ES2319059B1 - Brushita como sistema de inmovilizacion de enzimas y su uso en biosensores amperometricos biocompatibles. - Google Patents
Brushita como sistema de inmovilizacion de enzimas y su uso en biosensores amperometricos biocompatibles. Download PDFInfo
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Abstract
Brushita como sistema de inmovilización de
enzimas y su uso en biosensores amperométricos biocompatibles.
La presente invención se refiere a un nuevo
sistema de inmovilización enzimático que utiliza un material
inorgánico biocompatible (Brushita, un cemento fraguado de fosfato
cálcico) como matriz para la adsorción de enzimas y a un biosensor
amperométrico preparado con dicho sistema de inmovilización.
Comprende el procedimiento de fabricación del biosensor y su
aplicación en medios acuosos y predominantemente orgánicos.
En el proceso de fabricación del biosensor,
primero se deposita una mezcla brushita-enzima
sobre la superficie electródica y se deja secar al aire, a
temperatura ambiente. Posteriormente se procede a la reticulación
intermolecular del enzima adsorbido a la matriz, manteniendo el
electrodo modificado en vapor de glutaraldehido. El biosensor
resultante se utiliza para la determinación de analitos en
disolventes acuosos y medios predominantemente orgánicos.
Description
Brushita como sistema de inmovilización de
enzimas y su uso en biosensores amperométricos biocompatibles.
La presente invención se refiere a un nuevo
sistema de inmovilización enzimático que utiliza un material
inorgánico biocompatible (Brushita, un cemento fraguado de fosfato
cálcico) como matriz para la adsorción de enzimas, y a un biosensor
para la determinación de analitos en medios acuosos y no acuosos
basado en un sistema de inmovilización de enzimas sobre
brushita.
Los biosensores constan de un transductor y un
material biológico y uno de los aspectos más relevantes en la
aplicabilidad de un biosensor es el tipo y calidad del material
biológico. En este sentido se han propuesto distintos sistemas de
inmovilización, entre ellos la adsorción de las biomoléculas sobre
distintos materiales. Se trata de un método sencillo que consiste
en poner en contacto las moléculas de enzima con el material
adsorbente durante el tiempo suficiente para que se produzcan las
interacciones entre la biomolécula y la matriz.
En la patente FR 2667077 se detalla el proceso
de inmovilización de una proteína, preferentemente una enzima, por
adsorción en un soporte sólido de un electrodo (vidrio, metal,
polímero, componente de tela, fibra óptica, etc.) y posterior
reticulación por vaporización de un agente reticulante
(glutaraldehído) por pulverización, para hacer más estable la
enzima. En esta patente se reivindica también un biosensor que
utiliza un electrodo enzimático obtenido a través de este proceso
de inmovilización para la determinación de analitos en disoluciones
acuosas que presenta tiempos de respuesta cortos (del orden de
5-10 segundos).
Se han descrito distintos biosensores
enzimáticos amperométricos que utilizan como soporte para la
adsorción de la enzima matrices inorgánicas como arcillas del tipo
laponita (Cosnier and col., Mater. Sci. Eng., C., 2006, 26,
442-447; Li and Hu., J. Electroanal. Chem., 2003,
558, 155-165) e hidróxidos de doble capa (Mousty
et al., Biosens. Bioelectron., 2007, 22,
1733-1738), nanopartículas de carbonato cálcico
(Shan et al., Biosens. Bioelectron., 2007., 22,
1612-1617), nanopartículas de oro (Zhang et
al., Biosens. Bioelectron., 2005, 21, 337- 345), nanotubos de
carbono (Zhao et al., Electrochem. Commun., 2003, 5,
825-829) e híbridos de nanopartículas de oro con
nanotubos de carbono (Chen et al., Biosens. Bioelectron.,
2007, 22, 1268-1274) utilizándose para la
determinación de analitos en medios acuosos. Entre las ventajas más
importantes de estos biosensores destacan, en algunos casos, la
biocompatibilidad de las matrices de inmovilización, en otros la
conductividad eléctrica de los materiales utilizados, en otros la
estabilidad de los biosensores y en otros su sencilla
fabricación.
En los últimos años se han desarrollado los
llamados biosensores de fase orgánica, que son dispositivos capaces
de trabajar en disolventes orgánicos, pudiéndose utilizar para la
determinación de analitos en muestras de muy distinta naturaleza y
ampliando así el campo de aplicación de los biosensores
(Sánchez-Paniagua et al., 2006., Biomol. Eng,
23, 135-147; Sánchez-Paniagua et
al., Biosens. Bioelectron., 2006, 21,
2320-2328).
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un nuevo
sistema de inmovilización enzimático que combina adsorción y
entrecruzamiento y utiliza como matriz para la adsorción de enzimas
un material inorgánico la brushita (cemento fraguado de fosfato
cálcico) que es biocompatible (Kumta et al., Acta Biomater.,
2005., 1, 65-83) y posee, además, características de
electrolito sólido (Tortet y col., J. Solid State Chem., 1997.,
132, 6-16). Así mismo se refiere a un biosensor
amperometrico cuyo componente biológico consiste en uno o más
enzimas inmovilizadas en dicha matriz, para la determinación de
analitos en medios acuosos y predominantemente orgánicos.
Las aportaciones más importantes de este nuevo
dispositivo combinan la sencilla y rápida fabricación del biosensor
como consecuencia de la inmovilización por adsorción, la ampliación
del campo de aplicación del biosensor a estudios "in
vivo", como consecuencia de utilizar una matriz
biocompatible, así como a muestras de naturaleza hidrofóbica, ya que
permite realizar medidas en medios no acuosos, y a la determinación
de analitos a niveles traza por la elevada sensibilidad de estos
dispositivos.
Brushita como sistema de inmovilización de
enzimas y su uso en biosensores amperométricos biocompatibles.
La presente invención se refiere a un nuevo
sistema de inmovilización enzimático que utiliza un material
inorgánico biocompatible (Brushita, un cemento fraguado de fosfato
cálcico) como matriz para la adsorción de enzimas, y a un biosensor
amperométrico basado en dicho sistema de inmovilización. Comprende
el procedimiento de fabricación del biosensor y su aplicación en
medios acuosos y predominantemente orgánicos.
La fabricación del biosensor es un proceso
sencillo que requiere los siguientes pasos: (1) adsorción de la
enzima en la brushita y (2) entrecruzamiento intermolecular
enzimático con un agente entrecruzante. En primer lugar, se
deposita una mezcla brushita-enzima sobre la
superficie de un electrodo y se deja secar al aire, a temperatura
ambiente. El electrodo modificado se mantiene en vapor de
glutaraldehido para llevar a cabo la reticulación enzimática, que
evita en gran medida la pérdida de enzima aumentando la estabilidad
del biosensor. En la Figura 1 se muestra una micrografía de la
superficie electródica después de producirse la adsorción y
reticulación enzimática, observándose pequeñas partículas en buen
contacto con la superficie del metal.
El material biológico que se encuentra
inmovilizado en brushita puede ser una o más enzimas
oxidorreductasas. Para el entrecruzamiento químico se puede utilizar
cualquier reactivo polifuncional que sirva como agente reticulante
enzimático. El tipo de electrodo (transductor) utilizado dependerá
del analito a determinar.
La proporción enzima-brushita en
la mezcla puede variar entre 0,25 y 1,5; la cantidad de mezcla
enzima-brushita depositada en la superficie
electródica de área 0,07 cm^{2}, puede variar entre 12,5
\mug-100 \mug y tiempo de entrecruzamiento
enzimático entre 5 y 25 minutos.
La determinación de los analitos con el
biosensor propuesto se lleva a cabo mediante amperometría, en
agitación constante, en una celda electroquímica termostatizada, que
contiene el biosensor, un electrodo auxiliar y un electrodo de
referencia, manteniendo el biosensor al potencial adecuado
constante. Como consecuencia de la reacción entre la enzima
inmovilizada y el analito, se produce la transformación química del
sustrato. En la superficie del electrodo de trabajo (biosensor)
tiene lugar la reacción redox de alguna de las especies que
participan en la reacción enzimática, generándose una intensidad de
corriente que estará relacionada con el analito presente en la
muestra. El biosensor resultante permite la determinación de
analitos en disolventes acuosos y medios predominantemente
orgánicos.
La Figura 1 muestra la micrografía de las
muestras tirosinasa/brushita con entrecruzamiento con
glutaraldehido sobre una superficie metálica.
La Figura 2 muestra la curva de calibrado de
catecol en medio acuoso obtenida con el biosensor de
tirosinasa/brushita en disoluciones tampón fosfato 0,1 M pH 6,0.
La Figura 3 muestra las curvas de calibrado de
catecol en medios predominantemente orgánicos obtenidas con el
biosensor de tirosinasa/brushita en mezclas de disolvente
orgánico:tampón (98,5:1,5): (a) etanol:tampón y (b)
acetonitrilo:tampón.
La Figura 4 muestra la estabilidad del biosensor
propuesto en (a) medio acuoso y (b) mezclas acetonitrilo:tampón
(98,5:1,5).
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su
alcance.
Ejemplo
1
Para la fabricación del biosensor se prepara una
suspensión de cemento de brushita (2 mg mL^{-1}) por dispersión en
agua desionizada mediante agitación durante, al menos, 12 horas y
una disolución de enzima (2 mg mL^{-1}) en agua desionizada. Una
cantidad de la mezcla acuosa de tirosinasa/brushita (25 \mug:25
\mug) se deposita sobre la superficie (0,07 cm^{2}) de un
electrodo de carbón vitrificado. Se mantiene el electrodo al aire
durante 2 horas para que se produzca el secado total de la
película. Posteriormente, se produce un entrecruzamiento químico de
las moléculas de enzima, manteniendo el electrodo durante 15
minutos en vapor de glutaraldehído.
Ejemplo
2
El biosensor preparado según se describe en el
ejemplo 1 se utiliza para la determinación de catecol disuelto en
disolución tampón fosfato (Figura 2) y en medios predominantemente
orgánicos, como son mezclas acetonitrilo-tampón
(98,5:1,5) y etanol-tampón (98,5:1,5) (Figura 3),
mediante medidas amperométricas con agitación constante, aplicando
al electrodo de trabajo un potencial de -0,1 V vs electrodo de
calomelanos saturado, potencial al cual se reduce la
o-quinona producida en la reacción enzimática.
Las características analíticas obtenidas en la
determinación de catecol en disolución tampón fosfato son
sensibilidad 46,57 A M^{-1} cm^{-2}, intervalo lineal 3
10^{-9}-3 10^{-6} M y límite de detección,
correspondiente a 3 veces la señal del ruido, 1 nM. La concentración
máxima admisible para el contenido total de fenoles en aguas de
bebida según la legislación de la Unión Europea (Directiva
80/778/EEC), es de 5 10^{-9} M. Teniendo en cuenta el límite de
detección obtenido con este biosensor (1nM), estos dispositivos
surgen como una interesante alternativa para este tipo de
análisis.
Cuando el catecol se encuentra disuelto en un
disolvente predominantemente orgánico, como es la mezcla
acetonitrilo:tampón fosfato (98,5-1,5), se obtiene
una sensibilidad de 3,3 A M^{-1} cm^{-2}, un intervalo lineal
de 4 10^{-8}-7 10^{-6} M
y un límite de detección de 40 nM. Estos resultados demuestran que el biosensor se puede utilizar en el análisis de muestras orgánicas.
y un límite de detección de 40 nM. Estos resultados demuestran que el biosensor se puede utilizar en el análisis de muestras orgánicas.
Los tiempos de respuesta obtenidos con estos
biosensores fueron siempre menores de 12 segundos, característica
que permite su uso como detectores en sistemas de flujo
continuo.
Ejemplo
3
El biosensor, en medio acuoso, es muy estable
durante los cinco primeros días (las señales obtenidas se mantienen
por encima del 95% de la señal inicial), descendiendo la señal un
20% el séptimo día y un 60% al transcurrir 9 días. En medio no
acuoso el biosensor es muy estable durante 3 días, comenzando el
descenso de la señal a partir del cuarto día, tal y como muestra la
Figura 4.
Ejemplo
4
Para evaluar la precisión del método analítico
se estudió la repetibilidad y precisión intermedia en medios acuoso
y predominantemente orgánicos, obteniéndose los siguientes
resultados. Se midió la corriente generada por una disolución de
catecol en tampón de 100 nM y una disolución de catecol 0,8 \muM
en acetonitrilo-tampón fosfato (98,5:1,5). En medio
acuoso se obtiene un coeficiente de variación (CV) en el estudio de
repetibilidad de 2,37% (n=10) y de 3,87% (n=20) para la precisión
intermedia. Los CV obtenidos en disoluciones no acuosas para
repetibilidad y precisión intermedia fueron 3,62% (n=10) y 5,55%
(n=20) respectivamente.
Claims (8)
1. Material biológico con enzima inmovilizada en
su interior caracterizado porque contiene una o varias
enzimas adsorbidas en brushita.
2. Material biológico con enzima inmovilizada,
según reivindicación 1, caracterizado porque las enzimas son
oxidorreductasas.
3. Método de obtención del material biológico
con enzima inmovilizada descrito en las reivindicaciones 1 y 2,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (a)
adsorción del enzima a brushita y (b) reticulación intermolecular
del enzima por vapor de glutaraldehído.
4. Uso del material biológico con enzima
inmovilizada, según reivindicación 1, como parte de un
biosensor.
5. Uso del material biológico con enzima
inmovilizada, según reivindicación 4, donde el biosensor realiza
medidas amperométricas en disoluciones por agitación constante.
6. Uso del material biológico con enzima
inmovilizada, según reivindicaciones 4 y 5, donde el biosensor
consta de un electrodo en cuya superficie se deposita una mezcla de
enzima-brushita.
7. Uso del material biológico con enzima
inmovilizada, según reivindicaciones 4, 5 y 6, donde el biosensor
determina analitos en medios acuosos.
8. Uso del material biológico con enzima
inmovilizada, según reivindicaciones 4, 5 y 6, donde el biosensor
determina analitos en medios predominantemente orgánicos.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702403A ES2319059B1 (es) | 2007-09-07 | 2007-09-07 | Brushita como sistema de inmovilizacion de enzimas y su uso en biosensores amperometricos biocompatibles. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702403A ES2319059B1 (es) | 2007-09-07 | 2007-09-07 | Brushita como sistema de inmovilizacion de enzimas y su uso en biosensores amperometricos biocompatibles. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2319059A1 ES2319059A1 (es) | 2009-05-01 |
| ES2319059B1 true ES2319059B1 (es) | 2010-02-12 |
Family
ID=40560397
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200702403A Active ES2319059B1 (es) | 2007-09-07 | 2007-09-07 | Brushita como sistema de inmovilizacion de enzimas y su uso en biosensores amperometricos biocompatibles. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2319059B1 (es) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4812404A (en) * | 1985-09-20 | 1989-03-14 | Dental Kagaku Kabushiki Kaisha | Apatite immobilized glucanase |
| US6004786A (en) * | 1996-05-28 | 1999-12-21 | Toyo Denka Kogyo Co., Ltd. | Inorganic carrier containing bound silane coupling agent having carboxylic-ester group for immobilizing lipase |
| US20060204580A1 (en) * | 2002-04-18 | 2006-09-14 | Gower Laurie B | Biomimetic organic/inorganic composites, processes for their production, and methods of use |
-
2007
- 2007-09-07 ES ES200702403A patent/ES2319059B1/es active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4812404A (en) * | 1985-09-20 | 1989-03-14 | Dental Kagaku Kabushiki Kaisha | Apatite immobilized glucanase |
| US6004786A (en) * | 1996-05-28 | 1999-12-21 | Toyo Denka Kogyo Co., Ltd. | Inorganic carrier containing bound silane coupling agent having carboxylic-ester group for immobilizing lipase |
| US20060204580A1 (en) * | 2002-04-18 | 2006-09-14 | Gower Laurie B | Biomimetic organic/inorganic composites, processes for their production, and methods of use |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HJERTÉN, S. et al. "{}Immobilization of Enzymes on Columns of Brushite"{}. Journal of Chromatography, 1981, Volumen 215, páginas 25-30. Ver página 25, resumen. * |
| MOUSTY, C. et al. "{}Rutin Determination at an Amperometric Biosensor"{}. Electroanalysis, Enero 2007, Volumen 19, Números 2-3, páginas 253-258. Ver página 253, resumen. * |
| SHAN, D. et al. "{}A New Polyphenol Oxidase Biosensor Mediated by Azure B in Laponite Clay Matrix"{}. Electroanalysis, 2003, Volumen 15, Número 19, páginas 1506-1512. Ver página 1506, resumen. * |
| SHAN, D. et al. "{}Layered Double Hydroxides: An Attractive Material for Electrochemical Biosensor Design"{}. Analytical Chemistry, 2003, Volumen 75, Número 15, páginas 3872-3879. Ver página 3872, resumen; página 3873, Sección Experimental. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2319059A1 (es) | 2009-05-01 |
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Legal Events
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| EC2A | Search report published |
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