ES2318183T3

ES2318183T3 - Procedimiento de concentracion de proteinas.

Info

Publication number: ES2318183T3
Application number: ES03781532T
Authority: ES
Inventors: Konstantin Konstantinov; Huong T. Nguyen; Jens H. Vogel
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-11-01
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2023-11-01
Also published as: EP1596667A2; JP4500683B2; CA2504134C; DE60326012D1; JP2006504525A; AU2003287299A1; CA2504134A1; US20060149042A1; EP1596667A4; US7674885B2; WO2004042012A2; WO2004042012A3; EP1596667B1; AU2003287299A8

Abstract

Un procedimiento para concentrar una proteína a partir de una solución acuosa inicial que tiene componentes en solución, los componentes en solución que comprenden la proteína y un polímero orgánico, el polímero orgánico se selecciona del grupo que consiste en los copolímeros en bloque de la familia de Pluronic, polietilenglicol y polímeros antiespuma, el procedimiento comprende: (1) someter la solución acuosa inicial a ultrafiltración para concentrar la proteína, de modo tal que se produce una primera solución retenida, (2) ajustar la conductividad de la primera solución retenida por debajo de aproximadamente 6 mS/cm medido a 22ºC para producir una segunda solución retenida, y (3) someter la segunda solución retenida a ultrafiltración para concentrar adicionalmente la proteína de modo que se genere una solución concentrada.

Description

Procedimiento de concentración de proteínas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la concentración de soluciones de macromoléculas tales como proteínas. En una forma de realización, el procedimiento de la invención involucra la ultrafiltración de una solución que comprende macromoléculas y el polímero orgánico de coconcentración, luego una diafiltración para reducir la conductividad, y luego una segunda ultrafiltración para concentrar la macromolécula sin pérdida significativa de rendimiento debido a la precipitación.

Descripción de la técnica relacionada

La producción de proteína involucra la creación de grandes volúmenes de solución de proteína comparativamente diluidos. Se prefiere concentrar la proteína después de la fermentación para facilitar las etapas posteriores, tales como congelamiento, almacenamiento a granel y descongelamiento y purificación posterior. Sin embargo, en el pasado se ha comprobado que la capacidad de obtener concentraciones de proteína óptimas para los productos a partir de soluciones que contienen un polímero orgánico de coconcentrante, tal como se halla en muchas soluciones de sobrenadante de cultivos celulares producidos a partir de la recolección de cultivos de células de mamífero, está limitada debido al aumento de precipitación (y en consecuencia, pérdida) de las moléculas de producto, ya que aumenta la concentración usando ultrafiltración. Por ejemplo, la excesiva precipitación ha evitado la concentración por ultrafiltración en más de 10-20 veces respecto de la concentración de proteína en el sobrenadante del cultivo de células inicial.

El proceso de aislamiento o recuperación primaria forma la interfaz entre la fermentación y la purificación posterior, y a menudo es crítica tanto en términos de capacidad de producción como de la economía del proceso. El principal objeto del proceso de aislamiento es obtener el producto proteico en solución libre de partículas, concentrada, que permite además realizar el procesamiento y la purificación posterior.

La ultrafiltración (UF) es una tecnología eficiente para la concentración de soluciones proteicas y con frecuencia se usa como una etapa importante para el aislamiento de las proteínas del sobrenadante del cultivo celular. En particular, la ultrafiltración se usa en los procesos de fermentación discontinuos y perfusión de células. Debido a que los procesos de perfusión continua producen volúmenes grandes de producto de proteína comparativamente diluidos, los factores de concentración alta son deseables para facilitar los procesos finales. Una limitación importante de los procesos de fabricación de proteínas basados en cultivos celulares convencionales es el factor de concentración obtenible del aislamiento de proteínas. En la mayoría de los casos, los factores de concentración de solo 10-20 veces se obtienen usando ultrafiltración durante el proceso de aislamiento. Los intentos de aumentar la concentración han originado problemas de filtrabilidad crecientes y pérdidas de producto debidas a la precipitación. La naturaleza y la causa de la precipitación son generalmente desconocidas. En la etapa de UF la concentración significativamente superior normalmente no es fácilmente obtenible debida al aumento de precipitación adicional. Esto puede lentificar las etapas subsiguientes del proceso debido a que se deben procesar volúmenes muy grandes. Esto es especialmente verdadero para los procesos de perfusión continua debido a los títulos de producto comparativamente bajos y al alto rendimiento volumétrico en comparación con la fermentación discontinua.

Los sobrenadantes del cultivo celular consisten en un amplio espectro de compuestos. Estos incluyen suplementos de un medio de cultivo celular tal como copolímeros en bloque no iónicos, particularmente de la familia de Pluronic de copolímeros en bloque no iónicos comercializados por BASF, y aceite de silicio, y los compuestos que se secretan de las células o liberan de la tisis celular (por ejemplo, proteínas, lípidos). Usualmente se requiere el polímero en bloque no iónico Pluronic F-68 como suplemento del medio de cultivo celular para proteger células de mamífero.

En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar mucho la concentración del sobrenadante del cultivo celular sin pérdida significativa del rendimiento de macromoléculas del producto o problemas de filtrabilidad. Los solicitantes descubrieron sorprendentemente que un sobrenadante del cultivo celular, que comprende las macromoléculas del producto y un polímero orgánico que se coconcentra con las macromoléculas del producto durante la ultrafiltración, de modo que un copolímeros de Pluronic, se puede concentrar mucho con rendimientos superiores a los de cualquiera de los proceso informado conocidos por los solicitantes al someter el sobrenadante a una ultrafiltración inicial, luego ajustar la conductividad del retenido, tal como por diafiltración con agua para inyección (WFI), diluyente o buffer, y luego someter la solución a una segunda ultrafiltración.

Breve sumario de la invención

En relación con la presente invención, se proporcionan procedimientos para concentrar una macromolécula a partir de una solución acuosa inicial que tiene en componentes en solución. Los componentes en solución comprenden la macromolécula y un polímero orgánico. La macromolécula se concentra al someter primero la solución inicial a ultrafiltración para concentrar la macromolécula de modo que se produce una primera solución retenida, luego se ajusta la conductividad de la primera solución retenida de modo de evitar sustancialmente o revertir sustancialmente la precipitación de los componentes en solución inducida por el polímero orgánico para producir una segunda solución retenida, y luego la segunda solución retenida se somete a ultrafiltración para concentrar adicionalmente la macromolécula de modo de producir una solución concentrada. En una forma de realización, la conductividad se ajusta por diafiltración contra agua, diluyente o buffer adecuados.

Con preferencia, la invención se refiere a la concentración de soluciones acuosas de proteínas nativas o recombinantes. La solución inicial con preferencia comprende sobrenadante del cultivo celular de mamífero o insecto. La invención además se refiere con preferencia a los procedimientos para la concentración del sobrenadante del cultivo celular que comprende una proteína producto y polímero orgánicos de la familia Pluronic de copolímeros en bloque, y con mayor preferencia que comprende copolímero en bloque Pluronic F-68. La invención también se puede practicar usando los sobrenadantes del cultivo celular que contienen otros polímeros orgánicos tales como polietilenglicoles o compuestos antiespuma. Los presentes procedimientos producen soluciones de proteínas que tiene factores de concentración altos (es decir, de 20 veces a 100 veces o mayor, con preferencia de 75 veces a 100 veces o mayor).

Los solicitantes descubrieron que durante la ultrafiltración, los polímeros orgánicos coconcentrados tal como Pluronic F-68 inducen la precipitación de las macromoléculas. También se descubrió que dicha precipitación depende de la fuerza iónica de la solución. En consecuencia, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento de concentración de una solución que comprende macromoléculas y polímero orgánico. El procedimiento comprende primero concentrar la solución para producir una primera solución retenida, ajustar la fuerza iónica de la primera solución retenida usando un agente de dilución adecuado de modo de evitar sustancialmente o reducir sustancialmente la precipitación de los componentes en solución inducida por el polímero orgánico para obtener una segunda solución retenida, y luego concentrar la segunda solución retenida en al menos 50 veces, con preferencia al menos 100 veces, y aún con mayor preferencia en más de 100 veces en comparación con la concentración de macromolécula de la solución inicial y la b la obtención de rendimientos de 75-100% de la macromolécula, con preferencia al menos 95,0%, con mayor preferencia al menos 99,0%, y en particular con preferencia un porcentaje de rendimiento de 99,5 o más de la macromolécula. En una forma de realización, el polímero orgánico comprende un miembro de la familia Pluronic de copolímeros en bloque no iónicos, y con mayor preferencia comprende Pluronic F-68. Se pueden realizar etapas del proceso adicionales opcionales. Por ejemplo, el producto de la macromolécula del procedimiento de la invención se puede someter a congelamiento, descongelamiento y filtración posdescongelamiento del producto refinado para aumentar la pureza o preparar una dosis terapéutica deseable.

En una forma de realización particular, la presente invención se refiere a resolver el problema de precipitación de proteína inducida por Pluronic. En una primera etapa, se concentra el sobrenadante del cultivo celular, por ultrafiltración, a un factor de concentración donde la pérdida de producto es mínima (por ejemplo 20 veces con respecto a la concentración original). Luego, con preferencia usando el mismo equipamiento, el total o una porción del concentrado obtenido en la primera etapa anterior se diafiltra contra agua (WFI) u otro buffer adecuado para reducir la conductividad a un punto donde se evita sustancialmente la precipitación del producto inducida por Pluronic, es decir, una conductividad de menos de 6 mS/cm, y con mayor preferencia de 0,5 a 5 mS/cm. Como se usa en la presente, las mediciones de conductividad se realizan a 22ºC a menos que se describa de otro modo. Finalmente, el material también se concentra para obtener factores altos de concentración final (por ejemplo 75-100X con respecto a la concentración original) con poca o sin pérdida de producto y con precipitación de proteína a granel minimizada. Las tres etapas se pueden realizar en el mismo equipo. En este caso, generalmente existe poco o ningún aumento de complejidad y no es necesario material nuevo o requisitos de hardware. La etapa de filtración inicial permite la minimización de WFI o el consumo de buffer durante la etapa de diafiltración. Debido a que el volumen adicional que se debe filtrar durante la etapa de diafiltración es en consecuencia bajo (usualmente el volumen adicional necesario durante la diafiltración es menor de 20%, con frecuencia menor de 15%), el tiempo del proceso total no está significativamente prolongado.

Un proceso de acuerdo con la presente invención permite un incremento significativo del factor de concentración, es decir, de 20 veces a 100 veces y superior, a la vez que también aumenta el rendimiento del producto en comparación con un proceso convencional. El presente proceso provee rendimientos del proceso de 75% a 100%, con preferencia de 90% - 100%, y en muchos casos, hasta 95%, o incluso hasta 99,5%, los que en el arte previo solo se pueden obtener para factores de concentración mucho menores de menos de 10 a 20 veces. La precipitación de proteína a granel se reduce significativamente cuando se emplea un proceso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la filtrabilidad para un concentrado de 20 veces varía de 6 a 10 ml (10 ml es el máximo teórico) medido usando un filtro de jeringa Acrodisc de 25 ml fabricado por Pall Corporation que tiene 2,8 cm cuadrado de área de filtro a 10 libras de presión. Esta es una mejora significativa en comparación con un 1 a 5 ml que se usan en los procesos del arte previo. Mediante un proceso de acuerdo con la invención se obtiene mejor filtrabilidad para un concentrado 75 veces (6 ml de promedio) que el concentrado de 20 veces que se usa en los procesos convencionales de la técnica anterior (aproximadamente 3 ml de promedio; ver, por ejemplo, datos de filtrabilidad que se muestran en la Fig. 17).

Los objetos, características y ventajas de la invención se expondrán en la siguiente descripción. Los objetos, características y ventajas de la invención se pueden realizar y obtener por medio de los instrumentos y la combinación indicadas particularmente en la presente.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos acompañantes, que se incorporan y constituyen una parte de la memoria descriptiva, ilustran una forma de realización preferida en este momento de la invención y junto con la descripción general dada anteriormente y la descripción detallada de la forma de realización preferida dada a continuación, sirve para explicar los principios de la invención.

La Fig. 1 muestra de copolímeros en bloque de Pluronic ejemplares.

Fig. 2: Desarrollo experimental para los experimentos de adición de Pluronic F-68. Las muestras se tomaron de una corrida de UF-concentración típica (a 1 X-50X; la muestra 50X (final) se tomó del concentrado de UF final extraído del sistema). Las soluciones de Pluronic F-68 se prepararon en un medio de cultivo de células estándar (a 0-200 g/l). El resultado es una matriz de 25 soluciones, con factores de concentración final de 0,5-25 veces en comparación con el sobrenadante y las concentraciones de Pluronic F-68 entre 0,5 y 125 g/l (se asume una retención completa de Pluronic F-68 durante la UF y 1 g/l de concentración de Pluronic F-68 en el medio).

Fig. 3: (a) electroforesis en gel SDS seguida por tinción con plata; (1) = Estándar IL-2SA (5 mg/l); (2) = Recolección de concentrado de UF (25X); (3) = Sobrenadante de 25X después de centrifugación; (4) Pellet redisuelto en 1 ml de buffer; (b) ZAP (transferencia western teñida usando anticuerpo antihlL-2); (1) = Recolección no concentrada; (2) = Recolección de concentrado de UF (25X); (3) = Sobrenadante de 25X después de la centrifugación; (4) = Pellet redisuelto en 10 ml.

Fig. 4: Viscosidad de soluciones de Pluronic F-68 preparadas en medio de cultivo celular y diversos concentrados de ultrafiltración. La dilución del medio de cultivo se realizó con WFI para alcanzar 1-1,5 mS/cm de conductividad.

Fig. 5: Precipitación durante la adición de Pluronic F-68 en la recolección de cultivo ultrafiltrado de diferente concentración, medida por incremento de absorbancia a 580 nm en una cubeta estándar en un espectrofotómetro estándar (comparar también la Fig. 2). El material para la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.

Fig. 6: Proteína total restante después de la centrifugación en los experimentos de adición de Pluronic F-68 (comparar también la Fig. 2). El material para la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.

Fig. 7: IL-2SA restante en solución después de la centrifugación en los experimentos de adición de Pluronic F-68 (comparar también la Fig. 2). El material para la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.

Fig. 8: Rendimiento de proteína a granel después de la precipitación inducida por Pluronic F-68. Se muestran las curvas para varias concentraciones de proteína (compare La Fig. 2). El material para la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.

La Fig. 9: Rendimientos de IL-2SA después de la precipitación inducida por Pluronic F-68. Se muestran las curvas para varias concentraciones de proteína (compare La Fig. 2). El material para la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.

Fig. 10: (a) Perfil de concentración para los solutos retenidos en la superficie de la membrana (esquemática), (b) Distribución de presión no homogénea y en consecuencia flujo del permeado no homogéneo en filtración de flujo cruzado (de Vogel et al., 2002), "TMP" es presión de transmembrana.

La Fig. 11: precipitación inducida por Pluronic de proteína total y IL-2SA y su reducción por conductividad reducida (experimentos de adición). Conductividad baja = 1-1,5 mS/cm.

La Fig. 12: Influencia de la adición de sal a concentrado de baja conductividad diafiltrado sobre la precipitación de proteína a granel.

La Fig. 13: Influencia del pH sobre la precipitación. Se usó ácido fosfórico concentrado para el descenso gradual del pH del concentrado de UF/DF/LTF 75X.

La Fig. 14: Influencia de la conductividad sobre la precipitación para dos pH diferentes (pH 6,0 ajustado por la adición de ácido fosfórico concentrado). Se usó el concentrado de UF/DF/UF 75X en ambos casos.

La Fig. 15: Esquema del proceso de aislamiento de UF/DF/UF de acuerdo con una forma de realización preferida de la invención.

La Fig. 16: Realización del esquema del proceso de aislamiento de UF/DF/UF de la invención en comparación con el proceso de UF convencional.

La Fig. 17: Filtrabilidad de IL-2SA a granel concentrado por el nuevo esquema del proceso de aislamiento UF/DF/UF en comparación con el proceso de UF/DF convencional.

La Fig. 18: Influencia de las concentraciones altas de Pluronic F-68 (75 g/l) sobre la unión de IL-2SA a la resina de intercambio catiónico SP Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech).

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

La presente invención es ventajosa para usar en los procesos de fermentación por perfusión continua o semicontinua y fermentación discontinua. Con más preferencia, la invención se refiere a fermentación por perfusión continua o semicontinua. Como es bien conocido en el arte, producir proteínas mediante procesos continuos tiene ciertas ventajas. La proteína producida generalmente es de mejor calidad debido al menor tiempo de retención en el biorreactor. Asimismo las proteínas producidas por procesos continuos están menos sujetas a la degradación. En los procesos discontinuos, normalmente hay mayores concentraciones de proteína en el sobrenadante de la fermentación, mientras que en los procesos continuos, la proteína producida está en una solución más diluida.

En consecuencia, el presente procedimiento es particularmente beneficioso para la concentración de los productos de proteína obtenidos de procesos de perfusión continuos o semicontinuos, ya que tienen que procesar una solución de proteína comparativamente más diluida. A menudo, en la perfusión continua concentración de proteína es significativamente menor de 1 g/l y algunas veces menor de 0,1 g/l. Los factores de concentración altos, con preferencia 100 veces y superiores, son muy deseables para facilitar el procesamiento posterior adicional. Además, la presente invención se puede usar con proteínas producidas por lotes si se deseara por alguna razón.

La presente invención involucra concentrar las macromoléculas a partir de una solución acuosa que tiene componentes en solución. Estos componentes en solución incluyen la macromolécula y un polímero orgánico.

Los componentes en solución también pueden incluir otros compuestos tales como los que se hallan comúnmente en el sobrenadante del cultivo celular. Por ejemplo, los componentes pueden incluir suplementos del medio de cultivo celular tal como aceite de silicio y antiespuma y compuestos que se secretan de las células o se liberan después de la lisis celular (por ejemplo, proteínas y lípidos tales como que se hallan en la célula huésped).

La presente invención es particularmente útil para soluciones que están compuestas de un polímero orgánico tal como un miembro de la familia Pluronic de copolímeros en bloque, y con mayor preferencia compuestos de Pluronic F-68, que es un componente esencial de muchos medio de cultivo celular para los procesos de fabricación de proteínas. También se considera que otros polímeros orgánicos se coconcentran con una macromolécula deseada durante la ultrafiltración y producen la precipitación de la macromolécula o proteína. En consecuencia, los procedimientos de la invención se aplican para concentrar soluciones que comprenden otros polímeros orgánicos para la coconcentración, tales como polietilenglicol ("PEG"), polímeros antiespuma. En la mayoría de los casos, se considera que la precipitación de proteína se produce como resultado de la reducción de la constante dieléctrica de la solución concentrada después de la ultrafiltración, así como del aumento de la competición por las moléculas de agua necesarias para la solvatación de los polímero orgánicos y macromoléculas coconcentrados.

Se considera que el mecanismo fundamental de la precipitación de las macromoléculas inducido por las concentraciones aumentadas de un polímero orgánico tal como, por ejemplo, Pluronic F-68, se aplica a las soluciones que comprenden otras proteínas y macromoléculas, además de las descritas en forma específica en los ejemplos. En consecuencia, los procedimientos de la presente invención se pueden emplear con muchos polímeros orgánicos y proteínas diferentes. Las soluciones de macromoléculas usadas en los procedimientos de la invención pueden ser soluciones de proteínas. En una forma de realización, se puede emplear un proceso de acuerdo con la presente invención con la proteína recombinante del agonista selectivo de la interleuquina 2 ("IL-2SA"). Otros productos de proteína recombinante que se pueden procesar usando técnicas de la presente invención incluyen el Factor VIII humano recombinante comercializado por Bayer Corp. como Kogenate^{TM} infliximab recombinante comercializado por Centocor, Inc. como Remicade^{TM} abciximab recombinante comercializado por Johnson y Johnson como Reopro^{TM}, agalfidafe beta comercializado por Genzyme Inc. como Fabrazyme^{TM}, factor antihemofílico recombinante comercializado por Wyeth Ayerst como Refacto^{TM} y factor antihemofílico recombinante comercializado por Baxter Inc. como Recombinate^{TM} y alguna y todas sus versiones de segunda y tercera generación, así como muchos otros productos de proteína.

Una función principal de Pluronic F-68 es proteger las células del daño potencial causado por el burbujeo (ver por ejemplo Murhammer and Goochee, 1988; Murhammer and Goochee, 1990; Jordan et al., 1994), que a su vez es necesario para asegurar suficiente transferencia de oxígeno dentro de los biorreactores en producción en escala. Sin la adición de sustancias protectoras como Pluronic F-68, las células se adhieren a la interfaz gas-líquido (Chalmers and Bavarian, 1991). Durante la ruptura de las burbujas de gas, las células se someten posteriormente a estreses de cizallamiento muy altos. Según el diámetro de la burbuja, se han informado tasas de disipación de energía máximas de hasta 9,52* 10^{7} J*m-^{3}*s-^{1}, con burbujas más pequeñas para una aireación más eficiente que también origina estrés de cizallamiento superior (Boulton-Stone and Blake, 1993; García-Briones et al., 1994). En comparación, se sabe que las tasas de disipación de energía del orden 10^{4}-10^{7} J*m^{-3}*s^{-1} causan muerte celular en los campos de flujo bien definidos (por ejemplo Schurch et al., 1988, Augenstein et al., 1971).

Pluronic F-68 protege a las células sujetas a este alto estrés de cizallamiento al evitar la adhesión celular a la interfaz aire-líquido (García-Briones y Chalmers, 1992), que parece ser el resultado de la reducción de la tensión superficial dinámica con Pluronic F-68 (Michaels et al., 1995b). Además, se ha demostrado que Pluronic F-68 interactúa directamente con la membrana celular, lo que produce una sensibilidad al cizallamiento significativamente reducida (Goldblum et al., 1990; Michaels et al., 1991).

El grado de protección mediante Pluronic F-68 depende de su concentración en el medio. En muchos casos, en la bibliografía se considera óptima una concentración de 1 g/l (por ejemplo Mizrahi, 1984, Maiorella et al., 1988). En el caso de IL-2SA, la concentración de Pluronic F-68 también es con preferencia 1 g/l (0.1%).

Estructura y nomenclatura de los Pluronic

Los Pluronic generalmente comprenden un bloque central de polioxipropileno hidrofóbico (PPO) entre bloques de polioxietileno (PEO) hidrofílico, en consecuencia se pueden describir generalmente como moléculas de tres bloques PEO_{m}-PPO_{n}-PEO_{m} (ver la Fig. 1). La cantidad de bloques de PEO varía para los diferentes Pluronic de m = 2-130, mientras que la cantidad de bloques de PPO varía de n = 15-67. La nomenclatura de Pluronic provista por BASF Corp. de Parsippany NJ incluye un código de letras para la forma física, es decir, líquida (L), pasta (P) o escamas (F). La letra es seguida por un número de 2 ó 3 dígitos. El primer dígito, o en el caso del código de 3 dígitos, los primeros dos dígitos, multiplicados por 300 indican el peso molecular aproximado de la parte PPO hidrofóbica. El último dígito multiplicado por 10 da el contenido aproximado de PEO hidrofílico de la molécula completa (por ejemplo "8" significa 80% de PEO).

Propiedades físicas de Pluronic F-68

Pluronic F-68 es un sólido (escamas) con 80% de contenido de PEO. El peso molecular promedio de la molécula completa es aproximadamente 8,4 kD (BASF Corp., NJ). Debido al alto contenido de PEO hidrofílico (es decir, 80%), la molécula es más soluble que muchos otros Pluronic (> 100 g/l en agua a 25ºC; información del fabricante, BASF Corp, NJ).

En contraste con los tensioactivos convencionales, la formación de micelas de los copolímeros de tres bloques anfifílicos es intrínsecamente más compleja, y, en general, no se observan CMC (concentración de micela crítica, concentración a la que se forman las micelas a una temperatura dada) o CMT (temperatura de micela crítica, la temperatura a la que se forman las micelas para una concentración dada) marcadas. En cambio, se halla un rango amplio de CMC y/o CMT por técnicas de dispersión luminosa y/o espectroscópicas, por ejemplo, con sondas fluorescentes (Alexandridis and Hatton, 1995). Este rango generalmente es > 100 g/l. Debido a que la formación de micelas es dirigida por la entropía, y la energía libre de la micelización es principalmente una función del bloque de PPO hidrofóbico, Pluronic F-68 con su carácter principalmente hidrofílico no forma micelas fácilmente en agua a TA (Alexandridis et al., 1994). En cambio, para las concentraciones de 10 g/l en agua, la CMT está alrededor de 45-50ºC, mientras que para las concentraciones de 100 g/l, la CMT está alrededor de 30-35ºC. En consecuencia, para TA, la CMC es > 100 g/l
(Alexandridis et al., 1994).

Se sabe que Pluronic F-68 causa contaminación adicional de la membrana en la etapa de ultrafiltración a menudo empleada para concentración/aislamiento inicial. Como se describe en Schulz et al. (1997) mencionado supra, durante la ultrafiltración, se forma una membrana secundaria, cuyas propiedades dominan la retención de los polímeros orgánicos. Como resultado, Pluronic F-68 es al menos parcialmente retenido incluso si se usan membranas límite de peso molecular alto, que solo es posible para los productos particularmente grandes (por ejemplo, 100 kD). En consecuencia, Pluronic F-68 es muy difícil de eliminar por procesos de filtración (Schulz et al., 1997).

Por ejemplo, se proporcionan los datos a partir de un proceso para el aislamiento de una proteína recombinante (IL-2SA). Investigaciones detalladas han demostrado que Pluronic F-68 se coconcentra durante los procesos de ultrafiltración e induce la precipitación de proteína significativa con factores de concentración superiores 20-25 veces (para 1 g/l de Pluronic F-68 en el medio).

Los procedimientos de la presente invención incluyen la ultrafiltración, que se puede obtener usando equipamiento y condiciones estándares conocidas por los expertos en la técnica. La presente invención también incluye una etapa de de ajuste de la conductividad de una solución. Esto se puede conseguir por cualquier forma conocida por los expertos en la técnica. De particular preferencia son diafiltración, dilución o filtración en gel. La de mayor preferencia es diafiltración. Como se usa en la presente, "solución" se refiere a una solución o suspensión.

La invención se describe con más detalle por medio de los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de la naturaleza del precipitado

El análisis del precipitado formado durante la concentración por ultrafiltración del sobrenadante del cultivo celular por espectroscopia de infrarrojo identifica claramente la proteína como el principal componente del precipitado.

Se obtuvo una recolección concentrada 25 veces a partir de la fermentación de IL-2SA. El sobrenadante se sometió a centrifugación y el pellet se redisolvió en PBS. La Recolección concentrada por UF, el sobrenadante de concentración de 25 veces y el pellet redisuelto se analizaron por electroforesis en gel SDS seguido por tinción con plata (ver la Fig. 3a) e inmunotinción (análisis ZAP) con un anticuerpo anti-hIL-2SA (ver la Fig. 3b). A partir de la Fig. 3a, (4) se puede observar que el precipitado, que estaba al menos parcialmente redisuelto en el buffer, en efecto contiene cantidades significativas de proteína. Como se puede observar a partir de la Fig. 3b, (4) también precipita algo de IL-2SA. Sin embargo, la cantidad de IL-2SA precipitado parece ser relativamente baja (comparar 3b, (4) y (3)), lo que es compatible con los rendimientos relativamente razonables de alrededor de 90% del proceso de ultrafiltración convencional. En consecuencia, se puede concluir que la mayor parte de la proteína a granel (proteína de la célula huésped) forma el precipitado encontrado durante la ultrafiltración de los sobrenadantes del cultivo celular.

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Ejemplo 2 Coconcentración de Pluronic F-68

El peso molecular promedio de Pluronic F-68 es 8,4 kD, que es relativamente alto. Debido a la formación de membranas secundarias durante los procesos de ultrafiltración y las condiciones intrínsecamente no homogéneas a lo largo del canal de flujo cruzado, la selectividad de la tecnología de UF convencional usualmente no permite la separación de moléculas significativa en el rango de tamaño de Pluronic. Incluso para membranas de UF de 100 kD, usadas para los productos de proteína más grandes como rFVIII o gp220/350, usualmente se halla una retención y coconcentración significativas de polímeros como Pluronic F-68 (ver, por ejemplo, Schulz et al., 1997). Se puede suponer que el coeficiente de retención R de Pluronic F-68 durante el proceso de ultrafiltración, por ejemplo, con NMWCO de 10 kD (límite de peso molecular nominal) será cercano a 1 (o 100%). Debido a que la concentración de Pluronic F-68 en el medio requerida para obtener una protección celular adecuada durante la fermentación es 1 g/l (0,1%), en consecuencia una concentración de 30 veces llevaría hasta 30 g/l (o 3%) de Pluronic F-68 en el concentrado por UF.

Para confirmar esta hipótesis, las muestras de retenido de varios factores de concentración (1X = sobrenadante del cultivo, 2X, 4X, 8X, 16X y aproximadamente 50X) se sometieron a un análisis por cromatografía en capa fina (TLC). Las concentraciones resultantes de Pluronic F-68 fueron estimadas como 1-2 g/l para 1 y 2X, 4 g/l para 4X, 4-10 g/l para 8X, 10 g/l para 16 X y 50 g/l para 50X. Considerando la inexactitud intrínseca del procedimiento de TLC, estos resultados confirman claramente la coconcentración de Pluronic F-68 casi completa.

Esta coconcentración de Pluronic F-68 posee evidentemente el efecto adicional de incrementar la viscosidad de la solución del producto. Como se puede observar a partir de la Fig. 4, los concentrados de varias corridas de UF muestran efectivamente perfiles de viscosidad similares (en función de la concentración de Pluronic F-68 asumida) como soluciones de Pluronic F-68 de concentración conocida preparadas tanto en medio de cultivo como medio de cultivo diluido.

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Ejemplo 3 Experimentos de adición con Pluronic F-68

Debido a que se ha demostrado que la concentración final de Pluronic F-68 en el retenido de ultrafiltración es usualmente muy alta, se realizaron experimentos de adición con sobrenadante y concentrados de cultivo de diferentes factores de concentración con el fin de caracterizar la influencia de estas concentraciones de Pluronic F-68 superiores sobre la solubilidad de la proteína. Como se puede observar a partir de la Fig. 5, la adición de Pluronic F-68 en las muestras de sobrenadantes del cultivo preconcentrados efectivamente causa una precipitación importante. Como se esperaba, la precipitación inducida por Pluronic-F68 parece ser más fuerte para un factor de concentración mayor. La Fig. 6 muestra la proteína total restante en solución medida por el ensayo de Bradford (después de la centrifugación) en función del factor de concentración y la concentración de Pluronic-F68. Estos resultados son coherentes con las mediciones de A580 y confirman que la proteína está precipitando en función de la concentración de Pluronic F-68 adicionada y el factor de concentración total. Como se puede observar a partir de la Fig. 7, en principio esto también es verdadero para el ejemplo de la molécula del producto IL-2SA.

Se considera que esta inducción de la precipitación de proteína por concentraciones aumentadas de Pluronic F-68 es causada por dos efectos. Primero, la unión de las moléculas de agua a los bloques de PEO hidrofílico del Pluronic F-68 reduce la disponibilidad de las moléculas del agua para la capa de hidratación de las proteínas. Segundo, la concentración de Pluronic F-68 aumentado disminuye la constante dieléctrica el medio, que aumenta las interacciones de Coulomb entre las moléculas de proteína. El resultado total es una reducción de la protección electrostática y, en consecuencia, una disminución de la capacidad del sistema para solvatar completamente las moléculas de proteína.

La proteína comienza a precipitar a las concentraciones de Pluronic F-68 de alrededor de 20-30 g/l (ver la Fig. 8). Esto es compatible con el hecho de que en el proceso convencional, la precipitación fuerte comienza a producirse a una concentración de alrededor de 20-25 veces, ya que a una concentración inicial de 1 g/l de Pluronic F-68 en el medio y 100% de retención, las concentraciones finales serán 20-25 g/l.

Para el ejemplo de IL-2SA, la molécula del producto precipita al concentraciones de Pluronic F-68 algo superiores (ver la Fig. 9), lo que explica que el proceso convencional aún tenga rendimientos relativamente razonables en el proceso de UF mismo, si bien se produjeron grandes pérdidas en las etapas posteriores como resultado de la precipitación.

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Ejemplo comparativo 4

Estrategia hidrodinámica para minimizar la precipitación de proteína

Para minimizar la precipitación de proteína, se debería minimizar la concentración de proteína máxima del sistema. Debido al transporte por convección de los solutos retenidos hacia la superficie de la membrana, la concentración de proteína máxima en cualquier sistema de ultrafiltración de flujo cruzado dado se alcanza en la capa límite laminar de la superficie de la membrana, es decir, equivale a c_{pared}. A partir de un simple equilibrio de masa, se deduce que la concentración de pares depende exponencialmente del flujo del permeado J y el coeficiente de transferencia de masa kD (ver la Fig. 10):

1

Equilibrio de masa para la retención completa (R = 1; comparar la Fig. 10).

Para el caso del flujo turbulento en el canal de flujo relleno con espaciador y capa límite laminar de la superficie de la membrana (modelo de película), se aplica el siguiente equilibrio de masa: (acumulación de masa de proteína en la membrana) = (transporte por convección) - (retrotransporte por difusión)

2

(se emplea la ley de Fick para el transporte por difusión)

con dm/dt = c * F (F = flujo volumétrico a través de la membrana [por ejemplo, litros/h])

3

en estado estacionario, la acumulación de proteínas en la superficie es = 0; la separación de variables lleva a:

4

integración de y = 0 (c = c_{pared}) a y = espesor de la capa laminar S (c = c_{masa}):

5

lleva a:

6

y de este modo al flujo específico (retención completa):

7

En consecuencia, la concentración de superficie normalizada para cualquier flujo del filtrado ajustado J es:

8

Lista de símbolos

A: área

C: concentración

c^{eq}: concentración en equilibrio

D: coeficiente de difusión

S: espesor de la capa límite laminar

F: flujo volumétrico

J: flujo del permeado

k_{D}: coeficiente de transferencia de masa

M: masa

q^{eq}: masa unida por unidad de resina en equilibrio.

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El coeficiente de transferencia de masa (que puede ser estimado sobre la base de la correlación empírica o semiempírica del número de Sherwood con el número de Reynolds y Schmidt) depende de la velocidad de flujo cruzado en el sistema y su geometría. Sin embargo, la transferencia de masa es difícil de optimizar en sistemas de flujo cruzado convencional debido al acoplamiento intrínseco de la fuerza de cizallamiento y la generación de presión (Ver, es decir, Vogel, J. H.: "Kontrollierte Scheraffinitátsfiltration: Eine neue Technik zur integrierten Aufarbeitung pharmazeutischer Proteine aus tierischer Zellkultur". Fortschr.-Ber. VDI Reihe 17, Nr. 185. VDI Verlag, Duesseldorf. ISBN 3-18-318517-2. ISSN 0178-9600.1999, Vogel, J. H., Anspach, B., Kroner, K.-H. Piret, J. M., Haynes, C. A.: Controlled Shear Affinity Filtration (CSAF): A New Technology for Integration of Cell Separation and Protein Aislation from Mammalian Cell Cultures. Biotechnology and Bioengineering. Vol. 78, 7. p. 806-814. 2002, los cuales se incorporan en la presente como referencia). Más específicamente, el incremento de la velocidad de flujo cruzado para aumentar la k_{D} también aumenta el descenso de presión en el canal de flujo. Esto a su vez crea condiciones no homogéneas en las que la c_{pared} puede variar a lo largo del canal de flujo.

En cualquier caso, se ha demostrado que el procedimiento hidrodinámico para reducir la c_{pared} solo reduce ligeramente la precipitación de proteína total inducida por Pluronic, de este modo se permite solo obtener factores de concentración ligeramente superiores sin pérdidas de rendimiento adicional. En consecuencia, hubo fundamentalmente una necesidad de una nueva solución, y este problema se ha resuelto exitosamente con los procesos y productos de acuerdo con la presente invención.

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Ejemplo 5 La influencia de la conductividad sobre la precipitación de proteína inducida por Pluronic

En las condiciones fisiológicas del medio de cultivo celular y la recolección, la solubilidad de proteína es usualmente buena. Sin embargo, se postuló que en el sobrenadante del cultivo celular concentrado, las concentraciones altas de Pluronic extraerán más agua de las capas de hidratación de las proteínas, lo que más probablemente permite las interacciones hidrofóbicas impulsadas termodinámicamente entre las proteínas y finalmente produce la precipitación de proteína. En efecto, esta situación se podría caracterizar por "aumento de competición" para las moléculas de agua necesarios para mantener la solubilidad de las proteínas. Debido a que Pluronic no se puede separar efectivamente, esto se analizó con otros experimentos de adición si una reducción del contenido de sal por diafiltración contra WFI (agua para inyección) ayuda a mantener la solubilidad de las proteínas. Como se puede observar a partir de la Fig. 11, al reducir la conductividad de 11-12 mS/cm (como en la recolección) a aproximadamente 1-1,5 mS/cm, las proteínas parecen precipitar solo a concentración alta de Pluronic F-68.

Con el fin de confirmar la influencia del conductividad, se agregó sal a muestras de baja conductividad para restaurar la conductividad original del sobrenadante del cultivo celular (ver la Fig. 12). Se agregó aCl (solución patrón 1 M) en forma gradual con mezclado al concentrado 50X diafiltrado (aproximadamente 0,9 mS/cm, pH 7,14) para aumentar la conductividad. El aumento de la absorción a A580 y la disminución de la proteína soluble muestran que la adición de nuevo de sal revierte el efecto de la conductividad reducida. En este caso, se induce la fuerte precipitación de proteína, medida por A580 (ver la Fig. 12).

Estos resultados demuestran que la reducción de las concentraciones de las sales puede reducir significativamente o incluso eliminar la precipitación del producto.

Ejemplo 6 La influencia del pH sobre la precipitación

A partir de la Fig. 13 se puede observar que a baja conductividad (es decir, desde 0,5 a 5, particularmente
1,2 mS/cm), se evita en forma eficiente la precipitación. Dichas condiciones se pueden obtener por ejemplo, al mantener un pH de más de 6,7. Si el pH se reduce por debajo de aproximadamente 6,7, los aumentos de A580 indican precipitación, mientras que la filtrabilidad del material comienza a caer. Cabe destacar que el pH de las fermentaciones del cultivo celular está controlado en condiciones neutrales, que aparentemente está dentro del rango de la precipitación minimizada. Una disminución potencial del pH durante el almacenamiento es despreciable debido a que la actividad metabólica de cualquiera de las células viables restantes en la recolección almacenada es baja a una temperatura de almacenamiento de 4ºC. Por el contrario, debido a que el sistema de buffer del medio de cultivo celular está frecuentemente basado en bicarbonato, la liberación de gas de CO_{2} (por ejemplo, durante la UF) lleva a un ligero aumento del pH. En cualquier caso, para valores de pH razonablemente altos, la sensibilidad de precipitación con respecto a la conductividad es superior que la sensibilidad con respecto al pH (ver la Fig. 14).

Ejemplo 7 Un esquema de aislamiento preferido de la invención: UF/DF/UF

Un procedimiento preferido de la invención comprende ultrafiltración, diafiltración, luego ultrafiltración ("UF/DF/ UF") (comparar la Fig. 15). En una primera etapa, el sobrenadante del cultivo celular se concentra por ultrafiltración a un factor de concentración conocido por no causar pérdida de producto, tal como 20X. Luego, en el mismo equipo de UF, el concentrado se diafiltra contra agua (WFI) o buffer para reducir la conductividad al punto en que se evita eficientemente la precipitación del producto inducida por Pluronic. Finalmente, el material también se concentra para obtener factores de concentración muy altos (por ejemplo 75-100X) sin pérdida de producto y con precipitación de proteína a granel minimizada. La concentración inicial está destinada a minimizar el consumo de agua/buffer y el tiempo de proceso total. Mediante esta etapa, el volumen necesario para la posterior diafiltración es solo aproximadamente el 15% del volumen inicial del sobrenadante del cultivo celular. Después de la diafiltración, se reanuda la concentración para obtener factores de concentración final muy altos (por ejemplo >75 - 100 veces). Debido a la fuerza iónica reducida, las proteínas permanecen en solución y la filtrabilidad continúa alta.

Las tres etapas se pueden realizar en el mismo equipo, según se desea. En este caso, no existe aumento de la complejidad y no es necesario material nuevo ni requisitos de hardware. La etapa de UF inicial permite la minimización del consumo de WFI. Debido a que el volumen adicional que se debe filtrar durante la etapa de DF es en consecuencia bajo (usualmente menor de 15% más), el tiempo total del proceso no está significativamente prolongado.

Para el ejemplo de IL-2SA, la Fig. 16 muestra el rendimiento de un proceso de acuerdo con la presente invención medido a diferentes etapas desde un factor de concentración 20X hasta el 100X final. Como se puede observar, el nuevo proceso permite un aumento significativo del factor de concentración, a la vez que simultáneamente se maximiza el rendimiento del producto en comparación con un proceso convencional. Los factores de concentración se aumentan hasta 5 veces y se maximiza el rendimiento. La precipitación se reduce significativamente, como se puede observar a partir de los datos de filtrabilidad mostrados en la Fig. 17.

Ejemplo 8 Influencia de las concentraciones altas de Pluronic sobre el procesamiento posterior/cromatografía de intercambio catiónico

Un factor de concentración superior obtenido por el proceso de UF-DF-UF significa que la concentración de Pluronic F-68 del material que ingresa en la primera columna de purificación también será superior, por ejemplo aproximadamente 75 g/l (o 7,5%) para un valor blanco 75X. En consecuencia, se realizaron otros estudios para evaluar si estas concentraciones de Pluronic F-68 altas podrían tener un impacto negativo sobre la etapa inicial de purificación final. A menudo la primera etapa de purificación es una cromatografía de intercambio catiónico. La Fig. 18 muestra las isotermas de adsorción para una resina de intercambio iónica estándar a 20ºC con y sin Pluronic F-68 agregado adicional. Debido a que el Pluronic F-68 es un componente del medio esencial, no estuvo disponible un concentrado completamente libre de Pluronic. Sin embargo, el concentrado de UF-DF-UF-TCF 75 veces se diluyó hasta 160 veces para la medición de la isoterma "control", que produce muy bajas concentraciones de Pluronic F-68, especialmente para la pendiente inicial de la isoterma. En contraste, la dilución con una solución de 75 g/l de Pluronic F-68 en medio prediluido produce 75 g/l de concentración final de Pluronic F-68 para todos los puntos de la isoterma. Como se puede observar a partir de la figura, ambas isotermas son muy similares, lo que indica ningún efecto negativo de los niveles elevados de Pluronic sobre la termodinámica de la adsorción.

El Pluronic se coconcentrará en prácticamente todos los procesos de ultrafiltración. Como resultado, induce la precipitación de proteína, que usualmente comenzará a un factor de concentración de aproximadamente 20-25 veces. Este problema "universal" de precipitación de proteína lleva a las pérdidas de rendimiento y otros problemas en el proceso de aislamiento/purificación e impide la obtención de factores de concentración superiores.

Usando IL-2SA como ejemplo de modelo, se ha demostrado que la reducción de la fuerza iónica del sobrenadante del cultivo puede evitar o minimizar eficientemente la precipitación de proteína inducida por Pluronic a concentraciones de Pluronic F-68 muy altas.

El nuevo esquema de aislamiento resultante (UF/DF/UF) ofrece una solución eficiente y robusta al problema de la precipitación. Esto permite la obtención de una concentración de hasta 100 veces (es decir, hasta 5 veces superior que en el proceso antiguo), con rendimiento maximizado y filtrabilidad aumentada. Esto, a su vez, facilita drásticamente las operaciones posteriores adicionales.

Además, se ha demostrado que las concentraciones altas de Pluronic F-68 resultantes (hasta 75 g/l y mayores) no tienen influencia negativa sobre la unión de IL-2SA durante el intercambio de cationes posterior.

En consecuencia, el esquema del proceso de UF/DF/UF atrae como una "tecnología de plataforma" muy adecuada para el aislamiento de las proteínas de la fermentación del cultivo celular. Además de su rendimiento aumentado, es robusto y fácil de implementar y utiliza el equipamiento de ultrafiltración y el procedimiento de limpieza estándares iguales a los de la UF convencional.

Se han publicado los siguientes documentos, que se refieren generalmente a la recuperación de las proteínas producidas a partir de cultivos de células de mamífero y de insectos usando la ultrafiltración así como ciertos materiales tales como los polímeros usados en relación con estas:

Alexandridis, P. and Hatton, T. A.: Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) block copolymer surfactants in aqueous solutions and at interfaces: thermodynamics, structure, dynamics, and modeling. Colloids and Surfaces A: 10 Physicochemical and Engineering Aspects 96. 1-46. 1995.

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Boulton-Stone, J. M. and Blake, J. R.: Gas-bubbles bursting at a free surface. J. Fluid Mech. 154. 437-466. 1993.

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Vogel, J. H., Anspach, B., Kroner, K.-H., Piret, J. M., Haynes, C.A.: Controlled Shear Affinity Filtration (CSAF): A New Technology for Integration of Cell Separation and Protein Isolation from Mammalian Cell Cultures. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 78, 7, p. 806-814. 2002.

Claims

1. Un procedimiento para concentrar una proteína a partir de una solución acuosa inicial que tiene componentes en solución, los componentes en solución que comprenden la proteína y un polímero orgánico, el polímero orgánico se selecciona del grupo que consiste en los copolímeros en bloque de la familia de Pluronic, polietilenglicol y polímeros antiespuma, el procedimiento comprende: (1) someter la solución acuosa inicial a ultrafiltración para concentrar la proteína, de modo tal que se produce una primera solución retenida, (2) ajustar la conductividad de la primera solución retenida por debajo de aproximadamente 6 mS/cm medido a 22ºC para producir una segunda solución retenida, y (3) someter la segunda solución retenida a ultrafiltración para concentrar adicionalmente la proteína de modo que se genere una solución concentrada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la conductividad se ajusta por diafiltración contra agua, diluyente o buffer adecuados.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la conductividad de la primera solución retenida se ajusta entre aproximadamente 0,5 a 5 mS/cm medido a 22ºC.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la conductividad de la primera solución retenida se ajusta entre aproximadamente 1,0 a 1,5 mS/cm medido a 22ºC.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polímero orgánico es un copolímero en bloque no iónico.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polímero orgánico es un copolímero en bloque de polioxietileno-polioxipropileno.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución inicial comprende sobrenadante de cultivo de células de mamífero o insecto.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución concentrada tiene al menos una concentración 50 veces superior de proteína que la solución inicial.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución concentrada tiene al menos una concentración 100 veces superior de proteína que la solución inicial.