ES2319286T3

ES2319286T3 - Epitopos inmunogenos de linfocitos t colaboradores de antigenos de tumor humanos y utilizacion de dichos epitopos en metodos inmunoterapeuticos.

Info

Publication number: ES2319286T3
Application number: ES04023546T
Authority: ES
Inventors: Hans-Georg Rammensee; Toni Weinschenk; Jorn Dengjel
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2004-10-02
Filing date: 2004-10-02
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2024-10-02
Also published as: WO2006037421A2; US8067529B2; EP1794190B1; SI1794190T1; ES2328945T3; DE602005015990D1; EP1794190B9; DE602004019215D1; JP2008514208A; JP2011200231A; US20090317428A1; AU2005291660A1; ATE439375T1; PL1642905T3; EP1642905A1; EP1642905B1; SI1642905T1; CA2583065A1; EP1794190A2; AU2005291660B2

Abstract

Un péptido asociado a tumor con una longitud de entre 15 y 30 aminoácidos, que comprende un aminoácido contiguo conforme a SEQ ID n.º 1.

Description

Epítopos inmunógenos de linfocitos T colaboradores de antígenos de tumor humanos y utilización de dichos epítopos en métodos inmunoterapéuticos.

La presente invención se refiere a métodos inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer y, en particular, al cáncer renal. La presente invención se refiere, además, a epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan como ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas inmunológicas contra los tumores. En particular, la presente invención se refiere a 338 novedosas secuencias peptídicas derivadas de moléculas HLA de clase II de líneas celulares tumorales humanas, que pueden ser usadas en la composición de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales.

Antecedentes de la invención

La estimulación de la respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmune.

Determinados elementos de la respuesta inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos de poblaciones de células destructoras de tumores o de sangre periférica sugiere que estos linfocitos tienen un papel importante en la defensa inmunológica natural contra el cáncer (Cheever y col, "Annals N.Y. Acad. Sci". 1993 690: 101-112). En particular, los linfocitos T CD8^{+} (TCD8^{+}), que reconocen péptidos que alojan moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de, normalmente, 8 a 10 residuos derivados de proteínas ubicadas en el citosol, tienen un papel importante en esta respuesta. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células con un núcleo con péptidos resultantes de la división proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos; las moléculas MHC de clase II, que sólo se encuentran en células profesionales presentadoras de antígenos (APC). Presentan péptidos de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el proceso de endocitosis y, posteriormente, son procesadas. Los complejos de péptido y MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD8^{+}. Los complejos de péptido y MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4^{+}.

Para que un péptido provoque una respuesta inmunológica celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los péptidos de unión a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos conservados en su secuencia que interaccionan con el surco de unión correspondiente de la molécula MHC.

Ahora existen numerosos ejemplos de TCD8^{+}, tanto humanos como de ratones, que reconocen específicamente células tumorales y desarrollan una actividad terapéutica tras el traslado adoptivo, induciendo, en algunos casos, la remisión completa. Sin embargo, a pesar del potencial de los linfocitos T para erradicar tumores, es obvio, teniendo en cuenta el crecimiento progresivo de la mayoría de los cánceres, que muchos tumores no son reconocidos por TCD8^{+} en vivo. A pesar de que se ha encontrado una variedad de tumores inmunógenos, ha sido difícil demostrar la estimulación de una respuesta inmune antitumoral efectiva:

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T específicos de tumores, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteínas, como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. Además, los antígenos asociados a tumores también pueden estar presentes sólo en células tumorales como, por ejemplo, como producto de genes mutados. Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son las estructuras específicas de tejidos, como los antígenos CT (testículo canceroso) que son expresados en distintos tipos de tumor y en tejido sano del testículo.

Se han identificado diversos antígenos asociados a tumores. Además, se están dedicando muchos esfuerzos a la identificación de antígenos adicionales asociados a tumores. Algunos grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los expertos "antígenos específicos de tumor", son específicos de tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de próstata y los cruzamientos cromosómicos, como el bcr/abl, en el linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores que se han identificado tienen lugar en muchos tipos de tumores y, algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores de tumores (los genes supresores de tumores para el cáncer renal, por ejemplo, son analizados en Linehan, W. M, M. M. Walther, B. Zbar; The genetic basis of cancer of the kidney; "J Urol"; dic. 2003;170 (6 Pt 1): 2163-72), que son los que realmente causan el evento de transformación, tienen lugar en casi todos los tipos de tumor. Por ejemplo, las proteínas celulares normales que controlan el crecimiento y la diferenciación celular, como las p53 (que es un ejemplo de gen supresor de tumor), ras, c-met, myc, pRB, VHL y HER-2/neu, pueden acumular mutaciones y resultar en una regulación ascendente de la expresión de estos productos genéticos, transformándolos así en oncógenos (McCartey y col; "Cancer Research"; 1998; 15: 58 2601-5. Disis y col; "Ciba Found. Symp"; 1994; 187: 198-211). Estas proteínas mutantes pueden ser el blanco de una respuesta inmune específica de tumor en muchos tipos de cáncer.

Un gen supresor de tumor es un gen que reduce la probabilidad de que una célula de un organismo multicelular se convierta en una célula tumoral. La mutación o eliminación de dicho gen aumenta la probabilidad de desarrollar un tumor. En ese sentido, un gen supresor de tumor es similar a un oncogén. Los genes supresores de tumor o, más exactamente, las proteínas que codifican, tienen un efecto amortiguador o represor en la regulación del ciclo celular. Los genes/proteínas supresores de tumor realizan esto básicamente de tres maneras: 1. Mediante la represión de los genes esenciales para que el ciclo celular continúe. Si éstos genes no son expresados, el ciclo celular no continuará y la división celular inhibirá de forma efectiva. 2. Asociando el ciclo celular a daños en el ADN. Mientras haya DNA dañado en la célula, ésta no se debe dividir. Si el daño se puede reparar, el ciclo celular continuará. 3. Si el daño no se puede reparar, la célula comenzará el proceso de apoptosis -la muerte celular programada- para anular la amenaza que supone para el bienestar del organismo. La primera proteína supresora de tumor que se descubrió fue la pRb del retinoblastoma humano. Un gen supresor de tumor importante es el p53 (véase más arriba).

La transformación de proteínas a partir de virus oncogénicos, como las E6 y E7 a partir del VPH o la EBNA1 a partir del virus de Epstein-Barr (VEB), también ocurre en muchos tipos de tumor y puede ser el blanco de una respuesta inmune específica de tumor en múltiples tipos de cáncer (McKaig y col. "Head Neck" 1998 20(3):250-65. Punwaney y col. "Head Neck" 1999 21(1):21-9. Serth y col. "Cancer Res". 1999 15:59(4):823-5. Pagano, J. S. "Proc. Assoc. Am. Physicians" 1999 111(6):573-80). La proteínas huésped que no son oncogénicas, como las familias MAGE y MUC, son también ubicuas. Específicamente, la familia MAGE de antígenos se ha encontrado en muchos tipos de cáncer, como el cáncer de mama, de pulmón, de esófago, hepático, tiroideo, el neuroblastoma, el cáncer gástrico, el melanoma y el mieloma múltiple (Gillespie, A. M. y Coleman, R. E. "Cancer Treat. Rev". 1999 25(4):219-27). La familia MUC de antígenos se ha asociado al cáncer de ovario y de endometrio, el cáncer de mama, el mieloma múltiple, el cáncer de páncreas y el cáncer rectal y de colon (Segal-Eiras, A. y Croce, M. V. "Allergol. Immunopathol". 1997 25(4):176-81).

Además, la mayoría de los cánceres están asociados a más de un antígeno. Algunos ejemplos de tumores que expresan más de un antígeno tumoral incluyen, sin limitarse a ellos, el cáncer de mama, asociado a MUC-1, HER-2/neu, MAGE, p53, T/Tn y CEA; el cáncer de colon, asociado a MUC-2 y MUC-4, CEA, p53 y la familia MAGE; el melanoma, asociado a miembros de la familia MAGE, a MART-1 y gp100; y el cáncer de próstata, asociado a GM2, Tn, sTn, al antígeno Thompson-Friedenreich (TF), MUC1, MUC2, la cadena beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG beta), HER2/neu, PSMA y PSA. De hecho, se han sugerido los paneles de antígenos para su uso en la inmunoterapia contra el cáncer con el fin de compensar el hecho de que puedan desarrollarse variantes de los tumores con pérdida de antígenos bajo la presión del sistema inmune (Zhang y col. "Clin. Cancer Res". 1998 4:2669. Kawashima y col. "Hum. Immunol". 1998 59:1).

Para que las proteínas puedan ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos de tumores específicos, y para que se puedan utilizar en terapia, deben cumplirse una serie de requisitos. El antígeno debe estar expresado principalmente por células tumorales, y no por tejidos sanos normales o en pequeñas cantidades. También es deseable, no sólo que el antígeno correspondiente esté presente en un tipo de tumor, sino que, además, aparezca en concentraciones altas (en número de copias por célula, por ejemplo). La presencia de epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno es esencial, ya que el péptido ("péptido inmunógeno") que deriva de un antígeno asociado a un tumor debe inducir una respuesta de los linfocitos T in vitro o in vivo.

Hasta ahora, se han descrito numerosas estrategias para encauzar antígenos hacia la vía de procesamiento de clase II. Es posible incubar células presentadoras de antígenos (APC) con el antígeno deseado para que sea absorbido y procesado (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Otras estrategias usan las proteínas de fusión, que contienen secuencias blanco lisosomales. Expresadas en APC, estas proteínas de fusión dirigen a los antígenos al compartimento de procesamiento de clase II (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).

En la inmunización contra los tumores, los linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la organización de la función efectora de los CTL. Los epítopos de los linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T colaboradores del tipo Th1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8^{+}, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra células tumorales que presentan MHC/péptidos asociados a tumores en sus superficies. De esta forma, los epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden actuar como ingredientes activos de vacunas que estimulen las respuestas inmunológicas contra los tumores.

La tarea principal en el desarrollo de una vacuna tumoral es, por tanto, la identificación y caracterización de novedosos antígenos asociados a tumores y epítopos inmunógenos de linfocitos T colaboradores derivados de ellos que puedan ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD4^{+}. Un objeto de la presente invención es, por tanto, proporcionar novedosas secuencias de aminoácidos para el péptido que tiene la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase II.

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Conforme a la presente invención, este objeto se consigue proporcionando un péptido asociado a tumor de una longitud de entre 15 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia contigua de aminoácidos conforme a la SEQ ID n.º 1 de la lista de secuencias adjunta, en la que el péptido tiene la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II.

La presente invención describe además 337 novedosas secuencias peptídicas derivadas de moléculas HLA de clase II de líneas celulares tumorales humanas, en particular líneas celulares de cáncer renal, que pueden ser usadas en la composición de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales. Las secuencias peptídicas han sido identificadas por medio de un enfoque combinado nuevo y de aplicación general para la identificación de ligandos desconocidos de clase II de HLA procesados de forma natural de antígenos definidos -asociados a tumores, por ejemplo. Así pues, se han identificado nuevos y prometedores candidatos para la inmunoterapia basada en péptidos de una forma que incluye la selección de antígenos tumorales de interés destacable y la cuidadosa determinación de las secuencias de péptidos derivadas de los mismos.

Un primer aspecto de la invención proporciona un péptido como el anterior, siempre que el péptido no sea el polipéptido humano intacto del que deriva la secuencia de aminoácidos (es decir, una de las secuencias completas incluidas en los ID de enlace del locus. Véase la tabla adjunta más abajo para los números de registro).

Tal y como se describe más abajo, el péptido que forman la base de la presente invención ha sido identificado como presentado por células portadoras de MHC de clase II (células Awells). Por tanto, este péptido en particular, así como todos los péptidos que contengan la secuencia (a saber, péptidos derivados), provocarán muy probablemente una respuesta específica de los linfocitos T, si bien el alcance de dicha respuesta podría variar de un péptido a otro. Podrían producirse diferencias debido a mutaciones en los mencionados péptidos, por ejemplo (véase más abajo). El experto en la materia conoce bien los métodos que se pueden aplicar para determinar el alcance de una respuesta inducida por un péptido individual, en particular con respecto a los ejemplos contenidos aquí y en la literatura sobre la materia.

Preferentemente, un péptido conforme a la presente invención consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID n.º 1.

Un péptido conforme a la presente invención puede contener, además de la secuencia según la SEQ ID n.º 1, cadenas de aminoácidos adicionales localizadas en el N-terminal y/o el C-terminal que no necesariamente forman parte del péptido que actúa como secuencia central del péptido que comprende el motivo de unión y como epítopo inmunógeno de linfocito T colaborador.

Sin embargo, estas cadenas pueden ser importantes para proporcionar una introducción eficiente en las células del péptido de la presente invención. En una de las modalidades de la invención, el péptido comprende los 80 aminoácidos N-terminal de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente Ii), como se deriva del NCBI (National Center for Biotechnology Information), número de registro del GenBank X00497 (Strubin, M, B. Mach y E. O. Long; The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity; "EMBO J"; 1984; 3 [4], 869-872).

Como puede derivarse de la base de datos aquí descrita, determinadas posiciones de péptidos de unión de HLA-DR son residuos conservados que forman una secuencia central que se ajusta al motivo de unión del surco de unión del HLA. Las modificaciones de éstos y otros residuos que participan en la unión de HLA-DR pueden mejorar la unión sin alterar el reconocimiento de los CTL.

Los residuos de aminoácidos que no son esenciales para interactuar con el receptor del linfocito T pueden ser modificados mediante el reemplazo con otro aminoácido cuya incorporación no afecte de forma sustancial a la reactividad del linfocito T ni elimine la unión con el MHC relevante.

Se sabe, además, que los péptidos presentados por MHC de clase II están compuestos de una "secuencia central" con un determinado motivo de aminoácidos específico de HLA y, opcionalmente, extensiones N- y/o C-terminal que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, son considerados irrelevantes en la interacción del péptido y el linfocito T). Las extensiones N- y/o C-terminal pueden tener una longitud de entre 1 y 10 aminoácidos, respectivamente. Por lo tanto, un péptido preferido en la presente invención exhibe una longitud de entre 9 y 30 aminoácidos. Este péptido puede ser usado o bien directamente, para cargar moléculas MHC de clase II, o bien la secuencia puede ser clonada en los vectores según la descripción que se detalla más abajo.

Si un péptido que es mayor de unos 12 residuos de aminoácidos es usado directamente para unirse a una molécula MHC, se prefiere que los residuos que flanquean la región central de unión de HLA sean los que no afecten de forma sustancial a la habilidad del péptido de unirse específicamente al surco de unión de la molécula MHC o de presentar al péptido al CTL.

Se pueden derivar ejemplos de péptidos de variantes, motivos y ligandos de MHC, así como determinados ejemplos de extensiones N- y/o C-terminal en la base de datos SYFPEITHI (Rammensee H, J. Bachmann, N. P. Emmerich, O. A. Bachor y S. Stevanovic; SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs; "Immunogenetics"; noviembre de 1999; 50 [3-4]: 213-9. Review) en http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com y en las referencias allí citadas.

Algunos ejemplos de péptidos para el HLA-DR en la base de datos son: K H K V \underbar{Y A C E V T H Q G} L S S derivado de la cadena Ig kappa 188-203 (Kovats y col; "Eur J Immunol".; abril de 1997; 27 [4]: 1014-21); K V Q \underbar{W K V D N A L Q S} G N S derivado de la cadena Ig kappa 145-159 (Kovats y col; "Eur J Immunol".; abril de 1997; 27 [4]: 1014-21); L P R L I \underbar{A F T S E H S H F} derivado de GAD65 270-283 (Endl y col; "J Clin Invest"; mayo de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15) o F \underbar{F R M V I S N P A} A T H Q D I D F L I derivado de GAD65 556-575 (Endl y col; "J Clin Invest"; mayo de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15). Además, los péptidos también pueden derivarse de secuencias mutadas de antígenos, como en el caso del \underbar{A T G F K Q S S K} A L Q R P V A S, derivado de la proteína de fusión bcr-abl de 210 kD (Bosch y col; "Blood"; noviembre de 1996; 1, 88 [9]: 3522-7), G \underbar{Y K V L V L N P S} V A A T, derivado de HCV-1 NS3 28-41 (Diepolder y col; "J Virol"; agosto de 1997; 71 [8]: 6011-9), o \underbar{F R K Q N P D I V} I Q Y M D D L Y V G, derivado de HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg y col; "J Immunol". enero de 1999; 1, 162 [1]: 152-60). Todos los aminoácidos de "anclaje" (como ejemplos de HLA-DR4, véase Friede y col; "Biochim Biophys Acta"; Junio de 1996; 7, 1316 [2]: 85-101. Sette y col; "J Immunol". septiembre de 1993 15,151[6]:3163-70. Hammer y col; "Cell"; julio de 1993 16,74[1]:197-203. Hammer y col; "J. Exp. Med"; mayo de 1995; 1, 181 [5]: 1847-55) se han indicado en negrita y las supuestas secuencias centrales se han subrayado.

En el concepto "péptido" no sólo incluimos moléculas en las que los residuos de aminoácidos están unidas por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas en las que el enlace peptídico está invertido. Estas formas retro-inverso pueden hacerse usando métodos conocidos por los especialistas en la materia, como los descritos por Meziere y col. (1997); "J. Immunol"; 159, 3230-3237. Este enfoque implica la creación de pseudopéptidos que contengan modificaciones en el esqueleto, y no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y col. (1997) muestran que, al menos para respuestas de linfocitos T colaboradores y MHC de clase II, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos de tipo retro-inverso, que contienen uniones NH-CO en lugar de uniones peptídicas CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Normalmente, el péptido de la invención se caracteriza porque, si aparece expresado en una célula presentadora de antígenos, puede ser procesada de forma que se produzca un fragmento capaz de unirse a una molécula MHC adecuada y pueda ser presentada por la célula apropiada y provocar una respuesta adecuada. Se apreciará que un fragmento producido a partir del péptido puede ser también un péptido de la invención. Convenientemente, el péptido de la invención contiene una porción que incluye la secuencia de aminoácidos dada o una porción o variante de la misma y otra porción más que le confiere alguna propiedad deseable. Por ejemplo, la porción añadida puede incluir otro epítopo de linfocito T (independientemente de que derive o no del mismo polipéptido que la primera porción que contiene el epítopo de linfocito T) o una proteína o un péptido portadores. Por lo tanto, en una modalidad, el péptido de la invención es una proteína humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento proteico y otra porción de polipéptido, siempre que la porción humana incluya una o más secuencias de aminoácidos de invención.

En una modalidad especialmente preferida, el péptido de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de la invención y, al menos, un epítopo de linfocito T más, que es capaz de facilitar la producción de una respuesta del linfocito T dirigida al tipo de tumor expresado de forma aberrante por un antígeno asociado a un tumor. Por lo tanto, los péptidos de la invención incluyen cadenas perladas de polipéptidos que también pueden ser usadas como vacunas.

Se entenderá de lo que sigue que, en algunas aplicaciones, se usan directamente los péptidos de la invención (es decir, no son producidos por expresión de un polinucleótido en una célula del paciente o en una célula suministrada al paciente).

Se prefiere que los péptidos de la invención puedan unirse al HLA-DR. En particular, se prefiere que los péptidos se unan de forma selectiva al HLA-DR4.

Los péptidos de la invención son particularmente útiles en métodos inmunoterapéuticos para detectar y destruir células que expresan de forma aberrante polipéptidos que forman la base de los péptidos de la presente invención. Debido a que estos péptidos específicos consistentes en las secuencias de aminoácidos dadas se unen al HLA-DR, se prefiere que los péptidos de la invención sean aquellos que unan HLA-DR y que, una vez formado, el complejo HLA-DR-péptido, cuando esté presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada, sea capaz de provocar la producción de un CTL que reconozca una célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos dada.

En una modalidad de la presente invención, el péptido de la presente invención comprende los 80 aminoácidos N-terminal de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente Ii), como se deriva del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (véase también más adelante).

En el término "expresado de forma aberrante" incluimos el significado de que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen es silencioso en el tejido del que deriva el tumor pero sí se expresa en el tumor. Con el término "sobreexpresado" queremos decir que el polipéptido está presente a un nivel al menos 1,2 veces mayor que en tejido normal. Preferentemente a un nivel 2 veces mayor y, más preferentemente, a un nivel 5 ó 10 veces mayor que en el tejido normal.

Los péptidos (al menos los que contienen enlaces peptídicos entre residuos de amino ácidos) pueden ser sintetizados por el modo de poliamida Fmoc de síntesis de péptidos de fase sólida, tal y como describen Lu y col. (1981) "J. Org. Chem" 46, 3433 y las referencias ahí contenidas. La protección temporal del grupo N-amino se debe al grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La división repetitiva de este grupo de protección de alta base lábil se lleva a cabo utilizando piperidina al 20% en N, N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la cadena lateral pueden estar protegidas como sus butil éteres (en el caso de la serina treonina y de la tirosina), butil ésteres (en el caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado del butiloxicarbonilo (en el caso de la lisina y la histidina), derivado del tritilo (en el caso de la cisteína) y de 4-methoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (en el caso de la arginina). En donde la glutamina o la asparagina son residuos C-terminales, se hace uso del grupo 4,4'-dimetoxibencihidrilo para la protección de las funcionalidades amido de la cadena lateral. El apoyo de la fase sólida se basa en un polímero polidimetil-acrilamido constituido a partir de los tres monómeros dimetilacrilamido (monómero esqueleto), bisacriloiletileno diamino (interconector) y acriloilsarcosino metil éster (agente funcionalizador). El agente ligado divisible péptido-resina usado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético ácido lábil. Todos los derivados de aminoácidos se añaden como sus derivados anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la asparagina y la glutamina, que se añaden usando un procedimiento inverso de acoplamiento mediado por N, N-diciclohexil-carbodiimida/1hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección son controladas usando procedimientos analíticos de isotina, ácido trinitrobencenosulfónico o ninhidrina. Al completarse la síntesis, los péptidos se separan de la resina con eliminación concomitante de los grupos de protección de la cadena lateral por medio del tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contenga una mezcla depuradora al 50%. Los depuradores utilizados normalmente son etanoditiol, fenol, anisol y agua. La elección exacta depende de los aminoácidos constituyentes del péptido que se esté sintetizando.

El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío, con la posterior trituración con éter dietílico, proporcionando el péptido crudo. Los depuradores se eliminan por un procedimiento de extracción simple que, en la liofilización de la fase acuosa, proporciona un péptido crudo libre de depuradores. Los reactivos para la síntesis de péptidos se pueden adquirir en Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

La purificación se puede realizar mediante técnicas, o combinación de técnicas, como la cromatografía de exclusión, la cromatografía de intercambio de iones y, normalmente, la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida.

El análisis de los péptidos puede llevarse a cabo por medio de la cromatografía en capa delgada, la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, el análisis de los aminoácidos después de la hidrólisis ácida, el análisis de espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos y el análisis de espectrometría de masa MALDI y ESI-Q-TOF.

Un aspecto más de la invención proporciona un ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser ADN, ADNc, PNA, CNA, ARN o combinaciones de los mismos y puede contener o no contener intrones. Naturalmente, sólo son codificables por el polinucleótido los péptidos que contienen residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídico naturales. Un aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido según la invención.

Se han desarrollado una variedad de métodos para ligar polinucleótidos, especialmente ADN, con vectores; por ejemplo, mediante extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se pueden añadir extensiones complementarias del homopolímero al segmento de ADN que se vaya a insertar en el ADN vector. El vector y el segmento de ADN se unen entonces, mediante un enlace de hidrógeno, entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

Los conectores sintéticos que contengan uno o más sitios de restricción proporcionan un método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por digestión de restricción de endonucleasa como se describió anteriormente, es tratado con la ADN polimerasa T4 bacteriófaga o la ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los extremos 3' monocatenarios con sus actividades exonucleolíticas 3'-5' y rellenan los extremos 3' con sus actividades de polimerización.

La combinación de estas actividades genera, por tanto, segmentos de ADN de extremo romo. Los segmentos de extremo romo se incuban entonces con exceso molar de moléculas de conexión, en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de moléculas de ADN de extremo romo, como la ADN ligasa T4 bacteriófaga. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN que portan secuencias de ligador polimérico en sus extremos. Estos segmentos de ADN son divididos entonces con la enzima de restricción apropiada y ligados a un vector de expresión que ha sido dividido con una enzima que produce extremos compatibles con los del segmento de ADN.

Los ligadores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción se pueden adquirir de diversas fuentes, incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA.

Una forma deseable de modificar el ADN codificante del polipéptido de la invención es usar la reacción en cadena de la polimerasa descrita por Saiki y col. (1988) "Science" 239, 487-491. Este método puede usarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo manipulando los sitios de restricción apropiados, o puede usarse para modificar en ADN de otras formas útiles conocidas por los expertos en la materia. En este método, para que el ADN sea amplificado enzimáticamente es flanqueado por dos cebadores específicos que se incorporan al ADN amplificado. Estos cebadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que pueden ser usados para la clonación en vectores de expresión mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

El ADN (o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) se expresa entonces en un huésped apropiado para producir un polipéptido que comprende el compuesto de la invención. Así, el ADN que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede ser usado de acuerdo con técnicas conocidas, modificadas convenientemente en vista de las enseñanzas contenidas en la presente invención, para construir un vector de expresión que entonces es usado para transformar una célula huésped apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Dichas técnicas incluyen las descritas en las patentes de EUA n.º 4.440.859, concedida el 3 de abril de 1984 a Rutter y col; 4.530.901, concedida el 23 de julio de 1985 a Weissman; 4.582.800, concedida el 15 de abril de 1986 a Crowl; 4.677.063, concedida del 30 de junio de 1987 a Mark y col; 4.678.751, concedida el 7 de julio de 1987 a Goeddel; 4.704.362, concedida el 3 de noviembre de 1987 a Itakura y col; 4.710.463, concedida el 1 de diciembre de 1987 a Murray; 4.757.006, concedida el 12 de julio de 1988 a Toole Jr. y col; 4.766.075, concedida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel y col. y 4.810.648, concedida el 7 de marzo de 1989 a Stalker.

El ADN (o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede unirse a una amplia variedad de secuencias de ADN para su introducción en el huésped adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma de introducción del ADN en el huésped y de si se desea la integración o el mantenimiento episomal.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión como, por ejemplo, un vector plasmídico, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias adecuadas de nucleótidos de control regulador de traducción y transcripción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas habituales. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar las células huésped transformadas. Una de las técnicas de selección implica la incorporación en el vector de expresión de una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios, que codifique un carácter seleccionable en la célula transformada como, por ejemplo, la resistencia a antibióticos.

De forma alternativa, el gen para dicho carácter seleccionable puede estar en otro vector, que es usado para cotransformar la célula huésped deseada.

Las células huésped que han sido transformadas por el ADN recombinante de la invención son cultivadas entonces durante el tiempo necesario y en las condiciones apropiadas, conocidas por los expertos en la materia en vista de las enseñanzas descritas en la presente invención, para permitir la expresión del polipéptido, que entonces puede ser recuperado.

Se conocen muchos sistemas de expresión, entre los que se encuentran bacterias (E. coli y Bacillus subtilis, por ejemplo), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo), hongos filamentosos (Aspergillus, por ejemplo) y células de plantas, animales e insectos. Con preferencia, el sistema podrá ser de células Awells.

Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite que tengan lugar la unión de la ARN polimerasa y la trascripción. Las secuencias de promotores compatibles con huéspedes bacterianos se encuentran normalmente en los vectores plasmídicos que contienen sitios de restricción adecuados para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Algunos vectores plasmídicos procarióticos típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329, que se pueden adquirir en Biorad Laboratories, (Richmond, CA, EUA); y pTrc99A y pKK223-3, que se pueden adquirir en Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA.

Un vector plasmídico típico de células de mamíferos es el pSVL, que se puede adquirir en Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA Este vector usa el promotor tardío SV40 para llevar a cabo la expresión de los genes clonados, habiéndose encontrado el mayor nivel de expresión en las células productoras de antígenos T, como las células COS-1. Un ejemplo de vector de expresión inducible de mamífero es el pMSG, que también puede adquirirse en Pharmacia. Este vector usa el promotor inducido por glucocorticoide del duplicado del terminal largo del virus del tumor mamario del ratón para llevar a cabo la expresión del gen clonado. Los vectores plasmídicos de levadura pRS403-406 y pRS413-416 son útiles y, normalmente, pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos de integración de levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycps). Se conocen otros vectores y sistemas de expresión para ser usados con una variedad de células huésped.

La presente invención también hace referencia a una célula huésped transformada con un constructo vector polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. En algunas circunstancias, las células bacterianas pueden ser preferentemente células huésped procarióticas y, normalmente, son una cepa de E. coli como, por ejemplo, las cepas E. coli DH5, que pueden adquirirse en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, y RR1, que se puede adquirir en la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (No ATCC 31343). Las células huésped eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, insectos y mamíferos y, con preferencia, células de vertebrados como, por ejemplo, de ratón, rata, mono o líneas celulares humanas de riñón o fibroblásticas. Las células huésped de levadura incluyen las YPH499, YPH500 y YPH501, que normalmente pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Las células huésped de mamíferos preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), disponibles en la ATCC, como CCL61; células embrionarias de ratón suizo NIH NIH/3T3, disponibles en la ATCC, como CRL 1658; células COS-1 derivadas de riñón de mono, disponibles en la ATCC, como CRL 1650 y 293 células de riñón embrionario humano. Las células de insecto preferida son las células Sf9 que pueden sufrir transfección con vectores de expresión de baculovirus.

La transformación de los huéspedes celulares apropiados con un constructo de ADN de la presente invención se lleva a cabo con métodos bien conocidos que suelen depender del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de las células huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohen y col. (1972) "Proc. Natl. Acad. Sci". EE. UU, 69, 2110 y Molecular Cloning, A Laboratory Manual de Sambrook y col. (1989) "Cold Spring Harbor Laboratory", Cold Spring Harbor, NY. La transformación de las células de levadura se describe en Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual de Sherman y col. (1986) "Cold Spring Harbor" NY. También es útil The method of Beggs (1978) "Nature" 275, 104-109. Con respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles para la transfección de dichas células como, por ejemplo, el fosfato cálcico y el dextran DEAE o las formulaciones de liposomas, se pueden adquirir en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células, y se conoce bien su uso para la transformación de células de levadura, bacterias, insectos y vertebrados.

Las células transformadas con éxito, es decir, las que contienen un constructo de ADN de la presente invención, pueden ser identificadas por medio de técnicas conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un constructo de expresión de la presente invención pueden cultivarse para producir un polipéptido de la invención. Las células pueden ser cultivadas y lisadas, y el contenido de su ADN puede ser examinado en busca de la presencia de ADN usando un método como el descrito por Southern (1975), "J. Mol. Biol". 98,503 o por Berent y col. (1985), "Biotech". 3,208. De forma alternativa, la presencia la proteína en el sobrenadante puede ser detectada usando anticuerpos, como se describe más abajo.

Además del análisis directo de la presencia de ADN recombinante, la transformación puede confirmase por medio de métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas con un vector de expresión producen proteínas que presentan la antigenicidad apropiada. Las muestras de células que puedan haber sufrido transformación se cultivan y analizan en busca de la proteína utilizando los anticuerpos adecuados. Así, además de las propias células huésped transformadas, la presente invención también considera el cultivo de dichas células, preferentemente monoclonal (clonalmente homogéneo) o derivado de un cultivo monoclonal, en un medio de nutrientes.

Se apreciará que algunas células huésped de la invención son útiles en la preparación de péptidos de la invención como, por ejemplo, células de bacterias, levadura e insectos. Sin embargo, también podrán ser útiles para ciertos métodos terapéuticos otras células huésped. Por ejemplo, las células presentadora de antígenos, como las células dendríticas, pueden ser usadas para expresar los péptidos de la invención de forma que sean cargadas en las moléculas MHC adecuadas.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un péptido para su inyección intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) e intramuscular (i.m.). Las formas preferidas de inyección de péptidos son s.c, i.d, i.p, i.m. e i.v. Las formas preferidas de inyección de ADN son i.d, i.m, s.c, i.p. e i.v. Podrán darse dosis de entre 1 y 500 mg de péptido a ADN.

En otro aspecto de la invención, se describe un método para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de un péptido según la invención, o una cantidad efectiva de un polinucleótido o un vector de expresión que codifique dicho péptido, en la que la cantidad de dicho péptido o la cantidad de dicho polinucleótido o vector de expresión es efectiva para provocar una respuesta inmune contra la célula diana en el paciente. La célula diana es una célula de cáncer o de tumor.

El péptido o el ácido nucleico codificador del péptido constituye una vacuna contra el tumor o el cáncer. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente o de una línea celular humana que después se administra al paciente; o usada in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunes del paciente, al que luego se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra in vitro en las células, puede ser útil para las células su transfección para coexpresar citocinas como la interleucina-2. El péptido podrá ser sustancialmente puro; o estar combinado con un adyuvante que estimule la respuesta inmune como Detox; o usado en combinación con citocinas estimuladoras de la respuesta inmune; o ser administrado con un sistema de liberación apropiado como, por ejemplo, liposomas. El péptido también podrá conjugarse con un vehículo apropiado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker y col. (1993) "Ann. NY Acad. Sci". 690,276-291). El péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión o ser una molécula híbrida. Los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención han de estimular el linfocito T citotóxico CD4. Sin embargo, la estimulación es más eficiente con la ayuda de linfocitos T CD4^{+}. Así, las secciones de fusión de una molécula híbrida proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4^{+}. Estos epítopos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen a los identificados en el toxoide tetánico. El polinucleótido puede ser substancialmente puro o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuados.

Entre los vectores y los sistemas de liberación adecuados se encuentran los virales, como los sistemas basados en adenovirus, virus de la vaccinia, retrovirus, virus del herpes, virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos, conocidos por los expertos en la liberación de ADN. La liberación física por medio de una "pistola genética", por ejemplo, también puede usarse. El péptido o el péptido codificado por el ácido nucleico puede ser una proteína de fusión, con un epítopo del toxoide tetánico que estimule los linfocitos T CD4^{+}, por ejemplo.

El péptido para una vacuna contra el cáncer puede ser cualquier péptido apropiado conforme a la invención.

Cualquier ácido nucleico administrado al paciente es estéril y apirógeno. El ADN desnudo puede ser administrado por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Los péptidos pueden ser administrados por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea.

La vacunación resulta en una respuesta de los linfocitos T citotóxicos estimulados por células presentadoras de antígenos. Una vez que los linfocitos T citotóxicos han sido sensibilizados, puede resultar ventajoso el aumento de la expresión del MHC en las células tumorales.

También puede ser útil la direccionalización de la vacuna hacia poblaciones específicas de células como, por ejemplo, hacia células presentadoras de antígenos, bien por medio de inyecciones, vectores de direccionalización y sistemas de liberación; o por purificación selectiva de dicha población de células del paciente y administración ex vivo del péptido o del ácido nucleico (las células dendríticas, por ejemplo, pueden clasificarse tal y como se describe en Zhoy y col. [1995] "Blood" 86,3295-3301; o en Roth y col. [1996] "Scand. J. Immunology" 43,646-651). Por ejemplo, los vectores de direccionalización pueden comprender un promotor específico de tumor o de tejido que dirige la expresión del antígeno al lugar adecuado.

Otro aspecto de la invención, por tanto, proporciona una vacuna efectiva contra el cáncer o las células tumorales o cancerosas, que comprende una cantidad efectiva de un péptido según la invención o un ácido nucleico que codifica dicho péptido. Asimismo, se prefiere particularmente que la vacuna sea una vacuna de ácidos nucleicos. Se sabe que la inoculación de una vacuna de ácidos nucleicos - -como una vacuna de ADN - - que codifique un polipéptido provoca una respuesta de los linfocitos T.

Convenientemente, la vacuna de ácidos nucleicos puede comprender cualquier medio de liberación adecuado del ácido nucleico. El ácido nucleico, preferentemente ADN, puede estar desnudo (es decir, sin ningún otro componente sustancial para ser administrado) o puede ser liberado en un liposoma o como parte de un sistema de liberación de un vector viral.

Se cree que la absorción del ácido nucleico y la expresión del polipéptido codificado por parte de las células dendríticas puede ser el mecanismo de sensibilización de la respuesta inmune. Sin embargo, aunque las células dendríticas pueden no sufrir la transfección, siguen siendo importantes porque detectan el péptido expresado de las células del tejido que hayan sufrido la transfección.

Se prefiere que la vacuna -como, por ejemplo, la vacuna de ADN- sea administrada en el músculo. También se prefiere que sea administrada en la piel. La vacuna de ácidos nucleicos puede administrarse sin adyuvante. La vacuna de ácidos nucleicos también puede administrarse con un adyuvante como BCG o alum. Otros adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede ser usado (Superfos, Dinamarca). Se prefiere que la vacuna de ácidos nucleicos se administre sin adyuvantes. Otros adyuvantes, como el adyuvante de Freund, también pueden ser útiles. También puede ser útil administrar el péptido conjugado con la hemocianina de lapa californiana, preferentemente también con un adyuvante.

La terapia de inmunización contra el cáncer por medio de un polinucleótico se describe en Conry y col. (1996) "Seminars in Oncology" 23,135-147; Condon y col. (1996) "Nature Medicine" 2,1122-1127; Gong y col. (1997) "Nature Medicine" 3,558-561; Zhai y col. (1996) "J. Immunol". 156,700-710; Graham y col. (1996) "Int J. Cancer" 65,664-670; y Burchell y col. (1996) pp 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo y col. (eds), "John Libbey Eurotext".

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un péptido según la invención, o de un polinucleótido o un vector de expresión que codifique dicho péptido, en la fabricación de un medicamento para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vitro, método que comprende el contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de clase II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según la invención.

Apropiadamente, los CTL son linfocitos colaboradores CD4^{+}, con preferencia de tipo TH1. Las moléculas MHC de clase II pueden ser expresadas en la superficie de cualquier célula adecuada. Se prefiere que dicha célula no exprese de forma natural moléculas MHC de clase II (en cuyo caso, se realiza la transfección en la célula para que exprese dicha molécula) o, si lo hace, sea defectuosa en las vías de procesamiento o de presentación de los antígenos. En este sentido, es posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase II sea sensibilizada completamente con un antígeno del péptido antes de activar los CTL.

La célula presentadora de antígenos (o célula estimulante) se caracteriza por tener en su superficie una molécula MHC de clase II y, preferentemente, no ser capaz de realizar por sí misma la carga de dicha molécula con el antígeno seleccionado. Tal y como se describe más abajo, la molécula MHC de clase II puede cargarse fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.

Preferentemente, la célula del mamífero carece o tiene un nivel o función reducida del transportador peptídico TAP. Entre las células adecuadas que carecen del transportador TAP se incluyen las T2, RMA-s y Drosophilia. TAP es el transportador asociado al procesamiento antigénico.

La línea celular humana T2 con carga peptídica defectuosa está disponible en la ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA, con el n.º de catálogo CRL 1992. La línea 2 de Drosophila de Schneider está disponible en la ATCC, con el número de catálogo CRL 19863. La línea celular del ratón RMA-S se describe en Karre y Ljunggren (1985), "J. Exp. Med"., 162, 1745.

Convenientemente, la célula huésped, antes de la transfección, no expresa moléculas MHC de clase I de forma sustancial. También se prefiere que la célula estimulante exprese una molécula importante para la estimulación conjunta del linfocito T como, por ejemplo, cualquiera de las B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3.

Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase II, así como las moléculas de estimulación conjunta, están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

En otra modalidad, también se pueden utilizar combinaciones de moléculas HLA.

El uso de vacunas de poliepítopos recombinantes para la liberación de linfocitos T citotóxicos CD8^{+} múltiples se describe en Thomson y col. (1996) "J. Immunol". 157, 822-826 y en el documento WO 96/03144. En relación a la presente invención, puede ser conveniente incluir en una única vacuna un péptido (o un ácido nucleico que codifique un péptido) que incluya, en cualquier orden, una secuencia de aminoácidos de la presente invención y un epítopo estimulador de los linfocitos T CD4^{+} (como el toxoide tetánico). Esta vacuna sería particularmente útil en el tratamiento del cáncer. Estas vacunas "perladas" son características de las vacunas de ADN.

Pueden usarse otros métodos para generar linfocitos T citotóxicos in vitro. Por ejemplo, los métodos descritos en Peoples y col. (1995) "Proc. Natl. Acad. Sci"., EUA, 92,432-436 y en Kawakami y col. (1992) "J. Immunol". 148,638643 usan linfocitos autólogos destructores de tumores en la generación de linfocitos T citotóxicos. En Plebanski y col. (1995) "Eur. J. Immunol". 25,1783-1787, se hace uso de linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) en la preparación de linfocitos T citotóxicos. En Jochmus y col. (1997) "J. Gen. Virol". 78,1689-1695, se describe la producción de linfocitos T citotóxicos autólogos por medio de la utilización de células dendríticas sensibilizadas de forma reiterada con péptidos o polipéptidos o por medio de la infección con un virus recombinante. Hill y col. (1995) "J. Exp. Med". 181,2221-2228 y Jerome y col. (1993) "J. Immunol". 151,1654-1662, usan linfocitos B en la producción de linfocitos T citotóxicos autólogos. Adicionalmente, en la preparación de CTL autólogos también pueden usarse macrófagos sensibilizados de manera repetida con péptidos o polipéptidos, o infectados con virus recombinante.

Las células alogénicas también pueden ser usadas en la preparación de linfocitos T citotóxicos. Este método se describe en detalle en el documento WO 97/26328. Por ejemplo, además de las células de Drosophilia y T2, pueden usarse otras células para presentar antígenos, como las células CHO, las células de insecto infectadas por baculovirus o células diana de bacterias, levadura o infectadas por vaccinia. Adicionalmente, pueden usarse virus de plantas. Véase, por ejemplo, Porta y col. (1994) "Virology" 202, 449-955, en donde se describe el desarrollo del virus del mosaico del garbanzo como un sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos foráneos.

Los linfocitos T citotóxicos activados, que son dirigidos contra los péptidos de la invención, son útiles para terapia. Así, la invención describe linfocitos T citotóxicos activados que pueden obtenerse por los métodos anteriores.

Otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen de forma selectiva a una célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención. Con preferencia, el CTL reconoce a la mencionada célula por interacción con el complejo de péptidos/HLA (por ejemplo, de unión). Los CTL son útiles en un método para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, en el que al paciente se le administra un número efectivo de los CTL activados. Los CTL administrados al paciente pueden derivar del paciente y se activados tal y como se describe más arriba (es decir, son CTL autólogos) De forma alternativa, los CTL pueden no ser del paciente, sino de otro individuo. Evidentemente, se prefiere que se trate de un individuo sano. Por "individuo sano" entendemos un individuo con buena salud en general, preferentemente con un sistema inmune competente y, más preferentemente, que no sufra ninguna enfermedad que pueda ser fácilmente detectable.

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Los CTL activos expresan un receptor de linfocitos T (TCR) que reconoce a las células que expresan el polipéptido aberrante. Resulta de utilidad que el ADNc que codifica el TCR esté clonado del CTL activado y transferido a otro CTL para su expresión.

In vivo, las células diana para el CTL CD4^{+} conforme a la presente invención pueden ser células del tumor (que, a veces, expresa MHC de clase II) y/o células del estroma que rodean al tumor (células tumorales) (que, a veces, también expresan MHC de clase II).

Los TCR de clones de CTL de la invención específicos para los péptidos de la invención son clonados. El uso de los TCR en los clones de CTL se determina usando (i) anticuerpos monoclonales específicos de región variable y (ii) RT PCR con cebadores específicos para las familias de genes Va y Vp. Se prepara una genoteca de ADNc a partir de ARNm poli-A extraído de los clones de CTL. Se usan los cebadores específicos para la porción C-terminal de las cadenas a y P de TCR y para la porción N-terminal de los segmentos Va y P identificados. El ADNc completo para la cadena a y b de TCR se amplifica con una ADN-polimerasa de alta fidelidad y los productos amplificados son clonados a un vector de clonación adecuado. Los genes clonados de las cadenas a y P pueden ser unidos en un TCR de cadena única por medio del método descrito por Chung y col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci". EUA 91,12654-12658. En este constructo de cadena única, el segmento VaJ está seguido por el segmento V DJ, seguido a su vez por el segmento Cp, seguido a su vez por el segmento citoplasmático y la transmembrana de la cadena CD3. Este TCR de cadena única se inserta entonces en un vector de expresión retroviral (puede usarse un panel de vectores basado en su habilidad para infectar linfocitos T CD8^{+} humanos maduros y para mediar en la expresión génica: El sistema retroviral de vectores Kat es una de las posibilidades preferidas [véase Finer y col. (1994) "Blood" 83, 43]). Los retrovirus anfotróficos de alta valoración son usados para infectar linfocitos T CD8^{+} o CD4^{+} purificados, aislados de las sangre periférica de pacientes con tumor (siguiéndose el protocolo publicado por Roberts y col. (1994) en "Blood" 84, 2878-2889). Los anticuerpos Anti-CD3 son usados para desencadenar la proliferación de linfocitos T CD8^{+} purificados, lo que facilita la integración retroviral y expresión estable de TCR de cadena única. La eficacia de la transducción retroviral se determina por coloración de los linfocitos T CD8^{+} infectados con anticuerpos específicos del TCR de cadena única. El análisis in vitro de los linfocitos T CD8^{+} transducidos establece que muestran la misma toxicidad específica de tumor que con el clon de CTL allo-restringido del que originalmente se clonaron las cadenas de TCR. Las poblaciones de linfocitos T CD8^{+} transducidos con la especificidad esperada pueden ser usadas en la inmunoterapia adoptiva de los pacientes con tumores. Los pacientes pueden ser tratados con entre 10^{8} y 10^{11} CTL autólogos transducidos. De forma análoga a los CD8^{+}, se pueden generar linfocitos T colaboradores CD4^{+} transducidos con constructos
relacionados.

Otros sistemas adecuados para introducir genes en CTL se describen en Moritz y col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci". USA 91,4318-4322. Eshhar y col. (1993) "Proc. Natl. Acad. Sci". USA 90,720-724 y Hwu y col. (1993) "J. Exp. Med". 178, 361-366 también describen la transfección de los CTL. Por tanto, otro aspecto de la invención proporciona un TCR que reconoce una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. El TCR se obtiene del CTL activado.

Al igual que el TCR, se incluyen en la presente invención moléculas funcionalmente equivalentes al TCR. Éstas incluyen cualquier molécula funcionalmente equivalente a un TCR, que puede realizar la misma función que el TCR. En particular, dichas moléculas incluyen TCR modificados genéticamente de cadena única y tres dominios, fabricadas por el método descrito por Chung y col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci". EUA 91, 12654-12658, mencionado anteriormente. La invención también describe un polinucleótido que codifica el TCR o la molécula funcionalmente equivalente, y un vector de expresión que codifica el TCR o una molécula funcionalmente equivalente. Los vectores de expresión adecuados para la expresión del TCR de la invención incluyen los descritos más arriba en relación a la expresión de los péptidos de la invención.

Se prefiere, sin embargo, que los vectores de expresión sean capaces de expresar el TCR en un CTL después de la transfección.

La invención describe un método para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende los siguientes pasos: (1) obtención de CTL del paciente; (2) introducción en dichas células de un polinucleótido que codifique un TCR o una molécula funcionalmente equivalente, como se definió más arriba, y (3) introducción al paciente de las células producidas en el paso (2).

La invención describe un método para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la definida en los otros aspectos de la invención. El método comprende los siguientes pasos: (1) obtención de células presentadoras de antígenos, como células dendríticas, del paciente; (2) contacto de dichas células presentadoras de antígenos con un péptido, como se definió en los otros aspectos de la invención, o con un polinucleótido que codifique dicho péptido, ex vivo y (3) reintroducción en el paciente de las células presentadoras de antígenos así tratadas.

Preferentemente, las células presentadoras de antígenos son células dendríticas. Las células dendríticas son células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetid con un péptido antigénico. El péptido antigénico puede ser cualquier péptido antigénico adecuado que desencadene una respuesta adecuada de los linfocitos T. La terapia de linfocitos T con células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con péptidos de un antígeno asociado a un tumor se describe en Murphy y col. (1996) "The Prostate" 29, 371-380 y en Tjua y col. (1997) "The Prostate" 32, 272-278.

En otra modalidad, las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, son contactadas con un polinucleótido que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica resultante en la presentación de un péptido e inducción de inmunidad.

Convenientemente, el polinucleótido puede estar comprendido en un polinucleótido viral o en un virus. Por ejemplo, se ha demostrado que las células dendríticas transducidas por adenovirus inducen inmunidad antitumoral específica de antígeno en relación con MUC1 (véase Gong y col. [1997] "Gene Ther". 4,1023-1028). De forma similar, pueden usarse sistemas basados en adenovirus (véase, por ejemplo, Wan y col. [1997] "Hum. Gene Ther". 8,1355-1363); sistemas retrovirales (Specht y col. [1997] "J. Exp. Med". 186,1213-1221 y Szabolcs y col. [1997]); transferencia sanguínea mediada por partícula a células dendríticas (Tuting y col. [1997] "Eur. J. Immunol". 27, 2702-2707) y ARN (Ashley y col. [1997] "J. Exp. Med". 186, 1177 1182).

Se apreciará que, con respecto a los métodos para matar células diana en un paciente, se prefiere especialmente que las células diana sean células cancerosas y, más aún, que sean células de cáncer renal.

Se prefiere especialmente que los pacientes que sean tratados con los métodos tengan un haplotipo HLA-DR. Así, en una modalidad preferida, el haplotipo HLA del paciente se habrá determinado antes del tratamiento. El análisis del haplotipo HLA del paciente puede efectuarse mediante los métodos adecuados, conocidos por los expertos en la materia.

La invención incluye en particular el uso de péptidos de la invención (o polinucleótidos que los codifiquen) para la vacunación activa in vivo; para la manipulación in vitro de células dendríticas autólogas seguida de la introducción de dichas células para activar repuestas de CTL; para activar CTL autólogos in vitro seguido de terapia adoptiva (es decir, los CTL así manipulados son introducidos en el paciente); y para activar CTL de donantes sanos (MHC apareado o desapareado) in vitro seguido por terapia adoptiva.

En una modalidad preferida, las vacunas de la presente invención se administran a un huésped tanto solas como en combinación con otras terapias contra el cáncer para inhibir o suprimir la formación de tumores.

La vacuna de péptidos puede administrarse sin adyuvante. La vacuna de péptidos también puede administrarse con un adyuvante como BCG o alum. Otros adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede ser usado (Superfos, Dinamarca). Otros adyuvantes, como el adyuvante de Freund o el GMCSF, también pueden ser útiles. También puede ser útil administrar el péptido conjugado con la hemocianina de lapa californiana, preferentemente también con un adyuvante.

Los péptidos conformes a la invención también pueden ser usados como reactivos diagnósticos. Con ellos puede analizarse si, en una población de CTL, aparecen CTL dirigidos específicamente contra un péptido o inducidos por una terapia. Además, el aumento de linfocitos T precursores puede ser analizado con los péptidos que tengan una reactividad contra el péptido definido. Además, el péptido puede ser usado como marcador para controlar la progresión de la enfermedad de un tumor que expresa el antígeno mencionado del que el péptido deriva.

En la tabla 1 adjunta, se enumeran los péptidos identificados. Además, en la tabla se nombran las proteínas de las que deriva el péptido así como la posición respectiva del péptido en la proteína correspondiente. Además, se dan los números de registro respectivos vinculados al Genbank del National Centre for Biotechnology Information del National Institute of Health (véase http: www.ncbi.nlm.nih.gov).

En otra modalidad preferida, los péptidos son usados para la tinción de leucocitos, en particular de linfocitos T. Este uso es particularmente ventajoso si se prueba que en una población de CTL aparecen CTL específicos dirigidos contra un péptido. Además, el péptido puede usarse como marcador para determinar la evolución de una terapia contra una enfermedad o trastorno tumoral.

En otra modalidad preferida, los péptidos son usados para la producción de un anticuerpo. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse de forma estándar con la inmunización de animales, por medio de la inyección del péptido y la subsiguiente purificación de la globulina inmune. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse siguiendo los protocolos estándar, como los descritos, por ejemplo, en "Methods Enzymol". (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene uno o más de los mencionados péptidos conformes a la invención. Esta composición se administra por vía parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular o por vía oral. Para ello, los péptidos son disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes como soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes blásticos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos también pueden administrase junto con substancias estimulantes de la respuesta inmune, como las citocinas. Una lista completa de excipientes que pueden usarse para esta composición aparece, por ejemplo, en A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. La composición puede usarse para la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales.

La preparación farmacéutica con al menos uno de los péptidos de la presente invención que comprenda la SEQ ID n.º 1 es administrada a un paciente que sufra una enfermedad tumoral que esté asociada al péptido o antígeno respectivo. Así puede desencadenarse una respuesta inmune específica de CTL.

En otro aspecto de la presente invención, una combinación de dos o varios péptidos conformes a la presente invención pueden usarse como vacuna, tanto en combinación directa como dentro del mismo régimen de tratamiento. Además, pueden usarse combinaciones con otros péptidos como, por ejemplo, péptidos específicos de MHC de clase I. El experto en la materia será capaz de seleccionar las combinaciones preferidas de péptidos inmunógenos por medio del análisis, por ejemplo, de la generación de linfocitos T in vitro así como su eficacia y presencia global, la proliferación, afinidad y expansión de determinados linfocitos T para determinados péptidos, y la funcionalidad de los linfocitos T; por ejemplo, analizando la producción de IFN-\gamma (véanse también los ejemplo más abajo). Normalmente, los péptidos más eficaces son entonces combinados como vacuna para los propósitos descritos más arriba.

Una vacuna adecuada contendrá 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 péptidos distintos, preferiblemente 4, 5, 6 ó 7 péptidos distintos y, más preferiblemente, 6 péptidos diferentes.

Finalmente, la vacuna puede depender del tipo de cáncer específico que el paciente sufra así como del estado de la enfermedad, regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmune del paciente y, naturalmente, el haplotipo HLA del paciente.

Se ha comprobado que los 80 aminoácidos N-terminales de la Ii son suficientes para dirigir a las proteínas a la vía de procesamiento de clase II (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354). Con el fin de proporcionar una demostración del concepto de la presente invención, los inventores generaron proteínas de fusión consistentes en los 80 aminoácidos N-terminales de la Ii y un antígeno ejemplar asociado a diversas malignidades, la ciclina D1 (CCND1).

La ciclina D1 es un regulador del ciclo celular que participa en la transición G1-S a través de interacciones con quinasas ciclina-dependientes. Además, la ciclina D1 es un proto-oncogén y se ha demostrado su sobreexpresión en muchos tipos de tumor (Hedberg, Y., Davoodi, E., Roos, G., Ljungberg, B. & Landberg, G. (1999) Int. J. Cancer 84, 268-272, Vasef, M. A., Brynes, R. K., Sturm, M., Bromley, C. & Robinson, R. A. (1999) Mod. Pathol. 12, 412-416, - Troussard, X., Avet-Loiseau, H., Macro, M., Mellerin, M. P., Malet, M., Roussel, M. & Sola, B. (2000) Hematol. J. 1, 181-185) mientras que aparece expresado con poca intensidad en muchos órganos y tejidos sanos sin una distribución particular, a excepción del hígado y la fibra muscular lisa superior aórtica (Weinschenk, T., Gouttefangeas, C., Schirle, M., Obermayr, F., Walter, S., Schoor, O., Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K. H., Wernet, D. et al. (2002) Cancer Res. 62, 5818-5827). En un enfoque espectrométrico de masas diferencial, los inventores compararon espectros de masas de péptidos HLA purificados de células transfectadas y sin transfectar y usaron los péptidos resultantes de interés en experimentos de sensibilización in vitro de linfocitos T CD4^{+} colaboradores, con el fin de demostrar el carácter inmunógeno de estos ligandos HLA de clase II.

La identificación de epítopos de linfocitos T colaboradores de antígenos asociados a tumores sigue siendo una tarea importante en la inmunoterapia contra los tumores. En este sentido, aportamos un método de aplicación general y péptidos que derivados del análisis diferencial de péptidos por espectrometía de masas para identificar ligandos MHC de clase II, presentados y procesados de forma natural, de antígenos asociados a tumores. Este enfoque combina por primera vez la transfección de APC con un vector que codifique una proteína de fusión entre la cadena invariante y el antígeno de interés, la elución de péptidos unidos a HLA y la identificación por espectrometría de masas de los péptidos derivados del antígeno presentados por el agente de transfección, por comparación con las células no transfectadas. Además, pudimos validar el método mostrando que los linfocitos T inducidos contra el péptido identificado reconoces específicamente a los agentes de transfección que sobreexpresan el antígeno cognado. Aunque todavía se tiene que probar la inmunogenicidad in vivo de los péptidos identificados, nuestro enfoque conduce a la caracterización exacta de los ligandos MHC de clase II procesados de forma natural. Así, los inventores evitan probar péptidos sintéticos solapados de antígenos asociados a tumores o un intervalo amplio de péptidos seleccionados por predicción de epítopos, ya que es menos exacto que la predicción de epítopos de clase I. En comparación con laboriosos ensayos de linfocitos T que podrían conducir a la identificación de crípticos epítopos de linfocitos T incapaces de inducir la activación de los linfocitos T in vivo (Anderton, S. M., Viner, N. J., Matharu, P., Lowrey, P. A. & Wraith, D. C. (2002) Nat. Immunol. 3, 175-181), el trabajo puede centrarse en los pocos péptidos que se encuentran para ser presentados. Además, con este método no es necesario producir el antígeno recombinante o disponer de líneas celulares tumorales que expresen el antígeno para probar que los péptidos se procesan de forma natural.

Los inventores usaron el N-terminal de Ii para dirigir antígenos asociados a tumores al compartimento de procesamiento de clase II de células B transformadas por el VEB. Para conseguir esto, construimos un vector versátil con el que se puede expresar cualquier antígeno como una proteína de fusión con Ii y que ayuda a determinar el nivel de expresión de la proteína en células transfectadas mediante el análisis de transferencia Western. Ya se ha mostrado que el N-terminal de Ii es suficiente para dirigir proteínas al compartimento de procesamiento de clase II. Pero, hasta ahora, esto sólo se ha descrito en un modelo que utiliza ovalbúmina (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221) para identificar antígenos desconocidos usando genotecas de ADNc que codifican proteínas de fusión (Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354) o para confirmar la especificidad de clones de linfocitos T conocidos (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). No tenemos conocimiento de que este método se haya usado antes para identificar péptidos unidos a MHC de clase II, presentados de forma natural, de antígenos asociados a tumores conocidos. El análisis diferencial de ligandos de clase II de células transfectadas y no transfectadas por espectrometría de masas MALDI y la posterior caracterización por espectrometría de masas ESI de los péptidos expresados diferencialmente tiene como resultado un método directo para identificar ligandos de clase II de los antígenos de interés. La transfección de las células con proteínas de fusión queratina 18 mostró que nuestro método es de aplicación general para los antígenos de interés. También
pudimos describir un péptido presentado por HLA-DR a partir de un transgén modelo, la queratina 18.

Los inventores identificaron un antígeno inmunógeno del péptido de ciclina D1 presentado por HLA-DR4 con la secuencia NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1), así como otros 337 péptidos asociados al antígeno HLA de clase II, eluidos de una línea celular tumoral humana transfectada. El péptido de ciclina D1 y otros péptidos identificados a partir de la línea celular humana son posibles candidatos para el desarrollo clínico de vacunas terapéuticas para el tratamiento de cánceres humanos (Weinschenk, T., Gouttefangeas, C., Schirle, M., Obermayr, F., Walter, S., Schoor, O., Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K. H., Wernet, D. et al. (2002) Cancer Res. 62, 5818-5827).

Ahora se describirá la invención en más detalle, haciéndose referencia a las siguientes figuras, al listado de secuencias y a los ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención.

Las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 338 muestran secuencias de péptidos de epítopos de linfocitos T que contienen péptidos presentados por el MHC de clase II.

Las SEQ ID n.º 339 a 350 muestran secuencias de cebadores como se han usado en los ejemplos.

La figura 1 muestra un primer análisis de transferencia Western de proteínas de fusión generadas en el transcurso de los experimentos.

La figura 2 muestra un segundo análisis de transferencia Western de proteínas de fusión generadas en el transcurso de los experimentos.

La figura 3 muestra los cromatogramas de la HPLC de la línea celular sin transfectar y el clon de ciclina D1 de Ii de Awells.

Las figuras 4 y 5 muestran los análisis espectrométricos de masas de una fracción preferida con una señal individual infrecuente.

La figura 6 muestra la identificación de los péptidos NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1) (ciclina D1_{198-212}).

La figura 7 muestra la estimulación específica de los linfocitos T por el péptido de ciclina D1 (panel superior) y la producción de citocina de los linfocitos T en respuesta al péptido (panel inferior).

La figura 8 muestra un control negativo de la activación inespecífica de linfocitos T colaboradores CD4^{+} con receptores de linfocitos T específicos de HLA-DR4/ciclina D1_{198-212}.

Ejemplos

Como resultará obvio para los expertos en la materia al leer la descripción y los ejemplos presentes, la invención también se refiere a otros epítopos de antígenos asociados a tumores, tal y como se describe específicamente en los siguientes ejemplos, relacionados con un antígeno inmunógeno de péptido de ciclina D1 presentado por HLA-DR4 con la secuencia NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1), y la queratina 18. Los ejemplos deben interpretarse como esbozos generales que los expertos en la materia pueden aplicar fácilmente a todos los epítopos de antígenos asociados a tumores de la presente invención (es decir, que comprendan cualquiera de las secuencias SEQ ID n.º 1 a 338) y así aplicar enteramente la presente invención.

Abreviaturas utilizadas en la presente solicitud:

Ac:: anticuerpo

Ag:: Antígeno

APC:: célula presentadora de antígeno

CD:: grupo de diferenciación

cpm:: recuentos por minuto

DC:: célula dendrítica

VEB:: virus de Epstein-Barr

ESI:: ionización por electrospray

HLA:: antígeno de leucocito humano

HPLC:: cromatografía líquida de alto rendimiento

IFN:: Interferón

Ii:: cadena invariante (CD74)

IL:: interleucina

MALDI:: láser de matriz asistida de ionización desorción

MHC:: Complejo mayor de histocompatibilidad

MS:: espectrometría de masas

OD_{450}:: densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm

PBMC:: células mononucleares de sangre periférica

PCR:: reacción en cadena de la polimerasa

PHA:: Fitohemaglutinina

SDS-PAGE:: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfatosódico

SI:: índice de estimulación

TOF:: tiempo de vuelo

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Células y anticuerpos

Se mantuvo línea celular humana B-linfoblastoide Awells (IHW-No. 9090; HLA-DRB1*0401, HLA-DRB4*0101) en medio RPMI 1640 (C.C. Pro, Neustadt, Alemania) con un 10% de FCS (Pan, Aidenbach, Alemania) y se complementó con 2 mM de L-glutamina (BioWhittaker, Verviers, Bélgica), 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (BioWhittaker). En el caso de los clones de células transfectadas, se añadieron 0,8 mg/ml de G418 (PAA Laboratories, Linz, Austria). Se generaron agentes de transfección estables por electroporación de células Awells (280 V, 975 \muF; Gene Pulser II, Biorad, Múnich, Alemania), seguida de la clonación mediante el método de dilución límite. Los anticuerpos L243 (anti-HLA-DR) (Lampson, L. A. & Levy, R. (1980) J. Immunol. 125, 293-299) y W6/32 (anti HLA de clase I) (Brodsky, F. M. & Parham, P. (1982) J. Immunol. 128, 129-135) fueron purificados de sobrenadantes de cultivo de hibridoma utilizando cuentas de A-sefarosa de proteína (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se indujo la línea celular Th y se cultivó en IMDM (BioWhittaker) con un 10% de suero humano AB (Pel-Freez Clinical Systems, LLC, Milwaukee, WI, EUA) y complementada con 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 50 \muM de \beta-mercaptoetanol. Los anticuerpos usado en el análisis de citometría de flujo se adquirieron de PharMingen (San Diego, CA, EUA).

Constructos de ADN plasmídicos

Se amplificó el ADNc codificante de los 80 aminoácidos N-terminal de la Ii (NCBI, número de registro de GenBank X00497) en una PCR a partir del vector pBluescript II KS(+) 41-1 (Stratagene, Heidelberg, Alemania), adquirido de A. Melms, (Malcherek, G., Wirblich, C., Willcox, N., Rammensee, H. G., Trowsdale, J. & Melms, A. (1998) Eur. J. Immunol. 28, 1524-1533) y subclonado en los sitios HindIII y BamHI de pcDNA3 (pcDNA3-Ii; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) mediante los cebadores 5' ATCGAAGCTTCCAAGATGCACAGGAGGAGAAGC (SEQ ID n.º 339) y 3' ATCGGGATCCTTTGTCCAGCCGGCCCTGCTG (SEQ ID n.º 340). Los genes de interés se amplificaron en una PCR a partir de ADNc de tejido renal maligno mediante los cebadores 5' ATCGGAATTCtGAGCTT
CACCACTCGCTCC (SEQ ID n.º 341) y 3' ATCGGCGGCCGCTTAATGCCTCAGAACTTTGGT (SEQ ID n.º 342) para la queratina 18 (NCBI, número de registro GenBank X12881), y los cebadores 5' ATCGGAATTCTGGAACAC
CAGCTCCTGTGC (SEQ ID n.º 343) y 3' ATCGGCGGCCGCTCAGATGTCCACGTCCCGCAC (SEQ ID n.º 344) para la ciclina D1 (NCBI, GenBank X59798), respectivamente. El ADNc obtenido fue subclonado mediante la clonación TOPO TA (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) e insertado finalmente en los sitios EcoRI y NotI de la Ii pcDNA3, dentro de la secuencia de la Ii.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se aisló ARN de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) conforme a las recomendaciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir de 1 \mug del ARN total. Se efectuó una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Se usó SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) para la amplificación de la PCR y la detección en tiempo real de los productos de la PCR. Las secuencias de los cebadores son las siguientes: 18S ARNr, cebadores 5' CGGCTACCACATCCAAGGAA (SEQ ID n.º 345) y 3' GCTGGAATTACCGCGGCT (SEQ ID n.º 346); Queratina 18, cebadores 5' GAGCCTGGAGACCGAGAAC (SEQ ID n.º 347) y 3' TTGCGAAGATCT
GAGCCC (SEQ ID n.º 348); ciclina D1, cebadores 5' CACGATTTCATTGAACACTTCC (SEQ ID n.º 349) y 3' TGAACTTCACATCTGTGGCAC (SEQ ID n.º 350). Las PCR se efectuaron en 20 \mul con 300 nM de cada cebador (18S cebador inverso: sólo 50 nM). Todas las muestras se amplificaron por duplicado. Las diferencias de expresión entre las células transfectadas y las normales para distintos genes se calcularon a partir de curvas de amplificación mediante cuantificación relativa, utilizando el método comparado del ciclo de umbral (C_{T}) (disponible en http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Se seleccionó ARN ribosomal 18S como gen de referencia para las normalizaciones.

Detección de proteínas de fusión

Se detectaron proteínas de fusión mediante el análisis de transferencia Western, utilizando el AcMo PIN.1 (Stressgen, Biomol, Hamburgo, Alemania), ligado a los residuos de aminoácidos 12-28 de la Ii. Resumidamente, las células se lisaron como se describe (Hsieh, C. S., deRoos, P., Honey, K., Beers, C. & Rudensky, A. Y. (2002) J. Immunol. 168, 2618-2625), los lisados se hirvieron en amortiguador Laemmli de carga, se separaron en SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de una saturación con BSA, las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el AcMo PIN.1 (1 \mug/ml). Las proteínas se visualizaron utilizando IgG ovino anti-ratón acoplado a peroxidasa (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania). En algunos casos, las células transfectadas se cultivaron con 10-100 \muM de cloroquina (Sigma, Steinheim, Alemania) con el fin de investigar la direccionalización endosomal/lisosomal de las proteínas de fusión. Después se lisaron las células y se detectaron las proteínas mediante transferencia Western, como se describió anteriormente.

La queratina 18-Ii también se detectó mediante inmunoprecipitación y posterior digestión in situ con tripsina, seguida de análisis de espectrometría de masas. Resumidamente, las células se lisaron como se ha descrito (Hsieh, C. S., deRoos, P., Honey, K., Beers, C. & Rudensky, A. Y. (2002) J. Immunol. 168, 2618-2625) y se incubaron con el AcMo PIN.1 y cuentas de A-sefarosa de proteína (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las bolitas de sefarosa se lavaron, se hirvieron en amortiguador Laemmli de carga y se colocaron en SDS-PAGE al 12%. Los puntos de proteínas se eliminaron del gel y se digirieron in situ con tripsina, esencialmente como se ha descrito(Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. (1996) Anal. Chem. 68, 850-858). El análisis posterior se efectuó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF (Reflex III, Bruker Daltonik, Bremen, Alemania). La identidad de las proteínas se verificó por espectros de espectrometría de masas en tándem registrados en un espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo de aceleración, híbrido y ortogonal (QStar Pulsar i Qqoa Tof; Applied Biosystems-MDS Sciex, Weiterstadt, Alemania).

Elución de péptidos unidos a MHC de clase II

Las bolitas de células congeladas (3,5 a 5 x 10^{10} células) se procesaron como se ha descrito (Schirle, M., Keilholz, W., Weber, B., Gouttefangeas, C., Dumrese, T., Becker, H. D., Stevanovic, S. & Rammensee, H. G. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2216-2225) y los péptidos se aislaron conforme a los protocolos estándar (Seeger, F. H., Schirle, M., Keilholz, W., Rammensee, H. G. & Stevanovic, S. (1999) Immunogenetics 49, 996-999) utilizando el AcMo L243 específico de HLA-DR (Lampson, L. A. & Levy, R. (1980) J. Immunol. 125, 293-299).

Análisis molecular de los péptidos eluidos con DR

Los péptidos se separaron por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida (HPLC, SMART system, \muRPC C2/C18 SC 2.1/10; Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) y las fracciones se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (MS), utilizando un espéctómetro de masas Bruker Reflex III (Bruker Daltonik). Los péptidos presentados de forma diferente se siguieron analizando mediante espectrometría de masas nano-ESI (ionización de electrospray) en tándem en un en un espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo de aceleración, híbrido y ortogonal (Q-TOF; Micromass, Manchester, Reino Unido), como se ha descrito (Schirle, M., Keilholz, W., Weber, B., Gouttefangeas, C., Dumrese, T., Becker, H. D., Stevanovic, S. & Rammensee, H. G. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2216-2225).

Síntesis y análisis de péptidos

Los péptidos fueron sintetizados en el sintetizador de péptidos EPS221 (Abimed, Langenfeld, Alemania) siguiendo la estrategia Fmoc/tBu. Tras la eliminación de la resina por el tratamiento con TFA/fenol/etanoditiol/tioanisol/agua (90/3.75/1.25/2.5/2.5 por vol.) durante 1 o 3 horas (péptidos con arginina), los péptidos fueron precipitados desde el metil-tert butil éter, lavados una vez con metil-tert butil éter, dos veces con éter dietílico y resuspendidos en agua antes de la liofilización. Los productos de la síntesis fueron analizados por HPLC (Varian star, Zinsser analytics, Múnich, Alemania) y por espectrometría de masas de MALDI-TOF (future, GSG, Bruchsal, Alemania). Los péptidos con una pureza de menos del 80% fueron purificados por HPLC de preparación.

Células dendríticas derivadas de monocitos

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) conforme a los procedimientos habituales, a partir de HLA-DRB1*0408-, HLA-DRB1*1101-, HLA-DRB3*0202-, HLA-DRB4*01-positivo de un donante. Las células dendríticas (DC) se obtuvieron de PBMC adherentes al plástico cultivadas con GM-CSF y IL-4 durante 6 días como se describió anteriormente (Bender, A., Sapp, M., Schuler, G., Steinman, R. M. & Bhardwaj, N. (1996) J. Immunol. Methods 196, 121-135), a excepción de que el medio utilizado fue X-VIVO 15 (BioWhittaker) sin suero. Al sexto día se analizaron las células dendríticas inmaduras por citometría de flujo en busca de expresión de CD1a, CD11c, CD14, CD40, CD83, CD86 y HLA-DR en la superficie celular, con un aparato FACScalibur con software CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las DC se maduraron después con 50 \mug/ml de ácido poliinosínico-policitidílico (Poly I/C, Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) y 10 ng/ml de TNF-\alpha (PharMingen) durante dos días más y se volvieron a analizar mediante citometría de flujo en busca de expresión de CD14, CD80, CD83 y CD86 en la superficie celular. Las DC maduras mostraron una clara regulación ascendente de las moléculas CD80, CD83 y CD86.

Generación de linfocitos T colaboradores específicos de péptidos

Se cargaron 3 x 10^{5} DC maduras durante dos horas con 10 \muM del péptido NPPSMVAAGSVVAAV en una placa de 24 pocillos y se lavaron exhaustivamente. A continuación, se añadieron 4 x 10^{6} PBMC autólogas frescas a las DC, en presencia de 10 ng/ml de IL-12p70 para favorecer el desarrollo de Th-1. Las PBMC se reestimularon semanalmente con PBMC autólogas, irradiadas y con carga de péptidos en presencia de 10 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-7. Tras 3 y 5 reestimulaciones, los linfocitos T se mezclaron y se probaron con PBMC autólogas en presencia del péptido. La línea celular de linfocitos T colaboradores se amplificó entonces cada 1 o 2 semanas con PBMC alogénicas irradiadas en presencia de 1 \mug/ml de PHA, 25-50 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-7 y después se probó para comprobar el reconocimiento de las líneas celulares transfectadas. Cada tres o cuatro semanas, la línea celular de linfocitos T colaboradores se reestimulaba con PBMC autólogas irradiadas en presencia de 10 \muM de péptido, 10 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de
IL-7.

Ensayos funcionales y caracterización de la línea celular de linfocitos T colaboradores

La activación de los linfocitos T colaboradores se comprobó por proliferación celular, calculada mediante incorporación de timidina y secreción de citocina. Resumidamente, se incubaron 2 x 10^{5} células por triplicado en una placa de 96 pocillos con 2 x 10^{5} PBMC autólogas irradiadas en presencia o ausencia de 10 \muM de péptido o 3 \mug/ml de PHA. Tras 24 horas, se cultivaron y congelaron dos porciones de 50 \mul de sobrenadante y se añadieron 50 \mul de medio fresco a las células. Tras 54 horas, se añadieron 50 \mul de medio tritiado con timidina (0.074 MBq/pocillo, Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania) y se midió la incorporación de timidina a las 72 horas utilizando un centellómetro (Microbeta, Wallac, Friburgo, Alemania). La proliferación celular se expresa en forma de índice de estimulación (SI), que corresponde a la siguiente proporción: (media de cpm de linfocitos T estimulados)/(media de cpm de linfocitos T sin estimular). La secreción e IL-2 se midió utilizando la línea celular CTLL-2 dependiente de IL-2. Resumidamente, se incubaron 10^{4} células en presencia de sobrenadantes durante 20-24 horas. A continuación, se añadió medio con timidina (0.055 MBq/pocillo) durante 7-8 horas más y se midió la incorporación de timidina como se describió anteriormente. Los resultados también se expresan en forma de índice de estimulación.

La secreción de IFN-\gamma, IL-4 e IL-6 se midió mediante sándwich ELISA, utilizando pares de anticuerpos y estreptavidina conjugada con peroxidasa, adquirida de PharMingen y conforme a las recomendaciones del fabricante. Utilizamos Supersensitive TMB (Sigma, Deisenhofen, Alemania) como substrato y la reacción fue detenida con una solución de 2 M de H_{2}SO_{4}. A continuación se midió la OD_{450} y los resultados se expresaron en pg/ml conforme a los estándares.

Reconocimiento de células transfectadas con ciclina D1 por la línea celular de linfocitos T colaboradores específica del péptido

La ausencia de reacción alogénica detectable de los linfocitos T contra los agentes de transfección se demostró mediante el cultivo conjunto de PBMC frescas del donante utilizadas para generar la línea de linfocitos T colaboradores en presencia de varios números de células de agentes de transfección irradiados. La proliferación celular y la secreción de IL-2, IL-4, IL-6 e IFN-\gamma se midió como se describió anteriormente y se determinó así la proporción de efector/diana para otros experimentos.

El reconocimiento del péptido procesado naturalmente derivado de la ciclina D1 se evaluó mediante el cultivo conjunto de la línea celular de linfocitos T colaboradores específica del péptido (2 x 10^{5} células) en presencia de células Awells (4 x 10^{4} células) transfectadas con un plásmido codificador de ciclina D1 o de queratina 18 como control negativo y conforme a la proporción de células determinada más arriba. Como controles positivos se utilizaron PBMC autólogas irradiadas en presencia de 10 \muM de péptido o 3 \mug/ml de PHA. La proliferación celular y la secreción de IL-2 e IFN-\gamma se midió como se describió anteriormente. En algunos experimentos, las células se cultivaron en presencia de 20 \mug/ml de anticuerpo L243 purificado.

Resultados Generación de clones de células que expresan proteínas de fusión

Clonamos el ADNc codificador de los 80 aminoácidos N-terminales de la Ii en el vector pcDNA3 de tal forma que el extremo 3' del inserto era seguido por un sitio de clonación general (GCS). Esto nos proporcionó un vector versátil capaz de expresar proteínas de fusión de la Ii y los genes de interés. En el marco de la Ii, clonamos el ADNc de la ciclina D1 así como la queratina 18 como control.

La línea celular Awells se transfectó de forma estable con vectores codificadores de las dos proteínas de fusión mediante electroporación. Posteriormente, se generaron clones de células aisladas y se evaluó su expresión antigénica a nivel de ARNm y de proteínas. En comparación con el tipo normal (línea celular sin transfectar), el clon óptimo de queratina 18 de Ii expresó 5.700 veces más queratina 18 y el clon óptimo de ciclina D1 de Ii expresó 1.200 veces más ciclina D1, como resultó del análisis de PCR cuantitativo en tiempo real. Los datos se normalizaron en ARN ribosómico 18S.

En anticuerpo PIN.1 se utilizó para detectar las proteínas de fusión de Ii mediante análisis de transferencia Western. En comparación con el tipo normal, donde sólo se detectaron dos bandas correspondientes a dos isoformas de Ii (Warmerdam, P. A., Long, E. O. & Roche, P. A. (1996) J. Cell Biol. 133, 281-291), se observó en cada clon una banda adicional en representación de las proteínas de fusión de la queratina 18 de Ii o la ciclina D1 de Ii, con los pesos moleculares esperados (Figura 1). En el caso del clon Awells-Ii-queratina 18, la proteína de fusión también se identificó mediante inmunoprecipitación, seguida de digestión in situ con tripsina y el posterior análisis
MS/MS.

También se evaluaron los niveles de expresión de HLA de clase I y II en la superficie celular mediante citometría de flujo con el fin de determinar si el procedimiento de transfección y clonación interfirió en ellos. Ambos clones mostraron niveles de expresión normales de moléculas HLA de clase I y II en comparación con la línea celular sin transfectar.

Direccionalización endosomal/lisosomal de las proteínas de fusión

Ya se ha descrito que el N-terminal de Ii es suficiente para dirigir proteínas a la vía del MHC de clase II (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354, Malcherek, G., Wirblich, C., Willcox, N., Rammensee, H. G., Trowsdale, J. & Melms, A. (1998) Eur. J. Immunol. 28, 1524-1533). Con el fin de comprobar si nuestros constructos seguían realmente dicha ruta de procesamiento de antígenos, incubamos los agentes de transfección durante 4 horas con cantidades cada vez mayores de cloroquina, un fármaco citotóxico que inhibe la degradación lisosomal de las proteínas mediante el aumento del pH lisosomal (Kaplan, J. & Keogh, E. A. (1981) Cell 24, 925-932, Tietze, C., Schlesinger, P. & Stahl, P. (1982) J. Cell Biol. 92, 417-424, Seglen, P. O. (1983) Methods Enzymol. 96:737-64., 737-764). Después se lisaron las células y se detectaron las proteínas de fusión mediante transferencia Western. La figura 2 muestra que las bandas de proteínas se vuelven más intensas a medida que se aumentan las cantidades de cloroquina, lo que indica que las cantidades de proteínas de fusión aumentan con el aumento de concentración de cloroquina y demuestra que las proteínas de fusión siguen la vía del MHC de clase II de degradación de
proteínas.

Análisis diferencial por espectrometría de masas de péptidos unidos a HLA-DR

Se cultivaron de 3,5 a 5 x 10^{10} células de cada clon y de la línea celular sin transfectar y los péptidos unidos a HLA-DR se aislaron y separaron mediante HPLC, como se describió anteriormente (Seeger, F. H., Schirle, M., Keilholz, W., Rammensee, H. G. & Stevanovic, S. (1999) Immunogenetics 49, 996-999). Se compararon los cromatogramas de la HPLC de la línea celular sin transfectar y el clon de ciclina D1 de Ii de Awells (figura 3). Algunas diferencias menores, en su mayoría cuantitativas, en el repertorio de péptidos presentados por HLA-DR dieron como resultado trazas UV ligeramente diferentes, como se muestra en la figura 3. Tal y como esperábamos, no se pudieron asignar señales UV diferenciadas a los péptidos presentados exclusivamente por los agentes de transfección. Las únicas diferencias sutiles en la presentación de péptidos restringidos por HLA-DR entre Awells y las líneas transfectadas también se detectaron mediante análisis MALDI-TOF, en el que la mayoría de las fracciones de la HPLC contenían modelos idénticos. La figura 4 muestra el análisis por espectrometría de masas de la única fracción con una señal individual diferenciada (m/z: 1732,96), que sólo se produjo en la mezcla de péptidos eluida de la línea transfectada de queratina 18 y que representaba un péptido derivado de la queratina 18. En la figura 5, la señal m/z de 1370.1 indica un péptido presentado exclusivamente a partir del agente de transfección de la ciclina D1. Ambos péptidos se analizaron más detalladamente mediante ESI MS/MS de nanoflujo (MS en tándem). Los inventores pudieron identificar los péptidos NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1) (ciclina D1_{198-212}) (figura 6) y SHYFKIIEDLRAQI (SEQ ID n.º 2) (queratina 18_{126-139}) derivados de las dos proteínas de fusión transfectadas, respectivamente. Las secuencias se verificaron mediante espectros de masas de los péptidos sintéticos correspondientes.

Generación y caracterización de una línea celular de linfocitos T específica de un péptido

Con el fin de establecer una prueba de concepto para la identificación de péptidos novedosos derivados de HLA de clase II, asociados a tumores y supuestamente inmunógenos, se indujeron linfocitos T específicos para el péptido identificado de ciclina D1 mediante estimulación in vitro con el correspondiente péptido sintético cargado en células dendríticas HLA-DR4^{+}. Después de las (re)estimulaciones in vitro tercera y quinta, respectivamente, se evaluó la especificidad de la línea celular de linfocitos T colaboradores. Los linfocitos T se estimularon específicamente con el péptido de ciclina D1, como se muestra en la figura 7 (panel superior). Los linfocitos T proliferaron en respuesta a PBMC autólogas cargadas con el péptido de ciclina D1 (SI = 5,4). Como control positivo, PHA indujo una fuerte proliferación de linfocitos T (SI = 330). Los inventores analizaron a continuación qué tipo de linfocitos T colaboradores (Th1 o Th2) se estimuló en respuesta al péptido mediante un examen del perfil de la citocina. Como también se muestra en la figura 7 (panel inferior), los linfocitos T produjeron IL-2 en respuesta al péptido, aunque en poca proporción, al mismo tiempo que continuaban sensibilizados ante la estimulación de PHA. Al contrario, la estimulación de los linfocitos T inducida por el péptido dio como resultado una fuerte secreción de IFN-\gamma (3250 pg/ml, fig. 7C) pero ninguna secreción de IL-4 o IL-6, aunque los linfocitos T continuaban sensibilizados de forma fuerte y moderada ante la secreción de citocina inducida por PHA, respectivamente. En la figura 8 se presenta la estimulación con un péptido sin relación alguna como control negativo para la eventual activación indeterminada de linfocitos T colaboradores con receptores de linfocitos T específicos de HLA-DR4/ciclina D1_{198-212}. En conclusión, la línea celular establecida de linfocitos T colaboradores CD4^{+} es específica para el péptido de ciclina D1_{198-212} y es del tipo Th1. Este tipo es especialmente importante para ayudar a los linfocitos T citotóxicos CD8^{+} específicos a eliminar células
tumorales.

La línea celular de linfocitos T colaboradores específicos del péptido también reconoce las células transfectadas con ciclina D1

Debido a que las células Awells y la línea de linfocitos T no se igualan perfectamente en HLA, evaluamos primero si podía darse alguna reacción alogénica al cultivar ambos. Resumidamente, se cultivaron de forma conjunta distintos números de células de agentes de transfección de Awells-Ii-queratina 18 o Awells-Ii-ciclina D1irradiados, en presencia de un número constante de PBMC del donante de linfocitos T, y se midió la proliferación celular así como la secreción de IL-2, IL-4, IL-6 e IFN-\gamma. Ambos agentes de transfección indujeron una proliferación moderada de los linfocitos T en números elevados células, pero no se observó secreción de citocina (no se muestran datos). Decidimos utilizar una proporción de (linfocitos T efectores)/(células diana) de 5/1, en la que sólo se observó una ligera proliferación de linfocitos T en ausencia de secreción de citocina. Como consecuencia, la activación de los linfocitos T con resultado de secreción de citocina sólo se pudo inducir específicamente mediante el antígeno cognado presentado por el agente de transfección.

La línea celular de linfocitos T colaboradores específica para el péptido de ciclina D1 pudo reconocer las células transfectadas que sobreexpresaban la proteína de ciclina D1 y procesaban y presentaban de forma natural el péptido de ciclina D1 en asociación con las moléculas HLA-DR. Tal y como se muestra en la figura 8, los agentes de transfección Awells-Ii-ciclina D1 pudieron activar específicamente la línea celular de linfocitos T colaboradores como se observa por la secreción de IL-2 (SI = 40). Por el contrario, los agentes de transfección de Awells-Ii-queratina 18 (utilizados como control negativo para la estimulación de linfocitos T y que presentan el péptido_{126-139} no relacionado de queratina 18, en asociación con HLA-DR) no indujeron la activación de linfocitos T, lo que indica que la línea celular de linfocitos T colaboradores específica del péptido reconoce específicamente el antígeno cognado. Además, estos resultados demuestran que el péptido de ciclina D1 utilizado en la presente invención es un péptido procesado de forma natural que contiene un epítopo de linfocitos T. Esta activación se pudo inhibir (en un 71,2%) mediante al presencia del anticuerpo de bloqueo L243 específico de HLA-DR.

Producción de linfocitos citotóxicos activados (CTL) utilizando moléculas de clase II y el antígeno peptídico ciclina D1_{198-212} y su administración

Los linfocitos T citotóxicos activados (CTL) se producen utilizando moléculas HLA-DR de clase II y el péptido de ciclina D1_{198-212} (SEQ ID n.º 1).

En general, el método descrito en la solicitud de patente de PCT WO 93/17095 se utiliza para producir los CTL. Las células Awells se utilizan para presentar el antígeno peptídico a las CTL. La molécula HLA-DR se expresa en las células Awells. El péptido evaluado se sintetiza en un sintetizador de Applied Biosystems, ABI 431A (Foster City, CA, EUA) y se purifica posteriormente mediante HPLC. Como se describe en detalle en WO 93/17095, con el fin de optimizar las condiciones in vitro para la generación de linfocitos T citotóxicos específicos, el cultivo de células de estimulación se mantiene en un medio apropiado. Las células de estimulación son células Awells, que son mantenidas, preferentemente, en un medio sin suero (por ejemplo, Excell 400).

\newpage

Antes de la incubación de las células de estimulación con las células que se desean activar -es decir, células CD4^{+} precursoras-, se añade una cantidad de péptidos antigénicos al cultivo de células de estimulación, suficiente para cargarse en las moléculas de clase II humanas para su expresión en la superficie de las células de estimulación. Una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permite que unas 200 o, preferentemente 200 o más, moléculas MHC humanas de clase II cargadas con el péptido sean expresadas en la superficie de cada célula de estimulación. Las células de estimulación se incuban habitualmente con >20 pg/ml de péptido.

Las células CD4^{+} precursoras o en reposo se incuban a continuación en un cultivo con las células de estimulación adecuadas durante un periodo de tiempo suficiente para activar las células CD4^{+}. Las células CD4^{+} se activarán así de forma específicamente antigénica. La proporción de células (efectoras) CD4^{+} precursoras o en reposo y de células de estimulación puede variar de individuo a individuo y puede depender de variables como la propensión de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo. El linfocito: la proporción de la célula de estimulación (célula Awells) se encuentra habitualmente en un rango aproximado de 30: 1 y 300: 1. Por ejemplo, 3 x 10^{1} PBL humanas y 1 x 10^{6} células Awells vivas se añaden y mantienen en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640.

El cultivo efector/estimulador se mantiene el tiempo necesario para estimular un número de linfocitos CD4^{+} efectivo o utilizable terapéuticamente. El tiempo óptimo habitual es entre uno y cinco días, con un "plateau", es decir, un nivel de activación "máximo" específico de CD4^{+}, que normalmente se observa tras cinco días de cultivo. La activación in vitro de los linfocitos CD4^{+} se detecta habitualmente en un periodo de tiempo breve tras la transfección de un línea celular. La expresión transitoria en una línea celular transfectada capaz de activar linfocitos CD4^{+} se detecta en las 48 horas siguientes a la transfección. Esto indica claramente que tanto los cultivos estables como los transitorios de células transformadas que expresan moléculas MHC humanas de clase II son efectivos para activar células CD4^{+}.

Los linfocitos CD4^{+} activados pueden separarse de forma efectiva de las células de estimulación (Awells) utilizando anticuerpos monoclonales específicos para las células de estimulación, para los péptidos cargados en las células de estimulación o para los linfocitos CD4^{+} (o una parte de los mismos) para unir su ligando complementario adecuado. Las moléculas de anticuerpos etiquetados se extraen entonces de la mezcla de células efectoras de estimulación mediante métodos de inmunoprecipitación o inmunoensayo.

Las cantidades citotóxicas efectivas de los linfocitos CD4^{+} activados pueden variar según se utilicen in vivo o in vitro, o según la cantidad y el tipo de células diana de estas células citotóxicas. Para humanos adultos se utilizan una cantidad aproximada de entre 1 x 10^{6} y 1 x 10^{12} de CTL activadas.

Los linfocitos CD4^{+} activados se recogen del cultivo de células Awells antes de la administración de linfocitos CD4^{+} al individuo en tratamiento.

Para volver a introducir componentes celulares se utilizan métodos como los ilustrados en los documentos US Patent n.º 4.844.893 de Honsik y col. y US Patent n.º 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, es apropiada la administración de linfocitos CD8 activados mediante infusión intravenosa.

TABLA 1 Epítopos de péptidos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores en la presente invención

1

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<110> Immatics biotechnologies GmbH

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<120> Epítopos inmunógenos de linfocitos T colaboradores de antígenos de tumor humanos y utilización de dichos epítopos en métodos inmunoterapéuticos

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<130> FB14464

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<160> 338

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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23

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<210> 2

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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25

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<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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26

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<210> 5

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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27

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<210> 6

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<211> 17

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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28

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<210> 7

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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29

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<210> 8

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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30

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<210> 9

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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31

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<210> 10

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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32

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<210> 11

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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33

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<210> 12

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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34

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<210> 13

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<211> 16

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\hskip1cm

87

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\hskip1cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip1cm

89

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

91

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

92

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

93

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

94

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

95

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

96

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

97

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm

98

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip1cm

107

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm

109

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip1cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\hskip1cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\hskip1cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\hskip1cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\hskip1cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip1cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\hskip1cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\hskip1cm

137

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\hskip1cm

138

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

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<211> 16

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\hskip1cm

139

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\hskip1cm

140

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\hskip1cm

141

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\hskip1cm

142

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\hskip1cm

143

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\hskip1cm

144

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\hskip1cm

145

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\hskip1cm

146

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\hskip1cm

148

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\hskip1cm

149

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\hskip1cm

150

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\hskip1cm

151

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\hskip1cm

152

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\hskip1cm

153

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\hskip1cm

154

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\hskip1cm

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\hskip1cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\hskip1cm

157

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

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<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\hskip1cm

158

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\hskip1cm

159

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\hskip1cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\hskip1cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\hskip1cm

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\hskip1cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\hskip1cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\hskip1cm

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\hskip1cm

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\hskip1cm

168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\hskip1cm

169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\hskip1cm

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\hskip1cm

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\hskip1cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\hskip1cm

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\hskip1cm

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\hskip1cm

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\hskip1cm

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\hskip1cm

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\hskip1cm

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\hskip1cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\hskip1cm

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\hskip1cm

182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\hskip1cm

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\hskip1cm

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\hskip1cm

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\hskip1cm

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\hskip1cm

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\hskip1cm

189

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\hskip1cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\hskip1cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\hskip1cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\hskip1cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\hskip1cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\hskip1cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\hskip1cm

200

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\hskip1cm

201

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\hskip1cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\hskip1cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\hskip1cm

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\hskip1cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\hskip1cm

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\hskip1cm

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\hskip1cm

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\hskip1cm

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\hskip1cm

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\hskip1cm

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\hskip1cm

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\hskip1cm

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\hskip1cm

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\hskip1cm

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\hskip1cm

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\hskip1cm

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\hskip1cm

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\hskip1cm

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\hskip1cm

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\hskip1cm

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\hskip1cm

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\hskip1cm

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\hskip1cm

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\hskip1cm

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\hskip1cm

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\hskip1cm

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\hskip1cm

233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\hskip1cm

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\hskip1cm

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\hskip1cm

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\hskip1cm

237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\hskip1cm

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\hskip1cm

239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\hskip1cm

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\hskip1cm

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\hskip1cm

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\hskip1cm

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\hskip1cm

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\hskip1cm

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\hskip1cm

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\hskip1cm

247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\hskip1cm

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\hskip1cm

249

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\hskip1cm

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\hskip1cm

251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\hskip1cm

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\hskip1cm

253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\hskip1cm

254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\hskip1cm

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\hskip1cm

256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\hskip1cm

257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\hskip1cm

258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\hskip1cm

259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\hskip1cm

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\hskip1cm

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\hskip1cm

262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\hskip1cm

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\hskip1cm

264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\hskip1cm

265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\hskip1cm

266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\hskip1cm

267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\hskip1cm

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\hskip1cm

269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\hskip1cm

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

271

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\hskip1cm

272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\hskip1cm

273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\hskip1cm

274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\hskip1cm

275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\hskip1cm

276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\hskip1cm

277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\hskip1cm

278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\hskip1cm

279

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\hskip1cm

280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

281

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\hskip1cm

282

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\hskip1cm

283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\hskip1cm

284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\hskip1cm

285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\hskip1cm

286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\hskip1cm

287

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

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<211> 17

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\hskip1cm

288

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\hskip1cm

289

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\hskip1cm

290

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\hskip1cm

291

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\hskip1cm

292

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\hskip1cm

293

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\hskip1cm

294

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\hskip1cm

295

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\hskip1cm

296

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\hskip1cm

297

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\hskip1cm

298

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\hskip1cm

299

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

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<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\hskip1cm

300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\hskip1cm

301

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\hskip1cm

302

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\hskip1cm

303

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\hskip1cm

304

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\hskip1cm

305

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\hskip1cm

306

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\hskip1cm

307

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\hskip1cm

308

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\hskip1cm

309

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\hskip1cm

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\hskip1cm

311

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\hskip1cm

312

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

\hskip1cm

313

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

\hskip1cm

314

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\hskip1cm

315

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\hskip1cm

316

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

\hskip1cm

317

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

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<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

318

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

\hskip1cm

319

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

\hskip1cm

320

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\hskip1cm

321

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\hskip1cm

322

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

\hskip1cm

323

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\hskip1cm

324

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\hskip1cm

325

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\hskip1cm

326

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

\hskip1cm

327

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

328

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

\hskip1cm

329

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

\hskip1cm

330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\hskip1cm

331

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\hskip1cm

332

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

\hskip1cm

333

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\hskip1cm

334

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

\hskip1cm

335

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

\hskip1cm

336

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

\hskip1cm

337

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\hskip1cm

338

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

\hskip1cm

339

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

\hskip1cm

340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

\hskip1cm

341

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

\hskip1cm

342

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

\hskip1cm

343

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

\hskip1cm

344

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\hskip1cm

345

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\hskip1cm

346

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\hskip1cm

347

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

\hskip1cm

348

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 327

\hskip1cm

349

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 328

\hskip1cm

350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 329

\hskip1cm

351

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 330

\hskip1cm

352

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 331

\hskip1cm

353

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 332

\hskip1cm

354

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 333

\hskip1cm

355

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 334

\hskip1cm

356

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 335

\hskip1cm

357

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 336

\hskip1cm

358

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 337

\hskip1cm

359

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 338

\hskip1cm

360

Claims

1. Un péptido asociado a tumor con una longitud de entre 15 y 30 aminoácidos, que comprende un aminoácido contiguo conforme a SEQ ID n.º 1.

2. El péptido asociado a tumor conforme a la reivindicación 1, que consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID n.º 1.

3. El péptido asociado a un tumor conforme a las reivindicaciones 1 ó 2, que tiene la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II, en particular a HLA-DR4.

4. El péptido asociado a tumor conforme a la reivindicación 3, en donde, cuando está unido a HLA-DR, es capaz de provocar la producción de un linfocito T citotóxico (CTL) que reconoce una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende la secuencia dada de aminoácidos.

5. El péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el péptido incluye enlaces no peptídicos.

6. El péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el péptido es una proteína de fusión que, en particular, comprende aminoácidos N-terminal de la cadena invariante (Ii) asociada a un antígeno HLA-DR.

7. Un ácido nucleico que consiste en la región codificante para un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. El ácido nucleico conforme a la reivindicación 7', que es ADN, ADNc, PNA, CNA, RNA o combinaciones de los mismos.

9. Un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8.

10. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 9.

11. La célula huésped conforme a la reivindicación 10 que es una célula Awells recombinante.

12. Un método para producir un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. El método comprende el cultivo de la célula huésped conforme a la reivindicación 11 y el aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.

13. Una composición farmacéutica que comprende un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 9 para su uso en medicina.

15. Una vacuna contra el cáncer que comprende un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 9.

16. El uso de un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

17. Un método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vitro, método que comprende el contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de clase II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

18. El método conforme a la reivindicación 17, en la que el antígeno se carga en moléculas MHC de clase II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada por medio de la puesta en contacto de una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.

19. El método conforme a la reivindicación 17, en la que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión conforme a la reivindicación 11.

20. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 en las que la molécula MHC de clase II es HLA-DR4.

21. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos mediante el método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que, de forma selectiva, reconocen una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

22. Un receptor de linfocitos T (TCR) que reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, pudiéndose obtener el TCR del linfocito T citotóxico (CTL) de la reivindicación 21.

23. El uso de linfocitos T citotóxicos como se definió en la reivindicación 21 en la fabricación de un medicamento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

24. El uso de un péptido asociado a tumor o de un ácido nucleico o de linfocitos T citotóxicos conforme a la reivindicación 21 para fabricar un medicamento para destruir células diana en un paciente en el que las células diana son células de cáncer.

25. El uso conforme a la reivindicación 24 en el que dicho cáncer es cáncer renal que expresa de forma aberrante el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.