ES2318344T3 - Procedimiento de diagnostico y/o de pronostico de un sindrome septico. - Google Patents
Procedimiento de diagnostico y/o de pronostico de un sindrome septico. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome séptico de acuerdo con el cual: a) se dispone de una muestra biológica del paciente y se extraen los ácidos nucleicos de la muestra biológica b) se dispone de al menos cinco reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos específicos: reactivo específico del gen diana IL-10, reactivo específico del gen diana TGFa, reactivo específico del gen diana HMG1, reactivo específico del gen diana IL-1a y reactivo especifico del gen diana T-bet c) se determina la expresión de al menos cinco genes diana seleccionados entre: IL-10, TGFa, HMG1, T-bet e IL-1a.
Description
Procedimiento de diagnóstico y/o de pronóstico
de un síndrome séptico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de diagnóstico o de pronóstico de un síndrome
séptico. También se describe un kit de diagnóstico y/o de
pronóstico de un síndrome séptico.
El síndrome séptico, respuesta sistémica a la
infección, representa una de las primeras causas de mortalidad en
los servicios de reanimación. Puede ser el resultado de una
infección bacteriana, vírica, micótica o parasitaria. Entre este
síndrome séptico, se distingue por orden de gravedad creciente
sepsis, sepsis grave y choque séptico. De este modo, un grupo de
expertos propuso en 1992 criterios de definición de estos tres
síndromes clínicos (R. C. Bone et al, The ACCP/SCCM
Consensus Conference Committee. American College of Chest
Physicians/Society of Critical Care Medicine, Chest 101 (6):
1644-1655, 1992):
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De manera general, los signos de sepsis, de
sepsis grave y de choque séptico están próximos y la diferencia
entre estas 3 situaciones reside principalmente en la importancia
de la perturbación de todas las funciones vitales. Durante un
choque séptico, se observa principalmente una caída de la presión
arterial, taquicardia, polipnea, moratones de la piel, hipo- o
hipertermia y escalofríos. Estos signos están acompañados también
por un mal funcionamiento de órganos "diana" con una alteración
de la función de órganos alejados del foco infeccioso (riñones,
pulmones, sistema nervioso central, aparato digestivo y sistema
hematológico afectados generalmente) que se traduce en una oliguria
(<0,5 ml/kg/h), insuficiencia renal, hipoxemia, trombopenia,
agitación, confusión.
La evolución de un síndrome séptico desde la
fase de sepsis hacia una fase de sepsis grave y después de choque
séptico no es sistemática, ya que aproximadamente el 64% de los
pacientes sépticos desarrollan una sepsis grave y el 23% de los
pacientes con sepsis grave evolucionan a choque séptico. Antes de
esta etapa última de choque séptico, deben prescribirse
tratamientos al paciente para interrumpir e invertir el proceso
fisiopatológico.
De este modo, es preciso restaurar un estado
hemodinámico satisfactorio y asegurar una ventilación eficaz.
También es preciso realizar simultáneamente el tratamiento
sintomático del choque y un tratamiento antibiótico adaptado tan
pronto como sea posible a los datos bacteriológicos.
De este modo, parece que aunque algunos
pacientes que desarrollan un síndrome séptico y particularmente un
choque séptico, pueden reanimarse mediante asistencia sanitaria
convencional, tal como un tratamiento antibiótico de amplio
espectro aplicado antes de los resultados de los análisis
bacteriológicos que indican la fuente infecciosa, otros paciente,
que desarrollan un síndrome séptico mucho más grave, necesitan el
empleo de terapéuticos pesados, como la proteína C activada. Además
del coste muy elevado, este tipo de terapéutico expone a los
pacientes a riesgos de efectos indeseables muy importantes
(trastornos de la coagulación, etc.). Por lo tanto, es muy
importante dirigirse de manera eficaz a los pacientes que puedan
beneficiarse de dicho tratamiento.
Debido a esto, el diagnóstico precoz de un
síndrome séptico es esencial y permite proponer un tratamiento
adaptado al paciente. Además, el pronóstico del síndrome séptico y
particularmente de un choque séptico, es primordial para proponer a
cada paciente un tratamiento adaptado y discriminar lo más pronto
posible los pacientes que presentan un síndrome séptico con
pronóstico malo y que necesitan una terapia pesada, de los
pacientes con pronóstico bueno.
Actualmente, el diagnóstico y el pronóstico de
un síndrome séptico y particularmente de un choque séptico se basan
esencialmente en el número de fallos viscerales, la respuesta al
tratamiento sintomático, la accesibilidad del terapéutico médico
y/o quirúrgico al foco infeccioso inicial y a posibles focos
metastáticos.
Esto presenta sin embargo el inconveniente de
que solamente puede aplicarse a una fase avanzada del síndrome
séptico y particularmente del choque séptico, reduciendo las
posibilidades de supervivencia del paciente.
El diagnóstico y el pronóstico de un síndrome
séptico también pueden basarse en la detección de algunas proteínas
o factores solubles implicados en este síndrome, tales como
citoquinas. Puede mencionarse particularmente la publicación de
Thijs & Hack (Intensive Care Med, 1995, 21:
S258-S263), que presenta una revisión de las
concentraciones plasmáticas de algunas citoquinas tales como TNF,
IL-1\beta, IL-6,
IL-8, durante una sepsis. De este modo, la
dosificación de citoquinas, implicadas durante el desarrollo de un
síndrome séptico puede ser un medio de diagnóstico y de pronóstico
de un síndrome séptico. Estos autores describieron de este modo una
correlación positiva entre el contenido plasmático de
IL-1 (Interleuquina-1) y un síndrome
séptico de pronóstico malo (Thijs & Hack, Intensive Care Med
31: S258-263, 1995). Sin embargo, otros autores no
encontraron ninguna correlación entre IL-1 y un
pronóstico malo del síndrome séptico, que sugiere una gran
variabilidad de este factor. Además, dosificaciones elevadas de TNF
(Factor de Necrosis Tumoral) se asociaron también a un pronóstico
malo (Casey et al., Ann Intern Med. 1993. 119:
771-778). El TNF-\alpha y después
IL-1\beta son las dos primeras citoquinas
pro-inflamatorias liberadas por los monocitos
después del comienzo de un estado séptico.
Otros autores demostraron que el contenido de
IL-10 (Interleuquina-10) plasmática
es más alto en los pacientes que desarrollan una sepsis de
pronóstico malo, mientras que decrece significativamente en los
pacientes que presentan una sepsis de pronóstico bueno hasta no ser
detectable en pacientes sanos (Van der Poll, J. Infect. Dis. 175:
118-122, 1997). La IL-10 es una
citoquina anti-inflamatoria muy importante y que,
por su capacidad de inhibir la producción de
TNF-\alpha y de IL-1\beta,
participa en el establecimiento del estado de
inmuno-parálisis. Sin embargo, al ser detectable
este aumento del contenido de IL-10 solamente en el
80% de los pacientes con choque séptico, la detección única de este
factor sigue siendo insuficiente para pronosticar la evolución del
choque séptico.
También puede mencionarse la patente
US-B-6.303.321 que describe un
método de pronóstico de la gravedad de un síndrome séptico que
comprende la medición de la concentración en suero de HMG1
(proteína del grupo de alta movilidad 1) mediante una técnica de
inmunotransferencia. La HMG1, al contrario que
TNF-\alpha e IL-1\beta, se
describe como un mediador pro-inflamatorio tardío
de los síndromes sépticos. Una alta concentración de HMG1 se
correlaciona con un pronóstico malo, no detectándose la
concentración en suero de HMG1 en pacientes sanos. Por el
contrario, se ha descrito en ratón una regulación
post-transcripcional del gen HMG1, que sugiere que
la expresión de este gen solamente debe analizarse a nivel proteico
(Wang et al., Science, 1999, vol 285, p.
248-251).
El documento
EP-A-1 310 567 (OLIGENE GMBH,
14-05-2003) describe un
procedimiento de diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome
séptico [0015], [0046]) de acuerdo con el cual se dispone de una
muestra biológica del paciente (muestra de sangre;
"Patientenmaterial (Blut oder Gewebe)" (material del
paciente (sangre o tejido)) [0046]) y se extraen los ácidos
nucleicos de la muestra ("cRNA [...] oder cDNA Sonden, die dem
Patientenmaterial [...] entstammen" (ARNc o sondas de ADNc,
que proceden del material del paciente), [0046]), se dispone de
al menos cuatro reactivos específicos que comprenden reactivos
específicos de los genes diana IL-1beta,
IL-10, TGFbeta (sondas de hibridación ([0046]);
Tabla 1), se determina la expresión de al menos cuatro genes diana
entre los cuales IL-1 beta, IL-10 y
TGFbeta (Tabla 1 [0046]).
Sin embargo, es importante observar que,
actualmente, ninguna citoquina es reconocida de manera consensuada
como herramienta de diagnóstico o de pronóstico de un síndrome
séptico. Además, la dosificación plasmática de citoquinas se basa
en una reacción antígeno-anticuerpo que puede
falsearse mediante la presencia de reacción cruzada con otros
antígenos no específicos de las citoquinas o mediante la presencia
de citoquinas complejadas en el plasma con un receptor soluble. La
presente invención se propone resolver los inconvenientes del
estado de la técnica presentando una nueva herramienta fiable de
diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome séptico, tal como
particularmente un choque séptico.
De manera sorprendente, los inventores
demostraron que el diagnóstico y/o el pronóstico de un síndrome
séptico puede determinarse mediante el estudio de un panel de genes
seleccionados entre IL-10, TGFI\beta, HMG1,
T-bet (Factor de transcripción de la caja T
específico de células T, T bet), IL-1\beta,
GATA-3 (GATA - proteína de unión 3) y
TNF-\alpha. Además, el análisis en una sola etapa
de la expresión de varios de estos genes permite obtener una
herramienta muy eficaz para el pronóstico y/o diagnóstico de un
síndrome séptico.
Antes de continuar, se proporcionan las
siguientes definiciones para entender mejor la invención.
Se entiende por síndrome séptico, una
respuesta sistémica a la infección. Este síndrome séptico puede
estar en fase de sepsis, sepsis grave o choque séptico.
Preferiblemente, el síndrome séptico es un choque séptico.
Se entiende por muestra biológica,
cualquier material procedente del paciente, que puede contener un
material biológico que permite detectar la expresión de un gen y
puede ser particularmente una muestra de sangre, de suero, de
saliva o de tejido o de células circulantes del paciente. Se dispone
de esta muestra biológica mediante cualquier tipo de extracción
conocido por el especialista en la técnica, tal como
particularmente una toma de sangre.
Se entiende por material biológico,
cualquier material que permite detectar la expresión de un gen,
como particularmente un ácido nucleico o una proteína. El ácido
nucleico puede ser particularmente un ARN (ácido ribonucleico) tal
como un ARNm (ARN mensajero). De acuerdo con una realización
preferida de la invención, el material biológico es un ácido
nucleico y aún más preferiblemente un ARNm (ARN mensajero).
\newpage
La extracción del material biológico de
la muestra biológica durante la etapa a) puede realizarse mediante
todos los protocolos de extracción de ácidos nucleicos o de
proteínas conocidos por el especialista en la técnica.
A título indicativo, la extracción de ácidos
nucleicos puede realizarse particularmente mediante:
- -
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- El especialista en la técnica podrá utilizar otros métodos de Tisis bien conocidos, tales como choques térmicos u osmóticos o lisis químicas con agentes caotrópicos tales como sales de guanidio (US-A-5.234.809).
- -
-
\vtcortauna
Se entiende por reactivo específico, un
reactivo que reacciona con el material biológico para demostrar, de
manera directa o indirecta, la expresión de un gen diana, que puede
determinarse mediante análisis de los ARNm procedentes de este gen
o mediante el análisis de la proteína codificada por este gen.
A título indicativo, cuando se desea determinar
la expresión de un gen diana mediante el análisis de la proteína
codificada por este gen, este reactivo específico comprende al
menos un anticuerpo específico de la proteína codificada por este
gen diana. A título indicativo, cuando se desea determinar la
expresión de un gen diana mediante el análisis de los ARNm
transcritos a partir de este gen, este reactivo específico
comprende al menos un cebador de amplificación específico del ADN
complementario de este ARNm (se habla entonces de cebador de
amplificación específico de un gen diana). El ADN complementario de
un ARNm puede obtenerse de acuerdo con un protocolo bien conocido
por el especialista en la técnica. A título indicativo, se extraen
durante la etapa a) del procedimiento de acuerdo con la invención
los ARN totales (que comprenden ARN ribosómicos, ARN transferentes
y ARNm) de la muestra biológica. A continuación se realiza una
reacción de transcripción inversa con ayuda de una enzima
transcriptasa inversa que permite obtener, a partir de un fragmento
de ARN, un fragmento complementario de ADN. La realización de dicha
etapa es bien conocida por el especialista en la técnica. Cuando se
desea más particularmente obtener únicamente los ADN
complementarios de los ARN mensajeros, se realiza esta etapa
enzimática en presencia de fragmentos de nucleótidos que comprenden
únicamente bases timina (poliT), que hibridan por complementariedad
con la secuencia poliA de los diferentes ARNm para formar un
complejo poliT-poliA que sirve entonces como punto
de partida para la reacción de transcripción inversa realizada por
la enzima transcriptasa inversa. Se obtienen entonces diferentes
ADN complementarios de los diferentes ARN mensajeros inicialmente
presentes en la muestra biológica. En lo sucesivo en la exposición,
se entiende por ADNc, un ADN complementario de un ARN
mensajero.
Por cebador de amplificación, se entiende
un fragmento de nucleótidos que comprende de 5 a 100 motivos de
nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 motivos de nucleótidos y
que posee una especificidad de hibridación en condiciones
determinadas para el inicio de una polimerización enzimática, por
ejemplo en una reacción de amplificación enzimática.
Por reacción de amplificación enzimática,
se entiende un proceso que genera múltiples copias de un fragmento
de nucleótidos diana con ayuda de cebadores de amplificación
específicos mediante la acción de al menos una enzima. Dichas
reacciones de amplificación las conoce bien el especialista en la
técnica y pueden mencionarse particularmente las siguientes
técnicas:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Se habla entonces de amplicones para designar
los polinucleótidos generados mediante una técnica de amplificación
enzimática. Preferiblemente, cuando la amplificación enzimática es
una PCR, el reactivo específico comprende al menos 2 cebadores de
amplificación específicos para amplificar una región particular del
ADN complementario del ARNm procedente del gen diana. Cuando la
amplificación enzimática es una PCR realizada después de una
reacción de transcripción inversa, se habla de
RT-PCR.
Por sonda de hibridación, se entiende un
fragmento de nucleótidos que comprende de 5 a 100 motivos de
nucleótidos, particularmente de 5 a 35 motivos de nucleótidos, que
posee una especificidad de hibridación en condiciones determinadas
para formar un complejo de hibridación con un fragmento de
nucleótidos diana. En la presente invención, el fragmento de
nucleótidos diana puede ser una secuencia de nucleótidos comprendida
en un ARN mensajero o una secuencia de nucleótidos comprendida en
un ADN complementario obtenido mediante transcripción inversa de
dicho ARN mensajero.
Por hibridación, se entiende el proceso
durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos de
nucleótidos, tales como por ejemplo una sonda de hibridación y un
fragmento de nucleótidos diana, que tienen secuencias
suficientemente complementarias, pueden formar una doble cadena con
puentes de hidrógeno estables y específicos.
Un fragmento de nucleótidos "capaz de
hibridar" con un polinucleótido es un fragmento que puede
hibridar con dicho polinucleótido en condiciones de hibridación, que
pueden determinarse en cada caso de forma conocida. Las condiciones
de hibridación se determinan mediante la rigurosidad, es decir el
rigor de las condiciones operatorias. La hibridación es tanto más
específica cuanto a mayor rigurosidad se realiza. La rigurosidad se
define particularmente en función de la composición de bases de un
duplo sonda/diana, así como por el grado de apareamiento erróneo
entre dos ácidos nucleicos. La rigurosidad también puede estar en
función de los parámetros de la reacción, tales como la
concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución
de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes
desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. La rigurosidad
de las condiciones en las que debe realizarse una reacción de
hibridación dependerá principalmente de las sondas de hibridación
utilizadas. Todos estos datos los conoce bien y las condiciones
apropiadas puede determinarlas el especialista en la técnica. En
general, de acuerdo con la longitud de las sondas de hibridación
utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación está
comprendida entre aproximadamente 20 y 70ºC, en particular entre 35
y 65ºC en una solución salina a una concentración
de aproximadamente 0,5 a 1 M. A continuación se realiza una etapa de detección de la reacción de hibridación.
de aproximadamente 0,5 a 1 M. A continuación se realiza una etapa de detección de la reacción de hibridación.
Por detección se entiende una detección
directa mediante un método físico o un método de detección con
ayuda de un marcador. Existen muchos métodos de detección para la
detección de ácidos nucleicos [véase por ejemplo el documento
Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, Na 45(4), p.
453-458 o Keller G.H. et al., DNA Probes, 2ª
ed., Stockton Press, 1993, secciones 5 y 6, p.
173-249]. Por marcador, se entiende un
trazador capaz de generar una señal. Una lista no limitante de
estos trazadores comprende las enzimas que producen una señal
detectable por ejemplo mediante colorimetría, fluorescencia o
luminiscencia, como peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa
alcalina, betagalactosidasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa;
cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminiscentes o
colorantes; grupos con densidad electrónica detectables mediante
microscopia electrónica o mediante sus propiedades eléctricas como
la conductividad, mediante métodos de amperimetría o voltimetría o
mediante mediciones de impedancia; grupos detectables mediante
métodos ópticos como difracción, resonancia de plasmón superficial,
variación del ángulo de contacto o mediante métodos físicos como
espectroscopia de fuerza atómica, efecto túnel, etc.; moléculas
radiactivas como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I. De este modo, el
polinucleótido puede marcarse durante la etapa de amplificación
enzimática, por ejemplo utilizando un nucleótido trifosfato marcado
para la reacción de amplificación. El nucleótido marcado será un
desoxirribonucleótido en los sistemas de amplificación que generan
un ADN, como PCR, o un ribonucleótido en las técnicas de
amplificación que generan un ARN, como las técnicas TMA o NASBA. El
polinucleótido también puede marcarse después de la etapa de
amplificación, por ejemplo hibridándolo con una sonda marcada de
acuerdo con la técnica de hibridación en sándwich descrita en el
documento WO-A-91/19812.
Otro modo particular preferente de marcado de
ácidos nucleicos se describe en la solicitud
FR-A-2 780 059 de la Solicitante.
Otro modo preferente de detección utiliza la actividad exonucleasa
5'-3' de una polimerasa, tal como se describe por
Holland P.M., PNAS (1991) p 7276-7280.
Pueden utilizarse sistemas de amplificación de
la señal como se describe en el documento
WO-A-95/08000 y, en este caso, la
reacción preliminar de amplificación enzimática puede no ser
necesaria.
En la presente invención, la sonda de
hibridación puede ser una sonda llamada de captura. En este
caso, el fragmento de nucleótidos diana puede marcarse previamente
por medio de un marcador. La sonda llamada de captura es
inmovilizada o inmovilizable en un soporte sólido mediante cualquier
medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo
mediante covalencia o adsorción. Se realiza entonces una reacción
de hibridación entre dicha sonda de detección y el fragmento de
nucleótidos diana marcado.
La sonda de hibridación también puede ser una
sonda llamada de detección. En este caso, la sonda de
hibridación puede marcarse por medio de un marcador. Se realiza
entonces una reacción de hibridación entre dicha sonda de captura y
el fragmento de nucleótidos diana.
Ya se utilice una sonda llamada de captura o una
sonda llamada de detección, la reacción de hibridación puede
realizarse en un soporte sólido que incluye todos los materiales en
los que puede inmovilizarse un ácido nucleico. Pueden utilizarse
materiales de síntesis o materiales naturales, opcionalmente
modificados químicamente, como soporte sólido, particularmente
polisacáridos tales como materiales a base de celulosa, por ejemplo
papel, derivados de celulosa tales como acetato de celulosa y
nitrocelulosa o dextrano, polímeros, copolímeros, particularmente a
base de monómeros de tipo estireno, fibras naturales tales como
algodón y fibras sintéticas tales como nylon; materiales minerales
tales como sílice, cuarzo, vidrios, cerámicas; látex; partículas
magnéticas; derivados metálicos, geles, etc. El soporte sólido puede
estar en forma de una placa de microscopio, de una membrana como se
describe en la solicitud
WO-A-94/12670, de una partícula o de
un biochip. Por biochip, se entiende un soporte sólido de
dimensión reducida donde se fijan una multitud de sondas de captura
en posiciones predeterminadas. El concepto de biochip, más
exactamente de chip de ADN, data de principios de los años 90.
Actualmente, este concepto se ha ampliado ya que empiezan a
desarrollarse chips de proteínas. Este concepto se basa en una
tecnología multidisciplinar que integra
micro-electrónica, química de los ácidos nucleicos,
análisis de imágenes e informática. El principio de funcionamiento
se basa en un fundamento de biología molecular: el fenómeno de
hibridación, es decir el apareamiento por complementariedad de las
bases de dos secuencias de ADN y/o de ARN. El método de los
biochips se basa en el empleo de sondas de captura fijadas en un
soporte sólido sobre las que se hace actuar una muestra de
fragmentos de nucleótidos diana marcados directa o indirectamente
con fluorócromos. Las sondas de captura se colocan de manera
específica en el soporte o chip y cada hibridación da una
información particular, en relación con el fragmento de nucleótidos
diana. Las informaciones obtenidas son acumulativas y permiten por
ejemplo cuantificar el nivel de expresión de un gen o de varios
genes diana. Para analizar la expresión de un gen diana, puede
realizarse entonces un biochip que tiene muchas sondas que
corresponden a todo o parte del gen diana, que se transcribe a
ARNm. Se hibridan entonces, por ejemplo, ADN complementarios de los
ARNm procedentes del o de los genes diana que se desea analizar.
Después de la hibridación, el soporte o chip se lava, se lee por
ejemplo con un escáner y el análisis de fluorescencia se trata
informáticamente. Pueden mencionarse a título indicativo, los chips
de ADN desarrollados por la compañía Affymetrix ("Accessing
Genetic Information with High-Density DNA
arrays", M. Chee et al., Science, 1996, 274,
610-614. "Light-generated
oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis" A.
Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 1994, 91,
5022-5026), para los diagnósticos moleculares. En
esta tecnología, las sondas de captura son generalmente de tamaños
reducidos, alrededor de veinte nucleótidos. Otros ejemplos de
biochips se dan en las publicaciones de G. Ramsay, Nature
Biotechnology, 1998, Nº 16, p. 40-44; F. Ginot,
Human Mutation, 1997, Nº 10, p. 1-10; J. Cheng
et al., Molecular diagnosis, 1996, Nº 1(3), p.
183-200; T. Livache et al., Nucleic Acid
Research, 1994, Nº 22(15), p. 2915-2921; J.
Cheng et al., Nature Biotechnology, 1998, Nº 16, p.
541-546 o en las patentes
US-A-4.981.783,
US-A-5.700.637,
US-A-5,445,934,
US-A-5.744.305 y
US-A-5.807.522. La característica
principal del soporte sólido debe ser conservar las características
de hibridación de las sondas de captura en los fragmentos de
nucleótidos diana, generando un ruido de fondo mínimo para el método
de detección.
En la presente invención, la determinación de
la expresión de genes diana puede analizarse mediante la
expresión de los ARNm que se transcriben en un momento dado. En
este caso, el material biológico es un ácido nucleico y el reactivo
específico puede ser indistintamente un cebador de amplificación o
una sonda de hibridación tal como se han definido anteriormente. La
expresión de un gen diana también puede analizarse mediante la
expresión de las proteínas codificadas por el gen diana. En este
caso, el material biológico es una proteína y el reactivo
específico puede ser un anticuerpo específico de la proteína
codificada por el gen diana.
A título indicativo, puede determinarse la
expresión de un gen diana de la siguiente manera:
- 1)
- después de extraer los ARN totales de una muestra biológica tal como se ha definido en la etapa a) del procedimiento de acuerdo con la invención tal como se ha presentado anteriormente, se realiza una etapa de transcripción inversa, tal como se ha descrito anteriormente para obtener los diferentes ADN complementarios de los diferentes ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra biológica (o ADNc)
- 2)
- se amplifican específicamente los ADNc. En este caso, el reactivo específico utilizado comprende al menos un cebador de amplificación específico del gen diana, tal como se ha definido anteriormente. Esta etapa puede realizarse particularmente mediante una reacción de amplificación de tipo PCR o mediante cualquier otra técnica de amplificación tal como se ha definido anteriormente. También pueden amplificarse simultáneamente los ADNc de varios genes diana: se habla entonces de amplificación múltiple.
- 3)
- se determina la expresión del gen diana cuantificando los ADNc. Los ADNc pueden cuantificarse particularmente mediante la utilización de un intervalo de cuantificación obtenido mediante una reacción de amplificación realizada hasta saturación. Para tener en cuenta la variabilidad de eficacia enzimática que puede observarse durante las diferentes etapas (transcripción inversa, PCR, etc.), puede normalizarse la expresión del gen diana de los diferentes grupos de pacientes, mediante la determinación simultánea de la expresión de un gen llamado de mantenimiento, cuya expresión es similar en los diferentes grupos de pacientes. Realizando una relación entre la expresión del gen diana y la expresión del gen de familia, se corrige de este modo cualquier variabilidad entre los diferentes experimentos. El especialista en la técnica podrá remitirse particularmente a las siguientes publicaciones: Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giuliette A methods, 2001, 25: 386-401.
\vskip1.000000\baselineskip
También puede determinarse la expresión de un
gen diana de la siguiente manera:
- 1)
- después de extraer los ARN totales de una muestra biológica tal como se ha definido en la etapa a) del procedimiento de acuerdo con la invención tal como se ha presentado anteriormente, se realiza una etapa de transcripción inversa, tal como se ha descrito anteriormente para obtener los diferentes ADN complementarios de los diferentes ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra biológica (o ADNc)
- 2)
- se inmovilizan los ADN en una membrana
- 3)
- se determina la expresión del gen diana hibridando los ADNc con sondas de hibridación específicas del gen diana marcadas previamente. Dichas técnicas de hibridación las conoce bien el especialista en la técnica y puede mencionarse particularmente la técnica de transferencia de Northern. Esta reacción de hibridación puede realizarse después de una etapa de amplificación específica de los ADN complementarios de los ARN mensajeros de un gen diana particularmente cuando el gen se expresa débilmente.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la expresión de un gen diana
permite entonces disponer de una herramienta para el diagnóstico
y/o pronóstico de un síndrome séptico. Por ejemplo, puede
analizarse la expresión de un gen diana en un paciente del que no
se conoce el pronóstico de su síndrome séptico y, comparando con
valores de expresión media conocidos del gen diana de pacientes con
pronóstico bueno y valores de expresión media conocidos del gen
diana de pacientes con pronóstico malo, determinar si el paciente
tiene un pronóstico bueno o malo para proponerle un tratamiento
adaptado. También puede estudiarse simultáneamente la expresión de
varios genes diana, particularmente mediante la utilización de un
biochip y se determina, en una sola etapa, es decir a partir de una
misma extracción y mediante un solo análisis (con ayuda de
dosificaciones repetidas o de medición en una sola etapa), la
expresión de varios genes diana. A continuación, se analizan los
genes de manera global para un paciente del que no se conoce el
pronóstico de su síndrome séptico y, comparando con valores de
expresión media conocidos de un mismo panel de genes diana de
pacientes con pronóstico bueno y valores de expresión media
conocidos de un mismo panel de genes diana de pacientes con
pronóstico malo, puede determinarse por lo tanto si el paciente
tiene un pronóstico bueno o malo para proponerle un tratamiento
adaptado.
De este modo, se describe un procedimiento de
diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome séptico, de acuerdo
con el cual:
- a)
- se dispone de una muestra biológica del paciente y se extrae material biológico de la muestra biológica
- b)
- se dispone de al menos cuatro reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos específicos: reactivo específico del gen diana IL- 10, reactivo específico del gen diana TGF\beta, reactivo específico del gen diana HMG1, reactivo específico del gen diana T-bet, reactivo específico del gen diana IL-1\beta, reactivo específico del gen diana TNF\alpha y reactivo específico del gen diana GATA-3
- c)
- se determina la expresión de al menos cuatro genes diana seleccionados entre: IL-10, TGF\beta, HMG1, T-bet, IL-1\beta, TNF\alpha y GATA-3.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, la
muestra biológica es una muestra de sangre. De acuerdo con una
realización preferida, el material biológico es un ácido
nucleico.
De acuerdo con una realización preferida, se
extraen los ARN totales de la muestra biológica.
De acuerdo con una realización preferida, el
reactivo específico de IL-10 comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
IL-10, el reactivo específico de TGF\beta
comprende al menos un cebador de amplificación específico del gen
diana TGF\beta, el reactivo específico de HMG1 comprende al menos
un cebador de amplificación específico del gen diana HMG1, el
reactivo específico de T-bet comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
T-bet, el reactivo específico de
IL-1\beta comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana IL-1\beta,
el reactivo específico de TNF\alpha comprende al menos un cebador
de amplificación específico del gen diana TNF\alpha y/o el
reactivo específico de GATA 3 comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana GATA 3.
De acuerdo con otra realización, el reactivo
específico comprende al menos una sonda de hibridación específica
de un gen diana. Preferiblemente, el reactivo específico de
IL-10 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana IL-10, el reactivo
específico de TGF\beta comprende al menos una sonda de
hibridación específica del gen diana TGF\beta, el reactivo
específico de HMG1 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana HMG1, el reactivo específico de
T-bet comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana T-bet, el reactivo
específico de IL-1\beta comprende al menos una
sonda de hibridación específica del gen diana
IL-1\beta, el reactivo específico de TNF\alpha
comprende al menos una sonda de hibridación específica del gen
diana TNF\alpha y/o el reactivo específico de GATA 3 comprende al
menos una sonda de hibridación específica del gen diana GATA 3.
Esta sonda puede ser una sonda de detección o una sonda de captura,
tal como particularmente una sonda de captura inmovilizada en un
biochip.
La invención se refiere preferiblemente a la
determinación de la expresión de los genes diana mediante el
análisis de la expresión de los ARNm.
De acuerdo con una realización preferida, se
dispone durante la etapa b) del procedimiento, de al menos dos
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen TGF\beta y reactivo
específico del gen HMG1 y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento de acuerdo con la invención, la expresión de al menos
dos genes diana seleccionados entre TGF\beta y HMG1.
De acuerdo con una realización preferida, se
dispone, durante la etapa b) del procedimiento, de al menos tres,
preferiblemente de al menos cuatro y aún más preferiblemente de al
menos cinco reactivos específicos seleccionados entre los
siguientes reactivos específicos: reactivo específico del gen
IL-10, reactivo específico del gen TGF\beta,
reactivo específico del gen HMG1, reactivo específico del gen
T-bet, reactivo específico del gen
IL-1\beta, reactivo específico del gen
TNF\alpha y reactivo específico del gen GATA-3 y
se determina, durante la etapa c) del procedimiento de acuerdo con
la invención, la expresión de al menos 3, preferiblemente de al
menos 4 y aún más preferiblemente de al menos 5 genes seleccionados
entre IL-10, TGF\beta, HMG1,
T-bet, IL-1\beta, TNF\alpha y
GATA-3.
De acuerdo con una realización preferida, se
dispone durante la etapa b) del procedimiento, de al menos tres
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen TGF\beta, reactivo
específico del gen HMG1 y reactivo específico del gen
IL-1\beta y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento de acuerdo con la invención, la expresión de al menos
tres genes diana seleccionados entre: TGF\beta, HMG1 e
IL-1\beta.
De acuerdo con otra realización preferida, se
dispone durante la etapa b) del procedimiento, de al menos cuatro
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen TGF\beta, reactivo
específico del gen HMG1, reactivo específico del gen
IL-1\beta y reactivo específico del gen
IL-10 y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento de acuerdo con la invención, la expresión de al menos
cuatro genes diana seleccionados entre: TGF\beta, HMG1,
IL-1\beta e IL-10.
De acuerdo con otra realización preferida, se
dispone durante la etapa b) del procedimiento, de al menos cinco
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen TGF\beta, reactivo
específico del gen HMG1, reactivo específico del gen
IL-1\beta, reactivo específico del gen
IL-10 y reactivo específico del gen
T-bet y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento de acuerdo con la invención, la expresión de al menos
cinco genes diana seleccionados entre: TGF\beta, HMG1,
IL-1\beta, IL-10 y
T-bet.
También se describe un procedimiento de
diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome séptico, tal como se
ha definido anteriormente, de acuerdo con el cual:
- a)
- se dispone de una muestra biológica del paciente, tal como se ha definido anteriormente y se extrae material biológico, tal como se ha definido anteriormente, de la muestra biológica
- b)
- se dispone de al menos un reactivo específico de un gen seleccionado entre los siguientes genes: IL-10, T-bet y GATA-3.
- c)
- se determina la expresión, tal como se ha definido anteriormente, de al menos un gen diana seleccionado entre: IL-10, T-bet y GATA-3.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, la
muestra biológica es una muestra de sangre.
De acuerdo con una realización preferida, el
material biológico es un ácido nucleico.
De acuerdo con una realización preferida, el
reactivo específico es un cebador de amplificación, tal como se ha
definido anteriormente, específico de un gen seleccionado entre
IL-10, T-bet y
GATA-3.
De acuerdo con otra realización preferida, el
reactivo específico de IL-10, T-bet
o de GATA 3 es una sonda de hibridación tal como se ha definido
anteriormente, específica respectivamente de los genes diana
IL-10; T-bet y GATA 3.
También se presenta un procedimiento de
diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome séptico, de acuerdo
con el cual:
- a)
- se dispone de una muestra biológica del paciente y se extraen los ARN totales de la muestra biológica
- b)
- se dispone de al menos un reactivo específico del gen HMG1
- c)
- se determina la expresión de los ARNm del gen HMG1.
\vskip1.000000\baselineskip
Es muy evidente que, en este procedimiento, no
se desea detectar la expresión del gen HMG1 a nivel proteico sino
solamente a nivel de los ARNm. Preferiblemente, el reactivo
específico del gen HMG1 es un cebador de amplificación o una sonda
de hibridación tal como se ha definido anteriormente.
También se presenta un kit de diagnóstico y/o de
pronóstico de un síndrome séptico, que comprende al menos cuatro
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen IL-10,
reactivo específico del gen TGF\beta, reactivo específico del gen
HMG1, reactivo específico del gen T-bet; reactivo
específico del gen IL-1\beta, reactivo específico
del gen TNF\alpha y reactivo específico del gen
GATA-3.
De acuerdo con una realización preferida, el
reactivo específico de IL-10 comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
IL-10, el reactivo específico de TGF\beta
comprende al menos un cebador de amplificación específico del gen
diana TGF\beta, el reactivo específico de HMG1 comprende al menos
un cebador de amplificación específico del gen diana HMG1, el
reactivo específico de T-bet comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
T-bet, el reactivo específico de
IL-1\beta comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana IL-1\beta,
el reactivo específico de TNF\alpha comprende al menos un cebador
de amplificación específico del gen diana TNF\alpha y/o el
reactivo específico de GATA 3 comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana GATA 3.
De acuerdo con otra realización, el reactivo
específico de IL-10 comprende al menos una sonda de
hibridación específica del gen diana IL-10, el
reactivo específico de TGF\beta comprende al menos una sonda de
hibridación específica del gen diana TGF\beta, el reactivo
específico de HMG1 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana HMG1, el reactivo específico de
T-bet comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana T-bet, el reactivo
específico de IL-1\beta comprende al menos una
sonda de hibridación específica del gen diana
IL-1\beta, el reactivo específico de TNF\alpha
comprende al menos una sonda de hibridación específica del gen diana
TNF\alpha y/o el reactivo específico de GATA 3 comprende al menos
una sonda de hibridación específica del gen diana GATA 3.
También se presenta un kit de diagnóstico y/o de
pronóstico de un síndrome séptico que comprende al menos un
reactivo específico seleccionado entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen IL-10,
reactivo específico del gen T-bet y reactivo
específico del gen GATA-3.
De acuerdo con una realización preferida, el
reactivo específico de IL-10 comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
IL-10, el reactivo específico de
T-bet comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana T-bet y/o el
reactivo específico de GATA 3 comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana GATA 3.
De acuerdo con otra realización preferida, el
reactivo específico de IL-10 comprende al menos una
sonda de hibridación específica del gen diana IL-10,
el reactivo específico de T-bet comprende al menos
una sonda de hibridación específica del gen diana
T-bet y/o el reactivo específico de GATA 3 comprende
al menos una sonda de hibridación específica del gen diana GATA
3.
También se presenta un procedimiento de
diagnóstico y/o de pronóstico de un síndrome séptico, de acuerdo
con el cual:
- a)
- se dispone de una muestra biológica del paciente y se extrae material biológico de la muestra biológica
- b)
- se dispone de al menos dos reactivos específicos de al menos dos genes diana seleccionados entre: IL-10, TGF\beta, HMG1, T-bet, IL-1\beta, TNF\alpha y GATA-3.
- c)
- se determina, en una sola etapa, la expresión de al menos dos genes diana seleccionados entre: IL-10, TGF\beta, HMG1, T-bet, IL-1\beta, TNF\alpha y GATA-3.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, la
muestra biológica es una muestra de sangre.
De acuerdo con una realización preferida, se
extraen los ARN totales de la muestra biológica.
El gen diana se selecciona entre
IL-10, TGF\beta, HMG1, T-bet,
IL-1\beta, TNF\alpha y
GATA-3.
De acuerdo con una realización preferida, el
reactivo específico de IL-10 comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
IL-10, el reactivo específico de TGF\beta
comprende al menos un cebador de amplificación específico del gen
diana TGF\beta, el reactivo específico de HMG1 comprende al menos
un cebador de amplificación específico del gen diana HMG1, el
reactivo específico de T-bet comprende al menos un
cebador de amplificación específico del gen diana
T-bet, el reactivo específico de
IL-1\beta comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana IL-1\beta,
el reactivo específico de TNF\alpha comprende al menos un cebador
de amplificación específico del gen diana TNF\alpha y/o el
reactivo específico de GATA 3 comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana GATA 3.
De acuerdo con otra realización, el reactivo
específico comprende al menos una sonda de hibridación específica
de un gen diana. Preferiblemente, el reactivo específico de
IL-10 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana IL-10, el reactivo
específico de TGF\beta comprende al menos una sonda de
hibridación específica del gen diana TGF\beta, el reactivo
específico de HMG1 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana HMG1, el reactivo específico de
T-bet comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana T-bet, el reactivo
específico de IL-1\beta comprende al menos una
sonda de hibridación específica del gen diana
IL-1\beta, el reactivo específico de TNF\alpha
comprende al menos una sonda de hibridación específica del gen diana
TNF\alpha y/o el reactivo específico de GATA 3 comprende al menos
una sonda de hibridación específica del gen diana GATA. 3. Esta
sonda puede ser una sonda de detección o una sonda de captura, tal
como particularmente una sonda de captura inmovilizada en un
biochip.
Se presenta preferiblemente la determinación de
la expresión de los genes diana mediante el análisis de la
expresión de los ARNm. Durante la etapa c), se determina en una
sola etapa, es decir a partir de una misma extracción y mediante un
solo análisis (con ayuda de dosificaciones repetidas o de medición
en una sola etapa), la expresión de al menos dos genes diana. A
continuación, se analizan los genes de manera global para un
paciente del que no se conoce el pronóstico de su síndrome séptico
y, comparando con valores de expresión media conocidos de un mismo
panel de genes diana de pacientes con pronóstico bueno y valores de
expresión media conocidos de un mismo panel de genes diana de
pacientes con pronóstico malo, puede determinarse por lo tanto si
el paciente tiene un pronóstico bueno o malo para proponerle un
tratamiento adaptado.
De acuerdo con una realización preferida, se
dispone, durante la etapa b) del procedimiento, de al menos tres,
preferiblemente de al menos cuatro y aún más preferiblemente de al
menos cinco reactivos específicos seleccionados entre los
siguientes reactivos específicos: reactivo específico del gen
IL-10, reactivo específico del gen TGF\beta,
reactivo específico del gen HMG1, reactivo específico del gen
T-bet; reactivo específico del gen
IL-1\beta, reactivo específico del gen
TNF\alpha y reactivo específico del gen GATA-3 y
se determina, durante la etapa c) del procedimiento, la expresión
de al menos 3 preferiblemente al menos 4 y aún más preferiblemente
de al menos 5 genes seleccionados entre IL-10,
TGF\beta, HMG1, T-bet,
IL-1\beta, TNF\alpha y
GATA-3.
De acuerdo con una realización preferida, se
dispone durante la etapa b) del procedimiento, de al menos tres
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen TGF\beta, reactivo
específico del gen HMG1 y reactivo específico del gen
IL-1\beta y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento, la expresión de al menos tres genes diana
seleccionados entre: TGF\beta, HMG1 e
IL-1\beta.
De acuerdo con otra realización preferida, se
dispone durante la etapa b) del procedimiento, de al menos cuatro
reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos
específicos: reactivo específico del gen TGF\beta, reactivo
específico del gen HMG1, reactivo específico del gen
IL-1\beta y reactivo específico del gen
IL-10 y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento, la expresión de al menos cuatro genes diana
seleccionados entre: TGF\beta, HMG1,
IL-1(3 e IL-10. De acuerdo
con otra realización preferida, se dispone durante la etapa b) del
procedimiento, de al menos cinco reactivos específicos seleccionados
entre los siguientes reactivos específicos: reactivo específico del
gen TGF\beta, reactivo específico del gen HMG1, reactivo
específico del gen IL-1\beta, reactivo específico
del gen IL-10 y reactivo específico del gen
T-bet y se determina, durante la etapa c) del
procedimiento, la expresión de al menos cinco genes diana
seleccionados entre: TGF\beta, HMG1, IL-1\beta,
IL-10 y T-bet.
La figura adjunta se proporciona a modo de
ejemplo explicativo y no tiene ningún carácter limitante. Esta
figura permitirá entender mejor la invención.
La figura 1 presenta un dendograma obtenido a
partir de 31 muestras obtenidas de pacientes de síndrome séptico
con pronóstico bueno (SEP-BP) o con pronóstico malo
(SEP-MP) y la utilización de un panel de sondas que
permite el análisis de la expresión de 5 genes diana de acuerdo con
la invención (IL-10, IL-1\beta,
GATA-3, TGF-\beta y HMG1).
Los siguientes ejemplos se proporcionan a título
ilustrativo y no tienen ningún carácter limitante. Estos ejemplos
permitirán entender mejor la invención.
El estudio se realizó en 42 pacientes que habían
desarrollado un síndrome séptico y admitidos en el servicio de
reanimación quirúrgica o médica del centro hospitalario
Lyon-Sud. También se utilizaron quince voluntarios
sanos, para comparar la expresión de los genes
IL-10, TGF\beta, HMG1, T-bet,
IL-1\beta, TNF\alpha y GATA-3 en
la sangre periférica de pacientes sanos y de pacientes con síndrome
séptico. Se distinguía entonces un grupo de 15 pacientes sanos (S)
y un grupo de 42 pacientes que desarrollan un síndrome séptico
(SEP).
Extracción de los ARN y síntesis de los
ADNc - Para cada paciente, la muestra biológica era una
extracción de sangre, que se obtenía regularmente los 11 primeros
días siguientes al comienzo del síndrome séptico desarrollado por
los pacientes SEP. También se realizó una extracción de acuerdo con
el mismo protocolo en los pacientes sanos (S). Estas extracciones se
recogieron directamente en tubos PAXGene^{TM} Blood RNA
(PreAnalytix, Franklin Lakes, EEUU). Después de la etapa de
extracción de sangre y para obtener una lisis total de las células,
los tubos se dejaron a temperatura ambiente durante 4 h y después
se conservaron a -20ºC hasta la extracción del material biológico.
Más exactamente, en este protocolo, los ARN totales se extrajeron
con ayuda de los kits PAXGene Blood RNA® (PreAnalytix) respetando
las recomendaciones del fabricante. Brevemente, los tubos se
centrifugaron (10 min., 3000 g) para obtener un resto de ácidos
nucleicos. Este resto se lavó y se recogió en un tampón que
contenía proteinasa K necesaria para la digestión de las proteínas
(10 min. a 55ºC). Se realizó un nuevo centrifugado (5 min. 19000 g)
para eliminar los restos celulares y se añadió etanol para
optimizar las condiciones de fijación de los ácido nucleicos. Los
ARN totales se fijaron específicamente en las columnas PAXgene RNA
spin column y, antes de la elución de estos, se realizó una
digestión del ADN contaminante con ayuda del "RNAse free DNAse
set" (Qiagen, Ltd, Crawley, RU).
Para cada extracción, la calidad de los ARN
totales se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa y un
marcado con bromuro de etidio. Se realizó una reacción de
transcripción inversa (RT) en un volumen final de 20 pl. El ARN
total (1 \mug) se mezcló con 1 \mul de poliT a 50 \muM y 1
\mul de dNTP mix (ThermoScript^{TM} RT-PCR
system, Invitrogen) y después se incubó 5 min. a 65ºC. Después de
refrigerado en hielo, la solución se mezcló con 4 \mul de 5x
tampón "cDNA synthesis buffer" 1 \mul de inhibidor de
ribonucleasa "RNAse out" (40 U/\mul), 1 \mul de agua
tratada con DEPC y 1 \mul de Thermoscript RT (15 U/\mul),
obteniéndose todos estos productos del sistema ThermoScript^{TM}
RT-PCR system (Invitrogen). La transcripción
inversa se realizó durante 1 h a 50ºC y después se interrumpió
mediante una incubación de 5 min. a 85ºC. Para terminar, cada
solución de ADNc se diluyó a 1/10 en agua con DEPC.
Preparación de los patrones para la
generación de intervalos de cuantificación - El patrón HMG1 se
preparó mediante una amplificación por PCR (reacción en cadena de
la polimerasa) realizada hasta saturación. Los amplicones obtenidos
se purificaron (PCR purification kit, Qiagen Ltd) y la presencia de
un amplicón único se verificó mediante electroforesis en gel de
agarosa marcado con bromuro de etidio.
Los patrones del gen de mantenimiento
ciclofilina B y genes diana TGF\beta, IL-1\beta,
T-bet, GATA3 e IL-10 se obtuvieron
de Search-LC (Heiiderberg, Alemania).
Análisis de la expresión de los ARNm mediante
PCR en tiempo real - Los ARNm de los genes diana TGF\beta,
IL-1\beta, T-bet, GATA3,
IL-10 y TNF\alpha se cuantificaron mediante PCR
cuantitativa en tiempo real utilizando el LightCycler^{TM}
(Roche). Las reacciones de PCR se realizaron con ayuda del kit
Fast-Start^{TM} DNA Master SYBR Green I
real-time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals).
Cada PCR se realizó en un volumen final de 20 \mul que contenía 1
\mul de LC-Fast Start Reaction Mix SYBR Green I, 1
\mul de LC-Fast Start DNA Master SYBR Green
I/Enzima (incluyendo Taq ADN polimerasa, el tampón de reacción y
una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato), MgCl_{2}
(concentración final 3 mM), cebadores sentido y
anti-sentido (concentración final 0,5 \muM;
obtenidos cada uno de Search-LC - Heidelberg
Alemania) y 10 \mul de solución de ADNc. Después de una etapa de
desnaturalización de 10 min. a 95ºC, se realizó la amplificación
con ayuda de 40 ciclos de un protocolo de PCR "touchdown" (10
s a 95ºC, 10 s de hibridación a 68-58ºC, seguido de
un periodo de extensión de 16 s a 72ºC). Al final de cada ciclo, se
midió la fluorescencia emitida por el SYBR Green.
Para confirmar la especificidad de la
amplificación, los productos de PCR fueron objeto sistemáticamente
de un análisis de curva de fusión (LightCycler^{TM} - Roche).
Para ello, los productos de PCR se trataron con una temperatura
creciente de 58 a 98ºC con un aumento de 0,1ºC/s. Para cada producto
de PCR, se obtuvo un solo pico durante el análisis de la curva,
caracterizado por una temperatura de fusión específica.
La combinación de los cebadores para la
cuantificación de HMG1 utilizada es la descrita por Sortiriou et
al (Breast Cancer Res. 2002, 4: 1-8 que
corresponde a los cebadores sentido: 5'-GCG GAC AAG
GCC CGT TA-3' y anti-sentido:
5'-AGA GGA AGA AGG CCG AAG GA-3'
(producto de PCR: 119 pb).
Las combinaciones de cebadores necesarias para
la cuantificación del gen de mantenimiento ciclofilina B y de los
genes diana TGF\beta, IL-1\beta,
T-bet, GATA3 e IL-10 se obtuvieron
de Search-LC (Heidelberg, Alemania). De este modo,
para el gen de mantenimiento ciclofilina B, el Nº de entrada del
Genbank era M60857 y se amplificaba la región
105-338. Para IL-1\beta, el Nº de
entrada del Genbank era M15330 y se amplificaba la región
438-642. Para TNF\alpha, el Nº de entrada del
Genbank era X01394 y se amplificaba la región
373-783. Para T-bet, el Nº de
entrada del Genbank era AF241243 y se amplificaba la región
461-669. Para GATA3, el Nº de entrada del Genbank
era X55037 y se amplificaba la región 1023-1294.
Para TGF-\beta1, el Nº de entrada del Genbank era
X02812 y se amplificaba la región 1540-1818. Para
IL-10, el Nº de entrada del Genbank era AY029171 y
se amplificaba la región 126-413.
La cantidad de ARNm diana relativa a la cantidad
de ARNm del gen de mantenimiento ciclofilina B se analizó mediante
la técnica de cuantificación relativa con el LightCycler Relative
Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). Se utilizó
el "Second Derivative Maximum Method" (método del máximo de
la segunda derivada) del programa LightCycler^{TM} (Roche)
para determinar automáticamente el Crossing Point (punto de cruce)
(Cp) para cada muestra. El valor del Cp se definió como el número
de ciclos para el que la fluorescencia era significativamente
diferente del ruido de fondo.
Se realizaron cinco diluciones en serie a 1/10
por cuadruplicado con cada patrón para generar una curva patrón que
expresa el Cp en función del logaritmo del número de copias. Las
diluciones de patrón se optimizaron para que la curva patrón cubra
el nivel de expresión esperado para el gen diana y el gen de
mantenimiento. Las curvas patrón relativas que describen la eficacia
de PCR para el gen diana y el gen de mantenimiento se generaron y
se utilizaron para realizar una cuantificación con el LightCycler
Relative Quantification Software (Roche Molecular
Biochemicals).
Los resultados obtenidos se presentan en la
tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta tabla 1 presenta el nivel de expresión de
los ARNm IL-10, IL-1\beta,
TNF\alpha, HMG1, GATA3, TGF\beta y T-bet en 15
pacientes sanos (S) y 42 pacientes que desarrollan en síndrome
séptico (SEP), obtenidos a partir de extracciones de sangre total
obtenidas durante los tres primeros días después del comienzo del
síndrome séptico. La comparación entre el grupo de los paciente S y
SEP se realizó con ayuda del test U no paramétrico de Mann Whitney
y se calculó el valor de probabilidad (p). Los resultados se
expresan mediante la relación de cuantificación relativa entre los
ARNm del gen diana y los ARNm del gen de mantenimiento ciclofilina
B. Los resultados se expresan mediante la media de las relaciones
obtenidas para cada grupo de pacientes. El SEM (error estándar de
la media) también se calculó para cada grupo. Los valores
presentados en la tabla 1 son las medias obtenidas \pm el SEM.
Los valores se consideraban estadísticamente diferentes cuando el
valor de p obtenido era inferior a 0,05.
Los pacientes SEP presentaban un nivel de
expresión de los ARNm IL-10 y TNF\alpha
significativamente mayor con respecto a los voluntarios sanos S
(respectivamente +10% y +4%). De manera sorprendente, los inventores
también mostraron una supresión de los ARNm de HMG1 en pacientes
SEP (+50%). Además los inventores demostraron que el nivel de
expresión de los ARNm T-bet era significativamente
mayor con respecto a los voluntarios sanos S (+24%). Por el
contrario, la expresión de los ARNm GATA3 era significativamente
menor en los pacientes SEP con respecto a los voluntarios sanos S
(-70%).
Conclusión - El estudio de la expresión
de los ARNm de los genes que codifican T-bet y
GATA3, pero también HMG1 a partir de extracciones de sangre total
permite de este modo el diagnóstico de un paciente que desarrolla
un síndrome séptico.
En otro momento, los inventores buscaron una
herramienta para el pronóstico de un síndrome séptico durante las
primeras 72 h después del comienzo de un choque séptico.
Para ello, se realizó un estudio en 42 pacientes
SEP que desarrollan un síndrome séptico y admitidos en el servicio
de reanimación quirúrgica y médica del centro hospitalario
Lyon-Sud. Más exactamente, estos pacientes con
síndrome séptico se seleccionaron durante las primeras 72 h después
del comienzo de un choque séptico de acuerdo con los criterios de
inclusión del American College of Chest Physicians/Society of
Critical Care Medicine tal como se han definido anteriormente. Cada
paciente se sometió a seguimiento durante un periodo máximo de 28
días. Se distinguiría entonces un grupo de 26 pacientes que
desarrollan un síndrome séptico con pronóstico bueno
(SEP-BP) y un grupo de 16 pacientes que desarrollan
un síndrome séptico con pronóstico malo
(SEP-MP).
Extracción de los ARN y síntesis de los
ADNc - Esta etapa se realizó de acuerdo con el protocolo
descrito anteriormente en el ejemplo 1.
Preparación de los patrones para la
generación de los intervalos de cuantificación - Esta etapa se
realizó de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente en el
ejemplo 1.
Análisis de la expresión de los ARNm mediante
PCR en tiempo real - Esta etapa se realizó de acuerdo con el
protocolo descrito anteriormente en el ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se presentan en la
tabla 2 a continuación.
Esta tabla presenta el nivel de expresión de los
ARNm IL-10, IL-1\beta,
TNF\alpha, HMG1, GATA3, TGF\beta y T-bet en
pacientes con pronóstico bueno (SEP- BP) y con pronóstico malo
(SEP-MP) obtenidos a partir de extracciones de
sangre total obtenidas durante los tres primeros días después del
comienzo del choque séptico. La comparación entre el grupo de los
pacientes con pronóstico bueno y con pronóstico malo se realizó con
ayuda del test U no paramétrico de Mann Whitney y se calculó el
valor de probabilidad (p). Los resultados se expresan mediante la
relación de cuantificación relativa entre los ARNm del gen diana y
los ARNm del gen de mantenimiento ciclofilina B. Los resultados se
expresan mediante la media de las relaciones obtenidas para cada
grupo de pacientes. El SEM (error estándar de la media) también se
calculó para cada grupo. Los valores presentados en la tabla 2 son
las medias obtenidas ± el SEM. Los valores se consideraban
estadísticamente diferentes cuando el valor de p obtenido era
inferior a 0,05.
Los pacientes con pronóstico malo presentaban un
nivel de expresión de los ARNm IL-10, TNF\alpha y
HMG1 mayor con respecto a los pacientes con pronóstico bueno. La
diferencia era estadísticamente significativa para
IL-10 y HMG1. Al contrario que
IL-10, TNF\alpha y HMG1, los pacientes con
pronóstico malo tendían a presentar niveles de expresión de los
ARNm GATA3, T-bet, IL-1\beta y
TGF\beta menores que los pacientes con pronóstico bueno.
Los inventores demostraron que el estudio de un
perfil de expresión de varios genes permite obtener una herramienta
de pronóstico del síndrome séptico y particularmente del choque
séptico.
A este respecto, la tabla a continuación
presenta un análisis de agrupamiento jerárquico de 36 pacientes
SEP-BP y SEP-MP utilizando la
expresión de 2 a 5 genes medidas durante los tres primeros días
después del comienzo del choque séptico. La función de agrupamiento
jerárquico del programa Spotfire se utilizó para realizar este
análisis. Los resultados utilizados para el análisis se expresan
mediante la relación de cuantificación relativa entre los ARNm del
gen diana y los ARNm del gen de mantenimiento ciclofilina B. Para
tener en cuenta las diferencias constitutivas de expresión entre los
genes, se normalizaron los niveles de expresión de cada gen
calculando una variable centrada reducida. Para cada uno de los
análisis realizados, se obtuvieron 2 sub-grupos,
uno que agrupaba esencialmente pacientes con pronóstico malo
(SEP-MP) y el otro, pacientes con pronóstico bueno
(SEP-BP). La tabla 3 representa, para cada uno de
los 2 grupos, el porcentaje de pacientes agrupados juntos, es decir
el porcentaje de pacientes clasificado como MP que eran
efectivamente de pronóstico malo y el porcentaje de pacientes
clasificado como BP que eran efectivamente de pronóstico bueno.
Estos resultados muestran que el estudio
simultáneo de la expresión de 2 genes seleccionados entre
IL-10, TGF\beta, IL-1\beta,
HMG1, T-bet, TNF\alpha y GATA3 y particularmente
TGF\beta y HMG1, permite clasificar correctamente más del 80% de
los pacientes SEP-MP. Se obtenían resultados
comparables durante el estudio simultáneo de la expresión de 3
genes seleccionados entre IL-10, TGF\beta,
IL-1\beta, HMG1, T-bet,
TNF\alpha y GATA3 y particularmente TGF\beta,
IL-1\beta y HMG1, el estudio simultáneo de la
expresión de 4 genes seleccionados entre IL-10,
TGF\beta, IL-1\beta, HMG1,
T-bet, TNF\alpha y GATA3 y particularmente
TGF\beta, IL-1\beta, IL-10 y
HMG1, el estudio simultáneo de la expresión de 5 genes seleccionados
entre IL-10, TGF\beta,
IL-1\beta, HMG1, T-bet,
TNF\alpha y GATA3 y particularmente TGF\beta,
IL-1\beta, IL-10,
T-bet y HMG1.
Conclusión - El análisis del perfil de
expresión de al menos dos genes seleccionados entre
IL-10, TGF\beta, IL-1\beta,
HMG1, T-bet, TNF\alpha y GATA3 a partir de
extracciones de sangre total permite de este modo un pronóstico
precoz de la supervivencia de los pacientes que presentan un
síndrome séptico y que desarrollan particularmente un choque
séptico. Más particularmente, el análisis de la expresión de un
panel de genes que comprende al menos IL-10,
IL-1\beta, TGF-\beta y HMG1
permite discriminar muy eficazmente los pacientes con pronóstico
bueno de los pacientes con pronóstico malo. Esto puede permitir al
médico encargado de la reanimación identificar rápidamente a los
pacientes con pronóstico malo y por lo tanto orientar la asistencia
sanitaria de los pacientes hacia la utilización de tratamientos
pesados y costosos.
Los resultados presentados en el ejemplo 2 se
validaron mediante la utilización de otra técnica, aplicada en
nuevas muestras de pacientes. Para ello, se realizó un estudio en
31 pacientes que desarrollan un síndrome séptico y admitidos en el
servicio de reanimación quirúrgica y médica del centro hospitalario
Lyon-Sud. Más exactamente, estos pacientes de
síndrome séptico se seleccionaron entre el segundo y el cuarto día
después del comienzo de un choque séptico de acuerdo con los
criterios de inclusión del American College of Chest
Physicians/Society of Critical Care Medicine tal como se han
definido anteriormente. Cada paciente se sometió a seguimiento
durante un periodo máximo de 28 días. Se distinguiría entonces un
grupo de 21 pacientes que desarrollan un síndrome séptico con
pronóstico bueno (SEP-BP) y un grupo de 10
pacientes que desarrollan un síndrome séptico con pronóstico malo
(SEP-MP).
Extracción de los ARNm - Esta etapa se
realizó de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente en el
ejemplo 1.
Análisis de la expresión de los ARNm en chip
de ADN - se realizó una síntesis de ADNc y después ADN de doble
cadena, a partir de los ARN extraídos. A continuación, se
utilizaron los ADN de cadena doble como base para una transcripción
in vitro durante la cual se realiza en marcado de los ARNc. A
continuación, se hibridaron los ARNc en el chip. El escáner permitía
la lectura de la fluorescencia.
Los resultados obtenidos se presentan en la
figura 1. En el dendograma se encuentran 31 columnas que
corresponden a las 31 muestras de pacientes y 5 líneas que
corresponden a las 5 sondas utilizadas para el análisis de la
expresión de los 5 genes diana. Las muestras, así como los genes que
tienen un perfil de expresión comparable, demostrado mediante una
correlación de tipo Pearson, se colocaron unos al lado de otros.
Las muestras se clasificaron de acuerdo con el método de media no
ponderada (Spotfire Decision Site for Functional Genomics V7.1,
manual) mientras que los genes se clasificaron según el valor medio
de expresión obtenido en el conjunto de las muestras. Después de la
normalización de las señales de fluorescencia generadas por el
programa Microarray Suite (MAS5.0, Affymetrix), el nivel de
expresión se representa mediante diferentes niveles de color. De
este modo, el color blanco corresponde a un nivel reducido de
expresión, el color gris corresponde a un nivel de expresión
intermedio, mientras que el color negro corresponde a un alto nivel
de expresión. La longitud de las ramas del dendograma se
correlaciona con el perfil de expresión y la línea de puntos que
divide el dendograma permite distinguir dos grupos de pacientes: un
primer grupo de pacientes con pronóstico malo
"SEP-MP" y un segundo grupo de pacientes con
pronóstico bueno "SEP-BP".
Estos resultados mostraban que el estudio
simultáneo de la expresión de 5 genes seleccionados entre
IL-10, TGF\beta, IL-1\beta,
HMG1, T-bet, TNF\alpha y GATA3 y particularmente
TGF\beta, IL-1\beta, IL-10,
T-bet y HMG1 permiten clasificar correctamente el
70% de los pacientes. Los inventores también demostraron que el
estudio de un perfil de expresión de varios genes tal como se ha
definido en el ejemplo 2 para pacientes durante las primeras 72 h
después del comienzo de un choque séptico, también era aplicable
para pacientes entre el segundo y el cuarto día después del
comienzo de un choque séptico.
Conclusión - El análisis del perfil de
expresión de al menos dos genes seleccionados entre
IL-10, TGF\beta, IL-1\beta,
HMG1, T-bet, TNF\alpha y GATA3 a partir de
extracciones de sangre total permite de este modo un pronóstico de
la supervivencia de los pacientes durante las primeras 72 h después
del comienzo de un choque séptico, pero también entre el segundo y
el cuarto día después del comienzo de un choque séptico. Más
particularmente, el análisis de la expresión de un panel de genes
que comprende al menos IL-10,
IL-1\beta, TGF-\beta y HMG1
permite discriminar muy eficazmente los pacientes con pronóstico
bueno de los pacientes con pronóstico malo, al comienzo del choque
séptico y varios días después. Esto puede permitir al médico
encargado de la reanimación identificar rápidamente a los pacientes
con pronóstico malo y por lo tanto orientar la asistencia sanitaria
de los pacientes hacia la utilización de tratamientos pesados y
costosos.
Claims (4)
1. Procedimiento de diagnóstico y/o de
pronóstico de un síndrome séptico de acuerdo con el cual:
- a)
- se dispone de una muestra biológica del paciente y se extraen los ácidos nucleicos de la muestra biológica
- b)
- se dispone de al menos cinco reactivos específicos seleccionados entre los siguientes reactivos específicos: reactivo específico del gen diana IL-10, reactivo específico del gen diana TGF\beta, reactivo específico del gen diana HMG1, reactivo específico del gen diana IL-1\beta y reactivo especifico del gen diana T-bet
- c)
- se determina la expresión de al menos cinco genes diana seleccionados entre: IL-10, TGF\beta, HMG1, T-bet e IL-1\beta.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra biológica es una muestra de
sangre.
3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el reactivo específico de
IL-10 comprende al menos un cebador de
amplificación especifico del gen diana IL-10, el
reactivo específico de TGF\beta comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana TGF\beta, el reactivo
especifico de HMG1 comprende al menos un cebador de amplificación
específico del gen diana HMG1, el reactivo específico de
IL-1\beta comprende al menos un cebador de
amplificación específico del gen diana IL-1\beta
y/o el reactivo específico de T-bet comprende al
menos un cebador de amplificación específico del gen diana
T-bet.
4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el reactivo específico de
IL-10 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana IL-10, el reactivo
específico de TGF\beta comprende al menos una sonda de
hibridación especifica del gen diana TGF\beta, el reactivo
específico de HMG1 comprende al menos una sonda de hibridación
específica del gen diana HMG1, el reactivo especifico de
IL-1\beta comprende al menos una sonda de
hibridación específica del gen diana IL-1\beta y/o
el reactivo específico de T-bet comprende al menos
una sonda de hibridación específica del gen diana
T-bet.
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