ES2318079T3 - Metodos para el diagnostico del cancer pancreatico y composicones uti les en los mismos. - Google Patents
Metodos para el diagnostico del cancer pancreatico y composicones uti les en los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2318079T3 ES2318079T3 ES03024982T ES03024982T ES2318079T3 ES 2318079 T3 ES2318079 T3 ES 2318079T3 ES 03024982 T ES03024982 T ES 03024982T ES 03024982 T ES03024982 T ES 03024982T ES 2318079 T3 ES2318079 T3 ES 2318079T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- baselineskip
- nucleic acid
- compound
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57525—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the liver or pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Un método para determinar in vitro la presencia o ausencia de cáncer pancreático en un paciente, que comprende (i) detectar en la muestra biológica de un paciente una cantidad de un polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2, y (ii) comparar la cantidad de polipéptido con un valor estándar predeterminado indicando la línea de decisión entre presencia inducida por el tumor o no inducida por el tumor del polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2 en la célula, y a partir de ello determinar la presencia o ausencia de cáncer pancreático en el paciente, en el que la sobreexpresión es específica de células tumorales pancreáticas.
Description
Métodos para el diagnóstico del cáncer
pancreático y composiciones útiles en los mismos.
La invención está relacionada con el diagnóstico
específico del cáncer pancreático.
El cáncer pancreático es un tipo de cáncer que
es difícil de diagnosticar y de controlar, y la mayoría de estos
cánceres pueden crecer muy rápidamente.
Las neoplasias de páncreas exocrino pueden
surgir a partir de células ductales, acinares o del estroma. El 80%
de los carcinomas pancreáticos derivan del epitelio ductal. El 60%
de estos tumores están localizados en la cabeza del páncreas, el
10% en la cola y el 30% están localizados en el cuerpo del páncreas
o son difusos ((Warshau:, A.L., y Fernandez-del,
C.C., N. Engl. J. Med. 326 (1992) 4555-4565).
Histológicamente, estos tumores se clasifican además en
diferenciados, moderadamente diferenciados y pobremente
diferenciados. Algunos tumores se clasifican como adenoescamosos,
mucinosos, indiferenciados o indiferenciados con células gigantes
tipo osteoblasto (Gibson, J.B., y Sobin, L.H., Histological typing
of tumors, of the liver, biliary tract and pancreas, WHO, Geneva,
1978). Puesto que la enfermedad es asintomática en sus fases
tempranas, y a causa de la falta de alguna prueba de diagnóstico
precoz y a su carácter agresivo respecto a la metástasis local y en
órganos viscerales, esta enfermedad se asocia con muy mal
pronóstico. Sólo el 20% de los tumores son extirpables y la mejora
en la supervivencia de los regímenes quimioterapéuticos aprobados es
bastante pobre (Kroep, J.R., et al., Ann. Oncol. 10, Supl. 4
(1999) 234-238). La identificación de nuevas dianas
para el diagnóstico precoz de los tumores pancreáticos es por lo
tanto un reto de suma importancia.
La WO 02/08288 describe unos polipéptidos
secretados y transmembranales, y los ácidos nucleicos que los
codifican. La Fig. 130 muestra la secuencia polipeptídica de
UKW.
Sorprendentemente se encontró que los ácidos
nucleicos que codifican el polipéptido UKW están sobreexpresados
específicamente en las células tumorales pancreáticas, mientras que
la expresión es considerablemente menor en las células pancreáticas
normales o en células tumorales de otro origen, por ejemplo, células
de cáncer de pulmón o de cáncer de colon. Por lo tanto, UKW es una
nueva diana valiosa para el diagnóstico específico.
La presente invención por lo tanto proporciona
un método para determinar la presencia o ausencia de cáncer
pancreático en un paciente, que comprende
(i) obtener una muestra biológica del
paciente
(ii) detectar en la muestra una cantidad de
ácido nucleico que codifica UKW o una cantidad de polipéptido UKW;
y
(iii) comparar la cantidad de ácido nucleico o
polipéptido con un valor estándar predeterminado que indique la
línea de decisión entre expresión de UKW inducida por un tumor o no
inducida por un tumor o la presencia en la célula, y a partir de
ello determinar la presencia o ausencia de cáncer pancreático en el
paciente.
Preferiblemente, la detección se realiza
mediante la utilización de un agente de unión que se une al ácido
nucleico o al polipéptido UKW. Más preferiblemente, el agente de
unión es una sonda que hibrida bajo condiciones astringentes con el
ácido nucleico de UKW, o un anticuerpo, preferiblemente un
anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido UKW,
preferiblemente al dominio extracelular.
Además, la presente invención proporciona un
proceso para determinar si una muestra de tejido o fluido de un
paciente contiene o no células tumorales pancreáticas o deriva de
células tumorales pancreáticas, en el que se usa la muestra de
prueba y una segunda muestra que tiene su origen en células no
tumorales pancreáticas del mismo individuo o un individuo diferente
de la misma especie, y que comprende los siguientes pasos:
(a) incubar cada muestra respectiva bajo
condiciones de hibridación restrictivas con una sonda de ácido
nucleico que se selecciona de entre el grupo que consta de:
- (i)
- una secuencia de ácido nucleico de Id. de Sec. Nº: 1, o un fragmento de la misma;
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a cualquier secuencia de ácido nucleico de (i);
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de (i); y
- (iv)
- una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de (ii); y
(b) determinar la cantidad aproximada de
hibridación de cada muestra respectiva con dicha sonda, y
(c) comparar la cantidad aproximada de
hibridación de la muestra de prueba con la cantidad aproximada de
hibridación de dicha segunda muestra para identificar si la muestra
contiene o no una cantidad mayor del ácido nucleico específico o
mezcla de ácidos nucleicos que dicha segunda muestra.
La invención también incluye un método para la
detección de tumores pancreáticos, que comprende
(a) incubar una muestra de un paciente que se
sospecha que padece cáncer pancreático, seleccionada de entre el
grupo de fluidos corporales, células, de un extracto celular o de
sobrenadantes de cultivos celulares de dichas células, en la que
dicha muestra contiene ácidos nucleicos, con una sonda de ácido
nucleico que se selecciona del grupo que consiste en
- (i)
- el ácido nucleico mostrado en Id. de Sec. Nº: 1 o un ácido nucleico que es complementario a dicha secuencia, y
- (ii)
- ácidos nucleicos que hibridan con uno de los ácidos nucleicos de (i) y
(b) detectar la hibridación; preferiblemente por
medio de otra pareja de unión del ácido nucleico de la muestra y/o
la sonda del ácido nucleico o por radiografía de rayos X.
Ambos métodos pueden realizarse también
utilizando anticuerpos, detectándose el polipéptido UKW por la
interacción entre el anticuerpo y el polipéptido.
La invención también proporciona un método para
monitorizar la progresión del cáncer pancreático en el paciente. En
tal método, la cantidad de ácido nucleico o polipéptido UKW en una
muestra biológica (por ejemplo, fluidos corporales como sangre,
lisados celulares o un transcrito reverso de una muestra de RNA) de
un paciente que padece cáncer pancreático se determina en al menos
dos puntos diferentes en tiempo y se comparan. La información de la
progresión de dicho cáncer pancreático se puede deducir por el
cambio de la cantidad.
La invención también proporciona equipos de
diagnóstico que comprenden una o más sondas o cebadores
oligonucleótidos para la hibridación con el ácido nucleico de UKW
en un ensayo diagnóstico utilizando una muestra obtenida de un
paciente afectado o del que se sospecha que padece cáncer
pancreático.
La invención también comprende la utilización de
anticuerpos contra el polipéptido de UKW.
Como se utiliza aquí, el término "UKW" se
refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Id. de
Sec. Nº: 2; preferiblemente la secuencia de DNA y la secuencia de
mRNA relacionado de Id. de Sec. Nº: 1, además del polipéptido
codificado por el Id. de Sec. Nº: 2. Puesto que UKW es una proteína
receptora transmembranal, el polipéptido es de excepcional interés
para el diagnóstico y es preferible como epítopo para los
anticuerpos que se unen al dominio extracelular de los polipéptidos
de UKW. Por lo tanto, se prefiere dirigir la muestra de ácido
nucleico y las sondas a esa región, y especialmente a partes de la
misma que poseen baja homología con otros genes y polipéptidos.
El receptor UKW es una proteína transmembranal
compuesta de 373 aminoácidos con una secuencia señal de 18
aminoácidos. El receptor consiste en un dominio extracelular de 215
aminoácidos, un dominio transmembrana de 23 aminoácidos y un
dominio citoplasmático de 117 aminoácidos. Los dominios
extracelulares exponen dos pliegues tipo C2 de inmunoglobulina
compuestos de 93 aminoácidos y 72 aminoácidos.
La frase "ácido nucleico o polipéptido"
usada a lo largo de esta solicitud se refiere a un ácido nucleico o
polipéptido que tiene una actividad UKW, que está sustancialmente
libre del material celular, o del medio de cultivo cuando se
produce por técnicas de DNA recombinante, o sustancialmente libre de
precursores químicos u otros productos químicos cuando se
sintetizan químicamente. Tal ácido nucleico preferiblemente está
libre de secuencias que en la naturaleza flanquean el ácido
nucleico (por ejemplo las secuencias localizadas en los extremos 5'
y 3' del ácido nucleico) en el organismo del que deriva el ácido
nucleico.
Las "sondas y cebadores de ácidos nucleicos
para UKW", tal y como se utiliza aquí, se refiere a fragmentos
de ácidos nucleicos útiles para la detección de los ácidos nucleicos
de UKW mediante métodos de hibridación. Las técnicas y condiciones
de hibridación son bien conocidas para los expertos en la materia.
Tales condiciones de hibridación son, por ejemplo, condiciones
moderadamente astringentes, lo que incluye el lavado con una
solución de 5 x SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mmol/l, pH 8,0, seguido
de una hibridación a 50-60ºC con 5 x SSC toda la
noche, lavado a temperatura ambiente durante 40 minutos con 2 x SSC
que contiene SDS al 0,1% y después un lavado con 0,1 x SSC, SDS al
0,1% a 50ºC durante 40 min. con un cambio de solución nueva. También
es posible utilizar temperaturas más elevadas para la hibridación
(por ejemplo, 65-70ºC) como condiciones de
hibridación altamente astringentes. La sonda y los cebadores de
ácido nucleico normalmente consisten en un segmento del ácido
nucleico de UKW de al menos unas 50 posiciones consecutivas, más
preferiblemente de 200 a 300 nucleótidos. La optimización de las
sondas y los cebadores puede realizarse de acuerdo con el estado de
la materia. Existe un programa informático
(http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)
que se usa generalmente para el diseño de tales sondas y
cebadores.
\global\parskip0.870000\baselineskip
Para una elevada selectividad es preferible
utilizar condiciones de salinidad relativamente baja y/o alta
temperatura, por ejemplo, una concentración de sal de alrededor de
0,02 mol/l a alrededor de 0,15 mol/l y temperaturas desde alrededor
de 50ºC a alrededor de 70ºC.
Los polipéptidos de UKW pueden identificarse en
ensayos de diagnóstico utilizando sondas y cebadores específicos.
Normalmente tales métodos incluyen la amplificación de la secuencia
diana en la muestra mediante métodos de amplificación tales como el
método de PCR. La detección cuantitativa puede realizarse con
técnicas de PCR, preferiblemente mediante el uso de la
RT-PCR cuantitativa, utilizando por ejemplo el
termociclador LightCycler® de Roche Diagnostics GmbH, DE.
En una realización preferida de la invención, el
ácido nucleico codificante de la muestra se amplifica antes de la
prueba, por ejemplo mediante la conocida técnica de PCR. Normalmente
se utiliza una sonda de ácido nucleico derivada (marcada) en el
marco del diagnóstico por ácidos nucleicos. Esta sonda se pone en
contacto con un DNA, RNA o RT-DNA desnaturalizado
de la muestra que se une a un transportador y en ese proceso se
seleccionan la temperatura, fuerza iónica, pH y otras condiciones
del tampón dependiendo de la longitud y composición de la sonda de
ácido nucleico y de la temperatura de fusión resultante del híbrido
esperado, de forma que el DNA o RNA marcados pueden unirse a DNA o
RNA homólogo (hibridación, véase también Wahl, G.M., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687).
Los transportadores apropiados son membranas o materiales
transportadores basados en la nitrocelulosa (por ejemplo,
Schleicher y Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C.), nitrocelulosa
reforzada o unida en forma de polvo, o membranas de nailon
modificadas con varios grupos funcionales (por ejemplo, grupos
nitro) (por ejemplo, Schleicher y Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen;
Amersham Hybond M.; Pall Biodyne).
Para determinar si una muestra contiene células
tumorales pancreáticas, se determina la cantidad aproximada de
hibridación del ácido nucleico con el ácido nucleico o ácidos
nucleicos diana. No es necesario determinar cuantitativamente la
cantidad aproximada de hibridación, aunque se incluye una
determinación cuantitativa en la presente invención. Típicamente,
la cantidad aproximada de hibridación se determina cualitativamente,
por ejemplo, mediante una inspección ocular tras la detección de la
hibridación. Por ejemplo, si se usa un gel para diferenciar el
ácido nucleico marcado que hibrida con el ácido nucleico diana en la
muestra, la banda resultante puede examinarse visualmente. Cuando
se realiza una hibridación del ácido nucleico aislado que está
libre de células tumorales pancreáticas de un individuo de la misma
especie, se sigue el mismo protocolo. Se puede comparar la cantidad
aproximada de hibridación en la muestra con la cantidad aproximada
de hibridación en la muestra libre de células tumorales
pancreáticas, para identificar si la muestra contiene o no una
cantidad mayor de ácido nucleico o ácidos nucleicos diana que una
muestra que está libre de células tumorales pancreáticas.
En otro método de acuerdo con la invención no se
utiliza una segunda muestra. Para detectar si el gen UKW está
sobreexpresado, se compara el nivel de mRNA de UKW con el nivel de
RNA de un gen estándar (gen de mantenimiento de la célula (ver, por
ejemplo, Shaper; N.L., et al., J. Mammary Gland Biol.
Neoplasia 3 (1998) 315-324; Wu, Y.Y., y Rees, J.L.,
Acta Derm. Venereol. 80 (2000) 2-3), preferiblemente
mediante RT-PCR.
Como se ha demostrado de acuerdo con la presente
invención, el ácido nucleico de UKW se expresa en mayor cantidad en
una muestra tumoral pancreática que en una muestra libre de células
tumorales pancreáticas y/o en una cantidad mayor que un gen de
mantenimiento. Una muestra de prueba que contenga células tumorales
pancreáticas tendrá una cantidad mayor de ácido nucleico de UKW que
una muestra que está libre de células tumorales pancreáticas. Para
identificar si una muestra de prueba contiene el ácido nucleico de
UKW sobreexpresado, es decir, cuando las células son células
tumorales pancreáticas o son células tumorales de un carcinoma
mamario, es preferible que la muestra de prueba tenga una cantidad
aproximada de ácido nucleico de UKW que sea notablemente superior a
la cantidad aproximada en una muestra libre de células tumorales
pancreáticas. Por ejemplo, una muestra de prueba que tenga un gen
UKW sobreexpresado puede contener una cantidad del gen UKW entre
aproximadamente 15 y aproximadamente 60 veces superior a la de una
muestra libre de células tumorales pancreáticas, o al menos una
cantidad tres veces superior del mRNA de UKW que de un mRNA de un
gen de mantenimiento como la
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) o la porfobilinógeno desaminasa.
Los expertos en la materia conocen los métodos
de hibridación de una sonda y un ácido nucleico y se describen, por
ejemplo, en la WO 89/06698, EP-A 0 200 362, US
2.915.082, EP-A 0 063 879, EP-A 0173
251, EP-A 0128 018.
El DNA o RNA hibridado se detecta entonces
mediante la incubación del transportador con un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo tras lavados y una saturación exhaustivos
para prevenir uniones inespecíficas. El anticuerpo o el fragmento
de anticuerpo son dirigidos hacia la sustancia incorporada en la
sonda de ácido nucleico durante la hibridación. El anticuerpo está
a su vez marcado. Sin embargo, también es posible usar DNA marcado
directamente. Después de la incubación con los anticuerpos se lava
de nuevo para detectar sólo los conjugados de anticuerpo unidos
específicamente. La determinación se lleva a cabo entonces de
acuerdo con los métodos conocidos, mediante el marcaje del
anticuerpo o el fragmento de anticuerpo.
La detección de la expresión puede llevarse a
cabo por ejemplo mediante:
hibridación in situ con células completas
fijadas, con frotis de tejido fijados,
- hibridación de una colonia (células) e
hibridación de calvas (fagos y virus).
- hibridación Southern (detección de DNA),
- hibridación Northern (detección de RNA),
- análisis del suero (por ejemplo, análisis del
tipo celular de las células del suero mediante análisis de
slot-blot),
- posterior amplificación (por ejemplo, técnica
de PCR).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención
son por lo tanto valiosos marcadores en el diagnóstico y
caracterización de tumores pancreáticos.
De acuerdo con la invención los inhibidores de
la expresión de UKW (por ejemplo, anticuerpos o nucleótidos
antisentido) pueden utilizarse para inhibir la progresión de un
tumor pancreático in vivo.
La invención también proporciona métodos para la
identificación y aislamiento de antagonistas de UKW o inhibidores
de la expresión de UKW (por ejemplo, anticuerpos o nucleótidos
antisentido). Tales antagonistas o inhibidores pueden utilizarse
para inhibir la progresión de un tumor pancreático y causar una
apoptosis masiva de las células tumorales pancreáticas in
vivo.
De acuerdo con la invención, se proporcionan
métodos para la identificación y aislamiento de antagonistas de UKW
que tienen utilidad en el tratamiento del cáncer. Esos métodos
incluyen los métodos para modular la expresión de los polipéptidos
de acuerdo con la invención, métodos para identificar los
antagonistas de UKW que pueden unirse selectivamente a la proteína
de acuerdo con la invención, y métodos de identificación de
antagonistas de UKW que pueden modular la actividad de dichos
polipéptidos. Los métodos también incluyen los métodos para
modular, preferiblemente inhibir, la transcripción del gen UKW a
RNAm. Esos métodos pueden realizarse in vitro o in
vivo y pueden utilizar líneas celulares establecidas y los
modelos de animales transgénicos de la invención.
Un antagonista de UKW se define como una
sustancia o compuesto que disminuye o inhibe la actividad biológica
de UKW o un polipéptido, y/o inhibe la transcripción o traducción
del gen UKW. En general, los procedimientos de cribado de
antagonistas de UKW implican poner en contacto las sustancias
candidatas con células huésped en las cuales la capacidad invasiva
es mediada por la expresión de UKW, bajo condiciones favorables para
medir la actividad de UKW.
La actividad de UKW puede medirse de varias
formas. Típicamente, la activación es aparente por un cambio en la
fisiología celular, como una movilidad y capacidad invasiva
aumentada in vitro, por un cambio en el estado de
diferenciación, o por un cambio en el metabolismo celular que
conduce a un aumento de la proliferación.
Los polipéptidos de UKW pueden obtenerse por
métodos recombinantes o de forma sintética. Cuando se produce de
forma recombinante en procariotas, se obtiene un polipéptido de UKW
no glucosilado. Con ayuda de las secuencias de ácidos nucleicos
proporcionadas en la invención es posible buscar el gen UKW o sus
variantes en el genoma de cualquier célula deseada (por ejemplo,
además de en células humanas, en células de otros mamíferos), para
identificarlos y aislar el gen deseado que codifica las proteínas
UKW. Tales procesos y las condiciones de hibridación apropiadas son
conocidas para un experto en la materia y se describen, por ejemplo,
en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, y Hames,
B.D., Higgins, S.G., Nucleic Acid Hybridisation - A Practical
Approach (1985) IRL Press, Oxford, England. En este caso los
protocolos estándar descritos en estas publicaciones se usan
normalmente para los experimentos.
Con la ayuda de tales ácidos nucleicos que
codifican un polipéptido de UKW, puede obtenerse el polipéptido de
acuerdo con la invención de una manera reproducible y en grandes
cantidades. Para la expresión en organismos procariotas y
eucariotas, tales como células huésped procariotas o células huésped
eucariotas, el ácido nucleico se integra en los vectores de
expresión apropiados, de acuerdo con métodos conocidos para un
experto en la materia. Tal vector de expresión preferiblemente
contiene un promotor regulable/inducible. Estos vectores
recombinantes entonces se introducen para la expresión en células
huésped adecuadas tales como, por ejemplo, E. coli como
célula huésped procariota o Saccharomyces cerevisae, la línea
celular de teratocarcinoma PA-1, sc 9117 (Biittner,
R., et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991)
3573-3583), células de insecto o células CHO o COS
como células huésped eucariotas, y las células huésped transformadas
o transducidas se cultivan bajo condiciones que permiten la
expresión del gen heterólogo. El aislamiento de la proteína puede
llevarse a cabo según métodos conocidos a partir de la célula
huésped o a partir del sobrenadante de cultivo de la célula huésped.
Tales métodos se describen por ejemplo en Ausubel I., Frederick M.,
Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley and Sons, New
York. También puede ser necesaria una reactivación in vitro
de la proteína si no se encuentra en forma soluble en el cultivo
celular.
El polipéptido de UKW o los fragmentos del mismo
pueden purificarse tras su producción recombinante mediante
cromatografía de afinidad utilizando técnicas de purificación de
proteínas conocidas, lo que incluye la inmunoprecipitación,
filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico,
cromatoenfoque, isoelectroenfoque, precipitación selectiva,
electroforesis o similares, y pueden utilizarse para la generación
de anticuerpos contra UKW.
La invención también comprende vectores de
expresión recombinantes que son apropiados para la expresión de
UKW, células huésped recombinantes transfectadas con tales vectores
de expresión, así como un proceso para la producción recombinante
de una proteína codificada por el gen UKW.
La invención también comprende un método de
cribado para identificar un compuesto que inhibe la actividad
biológica del polipéptido de UKW y que comprende:
poner en contacto dicho polipéptido con un
compuesto o una variedad de compuestos bajo condiciones que permiten
la interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido; y
detectar la interacción entre dicho compuesto o
variedad de compuestos con dicho polipéptido.
La invención también comprende un método de
cribado para identificar un compuesto que inhibe la actividad
biológica del polipéptido de UKW o inhibe la transcripción o
traducción del gen UKW, que comprende:
poner en contacto dicho compuesto o variedad de
dichos compuestos con una célula huésped en la cual la capacidad
invasiva está mediada por la expresión de UKW; y
detectar la interacción entre dicho compuesto o
variedad de compuestos con dicha célula huésped.
La invención también comprende un método de
cribado de acuerdo con la invención, en el que la detección de la
interacción entre dicho compuesto o variedad de compuestos con dicha
célula huésped se mide al menos por un cambio en la fisiología
celular, un cambio en el estado de diferenciación, o un cambio en el
metabolismo celular que conduce a un aumento de la
proliferación.
La invención también comprende un método de
cribado para la identificación de un compuesto que es un antagonista
del polipéptido de UKW y que comprende:
poner en contacto dicho polipéptido de UKW con
un compuesto bajo condiciones que permiten la interacción de dicho
compuesto con dicho polipéptido;
determinar un primer nivel de actividad de dicho
polipéptido;
determinar un segundo nivel de actividad de
dicho polipéptido expresado en un huésped que no se ha puesto en
contacto con dicho compuesto; y
relacionar cuantitativamente el primer nivel de
actividad con el segundo nivel de actividad, y cuando dicho primer
nivel de actividad es menor que dicho segundo nivel de actividad,
dicho compuesto se identifica como un antagonista de dicho
polipéptido.
Los anticuerpos contra UKW pueden producirse de
acuerdo con los métodos conocidos en la materia. Por ejemplo,
pueden producirse anticuerpos monoclonales o policlonales utilizando
un polipéptido de alrededor de 10 a 100 aminoácidos de la secuencia
del polipéptido de UKW. Los polipéptidos apropiados derivados de UKW
incluyen preferiblemente aminoácidos del dominio
\hbox{extracelular, preferiblemente los aminoácidos
70-80, 99-113,
120-140 y 167-182.}
Los anticuerpos resultantes pueden cribarse por
su capacidad de unirse a UKW utilizando técnicas estándar, tales
como ensayos de inmunoabsorventes acoplados a enzimas. Los métodos
para identificar epítopos antigénicos y para la producción de
anticuerpos se describen por ejemplo en Mole, "Epitope
Mapping", en: Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson
(ed.), págs. 105-116, The Humana Press, Inc., 1992;
Price, "Production and Characterization of Synthetic
Peptide-Derived Antibodies", en: Monoclonal
Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application,
Ritter y Ladyman (Ed.), págs. 60-84, Cambridge
University Press, 1995; Morris (Ed.), Epitope Mapping Protocols 25,
Humane Press, Inc., 1996; y Coligan et al. (Ed.), Current
Protocols in Immunology, págs. 9.3.1-9.3.5 y págs.
9.4.1-9.4.11, John Wiley & Sons, 1997.
Los anticuerpos que son útiles de acuerdo con la
invención pueden identificarse porque reducen la proliferación y el
potencial invasivo de las células tumorales pancreáticas. Con este
propósito, se tratan las células tumorales pancreáticas o una línea
celular de tumor pancreático, preferiblemente la línea celular
SUIT-2 007, con un anticuerpo contra UKW y se mide
la proliferación y el potencial invasivo mediante el reactivo Cell
Proliferation Reagent WST-1 (un reactivo de sal de
tetrazolio, de Roche Diagnostics GmbH, DE) y el ensayo de invasión
Matrigel (BDS Biosciences, www.bdbiosciences.com).
Los anticuerpos anti-UKW pueden
derivarse de cualquier especie animal o ser anticuerpos quiméricos o
humanizados. Son especialmente preferibles los anticuerpos humanos.
Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen, por ejemplo, a
partir de ratones transgénicos que han sido manipulados mediante
ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos
en respuesta a una exposición al antígeno. En esta técnica, se
introducen elementos del locus de la cadena pesada y ligera humanas
en cepas de ratón derivadas de líneas de células madre embrionarias
que contienen una disrupción localizada en los loci de la cadena
pesada y la cadena ligera endógenas. El ratón transgénico puede
sintetizar anticuerpos humanos específicos de antígenos humanos, y
este ratón puede utilizarse para producir hibridomas que secretan
anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a
partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, en Green,
L. L., et al., Nat. Genet. 7 (1994) 13-21;
Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994)
856-859; y Taylor, L. D., et al. Int. Immun.
6 (1994) 579-591.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y
purificarse a partir de los cultivos de hibridoma mediante una
variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de
aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con
proteína-A Sepharosa, cromatografía de exclusión por
tamaño y cromatografía por intercambio iónico (véase, por ejemplo,
Coligan en las págs. 2.7.1-2.7.12 y págs.
2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification
of Immunoglobulin G (IgG)", en: Methods in Molecular Biology,
Vol. 10, págs. 79-104, The Humana Press, Inc.,
1992).
Los anticuerpos pueden utilizarse en
inmunoensayos de acuerdo con la invención. La detección puede
realizarse poniendo en contacto una muestra biológica con un
anticuerpo, y luego poniendo en contacto la muestra biológica con
una molécula marcada detectable, que se une al anticuerpo. El
anticuerpo puede conjugarse con avidina/estreptavidina (o biotina) y
la molécula marcada detectable puede comprender biotina (o
avidina/estreptavidina). Los expertos en la materia conocen
numerosas variaciones de esta técnica básica. Los marcajes
detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un
marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje
enzimático, un marcaje bioluminiscente u oro coloidal. Los expertos
en la materia conocen los métodos para obtener y detectar tales
inmunoconjugados marcados detectables y se describen con más detalle
a continuación.
Los ejemplos siguientes, referencias, listado de
secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a una mejor
comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se
expone en las reivindicaciones anexas.
Figura 1 Expresión diferencial del mRNA de UKW
en las líneas celulares de tumor pancreático SUIT-2
007 y SUIT-2 028 analizada mediante análisis de
Northern blot.
(a: línea celular de tumor pancreático
SUIT-2 007; b: línea celular de tumor pancreático
SUIT-2 028)
Figura 2 Chip de expresión de múltiples tejidos
(MTE^{TM}) (Clontech, Palo Alto, CA, USA). Este chip contiene
cargas normalizadas de RNA-Poli A^{+} de 76
tejidos diferentes además de RNA y DNA control, y permite un
cribado de la presencia y abundancia relativa de un mRNA diana en un
amplio espectro de tejidos fetales y adultos. H6 corresponde a 1
\mug de RNA total de la línea celular de tumor pancreático
SUIT-2 007. El código se expone a continuación.
Figura 3 Expresión relativa de RNA (Taqman©-PCR)
en muestras derivadas de adenocarcinoma de páncreas (PaCa),
pancreatitis crónica (ChronPa) y en tejidos pancreáticos normales
(NorPA).
Figura 4 Expresión relativa del mRNA de UKW en
líneas celulares de tumores pancreáticos invasivos y no
invasivos.
Figura 5 Expresión relativa del mRNA de UKW en
líneas celulares de tumores mamarios invasivos y no invasivos.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se cargaron 10 \mug de RNA total de las líneas
celulares SUIT-2 007 y SUIT-2 028
una al lado de la otra en un gel desnaturalizante de agarosa
formaldehído al 1% y se separaron por tamaño mediante
electroforesis. Se realizó una transferencia a la membrana de
nailon cargada positivamente BrightStar-Plus^{TM}
mediante una transferencia por capilaridad descendente. Tras el
entrecruzamiento por rayos UV (Stratagene UV Stratalinker 2400), se
hibridó la transferencia. El producto de RT-PCR se
marcó con \alpha-[^{32}P]dATP hasta una actividad
específica de 2 x 10^{9} cpm/\mug utilizando el equipo
Strip-EZ^{TM} DNA Kit (Ambion Inc., Austin,
Texas). La pre-hibridación (30 min.) y la
hibridación (toda la noche) con la sonda radioactiva se realizó en
la solución ExpressHyb^{TM} Hibridization Solution (Clontech,
Palo Alto, CA, USA) a 68ºC. Se lavó la membrana en la solución 1 (2
x SSC, SDS al 0,05%) a temperatura ambiente durante
30-40 min. con agitación y varios reemplazos de la
solución de lavado 1 seguido de un paso de lavado con la solución 2
(0,1 x SSC, SDS al 0,1%) a 50ºC durante 40 min. con un cambio de
solución nueva. Entonces se expuso la membrana a Cronex, películas
de rayos X de uso en medicina (Sterling Diagnostic Imaging Inc.,
USA) a -70ºC durante 2 h. Se valoró la igualdad de carga y la
transferencia de mRNA a la membrana mediante la rehibridación de la
transferencia con una sonda del cDNA de GAPDH marcado con
\alpha-[32P]dATP.
\vskip1.000000\baselineskip
La transferencia se hibridó con una sonda
marcada con \alpha-[32P]dATP derivada del cDNA de UKW de
acuerdo con las instrucciones del fabricante y se expuso a una
película de rayos X a -70ºC durante 62 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron PCR cuantitativas a tiempo real
con la tecnología Taqman® y el aparato ABI PRISM 7700 (Applied
Biosystems, Foster City, CA). Para las reacciones de transcriptasa
reversa se utilizaron 10 \mug de RNA total aislado a partir de
adenocarcinomas de páncreas, pancreatitis crónica y tejidos
pancreáticos normales congelados en un volumen de 20 \mul.
Entonces se llevaron a cabo las PCR mezclando 200 ng de cDNA con 4
\mul de tampón de SYBR-Green 10x, MgCl_{2} 3 mM,
dNTP 1 mM, 0,2 unidades de N-uracil glicosilasa, 1
unidad de AmpliTaq Gold, 4 \mul de mezcla de cebadores (300 nM de
cada cebador: directo 5'TTCTCTTTGACAGGTTCTGGGC3' (Id. de Sec. Nº:
3); reverso 5'GGTTGGAACCAGTAGGGCCTC3') (Id. de Sec. Nº: 4) en un
volumen final de 40 \mul. Los cebadores de PCR se diseñaron para
dar lugar a un fragmento de DNA de 50 pb utilizando el programa
Primer Express (PE Biosystems, CA, USA). Los ciclos de
amplificación fueron los siguientes: 2 min. a 50ºC seguido de 10
min. a 95ºC y 40 ciclos de amplificación (95ºC durante 15 s. y 60ºC
durante 60 s.). Estos experimentos se realizados por duplicado. Los
resultados se calcularon mediante la sustracción del gen UKW de los
niveles basales de RNA del gen de mantenimiento en cada muestra.
Cada valor se dividió por el nivel basal promedio de mRNA de UKW de
tres tejidos sanos. Las proporciones se elevaron al cuadrado y se
calculó un valor recíproco.
\vskip1.000000\baselineskip
- xs13for: {}\hskip0,3cm 5'AGATCCGCATGTCCCTTC3'
- (Id. de Sec. Nº: 5);
- xs13rev: {}\hskip0,3cm 5'CCTTGCGCATCATGGTGTT3'
- (Id. de Sec. Nº: 6).
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR LightCycler se realizó en un LightCycler
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) en los capilares
LightCycler utilizando una mezcla inicial disponible comercialmente
que contiene la polimerasa de DNA Taq, SYBR-Green
I, desoxiribonucleósidos trifosfato (LightCycler DNA master
SYBR-Green I, Roche Molecular Biochemical). Tras la
adición de los cebadores (directo 5'CCCCAGGAGTTTATGCTTGG3' (Id. de
Sec. Nº: 7); reverso 5'GCCTGGATACCACACTACCAG3' (Id. de Sec. Nº: 8);
concentración final: 0,5 \muM), el MgCl_{2} (3 mM) y el molde
de DNA a la mezcla inicial, se realizaron 37 ciclos de
desnaturalización (95ºC durante 1 s.), hibridación (58ºC durante 5
s.) y extensión (72ºC durante 8 s.). Todos las tasas de transición
de temperatura se fijaron a 20ºC por s. Tras la finalización de la
amplificación de PCR, se realizó un análisis de la curva de fusión.
Para este procedimiento, los productos de PCR se desnaturalizaron a
95ºC, se hibridaron a 65ºC, y se calentaron gradualmente hasta
95ºC. La fluorescencia de SYBR-Green I se monitorizó
continuamente cada 0,1ºC. La curva de fusión se analizó mediante
inspección visual y las estructuras reordenadas del gen UKW
amplificado se fusionaron a 85-88ºC. Para el
control de la formación de dímeros de cebadores se incluyó un
control sin DNA molde ("control agua") en cada experimento.
Normalmente un pequeño pico es visible a 78ºC, que puede
diferenciarse del pico generado por el producto de amplificación
específico a 85-88ºC. La curva de calibración de la
calnexina se generó utilizando diluciones seriadas (1:10, 1:50 y
1:80) del cDNA de la línea celular de cáncer pancreático
Suit-2 007. Las cantidades relativas del cDNA de UKW
y calnexina se determinaron en base a una curva de calibración. La
expresión relativa del gen UKW se calculó como un valor normalizado
generado dividiendo los niveles basales del gen UKW y la calnexina
de cada muestra. Cebador directo de la calnexina
5'ATTGTCAGATCGTTCATTGC3' (Id. de Sec. Nº: 9); cebador reverso
5'ATGGAACAGGTAACCAGCAT3' (Id. de Sec. Nº: 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para la inmunización, se sintetizaron los
péptidos de los aa 167-182 y de los aa
306-320 (Id. de Sec. Nº: 2) y se acoplaron a una
molécula portadora. Se inmunizaron 2 conejos con la mezcla de
péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 0: Extracción de un suero preinmune seguido
de una primera inmunización.
Día 14: Segunda inmunización.
Día 28: Tercera inmunización.
Día 38: Extracción de sangre.
Día 56: Cuarta inmunización.
Día 66: Extracción de sangre.
Día 80: Extracción total de sangre.
El antisuero recuperado se purificó por
cromatografía de afinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Alves, F. et al., Pancreas
23 (2001) 227-235.
Ausubel I, Frederick M., Current
Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley and Sons, New
York.
Baines et al., "Purification of
Immunoglobulin G (IgG)", en: Methods in Molecular Biology, Vol.
10, págs. 79-104, The Humana Press, Inc.,
1992.
Büttner, R. et al., Mol. Cell.
Biol. 11 (1991) 3573-3583.
Coligan et al. (Ed.), Current Protocols
in Immunology, págs. 9.3.1-9.3.5 y págs.
9.4.1-9.4.11 John Wiley & Sons,
1997.
Elsasser, H.P. et al., Virchows
Arch. B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 64 (1993)
201-207.
EP-A 0 063 879
EP-A 0 128 018
EP-A 0 173 251
EP-A 0 200 362
Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical
Sciences, 19ª edición, Mack Publishing Company,
1995.
Gibson, J. B., y Sobin, L. H.,
Histological typing of tumors of the liver, biliary tract and
pancreas, WHO, Geneva, 1978.
Green, L. L. et al., Nat.
Genet 7 (1994) 13-21.
Hames, B. D., Higgins, S. G.,
Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach (1985)
IRL Press, Oxford, England.
Kroep, J. R. et al., Ann.
Oncol. 10, Supl. 4 (1999) 234-238.
Lonberg, N., et al., Nature
368 (1994) 856-859.
Mole, "Epitope Mapping", En: Methods
in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (Ed.), págs.
105-116, The Humana Press, Inc.,
1992.
Morris (Ed.), Epitope Mapping Protocols 25,
Humane Press, Inc., 1996.
Price, "Production and Characterization
of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en:
Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical
Application, Ritter y Ladyman (Ed.), págs. 60-84,
Cambridge University Press, 1995.
Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory. Manual (1989) Cold Spring harbour
Laboratory Press, New York, USA.
Shaper, N. L. et al., J. Mammary
Gland Biol. Neoplasia. 3 (1998)
315-324.
Taniguchi, S. et al., Clin.
Exp. Metastasis 10 (1992) 259-266.
Taylor, L. D. et al., Int.
Immun. 6 (1994) 579-591.
Tong, D. et al., Breast Cancer
Res. Treat. 56 (1999) 91-97.
US 2.915.08Z
Wahl, G. M. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687.
Warshau, A. L., y Fernandez, -del,
C. C., N. Engl. J. Med. 326 (1992)
4555-4565.
Wenger, C. et al., Oncogene
18 (1999) 1073-1080.
WO 02/08288
WO 89/06698
Wu, Y. Y., y Rees, J. L., Acta
Derm. Venereol. 80 (2000) 2-3.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para el diagnóstico y la
terapia de cáncer pancreático y composiciones útiles en los
mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21460
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PE 02024539.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-10-31
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (366)...(1484)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador reverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador xs13 directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,6cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador xs13 reverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia: cebador
directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador reverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador reverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (9)
1. Un método para determinar in vitro la
presencia o ausencia de cáncer pancreático en un paciente, que
comprende
(i) detectar en la muestra biológica de un
paciente una cantidad de un polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2, y
(ii) comparar la cantidad de polipéptido con un
valor estándar predeterminado indicando la línea de decisión entre
presencia inducida por el tumor o no inducida por el tumor del
polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2 en la célula, y a partir de ello
determinar la presencia o ausencia de cáncer pancreático en el
paciente, en el que la sobreexpresión es específica de células
tumorales pancreáticas.
2. Un proceso para determinar in vitro si
la muestra de tejido o fluido de un paciente contiene o no células
tumorales pancreáticas o deriva de células tumorales pancreáticas,
en el que se utilizan una muestra de prueba y una segunda muestra
originada a partir de células no tumorales pancreáticas del mismo
individuo o de un individuo diferente de la misma especie, cuyo
proceso comprende los siguientes pasos:
(a) incubar cada muestra respectiva bajo
condiciones de hibridación restrictivas con una sonda de ácido
nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
- (i)
- una secuencia de ácido nucleico de Id. de Sec. Nº: 1, o un fragmento de la misma;
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico de (i);
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de (i); y
- (iv)
- una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de (ii); y
(b) determinar la cantidad aproximada de
hibridación de cada muestra respectiva con dicha sonda, y
(c) comparar la cantidad aproximada de
hibridación de la muestra de prueba con la cantidad aproximada de
dicha segunda muestra para identificar si la muestra de prueba
contiene o no una mayor cantidad de ácido nucleico o mezcla de
ácidos nucleicos específicos que dicha segunda muestra.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
que se caracteriza porque
a) dicha muestra se selecciona del grupo de
fluidos corporales o células, o de un extracto celular o el
sobrenadante del cultivo celular de dichas células,
b) dicha determinación de la hibridación se
realiza mediante otra pareja de unión del ácido nucleico de la
muestra y/o la sonda de ácido nucleico o por exposición a una
película de rayos X.
4. Un método de cribado para identificar in
vitro un compuesto que inhibe la actividad biológica del
polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2, lo que comprende:
poner en contacto dicho polipéptido con un
compuesto o una variedad de compuestos bajo condiciones que permiten
la interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido; y
detectar la interacción entre dicho compuesto o
variedad de compuestos con dicho polipéptido.
5. Un método de cribado para identificar in
vitro un compuesto que inhibe la actividad biológica del
polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2 o inhibe la transcripción o
traducción del ácido nucleico que codifica un polipéptido de Id. de
Sec. Nº: 2, lo que comprende:
poner en contacto dicho compuesto o variedad de
compuestos con una célula huésped en la que la capacidad invasiva
está mediada por la expresión de un ácido nucleico que codifica un
polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2, y
detectar la interacción entre dicho compuesto o
variedad de compuestos con dicha célula huésped.
6. El método de cribado de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la detección de la interacción entre
dicho compuesto o variedad de compuestos con dicha célula huésped se
mide mediante al menos un cambio en la fisiología celular, un
cambio en el estado de diferenciación o un cambio en el metabolismo
celular que conduce a un aumento de la proliferación.
7. Un método de cribado para la identificación
in vitro de un compuesto que es un antagonista de un
polipéptido de Id. de Sec. Nº: 2, lo que comprende:
\newpage
poner en contacto dicho polipéptido de Id. de
Sec. Nº: 2 con un compuesto bajo condiciones que permitan la
interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido;
determinar un primer nivel de actividad de dicho
polipéptido;
determinar un segundo nivel de actividad de
dicho polipéptido expresado en un huésped que no ha sido puesto en
contacto con dichos compuestos; y
relacionar cuantitativamente el primer nivel de
actividad con el segundo nivel de actividad, y cuando dicho primer
nivel de actividad es menor que dicho segundo nivel de actividad,
dicho compuesto se identifica como un antagonista de dicho
polipéptido.
8. Un anticuerpo dirigido frente a los aa
167-182 o aa 306-320 del polipéptido
UKW de Id. de Sec. Nº: 2.
9. Un equipo para el diagnóstico de un tumor
pancreático que comprende el anticuerpo de la reivindicación 8.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02024539 | 2002-10-31 | ||
| EP02024539 | 2002-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2318079T3 true ES2318079T3 (es) | 2009-05-01 |
Family
ID=32405681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03024982T Expired - Lifetime ES2318079T3 (es) | 2002-10-31 | 2003-10-29 | Metodos para el diagnostico del cancer pancreatico y composicones uti les en los mismos. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7429452B2 (es) |
| EP (1) | EP1416279B1 (es) |
| JP (2) | JP4394924B2 (es) |
| AT (1) | ATE419533T1 (es) |
| DE (1) | DE60325541D1 (es) |
| ES (1) | ES2318079T3 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006022690A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-03-02 | Applera Corporation | Method and compositions for treating diseases targeting cd71 |
| WO2006038904A2 (en) * | 2004-08-06 | 2006-04-13 | Applera Corporation | Method and compositions for treating diseases targeting e-cadherin |
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| US8048626B2 (en) * | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| WO2008117067A2 (en) | 2007-03-27 | 2008-10-02 | Carl Arne Krister Borrebaeck | Protein signature/markers for the detection of adenocarcinoma |
| US8538733B2 (en) | 2008-01-25 | 2013-09-17 | Life Technologies Corporation | Methods for the analysis of dissociation melt curve data |
| US9708647B2 (en) | 2015-03-23 | 2017-07-18 | Insilixa, Inc. | Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays |
| US9499861B1 (en) | 2015-09-10 | 2016-11-22 | Insilixa, Inc. | Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| GB201608192D0 (en) * | 2016-05-10 | 2016-06-22 | Immunovia Ab | Method, array and use thereof |
| JP7687957B2 (ja) | 2019-03-14 | 2025-06-03 | インシリクサ， インコーポレイテッド | 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム |
| GB202010970D0 (en) | 2020-07-16 | 2020-09-02 | Immunovia Ab | Methods, arrays and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US81659A (en) * | 1868-09-01 | m ax i mi | ||
| DE3854821T2 (de) | 1987-02-19 | 1996-05-23 | Scripps Clinic Res | Zellenoberflachenmarker für humanen Pankreaskrebszellen |
| US5912143A (en) * | 1996-12-27 | 1999-06-15 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotides encoding a human mage protein homolog |
| AU3395900A (en) * | 1999-03-12 | 2000-10-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides |
| AU2001273150A1 (en) | 2000-07-20 | 2002-02-05 | Genentech Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
-
2003
- 2003-10-29 DE DE60325541T patent/DE60325541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-29 AT AT03024982T patent/ATE419533T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-10-29 US US10/696,487 patent/US7429452B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-29 ES ES03024982T patent/ES2318079T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-29 EP EP03024982A patent/EP1416279B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-31 JP JP2003371406A patent/JP4394924B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-04-24 US US12/150,089 patent/US20090136939A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-09-01 JP JP2009201213A patent/JP2009284907A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2009284907A (ja) | 2009-12-10 |
| EP1416279B1 (en) | 2008-12-31 |
| ATE419533T1 (de) | 2009-01-15 |
| DE60325541D1 (de) | 2009-02-12 |
| EP1416279A1 (en) | 2004-05-06 |
| US20040110219A1 (en) | 2004-06-10 |
| JP2004147656A (ja) | 2004-05-27 |
| JP4394924B2 (ja) | 2010-01-06 |
| US7429452B2 (en) | 2008-09-30 |
| US20090136939A1 (en) | 2009-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090136939A1 (en) | Methods for diagnosis and therapy for pancreatic cancer and composition useful therein | |
| JP4446036B2 (ja) | 上皮誘導性癌の治療のための薬剤組成物 | |
| KR101393144B1 (ko) | 요로상피암의 검출용 키트 및 방법 | |
| MX2011001445A (es) | Metodo para detectar cancer. | |
| EP2488874A2 (en) | Biomarker for identification of melanoma tumor cells | |
| Pyle-Chenault et al. | VSGP/F-spondin: a new ovarian cancer marker | |
| US8969020B2 (en) | Peptide sequence that promotes tumor invasion | |
| Colpitts et al. | Identification and immunohistochemical characterization of a mucin-like glycoprotein expressed in early stage breast carcinoma | |
| WO2011010309A1 (en) | A method of diagnosing cancer | |
| US8257716B2 (en) | Anti-PDEF antibodies and uses thereof | |
| KR20070001913A (ko) | 자궁경부 표본에서 암 바이오마커를 검출하기 위한 방법 | |
| JP5145549B2 (ja) | 腫瘍マーカー | |
| JP5467256B2 (ja) | 消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、および消化器癌検出方法 | |
| Kaneko et al. | Use of formalin-fixed paraffin-embedded tissue and single-strand conformation polymorphism analysis for polymerase chain reaction of antigen receptor rearrangements in dogs | |
| JP2011501147A (ja) | 結腸癌のバイオマーカーとしてのテネイシン−ｗの使用 | |
| JP2009535033A (ja) | Ｃｒｉｐｔｏ−３の検出のための組成物および方法 | |
| AU2012328989A1 (en) | USP2a peptides and antibodies | |
| US7297760B2 (en) | Cancer associated protein | |
| WO2025255297A1 (en) | Anti-human tigit antibodies for in vitro diagnostics | |
| JP4474551B2 (ja) | 神経膠腫細胞株ｕ２５１の増殖能抑制剤及び浸潤能抑制剤 | |
| US7928188B2 (en) | Antigen polypeptide for the diagnosis and/or treatment of ovarian cancer | |
| CN101802193B (zh) | 癌症诊断套件以及癌症诊断方法 |