ES2318747T3

ES2318747T3 - Composiciones de peroxidasas antimicrobianas mejoradas.

Info

Publication number: ES2318747T3
Application number: ES06741316T
Authority: ES
Inventors: Dave Van Den Plas; Kris De Smet; Philippe Sollie
Original assignee: Flen Pharma NV
Current assignee: Flen Pharma NV
Priority date: 2005-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2026-06-13
Also published as: CY1108814T1; CA2611796C; WO2006133523A2; NZ564307A; CA2611796A1; PL1893187T3; AU2006257730B2; EP1893187B1; DK1893187T3; EP1893187A2; PT1893187E; DE06741316T1; WO2006133523A3; AU2006257730A1; US8679526B2; US20090285890A1; ATE414531T1; DE602006003760D1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende una combinación de - un peróxido o un sistema formador de peróxido - una o más peroxidasas - uno o más agentes estimulantes. caracterizado porque el uno o más agentes estimulantes es una molécula de benceno sustituida con un grupo -OH o un grupo (CH 2) nOH (n = 1, 2, 3 ó 4) y sustituida con un grupo alcoxi con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono y sustituida opcionalmente además con uno a 4 sustituyentes, seleccionado cada uno de los mismos independientemente de entre el grupo que consiste en un grupo hidroxi, un aldehído, una cetona, un ácido y un halógeno, un grupo hidroxialquilo con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, un grupo alquilo lineal o ramificado o un grupo alquenilo lineal o ramificado con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, encontrándose dichos grupos hidroxialquilo, alquilo o alquenilo sustituidos opcionalmente además con un grupo halógeno, carboxilo, hidroxilo, aldehído o cetona.

Description

Composiciones de peroxidasas antimicrobianas mejoradas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas antimicrobianas para utilización tópica y al tratamiento de heridas e infecciones utilizando dichas composiciones. Más particularmente, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden compuestos para aumentar y/o estabilizar la actividad de las peroxidasas antimicrobianas.

Antecedentes de la invención

Las peroxidasas se han utilizado desde hace mucho tiempo en el lavado de ropa, para procesos de decoloración en las industrias textil y papelera y asimismo como agentes antimicrobianos. Las peroxidasas se utilizan se utilizan en dichas aplicaciones para convertir el peróxido de hidrógeno en radicales. Se han descrito determinados compuestos orgánicos tales como el ácido p-hidroxicinámico, el 2,4-diclorofenol, el sulfonato de p-hidroxibenceno, la vainillina, el ácido p-hidroxibenzoico y derivados en procesos industriales para la decoloración textil (WO 9218683).

La actividad antimicrobiana de los sistemas basados en la peroxidasa depende del tipo del dador de electrones. El documento EP 514417 demuestra el efecto de los iones yoduro y tiocianato en la actividad antimicrobiana frente bacterias y hongos. Dicha patente demuestra asimismo el efecto estimulante de los antioxidantes en la actividad de las peroxidasas. Se ha especificado que las composiciones descritas resultan activas tanto contra bacterias como contra levaduras comprenden entre 0,5 y 200 mg/kg de aniones de yoduro, entre 2 y 100 mg/kg de aniones de tiocianato, y entre 0,2 y 100 g/kg de D-glucosa. El peso: la proporción en peso de los aniones yoduro tiocianato en las composiciones descritas se encuentra comprendida entre 0,1:1 y 50:1 y la concentración combinada en peso de los aniones es por lo menos de 5 mg/kg. Dichas composiciones comprenden además entre 10 y 100000 U/kg de lactoperoxidasa, y comprenden entre 150 y 4000 U/kg glucosa oxidasa. El documento US 4476108 da a conocer un método para producir radicales libres antimicrobianos en la boca durante un período controlado de tiempo aplicando de una combinación de una peroxidasa, un peróxido y una fuente de moléculas dadoras dentro de unos niveles de concentración predeterminados. La preparación se utiliza preferentemente en un excipiente líquido o pastoso. El excipiente puede ser agua, pasta dentífrica con una formulación estándar, un enjuague bucal con una formulación estándar, chicle, pasta protectora, un producto limpiador de prótesis dentales y geles de lavado bucodental. Más particularmente, da a conocer unas composiciones antimicrobianas para aplicación oral con actividad a corto plazo (inferior a dos minutos) utilizando peróxido, una peroxidasa, una molécula dadora tal como la feniletilamina, la tirosina, el triptófano, el ácido benzoico, el ácido salicílico, la hidroquinona, la deshidrofenilalanina, la vainillina y el ácido paraaminobenzoico. El documento US 20020119136 describe una clase de compuestos de dialcoxifenol (por ejemplo, la acetosiringona y los alquilsiringatos) con un efecto estimulante en las peroxidasas.

La actividad antimicrobiana tal como la efectuada contra hongos y bacterias se ha atribuido a compuestos aromáticos tales como el siringaldehído y la vainillina [Fitzgerald et al. (2005). J Agric Food Chem. 53, 1769-1775; Fitzgerald et al. (2004). J Appl Microbiol. 97, 104-113]. La actividad antimicrobiana se observa únicamente, sin embargo, a unas concentraciones elevadas y tras unos períodos prolongados de incubación. A pesar de la variedad existente de compuestos estimulantes de la peroxidasa existe la necesidad de compuestos adicionales estimulantes de la peroxidasa, que sean atóxicos, resulten suficientemente solubles para utilizar en composiciones acuosas y presenten el efecto antimicrobiano prolongado pretendido para aplicaciones médicas tal como la desinfección de heridas. El documento WO 02/08377 da a conocer unas composiciones antimicrobianas que comprenden unos componentes enzimáticos y opcionalmente unos agentes estimulantes.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que un grupo determinado de moléculas sustituidas de benceno o fenol, que son hidrosolubles y presentan una hidrofobicidad moderada, resultan especialmente apropiadas para potenciar una composición farmacéutica antimicrobiana basada en peroxidasas para una aplicación tópica prolongada.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa y un agente estimulante caracterizada porque el agente estimulante es una molécula de benceno sustituida con un grupo -OH o un grupo (CH_{2})_{n}OH (n = 1, 2, 3 ó 4) y sustituida con un grupo alcoxi (-OR) con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Aparte de dichos dos sustituyentes requeridos, las moléculas de benceno se pueden sustituir opcionalmente con de uno a 4 sustituyentes, seleccionado cada uno de los mismos independientemente de entre el grupo que consiste en un grupo hidroxi, un aldehído, una cetona, un ácido, un halógeno (I, F, Cl, Br), un grupo hidroxialquilo con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, un grupo alquilo lineal o ramificado o un grupo alquenilo lineal o ramificado con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, encontrándose dichos grupos hidroxialquilo, alquilo o alquenilo sustituidos opcionalmente con un grupo halógeno, carboxilo, hidroxilo, aldehído o cetona. La molécula de benceno sustituida es preferentemente hidrosoluble a una concentración de por lo menos un 0,1% (p/v). Además, la molécula de benceno sustituida puede ser una molécula lipófila con un coeficiente de partición octanol/agua X log P comprendido entre 1 y 4. Habitualmente, la combinación del peróxido o el sistema formador de peróxido, la peroxidasa y el agente estimulante combinado opcionalmente con uno o más haluros y/o pseudohaluros se encuentra presente en la composición farmacéutica como principio activo antimicrobiano. Según una forma de realización dicha combinación se encuentra presente como único principio antimicrobiano en la composición farmacéutica. La presente invención describe la combinación del peróxido o el sistema formador de peróxido, la peroxidasa y el agente estimulante descritos en la presente memoria para utilizar como medicamento. Más particularmente, la utilización de la combinación de la presente invención se prevé para el tratamiento y/o prevención de trastornos cutáneos. La composición farmacéutica está dirigida al uso tópico, más particularmente a la utilización en la piel y es, por ejemplo, un apósito hidrófilo para heridas. En el benceno sustituido, el grupo -OH o (CH_{2})_{n}OH
(n = 1, 2, 3 ó 4) y el grupo alcoxi se pueden disponer en la posición orto-. Dicha molécula de benceno sustituida puede ser un hidroxialquilalcoxibenceno o un alcoxifenol o puede ser un hidroxialquilalcoxibenzaldehído o un hidroxialcoxibenzaldehído. La molécula de benceno sustituido puede pertenecer a un grupo con una estructura general representada por la fórmula (I)

1

en la que R es -CH_{3} o -CH_{2}CH_{3}, en la que X se selecciona de entre el grupo que consiste en -H, -CHO y -COCH_{3}, en la que Y se selecciona de entre el grupo que consiste en -H, un halógeno y un grupo alquilo con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, y en la que ambas posiciones Z se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en -H y un grupo alquilo con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Dicha molécula de benceno sustituido puede ser un metoxifenol tal como el guayacol o puede ser un hidroximetoxibenzaldehído tal como la vainillina. La peroxidasa de la composición puede ser una lactoperoxidasa y la composición comprende además los iones yoduro y/o tiocianato. La peroxidasa se puede encontrar presente en una concentración comprendida entre 10 y 100 U/kg. El sistema formador de peróxido es en una forma de realización es un sistema enzimático formador de peróxidos que comprende un enzima oxidasa. Según una forma de realización particular, el enzima formador de peróxido de hidrógeno es una glucosa oxidasa. La molécula de benceno que actúa como agente estimulante se puede encontrar presente en la composición farmacéutica en una concentración comprendida entre aproximadamente 0,01 y 10 mM/l. Uno o más haluros y/o pseudohaluros se pueden encontrar presentes en una concentración comprendida entre 0,1 y 200 mg/kg.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un agente estimulante simple o comprenden una mezcla de distintos agentes estimulantes en unas proporciones distintas.

Una forma de realización particular de la presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente que comprenden además uno o más haluros o pseudohaluros o tiocianatos. Más particularmente, las composiciones comprenden un haluro. Más particularmente, las composiciones de la presente invención comprenden un haluro y no un tiocianato.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de una composición que comprende un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa y un agente estimulante, para la realización de un medicamento para el tratamiento de trastornos cutáneos. Según una forma de realización particular, la utilización de una composición comprende como único principio antimicrobiano la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, uno o más haluros o pseudohaluros y un agente estimulante. Más particularmente, las composiciones para utilizar en los métodos de realización de la presente invención comprenden la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante, y un haluro. Adicionalmente o alternativamente, las combinaciones utilizadas en el contexto de la presente invención no comprenden un tiocianato. Una forma de realización particular de la presente invención se refiere a composiciones para utilizar en los métodos de realización de la presente invención que comprenden la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante sin un haluro o pseudohaluro.

Más particularmente, la utilización tópica de las composiciones de la presente invención se prevé en el contexto del tratamiento y la prevención de infecciones microbianas, por ejemplo, de la piel. Más particularmente, se prevé la utilización de la combinación descrita en la realización de una composición antimicrobiana, en la que el agente estimulante es una molécula de benceno sustituida tal como se ha definido en el primer aspecto de la presente invención.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al tratamiento o a la prevención de un trastorno cutáneo, más particularmente una infección microbiana en. la piel, el pelo o las. uñas de un animal o de un ser humano, que comprende la etapa de poner en contacto la piel, el pelo, o las uñas con la composición que comprende una cantidad efectiva de la combinación de la presente invención, que comprende un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa o un agente estimulante, en la que el agente estimulante es una o más moléculas de benceno sustituido tal como se ha definido en el primer aspecto de la presente invención. Más particularmente, las composiciones para utilizar en los métodos de tratamiento de la presente invención comprenden la combinación de un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, uno o más haluros o pseudohaluros y un agente estimulante. Las formas de realización adicionales de la presente invención se refieren a la utilización de composiciones que comprenden la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante y un haluro. Adicionalmente o alternativamente, las combinaciones utilizadas en el contexto de la presente invención se refieren a composiciones que no comprenden un tiocianato. Una forma de realización particular de la presente invención se refiere a composiciones para utilizar la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante, sin haluros o pseudohaluros.

Más particularmente, la presente invención proporciona unas composiciones que comprenden como único principio antimicrobiano, la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, por lo menos uno o más haluros o pseudohaluros y un agente estimulante. En una forma de realización particular, la piel, el pelo o las uñas se ponen en contacto con las composiciones de la presente invención entre 2 y 8 horas. Según una forma de realización particular, el trastorno cutáneo es una herida o una quemadura.

Una forma de realización particular de la presente invención se refiere a composiciones que comprenden la combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante y opcionalmente uno o más pseudohaluros formulados específicamente para obtener un efecto antimicrobiano cuando se realiza una aplicación tópica. Habitualmente, la composición es un hidrogel hidrófilo. Según una forma de realización particular, la presente invención se proporciona como apósito para heridas o se proporciona para utilizar en o para la impregnación de apósitos para heridas estructurales. Habitualmente, la composición se envasa en un recipiente hermético. De este modo, la presente invención proporciona asimismo unos apósitos para heridas que comprenden un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante y opcionalmente uno o más haluros o pseudohaluros caracterizados porque el agente estimulante es una molécula de benceno sustituida tal como se define en el primer aspecto de la presente invención. En una forma de realización particular, la combinación de un sistema generador de peróxidos, una peroxidasa y un agente estimulante se proporciona como único principio antimicrobiano de la misma.

Los agentes estimulantes de la presente invención que presentan una hidrosolubilidad moderada (por lo menos
0,1 mg/ml) o elevada (por lo menos 1 mg/ml) resultan particularmente apropiados para formularse en un hidrogel.

Otra forma de realización particular de la presente invención se refiere a un apósito para heridas en forma hidrogel hidrófilo que comprende como principios activos antimicrobianos un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, guayacol y opcionalmente uno o más haluros o pseudohaluros.

Otra forma de realización particular de la presente invención se refiere a un apósito para heridas en forma hidrogel hidrófilo que comprende como principios activos antimicrobianos un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, vainillina y opcionalmente uno o más haluros o pseudohaluros.

Otra forma de realización particular de la presente invención se refiere a la utilización de una composición que comprende como principios activos antimicrobianos un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, vainillina y opcionalmente uno o más haluros o pseudohaluros para la realización de un medicamento para uso tópico con actividad antimicrobiana.

Otra forma de realización particular de la presente invención se refiere a la utilización de una composición que comprende como principios activos antimicrobianos un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, guayacol y opcionalmente uno o más haluros o pseudohaluros para la realización de un medicamento para uso tópico con actividad antimicrobiana.

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Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa el efecto antimicrobiano en Staphylococcus aureus de mezclas de compuestos según una forma de realización de la presente invención y oxidasa/peroxidasa A: guayacol; B: vainillina; C: etilvainillina; D: siringaldehído (ejemplo comparativo) (\blacklozenge: agente estimulante y ES (sustrato (glucosa, KSCN, Kl) y enzimas (oxidasa/peroxidasa)), \blacksquare: agente estimulante únicamente; \ding{115} ES (sustrato (glucosa, KSCN, Kl) y oxidasa/peroxidasa) únicamente.

La Figura 2 representa el efecto antimicrobiano de composiciones que comprenden agentes estimulantes en S. aureus según una forma de realización de la presente invención. Las composiciones comprenden el agente estimulante indicado, sustrato (glucosa, KSCN, Kl) y enzima (oxidasa/peroxidasa) (las barras marcadas con * representan ejemplos comparativos) (los resultados son la media de dos experimentos independientes). 100% indica enzima y sustrato sin sustancias añadidas.

La Figura 3 representa la decoloración con radicales DPPH de compuestos según una forma de realización de la presente invención (los ejemplos comparativos se indican con *). Los resultados son la media de dos experimentos independientes.

La Figura 4 representa la decoloración con \beta-carotenos de compuestos según una forma de realización de la presente invención (los ejemplos comparativos se indican con *). (Los resultados son la media de dos experimentos independientes).

La Figura 5 representa el efecto antimicrobiano en bacterias Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
(MRSA) bacteria de composiciones según una forma de realización de la presente invención que comprende ES (= enzima (oxidasa/peroxidasa) + sustrato (glucosa), KSCN, Kl), ES + agente estimulante, o agente estimulante solo.

La Figura 6 representa el efecto de distintas concentraciones de composiciones que comprenden enzimas, sustrato y distintas concentraciones de guayacol en bacterias Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA).

La Figura 7 representa el efecto antimicrobiano en Escherichia coli (bacteria gramnegativa) de mezclas de composiciones según una forma de realización de la presente invención comprendiendo ES (= enzima (oxidasa/peroxidasa) + sustrato (glucosa), KSCN, Kl) solo, ES + agente estimulante, o agente estimulante solo tras 6 horas de incubación.

La Figura 8 representa el retraso del crecimiento de bacterias MRSA en presencia de ES (enzima, sustrato + haluro), guayacol (G) y enzima, sustrato + haluro con guayacol (ES + G). El medio de cultivo sin oxidasa/peroxidasa se utiliza como referencia (control) según una forma de realización de la presente invención.

La Figura 9 representa el retraso de Candida albicans en presencia de oxidasa/peroxidasa, sustrato + haluro (ES), guayacol (G), oxidasa/ peroxidasa, sustrato + haluro con guayacol (ES + G), oxidasa/peroxidasa, sustrato + haluro con vainillina (ES + V) según una forma de realización de la presente invención. El medio sin oxidasa/ peroxidasa se utiliza como referencia (control).

La Figura 10 representa la toxicidad celular de la oxidasa/peroxidasa + sustrato + haluro (ES) con y sin guayacol en células de mamíferos (panel superior: queratinocitos HaCaT, panel inferior fibroblastos 3T3) según una forma de realización de la presente invención.

La Figura 11 representa el efecto antimicrobiano de la oxidasa/peroxidasa + sustrato + haluro (ES), con y sin guayacol en bacterias grampositivas y gramnegativas según una forma de realización de la presente invención.

La Figura 12 representa el efecto antimicrobiano de una formulación de hidrogel con oxidasa/peroxidasa + sustrato (+ haluro), con guayacol o guayacol + vainillina en bacterias anaeróbicas según una forma de realización de la presente invención. Las composiciones del hidrogel se describen en la tabla 3.

La Figura 13 representa el efecto antifúngico de la oxidasa/peroxidasa + sustrato + (haluro), y guayacol según una forma de realización de la presente invención. Las composiciones del hidrogel se describen en la tabla 3.

La Figura 14 representa el efecto antimicrobiano de una formulación de hidrogel con oxidasa/peroxidasa + sustrato + haluro), con guayacol o guayacol + vainillina en bacterias aeróbicas según una forma de realización de la presente invención. Las composiciones del hidrogel se describen en la tabla 3.

Descripción detallada de la invención Definiciones

"Peroxidasa" se refiere a los enzimas de la clase EC 1.11.1.7 y comprende la lactoperoxidasa.

Tal como se utiliza en la presente invención la referencia a "enzima/sustrato" o "ES" se refiere a la combinación del sistema oxidasa/peroxidasa y su sustrato.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "haluro" se refiere a un ión de halógeno. Un "pseudohaluro" se refiere a un anión poliatómico parecido a los haluros en su química ácido - básica y de oxidación - reducción. Estos comprenden los iones cianuro, tiocianato, tiosulfato y azida.

"Antimicrobiano" se refiere a destruir o retrasar el crecimiento de microbios. Los microbios comprenden bacterias tales como bacterias gramnegativas (por ejemplo, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa), bacterias grampositivas (por ejemplo Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes) y bacterias formadoras de esporas. Los microbios comprenden hongos tales como mohos (por ejemplo Aspergillus niger, Penicillium funiculosum), levaduras (por ejemplo, Candida albicans, Saccharomvces cerevisiae, Pityrosporum ovale) y hongos dermatófitos (por ejemplo Trichophyton rubrum). El término antimicrobiano, por lo tanto, comprende los términos "bactericida", "bacteriostático", "fungicida" y "fungostático". Los microbios pueden comprender asimismo microalgas tales como Chlorella spp. y Spyrogyra spp. y virus tales como el virus del herpes, picornavirus, la varicela y verrugas.

"Parásito" se refiere a organismos superiores evolucionados tales como insectos (por ejemplo, piojo y garrapatas), nemátodos y similares que infectan la piel, las uñas, el pelo y los pulmones, el recto, la vagina, los ojos, los oídos y la nariz.

La "hidrofobicidad" se expresa como el coeficiente de reparto de un compuesto en un sistema de dos componentes de octanol/agua (XlogP). Cuanto más elevado sea el valor de XlogP, más hidrófobo es el compuesto. Los valores de XlogP se pueden hallar o prever en diversos sitios web.

"Tópico" en la presente solicitud se refiere a los tejidos humanos animales que cubren el organismo tanto externos (por ejemplo, la piel, las uñas o el pelo) como internos (por ejemplo pulmones, recto, vagina, ojos, oídos y nariz).

El término "trastorno cutáneo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere en líneas generales a cualquier proceso anómalo en la piel, comprendiendo pero sin limitarse a las mismas las infecciones microbianas.

La presente invención se refiere a la utilización de una clase de compuestos, a los que se hace referencia en la presente memoria como "agentes estimulantes" para potenciar la actividad antimicrobiana basada en la peroxidasa, más particularmente en el contexto de las composiciones terapéuticas y preventivas. Los compuestos son compuestos de benceno o de fenol sustituidos que son compuestos hidrosolubles y que presentan una hidrofobicidad moderada. La hidrosolubilidad de los compuestos de la presente invención es de por lo menos 0,1 mg/ml, más preferentemente de por lo menos 1 mg/ml. La hidrofobicidad de los compuestos de la presente invención (XlogP) se encuentra comprendida entre 1 y 4, más preferentemente entre 1 y 2.

En el sentido más amplio, los agentes estimulantes considerados en el contexto de la presente invención son moléculas de benceno que se encuentran sustituidas en una, dos, tres o cuatro posiciones con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en un grupo hidroxilo y un grupo hidroxialquilo o un grupo hidroxialquilo halogenado con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Los grupos hidroxialquilo se representan mediante la fórmula general -(CH_{2})_{n}OH (n = 1, 2, 3 ó 4). En dicho grupo hidroxialquilo el grupo -OH puede ser terminal (por ejemplo -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-OH) pero puede encontrarse asimismo en otro átomo de carbono de la cadena alquilica (por ejemplo -CH_{2}-CHOH-CH_{2}-CH_{3} o -CH_{2}-CH_{2}-CHOH-CH_{3}).

Los compuestos se encuentran sustituidos adicionalmente en una sola posición con un grupo alcoxi o un grupo alcoxi halogenado con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Aparte de dichos dos sustituyentes requeridos, las moléculas se pueden sustituir además opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno de ellos independientemente de entre el grupo que consiste en un grupo hidroxi, un aldehído, una cetona, un ácido y un halógeno (I, F, Cl, Br), un grupo hidroxialquilo con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, un grupo alquilo lineal o ramificado o un grupo alquenilo lineal o ramificado con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, en los que los grupos hidroxialquilo, alquilo o alquenilo se encuentran sustituidos además opcionalmente con un grupo halógeno, carboxilo, hidroxilo, aldehído o cetona. Otros posibles sustituyentes son los grupos azufre, nitro y nitroso.

Una forma de realización particular de la presente invención se refiere a subgrupos de los compuestos de la presente invención en los que, con respecto a un sustituyente -OH en el anillo de benceno, se encuentra presente una cadena lateral conjugada (por ejemplo -C=O, -C=C) o un grupo electrófilo (tal como -OH, -OR, halógeno) tanto en una posición orto- como en una posición para-, pero no en una posición meta-. Cuando se encuentran presentes más de un sustituyente -OH, el efecto beneficioso de dicho grupo electrófilo en la posición orto- o en la posición para- con respecto al grupo -OH, se reduce o elimina si el grupo electrófilo se encuentra en posiciones meta- con respecto a otro grupo -OH. Según otra forma de realización, el grupo -OH o -(CH_{2})_{n}OH (n = 1, 2, 3 ó 4) requerido y el grupo alcoxi se encuentran en una posición orto-. Según determinadas formas de realización la molécula de benceno sustituida se encuentra sustituida en dos posiciones y pertenece a la clase de los hidroxialquilalcoxibencenos o de los alcoxifenoles.

Según determinadas formas de realización, la molécula de benceno se encuentra sustituida en tres posiciones y pertenece a la clase de los hidroxialquilalcoxibenzaldehídos o de los hidroxialcoxibenzaldehídos.

Una subclase de agentes estimulantes considerados en el contexto de la presente invención son moléculas de fenol sustituidas con una estructura general representada por la fórmula (I)

2

En la que R es -CH_{3} o -CH_{2}CH_{3}, en la que X se selecciona de entre el grupo que consiste en -H, -CHO y -COCH_{3}, -COOH, en la que Y se selecciona de entre el grupo que consiste en -H, un halógeno y un grupo alquilo o un grupo alquilo halogenado con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, y en la que ambas posiciones Z se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en -H y un grupo alquilo o un grupo alquilo halogenado con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono.

Las formas de realización particulares de agentes estimulantes considerados en el contexto de la presente invención son los hidroximetoxifenoles (tales como el guayacol (2-metoxifenol), el 2-etoxifenol y el 2-propoxifenol) y los hidroximetoxibenzaldehídos (tales como la vainillina (4-hidroxil-3-metoxibenzaldehído), la etilvanillina (4-hidroxil-3-etoxibenzaldehído) y el 4-hidroxil-3-profoxibenzaldehído), la bromovainillina y la nitrovainillina.

Según unas formas de realización específicas, los agentes estimulantes considerados en el contexto de la presente invención son compuestos atóxicos y/o compuestos que se reconocen como compuestos GRAS (aceptados generalmente como seguros). Según otras formas de realización específicas los compuestos de la presente invención son compuestos conocidos como sustancias aromatizantes y perfumantes.

Un cierto número de agentes estimulantes considerados en el contexto de la presente invención se enumeran
en la Tabla 1.

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TABLA 1 Compuestos de la presente invención

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Otro aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los agentes estimulantes descritos anteriormente y comprenden además una peroxidasa, un peróxido o un sistema formador de peróxido y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones comprenden opcionalmente uno o más haluros o pseudohaluros.

La presente invención se basa en la observación de que la actividad de la actividad antimicrobiana basada en la peroxidasa aumenta en presencia de uno o más de los agentes estimulantes descritos en la presente memoria.

Según la presente invención, las composiciones se proporcionan presentando una actividad antimicrobiana basada en la peroxidasa. La actividad puede ser antibacteriana, antifúngica y/o dirigida contra cualquier otro microorganismo.

Según una forma de realización particular, la actividad antimicrobiana basada en la peroxidasas la originan uno o más enzimas peroxidasa que pueden generar iones con actividad antimicrobiana.

La actividad antimicrobiana apropiada basada en peróxidos utilizada en el contexto de la presente invención se refiere a enzimas peroxidasa que pueden oxidar iones haluros y/o pseudohaluros (tal como el isotiocianato). Los ejemplos de enzima peroxidasa apropiados en el contexto de la presente invención son las peroxidasas que pueden oxidar uno o más de entre iones cloruro, yoduro o tiocianato con respecto un ion antimicrobiano hipoclorito, hipoyodito, hipobromito- o hipotiocianito, respectivamente.

Según una forma de realización particular se utiliza una haloperoxidasa, es decir, un enzima que puede oxidar haluros a hipohalito.

Los ejemplos particulares de enzimas peroxidasa apropiados en el contexto de la presente invención son por ejemplo la mieloperoxidasa, la lactoperoxidasa y la cloroperoxidasa, la peroxidasa salivar y la peroxidasa eosinófila.

Según una forma de realización adicional, la peroxidasa presente en las composiciones de la presente invención se obtienen a partir de plantas (por ejemplo, peroxidasa de rábano o de semillas de soja) o a partir de microorganismos tales como hongos o bacterias.

Según una forma de realización particular, la actividad antimicrobiana basada en la peroxidasa se origina a partir de la lactoperoxidasa. La lactoperoxidasa puede convertir distintos sustratos, comprendiendo pero sin limitarse a los mismos yoduro y tiocianato, que actúan como dadores de electrones.

Según una forma de realización, las composiciones de la presente invención comprenden una peroxidasa y uno o más iones haluro o pseudohaluro (tales como el tiocianato) como dadores de electrones con respecto a la peroxidasa. Los haluros apropiados son, por ejemplo, yoduros iónicos en forma de sales de yoduros hidrosolubles tales como una sal de yoduro metálica alcalina, por ejemplo, yoduro potásico (KI), yoduro sódico (NaI) o yoduro de litio, yoduro de amonio, yoduro de calcio. Los ejemplos habituales son el yoduro sódico y el yoduro potásico.

Las fuentes apropiadas de ion tiocianato (SCN^{-}) comprenden el tiocianato sódico, el tiocianato potásico, el tiocianato de amonio y otras sales de tiocianato. Los ejemplos habituales son el tiocianato sódico y el tiocianato potásico. Según una forma de realización particular las composiciones de la presente invención comprenden la lactoperoxidasa y tanto un tiocianato como un haluro como dadores de electrones.

Según otra forma de realización adicional, las composiciones de la presente invención comprenden una peroxidasa tal como se ha descrito anteriormente y únicamente (uno o más) haluros como dadores de electrones con respecto a la peroxidasa. La presente invención demuestra que las composiciones que comprenden una combinación de un peróxido o un sistema formador de peróxido, una peroxidasa, un agente estimulante y (uno o más) haluros son composiciones antimicrobianas efectivas. Ello no permite únicamente una reducción del número de principios activos sino que permite evitar la adición de compuestos formadores de iones tiocianato que pueden resultar tóxicos. Por consiguiente, según una forma de realización particular, las composiciones de la presente invención no comprenden un tiocianato u otros pseudohaluros.

Tal como se ha detallado anteriormente, las composiciones de la presente invención comprenden tanto un peróxido de por sí o un sistema formador de peróxido. Habitualmente, el sistema formador de peróxido comprende un enzima formador de peróxidos y un sustrato. Según una forma de realización, el enzima formador de peróxidos es un enzima oxidorreductasa. Las oxidorreductasas aptas son la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa, la glicolato oxidasa, la lactato oxidasa, la L-gulunolactona oxidasa, la L-2-hidroxiácido oxidasa, la aldehído oxidasa, la xantina oxidasa, la D-aspartato oxidasa, la L-aminoácido oxidasa, la D-aminoácido oxidasa, la monoamina oxidasa, la piridoxaminofosfato oxidasa, la diamina oxidasa, y la sulfito oxidasa.

Los sustratos apropiados para utilizar en el sistema formador de peróxido según la presente invención comprenden los sustratos naturales de los enzimas enumerados anteriormente, así como otros sustratos, que permiten la formación de peróxidos. La \beta-D-glucosa es un sustrato específico de la glucosa oxidasa. Otros sustratos aptos comprenden, pero sin limitarse a los mismos, la D-glucosa, la D-galactosa, la L-sorbosa, el etanol, la tiramina, 1,4-diaminobutano, el 2-aminofenol, el glicolato, el L-lactato, la 2-desoxi-D-glucosa, la L-gulunolactona, la L-galaconolactona, la D-manonolactona, el L-2-hidroxiisocaproato, el acetaldehído, el butiraldehído, la xantina, el D-aspartato, el D-glutamato, los L-aminoácidos y los D-aminoácidos.

Habitualmente, la glucosa y la glucosa oxidasa se utilizan como sistema formador de peróxido de hidrógeno.

Como alternativa, el sistema formador de peróxido es no enzimático y el peróxido de hidrógeno se forma mediante vías alternativas, por ejemplo, mediante moléculas que se degradan de un modo natural formando peróxido, tal como las sales de perborato o percarbonato, más particularmente el percarbonato sódico o el perborato sódico.

Los componentes de las combinaciones de la presente invención se proporcionan en concentraciones que permiten una actividad antimicrobiana efectiva.

Las concentraciones habituales farmacéuticamente efectivas de peroxidasa se encuentran comprendidas entre 10 y 100.000 U/kg, 100 y 25,000 U/kg, 250 y 10000 U/kg, o 500 y 7000 U/kg de lactoperoxidasa. Al utilizar los agentes estimulantes de la presente invención, las concentraciones de peroxidasa utilizadas se pueden encontrar comprendidas entre 5 y 50 Unidades/kg, 10 y 100 U/kg, 20 y 250 U/kg, 50 y 500 Unidades/kg, 100 y 1000 U/kg, 200 y 2500 U/kg. Las concentraciones habituales farmacéuticamente efectivas de glucosa oxidasa se encuentran comprendidas entre 150 y 4000 U/kg, 200 y 3000 U/kg, 300 y 2500 U/kg de glucosa oxidasa.

Cuando se encuentran presentes, la concentración de aniones de yoduro se puede encontrar comprendida entre 1 y 200 mg/kg, 2 y 150 mg/kg, 5 y 75 mg/kg. La concentración de aniones haluro o pseudohaluro (tal como el tiocianato) se puede encontrar comprendida entre 1 y 100 mg/kg, 2 y 75 mg/kg o 5 y 50 mg/kg. Allí donde se pueda aplicar, el peso: la proporción de peso de los iones yoduro/tiocianato se puede encontrar comprendida entre 0,2:1 y 20:1, 0,5:1 y 15:1, o 1:1 y 5:1. La concentración en peso de los aniones combinados se puede encontrar comprendida entre 5 y 200 mg/kg, o 10 y 150 mg/kg.

Los agentes estimulantes se encuentran presentes en las composiciones de la presente invención a una concentración comprendida entre 1 y 10 mMoles/litro, 2 y 5 mMoles/litro, 2 y 10, 1 y 25 mMoles/litro, 5 y 50 mMoles/litro o 5 y 100 mMoles/litro. Los efectos antimicrobianos efectivos contra las bacterias se obtienen con 0,01, 0,1, 1, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 50 y 100 mMoles/litro. Los efectos antimicrobianos efectivos contra los hongos se obtienen con 0,01, 0,1, 1, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 50 y 100 mMoles/litro. Los agentes estimulantes de la presente invención se encuentran presentes en las composiciones de la presente invención en una concentración comprendida entre 1 y 100 mg/100 g (por ejemplo 1 y 5 mg/100 g, 1 y 10 mg/100 g, 5 y 20 mg/100 g, 10 y 50 mg/100 g, 20 y 50 mg/100 g, 25 y 75 mg/100 g o 50 y
100 mg/100 g).

En algunas formas de realización particulares las composiciones farmacéuticas comprenden entre el 0,25 y el 5% de glucosa, entre el 0,01 y el 0,1% de sal de yodo tal como KI, entre 0,5 y 5 U/ml de glucosa oxidasa, entre 0,5 y 5 U/ml de peroxidasa y entre 10 y 400 \muM de agente estimulante o una mezcla de agente estimulante tal como el guayacol y/o la vainillina.

Según una forma de realización de la presente invención, las composiciones de la presente invención comprenden tanto un enzima peroxidasa como un dador de electrones con respecto a la peroxidasa. Habitualmente, cuando se utiliza lactoperoxidasa, se añaden iones de yoduro y/o de tiocianato como dadores para el enzima lactoperoxidasa.

Según una forma de realización alternativa los agentes estimulantes de la presente invención sustituyen parcial o completamente la molécula dadora. Ello presenta la ventaja adicional que se pueden sustituir completa o parcialmente compuestos tóxicos tales como los tiocianatos por compuestos menos tóxicos o atóxicos.

Por consiguiente, en una forma de realización particular, el principio activo antimicrobiano de las composiciones farmacéuticas de la presente invención consiste en un peróxido o un sistema formador de peróxido, una lactoperoxidasa, un haluro y un agente estimulante. En una forma de realización particular adicional, el principio activo antimicrobiano de las composiciones farmacéuticas de la presente invención consiste en un peróxido o un sistema formador de peróxido, una lactoperoxidasa, aniones de yoduro y un agente estimulante. Habitualmente, el agente estimulante de la presente invención es vainillina o guayacol.

Los agentes estimulantes de la presente invención, cuando se encuentran presentes en la composición farmacéutica, presentan la ventaja de que la actividad antimicrobiana se mantiene durante un período mucho más prolongado que sin dichos compuestos, con la consecuencia de que el ungüento, gel, apósito o aplicación similar se ha de sustituir con menos frecuencia, lo que reduce las molestias para el paciente que se está tratando.

Por consiguiente, la presente invención proporciona unas composiciones farmacéuticas que resultan aptas para una utilización prolongada sobre la piel.

Las composiciones de la presente invención comprenden opcionalmente además uno o más excipientes farmacéuticos. Las siguientes preparaciones constituyen unos ejemplos de excipientes farmacéuticos acuosos o hidrófilos que resultan apropiados para disolver los enzimas y los agentes estimulantes de la presente invención. Los productos se pueden preparar en un medio estéril o no estéril. Las preparaciones son tanto acuosas como hidrófilas, es decir, preparaciones que al entrar en contacto con un medio acuoso tanto se disuelven rápidamente en el medio acuoso como liberan rápidamente el fármaco al medio acuoso.

-: Los aerosoles son suspensiones de partículas finas sólidas o líquidas en un gas. Se utilizan para administrar fármacos al tracto respiratorio y la piel. Los aerosoles se pulverizan en unos dispositivos conocidos como atomizadores o nebulizadores. El paciente introduce la disolución y al aplicar presión a una pera de goma expulsa el producto en una niebla de pulverización suspendida en el aire. Como alternativa, una técnica más actual consiste en envasar el fármaco en un recipiente presurizado. El fármaco se disuelve en un disolvente o se suspende en un propulsor (gas licuado). Los recipientes presurizados proporcionan una bona protección ante la oxidación, la luz y, cuando resulta necesario, como en el caso de los productos cutáneos, los microorganismos (véase asimismo insuflaciones).

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-: Los colodiones son preparaciones fluidas para su utilización externa. Se aplican con un cepillo o con una varilla. El vehículo es volátil y se vapora cuando se aplica a la piel (éter y alcohol), dejando una película flexible protectora que cubre la zona. El ingrediente que produce la película es generalmente piroxilina (nitrocelulosa) y la sustancia que proporciona la flexibilidad aceite de ricino.

-: Las pomadas son emulsiones semisólidas para utilización externa. En una pomada acuosa el aceite, en un estado muy fino de subdivisión, se dispersa en la fase acuosa; en pomadas aceitosas la fase acuosa, en un estado muy fino de subdivisión, se dispersa en la fase aceitosa. La pomada se estabiliza mediante la inclusión de un agente emulsionante, mediante la inclusión de geles, agentes gelificantes u otros medios para aumentar la viscosidad.

-: Los polvos medicinales consisten en polvo muy fino de fluencia suave para uso externo.

-: Las emulsiones son dispersiones líquidas de una fase acuosa distribuida en una fase aceitosa, o de una fase aceitosa distribuida en una fase acuosa. La dispersión se estabiliza mediante la inclusión de un agente emulsionante.

-: Los (hidro)geles son suspensiones coloidales acuosas de un coloide cuyas partículas se encuentran en la fase externa o dispersión y el agua se encuentra en la fase interna o dispersa. Los expertos en la materia conocen distintos componentes aptos para realizar hidrogeles farmacéuticamente aceptables. Los hidrogeles se utilizan en general para retener o absorber humedad o agua. Los hidrogeles apropiados en el contexto de la presente invención se preparan con hidrocoloides tales como alginatos y poliacrilatos (por ejemplo carbopol) y celulosa y derivados de los mismos tales como la carmelosa (CMC). Otros hidrocoloides aptos son el hidróxido de aluminio, el dióxido de silicio o el ácido silícico, el almidón, el glucógeno, la gelatina, la pectina, la quitosana, la quitina, la goma arábiga, la goma de garrofín, la goma karaya, la goma de tragacanto, la goma ghatti, el agar-agar, la carragenina, la goma de algarrobo, la goma guar, la goma de xantana, el polimetacrilato de glicerilo. Un hidrogel se puede utilizar como tal. Los hidrogeles para utilizar en el contexto de la presente invención se pueden formular con distintas concentraciones de coloides en función de la consistencia pretendida.

-: Las glicerinas son disoluciones del fármaco en glicerol con o sin la adición de agua.

-: Las insuflaciones son polvos medicinales que se soplan mediante un insuflador (un dispositivo similar a un atomizador o a un atomizador presurizado).

-: Las gelatinas (geles) son preparaciones transparentes o translúcidas, no grasientas, semisólidas. El agente gelificante puede ser gelatina o un hidrato de carbono u otro polímero conocido como agente gelificante.

-: Los linimentos son preparaciones fluidas, semifluidas u, ocasionalmente, semisólidas destinadas a la aplicación en la piel. Pueden ser disoluciones alcohólicas o aceitosas de emulsiones. La mayor parte se aplican mediante masaje en la piel aunque algunas se aplican con un apósito o con un cepillo.

-: Las lociones son preparaciones fluidas de aplicación externa sin fricción. Se untan en la piel o se aplican en un apósito apropiado y se cubren con un material impermeable al agua para reducir la evaporación.

-: Las mezclas constituyen la forma de preparación líquida más habitual. El vehículo es habitualmente acuoso y el fármaco se puede encontrar en suspensión o en disolución.

-: Los ungüentos son preparaciones grasientas semisólidas. La base es habitualmente anhidra y contiene el medicamento en disolución o en suspensión.

-: Los oximieles son preparaciones en las que el vehículo es una mezcla de ácido y miel.

-: Las tinturas son líquidos para la aplicación a la piel o las mucosas, habitualmente con un cepillo blando. Las tinturas para la piel con frecuencia presentan un disolvente volátil que se evapora rápidamente para dejar una película seca o resinosa del medicamento. Las tinturas se pueden realizar viscosas mediante la adición de glicerina, que es pegajosa, se adhiere a la zona afectada y prolonga la acción del fármaco.

-: Los emplastos son preparaciones semisólidas para aplicaciones externas que difieren de productos similares al contener una proporción elevada de medicamentos pulverulentos finamente divididos. La base puede ser anhidra (parafina líquida o blanda) o hidrosoluble (glicerina o un mucílago). Su rigidez hace que resulten útiles como revestimientos protectores.

-: Las pulverizaciones son preparaciones de fármacos en medios acuosos, alcohólicos o que contienen glicerina. Se aplican en la mucosa o en la piel (lesionada) con un atomizador o un nebulizador.

La presente invención se refiere asimismo a un método de tratamiento o prevención de una infección microbiana tópica de un animal o ser humano que comprende la etapa de aplicar por vía tópica a dicho animal o ser humano una composición farmacéutica que comprende la combinación de la presente invención que comprende un peróxido o un sistema formador de peróxido, un enzima peroxidasa y un agente estimulante. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos de la presente invención comprenden además opcionalmente uno o más haluros y/o pseudohaluros. El método de tratamiento se puede utilizar por consiguiente en un tratamiento médico veterinario y en seres humanos. Según una forma de realización, los métodos de la presente invención se realizan en realizan en uñas, pelo y piel sanos. Adicionalmente o alternativamente, los métodos comprenden la aplicación en heridas, quemaduras y aquellas partes de la piel, uñas o pelo que se encuentran infectadas con parásitos. Los ejemplos de infecciones consideradas para tratar en el contexto de la presente invención comprenden, pero sin limitarse a las mismas, la foliculitis, la furunculosis, el ántrax, el impétigo, la eripsela, la borreliosis de Lyme, el herpes común, el herpes zóster, la pitiriasis versicolor, el intertrigo, y las infecciones por piojos, pulgas y sarna.

El tratamiento con la composición de la presente invención comprende opcionalmente mantener la composición en contacto con el cuerpo durante un período de diversas horas (por ejemplo, 2, 4, 6 u 8 horas), tras lo que opcionalmente se vuelve a aplicar la composición. Constituye una ventaja de la presente invención que la actividad prolongada del enzima peroxidasa junto con los agentes estimulantes permite renovar la composición con menos frecuencia que cuando se utiliza una composición sin dichos compuestos. Ello resulta particularmente interesante en el caso de heridas dolorosas tales como las quemaduras.

Por consiguiente, la presente invención se refiere asimismo a la utilización de los, agentes estimulantes de la presente invención en la realización de un medicamento o un dispositivo para la aplicación para el tratamiento o la prevención de infecciones tópicas microbianas o parasitarias.

Las composiciones farmacéuticas para utilización tópica se pueden formular como una pomada, una loción, una base de maquillaje, un ungüento, una loción, una suspensión (aceite en agua y agua en aceite), parches, un apósito o un gel. Dichas composiciones comprenden desodorantes en forma de formulaciones de desodorantes de roll-on o de barra, preparaciones contra el acné, por ejemplo en forma de lociones o pomadas, materiales impregnados tales como apósitos para las heridas, productos farmacéuticos para tratamientos humectantes para heridas y tratamientos para quemaduras. Gotas para los oídos, gotas para la nariz, inhalaciones, disoluciones o emulsiones vaginales y rectales. Teniendo en cuenta que la presente invención pretende alcanzar un efecto prolongado antimicrobiano, no se considera la aplicación en la cavidad bucal, debido a que la composición farmacéutica se eliminará al tragar en un período de pocos minutos.

Los ejemplos proporcionados a continuación se presentan a título ilustrativo de la presente invención y en modo alguno pretenden limitar la presente invención a las formas de realización descritas en los mismos.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Actividad antibacteriana en S. aureus de la oxidasa/peroxidasa con agentes estimulantes

Las células bacterianas (S. aureus) se sembraron en placas de agar de tripticasa de soja (Becton Dickinson) y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se recuperaron las células de las placas y se mezclaron en una disolución amortiguadora de NaCl - caldo de peptona (Merck). Se ajustó la cantidad de medio para proporcionar una suspensión bacteriana con una densidad celular de DO_{600} = 0,25 para las bacterias.

Para los ejemplos descritos en los siguientes ejemplos, se prepararon unas disoluciones de partida con una dilución reciente del 0,25% (v/v) de enzima - sustrato (Biovert^{TM}) para cada prueba independiente. La disolución de partida enzimática de Biovert^{TM} contiene 1527 U/ml de lactoperoxidasa; 2016 U/ml de glucosa oxidasa; la disolución de partida del sustrato de Biovert^{TM} comprende: un 55% (p/v) de glucosa, un 0,51% (p/v) de KSCN, un 0,73% (p/v) de Kl.

A fin de analizar la actividad sinérgica del agente estimulante en el agente estimulante enzima - sustrato, la concentración del enzima - sustrato se ajustó para obtener unas condiciones en las que la oxidasa/peroxidasa en un hidrogel realizara una actividad antibacteriana limitada pero determinable. La disolución mencionada anteriormente (0,25% (v/v)) se ha continuado diluyendo por consiguiente hasta 0,017% (v/v).

Se preparó una disolución de gel de un 0,33% (p/v) de Na - alginato (Kelset), un 0,66% (v/v) de PEG400 en agua, se esterilizó al autoclave y posteriormente se enfrió a temperatura ambiente.

Para un ensayo antibacteriano se mezclaron los siguientes componentes: 100 \mul de suspensión celular bacteriana, 100 \mul de disolución de partida (0,25%), 1 g (= 1 ml) de disolución de gel, 0,1 - 1 mg de agente estimulante,
300 \mul de agua milliQ. Las concentraciones finales del enzima/sustrato de la mezcla de la reacción son de 0,015 U/ml de glucosa oxidasa, 0.011 U/ml de lactoperoxidasa, un 0.00007% (p/v) de tiocianato potásico, un 0,0001% (p/v) de yoduro potásico, un 0,0076% de glucosa y entre 0,066 y 0,66 mg/m de agente estimulante.

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Tal como se representa en la figura 1, la vainillina, la etilvainillina y el guayacol potenciaron claramente la capacidad bactericida cuando se mezclaron con la disolución de enzima - sustrato, mientras que los sistemas por separado modificaron únicamente la supervivencia de las células afectadas.

La figura 2 indica que, cuando una cadena lateral conjugada o electrófila se encuentra presente en la posición meta- con respecto al grupo hidroxilo (por ejemplo, a isovainillina y los ejemplos comparativos, el 3,4-dihidroxibenzaldehído, el ácido gálico y el galato propílico), la actividad antibacteriana resulta menos acusada.

Los compuestos con una baja solubilidad en agua o en medios hidrófilos (por ejemplo el siringaldehído) no se podrían dispersar o disolver adecuadamente y no resultan aptos en la presente configuración experimental o para utilizar en una composición farmacéutica hidrófila tal como un hidrogel.

Además, las sustancias con un XlogP inferior a 0 tal como la tirosina (XlogP = - 1,87) o el 5-hidroxitriptófano (XlogP = -1,80) no presentaron actividad estimulante en la actividad antibacteriana de la glucosa/peroxidasa en la presente configuración experimental. El pirocatecol (1,2 dihidroxifenol) no se podría utilizar como ejemplo comparativo considerando su toxicidad.

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Ejemplo 2

Propiedades antioxidantes de los agentes estimulantes de la presente invención a) Ensayo de decoloración de radicales del DPPH

El DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) es un radical libre estable con permeabilidad celular que actúa como eliminador de radicales de hidrógeno y se utiliza como herramienta de selección para detectar la actividad eliminadora de radicales libres de los antioxidantes. Cuando una disolución con radicales se pone en contacto con un antioxidante, la molécula con el radical se reduce y por lo tanto pierde su color morado característico. Se puede realizar el seguimiento de dicha "decoloración" mediante un análisis espectrofotométrico.

Se preparó una disolución nueva con radicales DPPH (15 mg/ml) en 1-octanol (Sigma) y se transfirieron alícuotas de 900 \mul a cubetas espectofotométricas de 2 ml. Se añadieron 100 \mul de disoluciones 50 mMoles/litro de agentes estimulantes (disueltos en 1-octanol) a la disolución (la concentración final de los agentes estimulantes es de 5 mMoles/litro). El análisis espectrofotométrico de las muestras se realizó antes de 5 minutos a fin de evitar la extinción debida a los radicales libres (por ejemplo en suspensión en el aire).

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a) Ensayo con \beta-carotenos

En este ensayo se analizó la actividad antioxidante de un componente mediante su capacidad para prevenir la decoloración de una disolución de \beta-carotenos por parte de los radicales formados mediante iluminación.

Se preparó una disolución nueva de \beta-carotenos (20 mg/ml) en 1-octanol (Sigma) y se transfirieron alícuotas de
900 \mul a cubetas espectofotométricas de 2 ml. Se añadieron 100 \mu de disoluciones 50 mMoles/litro de agentes estimulantes (disueltos en 1-octanol) a la disolución (la concentración final de los agentes estimulantes es de 5 mMoles/litro). Se iluminaron las disoluciones hasta 5 horas y se realizó el análisis espectrofotométrico en los instantes
indicados.

La figura 3 demuestra que los antioxidantes analizados funcionaron correctamente en el ensayo de decoloración con \beta-carotenos. De los agentes estimulantes de la presente invención el guayacol y el guaetol resultaron moléculas muy efectivas, mientras que la vainillina y la etilvainillina funcionaron mal como antioxidantes en esta prueba.

Los datos de la figura 4 confirman los resultados observados en la figura 3. Demuestran que los antioxidantes analizados, el hidroxitolueno di-terc-butilado (BHT) y la vitamina E resultaron ser unos reductores menos potentes que el ácido gálico y el galato propílico. La vainillina y al etilvainillina funcionaron mal, mientras que el guayacol y el guaetol resultaron casi tan eficientes como el ácido gálico y el galato propílico.

La comparación de los resultados (véase la tabla 2) del ensayo de antioxidantes y de los ensayos de antimicrobianos demuestra que las propiedades antioxidantes de una molécula no se encuentran correlacionadas con el efecto antibacteriano en un ensayo de glucosa/peroxidasa.

TABLA 2 Efecto antioxidante y efecto antimicrobiano de los agentes estimulantes

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Ejemplo 3

Actividad antibacteriana en S. aureus MRSA de la oxidasa/peroxidasa con agentes estimulantes

El efecto de la vainillina y el guayacol en la actividad de la peroxidasa/oxidasa se analizó en bacterias MRSA (S. aureus resistentes a la meticilina) utilizando las condiciones de cultivo y las condiciones de ensayo descritas en el ejemplo 1.

La figura 5 muestra cómo tanto la vainillina como el guayacol ejercen un efecto estimulante en la actividad de la peroxidasa/oxidasa, mientras que dichos compuestos por sí solos ejercen un efecto limitado.

La figura 6 muestra cómo, en dichas condiciones, el guayacol ejerce un efecto estimulante significativo en la actividad de la peroxidasa/oxidasa.

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Ejemplo 4

Actividad antibacteriana en E. coli de agentes estimulantes y la oxidasa/peroxidasa

Se realizaron unos experimentos utilizando las condiciones descritas en los ejemplos 1 y 2 con bacterias gramnegativas (E. coli). La figura 7 muestra cómo tanto el guayacol como la vainillina junto con el enzima - sustrato resultan más efectivos que el enzima - sustrato por sí solo.

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Ejemplo 5

Efecto antibacteriano en bacterias y hongos de agentes estimulantes y la oxidasa/peroxidasa a) MRSA (S. aureus resistentes a la meticilina)

Se sembró un cultivo celular (A600 = 0,02) en caldo con tripticasa de soja (TS) (Difco^{TM}, Becton Dickinson) en presencia de una disolución al 0,08% (concentración subóptima) del sistema enzima/sustrato descrito en el ejemplo 1. La adición de guayacol provoca una inhibición adicional del crecimiento bacteriano (véase la figura 8). Se observa que este efecto se mantiene durante un período de tiempo significativo.

b)Candida albicans

Se sembró un cultivo celular de levaduras (A600 = 0,05) en caldo con dextrosa de Sabouraud (SD) (Difco^{TM}, Becton Dickinson) en presencia de una disolución al 0,02% (concentración subóptima) del sistema enzima/sustrato descrito en el ejemplo 1. La adición de tanto guayacol como vainillina provoca una inhibición adicional del crecimiento fúngico durante por lo menos 24 horas (véase la figura 9). El presente ejemplo demuestra claramente un efecto beneficioso de añadir los agentes estimulantes de la presente invención a las composiciones antifúngicas de oxidasa/peroxidasa.

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Ejemplo 6

Toxicidad celular en células de mamíferos de las composiciones de oxidasa/peroxidasa enriquecidas con estimulantes

Se cultivaron queratinocitos HaCaT y fibroblastos de ratón 3T3 en el siguiente medio de cultivo: medio DMEM (nivel elevado de glucosa; Sigma) enriquecido con suero de ternera inactivado (10%) (Life Technologies), L-glutamina (4 mM) (Sigma) y estreptomicina/penicilina (100 U) (Sigma).

Se preparó un gel de alginato en agua utilizando Kelset al 5% (p/v) (Keyser & MacKay), ácido algínico al 0,5% (p/v), PEG 400 al 28% (p/v), sustrato al 1,5% (v/v) (glucosa al 50% (p/v)/Kl al 1,4% (p/v) KI), una disolución de glucosa oxidasa/lactoperoxidasa al 0,075% (v/v) y 200 \muM de guayacol. Se preparó un gel idéntico sin guayacol como control.

Se disolvió un gramo del gel de alginato en 9 ml de medio de cultivo (gel de alginato diluido).

Se sembraron las células en subconfluencia. Tras incubar durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, se sustituyó el medio de cultivo por gel de alginato diluido y se incubaron las células a 37ºC, CO_{2} al 5% durante otras 24 horas. Se decantó el medio y se añadieron a las células 100 \mul de medio fresco que contenía 0,5 mg/ml de MTT (1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 3,5-difenilformazano). Se incubaron las células en dicho medio durante 3 h adicionales. Se analizó la viabilidad y el metabolismo celular determinando el producto de conversión cromofórica del MMT a 570 nm.

La figura 10 representa cómo no existe diferencia estadística (HaCaT: p = 0,31; 3T3: p = 0,32; prueba t) en la actividad metabólica de las células incubadas en el hidrogel de alginato con o sin guayacol. Las condiciones de control (únicamente ES) se publicaron en Vandenbulcke et al. (2006) Int J Low Extrem Wounds. 5, 109-114. El presente ejemplo demuestra que la adición del estimulante guayacol no supone efecto perjudicial alguno en la viabilidad de las células de los mamíferos.

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Ejemplo 7

Efecto antimicrobiano de los hidrogeles con oxidasa/peroxidasa y estimulantes

Se preparó un gel de alginato en agua utilizando Kelset al 5% (p/v) (Keyser & MacKay), ácido algínico al 0,5% (p/v), PEG 400 al 28% (p/v), sustrato al 1,5% (v/v) (glucosa al 50% (p/v)/Kl al 1,4% (p/v) KI), una disolución de glucosa oxidasa/lactoperoxidasa al 0,075% (v/v) y 5 mM de guayacol. Se preparó un gel idéntico sin guayacol como control.

Se incubaron bacterias (gramnegativas E. coli; y grampositivas S. aureus) en el gel anterior utilizando 1 g de gel, 100 \mul de una disolución de ES al 0,25% (v/v), 100 \mul de suspensión bacteriana (A600 = 0,25) y 300 \mul de agua.

Se tomaron muestras en distintos instantes y se sembraron en placas con caldo con tripticasa de soja. La figura 11 representa cómo el gel con oxidasa/ peroxidasa y el agente estimulante resulta efectivo en las bacterias tanto grampositivas como gramnegativas.

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Ejemplo 8

Efecto antimicrobiano de las formulaciones de hidrogeles con oxidasa/peroxidasa y agentes estimulantes

Se analizaron distintas composiciones de geles (descritas en la tabla 3) con respecto a su efecto antimicrobiano en los siguientes microorganismos: bacterias de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA); bacterias de Propionibacterium acnes y la levadura Saccharomyces cerevisiae.

TABLA 3 Composiciones de los geles con oxidasa/peroxidasa y agentes estimulantes.

6

Para determinar el número de microorganismos supervivientes, se realizaron diluciones a los instantes indicados (diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-5} en el caso de las bacterias y 10^{-1}, 10^{-2} y 10^{-3} en el caso de la S. cerevisiae). Posteriormente, se sembraron 100 \mul de las diluciones en placas con agar con tripticasa de sojas (TSA) para las MRSA, en placas de agar anaerobio exigente (ANA) en el caso de P. acnes o en placas con agar de dextrosa de Sabouraud (SDA) en el caso de la S. cerevisiae. Se incubaron las placas durante 24 horas a 37ºC (bacterias) o 30ºC (S. cerevisiae) durante 24 a 48 horas y se procedió al recuento de las unidades formadoras de colonias.

En el caso de las bacterias anaeróbicas Propionibacterium acnes, la incubación del gel con las bacterias así como la siembra en las placas ANA se realizó en frascos anaerobios (CO_{2} al 10%, H2 al 5% y N_{2} al 85%). El ambiente anaeróbico se creó utilizando un dispositivo Anoxomat^{TM} (Mart® Microbiology BV, Países Bajos).

Los datos presentados demuestran que, con la composición de gel de la tabla 3, los estimulantes a partir de 20 \muM reducen la proliferación bacteriana aproximadamente 1000 veces. A fin de reducir la proliferación de la levadura en un nivel similar, se necesitan unas concentraciones superiores del estimulante.

Ejemplo 9

Modelo en animales para analizar el efecto de los agentes estimulantes

Se examinó el efecto de los agentes estimulantes en la reducción de infecciones en heridas y en la cicatrización de las heridas utilizando ratones. Se anestesiaron los ratones y se afeitaron sus dorsos. Se realizaron heridas profundas en los dorsos afeitados de los ratones.

Para verificar el efecto de los agentes estimulantes en la reducción de la infección de dichas heridas, se aplicó una suspensión de 100 \mul de Staphylococcus aureus en la herida profunda y dicha herida profunda se cubrió con un hidrogel que contenía concentraciones estándar del sistema enzimático oxidasa/peroxidasa y concentraciones variables del agente estimulante. Las condiciones de control son heridas profundas infectadas cubiertas con un hidrogel que contiene el sistema enzimático de oxidasa/peroxidasa pero que carece del agente estimulante. Se realizó el seguimiento de la velocidad de reducción de la infección con respecto al tiempo.

Para verificar el efecto de los agentes estimulantes en la cicatrización de las heridas, se aplicó un gel que contenía el sistema enzimático oxidasa/peroxidasa y el agente estimulante a las heridas profundas del dorso de los ratones y se realizó el seguimiento del proceso de cicatrización con respecto al tiempo hasta que la herida hubo cicatrizado completamente. En las condiciones de control las heridas profundas infectadas se cubrieron con un hidrogel que contenía el sistema enzimático de oxidasa/peroxidasa pero que carecía del agente estimulante.

Ejemplo 10

Estudio comparativo de las composiciones de oxidasa/peroxidasa con estimulantes en úlceras crónicas de las piernas

Se utilizaron formulaciones de gel de composiciones de oxidasa/peroxidasa enriquecidas con agentes estimulantes tal como se describe en la tabla 3 en el tratamiento de úlceras crónicas de las piernas tal como se describe en de la Brassinne et al. (2006) J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 20, 131-135.

Se trataron distintos grupos de pacientes durante un período de 28 días. Se determinó tanto la superficie (seguimiento con acetato y planimetría) y el volumen (impresión en molde de Jeltrate y pesado) de cada herida en sus valores iniciales y tras 7, 14 y 28 días de tratamiento.

Los grupos de control se trataron con un gel que comprendía oxidasa/peroxidasa y sustrato pero sin agente estimulante.

Se observó que las composiciones que comprendían el agente estimulante presentaban efectivamente una actividad antimicrobiana, con unos efectos tóxicos limitados. Las composiciones se toleraban bien hasta el final del período de tratamiento.

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Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Incluso aunque se ha dedicado un enorme tiempo para compilar las referencias, no puede excluirse algún error u omisión, y la OEP renuncia a cualquier responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9218683 A [0002]: \bullet US 20020119136 A [0003]

\bullet EP 514417 A [0003]: \bullet WO 0208377 A [0004]

\bullet US 4476108 A [0003]

Documentos (no patentes) citados en la descripción

\bulletFITZGERALD et al. J Agric Food Chem., 2005, vol. 53, 1769-1775 [0004]

\bulletFITZGERALD et al. J Appl Microbiol., 2004, vol. 97, 104-113 [0004]

\bulletVANDENBULCKE et al. Int J Low Extrem Wounds., 2006, vol. 5, 109-114 [0074]

\bulletBRASSINNE et al. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 2006, vol. 20, 131-136 [0082]

Claims

1. Composición farmacéutica que comprende una combinación de

-: un peróxido o un sistema formador de peróxido

-: una o más peroxidasas

-: uno o más agentes estimulantes.

caracterizado porque el uno o más agentes estimulantes es una molécula de benceno sustituida con un grupo -OH o un grupo (CH_{2})_{n}OH (n = 1, 2, 3 ó 4) y sustituida con un grupo alcoxi con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono y sustituida opcionalmente además con uno a 4 sustituyentes, seleccionado cada uno de los mismos independientemente de entre el grupo que consiste en un grupo hidroxi, un aldehído, una cetona, un ácido y un halógeno, un grupo hidroxialquilo con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, un grupo alquilo lineal o ramificado o un grupo alquenilo lineal o ramificado con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, encontrándose dichos grupos hidroxialquilo, alquilo o alquenilo sustituidos opcionalmente además con un grupo halógeno, carboxilo, hidroxilo, aldehído o cetona.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende además uno o más haluros o pseudohaluros.

3. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicha molécula de benceno sustituido es una molécula lipófila con un coeficiente de reparto de octanol/agua XlogP comprendido entre 1 y 4.

4. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha composición es un apósito hidrofilico para heridas.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el apósito hidrofilico para heridas es un hidrogel.

6. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el grupo -OH o el grupo (CH_{2})_{n}OH (n = 1, 2, 3 ó 4) y el grupo alcoxi en la molécula de benceno se encuentran en la posición orto-.

7. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha molécula de benceno sustituido se selecciona de entre el grupo que consiste en un hidroxialquilalcoxibenceno, un alcoxifenol, un hidroxialquilalcoxibenzaldehído y un hidroxialcoxibenzaldehído.

8. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la molécula de benceno sustituido presenta una estructura general representada por la fórmula (I)

7

en la que R es -CH_{3} o -CH_{2}CH_{3}, en la que X se selecciona de entre el grupo que consiste en -H, -CHO, COOH y -COCH_{3}, en la que Y se selecciona de entre el grupo que consiste en -H, un halógeno y un grupo alquilo con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, y en la que ambas posiciones Z se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en -H y un grupo alquilo con una longitud de cadena de 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono.

9. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la molécula de benceno sustituido es un metoxifenol.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que el metoxifenol es guayacol.

11. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la molécula de benceno sustituido es hidroximetoxibenzaldehído.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que el hidroximetoxibenzaldehído es vainillina.

13. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la composición comprende los iones de yoduro.

14. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la composición comprende yoduro pero no iones de tiocianato.

15. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el sistema formador de peróxidos de hidrógeno comprende glucosa oxidasa como sustrato.

16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el agente estimulante se encuentra presente en una concentración comprendida entre 10 y 400 \muM.

17. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para utilizar como medicamento.

18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, para utilizar en el tratamiento de trastornos cutáneos.

19. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, para utilizar en la cicatrización de heridas.