ES2318799T3 - Metodo y kit de diagnostico in vitro para una infeccion por aspergillus. - Google Patents
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Abstract
Método para el diagnóstico in vitro de una infección por Aspergillus determinando en la muestra de suero o plasma de un sujeto la cantidad de anticuerpos dirigidos contra antígenos de Aspergillus, que comprende: a) incubar dicha muestra de suero o plasma con los antígenos de Aspergillus en busca de la formación de inmunocomplejos que pueden ser obtenidos entre dichos anticuerpos y dichos antígenos, y b) determinar la cantidad de los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de Aspergillus, en el que los antígenos de Aspergillus se seleccionan de entre el grupo constituido por una combinación de por lo menos dos de los siguientes antígenos: - el antígeno de ribonucleasa (RNU), - el antígeno de catalasa (CA), y - el antígeno de dipeptidilpeptidasa V (DPPV).
Description
Método y kit de diagnóstico in vitro para
una infección por Aspergillus.
La presente invención se refiere a un método
para el diagnóstico in vitro de una infección por
Aspergillus determinando en la muestra de suero o plasma de
un sujeto la cantidad de anticuerpos dirigidos contra una
combinación de por lo menos dos de los antígenos de
Aspergillus, la ribonucleasa (RNU), la catalasa (CA) y la
dipeptidilpeptidasa V (DPPV). La invención también se refiere a un
kit de diagnóstico que comprende dicha combinación.
El Aspergillus fumigatus es un patógeno
oportunista que es responsable de una variedad de infecciones en el
hospedante inmunocompetente así como en el inmunodeprimido. El
tratamiento con éxito de las diferentes formas de aspergilosis a
menudo está impedido por dificultades a la hora de establecer el
diagnóstico en ambos tipos de pacientes. Las estrategias de
diagnóstico se adaptan al estado inmunitario del paciente (Latgé J.,
Clin Microbiol Rev 1999; 12: 310-350). En el
hospedante inmunodeprimido y en pacientes con aspergilosis invasiva,
el "criterio de referencia" para el diagnóstico de laboratorio
es la búsqueda del antígeno circulante. En la aspergilosis del
hospedante inmunocompetente, el diagnóstico se basa en la presencia
de anticuerpos específicos anti-Aspergillus.
El desarrollo de nuevos ensayos cuantitativos y
reproducibles para medir la cantidad de anticuerpos
anti-Aspergillus ha demostrado recientemente un interés
renovado por muchas razones: (i) el número de pacientes con
cavidades preexistentes aumenta debido a la reaparición de la
tuberculosis, carcinoma pulmonar, enfisema y bronconeumopatía
obstructiva crónica; estos pacientes tienen riesgo de sufrir
aspergiloma, y un estudio serológico es clínicamente pertinente
para estos pacientes que pueden contraer graves aspergilomas
clínicamente silenciosos (Chu et al. 2004 J. Clin.
Microbiol. 42: 665-669; Denning, D. W. 1998. Clin.
Infect. Dis. 26: 781-803; Meersseman et al.
2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170: 621-625);
(ii) la atopía a los alérgenos fúngicos empeora la gravedad del
asma; un estudio reciente en el Reino Unido indica que la
sensibilización a hongos está asociada con ataques graves de asma
que requieren la hospitalización (Nelson et al., 1999, J.
Allergy Clin. Immunol. 104:775-785; O'Driscoll
et al., 1998, American Rev. Respir. Dis. 157: A623; Zureik
et al., 2002, Bmj 325: 411-414). Puesto que
siempre ha sido un debate sobre la cuantificación de las pruebas de
punción dérmicas o la presencia de alérgenos que se unen a IgE
compartidos por varios hongos en los extractos fúngicos brutos
usados en estos ensayos, actualmente es apropiado cuantificar la
sensibilización de pacientes asmáticos a alérgenos de
Aspergillus midiendo los anticuerpos anti-Aspergillus;
(iii) la ABPA es la manifestación más extrema de la alergia a
hongos que se produce lo más a menudo en la población de pacientes
más mayores con fibrosis quística; puesto que la edad de esta
población en riesgo está creciendo continuamente, y puesto que la
ABPA sigue siendo una complicación difícil de diagnosticar, un
diagnóstico serológico preciso sería lo más útil para esta
patología (Stevens et al., 2003, Clin. Infect. Dis. 3:
S225-S264); (iv) finalmente, datos recientes
sugieren que la cuantificación de los anticuerpos también podría ser
útil en la población de pacientes con riesgo de AI. El pico de
aparición de aspergilosis invasiva en la población inmunodeprimida
se ha desplazado en el tiempo para aparecer ahora a alrededor de
seis meses tras el injerto, en un momento en el que el sistema
inmunitario se reinicia (Morgan et al., 2004, Med. Mycol. 00:
1-10). Además, estudios clínicos recientes
mostraron un incremento en la incidencia de AI en pacientes sin
neoplasias hematológicas en unidades de cuidados intensivos
(Meersseman et al., 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170:
621-625). La AI en estos pacientes relativamente
inmunocompetentes se podría asociar con un incremento en los títulos
de anticuerpos contra Aspergillus. También se ha sugerido
(pero nunca investigado) que los pacientes se pudieron someter a
injertos mientras eran colonizados por Aspergillus. Un título
elevado de anticuerpo encontrado antes de la inmunosupresión en
pacientes que se van a someter a injerto sugeriría una infección
preexistente por Aspergillus, y podría ser una indicación de
una investigación micológica y/o un tratamiento preventivo
antifúngico.
La detección de anticuerpos en pacientes con
aspergilosis aún se realiza usando antígenos brutos en métodos
semicuantitativos tales como inmunoelectroforesis,
contrainmunoelectroforesis o hemoaglutinamiento (Latgé et
al., 1991, Infect. Immun. 59: 2586-2594).
También se han introducido los métodos de ELISA que usan lotes
antigénicos brutos producidos en el propio laboratorio, pero la
falta de estandarización entre los diferentes laboratorios a cargo
del diagnóstico hace que la comparación de la eficacia en el
diagnóstico de la aspergilosis sea difícil de evaluar debido a la
variabilidad de un lote a otro.
Los sujetos con fibrosis quística pueden ser
colonizados crónicamente con el hongo Aspergillus. El hongo
Aspergillus puede actuar como un alérgeno, e induce una
reacción de hipersensibilidad en los pulmones, dando lugar a la
ABPA. Las características clínicas de ABPA se pueden enmascarar o
pueden ser imitadas por los síntomas respiratorios de la fibrosis
quística, y es probable que den como resultado un sobrediagnóstico.
Tantos como el 50% de los sujetos con fibrosis quística pueden tener
en algún momento un ensayo serológico positivo aislado.
La forma invasiva de la aspergilosis se está
haciendo cada vez más importante en estados inmunosuprimidos,
debido a la contaminación medioambiental, al mayor uso de fármacos y
antibióticos quimioterapéuticos, etc. Los hospedantes más
susceptibles son los pacientes inmunodeprimidos, tales como los
casos con pacientes con transplantes de órganos, leucemia o con el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Estudios previos, en particular por el grupo de
Crameri, han demostrado que actualmente se puede lograr la
cuantificación reproducible de anticuerpos anti-Aspergillus
con ensayos inmunoquímicos usando antígenos recombinantes (Crameri
R., Chem Immunol 2002; 81: 73-93; Crameri R, Kodzius
R., Comb Chem High Throughput Screen 2001; 4:
145-155; Hemmann S. et al., J Allergy Clin
Immunol 1999; 104: 601-607; Kodzius R et
al., Comb Chem High Throughput Screen 2003; 6:
147-154; Kurup VP. et al., Clin Exp Allergy
2000; 30: 988-993). En los últimos 10 años, se han
caracterizado varios antígenos de Aspergillus
fumigatus, entre los cuales están los "antígenos de
quimiotripsina y catalasa" clásicos usados desde los estudios del
grupo de Biguet en el diagnóstico de la aspergilosis, o el antígeno
C de Longbottom (Beauvais A. et al. J Biol Chem 1997; 272:
6238-6244; Calera JA. et al. Infect Immun
1997; 65: 4718-4724; Kobayashi H. et al.
Infect Immun 1993; 61: 4767-4771; Latgé JP. et
al. Infect Immun 1991; 59: 2586-2594.; Paris S.
et al. FEMS Microbiol Lett 1993; 111:
31-36).
A pesar de estos antígenos conocidos de
Aspergillus, actualmente no hay ningún método in vitro
para el diagnóstico de una infección por Aspergillus que sea
reproducible para cada sujeto. De hecho, el nivel de anticuerpos
dirigidos contra un antígeno dado de Aspergillus varía con el
sujeto, y el principal antígeno de diagnóstico no es el mismo de un
sujeto a otro. Esto es debido probablemente a la variación genética
en la población de células B de los diferentes sujetos; también
puede estar asociado con cepas fúngicas que producen cantidades
diferentes de los antígenos respectivos in vivo.
De este modo, existe la necesidad de un nuevo
método de diagnóstico in vitro de una infección por
Aspergillus en un sujeto, que sea eficaz y reproducible,
independientemente de quién sea el paciente. Se ha desarrollado tal
nuevo método seleccionando, entre una pluralidad de antígenos de
Aspergillus conocidos por el experto en la materia, aquellos
que, cuando se combinan juntos, proporcionan resultados
significativos que permiten concluir de manera fiable que el sujeto
sufre una infección por Aspergillus.
Este método es apropiado para el diagnóstico de
aspergiloma y ABPA. El diagnóstico diferencial de ABPA es incluso
posible entre pacientes con fibrosis quística así como pacientes sin
fibrosis quística, una tarea muy difícil. La búsqueda de
anticuerpos anti-aspergillus también se puede usar
para trazar una primoinfección por Aspergillus en pacientes
que esperan terapias inmunusupresivas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, la invención se refiere a
un método para el diagnóstico in vitro de una infección por
Aspergillus determinando en la muestra de suero o plasma de
un sujeto la cantidad de anticuerpos dirigidos contra antígenos de
Aspergillus, que comprende:
- a)
- incubar dicha muestra de suero o plasma con los antígenos de Aspergillus en busca de la formación de inmunocomplejos susceptibles de ser obtenidos entre dichos anticuerpos y dichos antígenos, y
- b)
- determinar la cantidad de los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de Aspergillus,
en el que los antígenos de Aspergillus se
seleccionan de entre el grupo constituido por una combinación de
por lo menos dos de los siguientes antígenos:
- el antígeno de ribonucleasa (RNU),
- el antígeno de catalasa (CA), y
- el antígeno de dipeptidilpeptidasa V
(DPPV).
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente descripción, los términos
"inmunoglobulina" y "anticuerpo" se usan de
forma indiferente.
Los antígenos de RNU, CA y DPPV se obtienen
preferentemente de Aspergillus fumigatus.
Para obtener estos antígenos, se puede usar
cualquier método bien conocido por el experto en la materia, tal
como mediante purificación, mediante síntesis química (método en
fase sólida) o mediante biología molecular usando ácidos nucleicos
que codifican dichos antígenos y vectores de expresión (véase más
abajo).
El término "sujeto" se refiere a
cualquier mamífero, preferentemente un ser humano.
Preferentemente, en la etapa (b), la
determinación de una cantidad significativamente superior de
anticuerpos dirigidos contra por lo menos uno de dichos dos
antígenos, comparada con la cantidad obtenida para una muestra de
suero o plasma de referencia negativa, es indicativa de una
infección por Aspergillus.
El experto en la materia sabe cómo determinar la
cantidad significativamente superior en comparación con la obtenida
para una muestra de suero o plasma de referencia negativa.
Habitualmente, se usará un análisis estadístico apropiado (véanse
los Ejemplos, en particular el párrafo 6, "Revestimiento
antigénico y ELISA" de los Ejemplos). La cantidad
significativamente superior dependerá de las condiciones que se han
usado en el método de la invención. La expresión "muestra de
suero o plasma de referencia negativa" se refiere a cualquier
muestra de suero o plasma obtenida de un sujeto que no sufre una
infección por Aspergillus.
El medio apropiado, las condiciones apropiadas,
y el protocolo para la formación de los inmunocomplejos son
conocidos por el experto en la materia que trabaja en el campo de la
inmunología. A título de ejemplo, en "Current Protocols in
Immunology", actualizado anualmente (4 volúmenes) y editado por
el "National Institute of Health", de John E. Coligan, Ada M.
Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren
Strober-Wiley Interscience, se describen diversos
métodos y protocolos que se pueden usar.
Preferentemente, los antígenos de
Aspergillus se aplican como un revestimiento sobre un soporte
sólido. Ventajosamente, cada uno de dichos antígenos se aplica como
un revestimiento en una localización diferente sobre el soporte
sólido.
El revestimiento antigénico se puede realizar
sobre diversos soportes sólidos conocidos por el experto en la
materia, preferentemente directa o indirectamente usando un
espaciador. Los soportes sólidos pueden incluir vidrio,
poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon o
celulosas naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser
solubles o insolubles. También pueden consistir en microperlas, una
tira de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), o una
placa de microtitulación tal como una placa de (ELISA).
A título de ejemplo, en la etapa (a), la muestra
de suero o plasma se incuba con los antígenos de Aspergillus
que se han aplicado previamente como un revestimiento sobre un
soporte sólido. Después, los anticuerpos de la muestra de suero o
plasma que no han formado inmunocomplejos con los antígenos de
Aspergillus aplicados como revestimiento se eliminan, por
ejemplo con un tampón de lavado. En una etapa siguiente, los
anticuerpos anti-inmunoglobulina
(anti-Ig), tales como los anticuerpos
anti-IgG, anti-IgE y
anti-IgA, conjugados con un marcador, se pueden
poner en contacto con los inmunocomplejos formados en el soporte
sólido. Los anticuerpos anti-Ig conjugados que no
han interactuado con los anticuerpos de los inmunocomplejos se
eliminan entonces. Finalmente, en la etapa (b), se determina la
cantidad de dichos anticuerpos por medio de las señales de detección
obtenidas con los marcadores.
Los marcadores que se pueden usar son bien
conocidos por el experto en la materia, y se pueden seleccionar de
las enzimas, los colorantes, los agentes luminiscentes tales como
los agentes radioluminiscentes (tales como ^{14}C, ^{36}Cl,
^{57}Co, ^{58}Co, ^{51}Cr, ^{152}Eu, ^{59}Fe, ^{3}H,
^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{75}Se y ^{99m}Tc,
que se pueden detectar usando por ejemplo un contador de rayos
gamma o un contador de centelleo, autorradiografía, etc.),
bioluminiscentes, quimioluminiscentes (luminol, dioxetano,
luciferasa, luciferina), fluorescentes, y fosforescentes, los
ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina,
5-bromodesoxiuridina, isótopos radiactivos. De este
modo, los anticuerpos anti-Ig se conjugan por
ejemplo con enzimas tales como peroxidada, fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa
amilasa, anhidrasa, acetilcolinesterasa, lisozima, la malato
deshidrogenasa o la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
Los marcadores fluorescentes pueden ser, por ejemplo, la
fluoresceína y sus productos derivados, el isotiocianato de
fluoresceína (FITC), la aloficocianina (APC), la
ficoeritrin-cianina 5 (PC5) y la ficoeritrina (PE),
la calceína (AM), el fluorescente rojo tetrametilrodamina o la
rodamina y sus productos derivados, la GFP (Proteína Verde
Fluorescente), el dansilo, la umbeliferona, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida, el
soporte sólido es una placa de ELISA, y el método comprende:
- a)
- incubar dicha muestra de suero o plasma con los antígenos de Aspergillus aplicados como un revestimiento sobre la placa de ELISA,
- b)
- eliminar de la placa de ELISA los anticuerpos de dicha muestra de suero o plasma no unidos a los antígenos de Aspergillus,
- c)
- poner en contacto anticuerpos anti-inmunoglobulina (anti-Ig) conjugados con una enzima, siendo dichos anticuerpos anti-Ig capaces de unirse a los anticuerpos de dicha muestra de suero o plasma,
- d)
- eliminar de la placa de ELISA los anticuerpos anti-Ig no unidos a los anticuerpos de dicha muestra de suero o plasma,
- e)
- añadir el sustrato soluble correspondiente para la enzima, y
- f)
- leer los valores de la absorbancia de los pocillos de la placa de ELISA en un lector de ELISA a una longitud de onda apropiada,
en el que la cantidad de dichos anticuerpos se
determina por medio de los valores de absorbancia obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio y condiciones apropiados pueden ser,
por ejemplo, tales como los aplicados más abajo (véase párrafo 6,
"Revestimiento antigénico y ELISA" de los Ejemplos).
Ventajosamente, la enzima y el sustrato soluble
correspondiente se seleccionan del grupo que comprende:
- la fosfatasa alcalina y el sustrato soluble
fosfato de 4-nitrofenilo (PNPP);
- la peroxidasa y el sustrato soluble
ortofenilendiamina (OPD);
- la \beta-galactosidasa y el
sustrato soluble
2-nitrofenil-\beta-galactosidasa
(ONPG); o
- la
glucosa-6-fostato deshidrogenasa y
el sustrato soluble
glucosa-6-fosfato (G6P).
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de
RNU y CA. En otra realización, los antígenos de Aspergillus
comprenden la combinación de los antígenos de RNU y DPPV. En aún
otra realización, los antígenos de Aspergillus comprenden la
combinación de los antígenos de CA y DPPV. Lo más preferible, los
antígenos de Aspergillus comprenden la combinación de los
antígenos de RNU, CA y
DPPV.
DPPV.
Además de los antígenos de Aspergillus,
también se puede usar el antígeno de galactomanano (GM), un antígeno
polisacárido. Este antígeno de GM se puede obtener mediante
purificación de un cultivo de Aspergillus (véase, por
ejemplo, el punto 3: "Purificación de galactomanano", en
la parte I: "Material y métodos"), o mediante cualquier
otro método bien conocido por el experto en la materia.
Ventajosamente, cada uno de los antígenos de
RNU, CA, DPPV y GM se aplica como un revestimiento sobre el soporte
sólido, a una densidad comprendida entre 0,1 y 10 \mug/ml, más
ventajosamente 1 \mug/ml.
En otra forma de realización preferida, por lo
menos uno de los antígenos de Aspergillus de RNU, CA y DPPV
es un antígeno recombinante. Ventajosamente, por lo menos dos de los
antígenos de Aspergillus de RNU, CA y DPPV son antígenos
recombinantes. Lo más ventajoso, los tres antígenos de
Aspergillus de RNU, CA y DPPV son antígenos
recombinantes.
Preferentemente, dicho por lo menos un antígeno
de Aspergillus recombinante se obtiene clonando el producto
de amplificación del ADNc correspondiente en un vector de expresión.
Más preferentemente, el producto de amplificación del ADNc
correspondiente se obtiene de una genoteca de ADNc de
Aspergillus fumigatus, usando una pareja de cebadores
específicos para dicho por lo menos un antígeno de
Aspergillus.
El experto en la materia tiene a su disposición
las herramientas de biología molecular y celular para llevar a cabo
la clonación y la expresión recombinante de los antígenos de RNU, CA
y DPPV (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992)). Se
puede emplear una amplia variedad de combinaciones de
hospedante/vector de expresión, tales como hospedantes bacterianos
y los plásmidos bacterianos conocidos correspondientes, células de
levadura/vectores de expresión de levaduras, células de
insectos/vectores de expresión de insectos, células de
mamíferos/vectores de expresión de mamíferos, etc. Además, en estos
vectores se puede usar cualquier secuencia de control de la
expresión adecuada.
Preferentemente, dicho por lo menos un antígeno
de Aspergillus recombinante se obtiene usando levadura de
Pichia pastoris, tal como las cepas de levadura GS115 y KM71,
y vectores de expresión adecuados, tales como pKJ111 (Monod M.
et al., Contrib Microbiol 1999; 2: 182-192),
pKJ113 (Borg-von Zepelin M. et al., Mol
Microbiol 1998; 28: 543-554), pHILS 1 y
pPICZ\alphaA (Invitrogen).
La genoteca de ADNc que se puede usar es la
genoteca de ADNc \lambdagt11 de Aspergillus
fumigatus de Monod M. et al (1991).
Ventajosamente, la pareja de cebadores
específicos para el antígeno de RNU es SEQ ID nº 1 y SEQ ID nº 2.
Más ventajosamente, la pareja de cebadores específicos para el
antígeno de CA es SEQ ID nº 3 y SEQ ID nº 4. Lo más ventajoso, la
pareja de cebadores específicos para el antígeno de DPPV es SEQ ID n
5 y SEQ ID nº 6.
En otra realización preferida, se determina un
único perfil de señales de detección para una cepa dada de
Aspergillus.
Más preferentemente, el método de la invención
comprende además comparar el perfil de señales de detección con un
perfil estándar para cada cepa de Aspergillus, permitiendo la
identificación de la cepa que infecta al sujeto.
Preferentemente, la infección por
Aspergillus ha conducido a aspergiloma y/o aspergilosis
broncopulmonar alérgica (ABPA).
El aspergiloma es una lesión pulmonar
característica provocada por una masa de elementos miceliales del
hongo Aspergillus, que forma una masa esferoidal en una
cavidad pulmonar de paredes fibrosas que habitualmente es continua
con un bronquio.
Más preferentemente, la infección por
Aspergillus que conduce a ABPA se diagnostica en un sujeto
que sufre fibrosis quística, así como en un sujeto que no sufre
fibrosis quística.
Ventajosamente, la infección por
Aspergillus es una aspergilosis invasiva, la cual es posible
de diagnosticar antes de la inmunosupresión en el sujeto que se va
a someter a injerto.
Más ventajosamente, permite el diagnóstico de la
infección por Aspergillus en un ser humano inmunodeprimido,
ventajosamente en un ser humano con el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH).
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un kit de diagnóstico para determinar en una muestra de suero o
plasma la cantidad de anticuerpos dirigidos contra antígenos de
Aspergillus, que comprende:
(a) una combinación de por lo menos dos de los
siguientes antígenos de Aspergillus:
- el antígeno de RNU,
- el antígeno de CA, y
- el antígeno de DPPV.
Preferentemente, el kit de diagnóstico de la
invención comprende además un soporte sólido en el que dichos
antígenos de Aspergillus se aplican como revestimiento.
Ventajosamente, cada uno de dichos antígenos se aplica como un
revestimiento en una localización diferente sobre el soporte
sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, el kit de diagnóstico comprende
además:
(b) una disolución que contiene anticuerpos
anti-Ig conjugados con un marcador.
\vskip1.000000\baselineskip
Más ventajosamente, el kit de diagnóstico
comprende además:
(c) un tampón de lavado.
En una forma de realización, los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de
RNU y CA. En otra realización, los antígenos de Aspergillus
comprenden la combinación de los antígenos de RNU y DPPV. En aún
otra realización, los antígenos de Aspergillus comprenden la
combinación de los antígenos de CA y DPPV. Lo más preferible, los
antígenos de Aspergillus del kit de diagnóstico comprenden
la combinación de los antígenos de RNU, CA y DPPV.
En una forma de realización adicional, los
antígenos de Aspergillus del kit de diagnóstico comprenden
adicionalmente el antígeno de GM.
Ventajosamente, cada uno de los antígenos de
RNU, CA, DPPV y GM se aplica como un revestimiento sobre el soporte
sólido, a una densidad comprendida entre 0,1 y 10 \mug/ml, más
ventajosamente 1 \mug/ml.
En una realización preferida adicional, por lo
menos uno de los antígenos de Aspergillus de RNU, CA y DPPV
es un antígeno recombinante. Ventajosamente, por lo menos dos de los
antígenos de Aspergillus de RNU, CA y DPPV son antígenos
recombinantes. Más ventajosamente, los tres antígenos de
Aspergillus de RNU, CA y DPPV son antígenos
recombinantes.
En una realización preferida, el soporte sólido
es una placa de ELISA, y el marcador es una enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, el kit de
diagnóstico comprende además:
(d) una disolución que contiene el sustrato
soluble correspondiente para la enzima.
En un tercer aspecto, la invención se refiere al
uso de una combinación de por lo menos dos de los siguientes
antígenos para el diagnóstico de una infección por
Aspergillus en un ser humano:
- el antígeno de RNU,
- el antígeno de CA, y
- el antígeno de DPPV.
Preferentemente, la combinación es la de los
antígenos RNU, CA y DPPV.
En otra forma de realización preferida, para el
diagnóstico se usa un ensayo de ELISA.
Una forma de realización adicional preferida es
el uso de la invención en el que la infección por Aspergillus
ha conducido a aspergiloma y/o aspergilosis broncopulmonar alérgica
(ABPA). Preferentemente, la infección por Aspergillus que
conduce a ABPA se diagnostica en un sujeto que sufre fibrosis
quística, así como también en un sujeto que no sufre fibrosis
quística.
En otra forma de realización preferida, la
infección por Aspergillus es una aspergilosis invasiva, la
cual es posible de diagnosticar antes de la inmunosupresión en un
ser humano que va a ser sometido a injerto.
En otra forma de realización preferida, el uso
de la invención permite el diagnóstico de la infección por
Aspergillus en un ser humano inmunodeprimido, ventajosamente
en un ser humano con el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH).
La presente invención se describe adicionalmente
en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan con
fines únicamente ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de
las reivindicaciones adjuntas. Los diversos supuestos son
pertinentes para muchas situaciones prácticas, y pretenden ser a
título ejemplificativo para los expertos en la materia.
Figura 1. Respuesta de anticuerpos dirigida
contra 7 antígenos recombinantes en los sueros de pacientes con
aspergiloma y del control. Los valores mostrados son las medias de
las densidades ópticas (OD) de ELISA de 57 pacientes y 41 controles
procedentes de 3 centros (un suero por paciente). Los valores de OD
obtenidos con antígenos, seguidos de un asterisco en la línea
"Diagnóstico potencial", son significativamente diferentes en
un análisis de varianza de ANOVA de 3 vías, con el centro, el
antígeno y la patología como factores (DPPIV es sólo significativa
en uno de los centros).
Figura 2. Correlación entre el número de bandas
de IEP y el nivel de anticuerpos anti-DPPV
(expresado en valor de OD). El ajuste lineal (OD DPPV = 0,3 + 0,05
números de bandas de IEP) es estadísticamente significativo
(p<0,0001 para un error df de 101).
Figura 3. Seguimiento de los niveles de
anticuerpos dirigidos contra CAT, RNU, DPPV y GM en los sueros de 4
pacientes con aspergiloma (Ben, Ver, Pin, Maz). Los niveles de
anticuerpos anti-antígenos recombinantes se expresa
en valores de OD; CAT = \boxempty; DPPV = 0; RNU= \Delta; GM =
\blacklozenge.
Figura 4. Respuesta de anticuerpos contra 7
antígenos recombinantes por pacientes con ABPA, y sus contrapartes
del control atópicas o con fibrosis quísticas respectivas. Los
valores de OD mostrados son medias de 12 pacientes con ABPA y 16
pacientes con ABPA/fibrosis quística y 51 pacientes con fibrosis
quística y 37 pacientes de control (1 suero por paciente, 2
centros). En la Tabla 3 se muestra la significatividad de los
datos.
Figura 5. Gráfica canónica que muestra la
separación de las poblaciones que sufren ABPA con sus controles
respectivos. Para el análisis discriminante, se han usado los
valores de OD obtenidos con todos los antígenos recombinantes. La
gráfica canónica muestra los puntos y medias multivariables en las
dos dimensiones que separan mejor los grupos de pacientes. El
tamaño del círculo corresponde a un límite de confianza de 95% para
la media. Los grupos que son significativamente diferentes tienden
a tener círculos que no se intersecan.
Figura 6. Seguimiento de los niveles de
anticuerpos dirigidos contra CAT, RNU y DPPV en los sueros de 4
pacientes que sufren ABPA (Aud, Bod, Aub, Del). Los niveles de
anticuerpos anti-antígeno recombinante se expresan
en valores de OD. Las barras indican el período de ABPA según lo
define el médico (CAT = \boxempty; DPPV = 0; RNU = \Delta).
Figura 7. Agrupamiento jerárquico (método de
Ward) de 23 pacientes con AI probada. El agrupamiento se ha basado
en los valores de OD obtenidos mediante ELISA con los antígenos de
CAT y DPPV en sueros tomados al ingresar los pacientes en el
hospital; a: pacientes con títulos elevados de anticuerpos; b:
pacientes con títulos bajos de anticuerpos.
Figura 8. Análisis de varianza de una vía que
muestra que la población de pacientes con AI con título elevado de
anticuerpos (a) antes del injerto fue diferente de las poblaciones
de paciente b y de la población del control (véase la fig. 7 para
el agrupamiento de los pacientes). La media de los diamantes indica
la media de la muestra y el intervalo de confianza de 95%. Los
círculos visualizan el análisis de pares de Student: la
significatividad de los resultados se indica por la falta de
intersección entre dos círculos.
Figura 9. Evolución de los títulos de
anticuerpos contra el antígeno de RNU, CAT, DPPV y GM en seis
pacientes con AI probada. El día 0 es la primera muestra tomada al
ingresar el paciente en el hospital. El injerto (cuando se realiza)
se indica por una flecha. Los pacientes PIE, BAR y RUD pertenecen a
un agrupamiento (véase fig. 7) caracterizado por niveles elevados
de anticuerpos dirigidos contra DPPV y CAT. Los pacientes MOU, MOR y
GOR pertenecen al agrupamiento b de pacientes con niveles bajos de
antígenos contra CAT y DPPV. CAT = \boxempty; DPPV = 0; RNU =
\Delta; GM = \blacklozenge; GMAg \medbullet.
Figura 10. Gráfica canónica que muestra las 3
poblaciones de pacientes (con AI cierta, probable o negativa)
discriminados con niveles de anticuerpos en su ingreso en el
hospital. Para el análisis discriminante, se han usado los valores
de OD obtenidos con los antígenos de DPPV, GM, RNU y CAT. La gráfica
canónica muestra los puntos y medias multivariables en las dos
dimensiones que separan mejor los grupos de pacientes. El tamaño
del círculo corresponde a un límite de confianza de 95% para la
media. Los grupos que son significativamente diferentes tienden a
no tener círculos que se intersecan.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de A. fumigatus usada es la cepa
CBS 144.89 de origen clínico. Para expresar los antígenos
recombinantes, se usaron GS115 y KM71 de Pichia pastoris y
los vectores de expresión pKJ111 (Monod M. et al., 1999),
pKJ113 (Borg-von Zepelin M. et al., 1998),
pHILS1 y pPICZ\alphaA (Invitrogen). Todos los experimentos de
clonación de plásmidos se realizaron en XL1 blue de E. coli.
Para la propagación del bacteriófago \lambdagt11 (Promega), se
usó LE392 de E. coli.
Los ADNc de los antígenos de A. fumigatus
se obtuvieron mediante PCR usando ADN preparado a partir de
10^{6} clones de una genoteca de ADNc de \lambdagt11 construida
previamente (Monod M. et al., 1991). Los cebadores derivaron
de secuencias de ADN genómico de los genes que codifican la alcalina
proteasa ALP (Monod M. et al., 1993, FEMS Microbiol Lett.
106: 39-46), la metaloproteasa MEP
(Jaton-Ogay et al., 1994, Mol. Microbiol.
14: 917-928), la aspártico proteasa PEP (Reichard
et al., 1995, FEMS Microbiol. Lett.
130:69-74), la ribonucleasa RNU (Paris et
al., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 111:31-36), la
superóxido dismutasa SOD (Holdom et al., 2000, J. Clin.
Microbiol. 38: 558-562), la catalasa CAT (Calera
et al., 1997, Infect. Immun. 65: 4718-4724),
la dipeptidilpeptidasa (IV) DPPIV (Beauvais et al., 1997,
Infect. Imm. 65: 3042-3047) y la
dipeptidilpeptidasa (V) DPPV (Beauvais et al., 1997, J. Biol.
Chem.: 6238-6244) (Tabla 1). Se disolvieron
doscientos ng de ADN diana, 10 \mul de cada uno de los
oligonucleótidos sentido y antisentido a una concentración de 42 mM
y 8 \mul de mezcla desoxinucleotídica (que contiene 10 mM de cada
dNTP), en 100 \mul de tampón de PCR (10 mM de
Tris-HCl pH 8,3, 50 mM de KCl y 1,5 mM de
MgCl_{2}). A cada reacción se añadieron 2,5 U de ADN polimerasa
AmpliTAQ (Perkin Elmer). Las mezclas de reacción se incubaron 5
minutos a 94ºC, se sometieron a 25 ciclos de 0,5 minutos a 94ºC, 0,5
minutos a 55ºC y 0,5 minutos a 72ºC, y finalmente se incubaron 10
minutos a 72ºC.
Los plásmidos de expresión se construyeron
clonando productos de la PCR de ADNc en vectores de expresión de
P. pastoris. Los productos de la PCR se purificaron usando un
kit de purificación de PCR (Roche Diagnostics), y se digirieron
mediante enzimas de restricción, para lo cual se diseñó previamente
un sitio en el extremo 5' de los cebadores (Tabla 1). La
transformación en P. pastoris, la selección de los
transformantes y la producción de las enzimas recombinantes en el
medio metanol se llevó a cabo como se describió previamente (Beggah
S. et al., Microbiology 2000; 146: 2765-2773;
Borg-von Zepelin M. et. al., 1998). Todas las
proteínas marcadas con 6xHis se unieron a una columna Probond
(Invitrogen), con la excepción de la DPPIV. Tras lavar la
columna con 20 mM de tampón de fosfato pH6 que contiene 0,5 M de
NaCl, las proteínas se eluyeron de la columna Ni 2+ con 50 mM de
histidina. La elución de RNU requirió el uso de 500 mM de tampón de
imidazol pH, y la proteína se dializó contra disolución 50 mM de
histidina. La solubilización de los diferentes antígenos en la
disolución 50 mM de histidina permitió la aplicación directa de un
revestimiento de antígenos sobre la placa de microtitulación,
mientras que el imidazol interfirió con el revestimiento y la
subsiguiente reacción colorimétrica (datos no mostrados).
En contraste con los otros antígenos, la DPPIV
no se unió a la columna de Ni 2+. El análisis de transferencia
Western de la DPPIV con un anticuerpo monoclonal
anti-His1 del clon de polihistidina (Sigma), diluido
1/1000, fue negativo, mientras que un control de DPPV fue positivo
(datos no mostrados). Este resultado mostró que la falta de unión a
la columna de Ni no fue debida a la falta de accesibilidad del
marcador de 6 His al Ni debido a una estructura tridimensional
específica de la proteína, sino a la ausencia de la secuencia que
codifica el marcador de 6His en la proteína recombinante DPPIV. La
purificación de la DPPIVp se realizó como se describió
anteriormente (Beauvais A. et al. Infect Imm 1997; 65:
3042-3047), con algunas modificaciones. Para
purificar DPPIVp, el filtrado del cultivo de Pichia se
precipitó mediante 4 volúmenes de EtOH, y el precipitado
solubilizado en agua se dializó frente a 20 mM de tampón de Tris HCl
pH 8,0. Las proteínas se cargaron en una columna MonoQ HR 5/5, y la
proteína se eluyó con 0-500 mM de NaCl. Las
fracciones que contienen la actividad de dipeptidilpeptidasa medida
como se describe previamente (Beauvais A. et al., 1997) se
reunieron y se concentraron a vacío. La purificación final se
realizó usando una columna de permeación en gel Superdex 200 HR
10/30, usando 20 mM de tampón de Tris HCl pH 8,0 que contiene NaCl
0,12 M. Se verificó que la proteína purificada tuvo la actividad de
dipeptidilpeptidasa descrita anteriormente (Beauvais A. et
al., 1997).
La pureza de los diferentes lotes de antígenos
se controló mediante la falta de la banda de proteína contaminante
en SDS PAGE tras sobrecargar un gel de acrilamida separador al
10%.
\newpage
Se hizo crecer A. fumigatus durante 40
horas en un fermentador, como se describió previamente (Hearn et
al., 1990, en R.A. Samson y J.I.Pitt (ed.), Modern concepts in
Penicillum and Aspergillus classification, Plenum Press, Londres,
Nueva York). Debido a la finalización de la comercialización de
hidracina, se utilizó otro protocolo de purificación del GM. El
filtrado del cultivo se precipitó en etanol, y el precipitado se
digirió primero durante 3 días a 37ºC con amilasa (procedente de
Bacillus licheniformis, referencia de Sigma A4551) a una
relación de 1:30 (peso seco) en 100 mM de tampón de acetato de Na pH
5,6, y después se incubó 3 días a 37ºC con Pronase (de
Streptomyces griseus, referencia de Sigma P5147) a una
relación de 1:6 (peso seco). La mezcla de reacción se puso a hervir
durante 10 minutos a 100ºC, y se trató posteriormente durante 1
hora a 60ºC en presencia de NaOH (concentración final 1M). Tras la
neutralización, el GM se dializó y se liofilizó. La pureza de GM se
verificó mediante cromatografía de gases como se describió
previamente (Fontaine et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:
27594-27607, Latgé et al., 1994, Infect.
Immun. 62: 5424-5433).
Las patologías se identificaron en cada centro
basándose en los síntomas clínicos con reglas establecidas en cada
hospital. Se reclutaron en 3 centros (Toulouse, Grenoble y
Estrasburgo) 57 pacientes con aspergiloma y 41 controles. Además,
se tomaron secuencialmente 2 a 9 (media, 3,9) muestras por paciente
en el centro de Toulouse. En los centros de Toulouse y Grenoble, se
analizaron 16 pacientes con ABPA y 51 controles en la población de
fibrosis quística. Se compararon 12 pacientes con ABPA en una
población sin fibrosis quística con 27 controles. En Toulouse,
estaban disponibles muestras secuenciales (3 a 16, media de 8,6) por
pacientes para 14 pacientes con ABPA (en un contexto de fibrosis
quística o sin fibrosis quística). Todos los pacientes con AI
procedieron del hospital St Louis (Paris): 23 con AI probada o
probable, 21 con AI posible, y 34 controles que se
inmunosuprimieron o/y se sometieron a injerto como los pacientes con
AI. Para cada serie de pacientes, estaban disponibles 1 a 5
muestras (media 7,5), 2 a 11 muestras (media 6) y 1 a 12 muestras
(media 3,9) por paciente con AI probada/probable, AI posible y
paciente de control respectivamente. También estaban disponibles 1
a 7 sueros por paciente antes del injerto o del comienzo de la
terapia inmunosupresiva.
La IEP rápida se llevó a cabo usando el sistema
Beckman-IEP Paragon siguiendo una adaptación de las
instrucciones del fabricante. De forma resumida, la migración de
los antígenos de Aspergillus somáticos y metabólicos (Sanofi
Pasteur Diagnosis, Marnes la Coquette, Francia) se realizó a 100V
durante 12 minutos. La incubación con el suero puro duró
18-24 horas. Tras los lavados con citrato de sodio,
la presencia de una precipitina con actividad de catalasa se
visualizó con H_{2}O_{2} al 3%, y se contó el número total de
precipitinas tras la tinción con azul de Coomassie o ácido violeta
de Paragon del gel seco.
Todos los antígenos proteínicos y galactomanano
se aplicaron como revestimiento sobre placas de ELISA (Greiner Ref.
762070), a una concentración de 1\mu para todos los antígenos,
excepto para la catalasa, que se aplicó como revestimiento a 4
\mug/l. Tras la aplicación del revestimiento, los pocillos se
vaciaron y se llenaron con 300 \mul de PBS suplementado con Tween
20 al 2%. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura
ambiente, la disolución de PBS/Tween se sustituyó por 300 \mul de
PBS que contiene 5% de glucosa y 2,5% de leche sin grasa, y las
placas se incubaron durante 2 minutos a RT. Los pocillos se vaciaron
nuevamente y se secaron en un horno a 60ºC durante 10 min. Tras
secar, las placas se almacenaron congeladas. Las concentraciones y
protocolos del revestimiento antigénico se basaron en experimentos
preliminares que indicaron que estas concentraciones aseguraron
lecturas óptimas de OD con un conjunto de sueros procedente de
pacientes con aspergiloma que se sabe que contiene cantidades
elevadas de anticuerpos anti-Aspergillus. Los sueros de los
pacientes se diluyeron 1/500 en PBS que contiene Tween 20 al 0,05%
y BSA al 1%. Los sueros procedentes de Toulouse y St Louis se
analizaron en el laboratorio de los inventores. Los sueros
procedentes de Grenoble y Estrasburgo se ensayaron en el sitio
según el protocolo seguido en el Pasteur, que contenía clásicamente
las siguientes etapas: incubación durante 1h a 37ºC con el suero
del paciente; 5 lavados con PBS con Tween 20 al 0,05%; incubación
con un anticuerpo anti-IgG (H + L) secundario
conjugado con peroxidada (Sigma); 5 lavados e incubación con
ortofenilendiamina (OPD) para las lecturas de la OD. Los
experimentos se realizaron por duplicado, y se repitieron por lo
menos una vez.
El análisis estadístico de los datos se llevó a
cabo usando el programa de ordenador JMP (SAS, Cary, NC). Se
calcularon los valores medios, y se computó el error estándar. Los
métodos usados fueron el análisis de varianza, seguido de la
clasificación de las medias usando las diferencias de medias de
mínimos cuadrados analizadas por la prueba de la t de Student. El
análisis de bivariables para analizar la distribución de una
variable continua con otra se realizó a través del ajuste de elipse
de la densidad usando el valor r de correlación de Pearson para la
significatividad. El análisis discriminante clasificó los valores de
OD para antígeno en grupos de pacientes predefinidos en base a su
patología. El análisis se presentó como una gráfica canónica que
muestra los puntos y medias multivariables en las dos dimensiones
que separan mejor los grupos. La sensibilidad, especificidad,
valores predictivos negativos y valores predic-
tivos positivos se estimaron basándose en valores de corte optimizados calculados a partir de los pacientes del control.
tivos positivos se estimaron basándose en valores de corte optimizados calculados a partir de los pacientes del control.
La Fig. 1 muestra que, entre los antígenos
proteínicos, los antígenos de DPPV, catalasa y ribonucleasa
produjeron la mejor discriminación entre pacientes y controles. A
pesar de los niveles elevados de anticuerpos en los sueros de los
controles, la DPPIV fue también útil para identificar pacientes con
aspergiloma. Por el contrario, las proteasas (aspártico, metalo- y
serina proteasas) y la superóxido dismutasa no indujeron una
respuesta humoral específica en pacientes con aspergiloma (datos no
mostrados para serina proteasa). Un análisis de varianza de 3 vías
mostró una respuesta significativa (p = 0,03) para el factor de
interacción centro x antígeno x patología. Esto fue debido a la
respuesta con respecto a DPPIV, que fue discriminativa con pacientes
procedentes de Toulouse, pero que no lo fue en los otros centros
(datos no mostrados). Por el contrario, la eficacia discriminativa
de la ribonucleasa, dipeptidilpeptidasa y catalasa fue buena en los
3 centros. Los niveles de anticuerpos anti-RNU,
anti-CAT y anti-DPPV fueron
significativamente mayores en las poblaciones de pacientes que en la
población del control de los tres centros ensayados. La Tabla 2
muestra la sensibilidad del ensayo, incrementada con el número de
antígenos incluidos en el ensayo; se alcanzó un valor máximo de 95%
cuando se computaron los valores de OD obtenidos con los 3
antígenos. Por el contrario, los valores de la especificidad
disminuyeron ligeramente cuando se usaron múltiples
antígenos.
antígenos.
Se llevó a cabo un análisis detallado de los
pacientes del centro de Toulouse, puesto que los inventores tuvieron
múltiples muestras secuenciales por paciente. En esta serie de
pacientes, el antígeno de galactomanano (GM) también se ensayó y se
comparó con RNU, CAT y DPPV, los 3 antígenos proteínicos
recombinantes discriminativos que habían mostrado anteriormente ser
discriminativos. Los valores de OD de ELISA mostraron que el
antígeno de galactomanano también fue discriminativo para esta
patología. La media de la OD para los pacientes del control fue
mayor con los antígenos de GM y CAT que con RNU y DPPV. En las
condiciones ensayadas, se obtuvieron respectivamente los valores
medios de OD de 0,82 \pm 0,05, 0,95 \pm 0,08, 1,0 \pm 0,07 y
0,71 \pm 0,04 con RNU, DPPV, GM y CAT en los sueros de los
pacientes con aspergiloma, mientras que estos valores fueron 0,26
\pm 0,07, 0,25 \pm 0,06, 0,74 \pm 0,06 y 0,47 \pm 0,09 en
los sueros de los pacientes del control. Se obtuvo una buena
puntuación de correlación para todos los antígenos, obteniéndose la
mejor correlación con los antígenos GM, CAT y DPPV. Además, el
análisis de bivariables mostró una correlación buena y
estadísticamente significativa entre los números de las bandas de
IEP obtenidos y los valores de OD obtenidos con los tres antígenos
recombinantes y GM. La mejor correlación con el número de bandas de
precipitina se obtuvo con los valores de OD de DPPV, con un valor r
de 0,6 (Fig. 2), mientras que se obtuvieron los valores de 0,38,
0,31 y 0,28 respectivamente con RNU, GM y CAT.
Un análisis cinético de 13 pacientes del
hospital de Toulouse ilustró las variaciones observadas entre
pacientes en los títulos de los anticuerpos frente a los 4
antígenos discriminativos (Fig.3 como un ejemplo de 4 pacientes).
Aunque en conjunto hubo una diferencia significativa entre los
pacientes con aspergiloma y los pacientes del control (Fig. 1), la
respuesta de los anticuerpos dependió tanto del paciente como del
antígeno. En primer lugar, los niveles de anticuerpo dirigido
contra antígenos individuales variaron con el paciente. Por ejemplo,
para el paciente Maz el valor más elevado de OD se asoció a una
respuesta contra CAT y DPPV, mientras que los valores más bajos de
OD se obtuvieron con estos 2 antígenos en el paciente Ber. En
segundo lugar, el nivel de anticuerpo podría variar también a lo
largo del tiempo, dependiendo del antígeno y del paciente. Por
ejemplo, en el paciente Ben, los niveles de anticuerpo contra el
antígeno RNU aumentaron, mientras que, en el mismo paciente, el
nivel de anticuerpo contra los otros tres antígenos ensayados
permaneció constante a lo largo del tiempo (Fig. 3).
La ABPA es una complicación importante tanto de
pacientes con fibrosis quística así como de pacientes sin fibrosis
quística. Los pacientes con fibrosis quística a menudo son
colonizados por Aspergillus, y esta colonización puede estar
asociada con niveles elevados de anticuerpos
anti-Aspergillus, lo que hace difícil la diferenciación
entre pacientes que fueron colonizados de pacientes con ABPA
verdadera en esta población con fibrosis quística. Por esta razón,
se analizaron 4 poblaciones de pacientes: controles sin fibrosis
quística, controles con fibrosis quística, ABPA sin fibrosis
quística y ABPA con fibrosis quística.
La Fig. 4 muestra que el ELISA de los inventores
fue capaz de diferenciar pacientes con ABPA de pacientes del
control tanto en poblaciones atópicas como en poblaciones con
fibrosis quística. La reunión de todos los datos de anticuerpos
juntos en una gráfica canónica mostró la separación restrictiva de
las 4 poblaciones diferentes (Fig. 5). Al igual que en los
pacientes con aspergiloma, los 3 antígenos más discriminativos
fueron RNU, CAT y DPPV en todos los centros clínicos (Tabla 3).
Este estudio confirmó que los pacientes con
fibrosis quística tuvieron niveles elevados de anticuerpos
anti-
Aspergillus contra todos los antígenos, y especialmente contra DPPIV. Este resultado estaba de acuerdo con el hecho de que todos los pacientes con fibrosis quística tienen permanentemente A. fumigatus. Estos títulos de anticuerpos permanecieron sin embargo menores que los títulos anti-Aspergillus encontrados en los pacientes con ABPA. Estos datos sugirieron que la monitorización de los títulos de anticuerpos durante el seguimiento de los pacientes con fibrosis quística se podría usar para identificar el empeoramiento de la colonización o/y el aumento de una situación patológica de ABPA. La Tabla 4 muestra la especificidad, sensibilidad y valores negativos y predictivos para ABPA para la población analizada con fibrosis quística. Cuando cada uno de los 3 antígenos discriminantes se consideró separadamente, el valor más bajo de sensibilidad (38%) se obtuvo con CAT. Los valores más elevados de los parámetros de diagnóstico se obtuvieron con una combinación de RNU y DPPV. En consecuencia, estos dos antígenos se consideraron los antígenos más valiosos para el diagnóstico de ABPA. Se encontraron datos similares cuando se analizó la población de ABPA en un marco sin fibrosis quística (datos no mostrados).
Aspergillus contra todos los antígenos, y especialmente contra DPPIV. Este resultado estaba de acuerdo con el hecho de que todos los pacientes con fibrosis quística tienen permanentemente A. fumigatus. Estos títulos de anticuerpos permanecieron sin embargo menores que los títulos anti-Aspergillus encontrados en los pacientes con ABPA. Estos datos sugirieron que la monitorización de los títulos de anticuerpos durante el seguimiento de los pacientes con fibrosis quística se podría usar para identificar el empeoramiento de la colonización o/y el aumento de una situación patológica de ABPA. La Tabla 4 muestra la especificidad, sensibilidad y valores negativos y predictivos para ABPA para la población analizada con fibrosis quística. Cuando cada uno de los 3 antígenos discriminantes se consideró separadamente, el valor más bajo de sensibilidad (38%) se obtuvo con CAT. Los valores más elevados de los parámetros de diagnóstico se obtuvieron con una combinación de RNU y DPPV. En consecuencia, estos dos antígenos se consideraron los antígenos más valiosos para el diagnóstico de ABPA. Se encontraron datos similares cuando se analizó la población de ABPA en un marco sin fibrosis quística (datos no mostrados).
En cuanto a los pacientes con aspergiloma, se
observaron variaciones significativas en los títulos de anticuerpos
contra un antígeno entre pacientes, y a lo largo del tiempo en el
mismo paciente (Fig. 6). Por ejemplo, el paciente Aud tuvo un
título anti-DPPV bajo, mientras que el paciente Del
tuvo un título anti-RNU bajo; por el contrario, el
paciente Aub tuvo niveles elevados de títulos de anticuerpos contra
RNU. Los niveles de anticuerpos fueron constantes en pacientes Aub
y Del, pero muy variables en el paciente Aud. El incremento en los
títulos de los anticuerpos pareció estar asociado con episodios de
ABPA, mientras que una disminución en el título de los anticuerpos
se correlacionó con una mejora del paciente (Fig. 6).
Puesto que los antígenos más discriminantes que
indicaron una situación patológica en la población inmunocompetente
o atópica fueron RNU, CAT y DPPV, se ensayaron estos 3 antígenos
para investigar la situación de los anticuerpos en aspergilosis
invasiva. Además, se analizaron los anticuerpos dirigidos contra GM,
puesto que tanto se han asociado al crecimiento fúngico en los
tejidos pulmonares de los pacientes con aspergiloma (véase
anteriormente) como se ha sugerido que son responsables de los
falsos negativos obtenidos con el kit de Platelia usado para el
diagnóstico de AI, que se basa en la detección de antigenemia
galactomanánica (Hearn et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:
982-986; Herbrecht et al., 2002, J. Clin.
Oncol. 20: 1898-906). Se midieron los niveles de
anticuerpos contra estos 4 antígenos en una cohorte de pacientes
inmunodeprimidos con AI probada y probable, y controles que se
sometieron al mismo tratamiento clínico pero no tuvieron infección
fúngica.
En primer lugar, la comparación de los títulos
séricos en los mismos pacientes tras el injerto o la inmunosupresión
y tras el diagnóstico clínico de AI mostró la falta de incremento
en los niveles de anticuerpos durante el curso de AI en estos
pacientes inmunodeprimidos (valor de p de 0,83 para un error df de
118). Este resultado confirmó que, en el estudio de los inventores,
los pacientes inmunodeprimidos con AI no produjeron anticuerpos
detectables dirigidos contra el hongo durante el desarrollo de la
enfermedad. En contraste con los niveles de anticuerpos contra CAT,
RNU, DPPV o GM, el nivel de galactomanano circulante en los mismos
sueros fue discriminativo de AI, con un incremento en la cantidad
de antígeno liberado durante la evolución de AI a lo largo del
tiempo (valor de p <0,01 para un error df de 118).
Aunque el nivel de anticuerpo no cambió durante
el curso de la enfermedad, el análisis de la respuesta de
anticuerpos en la población de pacientes con AI probada mostró que
un nivel elevado de anticuerpos contra los cuatro antígenos
ensayados se correlacionó positivamente con la aparición de
aspergilosis invasiva probada/probable. La Tabla 5 muestra que el
antígeno más discriminante fue CAT, y en menor grado DPPV. RNU y GM
fueron muy poco discriminantes (véanse los bajos valores de
sensibilidad para estos 2 antígenos en la Tabla 5). La Fig. 7
muestra el agrupamiento jerárquico basado en los valores de OD con
los antígenos de CAT y DPPV obtenidos con los sueros de los
pacientes ensayados: se diferenciaron claramente dos grupos de
pacientes que contienen respectivamente 10 (grupo a) y 13 pacientes
(grupo b). Los valores de OD observados con el grupo de pacientes
con bajos títulos (b) no fueron significativamente diferentes del
grupo del control (c). En contraste, los valores de OD en el
segundo grupo de pacientes con títulos elevados de anticuerpos (a)
fueron significativamente diferentes de los otros grupos b y c
(Fig. 8). Los mejores valores de sensibilidad y especificidad
obtenidos para la población a (10 pacientes) frente a la población
del control (34 pacientes) fueron respectivamente 89 y 70% para
DPPV, y 100 y 97% para CAT. La detección de anticuerpos anti-A.
fumigatus en esta subpoblación de pacientes fue extremadamente
predictiva de AI. La presencia de niveles elevados de anticuerpos en
los sueros de estos pacientes antes de la inmunosupresión sugirió
que estaban infectados antes de los tratamientos de injerto o
inmunosupresión. Usando la plataforma de partición del programa de
ordenador JMP sobre los valores de OD obtenidos en nuestras
condiciones de ELISA experimentales y con la población muestreada
aquí, los valores de OD indicativos de un suero negativo para los 4
antígenos fueron respectivamente 0,21, 0,12, 0,44 y 0,54 para RNU,
DPPV, CAT y GM. Los valores por encima de 0,36, 0,35, 1,08 y 1,05,
para los mismos antígenos, fueron indicativos de una infección por
Aspergillus. Los datos de regresión logística han confirmado
que los antígenos más discriminantes con un valor de p <0,0001
fueron CAT y DPPV (datos no
mostrados).
mostrados).
En cuanto a los pacientes inmunocompetentes, se
observó una variabilidad importante en la respuesta de cada
paciente a los diferentes antígenos. La Fig. 9 muestra ejemplos de
la evolución de la respuesta de anticuerpos y antígenos en 6
pacientes diferentes. En el paciente PIE, BAR y RUD del grupo como
se define anteriormente, los antígenos que inducen la reactividad
más elevada fueron GM, CAT y DPPV respectivamente. El paciente GOR
tuvo niveles elevados de anticuerpo contra RNU y GM, y niveles bajos
contra CAT y DPPV. En pacientes GOR o PIE mostrados en la Fig. 9,
aunque niveles bajos de galactomanano antigénico en el fluido
circulante parecen asociados con títulos elevados de anticuerpos
anti-GM, el coeficiente de correlación obtenido
entre anticuerpos anti-GM y el índice de Platelia
en pacientes con AI probada fue -0,04, con un valor de p no
significativo de 0,22 para un df de 172. En el presente estudio,
resultados negativos en el índice de Platelia de AI no se asociaron
directamente con la presencia de anticuerpos
anti-GM.
\newpage
Estos datos mostraron que una medida sensible
del nivel de anticuerpo en los sueros de pacientes antes de la
inmunosupresión tuvo un buen valor predictivo positivo para AI (Fig.
10). Esta conclusión se observa cuando se analizaron los pacientes
probados y del control. También hay una tendencia hacia la
separación de las poblaciones probables y del control basada en los
niveles de anticuerpos, sugiriendo que algunos de los pacientes
probables son AI verdadera.
\vskip1.000000\baselineskip
Este estudio de la respuesta de anticuerpos de
diferentes clases de pacientes con aspergilosis con un formato de
ELISA ha demostrado el importante potencial de diagnóstico de 3
antígenos recombinantes que son la ribonucleasa, la
dipeptidilpeptidasa V y la catalasa 1 micelial previamente
caracterizados en el laboratorio de los inventores (Beauvais et
al., 1997, Infect. Imm. 65: 3042-3047; Calera
et al., 1997, Infect. Immun. 65: 4718-4724;
Latgé, J., 1999, Clin. Microbiol. Rev. 12: 310-350;
Paris, S. et al., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 111:
31-36).
Si los 3 antígenos se pueden usar en el
diagnóstico de aspergiloma, ABPA y AI, el potencial respectivo de
cada uno de estos 3 antígenos depende de la población analizada. La
catalasa fue el antígeno más útil tanto en poblaciones
inmunocompetentes como inmunodeprimidas. En pacientes con
aspergiloma, los antígenos de RNU y DPPV fueron tan discriminantes
o más que la CAT. En pacientes con ABPA, los antígenos más
discriminantes fueron RNU y DPPV. En pacientes con AI, RNU no fue
un antígeno apropiado, mientras que DPPV y, por encima de todos,
CAT fueron los antígenos reconocidos en la mayoría de los casos.
Además, el seguimiento de pacientes con aspergilosis mostró que el
nivel de anticuerpos dirigidos contra cada antígeno varió con el
paciente, y que el principal antígeno de diagnóstico a menudo fue
diferente en diferentes pacientes. Se desconoce hasta la fecha si
este resultado fue debido a una variación genética en la población
de células B de los diferentes pacientes, o si está asociado con
las cepas fúngicas infecciosas que producirían diferentes cantidades
de los antígenos respectivos in vivo. Se obtuvieron valores
más bajos de sensibilidad y predictivos positivos con pacientes con
ABPA que en pacientes con aspergiloma. Este resultado estaba de
acuerdo con la dificultad para diagnosticar esta patología. La
asociación de por lo menos dos y mejor tres de los antígenos de
ribonucleasa, catalasa y dipeptidilpeptidasa será óptima para el
diagnóstico de las aspergilosis más importantes y potencialmente
mortales, es decir, aspergiloma, ABPA, y aspergilosis pulmonar
invasiva.
En la población del control con fibrosis
quística, se encontraron títulos elevados de anticuerpos
anti-Aspergillus. Este resultado estaba de acuerdo con la
colonización continua habitual de estos pacientes con A.
fumigatus. De forma interesante, el nivel de anticuerpo contra
la proteína DPPIV fue mayor en la población del control con
fibrosis quística que en los pacientes con ABPA en la población sin
fibrosis quística, sugiriendo que este antígeno, que es homólogo
del CD26, puede desempeñar un papel en la patología de la fibrosis
quística. El estudio de los inventores mostró que la ABPA se puede
diagnosticar en una población atópica o en una población con
fibrosis quística sólo mediante la cuantificación de anticuerpos
específicos anti-Aspergillus. Las publicaciones del grupo de
Crameri no identificaron los mismos antígenos para el diagnóstico de
ABPA (Hemmann et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104:
601-607). La selección de los antígenos por el
laboratorio de Crameri se basó en un sistema de presentación de
fagos, y los antígenos de CAT y DPPV son antígenos proteínicos de
elevado Mr que pueden haber estado infrarrepresentados en la
librería de Crameri. Este parece ser el caso, puesto que un estudio
de colaboración con R. Crameri ha mostrado que los pacientes con
ABPA de Davos reaccionan significativamente con RNU, CAT y DPPV
(Crameri, comunicación personal). Además, en los estudios de
Crameri, la selección principal se basó en la unión de IgE,
mientras que nuestro análisis consideró niveles de IgG, y se sabe
para ABPA que IgE e IgG específicas anti-Aspergillus pueden
reconocer diferentes epítopos en estos pacientes.
El descubrimiento más importante del estudio de
los inventores fue la presencia de títulos elevados de anticuerpos
anti-Aspergillus en alrededor de la mitad de los pacientes
que se iban a someter a trasplante. Unas pocas publicaciones
previas han dado a conocer también la presencia de anticuerpos de
anti-Aspergillus en pacientes inmunodeprimidos con AI (Hearn
et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:
982-986; Herbrecht et al., 2002, J. Clin.
Oncol. 20: 1898-906). La falta de incremento de los
niveles de anticuerpos durante el curso de la enfermedad en los
pacientes examinados en este estudio sugiere que la aparición de
anticuerpos no es una respuesta del paciente a la infección
fúngica. Por el contrario, sugirió que una porción significativa de
los pacientes que se iban a someter a una terapia de
inmunosupresión de hecho tenían una infección por Aspergillus
en el momento del ingreso en el hospital. De forma interesante,
estudios epidemiológicos anteriores por el grupo de los inventores
(Chan et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40:
2041-2045; Debeaupuis et al., 1995, Can. J.
Bot. 73: 1087-1091) han mostrado que el origen de AI
fue hospitalario en alrededor de 50% de los casos. Este estudio de
detección de anticuerpos sugirió que alrededor de 50% (10/23
pacientes) de los pacientes con AI se infectaron al ingresar en el
hospital. Estos resultados son del máximo interés para pacientes con
riesgo de AI, debido a que sugieren la posibilidad de colonización
antes de la inmunosupresión, y que esta infección oculta por
Aspergillus ahora se puede sospechar como un origen de AI
para un número significativo de pacientes. La búsqueda de
anticuerpos será entonces una detección sistemática esencial a
realizar antes de comenzar una inmunoterapia intensiva y el
subsiguiente injerto. Todos estos hallazgos influirán enormemente el
tratamiento de los pacientes antes de la inmunosupresión, puesto
que se pueden hacer intentos para eliminar el hongo de los
pulmones. La importancia de una prueba de anticuerpos
anti-Aspergillus en el grupo inmunodeprimido también está
reforzada por el desplazamiento del pico de AI hacia el sexto mes
después del injerto (Morgan et al., 2004, Med. Mycol. 00:
1-10), y por los casos de pacientes
inmunocompetentes de unidades de cuidados intensivos (Meersseman
et al., 2004, Crit. Care Med. 170:
621-625).
Estudios previos han dado a conocer que la
presencia de cantidades elevadas de anticuerpos podría estar
asociada con el aclaramiento de los agentes circulantes en
infecciones fúngicas del paciente inmunodeprimido. Tales hallazgos
se han observado repetidamente en infecciones por Candida, en
las que niveles bajos de antígenos podrían estar asociados con
concentraciones elevadas de anticuerpos
anti-manánicos (Sendid et al., 2003, J.
Clin. Microbiol. 41: 4551-4558; Sendid et
al., 1999, J. Clin. Microbiol. 37: 1510-1517).
En las infecciones por Aspergillus, varios estudios también
han sugerido que las pruebas falsas-negativas de
antigenemia podrían ser debidas a la presencia de un nivel elevado
de anticuerpos anti-galactomanano (Herbrecht et
al., 2002, J. Clin. Oncol. 20: 1898-906; Marr
et al., 2004, J. Infect. Dis. 190: 641-649;
Pinel et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41:
2184-2186). Aunque en el estudio de los inventores
la presencia de anticuerpos contra GM parece estar correlacionada
con un título bajo de antígenos en unos pocos sueros, no se pudo
demostrar ninguna correlación negativa estadísticamente
significativa entre el antígeno de GM y las concentraciones de
anticuerpos anti-GM. Para algunos pacientes falsos
negativos para AI, se encontró un nivel bajo tanto de GM como de
anticuerpos anti-GM. Estos datos de
falsos-negativos permanecen sin explicar, pero se
excluye o por lo menos se minimiza la responsabilidad de los
anticuerpos para crear falsos negativos en el kit de Platelia.
Todos estos hallazgos influirán enormemente el
tratamiento de los pacientes antes de la inmunosupresión, con
vistas a curar o eliminar el hongo. Ahora se puede sospechar para un
número significativo de pacientes una infección oculta por
Aspergillus como origen de la AI.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los niveles no conectados por la misma letra son
significativamente diferentes
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<110> INSTITUT PASTEUR
\hskip1cmINSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
\hskip1cmBEAUVAIS Anne
\hskip1cmDEBEAUPUIS Jean-Paul
\hskip1cmLATGE Jean-Paul
\hskip1cmPARIS Sophie
\hskip1cmSARFATI Jacqueline
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<120> Método y kits de diagnóstico in
vitro para infección por Aspergillus
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<130> D23109
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 05291428.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
07-01-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 1
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\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 3
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<210> 4
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<400> 4
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<210> 5
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 9
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 10
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\hskip1cm
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 11
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\hskip1cm
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 12
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\hskip1cm
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<210> 13
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 13
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\hskip1cm
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 14
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\hskip1cm
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 15
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\hskip1cm
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de la amplificación
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<400> 16
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\hskip1cm
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> producto de PCR
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<211> 8
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<212> PRT
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<223> producto de PCR
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<211> 13
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<212> PRT
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<223> producto de PCR
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<211> 8
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<212> PRT
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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<210> 23
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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\hskip1cm
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<210> 24
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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\hskip1cm
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<210> 25
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<400> 25
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\hskip1cm
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<210> 26
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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\hskip1cm
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<210> 27
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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<400> 27
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\hskip1cm
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<210> 28
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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<400> 28
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<210> 29
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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<400> 29
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<210> 30
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> producto de PCR
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<400> 30
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\hskip1cm
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<210> 31
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<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
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Claims (31)
1. Método para el diagnóstico in vitro de
una infección por Aspergillus determinando en la muestra de
suero o plasma de un sujeto la cantidad de anticuerpos dirigidos
contra antígenos de Aspergillus, que comprende:
- a)
- incubar dicha muestra de suero o plasma con los antígenos de Aspergillus en busca de la formación de inmunocomplejos que pueden ser obtenidos entre dichos anticuerpos y dichos antígenos, y
- b)
- determinar la cantidad de los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de Aspergillus,
en el que los antígenos de Aspergillus se
seleccionan de entre el grupo constituido por una combinación de
por lo menos dos de los siguientes antígenos:
- el antígeno de ribonucleasa (RNU),
- el antígeno de catalasa (CA), y
- el antígeno de dipeptidilpeptidasa V
(DPPV).
2. Método según la reivindicación 1, en el que,
en la etapa (b), la determinación de una cantidad significativamente
superior de anticuerpos dirigidos contra por lo menos uno de dichos
dos antígenos, comparada con la cantidad obtenida para una muestra
de suero o plasma de referencia negativo, es indicativa de una
infección por Aspergillus.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que los antígenos de Aspergillus se aplican como un
revestimiento sobre un soporte sólido.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
cada uno de dichos antígenos se aplica como revestimiento en una
localización diferente sobre el soporte sólido.
5. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el
que el soporte sólido es una placa de ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzima (ELISA), y el método comprende:
- a)
- incubar dicha muestra de suero o plasma con los antígenos de Aspergillus aplicados como revestimiento sobre la placa de ELISA,
- b)
- eliminar de la placa de ELISA los anticuerpos de dicha muestra de suero o plasma no unidos a los antígenos de Aspergillus,
- c)
- poner en contacto anticuerpos anti-inmunoglobulina (anti-Ig) conjugados con una enzima, siendo capaces dichos anticuerpos anti-Ig de unirse a los anticuerpos de dicha muestra de suero o plasma,
- d)
- eliminar de la placa de ELISA los anticuerpos anti-Ig no unidos a los anticuerpos de dicha muestra de suero o plasma,
- e)
- añadir el sustrato soluble correspondiente para la enzima y
- f)
- leer los valores de absorbancia de los pocillos de la placa de ELISA en un lector de ELISA a una longitud de onda apropiada,
en el que la cantidad de dichos anticuerpos se
determina por medio de los valores de absorbancia obtenidos.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de
RNU y CA.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de
RNU y DPPV.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de CA
y DPPV.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de
RNU, CA y DPPV.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que por lo menos uno de los antígenos
de Aspergillus de RNU, CA y DPPV es un antígeno
recombinante.
\newpage
11. Método según la reivindicación 10, en el que
por lo menos un antígeno recombinante de Aspergillus se
obtiene clonando el producto de amplificación del ADNc
correspondiente en un vector de expresión.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el producto de amplificación del ADNc correspondiente se obtiene de
una genoteca de ADNc de Aspergillus fumigatus, usando
una pareja de cebadores específicos para dicho por lo menos un
antígeno de Aspergillus.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
la pareja de cebadores específicos para el antígeno de RNU es SEC
ID nº 1 y SEC ID nº 2.
14. Método según la reivindicación 12 ó 13, en
el que la pareja de cebadores específicos para el antígeno de CA es
SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que la pareja de cebadores
específicos para el antígeno de DPPV es SEC ID nº 5 y SEC ID nº
6.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden además el antígeno de galactomanano
(GM).
17. Método según la reivindicación 16, en el que
el antígeno de GM se obtiene mediante purificación a partir de un
cultivo de Aspergillus.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que se determina un único perfil de
señales de detección para una cepa dada de Aspergillus.
19. Método según la reivindicación 18, que
comprende además comparar el perfil de señales de detección con un
perfil estándar para cada una de las cepas de Aspergillus,
permitiendo la identificación de la cepa que infecta al sujeto.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en el que la infección por
Aspergillus ha conducido a aspergiloma y/o aspergilosis
broncopulmonar alérgica (ABPA).
21. Método según la reivindicación 20, en el que
la infección por Aspergillus que conduce a ABPA se
diagnostica en un sujeto que sufre fibrosis quística, así como en
un sujeto que no sufre fibrosis quística.
22. Método según cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 19, en el que la infección por
Aspergillus es una aspergilosis invasiva que es posible
diagnosticar antes de la inmunosupresión en el sujeto que va a ser
sometido a injerto.
23. Método según cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 19, que permite el diagnóstico de la infección
por Aspergillus en un ser humano inmunodeprimido.
24. Kit de diagnóstico para determinar en una
muestra de suero o plasma la cantidad de anticuerpos dirigidos
contra antígenos de Aspergillus, que comprende:
(a) una combinación de por lo menos dos de los
antígenos de Aspergillus siguientes:
- el antígeno de RNU,
- el antígeno de CA, y
- el antígeno de DPPV.
25. Kit de diagnóstico según la reivindicación
24, que comprende además un soporte sólido en el que se aplican
como revestimiento dichos antígenos de Aspergillus.
26. Kit de diagnóstico según la reivindicación
24 ó 25, que comprende además:
(b) una disolución que contiene anticuerpos
anti-Ig conjugados con un marcador.
27. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26, que comprende además:
(c) un tampón de lavado.
28. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden la combinación de los antígenos de
RNU, CA y DPPV.
29. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 28, en el que los antígenos de
Aspergillus comprenden además el antígeno de GM.
30. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 29, en el que el soporte sólido es una placa
de ELISA, y el marcador es una enzima.
31. Kit de diagnóstico según la reivindicación
30, que comprende además:
(d) una disolución que contiene el sustrato
soluble correspondiente para la enzima.
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