ES2319320T3 - Dispositivos analiticos con vias de flujo primaria y secundaria. - Google Patents

Dispositivos analiticos con vias de flujo primaria y secundaria. Download PDF

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Abstract

Un dispositivo analítico para realizar un ensayo para determinar la presencia o cantidad aproximada de un analito en una muestra líquida, comprendiendo el dispositivo: una vía de flujo primaria; una zona de captura, capaz de inmovilizar el analito dentro de la vía de flujo primaria; y una vía de flujo secundaria; en el que la única fuente de líquido de la vía de flujo secundaria es a partir de la vía de flujo primaria, y que se caracteriza porque: la vía de flujo secundaria está contigua a la vía de flujo primaria sólo en una confluencia única, aguas arriba de la zona de captura.

Description

Dispositivos analíticos con vías de flujo primaria y secundaria.
Antecedentes de la invención
Las interacciones entre ligando y receptor (que incluyen, por ejemplo, interacciones anticuerpo-antígeno, hibridación de ácidos nucleicos, interacciones sustrato de enzima/enzima, moléculas pequeñas/moléculas grandes e interacciones entre proteínas de unión y ácidos nucleicos) se pueden detectar usando etapas que consiguen: (1) introducir una muestra líquida en un dispositivo, (2) marcar al menos una parte de un analito presente en la muestra haciendo reaccionar la muestra con un reactivo de unión (denominado en este documento "etiqueta") del analito; (3) poner en contacto la muestra que contiene cualquier analito marcado con un reactivo de captura de analito, retirando de ese modo al menos una parte del analito de interés marcado del volumen de la muestra que no ha reaccionado; (4) retirar especies que no han reaccionado (por ejemplo, etiqueta o analito que no ha reaccionado) de la región del dispositivo que contiene el reactivo de captura de analito y (5) detectar y/o analizar la presencia del analito capturado en la región que contiene el reactivo de captura de analito.
Una clase de dispositivos para conducir tales ensayos de receptor y ligando usan material poroso a través de todo el ensayo. Típicamente en estos dispositivos, todos los reactivos (por ejemplo, reactivos de marcaje y reactivos de captura) se localizan sobre o en uno o más materiales porosos que están en comunicación fluida entre sí. La muestra líquida fluye a través de los materiales porosos y allí ocurren las interacciones entre la muestra y los reactivos. Típicamente, cada reactivo dentro de estos dispositivos se localiza en una zona específica sobre o en el material poroso. Típicamente, se introduce muestra líquida en el material poroso y a partir de entonces se mueve a través de las zonas por ejemplo, por migración capilar. Un ejemplo de este dispositivo de ensayo es un ensayo de flujo lateral o de tiras. Tales dispositivos de flujo lateral pueden comprender más de una pieza de material poroso en cuyo caso las tiras típicamente están alineadas en serie (frecuentemente en una relación de superposición la una con la otra) para formar una vía de flujo única, sustancialmente recta y continua dentro del dispositivo.
Los dispositivos de flujo lateral ilustrativos se describen por ejemplo en las Patentes de Estados Unidos Nº
4.943.522, Eisenger, et al., 5.096.837, Fan et al., 5.223.220, Fan et al., 5.521.102, Boehringer, et al., 5.766.961, Pawlak, et al. y 5.770.460, Pawlak, et al.. En las Patentes de Estados Unidos Nº 6.485.982, Charlton, et al., 6.352.862, Davis, et al., 5.622.871, May, et al., 5.656.503, May et al. y 6.534.320, Ching et al. se describen dispositivos de flujo lateral adicionales.
Típicamente, tales dispositivos de flujo lateral emplean un marcador visualmente detectable, tal como una solución coloidal de un metal o una perla de látex coloreada, para visualizar el analito capturado. Sin embargo tales marcadores tienen que estar presentes en la zona de captura en una cantidad suficiente para que se puedan ver, lo que a su vez requiere que esté presente una cantidad mínima de analito en la muestra y que se capture en la zona de captura. Por el contrario, los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), que emplean sistemas marcadores basados en enzimas y generalmente se conducen en un formato de placas, son típicamente más sensibles que tales dispositivos de flujo lateral, pero requieren múltiples etapas para efectuar el ensayo, que requieren en particular reacciones secuenciales y uno o más lavados entre tales reacciones.
Por tanto, aunque los sistemas de ensayo de tipo ligando/receptor tanto de flujo lateral como ELISA son útiles, cada uno tiene ciertas desventajas. Por lo tanto, se necesitan en la técnica dispositivos que puedan proporcionar flexibilidad con respecto a la elección del marcador en un formato de ensayo de una etapa, por ejemplo, permitiendo las reacciones secuenciales y/o el flujo de líquido con funcionalidad de una etapa. La presente invención aborda ésta y otras necesidades.
La referencia a documentos en este documento no pretende ser un reconocimiento de que cualquiera es técnica anterior pertinente. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación y en cuanto al contenido de los documentos se basa en la información disponible para el solicitante y no constituye reconocimiento alguno en cuanto a la exactitud de las fechas o contenido de los documentos.
El documento US 6.689.317 B1 describe un aparato de ensayo analítico para inmunoensayo que comprende una zona para recibir una muestra que contiene un analito, una zona para recibir una fase móvil, un medio de detección para permitir la detección del analito mediante inmunorreacción, una primera vía de flujo para el flujo del analito en la fase móvil desde la zona de recepción de muestra hasta el medio de detección y una segunda vía de flujo que permite el flujo de una fase móvil hasta el medio de detección.
El documento US 2004/152207 A1 describe un inmunoensayo enzimático de una etapa en el que el conjugado enzima/anticuerpo o marcador y el sustrato de enzima están separados hasta que se termina la separación del conjugado de enzima unida y libre o marcador. Esta separación se consigue mediante el uso de vías de flujo variables, la inmovilización del sustrato en la línea de ensayo, la colocación del sustrato en un saco o la asociación con una capa de partícu-
las, la captura química del producto de enzima, la disolución de la zona de retraso y sustratos de enzima protegidos.
El documento US 6.436.722 B1 describe un dispositivo para realizar un ensayo que comprende dos vías de flujo separadas establecidas en serie en el dispositivo con una etapa de activación de usuario única. Se configura una primera vía de flujo para suministrar una muestra y reactivos de unión solubles conjugados a una fase sólida. Se configura una segunda vía de flujo para dejar que un reactivo de lavado retire el conjugado y la muestra que no se han unido de la fase sólida a un absorbente y opcionalmente suministrar reactivos de detección. Se evita que la mezcla de muestra/conjugado en la primera vía de flujo entre a la segunda vía de flujo porque la energía capilar y de superficie de la segunda vía de flujo evita que esta mezcla la humedezca.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona dispositivos analíticos y métodos para realizar un ensayo para determinar la presencia o cantidad aproximada de al menos un analito en una muestra líquida. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, descritas en este documento, la vía de flujo secundaria comprende material no poroso y la vía de flujo primaria comprende materiales porosos y no porosos. Algunos dispositivos de la presente invención comprenden además una zona de marcaje localizada en la vía de flujo primaria, aguas arriba de la zona de captura y aguas abajo de la confluencia de las vías de flujo secundaria y primaria.
En algunas realizaciones de la presente invención, el dispositivo comprende además un absorbente (material absorbente) aguas abajo de y en comunicación fluida con la zona de captura, en el que la extracción del líquido desde la vía de flujo secundaria hacia la vía de flujo primaria se facilita mediante la absorción del líquido por el material absorbente.
En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, se localizan uno o más reactivos en la vía de flujo secundaria. Los reactivos ilustrativos incluyen sin limitación, reactivos de marcaje (tales como, sustratos de enzimas), reactivos acondicionantes, reactivos de control, reactivos de fin de ensayo y/o reactivos de referencia.
En algunas realizaciones ilustrativas descritas en este documento, la zona de marcaje está en relación con un material no poroso y la zona de captura está en relación con un material poroso.
En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, la etiqueta está enlazada a un marcador detectable. En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, la etiqueta está enlazada a un marcador visualmente detectable. En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, la etiqueta está enlazada a una enzima, que cuando se pone en contacto con un sustrato de enzima, convierte el sustrato de enzima en un marcador detectable. En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, la vía de flujo secundaria comprende el sustrato de enzima. Provechosamente, tales dispositivos proporcionan un inmunoensayo basado en enzima de una etapa real.
En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, la etiqueta comprende un primer elemento de enlace. Y un marcador, localizado en la vía de flujo secundaria, comprende un resto detectable y un segundo elemento de enlace acoplado al mismo, donde el primer elemento de enlace y el segundo elemento de enlace pueden unirse o, de otra manera, asociarse entre sí. En algunas realizaciones, el resto detectable es un resto coloreado. En algunas realizaciones, uno del primer elemento de enlace y segundo elemento de enlace es biotina y el otro es (estrept)avidina.
En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, el dispositivo comprende al menos dos vías de flujo secundarias en comunicación fluida con la vía de flujo primaria, donde cada vía de flujo secundaria forma sólo una confluencia con la vía de flujo primaria y la zona de marcaje se localiza aguas abajo de las confluencias. En tales realizaciones cada una de las vías de flujo secundarias puede comprender reactivos iguales o diferentes o no contener reactivos en absoluto.
En algunas realizaciones de la presente invención, los dispositivos comprenden además una zona de control localizada en la vía de flujo primaria. Particularmente cuando el dispositivo se usa para detectar un analito único en una muestra líquida, la zona de control en tal dispositivo preferiblemente se localiza aguas abajo de la zona de captura. Como se describe en otros lugares en este documento, la zona de control preferiblemente comprende un reactivo de control paralizante capaz de inmovilizar la etiqueta o un reactivo de control separado. Los reactivos de control se pueden localizar en una vía de flujo primaria o secundaria y pueden comprender un resto directamente o indirectamente detectable. El reactivo de control es preferiblemente sustancialmente movible cuando se pone en contacto con la muestra líquida.
En algunas realizaciones de los dispositivos descritos en este documento, dentro de la vía de flujo secundaria se comprende un reactivo de control que comprende un resto detectable, un reactivo que es sustancialmente movible cuando se pone en contacto con la muestra líquida. En tales realizaciones, el dispositivo comprende además una zona de control localizada en la vía de flujo primaria aguas abajo de la zona de captura y comprende un reactivo de control paralizante que puede unirse al reactivo de control detectable para que se pueda determinar un flujo de la muestra líquida desde la vía de flujo primaria a la vía de flujo secundaria y después de vuelta a la vía de flujo primaria a través de la zona de control.
En realizaciones adicionales de la presente invención, los dispositivos comprenden una zona de fin de ensayo localizada en la vía de flujo primaria y aguas abajo de la zona de captura y, cuando están presentes cualquiera de las zonas de control. La zona de fin de ensayo comprende un resto capaz de producir una señal detectable cuando se pone en contacto con la muestra, indicando de ese modo la llegada de la muestra a la zona de fin de ensayo y un tiempo adecuado para determinar el resultado del ensayo.
En realizaciones alternativas de los dispositivos descritos en este documento, el orificio de muestra está en comunicación fluida con una cámara a nivel inferior al nivel de la zona de marcaje y la cámara está en comunicación fluida con la vía de flujo para que la muestra entre a la vía de flujo desde el fondo de la vía de flujo entre la vía de flujo secundaria y la zona de marcaje (es decir, la confluencia de la vía de flujo secundaria y la vía de flujo primaria). En esta realización, la muestra líquida se fracciona con una parte de la muestra fluyendo aguas abajo hacia el contacto con la zona de marcaje y una segunda parte fluyendo aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria (poniéndose en contacto con cualquiera de los reactivos localizados allí dentro).
En todavía otras realizaciones de la presente invención, los dispositivos comprenden además una carcasa para encerrar la vía de flujo, comprendiendo la carcasa cualquiera o todos los siguientes:
i)
un orificio de entrada de muestra para recibir una muestra acuosa;
ii)
uno o más agujeros de ventilación para facilitar el flujo deseado de muestra; y
iii)
medios de acceso de lectura para permitir la lectura de la zona de captura y/o la zona de control y/o la zona de fin de ensayo.
La presente invención ha proporcionado además métodos para la detección de un analito en una muestra líquida que emplean los dispositivos de la presente invención. A modo de ejemplo, en una realización, el método comprende aplicar una muestra líquida a un dispositivo de la presente invención que comprende una zona de captura y determinar la presencia o cantidad aproximada de un analito en la zona de captura.
En realizaciones adicionales de la presente invención, se proporcionan métodos que comprenden aplicar una muestra líquida a un dispositivo de la presente invención para que una parte de la muestra líquida fluya a través de la vía de flujo primaria hasta una zona acondicionante (si existe) después hasta una zona de marcaje, donde se moviliza la etiqueta y reacciona con analito presente en la muestra, después fluye hasta la zona de captura, donde se captura al menos una parte del analito marcado y después fluye a través de cualquiera de las zonas restantes hasta el final del ensayo; y una segunda parte de la muestra líquida fluye hacia una vía de flujo secundaria del dispositivo, donde se moviliza el marcador; y dicha segunda parte de muestra líquida sale posteriormente de dicha vía de flujo secundaria y hacia dicha vía de flujo primaria hasta dicha zona de captura, donde dicho marcador reacciona con el analito marcado capturado para generar una señal visiblemente detectable que indica la presencia o cantidad aproximada de analito presente en la muestra.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-E ilustran configuraciones ilustrativas de vías de flujo secundarias y una parte de una vía de flujo primaria de dispositivos analíticos de acuerdo con la presente invención. En particular, se ilustran realizaciones ilustrativas de una parte no porosa de dispositivos de acuerdo con la presente. En estas figuras, los agujeros de ventilación y un sitio de aplicación de muestra (orificio de entrada de muestra) se indican como huecos. Cada una de las vías tiene por objeto estar en comunicación fluida con la zona de captura (no mostrada) localizada aguas abajo de la zona de marcaje (en la parte inferior de cada dibujo). La Figura 1A ilustra dos vías de flujo secundarias cada una ramificándose a partir de un lado diferente de la vía de flujo primaria. La Figura 1B ilustra una vía de flujo primaria dividiéndose para pasar a lo largo de cada lado del extremo aguas arriba de una vía de flujo secundaria. En ambas Figuras 1A y 1B la muestra fluye inicialmente aguas abajo directamente a partir del orificio de entrada de muestra con una parte de la muestra fluyendo a partir de entonces aguas arriba hacia fuera de la vía de flujo primaria y hacia una o más vías de flujo secundarias. Las Figuras 1C, 1D y 1E ilustran realizaciones en las que la muestra fluye lateralmente a partir del orificio de entrada de muestra y después fluye tanto aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria como aguas abajo hacia el flujo primario. Como se ilustra en las figuras, estas realizaciones ilustrativas localizan la etiqueta y el sustrato (un componente marcador ilustrativo) en la estructura no porosa. La zona de captura, así como las zonas de control y de fin de ensayo, si están presentes, se localizan aguas abajo de la región ilustrada y, en algunas realizaciones se localizan sobre o en un material poroso.
Las Figuras 2-5 ilustran diversas configuraciones de vía de flujo y de reactivo para realizaciones diferentes de dispositivos analíticos de acuerdo con la presente invención. Aunque en estas figuras no se muestra material absorbente (típicamente posicionado al final del ensayo y en comunicación fluida con el mismo), se contempla el mismo. A modo de ejemplo, se puede poner un material absorbente entre la lámina recortada y la cubierta superior de la Figura 2A, en comunicación fluida con el material poroso pero sin solapar ninguna de las zonas de captura, de control o de fin de ensayo.
La Figura 2A ilustra un dispositivo analítico ilustrativo de la presente invención que comprende una parte no porosa de la vía de flujo en comunicación fluida con una parte porosa de la vía de flujo, donde la parte no porosa tiene una configuración similar a las realizaciones representadas en las Figuras 1C, D y E. En esta realización, la zona de marcaje se localiza en la parte no porosa del dispositivo aguas abajo de la confluencia de las vías de flujo primaria y secundaria. Los elementos de la cubierta superior, la lámina recortada y el soporte inferior ilustrados (así como elementos similares ilustrados en otras figuras) están sombreados con el propósito de proporcionar contraste a las figuras. Los especialistas en la técnica apreciarán que la cubierta superior en particular es preferiblemente transparente y/o incluye un recorte adicional encima de las zonas de captura, de control y/o de fin de ensayo para que el usuario pueda observar esas zonas.
La Figura 2B representa una vista superior de la configuración de la parte de la vía de flujo porosa/no porosa de la realización representada en la Figura 2A, que incluye la colocación de reactivos en la misma. Esta figura ilustra la colocación de la vía de flujo secundaria aguas arriba (a la derecha en la figura) del orificio de entrada de muestra. En esta realización, una parte de la muestra líquida fluye desde el orificio de entrada de muestra, en primer lugar lateralmente y después aguas arriba, para ponerse en contacto con el sustrato. La parte restante de la muestra líquida fluye desde el orificio de entrada de muestra aguas abajo a la vía de flujo primaria y hacia el fin del ensayo. La flecha sólida localizada dentro de la parte no porosa del dispositivo ilustra el flujo inicial de la muestra y la línea discontinua indica el flujo retrasado y posterior desde la vía de flujo secundaria hacia la vía de flujo primaria.
La Figura 3A ilustra una vista despiezada de otra realización de un dispositivo analítico de acuerdo con la presente, cuya parte analítica es similar a la ilustrada en la Figura 2A. Sin embargo, en esta realización se añaden dos capas inferiores, un soporte inferior y una lámina recortada inferior, para crear una cámara de muestra debajo de la vía de flujo secundaria. Un soporte intermedio comprende láminas recortadas que permiten la comunicación fluida entre la cámara de la muestra y la parte recortada (analítica) superior del dispositivo. La Figura 3B proporciona una vista de sección transversal del dispositivo ensamblado ilustrado en la Figura 3A. Durante el funcionamiento, se aplica muestra líquida al orificio de muestra. La muestra fluye hacia abajo a través de recortes en la lámina recortada superior y el soporte intermedio y hacia la cámara de la muestra. Una vez que la muestra ha llenado la cámara de la muestra, ésta fluye a través del orificio de reentrada de la muestra hacia la parte analítica del dispositivo (el recorte superior). Después la muestra fluye tanto aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria como aguas abajo hacia la vía de flujo primaria para proporcionar el suministro secuencial de la muestra a la zona de captura de acuerdo con la presente. Esto se puede conseguir de diversas formas, por ejemplo, se puede conducir el flujo aguas abajo (es decir, flujo desde el orificio o canal de muestra hacia la zona de captura) mediante la acción capilar del componente poroso de la vía de flujo, mientras que el flujo aguas arriba (es decir, el flujo desde el orificio de muestra hacia la vía de flujo secundaria que comprende, por ejemplo, sustrato de enzima) se puede conducir mediante la acción capilar del canal hueco no poroso. Alternativamente, se puede añadir suficiente muestra líquida al orificio o canal de muestra para llenar el canal hueco no poroso y ponerse en contacto con el componente poroso de la vía de flujo. En el mismo ocurre un vaciado alternativo y fluido del canal hueco no poroso a medida que el componente poroso absorbe el fluido. Por tanto, en cualquier caso, una vez que no queda muestra en el orificio de entrada, entonces el componente poroso de la vía de flujo extrae la muestra desde la vía de flujo secundaria que comprende la zona de sustrato de enzima.
La Figura 3C representa una vista superior de la parte analítica (recorte superior) del dispositivo representado en la Figura 3A, sin la parte superior. Como en la Figura 2B, las flechas de líneas sólidas dentro de las vías de flujo indican el flujo inicial de líquido y las flechas de líneas discontinuas indican el flujo retrasado o secundario del líquido.
La Figura 4A ilustra una vista despiezada de una realización alternativa de un dispositivo de acuerdo con la presente invención que es similar al dispositivo ilustrado en las Figuras 2A y 2B pero donde la zona de marcaje se localiza en o sobre un material poroso en lugar de sobre un material no poroso. La Figura 4B representa una vista superior (mirando a través de la cubierta superior) de la parte analítica (o recorte) de la realización representada en la Figura 4A. Las flechas sólidas mostradas en la vía de flujo ilustran el flujo inicial de la muestra tanto aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria como aguas abajo hacia la vía de flujo primaria y las flechas de líneas discontinuas ilustran el flujo posterior o retrasado desde la vía de flujo secundaria hacia la vía de flujo primaria.
La Figura 5A es una vista despiezada de un dispositivo similar al ilustrado en la Figura 4A pero donde la zona de marcaje se localiza sobre o en un material poroso en lugar de sobre un material no poroso en la vía de flujo primaria. Como en la Figura 4A, se añaden dos capas inferiores para crear una cámara de muestra localizada debajo de la vía de flujo secundaria. La Figura 5B proporciona una sección transversal del dispositivo ensamblado ilustrado en la Figura 5A. De modo similar a la Figura 4B, la muestra aplicada al orificio de entrada fluye hacia abajo hacia la cámara de muestra entrando en la parte analítica (recorte superior) del dispositivo por el orificio de reentrada de muestra. Después la muestra fluye tanto aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria como aguas abajo hacia la vía de flujo primaria. Posteriormente, la muestra localizada en la vía de flujo secundaria fluye hacia la vía de flujo primaria y a través de la misma hasta el final del ensayo. La Figura 5C ilustra una vista superior, a través de la cubierta, de la parte analítica (recorte superior) de la realización de la Figura 5A. Las flechas sólidas mostradas en la vía de flujo ilustran el flujo inicial de la muestra tanto aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria como aguas abajo hacia la vía de flujo primaria y las flechas de líneas discontinuas ilustran el flujo posterior o retrasado desde la vía de flujo secundaria hacia la vía de flujo primaria.
La Figura 6 ilustra una vista despiezada de un dispositivo analítico de acuerdo con la presente invención y el orden de ensamblaje ilustrativo del mismo. En particular, se ilustra un soporte inferior no poroso que tiene tres reactivos impresos sobre el mismo; el sustrato (un componente marcador ilustrativo), localizado en la vía de flujo secundaria y un reactivo acondicionante y una etiqueta, localizados en la vía de flujo primaria. La lámina recortada se fija a la parte superior de este soporte inferior. El material poroso se pone dentro del recorte donde se ilustra. Una cubierta intermedia se localiza encima del recorte con el agujero de ventilación localizado en el extremo aguas arriba de la vía de flujo secundaria. Se pone un absorbente encima de y en comunicación fluida con el material poroso aguas abajo de la zona de control. Finalmente, se alinea una cubierta superior, que comprende preferiblemente recortes para el orificio de muestra, el agujero de ventilación y una o más ventanas de lectura y se fija a la cubierta intermedia y la lámina recortada para formar un dispositivo terminado.
La Figura 7A ilustra una sección transversal de una realización adicional de un dispositivo analítico de la presente invención que emplea un sistema marcador no enzimático y que localiza la zona de marcaje en o sobre un material poroso. En esta figura, un marcador no enzimático, localizado en la vía de flujo secundaria, comprende perlas de látex coloreadas que tienen biotina acoplada a las mismas. Las perlas marcadas con biotina se localizan en el material no poroso para que el marcador sea móvil después de la aplicación de un fluido, tal como la muestra líquida. Aguas abajo de la vía de flujo secundaria, en la vía de flujo primaria, se localiza una etiqueta movible sobre o en el material poroso y comprende un anticuerpo que se puede unir al analito diana, un anticuerpo que está acoplado a (estrept)avidina. Aguas abajo de y en comunicación fluida con la zona de marcaje, un segundo anticuerpo, también capaz de unirse al analito diana, se inmoviliza sobre o en el material poroso para formar la zona de captura. Los especialistas en la técnica apreciarán que las zonas de marcaje y de captura se pueden localizar en materiales porosos iguales o diferentes, aunque con tal que si se emplea más de una pieza de material poroso, las piezas se colocarán en comunicación fluida la una con la otra.
Durante el funcionamiento del ensayo ilustrado en la Figura 7A, se aplica una muestra líquida al sitio de aplicación de muestra (u orificio de entrada de muestra) donde una parte fluye aguas arriba hacia la vía de flujo secundaria, movilizando el marcador de perlas de látex acoplado a biotina y la parte restante fluye aguas abajo hacia la vía de flujo primaria. En la vía de flujo primaria, la muestra entra en el material poroso, moviliza la etiqueta y, si está presente en la muestra, el analito se une al complejo (etiqueta) avidina-anticuerpo (Ab_{2}). Después el complejo avidina-Ab_{2}-analito fluye con la muestra hasta la zona de captura donde el anticuerpo de captura se une a, o captura, el complejo avidina-anticuerpo-analito, formando un sándwich que comprende etiqueta (avidina-Ab_{2}) (Ab_{1})-analito-anticuerpo anticuerpo de captura. A medida que la muestra líquida evacua la vía de flujo primaria, esa parte de la muestra localizada en la vía de flujo secundaria entra en la vía de flujo primaria trayendo consigo el marcador movilizado. La muestra de la vía de flujo secundaria entra en el material poroso y se pone en contacto con la zona de control. Después la parte de avidina de la etiqueta capturada se une a o captura el marcador de perlas de látex-biotina, cuya acumulación en la zona de captura da como resultado una señal visualmente detectable indicativa de la presencia de analito en la muestra. En la Figura 7A también se muestra un material absorbente localizado aguas abajo de la zona de captura que puede servir tanto como un "recipiente" para la muestra líquida como para facilitar el flujo a través del dispositivo analítico.
La Figura 7B ilustra una vista superior del dispositivo ilustrativo de la Figura 7A, donde se muestra el agujero de ventilación de aire de la vía de flujo secundaria, junto con el área o abertura para aplicación de muestra y una ventana de observación (o lectura) transparente, que se localiza encima de la zona de captura, para poder ver los resultados del ensayo.
La Figura 8 ilustra una vista superior y una vista de sección transversal de una realización de un dispositivo analítico de acuerdo con la presente invención. Se añade una muestra que se sospecha que contiene un analito diana al orificio de entrada de muestra del dispositivo y entra en el canal de entrada de la muestra. Una parte de la muestra líquida se mueve a través de la vía de flujo primaria hasta la zona acondicionante, zona de marcaje y después hasta las zonas de captura y control. En esta realización ilustrada, las zonas de captura y control se localizan sobre o en un material poroso, tal como una tira Porex®, mientras que las zonas de marcaje y acondicionante se localizan en un material no poroso.
A medida que la muestra líquida fluye a través de la vía de flujo primaria y se pone en contacto con la zona de marcaje, la etiqueta se moviliza y transporta con la muestra (en esta ilustración, que comprende una enzima) hacia el material poroso y a través de la zona de captura. Si hay analito presente en la muestra, formará un complejo con la etiqueta y el reactivo de captura inmovilizado localizado en la zona de captura lo capturará. Los especialistas en la técnica reconocerán que la etiqueta y el analito pueden formar un complejo antes o después de que el reactivo de captura los capture. Si no hay analito presente en la muestra, el reactivo de captura no capturará la etiqueta pero seguirá fluyendo con la muestra hasta el final del ensayo.
A medida que una parte de la muestra fluye a través de la vía de flujo primaria, la muestra restante fluye hacia una vía de flujo secundaria no porosa. El sustrato de enzima que la muestra moviliza se localiza en la vía de flujo secundaria. Provechosamente, la muestra dentro de la vía de flujo secundaria vuelve a entrar en la vía de flujo primaria posterior al flujo de muestra inicial hacia la vía de flujo primaria. Por tanto, la muestra de la vía de flujo secundaria, que comprende el sustrato de enzima, fluye a través del material poroso hasta la zona de captura y se pone en contacto con en analito marcado inmovilizado, después de lo cual la etiqueta (en esta ilustración, que comprende una enzima) reacciona con el sustrato de enzima para producir una señal detectable.
Una almohadilla absorbente al final del ensayo junto con agujeros de ventilación de aire laterales, como se ha ilustrado, facilitan el flujo de muestra a través del dispositivo. Un agujero de ventilación lateral en la vía de flujo secundaria facilita el flujo de muestra hacia dentro y hacia fuera de la vía de flujo secundaria. En la realización particular ilustrada, una ventana de lectura se localiza encima de las zonas de control y captura para permitir al usuario la inspección fácil de esas zonas para la determinación de los resultados del ensayo. Debajo de la cubierta superior y encima del material poroso se localiza una cubierta intermedia que forma la parte superior de la parte no porosa del dispositivo. Una capa inferior se extiende a lo largo de todo el dispositivo.
Los especialistas en la técnica apreciarán que los dispositivos ilustrados en estas figuras tienen por objeto ilustrar ciertos aspectos y/o configuraciones de dispositivos de acuerdo con la presente invención. No pretenden ser limitantes de ninguna manera con respecto a la configuración del dispositivo. A modo de ejemplo, ninguna de las Figuras 2 a 5 ilustra el material absorbente opcional al final del ensayo que se ilustra en las Figuras 6 a 8. Tal absorbente se puede incluir en los dispositivos ilustrados y análogamente se contempla en este documento. De forma similar, se pueden incluir reactivos y/o zonas adicionales y/o diferentes en dispositivos de acuerdo con la presente invención que se ilustran necesariamente en las figuras.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
"Analito" se refiere a cualquier sustancia que se puede detectar. Por ejemplo, un analito puede ser un componente de una muestra que se conserva y detecta deseablemente durante el funcionamiento del dispositivo analítico descrito en este documento (por ejemplo, una molécula, tal como una proteína, un antígeno o un anticuerpo, o una célula en una muestra) o un análogo o derivado del componente de una muestra. Por consiguiente, el componente de la muestra se puede detectar directamente o indirectamente, tal como mediante la detección de un derivado, análogo u otros restos que sean predictivos de la cantidad o presencia del componente.
Una "etiqueta" se refiere a una molécula detectable y movible que se puede unir a un analito o un derivado del mismo. Las etiquetas se pueden detectar directamente, por ejemplo como en el caso de una etiqueta que comprende un resto coloreado o se pueden detectar indirectamente, por ejemplo en el caso de una etiqueta que comprende una enzima.
"Marcador" se refiere a un resto detectable, que da como resultado una señal detectable visualmente o de otra manera. Los marcadores pueden estar asociados con un analito o un derivado de un analito directamente o indirectamente a través de una etiqueta específica para el analito o un complejo secundario de elementos de enlace. Un etiqueta puede comprender un marcador detectable directamente, por ejemplo, tal como, un anticuerpo específico de analito acoplado a una perla de látex coloreada (el marcador) u otro resto coloreado o una etiqueta puede comprender un componente marcador, tal como por ejemplo una enzima que requiera que un sustrato (segundo componente marcador) genere una señal detectable (tal como, una señal visual). El término "marcador" como se usa en este documento incluye componentes únicos de un sistema marcador, tales como enzimas y sustratos. El marcador puede ser incoloro pero capaz de producir una señal detectable cuando reacciona con otro componente de marcador, tal como por ejemplo, una enzima que actúa sobre un sustrato de enzima para generar una molécula coloreada. Como se usa en este documento "resto coloreado" incluye, sin limitación, partículas coloreadas, particulados coloreados y moléculas coloreadas. Los restos coloreados ilustrativos incluyen, sin limitación, soluciones coloidales de metales, látex coloreado y/o asociaciones químicas que incluyen moléculas coloreadas, tales como asociaciones de moléculas coloreadas enzima/anticuerpo/sustrato.
Un "elemento de enlace" se refiere a una molécula que interacciona, se une o se asocia de otra forma con una segunda molécula en una mezcla, diferente al analito. Como se usa en este documento, un primer y segundo elementos de enlace interaccionan entre sí. Los ejemplos de elementos de enlace incluyen dos moléculas cualesquiera con afinidad entre las mismas, por ejemplo, biotina y estreptavidina.
"Zona de marcaje" como se usa en este documento se refiere a una región en un dispositivo que comprende una etiqueta. Por ejemplo, la zona de marcaje puede comprender un anticuerpo que se puede unir al analito diana, donde el anticuerpo se asocia con un marcador, tal como por ejemplo un resto coloreado o con un componente de marcador, tal como una enzima.
"Zona de captura" se refiere a una región en un dispositivo que comprende reactivo inmovilizado ("reactivo de captura") que se puede unir directamente o indirectamente a un analito o a un derivado de un analito que se tiene que detectar. Típicamente, el reactivo de captura se pone en contacto, se une o se asocia de otra forma con un analito, un derivado del mismo o un complejo que comprende un analito o un derivado del mismo reteniendo de ese modo al analito o al complejo en la zona de captura. "Inmovilizado" en este contexto de reactivo de captura inmovilizado significa que una cantidad suficiente del reactivo de captura se queda en la zona de captura durante todo el procedimiento de ensayo para permitir la determinación de la presencia o cantidad aproximada del analito. El reactivo de captura no se tiene que quedar más allá del tiempo requerido para realizar tal determinación. La inmovilización del reactivo de captura en la zona de captura puede suceder por, pero sin limitación, unión covalente o adsorción. Cuando la zona de captura se localiza sobre y/o dentro de un material poroso, dependiendo de la naturaleza del material, se puede emplear la derivatización para permitir la unión covalente del reactivo de captura en la zona de captura, por ejemplo usando glutaraldehído o carbodiimida. No es necesario que el reactivo de captura se una directamente, químicamente, biológicamente o de otra forma, al material poroso. El reactivo de captura se puede unir a otro material, otro material que está inmovilizado físicamente en el material poroso para formar la zona de captura o de otra forma se fija en la zona de captura mediante cualquier medio físico, químico o bioquímico. Por ejemplo, los reactivos de captura pueden estar unidos covalentemente o pasivamente a perlas o similares y después las perlas se fijan sobre o se inmovilizan dentro del material poroso o, si se emplea un material no poroso se fijan sobre el material no poroso. Los especialistas en la técnica entenderán e implementarán fácilmente diversos métodos o procedimientos para inmovilizar el reactivo de captura sobre o dentro del material que comprende la zona de captura.
Un "derivado de un analito" se refiere a un producto que resulta de una modificación química o enzimática del analito o cualquier sustancia cuya concentración en la muestra es directamente proporcional al analito. Por ejemplo, el derivado de un analito puede ser un complejo del analito con un componente adicional que, a su vez, se une al reactivo de captura o con un componente adicional que sirve solamente para marcar el analito, pero no interfiere con la capacidad del analito de unirse al reactivo de captura. En otra ilustración, el derivado de un analito puede ser un producto de reacción formado en una relación estequiométrica con el analito en una reacción, donde el producto de la reacción se une al reactivo de captura.
"Aguas abajo" se refiere a la dirección, por ejemplo de flujo de líquido, lejos del punto de aplicación del líquido y hacia el final del ensayo.
"Aguas arriba" se refiere a la dirección, por ejemplo de flujo de líquido, lejos de en lugar de hacia el final del ensayo.
"Vía de flujo" se refiere a la ruta que sigue un fluido/líquido a medida que fluye, ya sea en una carcasa, en o sobre un componente o material no poroso y/o en o sobre un componente o material poroso. La vía de flujo puede ser una ruta única o incluir varias rutas, donde cada ruta puede apoyar el flujo de líquido simultáneamente, en serie o independientemente en relación a otras rutas y donde cada ruta puede o no fluir hacia una o más rutas. Las vías de flujo incluyen pasajes de líquido, cámaras, canales, conductos, matrices u otras estructuras en las que o a través de las cuales pueden viajar los fluidos. Una "vía de flujo primaria" se refiere a una vía de flujo que comprende comunicación fluida desde del extremo aguas arriba, donde entra una muestra, aguas abajo a través de la zona de captura hasta el final del ensayo. La vía de flujo primaria puede comprender adicionalmente una o más zonas acondicionantes, una zona de marcaje, una zona de control y una zona de fin de ensayo. Como se usa en este documento, una "vía de flujo secundaria" se refiere a una vía de flujo que forma una confluencia única con una vía de flujo primaria aguas arriba de una zona de captura y en la que una parte del líquido aplicado al dispositivo se mueve desde una vía de flujo primaria hacia una vía de flujo secundaria y después regresa a la vía de flujo primaria a medida que el líquido de la vía de flujo primaria se mueve a través del dispositivo. La vía de flujo secundaria puede comprender materiales porosos o no porosos o ambos.
Una "confluencia" se refiere a un emplazamiento donde se encuentran al menos dos vías de flujo, permitiendo de ese modo la comunicación fluida entre al menos dos vías de flujo. La confluencia puede comprender una fusión de dos o más vías de flujo no porosas, dos o más vías de flujo porosas, una fusión entre una o más vías de flujo porosas y una o más vías de flujo no porosas o una bifurcación de una vía de flujo en dos o más vías de flujo.
Un material o componente "poroso" se refiere a un material insoluble en agua que comprende poros a través de los cuales puede fluir líquido. A modo de ejemplo, un material poroso puede comprender una red de material insoluble que apoya el flujo de líquido por fuerza capilar. Los capilares dentro de materiales porosos típicos son espacios abiertos orientados al azar y enredados, conectados entre sí y que forman una red de conductos que absorben líquido por capilaridad. Los materiales porosos se pueden formar a partir de fuentes naturales y/o sintéticas, fibrosas o particuladas. Los especialistas en la técnica conocen los materiales porosos adecuados para uso en este documento e incluyen, por ejemplo y sin limitación, materiales basados en nitrocelulosa, materiales basados en polímeros, materiales basados en acrílicos, tales como acrílico hilado y similares.
"Movible", como se usa en este documento, se refiere a un reactivo asociado con un material poroso o no poroso de un dispositivo de acuerdo con la presente invención, un reactivo que está inmóvil en uno o más conjuntos de condiciones y es sustancialmente movible en uno o más conjuntos de condiciones diferentes. Típicamente, los reactivos están inmóviles antes de, y se vuelven sustancialmente movibles durante, el funcionamiento de un dispositivo de la presente invención. A modo de ejemplo, un reactivo movible puede ser un reactivo que se ha impregnado en un material poroso o se ha colocado, por ejemplo seco, sobre un componente no poroso de un dispositivo de la presente invención, para que durante el funcionamiento del dispositivo, el reactivo se vuelva sustancialmente soluble, hidratado o de otra forma liberado a partir del material poroso o no poroso, cuando se ponga en contacto con la muestra y se transporte lateralmente junto con la muestra a medida que la muestra avanza a través del dispositivo. Preferiblemente, el reactivo movible y la muestra fluyen a través del dispositivo a velocidades sustancialmente iguales y con flujo relativamente inalterado. En otro ejemplo, el reactivo movible no se disuelve o solubiliza, pero no obstante se moviliza, es decir se libera y se transporta sustancialmente mediante la muestra.
Un material o componente "no poroso" se refiere a un material a través del cual fluyen cantidades insustanciales de líquido (por ejemplo, muestra líquida). Como se usa en este documento, típicamente el líquido fluye sobre o a lo largo de un material no poroso o dentro de un área (o canal o cámara) formado por múltiples piezas de material no poroso. Por lo tanto una vía de flujo no porosa se refiere a una vía de flujo formada por uno o más materiales no porosos a lo largo de la cual fluye el líquido. Un material poroso puede estar en comunicación fluida con una vía de flujo no porosa. Tal material poroso puede facilitar el flujo dentro del dispositivo, por ejemplo, absorbiendo líquido de la vía de flujo no porosa hacia o sobre la región porosa. Alternativamente o adicionalmente, una vía de flujo no porosa se puede construir para formar un espacio capilar a través del cual el líquido puede fluir por capilaridad. Otros mecanismos de flujo alternativos serán aparentes para los especialistas en la técnica y se contemplan análogamente en este documento. A modo de ejemplo, la fluídica, la presión hidrostática y/o la gravedad se pueden aprovechar para facilitar el flujo de líquido.
II. Introducción
La presente invención proporciona dispositivos analíticos mejorados y métodos que emplean tales dispositivos para uso en la determinación de la presencia o cantidad aproximada de uno o más analitos en una muestra líquida (es decir, fluida). En particular, los dispositivos de la presente invención comprenden al menos una vía de flujo secundaria, vía de flujo secundaria que se une a una vía de flujo primaria en una confluencia única. Las vías de flujo secundarias de acuerdo con la presente invención se configuran para que una muestra líquida presente en la vía de flujo primaria entre en la vía de flujo secundaria a través de la confluencia única y después posteriormente se vuelva a extraer hacia la vía de flujo primaria, a través de la misma confluencia única, a medida que el líquido de la vía de flujo primaria se reduce (es decir, fluye hacia el final del ensayo). La extracción de la muestra líquida desde la vía de flujo secundaria se puede conseguir, por ejemplo, mediante la absorción del líquido por un material poroso o absorbente en comunicación fluida con la vía de flujo secundaria y/o por acción capilar dentro de la vía de flujo secundaria. En algunas realizaciones proporcionadas en este documento, la vía de flujo secundaria comprende material no poroso que tiene uno o más reactivos localizados sobre el mismo, reactivos que se suministran en serie hacia la vía de flujo primaria. Un reactivo preferido para el suministro posterior de acuerdo con los dispositivos contemplados en este documento es uno o más componentes de un sistema marcador basado en enzima, tal como por ejemplo, un sustrato de enzima. El reactivo, por ejemplo, sustrato de enzima se deposita inicialmente en la vía de flujo secundaria y posteriormente la muestra lo moviliza sustancialmente. La vía de flujo secundaria también se puede emplear para recoger líquido que actúa como un lavado a continuación del flujo de líquido inicial a través del dispositivo. Por tanto, la vía de flujo secundaria permite el suministro retrasado de líquido solo o líquido con reactivos (por ejemplo, reactivos de marcaje o marcadores, reactivos acondicionantes y/o reactivos de control) a elementos aguas abajo. Por ejemplo, el suministro retrasado de uno o más sustratos de enzima desde una vía de flujo secundaria hacia una vía de flujo primaria y hasta una zona de captura que comprende analito capturado etiquetado con un complejo anticuerpo-enzima es útil para evitar el suministro prematuro, o la mezcla, del sustrato de enzima con la enzima en la etiqueta que, de otro modo, podría crear un color de fondo y evitar la interpretación precisa del resultado del ensayo.
Entre otras ventajas, los dispositivos y métodos de la presente invención proporcionan formatos reales de ensayo de etapa única que pueden emplear cualquiera de diversos sistemas marcadores que incluyen sin limitación marcadores basados en enzimas, restos coloreados, marcadores fluorescentes, etc.
III. Distribución General del Dispositivo
En general, los dispositivos de la presente invención pueden emplear tanto materiales porosos como no porosos en las vías de flujo. En dispositivos preferidos, la vía de flujo secundaria comprende material no poroso y la zona de captura, localizada dentro de la vía de flujo primaria, se localiza sobre o dentro de un material poroso. Un dispositivo de acuerdo con la presente depende de una señal detectable visualmente directamente (sistema marcador) para la detección de resultados, hasta el punto que la zona de captura se localiza preferiblemente sobre/en un material poroso para proporcionar una concentración más elevada de reactivo de captura en la zona de captura permitiendo de ese modo la captura de una concentración más elevada de analito y una generación de señal mayor. Cuando se emplea una señal legible por máquina (por ejemplo, radiactividad, fluorescencia o magnetismo) la zona de captura se puede colocar más fácilmente sobre un material no poroso.
Los dispositivos de la presente invención comprenden típicamente un sitio de aplicación de muestra, algunas veces denominado en este documento un orificio de entrada de muestra, una zona de marcaje, una zona de captura, una vía de flujo secundaria (que comprende típicamente uno o más reactivos en la misma) y opcionalmente una zona de control, una zona de fin de ensayo y/o un material absorbente, por ejemplo para facilitar el flujo de líquido desde la parte aguas arriba del dispositivo hasta la parte aguas abajo del dispositivo. En realizaciones preferidas descritas en este documento, el dispositivo se diseña para etiquetar, capturar y marcar uno o más analitos en un fluido (muestra líquida), detectando de ese modo la presencia, y opcionalmente cuantificando, uno o más analitos. Alternativamente, los dispositivos se pueden usar para etiquetar y marcar uno o más analitos en un líquido, donde el analito marcado/etiquetado después se captura y se determina la presencia o cantidad aproximada del analito. El uso de una estructura no porosa en al menos una parte del dispositivo posibilita el suministro rápido de muestra a la zona de captura y elimina la interferencia del flujo del material poroso.
En realizaciones adicionales contempladas en este documento, están presentes en el dispositivo una o más zonas acondicionantes que comprenden reactivos acondicionantes. Véanse, por ejemplo, las Figuras 6 y 8. Los reactivos acondicionantes pueden mejorar el rendimiento del ensayo, que incluye, por ejemplo, cambiar el pH, la concentración de sal o de un ión metálico, añadir o retirar componentes inorgánicos u orgánicos o detergentes, bloquear interacciones no específicas o retirar/filtrar componentes grandes y/o de interferencia de la muestra, tales como por ejemplo, glóbulos rojos de muestras de sangre completa. La una o más zonas acondicionantes se pueden incluir en o próximas al punto de aplicación de la muestra y/o en un emplazamiento completamente dentro de la vía de flujo primaria o secundaria y/o sobre/en cualquiera o ambos materiales porosos o no porosos.
Las realizaciones adicionales de los presentes dispositivos, análogamente comprenden reactivos de control dentro del dispositivo. Como lo apreciarán los especialistas en la técnica, tales reactivos de control se pueden localizar en cualquiera de las vías de flujo primaria o secundaria, dependiendo por ejemplo del tipo de control que se usa. Si el reactivo de control tiene por objeto indicar simplemente que ha fluido muestra hacia dentro y hacia fuera de la vía de flujo secundaria, entonces el reactivo de control se localiza preferiblemente en la vía de flujo secundaria y más preferiblemente en el mismo emplazamiento o aguas arriba de cualquiera de los otros reactivos en esa vía de
flujo.
En líneas generales, los dispositivos de la presente invención preferiblemente se distribuyen para que la muestra aplicada al dispositivo fluya hacia la vía de flujo primaria poniéndose en contacto opcionalmente con una zona acondicionante. Después una parte de la muestra fluye desde la vía de flujo primaria hacia la vía de flujo secundaria. Dentro de la vía de flujo secundaria la muestra típicamente se pone en contacto con un reactivo marcador y puede adicionalmente o alternativamente ponerse en contacto con una zona acondicionante. Debido a la fluídica dentro de los dispositivos de la presente invención, la muestra que fluye hacia la vía de flujo secundaria reside en esa vía de flujo hasta que la muestra que está en la vía de flujo primaria comienza a evacuar la vía de flujo primaria. En la vía de flujo primaria la parte de muestra inicial que fluye a través de la misma preferiblemente se pone en contacto con una zona de marcaje, movilizando la etiqueta localizada en la misma y opcionalmente se puede poner en contacto con una o más zonas acondicionantes. La muestra, que ahora comprende analito marcado si hay analito presente en la misma, ahora fluye hasta ponerse en contacto con la zona de captura donde el analito marcado, si está presente, se captura. La muestra continúa fluyendo por la zona de captura y, opcionalmente, hacia el contacto con una o más de una zona de control, una o más zonas acondicionantes adicionales, una o más zonas de fin de ensayo y después hasta el final del ensayo, preferiblemente hacia un material absorbente que, en parte, actúa como un recipiente para la
muestra.
A medida de la muestra líquida fluye a través de la vía de flujo primaria, la muestra de la vía de flujo secundaria comienza a entrar en la vía de flujo primaria, preferiblemente llevando consigo marcador movilizado de la vía de flujo secundaria. La muestra de la vía de flujo secundaria fluye aguas abajo poniéndose en contacto con la zona de marcaje, que preferiblemente ya no comprende etiqueta y después se pone en contacto con la zona de captura, donde se captura el marcador que fluye con la muestra o de otra manera reacciona con los reactivos capturados en la zona de captura y se genera una señal. La muestra continúa fluyendo a través del dispositivo poniéndose en contacto con cualquiera de las zonas restantes hasta el final del ensayo. Por tanto, preferiblemente el volumen de muestra líquida fluye a través del dispositivo hasta el final del ensayo.
En algunas realizaciones de la presente invención, la vía de flujo primaria está en comunicación fluida con una zona de marcaje que comprende una etiqueta que se puede unir al analito o a un derivado del mismo para formar un complejo. A medida que la muestra se pone en contacto con la zona de marcaje, la etiqueta se libera de la zona de marcaje, por ejemplo por hidratación o solubilización, volviéndose móvil con la muestra. A medida que la muestra y la etiqueta se mezclan, se combinan para formar analito marcado. Esta reacción o asociación de etiqueta y analito (o un derivado del mismo) puede ocurrir en la zona de marcaje o aguas abajo de la misma. Preferiblemente, la muestra de la vía de flujo primaria moviliza toda la etiqueta movible presente en la zona de marcaje antes de que la muestra de la vía de flujo secundaria se ponga en contacto con esa zona. Esto se prefiere cuando la vía de flujo secundaria comprende un componente del sistema marcador que tiene que reaccionar con un componente de la etiqueta para generar una señal. Las marcas incluyen, agentes de afinidad, tales como, por ejemplo, antígenos, haptenos, anticuerpos, ligandos, receptores, moléculas de ácidos nucleicos o reactantes químicos. Las etiquetas se pueden enlazar a un marcador detectable directamente, que incluye pero sin limitación, una partícula que absorbe la luz tal como oro/selenio coloidal o una partícula de látex coloreada, un resto que absorbe la luz, un resto o partícula fosforescente, un resto o partícula fluorescente o un resto o partícula quimiluminiscente, o la etiqueta se puede enlazar a un marcador detectable indirectamente, tal como una enzima, que incluye por ejemplo, sin limitación, una hidrolasa, una esterasa (por ejemplo, fosfatasa alcalina) o una óxidorreductasa (por ejemplo, peroxidasa del rábano picante). La zona de marcaje puede estar en una parte porosa o no porosa de la vía de flujo primaria. En algunas realizaciones, la zona de marcaje está en una parte no porosa del dispositivo, aguas abajo de la confluencia de la vía de flujo secundaria.
Después el analito marcado, así como cualquier etiqueta o analito libre o derivado del mismo, fluye aguas abajo junto con la muestra a medida que avanza a través del dispositivo. Preferiblemente, la muestra líquida y sus componentes fluyen a velocidades sustancialmente iguales a través del dispositivo. Sin quedar ligado a ninguna teoría particular, el flujo a través de la parte porosa del dispositivo preferiblemente no es absorbente, es decir, las interacciones entre el mismo material poroso y los componentes de la muestra son insignificantes o mínimas (las interacciones entre los componentes de la muestra y los reactivos sobre o en el material poroso, por supuesto, se esperan y no se consideran indicativas de flujo absorbente). La zona de captura comprende un reactivo inmovilizado sobre o en el dispositivo. En algunas realizaciones, la zona de captura se localiza en una región porosa del dispositivo. Los componentes del dispositivo se pueden disponer para que una parte aguas abajo de al menos una vía de flujo no porosa termine en un componente poroso para que cuando el líquido fluya hacia el final de la vía de flujo no porosa, el líquido se absorba hacia el componente poroso y continúe aguas abajo a través de la parte porosa de la vía de flujo. Cuando la muestra se pone en contacto con la zona de captura, el reactivo de captura se une e inmoviliza al analito, a un derivado del mismo y/o al analito marcado (complejo).
Dependiendo del sistema marcador, la etiqueta puede comprender un agente detectable directamente (por ejemplo, resto coloreado) o un agente detectable indirectamente (que incluye agentes que comprenden un elemento de enlace para enlazarse a otro agente detectable). Un ejemplo de un agente detectable indirectamente es una enzima que se detecta cuando se pone en contacto con un sustrato de enzima (por ejemplo, en el caso de un sistema marcador de enzima). En algunas realizaciones, es deseable retrasar el suministro del sustrato de enzima a la zona de captura hasta después del flujo inicial del analito y la etiqueta a la zona de captura. Por tanto, en tales realizaciones, se pone preferiblemente un sustrato de enzima en la vía de flujo secundaria para dejar que el sustrato de enzima se ponga en contacto con la etiqueta después de que se inmovilice en la zona de captura. Un agente detectable indirectamente ilustrativo que comprende un elemento de enlace es un agente que comprende biotina o (estrept)avidina. Tal agente se puede "enlazar" a, es decir, unirse o asociarse de otra forma con un segundo elemento de enlace, en este ejemplo, (estrept)avidina o biotina, respectivamente, asociándose de ese modo con el analito sin importar la molécula (por ejemplo, un resto coloreado o enzima) que se une a dicho segundo elemento de enlace.
El reactivo de unión localizado en la zona de captura se puede unir o de otra forma interaccionar con el analito o un componente del complejo de analito para retener (inmovilizar) el analito o componente. Por ejemplo en un formato de ensayo de sándwich, la zona de captura puede contener un anticuerpo inmovilizado que es un primer compañero de unión del analito diana y la etiqueta movible puede contener un anticuerpo que es un segundo compañero de unión del analito. Por tanto, en la zona de captura, el analito se intercala entre los dos anticuerpos.
En un sistema de ensayo competitivo, el analito desplaza o compite con su análogo o derivado en la zona de captura, donde el analito o su derivado se marcan en la zona de marcaje aguas arriba de la zona de captura.
En algunas realizaciones, la zona de captura se localiza en una región porosa del dispositivo. Los componentes del dispositivo se pueden disponer para que una parte aguas abajo de al menos una vía de flujo primaria no porosa termine en un componente poroso para que cuando el líquido fluya hasta el final de la vía de flujo no porosa, el líquido se absorba en el componente poroso y continúe aguas abajo a través de la parte porosa de la vía de flujo.
En algunas realizaciones, el dispositivo se diseña para que el sustrato de enzima no se ponga en contacto o tenga un contacto mínimo con una etiqueta libre, móvil que comprende marcador de enzima, que de otra forma causaría lecturas de fondo y/o falsos positivos en la zona de captura. En estas realizaciones, el sustrato de enzima llega a la zona de captura después de que se ha conseguido en gran parte la separación de la etiqueta libre de captura y unión, es decir, después de que el analito marcado se ha unido a la zona de captura. El resultado es una señal habitualmente visual y detectable en la zona de captura con muy poco o sin fondo. Esto se puede conseguir, y preferiblemente se consigue, poniendo el sustrato de enzima en la vía de flujo secundaria localizada aguas arriba de la zona de marcaje donde la vía de flujo secundaria está en comunicación fluida con la vía de flujo primaria.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente invención se encierran en una estructura o carcasa. Preferiblemente tales dispositivos comprenden además un medio para retirar cualquier aire dentro del dispositivo que se desplaza después de la introducción de líquido dentro del mismo, lo que significa que preferiblemente también funciona para permitir la reentrada de aire en el dispositivo a medida que el líquido fluye hacia fuera de las vías de flujo y hacia en final del ensayo. Esto minimizará la creación de contrapresión y/o la formación de vacío dentro del dispositivo que puede evitar que el líquido fluya a través del dispositivo. Por ejemplo, se pueden situar uno o más agujeros de ventilación de aire en el dispositivo, tales como en o próximo al extremo aguas arriba de la vía de flujo secundaria (lejos de la confluencia de esa vía de flujo con la vía de flujo primaria) y/o en o próximo al final del ensayo, para facilitar el movimiento de líquido hacia dentro y hacia fuera de la vía de flujo secundaria y a través de la vía de flujo primaria. Se prevé cualquier medio para influir en el flujo de aire en el dispositivo, que incluye sin limitación, agujeros de ventilación, válvulas o vacíos. Por ejemplo, la vía de flujo secundaria se puede diseñar tanto para facilitar el flujo de líquido como para alojar el aire desplazado dentro del dispositivo.
Las realizaciones adicionales pueden comprender, un agujero de ventilación de aire localizado en el extremo aguas arriba de la vía de flujo secundaria, que permita la entrada de líquido de la vía de flujo primaria y la extracción posterior del líquido de vuelta hacia la vía de flujo primaria cuando hay una cantidad mínima o no hay muestra en el orificio de entrada de muestra para apoyar el flujo continuo en la vía de flujo primaria. Se puede controlar el volumen de la muestra depositado en la vía de flujo primaria, para desencadenar el flujo en la vía de flujo secundaria. Los especialistas en la técnica apreciarán que la vía de flujo primaria no necesita vaciarse completamente antes de que el líquido de la vía de flujo secundaria vuelva a entrar en la vía de flujo primaria. En lugar de eso, a medida que el líquido se vacía de la vía de flujo primaria, tal como por absorción en el material absorbente en el extremo aguas abajo de la vía de flujo primaria, el líquido de la vía de flujo secundaria reentra en la vía de flujo primaria de una manera continua. Significativamente, el diseño de los dispositivos de la presente invención proporciona un inmunoensayo enzimático de una etapa real.
En algunas realizaciones, el orificio de muestra está en comunicación fluida con una cámara que está en un nivel inferior al nivel de la zona de marcaje. En estas realizaciones, la cámara inferior está en comunicación fluida con la vía de flujo primaria para que la muestra entre en la vía de flujo desde el fondo de la vía de flujo. Véanse, por ejemplo, las Figuras 3 y 5. En algunas realizaciones, la muestra entra en la vía de flujo desde el fondo en un emplazamiento entre el emplazamiento del sustrato de enzima y la zona de marcaje. En estas realizaciones, la muestra entra en el dispositivo, fluye a través de la cámara y después entra en la vía de flujo primaria y en este punto una primera parte de la muestra se pone en contacto con la zona de marcaje sin ponerse en contacto con el sustrato de enzima mientras una segunda parte de la muestra se pone en contacto con el sustrato de enzima (por ejemplo, en una vía de flujo secundaria) y posteriormente invierte la dirección y fluye hacia la vía de flujo primaria siguiendo a la parte inicial de la muestra. Los especialistas en la técnica apreciarán que tiene que estar presente muestra suficiente en la cámara inferior y se tiene que conseguir un caudal suficiente dentro del dispositivo para que la muestra que fluye hacia fuera de la vía de flujo secundaria fluya a través de la confluencia de la cámara inferior con las vías de flujo primaria y secundaria y hacia la vía de flujo primaria en lugar de volver hacia la cámara inferior.
Tales dispositivos de la invención que emplean una cámara inferior pueden incluir opcionalmente una zona acondicionante dentro de la cámara inferior que, por ejemplo, se una a los componentes de una muestra que impiden directamente o indirectamente la detección del analito. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.737.278. La zona acondicionante puede mejorar la detección del analito o de un derivado del mismo mediante la unión a componentes de interferencia antes de que alcancen la zona de captura.
Los dispositivos de la presente invención pueden opcionalmente, y típicamente lo hacen, incluir además una zona de control, preferiblemente localizada próxima a la zona de captura. Véanse, por ejemplo, las Figuras 2-5. Particularmente cuando el dispositivo se diseña para la detección de un analito único en una muestra líquida, la zona de control preferiblemente se localiza aguas abajo de la zona de captura. Cuando se va a detectar más de un analito y, por tanto, se emplea más de una zona de captura dentro del dispositivo, será preferible localizar una zona de control entre dos zonas de captura, por ejemplo como un medio para distinguir una zona de captura de otra. En un aspecto, la zona de control se puede diseñar para generar una señal que indica que la muestra líquida ha de hecho fluido a través del dispositivo por la zona de captura, y por lo tanto, que el ensayo está funcionando como se ha diseñado. La zona de control comprenderá generalmente un reactivo inmovilizado ("reactivo de control inmovilizado") que puede generar una señal detectable como resultado de la interacción con un componente de la muestra o, más preferiblemente, que se puede unir a un reactivo de control que comprende un resto detectable. A modo de ejemplo, la zona de control puede comprender un anticuerpo capaz de unirse (inmovilizar) a un componente de la etiqueta o capaz de unirse a un reactivo de control separado que comprende un antígeno acoplado a un resto coloreado. Cuando se usa un reactivo de control separado, tal reactivo preferiblemente se localiza en la vía de flujo secundaria, para que la inmovilización de tal reactivo de control en la zona de control sea un indicio del flujo de la muestra de la vía de flujo secundaria a través del dispositivo hacia la zona de control. El componente inmovilizado en la zona de control se puede visualizar directamente o indirectamente. Opcionalmente, la zona de control puede funcionar como una zona de "referencia" para ayudar en la determinación de la presencia de una cantidad aproximada del analito en la muestra acuosa o se pueden emplear tanto zonas de control como de referencia en el dispositivo. Los especialistas en la técnica estarán familiarizados con tales zonas de referencia y podrán implementar fácilmente las mismas en los presentes dispositivos.
Los especialistas en la técnica reconocerán que una zona de control también puede funcionar como un control negativo o positivo. A modo de ejemplo, una zona de control negativo se puede diseñar para indicar niveles no específicos o de fondo de marcador detectable. Esto se puede conseguir preparando la zona de control negativo de la misma manera que la zona de captura pero sin la presencia del componente de captura del reactivo de captura (tal como el anticuerpo de captura). Una zona de control positivo ilustrativa se puede preparar inmovilizando el analito diana auténtico dentro de la zona, analito que capturará e inmovilizará los reactivos de etiqueta y/o marcadores como un indicio positivo de la funcionalidad del ensayo.
Opcionalmente el dispositivo puede incluir una zona de fin de ensayo que indicará, por ejemplo, que ha fluido a través del dispositivo muestra suficiente y/o que la muestra y los reactivos han reaccionado en el dispositivo durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la interpretación precisa de los resultados del ensayo. Como con los otros reactivos empleados en los dispositivos de la presente invención, los reactivos de fin de ensayo se pueden localizar dentro de cualquiera o ambas vías de flujo primaria o secundaria. A modo de ejemplo, un reactivo de fin de ensayo se puede localizar en una vía de flujo secundaria para que la detección de tal reactivo de fin de ensayo en la zona de fin de ensayo demuestre el flujo satisfactorio de la muestra de la vía de flujo secundaria a través del dispositivo. Una zona de fin de ensayo ilustrativa puede comprender un reactivo de unión inmovilizado, tal como un anticuerpo y un reactivo de fin de ensayo ilustrativo puede comprender una perla de látex coloreada acoplada a un antígeno específico para tal anticuerpo.
Además, las realizaciones de dispositivos de acuerdo con la presente pueden comprender una región en el extremo aguas abajo de la vía de flujo primaria que puede servir para recoger la muestra líquida y cualquier reactivo que no se ha unido. La región final puede ser una extensión de una vía de flujo primaria porosa o un material poroso y absorbente diferente en comunicación fluida con la vía de flujo primaria o un depósito no poroso. Se prefiere material poroso/absorbente ya que el mismo puede facilitar el flujo a través del dispositivo.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la invención se pueden diseñar para detectar y/o estimar la cantidad de dos o más analitos. En tales realizaciones, se pueden proporcionar marcas diferentes, por ejemplo, anticuerpos diferentes, así como marcadores diferentes para cada analito o derivado del mismo. Además, los dispositivos pueden comprender dos o más zonas de captura en las que se captura un analito diferente o un derivado del mismo. Además, se pueden emplear una o más zonas de control por ejemplo, para proporcionar marcas de referencia para distinguir las zonas de captura diferentes y por lo tanto, la detección de analitos diferentes.
Las vías de flujo primarias pueden comprender materiales porosos o no porosos, o pueden comprender tanto materiales porosos como materiales no porosos. En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden una vía de flujo primaria que comprende una región aguas arriba (por ejemplo, que comprende la zona de marcaje asociada con la región no porosa) no porosa (opcionalmente microfluídica) y una región aguas abajo porosa (por ejemplo, que comprende la zona de captura asociada con la región porosa), en los que las zonas están en comunicación fluida. Por ejemplo, las Figuras 2A-B y 3A-C ilustran realizaciones en las que la zona de marcaje está asociada con partes aguas arriba que son no porosas y la zona de captura está asociada con regiones aguas abajo que son porosas. En otras realizaciones la zona de marcaje puede residir en la parte porosa del dispositivo, aguas arriba de la zona de captura, como se ilustra en las Figuras 4 y 5.
Aunque los dispositivos de la presente invención se emplean preferiblemente como dispositivos de ensayo de una etapa, es decir el ensayo sólo requiere la adición de la muestra al dispositivo, se contemplan análogamente otros ensayos que utilizan los dispositivos de esta invención, por ejemplo se pueden introducir otros líquidos, tales como lavados o acondicionadores, en el dispositivo antes o después de la adición de muestra. De forma similar, se pueden añadir reactivos y/o reactantes adicionales al dispositivo antes o después de la adición de muestra, que incluyen por ejemplo reactivos para mejorar la generación de señal que indica la presencia o cantidad aproximada de analito en una muestra líquida.
IV. Vías de Flujo Secundarias
La(s) vía(s) de flujo secundaria(s) pueden incluir también una parte porosa, pero preferiblemente son no porosas. La vía de flujo secundaria puede formar una confluencia con cualquier parte no porosa de la vía de flujo primaria. Preferiblemente, una vía de flujo secundaria forma una confluencia con la vía de flujo primaria en un emplazamiento donde se desea que se retrase al menos algo del flujo de la muestra en la vía de flujo secundaria antes de alcanzar un área aguas abajo de la confluencia en la vía de flujo primaria. En este caso, una parte de la muestra entra en la vía de flujo secundaria mientras que la parte restante de la muestra continua bajando por la(s) vía(s) de flujo primaria(s). Una vez que la mayor parte o toda la muestra del orificio de entrada de muestra ha entrado en la vía de flujo primaria, entonces el flujo continúa volviendo a extraer la muestra que reside en la vía de flujo secundaria hacia la vía de flujo primaria. Por tanto, en algunas realizaciones, una vía de flujo secundaria forma una confluencia entre la entrada de la muestra y la zona de marcaje para que al menos parte de la muestra se retrase en la vía de flujo secundaria antes de llegar a la zona de marcaje.
En cualquier caso, el volumen de la vía de flujo secundaria es tal que es suficiente para alcanzar la zona de captura y la zona de control opcional. En particular, el volumen hueco de la vía de flujo primaria porosa desde el borde aguas arriba hasta la zona de control (o zona de captura si no está presente una zona de control) tiene que ser menor que la capacidad de volumen de la vía de flujo secundaria.
Las Figuras 2B, 3C, 4B y 5C ilustran el flujo inicial (línea sólida) de la muestra a medida que una parte de la muestra se mueve inicialmente hacia la zona de marcaje mientras que otra parte se mueve hacia el sustrato de enzima. Las líneas discontinuas en las Figuras 2B, 3C, 4B y 5C ilustran el flujo posterior de la muestra que sigue al agotamiento de la muestra en el orificio de entrada de muestra. Este flujo posterior de muestra posteriormente se extrae hacia y a través de las zonas de marcaje y captura (tal como, por ejemplo mediante la absorción de la muestra por los componentes porosos y/o absorbentes y/o por acción capilar o flujo laminar dentro del componente no poroso). El líquido entra en la vía de flujo secundaria desde la vía de flujo primaria antes de salir nuevamente de la vía de flujo secundaria y reentrar en la vía de flujo primaria.
En la detección basada en enzima, el suministro prematuro, o la mezcla del sustrato de enzima con la etiqueta marcada con enzima aguas arriba de la zona de captura puede crear un fondo indeseable que evita la lectura precisa en la zona de captura. Por consiguiente, es deseable suministrar el sustrato de enzima después de que la mayor parte de la etiqueta marcada con enzima ha fluido aguas abajo hacia la zona de captura. Por lo tanto, en muchas realizaciones es útil poner el sustrato de enzima en una vía de flujo secundaria que forma una confluencia aguas arriba de la zona de marcaje. Cuando el sustrato de enzima está en la vía de flujo secundaria, el líquido que entra en la vía de flujo secundaria moviliza sustancialmente, por ejemplo mediante solubilización, el sustrato de enzima y posteriormente se vuelve a extraer hacia la vía de flujo primaria después de que la mayoría de la muestra de la vía de flujo primaria ha pasado a través con la enzima.
En los dispositivos de la presente invención se prefiere que la única fuente de líquido de la vía de flujo secundaria venga de la vía de flujo primaria (incluyendo el orificio de entrada de muestra o vía). Por tanto, el líquido entra en la vía de flujo secundaria sólo desde la vía de flujo primaria antes de volver a salir de la vía de flujo secundaria y reentrar en la vía de flujo primaria. Por tanto, las vías de flujo secundarias de la presente invención típicamente no comprenden ningún depósito que contenga líquido antes de la entrada de la muestra desde la vía de flujo primaria hacia la vía de flujo secundaria ni las vías de flujo secundarias comprenden un orificio de entrada para la adición de un segundo líquido. En muchas realizaciones, las vías de flujo secundarias forman sólo una confluencia con la vía de flujo primaria. Sin embargo, como se ha descrito más adelante, en algunos casos la vía de flujo secundaria estará en comunicación fluida con dos vías de flujo primarias, conectando de ese modo las dos vías de flujo primarias. En algunas realizaciones, la vía de flujo secundaria puede contener estabilizantes, componentes tampón y otros reactivos adicionalmente al sustrato de enzima u otros sistemas de detección o marcadores. En algunas realizaciones, una etiqueta está asociada con (por ejemplo conjugada con) un primer elemento de enlace (por ejemplo (estrept)avidina). En estas realizaciones la vía de flujo secundaria puede contener un segundo elemento de enlace, asociado con un resto coloreado que se une al primer elemento de enlace (por ejemplo biotina). Esta conformación permite la detección de la etiqueta y por lo tanto del analito. Los ejemplos de pares de elementos de enlace incluyen, por ejemplo, biotina y (estrept)avidina o fluoresceína y antifluoresceína.
Colocación de Vías de Flujo Secundarias
Como se ilustra en la Figura 1, las vías de flujo secundarias se pueden poner en muchas orientaciones con respecto a la vía de flujo primaria y la zona de marcaje. En algunos casos, la entrada de la muestra y la zona de marcaje están en una vía de flujo sustancialmente recta, con una vía de flujo secundaria que forma una confluencia con la vía de flujo primaria en un punto entre la muestra y la etiqueta. Véase, por ejemplo, la Figura 1A. Alternativamente, la Figura 1B ilustra una realización en la que la vía de flujo primaria se divide en dos vías de flujo primarias en una confluencia aguas arriba y después se fusiona en una confluencia aguas abajo de la vía de flujo secundaria.
En realizaciones adicionales, la vía de flujo primaria puede formar un ángulo entre su extremo aguas arriba (orificio de entrada de muestra) y la zona de marcaje. Como se ilustra en las Figuras 1C-E, se puede poner una vía de flujo secundaria para que forme una vía de flujo sustancialmente recta con la zona de marcaje situada en la vía de flujo primaria. Este aspecto también se representa en, por ejemplo, la Figura 2B.
La capacidad de flujo de cualquier vía de flujo particular (por ejemplo, como se representa en la sección transversal de una vía de flujo porosa o no porosa) no necesita mantenerse constante durante todo su recorrido.
Las vías de flujo secundarias comprenderán generalmente los medios para retirar el aire dentro del dispositivo que se desplaza después de la introducción de una muestra líquida en el mismo. En algunas realizaciones, se emplean uno o más agujeros de ventilación con este propósito. A modo de ejemplo, se puede situar un agujero de ventilación en el extremo aguas arriba de la vía de flujo secundaria para permitir el escape de aire de allí a medida que la muestra líquida fluye hacia esa vía de flujo. De forma similar, y a modo de ejemplo adicional, se pueden emplear agujeros de ventilación de aire también próximos al final del ensayo para facilitar el flujo de la muestra a través del dispositivo hasta ese final. Los agujeros de ventilación de aire estarán localizados generalmente en la parte superior o a lo largo del lado de un dispositivo, aunque con tal que la muestra preferiblemente no se salga del dispositivo a través de
tal(es) agujero(s) de ventilación. A modo de ejemplo, la Figura 8 ilustra una realización de la presente invención en la que los agujeros de ventilación de aire se configuran para que el aire dentro del dispositivo fluya hacia arriba y hacia el lado para escapar del dispositivo. Como se ilustra, esto se consigue mediante la formación de un agujero de ventilación en la parte superior de la cubierta superior del dispositivo, fijando material espaciador a la cubierta superior dejando el agujero de ventilación de aire (así como el orificio de entrada de muestra y la ventana de lectura) descubierto y después fijando una cubierta de agujero de ventilación al material espaciador, cuya cubierta de agujero de ventilación comprende recortes para el orificio de entrada de muestra y la ventana de lectura pero no para los agujeros de ventilación.
V. Agentes Marcadores
Los especialistas en la técnica apreciarán fácilmente diversos sistemas marcadores que se pueden emplear en los dispositivos de la presente invención. Los marcadores ilustrativos incluyen sin limitación, partículas que absorben la luz tales como oro/selenio coloidal o partículas de látex coloreadas, restos o partículas fosforescentes, restos o partículas fluorescentes, colorantes (por ejemplo, colorantes polimerizados) o soluciones coloidales, o moléculas o partículas coloreadas o fluorescentes o quimiluminiscentes, o productos insolubles coloreados de una acción enzimática y/o moléculas radiactivas. Preferiblemente, la señal generada por el marcador es detectable ópticamente, para que se pueda detectar a través de una ventana o región de lectura ópticamente clara o transparente y está relacionada con la presencia y/o cantidad de analito en la muestra.
En un sistema generador de señal preferido, se emplea un sustrato de enzima soluble como un marcador, sustrato que carece de una absorción sustancial en el espectro visible pero que se convierte en un producto insoluble en agua y visible (es decir, con una absorción sustancial en la región de longitud de onda visible) después de la acción de una enzima, enzima que se ha incorporado preferiblemente en la etiqueta. Las enzimas ilustrativas incluyen, sin limitación, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, peroxidasa del rábano picante y penicilinasa. Los especialistas en la técnica conocen diversos sustratos que se pueden usar en tal sistema marcador basado en enzima. La elección del sustrato dependerá, por ejemplo, de la enzima empleada, la sensibilidad deseada (por ejemplo si sólo la generación de color será suficiente para visualizar un resultado o si se prefiere la fluorescencia) y similares. Alternativamente, se puede usar un sustrato de enzima, con o sin absorción sustancial en el espectro visible, que se convierte en un producto fluorescente o luminiscente mediante una enzima.
En la presente invención también se contempla un ejemplo de algunas realizaciones que comprenden un dispositivo analítico en el que la determinación de la presencia o cantidad aproximada del analito en la muestra líquida comprende la detección de una señal ópticamente detectable donde: un dispositivo analítico comprende: una vía de flujo primaria; una zona de captura, capaz de inmovilizar el analito dentro de la vía de flujo primaria y una vía de flujo secundaria contigua a la vía de flujo primaria en una confluencia única aguas arriba de la zona de captura, donde la única fuente de líquido hacia la vía de flujo secundaria es de la vía de flujo primaria. Además donde la vía de flujo primaria puede comprender material poroso o no poroso y donde la vía de flujo secundaria puede comprender material no poroso. Una realización puede comprender además una zona de marcaje dentro de la vía de flujo primaria que comprende al menos una etiqueta que puede formar un complejo con el analito, donde dicha etiqueta se moviliza sustancialmente cuando se pone en contacto con la muestra líquida; y donde la zona de marcaje se puede localizar aguas arriba de y puede estar en comunicación fluida con la zona de captura y donde la zona de captura puede comprender un reactivo de captura inmovilizado que puede ser capaz de unirse al analito. Una realización puede comprender además un marcador en la vía de flujo secundaria donde dicho marcador puede comprender un primer elemento de enlace acoplado a un resto coloreado y dicha etiqueta puede comprender un segundo elemento de enlace y donde dicho primer elemento de enlace se puede unir a dicho segundo elemento de enlace. Un dispositivo analítico puede comprender además una realización donde el analito presente en la muestra líquida se une a dicha etiqueta y está unido por dicho reactivo de captura inmovilizado y donde dicho primer elemento de enlace acoplado a dicho resto coloreado está unido a dicho segundo elemento de enlace comprendido dentro de dicha etiqueta, proporcionando de ese modo una señal ópticamente detectable dentro de dicha zona de captura. Un dispositivo analítico puede incluir además una realización en la que dicho primer elemento de enlace y dicho segundo elemento de enlace son diferentes y son biotina y avidina respectivamente o avidina y biotina respectivamente.
VI. Construcción del Dispositivo
Los dispositivos de acuerdo con la presente invención se pueden construir por cualquiera de una diversidad de medios bien conocidos por los especialistas en la técnica. En algunas realizaciones, la estructura del cuerpo de una parte no porosa del dispositivo de la presente invención consiste en un montaje de múltiples (por ejemplo, tres o más) capas separadas que, cuando se unen apropiadamente entre sí, forman una vía de flujo no porosa comprendida dentro del dispositivo. Véanse, por ejemplo, las Figuras 2A y 3A. Como se muestra en estas figuras, tal estructura no porosa puede consistir en una cubierta superior, un soporte inferior y una parte interior o "lámina recortada", donde el recorte define sustancialmente las vías de flujo del dispositivo. Una película delgada (por ejemplo, una película de poliéster Mylar®) se puede aplicar a la cubierta superior y/o al soporte inferior para sellar el hueco creado por la capa recortada.
Se puede usar cualquier medio para parear un material poroso del dispositivo con un material no poroso y/o para asegurar los materiales no porosos entre sí, aunque con tal que; tal medio no impida la dinámica de flujo dentro del dispositivo. A modo de ejemplo, la parte interior (recortada) de la estructura no porosa del dispositivo de la presente invención se puede construir con un adhesivo de dos caras en el que se crean las vías de flujo (canal(es)/cámara(s)) mediante corte con troquel. Después de retirar las láminas protectoras, la parte recortada de la estructura no porosa después se parea con, por ejemplo, se pone en contacto con y se une a la superficie plana del soporte inferior. Esto se puede conseguir en un proceso de fabricación continuo o manualmente. Alternativamente, la forma de la vía de flujo no porosa se puede formar mediante estampado, moldeado, ataque químico, fotolitografía o ablación láser.
Los métodos de fabricación pueden comprender la deposición de al menos un reactivo biológico en una o más posiciones predeterminadas en un soporte de ensayo usando, por ejemplo, un proceso flexográfico. Se observa una introducción a la flexografía en, por ejemplo, Encyclopedia of Chemical Technology (Kirk-Othmer, eds., 1993), vol. 20, págs. 101-105 y las referencias citadas en la misma. Los métodos pueden incluir generalmente la combinación de diversas capas de soporte y matriz (tales como materiales porosos) en un dispositivo laminado, la aplicación de reactivos que incluyen la aplicación de reactivos biológicos usando flexografía, el corte de los dispositivos a partir de una banda con la colocación opcional de una carcasa y el embolsado final del producto. Las posiciones predeterminadas de los reactivos depositados generalmente están dentro de una vía de flujo del dispositivo y el reactivo biológico o de unión generalmente conserva una actividad biológica natural sustancial. En algunos aspectos del método, el proceso flexográfico incluye un sistema de rodillo anilox en una relación funcional con una lámina de impresión y un recipiente de reactivo que contiene el reactivo biológico para que el reactivo biológicamente activo se imprima repetidamente en el soporte de ensayo. El soporte de ensayo usado puede comprender un material poroso o no poroso, impermeable al agua en forma de una banda continua. En algunas realizaciones, el o los procesos continuos se realizan en un formato de banda donde el o los reactivos de marcaje, el o los reactivos marcadores, tales como sustrato(s) de enzima si son necesarios u otras composiciones químicas (tales como, por ejemplo, sales, polímeros, aglutininas o formulaciones tampón) para el tratamiento de la muestra se depositan en los emplazamientos deseados dentro de los canales o vías de flujo apropiados.
La cubierta superior y el soporte inferior de la estructura no porosa preferiblemente consisten en un material sólido y plano. La parte superior puede incorporar agujeros (agujeros de ventilación) que se pueden fabricar usando, por ejemplo, corte con troquel realizado en un proceso continuo en un formato de banda. Los agujeros en la parte superior de la estructura no porosa están orientados preferiblemente para que estén en comunicación con las vías de flujo (canales y/o cámaras) formadas en la parte interior de la estructura. En el dispositivo terminado, estos agujeros pueden funcionar, por ejemplo, como orificios de entrada para la introducción de muestra en el interior del dispositivo o como agujeros de ventilación en el dispositivo para facilitar el flujo de líquido en el mismo, por ejemplo, se puede colocar un agujero de ventilación sobre la vía de flujo que comprende el uno o más elementos marcadores (tales como, sustrato(s) de enzima) y/o se puede colocar en el extremo aguas abajo del dispositivo, por ejemplo adyacente a un material absorbente colocado al final del ensayo y/o un agujero de ventilación se puede colocar adyacente a la zona de captura y/o zona de control sirviendo de ese modo como un agujero de ventilación y como una ventana de lectura. Las posiciones y/o tamaño de estos agujeros así como la geometría de las vías de flujo se pueden variar según sea necesario para controlar el flujo secuencial de líquido deseado dentro del dispositivo proporcionando de ese modo el suministro secuencial de reactivo deseado.
Se pueden parear uno o más componentes porosos con la estructura no porosa intercalándolos entre las partes de cubierta superior y soporte inferior del componente no poroso del dispositivo, mientras el flujo de líquido transcurra a través del material poroso en lugar de por encima, por debajo o de otro modo alrededor del mismo. La parte de la cubierta superior de la estructura no porosa se puede unir con la superficie superior plana de la parte recortada, cubriendo y sellando de ese modo la parte recortada para formar las vías de flujo (canales y/o cámaras) del dispositivo encerradas entre los componentes de la cubierta superior y el soporte inferior.
Algunos reactivos, por ejemplo reactivos acondicionantes, se pueden depositar alternativamente en la superficie inferior de la parte de la cubierta superior. Se puede usar la impresión del mismo reactivo en las partes no porosas tanto superior como inferior de una vía de flujo para aumentar la cantidad de reactivo disponible para el ensayo.
En algunas realizaciones, la estructura no porosa incluirá en la superficie superior una capa de recubrimiento opaco (que puede, por ejemplo, contener material gráfico) que se puede introducir simplemente en un proceso flexográfico, continuo de impresión de tinta(s) deseada(s) o de laminado de material(es) polímero(s) no transparente(s) o se puede fijar manualmente al dispositivo.
Se puede emplear una diversidad de materiales como la parte de soporte inferior o de cubierta superior de la estructura no porosa. Cuando se fabrican los dispositivos de la presente invención en procesos continuos realizados en un formato de banda, se seleccionan los materiales preferiblemente en base a su compatibilidad con técnicas de conversión conocidas, por ejemplo, corte con troquel, impresión, laminado, estampado, colocación en isletas y otras técnicas. Los materiales generalmente también se seleccionan por su compatibilidad con el intervalo completo de condiciones a las que pueden estar expuestos los dispositivos de la presente invención, que incluyen extremos de pH, temperatura, concentración de sal y que son intrínsecamente compatibles sin la interferencia indeseada de los componentes de una muestra de líquido corporal que contiene el uno o más analitos de interés tales como sangre completa, muestras de ensayo obtenidas de sangre completa (por ejemplo, plasma o suero), orina, saliva, sudor, muestras fecales, vaginales y de esperma y muestras especialmente tratadas (por ejemplo, muestras extraídas para ensayos de enfermedades infecciosas).
En algunas realizaciones, los materiales estructurales consistirán en materiales poliméricos, por ejemplo, plásticos, tales como poliésteres, polietileno, polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato, cloruro de polivinilo (PVC), polisulfona, fluoruro de polivinilideno (PVDF) y similares. Estos materiales poliméricos pueden incluir superficies tratadas, por ejemplo, superficies derivatizadas o recubiertas y u otras alteraciones físico-químicas, para potenciar su utilidad en los dispositivos de la presente invención, por ejemplo, proporcionando flujo de líquido potenciado o mejorando la compatibilidad de impresión.
Preferiblemente el material no poroso es una lámina de poliéster, tal como las hechas de tereftalato de polietileno y conocidas como Mylar®.
Los materiales o componentes porosos se pueden formar mediante el procesamiento de componentes fibrosos naturales, tales como, por ejemplo, derivados de celulosa y se pueden presentar en una forma terminada adecuada de materiales parecidos al papel o componentes sintéticos, tales como, por ejemplo, fibra de vidrio o la mezcla de los mismos con aglutinantes sintéticos (tales como, por ejemplo, alcoholes poliméricos y/o derivados de vinilo) y presentarse en una forma terminada adecuada de un material parecido al filtro.
Alternativamente, los componentes porosos se forman a partir de materiales que no sean tejidos ni fibrosos, polímeros seleccionados de, por ejemplo, celulosa y sus derivados (por ejemplo, nitrocelulosa, ésteres de celulosa y celulosa regenerada), polialquilenos (por ejemplo, polietileno), policarbonatos sustituidos con halógenos (por ejemplo, PVDF y similares) y derivados de nylon 66.
Preferiblemente el material poroso comprende una membrana de nitrocelulosa (Millipore Corporation, Bedford, MA) o una membrana de polietileno, tal como una membrana POREX® Lateral-Flo^{TM} (Porex Technologies Corporation, Fairburn, GA) u otras membranas de polímero sinterizado descritas, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada Nº 2003/0096424, publicada el 22 de Mayo del 2003.
VII. Usos
El analito puede ser cualquier compuesto que se puede detectar, por ejemplo moléculas orgánicas pequeñas, péptidos y proteínas, azúcares, ácidos nucleicos, carbohidratos complejos, virus, partículas de bacterias (bacterias, fragmentos bacterianos), lípidos y combinaciones de los mismos, naturales o sintéticos o combinaciones de los mismos. Los analitos pueden incluir, pero sin limitación, fármacos, tanto naturales como sintéticos, diversos componentes de animales, que incluyen seres humanos, tales como componentes sanguíneos, componentes tisulares y similares; microorganismos, tales como bacterias, hongos, protozoarios, virus y similares; componentes o productos de desecho o contaminantes de tales productos en procesamientos comerciales y componentes ambientales, particularmente contaminantes, tales como pesticidas, microorganismos y similares.
En la realización de un ensayo en el dispositivo, se puede ensayar cualquier tipo de líquido, aunque con tal que, tal líquido fluya naturalmente o se pueda tratar para que pueda fluir apropiadamente dentro del dispositivo. A modo de ejemplo, un líquido particularmente viscoso puede requerir que se diluya antes de su uso en el ensayo o tal muestra puede requerir que se extraiga el analito de la misma en solución y se aplique la muestra extraída en el dispositivo. La muestra líquida puede ser una muestra artificial (con adiciones) o puede ser una muestra natural de cualquier fuente, tal como una fuente fisiológica, por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva, líquido espinal, lisado, aspirados nasofaríngeos, etc; una muestra de interés ecológico, por ejemplo, agua, tierra, corrientes de residuos, organismos, etc.; alimentos, por ejemplo, carne, productos lácteos, productos de plantas, otra materia orgánica, etc.; fármacos o contaminantes de fármacos en el procesamiento o similares. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, la muestra se puede someter a tratamiento previo, tal como extracción, destilación, cromatografía, electroforesis en gel, diálisis, disolución, centrifugación, filtración, separación celular y similares. Para la sangre, se puede desear retirar los glóbulos rojos y usar plasma o suero.
VII. Carcasa
Los dispositivos de la invención se pueden contener o encerrar en una carcasa. La carcasa puede ser de cualquier diseño o construcción (por ejemplo, plástico moldeado, estampado o laminado) mientras no impida el flujo de la muestra dentro de las vías de flujo y permita la lectura de la muestra cuando se termine el ensayo. La carcasa puede comprender cualquiera o todos los siguientes:
(1) un orificio de entrada de muestra para recibir una muestra líquida;
(2) un acceso de lectura para permitir la lectura de la zona de captura, permitiendo por tanto la determinación de la presencia o ausencia o cantidad aproximada de un analito en una muestra mediante la lectura de la zona de captura; y, opcionalmente,
(3) un acceso de lectura para permitir la lectura de una zona de control,
(4) un acceso de lectura para permitir la lectura de una zona de fin de ensayo, y/o
(5) uno o más agujeros de ventilación para facilitar el flujo de muestra.
Habiendo descrito la invención en general, se proporcionan los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación de la Etiqueta de Conjugado de Anticuerpo hCG y Fosfatasa Alcalina
Los químicos comunes fueron de calidad de reactivo analítico o de la mayor pureza disponible en el mercado. Un anticuerpo caprino contra hCG (gonadotropina coriónica humana) se conjugó con una fosfatasa alcalina intestinal de ternero usando la química de tioéter heterobifuncional siguiente.
Se diluyó una fosfatasa alcalina recombinante (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con solución salina tamponada con fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) y se sustituyó un número limitado de grupos amino de la enzima con maleimidas usando sulfo-SMCC (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) mediante incubación a temperatura ambiente. La enzima modificada se purificó por filtración en gel en una columna Sephadex G-25 (Amersham Biosciences Corporation, Piscataway, NJ) balanceada en fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) y se determinó un número de grupos maleimida introducidos. Un fragmento F(ab')_{2} de un anticuerpo caprino policlonal anti hCG (Quidel Corporation, San Diego, CA) en tampón Tris 50 mM-NaCl 0,5 M-ázida sódica al 0,1% (pH 8,0) se sometió a reacción con clorhidrato de 2-mercaptoetilamina (TCI America, Portland, OR) a 37ºC en una atmósfera de nitrógeno.
El anticuerpo reducido se purificó por filtración en gel en una columna Sephadex G-25 y se determinaron los equivalentes molares de tioles introducidos en el anticuerpo. Se realizó una reacción de conjugación entre la fosfatasa alcalina modificada y el anticuerpo a temperatura ambiente en una solución salina tamponada con fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5).
Después de inactivar las maleimidas y tioles que no reaccionaron con 2-mercaptoetanol y N-etilmaleimida, respectivamente, se fraccionó el conjugado por una filtración en gel en una columna Sephacryl S-300 HR (Amersham Biosciences Corporation) balanceada con Tris HCl 50 mM, tampón (pH 8,0) que contenía MgCl_{2} 1 mM, ZnCl_{2} 0,1 mM, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA; Biocell Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA) y solución ácida de sodio al 0,1%. Se evaluó la eficacia del conjugado resultante para detectar la hCG en los dispositivos analíticos descritos en los ejemplos posteriores.
Ejemplo 2
Preparación De Una Vía De Flujo Porosa
Se laminó una tira de 2,5 cm de ancho de una membrana de polietileno microporoso de 9 mm de grueso ("membrana Porex®"; Porex Technologies Corporation; véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Nº 2003/0096424, especialmente el Ejemplo 1) con una cinta adhesiva de doble recubrimiento de 2 mm de grueso (Adhesive Research Inc., Glen Rock, PA) por laminado a través de un rodillo de presión. Después de un período de endurecimiento de 24 h necesario para establecer la unión entre las dos capas del laminado, las líneas específicas para analito y de captura de control de 0,5 a 2,0 mm de ancho se separaron usando un X-Y Plotter equipado con un Rapidógrafo (punta dosificadora de 1 mm; Koh-I-Noor Inc., Leeds, MA) a lo largo de la longitud de la tira.
Un anticuerpo monoclonal contra la subunidad beta de hCG (Scripps Laboratories Inc., San Diego, CA) preparado en un tampón POPSO 100 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 250 mM se separó a una distancia de 7 mm de un borde de la membrana Porex. Un anticuerpo caprino contra fosfatasa alcalina (Biodesign International, Saco, ME) preparado en un tampón Tris 25 mM-citrato (pH 5,0) se separó a una distancia de 11 mm de un borde de la membrana.
Una solución acondicionante para una muestra que se sospecha que contiene un analito comprendió BSA disuelto en tampón POPSO 250 mM (pH 7,5) que contenía Triton X-100 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). La solución acondicionante se separó a una distancia de 1 mm del borde de la membrana usando el Rapidógrafo que comprende una punta dosificadora de 2 mm. Las tiras laminadas resultantes se secaron durante 10 min a 45ºC en un horno de convección y posteriormente se almacenaron en una caja lavada con nitrógeno.
Ejemplo 3
Preparación De La Vía de Flujo No Porosa
Como se muestra en la Figura 6 (la "lámina recortada"), se recortó una forma de una vía de flujo no porosa en la cinta adhesiva de doble recubrimiento de 10 mm de grueso (Lohmann Technologies, Hebron, KY) usando corte con troquel rotatorio seguido de laminado en la cinta Mylar® de poliéster de fondo transparente de 7 mm (Transilwrap Company, Inc., Franklin Park, IL) en un proceso de banda continua. La banda resultante de vías de flujo no porosas se cortó en paneles de 26,67 cm de largo que comprendían 10 dispositivos de ensayo cada uno.
La reserva de etiqueta de conjugado de anticuerpo y fosfatasa alcalina (véase el Ejemplo 1) se diluyó en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) complementado con BSA, sacarosa, poli(vinil alcohol) (PVA), MgCl_{2}, ZnCl_{2}, fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Calzyme Laboratories Inc., San Luis Obispo, CA) y Proclin 300 (Supelco, Bellefonte, PA) como conservante. Se preparó un sustrato para la fosfatasa alcalina o el conjugado de la fosfatasa alcalina con el anticuerpo en una formulación que consistía en dos partes, Parte A y Parte B.
La Parte A incluía una sal disódica de 3-indoxil fosfato (3-IP; Biosynth International Inc., Naperville, IL), sorbitol, dietanolamina, OGME (monododecil éter de octaetilenglicol) y PVA disuelto en metanol. La Parte B comprendía tampón ácido L-tartárico carbonato de sodio 2,5 M (pH 10,0). Después de mezclar 48 partes en peso de Parte A con 52 partes en peso de Parte B, se aplicó el sustrato al dispositivo en un intervalo de 15 minutos.
El panel del dispositivo se unió a la matriz de posicionamiento y se aplicaron soluciones del sustrato y del conjugado a la parte inferior de poliéster transparente Mylar® de los dispositivos como se indica en la Figura 2B. El sustrato se colocó al menos 1 mm aguas arriba y a la derecha del canal de entrada de la muestra en forma de un cuadrado de 5x5 mm por difusión de 1,5 \mul de la solución con una punta de micropipeta. El conjugado se colocó al menos 1 mm aguas abajo y a la izquierda del canal de entrada de la muestra en forma de un rectángulo de 2x5 mm por difusión de 1,5 \mul de la solución con una punta de micropipeta. El panel resultante que comprendía los dispositivos se secó a 45ºC en un horno de convección durante 10 min.
Ejemplo 4
Finalización Del Dispositivo
La tira laminada, descrita en el Ejemplo 2 y que comprende la membrana con anticuerpos de control y captura separados, se cortó en tiras de ensayo de 8 mm de ancho para encajar en la parte dilatada de la vía de flujo no porosa (9 mm, Figura 2A, capa intermedia y Figura 2B). Después de retirar el revestimiento para exponer un adhesivo, la tira de ensayo se fijó a la parte dilatada del canal a no más de 2 mm aguas abajo y a la izquierda del conjugado depositado (Figura 2B).
Para construir una cubierta superior, se cortó una tira de 7 mm de cinta de poliéster transparente Mylar para cubrir tanto un borde de la tira de captura porosa con una superposición de 2 mm como todo el emplazamiento del sustrato (Figura 6, la "Cubierta"). Posteriormente, para completar la construcción de la cubierta superior, se cortó en la tira Mylar un orificio de muestra en registro con el canal de la muestra y un agujero de ventilación del sustrato que se extendía ligeramente más allá del emplazamiento del sustrato. Finalmente, se retiró un revestimiento del adhesivo en la vía de flujo no porosa (la "lámina recortada" en la Figura 6) y la cubierta superior terminada se adhirió al mismo. Se puso una tira de 25 cm de largo y 20 mm de ancho de un papel absorbente (Ahlstrom Filtration Inc., Madisonville, TN) sobre tiras de captura en un emplazamiento 15 mm aguas abajo de un borde de la membrana Porex y se adhirió al adhesivo de la lámina recortada.
Ejemplo 5
Funcionamiento De Los Dispositivos Ensamblados Manualmente
Los dispositivos de ensayo se prepararon como se ha descrito en los Ejemplos 2-4 aplicando la etiqueta de conjugado anticuerpo-enzima diluida a 50, 100, 200 ó 400 \mug/ml. Se añadieron 75 \mul de un conjunto de orina femenina (muestra negativa a hCG) o el conjunto con adiciones de hCG (Quidel Corporation) hasta el nivel de 25 mUI/ml (muestra positiva a hCG) a los orificios de muestra de los dispositivos de ensayo. Los dispositivos se supervisaron para la aparición de una línea de captura azul específica para hCG.
Se registró el período de tiempo para la aparición de una señal de color débil ("tiempo para la señal") de las muestras positivas. No estuvieron presentes señales visibles en los dispositivos ensayados con las muestras negativas en todos los niveles de conjugado. La señal apareció progresivamente más rápido al aumentar los niveles del conjugado, mientras que la especificidad del ensayo se mantuvo sin cambios.
Ejemplo 6
Inmunoensayo basado en Fluorescencia para hCG
Se preparó una primera capa de tinta insoluble en agua para cubrir las superficies superior e inferior de la vía de flujo no porosa disolviendo acetato de polivinilo (Scientific Polymer Products Inc., Ontario, NY) en propil acetato usando un mezclador eléctrico con una paleta de hélice metálica. Se formuló un sustrato imprimible para fosfatasa alcalina como una suspensión de propanol de la siguiente forma: se combinaron y pulverizaron carbonato de sodio, manitol, OGME, dietilamina, sal disódica de Sustrato AttoPhos® (sal disódica de 2'-[2-benzotiazoil]-6'-hidroxibenzotiazol fosfato; Promega Corporation, Madison, WI) a temperatura ambiente con un homogenizador mezclador de alta velocidad. En la siguiente etapa, se disolvieron en la suspensión sílice pirógena (Sigma Chemical Company) y polivinilpirrolidona (PVP). Después la tinta resultante estuvo lista para impresión o almacenamiento refrigerado antes de la impresión. Se preparó una tinta acondicionante de muestra disolviendo BSA y trehalosa en Tris-HCl (pH 8,0) 2 M seguido de una adición de Proclin 300 (Supelco, Bellefonte, PA) como conservante. Después esta tinta también estuvo lista para uso inmediato o almacenamiento refrigerado.
A continuación, se realizó una tinta de impresión de etiqueta en dos etapas. En la primera etapa, se mezcló tampón Tris-HCl 2M (pH 8,0) con la reserva de etiqueta y fosfatasa alcalina intestinal de ternero descrita en el Ejemplo 3. En la siguiente etapa, se disolvieron en serie trehalosa, MgCl_{2}, Fragmento Peptídico de Bloqueo (Toyobo, Osaka, Japón) y Poly-Pep bovina (Sigma Chemical Company) para producir la tinta de impresión de etiqueta final. Se preparó una vía de flujo porosa que comprendía líneas de captura y control usando un proceso de banda continua como el descrito en el Ejemplo 2. Posteriormente, los dispositivos analíticos para el inmunoensayo basado en fluorescencia de hCG se crearon de una manera y con los materiales que se han descrito en el Ejemplo 4 mediante la adición de una vía de flujo porosa, una cubierta superior y absorbente.
Durante el funcionamiento, la fosfatasa alcalina separa el Sustrato AttoPhos® (sal disódica de 2'-[2-benzotiazoil]-6'-hidroxibenzotiazol fosfato; Promega Corporation, Madison, WI) para producir fosfato inorgánico y el alcohol, 2'-[2-benzotiazoil]-6'-hidroxibenzotiazol (BBT). Esta conversión catalizada por enzima de la forma fosfato del Sustrato AttoPhos® a BBT viene acompañada de la potenciación de las propiedades de fluorescencia. En relación con el Sustrato AttoPhos®, el BBT ha aumentado enormemente el rendimiento cuántico y la excitación de fluorescencia y espectro de emisión que se desplazan bien hacia la región visible. En relación con otros indicadores fluorométricos, el anión de BBT tiene un desplazamiento de Stokes inusualmente grande de 120 mm, que conduce a niveles menores de fluorescencia de fondo y sensibilidad de detección mayor. Para evaluar el funcionamiento de los dispositivos analíticos basados en fluorescencia, se añadieron 75 \mul de un conjunto de orina femenina (muestras negativas a hCG) o el conjunto con adiciones de hCG (Quidel Corporation) hasta el nivel de 0,8, 6 ó 25 mUI hCG/ml (muestras positivas a hCG) a cada dispositivo. Los dispositivos se iluminaron con un diodo de emisión de luz de 400 nm y se supervisó la emisión de fluorescencia a 500-600 nm usando un dispositivo de cargas interconectadas no refrigerado. Los resultados demostraron una sensibilidad analítica de 0,8 mUI hCG/ml a los 10 min después de la adición de la muestra al dispositivo.
Como se usa en este documento, los términos "un" "unos" y "cualquiera" tienen por objeto incluir tanto las formas singulares como las plurales.
Habiendo descrito con todo detalle esta invención, los especialistas en la técnica apreciarán que la misma se puede realizar dentro de un amplio intervalo de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del alcance de la invención y sin experimentación excesiva. Aunque esta invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que puede sufrir modificaciones adicionales. Esta solicitud tiene por objeto cubrir cualquiera de las variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la presente descripción como las que están dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y como puede aplicarse a los elementos esenciales expuestos anteriormente en este documento.

Claims (31)

1. Un dispositivo analítico para realizar un ensayo para determinar la presencia o cantidad aproximada de un analito en una muestra líquida, comprendiendo el dispositivo:
una vía de flujo primaria;
una zona de captura, capaz de inmovilizar el analito dentro de la vía de flujo primaria; y
una vía de flujo secundaria;
en el que la única fuente de líquido de la vía de flujo secundaria es a partir de la vía de flujo primaria, y que se caracteriza porque:
la vía de flujo secundaria está contigua a la vía de flujo primaria sólo en una confluencia única, aguas arriba de la zona de captura.
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2. El dispositivo de la reivindicación 1 en el que la vía de flujo primaria comprende material poroso y no poroso.
3. El dispositivo de la reivindicación 1 en el que la vía de flujo secundaria comprende material no poroso.
4. El dispositivo de la reivindicación 1 comprendiendo además:
una zona de marcaje en la vía de flujo primaria que comprende al menos una etiqueta que puede formar un complejo con el analito,
en el que dicha etiqueta es movible sustancialmente cuando se pone en contacto con la muestra líquida.
en el que la zona de marcaje se localiza aguas arriba de y en comunicación fluida con la zona de captura; y
en el que la zona de captura comprende un reactivo de captura inmovilizado que puede unir al analito.
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5. El dispositivo de la reivindicación 4 en el que la zona de marcaje se localiza aguas abajo de la confluencia de la vía de flujo secundaria con la vía de flujo primaria.
6. El dispositivo de la reivindicación 4 en el que la vía de flujo primaria comprende material poroso y no poroso y donde la zona de marcaje se localiza en el material no poroso y la zona de captura se localiza sobre o en el material poroso.
7. El dispositivo de la reivindicación 4 en el que la vía de flujo primaria comprende material poroso y no poroso y donde la zona de marcaje y la zona de captura se localizan sobre o en el material poroso.
8. El dispositivo de la reivindicación 1 que comprende además un material absorbente aguas abajo de y en comunicación fluida con la zona de captura.
9. El dispositivo de la reivindicación 4 en el que la etiqueta comprende un marcador visualmente detectable seleccionado entre el grupo que consiste en un resto coloreado, un resto fluorescente, un resto quimiluminiscente y un resto fosforescente.
10. El dispositivo de la reivindicación 4 en el que la etiqueta comprende una enzima, una enzima que es capaz de reaccionar con un sustrato de enzima para generar una señal visualmente detectable.
11. El dispositivo de la reivindicación 10 en el que la enzima se selecciona del grupo que consiste en hidrolasas, esterasas y oxidorreductasas.
12. El dispositivo de la reivindicación 10 que comprende además un reactivo de marcador localizado en la vía de flujo secundaria dicho reactivo de marcador comprendiendo un sustrato de enzima.
13. El dispositivo de la reivindicación 12, en el que una señal visualmente detectable se genera por reacción de la enzima con el sustrato de enzima.
14. El dispositivo de la reivindicación 1 que comprende además una zona de control en la vía de flujo primaria.
15. El dispositivo de la reivindicación 1 que comprende además una zona de fin de ensayo en la vía de flujo primaria aguas abajo de la zona de captura.
16. El dispositivo de la reivindicación 15 en el que la zona de fin de ensayo comprende un reactivo que produce una señal detectable cuando se pone en contacto con la muestra.
17. El dispositivo de la reivindicación 1 que comprende además una zona acondicionante en la vía de flujo primaria.
18. El dispositivo de la reivindicación 1 que comprende además una carcasa.
19. El dispositivo de la reivindicación 18 que comprende además un medio para desplazar el aire del dispositivo en el que dicho aire se desplaza después de la introducción de muestra líquida en el dispositivo.
20. El dispositivo de la reivindicación 19 en el que el medio para retirar el aire comprende al menos un agujero de ventilación de aire.
21. El dispositivo de la reivindicación 20 que comprende un agujero de ventilación de aire localizado en el extremo aguas arriba de la vía de flujo secundaria.
22. El dispositivo de la reivindicación 21 que comprende además un agujero de ventilación de aire en el extremo aguas abajo del dispositivo.
23. El dispositivo de la reivindicación 4 que comprende además un marcador en la vía de flujo secundaria.
24. El dispositivo de la reivindicación 23, en el que la determinación de la presencia o cantidad aproximada del analito en la muestra líquida comprende la detección de una señal ópticamente detectable.
25. El dispositivo de la reivindicación 24, en el que dicho marcador comprende un primer elemento de enlace acoplado a un resto coloreado y dicha etiqueta comprende un segundo elemento de enlace y en el que dicho primer elemento de enlace se puede unir a dicho segundo elemento de enlace.
26. El dispositivo de la reivindicación 25, en el que el analito presente en la muestra líquida se una a dicha etiqueta y está unido a dicho reactivo de captura inmovilizado; y en el que dicho primer elemento de enlace acoplado a dicho resto coloreado está unido a dicho segundo elemento de enlace comprendido dentro de dicha etiqueta, proporcionando de ese modo una señal ópticamente detectable dentro de dicha zona de captura.
27. El dispositivo de la reivindicación 26, en el que dicho primer elemento de enlace y dicho segundo elemento de enlace son diferentes y son biotina y avidina respectivamente o avidina y biotina respectivamente.
28. Un método para determinar la presencia o cantidad aproximada de al menos un analito en una muestra líquida, que comprende:
aplicar la muestra líquida a la vía de flujo primaria del dispositivo de la reivindicación 1; y
determinar la presencia o cantidad aproximada del analito en la zona de captura.
29. El método de la reivindicación 28, en el que el dispositivo comprende además una zona de marcaje situada aguas arriba de la zona de captura y aguas abajo de la confluencia de la vía de flujo secundaria con la vía de flujo primaria.
30. El método de la reivindicación 28, en el que la vía de flujo primaria comprende material poroso y no poroso.
31. El método de la reivindicación 28, en el que el dispositivo comprende además un material absorbente aguas abajo de y en comunicación fluida con la zona de captura.
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