por ejemplo, las moléculas de ACTR-1 de la invención pueden servir como marcadores indirectos de uno o más trastornos o estados patológicos o para trastornos que conducen a estados patológicos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "marcador indirecto" es un marcador bioquímico imparcial que se correlaciona con la ausencia o presencia de una enfermedad o trastorno, o con la progresión de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, con la presencia o ausencia de un tumor). La presencia o cantidad de tales marcadores es independiente de la causa de la enfermedad. Por lo tanto, estos marcadores pueden servir para indicar si un ciclo de tratamiento determinado es eficaz a la hora de reducir un estado patológico o trastorno. Los marcadores indirectos son particularmente útiles cuando es difícil evaluar la presencia o extensión de un estado patológico o trastorno mediante metodologías estándares (por ejemplo, tumores en etapas tempranas) o cuando se desea una evaluación de la progresión de la enfermedad antes de alcanzar un criterio de valoración clínico potencialmente peligroso (por ejemplo, se puede realizar una evaluación cardiovascular mediante la concentración de colesterol como un marcador indirecto, y se puede realizar un análisis de la infección por VIH mediante los niveles de ARN del VIH como un marcador indirecto, con bastante antelación a los resultados clínicos indeseables de infarto de miocardio o de SIDA totalmente desarrollado). Ejemplos del uso de los marcadores indirectos en la técnica incluyen: Koomen et al. (2000) J. Mass. Spectrom. 35:258-264; y James (1994) AIDS Treatment News Archive 209.

Las moléculas de ACTR-1 de la invención también son útiles como marcadores farmacodinámicos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "marcador farmacodinámico" es un marcador bioquímico imparcial que se correlaciona específicamente con los efectos del fármaco. La presencia o cantidad de un marcador farmacodinámico no se relaciona con el estado patológico o trastorno para el que se ha administrado el fármaco; por lo tanto, la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la presencia o actividad del fármaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador farmacodinámico puede ser indicativo de la concentración del fármaco en un tejido biológico, en que el marcador se expresa o transcribe o no se expresa ni se transcribe en ese tejido en relación con el nivel del fármaco. De este modo, la distribución o captación del fármaco se puede monitorizar mediante el marcador farmacodinámico. De igual forma, la presencia o cantidad del marcador farmacodinámico puede estar relacionada con la presencia o cantidad del producto metabólico de un fármaco, de tal forma que la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la velocidad de degradación relativa del fármaco in vivo. Los marcadores farmacodinámicos son de uso particular para aumentar la sensibilidad de la detección de los efectos del fármaco, particularmente cuando el fármaco se administra en dosis bajas. Ya que incluso una cantidad pequeña de un fármaco puede ser suficiente para activar varias rondas de transcripción o expresión del marcador (por ejemplo, un marcador de ACTR-1), el marcador amplificado puede estar en una cantidad que es más fácilmente detectable que el propio fármaco. El marcador también se puede detectar con más facilidad debido a la naturaleza del propio marcador; por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente memoria, para detectar un ARNm marcador de ACTR-1 se pueden emplear anticuerpos anti-ACTR-1 en un sistema basado en anticuerpos para detectar un marcador de la proteína ACTR-1, o sondas radiomarcadas específicas de ACTR-1. Además, el empleo de un marcador farmacodinámico puede ofrecer una predicción del riesgo basada en el mecanismo debido al tratamiento con el fármaco más allá del margen de posibles observaciones directas. Ejemplos del uso de los marcadores farmacodinámicos en la técnica incluyen: Matsuda et al. US 6.033.862; Hattis et al. (1991) Env. Health Perspect. 90:229-238; Schentag (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Supl. 3: S21-S24; y Nicolau (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Supl. 3:S16-S20.

Las moléculas de ACTR-1 de la invención también son útiles como marcadores farmacogenómicos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "marcador farmacogenómico" es un marcador bioquímico imparcial que se correlaciona con una respuesta clínica al fármaco específica o susceptibilidad en un sujeto (véase, por ejemplo, McLeod et al. (1999) Eur. J. Cancer 35(12):1650-1652). La presencia o cantidad del marcador farmacogenómico está relacionado con la respuesta prevista del sujeto a un fármaco específico o clase de fármacos antes de la administración del fármaco. Al evaluar la presencia o cantidad de uno o más marcadores farmacogenómicos en un sujeto, se puede seleccionar un tratamiento farmacológico que sea más adecuado para el sujeto, o que se predice que tendrá más éxito. Por ejemplo, basándose en la presencia o la cantidad del ARN, o la proteína (por ejemplo, proteína o ARN de ACTR-1) de marcadores tumorales específicos en un sujeto, se puede seleccionar un fármaco o ciclo de tratamiento que esté optimizado para el tratamiento del tumor específico que probablemente esté presente en el sujeto. De igual forma, la presencia o ausencia de una mutación de secuencia específica en el ADN de ACTR-1 se puede correlacionar con la respuesta de ACTR-1 al fármaco. Por lo tanto,el empleo de los marcadores farmacogenómicos permite aplicar el tratamiento más adecuado para cada sujeto sin tener que administrar el tratamiento.

5. Medios legibles por aparatos electrónicos y matrices

También se dan a conocer medios legibles por aparatos electrónicos que comprenden la información de secuencia de ACTR-1. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "información de secuencia de ACTR-1" se refiere a cualquier información de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos específica de las moléculas de ACTR-1 de la presente invención, incluidas, pero sin limitarse a ellas, secuencias completas de nucleótidos y/o aminoácidos, secuencias parciales de nucleótidos y/o aminoácidos, secuencias polimórficas que incluyen los polimorfismos mononucleotídicos (SNP), secuencias de epítopos y similares. Además, la información "relacionada con" dicha información de la secuencia de ACTR-1 incluye la detección de la presencia o ausencia de una secuencia (por ejemplo, detección de la expresión de una secuencia, fragmento, polimorfismo, etc.), determinación del nivel de una secuencia (por ejemplo, detección de un nivel de expresión, por ejemplo, una detección cuantitativa), detección de una reactividad con una secuencia (por ejemplo, detección de la expresión y/o niveles de la proteína, por ejemplo, mediante un anticuerpo específico de secuencia) y similares. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "medios legibles por aparatos electrónicos" se refiere a cualquier medio adecuado para almacenar, sostener o contener datos o información se pueda leer y se pueda acceder directamente mediante un aparato electrónico. Tales medios pueden incluir, pero sin limitarse a ellos: medios magnéticos de almacenamiento, tales como disquetes; medios de almacenamiento en disco duro y cinta magnética; medios ópticos de almacenamiento tales como discos compactos; medios de almacenamiento electrónicos tales como RAM, ROM, EPROM, EEPROM y similares; y discos duros generales e híbridos de estas categorías, tales como medios de almacenamiento magnetoópticos. El medio se adapta o se configura para que esté registrada en él la información de secuencia de ACTR-1 de la presente invención.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "aparatos electrónicos" pretende incluir cualquier aparato informático o de procesamiento u otro dispositivo configurado o adaptado para almacenar datos o información. Ejemplos de aparatos electrónicos adecuados para ser utilizados con la presente invención incluyen aparatos informáticos autónomos; redes, incluida una red local (LAN), una red de gran alcance (WAN), internet, intranet y extranet; dispositivos electrónicos tales como asistentes personales electrónicos (PDA), teléfonos móviles, mensáfono y similares; y sistemas de procesamiento locales y distribuidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, "registrado" se refiere a un procedimiento para almacenar o codificar información en los medios legibles por aparatos electrónicos. Los expertos en la técnica pueden adoptar fácilmente cualquiera de los métodos conocidos actualmente para registrar información sobre medios conocidos para generar manufacturas que comprenden la información de secuencia de ACTR-1. Se puede utilizar numerosos programas informáticos y formatos para almacenar la información de secuencia sobre el medio legible por aparatos electrónicos. Por ejemplo, se puede representar la información de secuencia en un archivo de texto de un procesador de textos, formatearla en programas disponibles comercialmente tales como WordPerfect y Microsoft Word, representarla en forma de un archivo ASCII o almacenarla en una aplicación de base de datos, tales DB2, Sybase, Oracle, o similares, así como en otras formas. Se pueden emplear numerosos formatos de estructuración de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener o crear un medio en el que se ha registrado la información de la secuencia de ACTR-1.

Al proporcionar información de la secuencia de ACTR-1 en forma legible, uno puede acceder sistemáticamente a la información de la secuencia para numerosos propósitos. Por ejemplo, el experto en la técnica puede utilizar la información de secuencia en forma legible para comparar una secuencia diana o motivo estructural diana con la información de secuencia almacenada dentro de los medios de almacenamiento de datos. Se utilizan medios de búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la invención que se aparean con una secuencia diana determinada o motivo diana.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer un medio en el que contener las instrucciones para realizar un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, en el que el método comprende las etapas de determinar la información de secuencia de ACTR-1 asociada al sujeto y basada en la información de secuencia de ACTR-1, determinar si el sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, y/o recomendar un tratamiento particular para la enfermedad, trastorno o estado prepato-
lógico.

La presente invención además da a conocer, en un sistema electrónico y/o en una red, un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, en el que el método comprende las etapas de determinar la información de secuencia de ACTR-1 asociada al sujeto y basada en la información de secuencia de ACTR-1, determinar si el sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, y/o recomendar un tratamiento particular para la enfermedad, trastorno o estado prepatológico. Además, el método comprende la etapa de recibir información fenotípica asociada al sujeto y/o adquirir desde una información fenotípica en red asociada al sujeto.

La presente invención también proporciona en una red un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad asociada a ACTR-1 o trastorno asociado a ACTR-1, comprendiendo dicho método las etapas de recibir información de secuencia de ACTR-1 del sujeto y/o información relacionada con él, recibir información fenotípica asociada al sujeto, adquirir información de la red que corresponde a ACTR-1 y/o una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, y basada en una o más entre la información fenotípica, la información de ACTR-1 (por ejemplo, información de secuencia y/o información relacionada a ésta) y la información adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociada a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociada a ACTR-1. Además, el método comprende la etapa de recomendar un tratamiento determinado para la enfermedad, trastorno o estado prepatológico.

La presente invención también da a conocer un método comercial para determinar si un sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, comprendiendo dicho método las etapas de recibir información relacionada con ACTR-1 (por ejemplo, información de secuencia y/o información relacionada con ésta), recibir información fenotípica asociada con el sujeto, adquirir información de la red relacionada con ACTR-1 y/o relacionada con una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, y basada en una o más entre la información fenotípica, la información de ACTR-1 y la información adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad o trastorno asociada a ACTR-1 o una predisposición a una enfermedad o trastorno asociada a ACTR-1. Además, el método comprende la etapa de recomendar un tratamiento determinado para la enfermedad, trastorno o estado prepatológico.

La invención también incluye una matriz que comprende una secuencia de ACTR-1 de la presente invención. Se puede utilizar la matriz para ensayar la expresión de uno o más genes impresos en la matriz. En una realización, se puede utilizar la matriz para ensayar la expresión génica en un tejido para determinar la especificidad de tejido de los genes de la matriz. De este modo, se pueden analizar simultáneamente la expresión de hasta 7600 genes, uno de los cuales pueden ser ACTR-1. Esto permite desarrollar un perfil que muestre una batería de genes que se expresan específicamente en uno o más tejidos.

Además de tal determinación cualitativa, la invención permite cuantificar la expresión génica. Por lo tanto, se puede averiguar no sólo la especificidad de tejido, sino también el nivel de expresión de una batería de genes en el tejido. Por lo tanto, los genes se pueden agrupar sobre la base de su expresión tisular per se y el nivel de expresión en ese tejido. Esto es útil, por ejemplo, para averiguar la relación de la expresión génica entre tejidos o dentro de los mismos. Por lo tanto, se puede perturbar un tejido y determinar el efecto sobre la expresión génica en un segundo tejido. En este contexto, se puede determinar el efecto de un tipo celular sobre otro tipo de célula en respuesta a un estímulo biológico. Tal determinación es útil, por ejemplo, para conocer el efecto de la interacción célula-célula a nivel de la expresión génica. Si se administra terapéuticamente un agente para tratar un tipo de célula pero que tiene un efecto indeseable sobre otro tipo de célula, la invención proporciona un ensayo para determinar la base molecular del efecto indeseable y, por lo tanto, proporciona la oportunidad de coadministrar un agente antagonista o si no tratar el efecto indeseado. De igual forma, incluso dentro de un único tipo de célula, se pueden determinar los efectos biológicos indeseables a nivel molecular. Por lo tanto, se pueden determinar los efectos de un agente sobre la expresión de otro agente diferente al gen diana y contrarrestarlo.

En otra realización, se puede utilizar la matriz para monitorizar el transcurso de la expresión de uno o más genes en la matriz. Esto se puede producir en varios contextos biológicos, tal y como se describe en la presente memoria, por ejemplo, el desarrollo de una enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1, el progreso de la enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1 y los procesos, tales como la transformación celular asociada a la enfermedad o trastorno asociado a ACTR-1.

La matriz también es útil para averiguar el efecto de la expresión de un gen sobre la expresión de otros genes en la misma célula o en diferentes células (por ejemplo, averiguar el efecto de la expresión de ACTR-1 sobre la expresión de otros genes). Esto asegura, por ejemplo, la selección de dianas moleculares alternativas para la intervención terapéutica si no se puede regular la diana final o vía abajo.

La matriz también es útil para averiguar patrones de expresión diferenciales de uno o más genes en células normales y anormales. Esto proporciona una batería de genes (que, por ejemplo, incluye ACTR-1) que podría servir como una diana molecular para la intervención terapéutica o de diagnóstico.

Esta invención se ilustra adicionalmente con los Ejemplos siguientes que no se deben interpretar como limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y caracterización del ADNc de la ACTR-1 humana

En este Ejemplo, se describe la identificación y caracterización del gen que codifica la ACTR-1 humana (también denominado intercambiablemente como "clon 56919" o "GPAT humana" en la presente memoria).

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Aislamiento del ADNc de la ACTR-1 humana

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de genes que codifican nuevos miembros de la familia de la aciltransferasa. Se determinó la secuencia completa del clon 56919 humano y se halló que contenía un marco abierto de lectura denominado "ACTR-1" humano.

La secuencia nucleotídica que codifica la ACTR-1 humana se muestra en la figura 1 y se presenta como SEQ ID NO:1. La proteína codificada por este ácido nucleico comprende unos 828 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 y presentada como SEQ ID NO:2. La región codificante (marco abierto de lectura) de la SEQ ID NO:1 se presenta como SEQ ID NO:3.

Análisis de las moléculas de la ACTR-1 humana

La búsqueda de homología con la secuencia de aminoácidos y/o nucleotídica de la ACTR-1 humana reveló que la proteína era significativamente homóloga (92%) a la GPAT mitocondrial, lo que indica que el clon 56919 representa el gen de la GPAT mitocondrial humana. La GPAT mitocondrial (mGPAT) cataliza la etapa inicial de la biosíntesis de los triglicéridos. Se ha identificado que los triglicéridos son un factor de riesgo independiente para el desarrollo de la ateroesclerosis. En la bibliografía se han descrito inhibidores de la mGPAT de los roedores (moléculas pequeñas y endógenas) que presentan efectos reductores de los triglicéridos in vivo. Por lo tanto, se predice que la mGPAT humana desempeña una función clave en la regulación de la biosíntesis/metabolismo de los triglicéridos en los humanos. Además, se predice que la inhibición de la GPAT mitocondrial humana dará lugar a una disminución de la concentración de los triglicéridos en el suero, lo que a su vez resultará beneficioso para el tratamiento de la ateroesclerosis.

Se analizó la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana con el programa PSORT (http://www.psort.nibb.
ac.jp) para predecir la localización de la proteína dentro de la célula. Este programa evalúa la presencia de diferentes secuencias de aminoácidos de tránsito y de localización dentro de la secuencia de búsqueda. Los resultados de los análisis muestran que la ACTR-1 humana se puede localizar en el núcleo, la mitocondria o el citoplasma. Basándose en la homología con las GPAT de ratón y de rata, se cree que la ACTR-1 humana es mitocondrial.

Se realizó el análisis de la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana con MEMSAT. Este análisis dio lugar a la identificación de dominios transmembranarios en la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana en los restos 177-194, 330-354, 472-494 y 576-594 de la SEQ ID NO:2.

También se realizaron búsquedas con la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana en la base de datos HMM (Figura 3). Estas búsquedas dieron lugar a la identificación de un "dominio aciltransferásico" en aproximadamente los restos 215-412 de la SEQ ID NO:2 (puntuación = 126,1).

Se realizaron más búsquedas con la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana en la base de datos Prosite y dieron lugar a la identificación de varios sitios de fosforilación posibles dentro de la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana (SEQ ID NO:2). Se identificaron sitios de fosforilación de la proteína cinasa C en los restos 48-50, 57-59, 136-138, 321-323, 405-407, 414-416, 459-461, 549-551, 685-687 y 763-765; se identificaron sitios de fosforilación de la proteína cinasa dependiente AMPc y GMPc en los restos 107-110 y 798-801; se identificaron sitios de fosforilación de la caseína cinasa II en los restos 30-33, 232-235, 405-408, 448-451, 504-507, 550-553, 565-568, 657-660, 670-673 688-691, 761-764 y 801-804; y se identificó un sitio de fosforilación de la tirosina cinasa en los restos 358-364 de la ACTR-1 humana. La búsqueda también identificó la presencia de motivos de N-glucosilación en los restos de aminoácidos 95-98, 128-131, 135-138, 375-378, 450-453, 454-457 y 741-744; motivos de N-miristoilación en los restos de aminoácidos 123-128, 256-261, 499-504, 541-546 y 600-605; y un sitio de amidación en los restos de aminoácidos 285-288 de la ACTR-1 humana.

Una búsqueda con la secuencia de aminoácidos de la ACTR-1 humana realizada en la base de datos ProDom dio lugar al alineamiento local de las diferentes proteínas ACTR-1 humanas conocidas con proteínas glicerol-3-fosfato-aciltransferasa (Figura 4).

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Distribución tisular del ARNm de ACTR-1

Este Ejemplo describe la distribución tisular del ARNm de ACTR-1, que se puede determinar con el análisis de hibridación in situ. Para el análisis in situ, primero se congelan en hielo seco diferentes tejidos, por ejemplo, muestras de tejido humano o de ratón. Se fijan secciones de los tejidos de un grosor de 10 \mum con formaldehído al 4% en una disolución salina a 1X tamponada con fosfato y tratada con DEPC a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de enjuagarlas dos veces en una disolución salina a 1X tamponada con fosfato con DEPC y una vez en trietanolamina-HCl a 0,1 M (pH 8,0). Después de la incubación en anhídrido acético al 0,25%-clorhidrato de trietanolamina a 0,1 M durante 10 minutos, se enjuagan las secciones en SSC 2X con DEPC (SSC 1X es NaCl a 0,15 M más citrato de sodio a 0,015 M). A continuación se deshidrata el tejido a través de una serie de lavados con etanol, se incuba en cloroformo al 100% durante 5 minutos y luego se enjuaga en etanol al 100% durante 1 minuto y etanol al 95% durante 1 minuto, y se deja secar al aire.

Se realizan hibridaciones con sondas de ARNc radiomarcadas con ^{35}S (5 X 10^{7} cpm/ml). Se incuban las sondas en presencia de una disolución que contiene NaCl a 600 mM, Tris a 10 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, ADN de esperma de salmón cizallado al 0,01%, ARNt de levadura al 0,01%, ARN total de tipo X1 de levadura al 0,05%, disolución de Denhardt a 1X, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, ditiotreitol a 100 mM, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% y tiosulfato de sodio al 0,1% durante 18 h a 55ºC.

Después de la hibridación, los portaobjetos de lavan con SSC 2X. A continuación, las secciones se incuban secuencialmente a 37ºC en TNE (una disolución que contiene Tris-HCl a 10 mM (pH 7,6), NaCl a 500 mM y EDTA a 1 mM) durante 10 minutos, en TNE con 10 \mug/ml de ARNasa durante 30 min y, finalmente, en TNE durante 10 minutos. Después se enjuagan los portaobjetos con SSC 2X a temperatura ambiente, se lavan con SSC 2X a 50ºC durante 1 h, se lavan con SSC 0,2X a 55ºC durante 1 h y con SSC 0,2X a 60ºC durante 1 h. Entonces se deshidratan las secciones rápidamente a través de concentraciones en serie de etanol-acetato de sodio a 0,3 M antes de secarlas al aire y exponerlas a una película de radiografía científica Biomax MR de Kodak durante 24 h y, posteriormente, se sumergen en una fotoemulsión de NB-2 y se exponen a 4ºC durante 7 días antes de revelarlas y contrateñirlas.

Ejemplo 2 Expresión de la proteína ACTR-1 recombinante en células bacterianas

En este Ejemplo, la ACTR-1 humana se expresa como un polipéptido de fusión con la glutatión-S-transferasa (GST) recombinante en E. coli y se aísla y se caracteriza el polipéptido de fusión. Específicamente, se fusiona la ACTR-1 humana con GST y se expresa este polipéptido de fusión en E. coli, por ejemplo, cepa PEB199. Se induce con IPTG la expresión de la proteína de fusión GST-ACTR-1 en PEB 199. A partir de lisados bacterianos brutos de la cepa PEB 199 inducida se purifica el polipéptido de fusión recombinante por cromatografía de afinidad sobre perlas de glutatión. Con un análisis electroforético en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado de los lisados bacterianos, se determina la masa molecular del polipéptido de fusión resultante.

Ejemplo 3 Expresión de la proteína ACTR-1 recombinante en las células COS

Para expresar el gen de ACTR-1 en las células COS, se utiliza el vector pADNc/Amp de Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Este vector contiene un origen de replicación de SV40, un gen de resistencia a la ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor de CMV seguido de una región policonectora, y un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica toda la proteína ACTR-1 y una etiqueta HA (Wilson et al. (1984) Cell 37:767) o una etiqueta FLAG fusionada en fase al extremo 3' del fragmento se clona en la región policonectora del vector, lo que coloca la expresión de la proteína recombinante bajo el control del promotor de CMV.

Para construir el plásmido, se amplifica la secuencia del ADN de ACTR-1 por PCR utilizando dos cebadores. El cebador en 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido de aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia codificante de ACTR-1 que comienza a partir del codón de iniciación; la secuencia del extremo 3' contiene secuencias complementarias a otro sitio de restricción de interés, un codón de parada de la traducción, la etiqueta HA o la etiqueta FLAG, y los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificante de ACTR-1. El fragmento amplificado por PCR y el vector pADNc/Amp se digieren con las enzimas de restricción adecuadas y se desfosforila el vector con la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente, los dos sitios de restricción elegidos son diferentes, por lo que el gen de ACTR-1 se introduce en la orientación correcta. La mezcla de ligación se introduce por transformación en las células de E. coli (se pueden utilizar cepas HB101, DH5\alpha y SURE, disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se siembra en placas sobre placas de medio con ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. Se aísla el ADN plasmídico de los transformantes y se examina mediante un análisis de restricción para detectar la presencia del fragmento correcto.

Posteriormente, se transfectan las células COS con el plásmido ACTR-1-pcADN/ADN mediante el método de coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Se pueden encontrar otros métodos adecuados para transfectar células hospedadoras en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2.ª, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La expresión del polipéptido de ACTR-1 se detecta por radiomarcación (se puede utilizar la ^{35}S-metionina o la ^{35}S-cisteína disponible en NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) utilizando un anticuerpo monoclonal específico contra HA. Brevemente, se marcan las células durante 8 h con ^{35}S-metionina (o ^{35}S-cisteína). Luego, se recogen los medios de cultivo y se lisan las células utilizando detergentes (tampón RIPA: NaCl a 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC a 0,5%, Tris a 50 mM, pH 7,5). El lisado celular y el medio de cultivo de precipitan con un anticuerpo monoclonal específico contra HA. Luego, se analizan los polipéptidos precipitados mediante SDS-PAGE.

Alternativamente, se clona el ADN que contiene la secuencia codificante ACTR-1 directamente en el policonector del vector pADNc/Amp con los sitios de restricción adecuados. El plásmido resultante se introduce por transfección en células COS del modo descrito anteriormente, y se detecta la expresión del polipéptido ACTR-1 mediante radiomarcación e inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal específico contra ACTR-1.

Ejemplo 4 Distribución tisular del ARNm de la ACTR-1 humana mediante el análisis con TaqMan^{TM}

Este Ejemplo describe la distribución tisular del ARNm de la ACTR-1 humana en una serie de células y tejidos, que se determina con el procedimiento TaqMan^{TM}. El procedimiento Taqman^{TM} es un método basado en PCR cuantitativa con transcripción inversa para detectar el ARNm. La reacción de RT-PCR explota la actividad 5'-nucleasa de la ADN-polimerasa AmpliTaq Gold^{TM} para escindir una sonda TaqMan^{TM} durante la PCR. Brevemente, se genera el ADNc de las muestras de interés, por ejemplo, varias muestras de tejido humano, y se utilizan como la sustancia de partida para la amplificación por PCR. Además de los cebadores específicos del gen en 5' y 3', en la reacción se incluyó una sonda oligonucleotídica (por ejemplo, la sonda Taqman^{TM}) específica del gen (complementaria a la región a amplificar). La sonda TaqMan^{TM} incluye el oligonucleótido con un colorante indicador fluorescente unido al extremo en 5' de la sonda (tal como FAM [6-carboxifluoresceína], TET (6-carboxi-4,7,2',7'-tetraclorofluoresceína], JOE (6-carboxi-4,5-dicloro-2,7-dimetoxifluoresceína], o VIC) y un colorante extintor de fluorescencia (TAMRA [6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametilrodamina]) en el extremo 3' de la sonda.

Durante la reacción de PCR, la escisión de la sonda separa el colorante indicador y el colorante extintor de fluorescencia, lo que da lugar a un aumento de la fluorescencia del indicador. La acumulación de los productos de PCR se detecta directamente al monitorizar el aumento de la fluorescencia del colorante indicador. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante indicador al colorante extintor de fluorescencia da lugar a la supresión de la fluorescencia indicadora. Durante la PCR, si la diana de interés está presente, la sonda se alinea específicamente entre los sitios del cebador directo e inverso. La actividad nucleolítica de 5' a 3' de la ADN-polimerasa AmpliTaq^{TM} Gold escinde la sonda entre el indicador y el extintor de fluorescencia sólo si la sonda se hibrida a la diana. A continuación, los fragmentos de la sonda se retiran de la diana y continúa la polimerización de la hebra. Se bloquea el extremo 3' de la sonda para prevenir la extensión de la sonda durante la PCR. Este procedimiento se produce en cada ciclo y no interfiere con la acumulación exponencial del producto. Se preparó el ARN utilizando el método con trizol y se trató con ADNasa para retirar el ADN genómico contaminante. Se sintetizó el ADNc mediante las técnicas estándares. La falsa síntesis de ADN en ausencia de la transcriptasa inversa dio lugar a muestras en las que no se detectaba la amplificación por PCR del gen de control, lo que confirma la retirada eficaz de la contaminación del ADN genómico.

Tal y como se indica en las Figuras 7 y 8, se detectó la expresión fuerte de ACTR-1 en los tejidos normales del hígado, corazón, cerebro y el tejido adiposo. Además, tal y como se indica en la Figura 9, se detectó la expresión fuerte de ACTR-1 a lo largo de un amplio panel de muestras de tejido hepático humano.

Ejemplo 5 Inducción de ACTR-1 in vivo en un modelo de colestiramina de mono tití

Además del análisis bioinformático, los estudios de TxP indican que MINE 56919 se induce in vivo en el modelo de colestiramina de mono tití (Figuras 10 A y B). La colestiramina es el tratamiento actual para el tratamiento de la hipercolesterolemia. La colestiramina es una resina soluble que actúa secuestrando los ácidos biliares y favoreciendo su excreción del cuerpo. Esto hace aumentar la conversión del colesterol en ácidos biliares con el beneficio último de disminuir el colesterol en el suero total (CT). Sin embargo, se ha demostrado que el tratamiento de la colestiramina a corto plazo da lugar a un aumento de la cantidad de triglicéridos en el suero (Garg A, Grundy S. M. (1994) Ann Intern Med 121:416-22; Kuroki S et al., (1999) Lipids 34: 817-23). La inducción de 56919, la mGPAT humana predicha, en el modelo de colestiramina de mono tití es coherente con que este gen realice una función clave en la regulación de la biosíntesis de los triglicéridos.

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar mediante la experimentación habitual, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria.

<110> MILLENNIUM PHARMACEUTICALS, INC., et al.

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<120> 56919, UNA NUEVA ACILTRANSFERASA HUMANA Y LOS USOS DE LA MISMA

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<130> MNI-186PC

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<140>

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<141>

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<150> 60/226.509

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<151> 21-08-2000

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<160> 3

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<170> PatentIn, versión 2.0

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<210> 1

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<211> 3003

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (341)...(2827)

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<221> característica miscelánea

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<222> (1)...(3003)

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 1

1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 828

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

6

7

8

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<210> 3

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<211> 2484

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 3

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9

10

Claims

1. Método para identificar un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama, que comprende:

a): poner en contacto una primera muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 ó 3.

b): detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra que se hibrida con la sonda;

c): poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 ó 3;

d): detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra que se hibrida con la sonda;

e): comparar el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra,

en el que una disminución del nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha sonda de hibridación se detecta por su marcación.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha detección es por hibridación in situ.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha detección es por hibridación de tipo Northern.

5. Método para identificar un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama que comprende:

a): poner en contacto una primera muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y segundo cebador de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 ó 3 y comprendiendo el segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos complementaria de la SEQ ID NO:1 ó 3;

b): incubar la muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico;

c): poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y segundo cebador de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 ó 3 y comprendiendo el segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia complementaria de la SEQ ID NO:1 ó 3;

d): incubar la muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico;

e): comparar el nivel de amplificación del ácido nucleico en la primera muestra respecto al nivel de amplificación del ácido nucleico en la segunda muestra

en el que una disminución en el nivel de la amplificación del ácido nucleico en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, en el que dicho método se utiliza para detectar el ARNm en dicha muestra.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, en el que dicho método se utiliza para detectar el ADN genómico en dicha muestra.

8. Un método para identificar un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama, que comprende:

a): poner en contacto una primera muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO:2;

b): detectar la presencia de un polipéptido en la muestra que se une al anticuerpo;

c): poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se une al polipéptido de la SEQ ID NO:2;

d): detectar la presencia de un polipéptido en la muestra que se une al anticuerpo;

e): comparar el nivel de la unión al anticuerpo en la primera muestra respecto al nivel de la unión al anticuerpo en la segunda muestra,

en el que una disminución del nivel de la unión al anticuerpo en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un tumor de mama o que corre el riesgo de desarrollar un tumor de mama.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo se detecta por su marcación.

10. Método para diagnosticar un tumor de mama en una muestra obtenida de un sujeto, que comprende:

evaluar la expresión o la actividad de una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 ó 3 o un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico en la muestra, de tal forma que una disminución en el nivel del ácido nucleico o del polipéptido respecto a un sujeto normal o una cohorte de sujetos normales es indicativa de un tumor de mama.

11. Método para identificar un compuesto capaz de tratar un tumor de mama que comprende ensayar la capacidad que el compuesto tiene para aumentar la expresión de la molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica presentada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3;

b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:2;

c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos idéntica al 90% a la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3, o una secuencia complementaria de la misma;

d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos un 93% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y

e) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en la que el fragmento comprende los restos de aminoácidos 215 a 412 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, por lo que se identifica dicho compuesto capaz de tratar un tumor de mama en un sujeto.

12. Método para identificar un compuesto capaz de tratar un tumor de mama que comprende ensayar la capacidad del compuesto para aumentar la actividad de un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

a): un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en la que el fragmento comprende los restos de aminoácidos 215 a 412 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2;

b): un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es idéntica al menos en un 90% al ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO:1 ó 3;

c): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos al 93% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2;

d): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, por lo que identifica a dicho compuesto capaz de tratar un tumor de mama en un sujeto.

13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en el que el ensayo es un ensayo con células en el que una célula que expresa el polipéptido se pone en contacto con el compuesto a analizar.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la célula es una célula de tumor de mama.