ES2319381T3 - Vacunas virales basadas en bacterias invasivas. - Google Patents

Abstract

Una vacuna contra el virus herpes simplex (VHS) que comprende una bacteria invasiva y atenuada o invasiva y apatógena, cuya bacteria comprende una secuencia codificante que codifica un antígeno de VHS en una forma que permite que dicha secuencia codificante se transfiera a una célula hospedadora de un hospedador humano o animal que la bacteria es capaz de invadir, y que sea expresada por dicha célula para formar dicho antígeno sin la introducción de un agente antimicrobiano para lisar la bacteria.

Description

Vacunas virales basadas en bacterias invasivas.

Campo de la invención

La invención se refiere a vacunas, especialmente a vacunas profilácticas, contra una enfermedad mediada por el Virus Herpes Simplex (VHS).

Antecedentes de la invención

Como se indicó en una revisión reciente de Bernstein y Stanberry (1999) y se discutió más exhaustivamente en ese documento y en las referencias citadas en él, los virus herpes simplex de tipo 1 y 2 (VHS-1 y VHS-2) son frecuentes en todo el mundo. No solamente producen una infección primaria, sino también infecciones latentes y recurrentes. VHS puede provocar una diversidad de enfermedades clínicas que incluyen herpes genital, infecciones orofaciales (p.ej., gingivoestomatitis, herpes labial, faringitis), infecciones cutáneas (p.ej., panadizo, herpes gladiatorum), infecciones oculares, herpes neonatal, encefalitis herpética, infección diseminada y eritema multiforme.

La gravedad y la duración de la mayoría de infecciones primarias sintomáticas se pueden reducir mediante la terapia antiviral, pero en general esto no afecta al establecimiento de la latencia ni reduce la recurrencia.

De forma similar, el tratamiento de las infecciones recurrentes puede disminuir la gravedad de la enfermedad, y la terapia inhibidora diaria puede disminuir las recurrencias tanto sintomáticas como asintomáticas, pero el tratamiento no afecta a la latencia y el efecto desaparece cuando se suspende la terapia. La naturaleza de por vida de esta infección, la prevalencia creciente de herpes genital a pesar de la disponibilidad de terapias antivirales eficaces y la gravedad de la enfermedad en los neonatos y en los individuos inmunodeprimidos hace que el VHS sea un objetivo importante en el desarrollo de vacunas. Sin embargo, todavía no hay disponible ninguna vacuna eficaz (Bernstein et al,
1999).

Se debe hacer una distinción entre las vacunas profilácticas y terapéuticas. Como discutieron Bernstein et al (1999), el objetivo de una vacuna profiláctica, preventiva, es evitar la enfermedad clínica aguda, la infección viral y la replicación viral en el aparato genital, y evitar o reducir el establecimiento de la latencia y de las recurrencias posteriores de la enfermedad, sintomáticas o asintomáticas. De manera ideal, tal vacuna proporcionaría una "inmunidad esterilizante" amplia y duradera en los puntos de entrada del virus al organismo, p.ej. el aparato genital, la mucosa nasal y orofaríngea y el ojo. Esto eliminaría el virus en el punto de entrada antes de la replicación o de la entrada al sistema nervioso periférico. Naturalmente, tal vacuna profiláctica es sumamente deseable, ya que evitaría la infección en vez de tratar simplemente una infección establecida. Esto es cierto en general para cualquier vacuna, pero una vacuna profiláctica es aún más deseable en el caso de una enfermedad mediada por VHS, debido a la capacidad del VHS de establecer la latencia y dar lugar a infecciones recurrentes.

En contraste, las vacunas terapéuticas se dirigen al tratamiento de pacientes que tienen una infección latente establecida. Así, su objetivo es reducir las recurrencias clínicas de la enfermedad y reducir la diseminación viral. (La diseminación es el fenómeno mediante el cual los virus se liberan del aparato genital, posiblemente en ausencia de síntomas de enfermedad, lo que conduce a la transmisión de la enfermedad por VHS a un individuo sin afectación previa. Así, además de tratar al individuo en cuestión, las vacunas terapéuticas se dirigen a evitar la propagación posterior de la enfermedad mediada por VHS).

Bernstein et al (1999) identifican seis tipos posibles de vacunas de VHS. Estos son: (i) vacunas con viriones inactivados, (ii) componentes o subunidades de viriones producidos de manera recombinante (es decir, proteínas), (iii) mutantes vivos de VHS atenuados genéticamente, (iv) mutantes de VHS deficientes de replicación, (v) vacunas de vectores vivos que expresan antígenos de VHS, y (vi) vacunas de ADN.

No se ha demostrado que las vacunas basadas en viriones (i) sean eficaces contra VHS, y tienen varias desventajas, p.ej. problemas para proporcionar concentraciones uniformes de inmunógenos, asegurar que todos los virus están inactivados, eliminar el ADN viral contaminante potencialmente oncogénico, y los costes de producción elevados.

Las vacunas de subunidades (ii) se consideran más seguras pero menos eficaces en la inducción de respuestas mediadas por células. Las vacunas de subunidades han tenido cierto éxito en el tratamiento del herpes genital recurrente experimental y en la reducción de la diseminación viral, pero esta estrategia no se ha aplicado con éxito todavía a vacunas profilácticas en vez de terapéuticas.

Las vacunas de virus vivos atenuados (iii) han sido igualmente ineficaces. En general, las vacunas de virus vivos se desarrollan mediante pases repetidos de virus en cultivo celular hasta que el virus se hace menos virulento. Esto no ha funcionado con VHS, ya que los pases en cultivo celular no dan como resultado una atenuación estable, de forma que las cepas de VHS de los pases pueden recuperar toda su virulencia. También se ha intentado la definición y la eliminación de genes específicos implicados en la latencia o la reactivación viral. Un gen candidato fue el gen de la timidina quinasa (Tk). Se desarrolló una vacuna de VHS-2 que era protectora en los sistemas de exposición experimentales, pero se demostró que era escasamente inmunógena en los ensayos de fase I, siendo así ineficaz. La deleción del gen gamma 34.5 (ICP 34.5), que se cree que es fundamental para la neurovirulencia, parece disminuir la virulencia e incrementar, pero quizás no eliminar, la latencia y la reactivación.

Se han usado mutantes de VHS deficientes de replicación (iv) en el tratamiento del herpes genital recurrente experimental en conejillos de Indias, pero no se ha diseñado ninguna vacuna profiláctica eficaz mediante el uso de esta estrategia.

También se han investigado las vacunas de vectores vivos (v). En una vacuna de vector vivo, se insertan uno o más genes de VHS en un vector viral o bacteriano capaz de replicarse, tal como un adenovirus. Tras la inmunización, el vector se replica y expresa las proteínas inmunógenas. Los vectores posibles incluyen virus vaccinia, virus varicela-zóster, virus adenoasociados y la bacteria Salmonella typhimurium. Chabalgoity et al (1996) y Karem et al (1997) ejemplifican esta aproximación.

Las vacunas de ADN (vi) han tenido solamente un éxito limitado. Existen algunos informes que indican que la inmunización intramuscular con un plásmido que porta un gen que codifica un antígeno de VHS (glicoproteína D o B) bajo control de un promotor eucariótico es eficaz para inducir la protección en ratones y en conejillos de Indias contra una exposición intravaginal con el virus. Sin embargo, estos estudios también dejan claro que estas vacunas son ineficaces en la prevención real de la infección. Los intentos de inducir una inmunidad mucosa protectora mediante la administración de ADN de forma intranasal han mostrado igualmente malos resultados en la prevención de la infección, a pesar de provocar la producción de títulos elevados de anticuerpos IgA específicos.

Por lo tanto, se puede observar que todavía no hay disponible ninguna vacuna realmente profiláctica, ya que todavía no hay disponible ninguna vacuna que evite la invasión viral. Si no se puede evitar la invasión viral, se puede establecer la latencia y puede darse como resultado la enfermedad recurrente. Esto es particularmente grave para lactantes nacidos de madres infectadas que padecen la enfermedad recurrente.

Obviamente, existe por lo tanto la necesidad de desarrollar vacunas de VHS profilácticas. Actualmente no hay ninguna vacuna de VHS profiláctica eficaz, y la idea más extendida es que la inmunidad hacia VHS pocas veces, o nunca, es adecuada para evitar la invasión viral. Por ejemplo, Bernstein et al (1999) indican que no consideran que la inducción de una inmunidad esterilizante duradera, especialmente en el aparato genital, sea factible en este momento. Como resultado, su opinión es que no se debería esperar que las vacunas de VHS profilácticas en humanos eviten la infección completamente, sino que proporcionen solamente protección contra los signos y síntomas clínicos de la infección por VHS.

Sumario de la invención

En contra de estos antecedentes, se ha identificado, sorprendentemente, una estrategia para el desarrollo de una vacuna de VHS profiláctica eficaz.

Recientemente se ha informado del uso de cepas atenuadas de Shigella y Salmonella como vehículos para administrar ADN plasmídico in vivo en células eucarióticas (Sizemore et al, 1995; Darji et al, 1997; Paglia et al, 1998; Fennelly et al, 1999). La patente de EE.UU. nº 5.877.159 (Powell/Universidad de Maryland en Baltimore, 2 de marzo de 1999) también proporciona hallazgos similares. Sin embargo, la patente de EE.UU. nº 5.877.159 no proporciona datos que demuestren la protección contra VHS. En particular, no proporciona ningún medio mediante el cual se pueda obtener una respuesta inmunitaria mucosa específica contra VHS. En el presente documento se demuestra que el uso de una cepa atenuada de Salmonella para transferir el gen de la glicoproteína de VHS es eficaz para inducir la protección contra una exposición intravaginal. Esto forma la base de una estrategia para desarrollar una vacuna profiláctica contra VHS.

Además, se ha demostrado definitivamente que la inmunidad obtenida se debe a la transcripción de la proteína mediante un proceso nuclear eucariótico, probablemente en los macrófagos y las células dendríticas, y no mediante la expresión de la proteína por las bacterias invasoras. Este es un punto de importancia fundamental cuando se usa una bacteria intracelular para administrar ADN a las células eucarióticas. La otra posibilidad es que la proteína sea producida por las propias bacterias invasoras mediante una iniciación inespecífica de la transcripción bajo control de un promotor críptico. En otros informes que usaban esta técnica en sistemas que no eran de VHS, se pusieron genes indicadores (\beta-galactosidasa o GFP) bajo el control de promotores procarióticos o eucarióticos (Darji et al. 1997; Paglia et al, 1998). En estos informes, la ausencia de actividad cuando se usó un promotor procariótico se tomó como una indicación de que la síntesis de la proteína se debía a sucesos eucarióticos. Además, por medio de RT-PCRT, se demostró la eliminación de un intrón colocado en una región no codificante en una pequeña fracción de ARN (Darji et al, 1997).

Para demostrar de forma rigurosa que la totalidad de la proteína producida procedía de un proceso nuclear eucariótico, se introdujo un intrón en la GFP. Se hallaron niveles similares de expresión de la GFP en los macrófagos peritoneales tras la inoculación intraperitoneal de salmonelas que albergaban el plásmido de GFP con o sin el intrón. Además, tras la administración oral se hallaron macrófagos transfectados en las placas de Peyer, la lámina propia del intestino delgado y en el bazo. Esta es la primera vez que se ha demostrado de manera concluyente de la expresión se da solamente en las células del hospedador eucariótico.

Además, se debería tener en cuenta la distinción entre las técnicas de la presente invención y las de Chabalgoity et al (1996) y Karem et al (1997). En esos estudios, se usó S. typhimurium como vector para administrar antígenos de VHS-1 a un organismo. Sin embargo, de manera crucial, la expresión tuvo lugar en la bacteria, en vez de mediante la transferencia a las células eucarióticas del hospedador.

Además, el documento WO 98/44131 (Walter Reed Army Institute of Research) describe un método mediante el cual se transforman Shigella atenuadas con ADN que codifica antígenos, y se dejan entrar en células de riñón de crías de hámster (BHK). Después se introducen agentes antimicrobianos para lisar las bacterias atenuadas, de forma que el ADN que codifica los antígenos se libera en las células. La presente invención no requiere el uso de tales agentes líticos antimicrobianos. En su lugar, el ADN que codifica los antígenos se transfiere sin la necesidad de introducir agentes líticos externos.

Se ha demostrado que la inmunización con ADN basada en Salmonella con una expresión de antígenos que tiene lugar en las células del hospedador mamífero es un método eficaz para inducir una respuesta inmunitaria celular mucosa y sistémica protectora contra la infección por VHS. En otros informes en los que se administró ADN de plásmidos que portaban el gen gD mediante la vía intramuscular, se analizó principalmente la respuesta inmunitaria humoral, y aunque se obtuvo protección tras una exposición intravaginal, no se evitó la infección (Bourne et al, 1996 (a) y (b)). Sin embargo, en el presente estudio se obtuvo un 100% de protección en presencia de niveles muy bajos de anticuerpos (indetectables en el lavado vaginal). Además, en contraste con lo que se observó tras la inmunización intramuscular, no se recuperaron virus en los lavados vaginales tras la exposición.

Recientemente se ha vuelto a abordar la cuestión de qué tipo de inmunidad está implicada en la protección tras una exposición mucosa (Kuklin et al, 1997). Actualmente se cree que la protección contra la infección por VHS está mediada por las células T, y que las células productoras de IFN-\gamma pueden desempeñar un papel importante.

En los estudios previos se demostró que los niveles elevados de IgA secretora específica no fueron suficientes para proteger a los ratones contra la infección intravaginal con dosis elevadas o incluso bajas de VHS (Kuklin et al, 1997). La conclusión de que los anticuerpos en el lugar de la infección mucosa fueron normalmente inadecuados para evitar la invasión procedió de experimentos en los que los ratones inmunizados de forma intranasal con vaccinia recombinante que expresaba glicoproteínas de VHS se expusieron de forma vaginal con VHS. A pesar de los títulos elevados de anticuerpos vaginales tanto IgA como IgG contra la glicoproteína de inmunización, tras la exposición viral se dio la infección y se recuperaron virus de los lavados vaginales. Además, la infección se confirmó porque se indujo una respuesta de Ab contra otras glicoproteínas, y además los animales expuestos desarrollaron respuestas de Ab secundarios hacia la glicoproteína de inmunización.

Este patrón de sucesos fue evidente incluso en algunos animales inmunes expuestos a una dosis mínima de virus (Kuklin et al, 1998).

En el presente documento se presentan datos que apoyan firmemente la idea de que la inmunidad celular es responsable del aclaramiento del virus. Los resultados demuestran que, tras la exposición intravaginal, los ratones inmunizados con salmonelas que portan un plásmido que comprende el gen de la glicoproteína D (pCIgD) no desarrollaron una respuesta de anticuerpos secundarios contra la glicoproteína de inmunización. Además, en contraste con lo que se observó tras la inmunización intramuscular con ADN plasmídico desnudo, la inmunización con salmonelas que albergaban el vector pCIgD dio como resultado la ausencia de virus en el tracto vaginal tras la exposición, es decir, el aclaramiento viral completo. La inmunidad celular se puede estimular adicionalmente mediante el uso de citocinas tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF), la interleucina-12 u otras moléculas que incrementan la respuesta inmunitaria celular. Según la invención, por lo tanto, la coadministración de tales moléculas puede ayudar a asegurar el aclaramiento viral.

Actualmente no hay ninguna vacuna de VHS profiláctica eficaz, y la idea más extendida es que la inmunidad hacia VHS pocas veces, o nunca, es adecuada para evitar la invasión viral. En el presente documento se proporcionan resultados que indican que la inmunización con salmonelas que albergan el gen de la glicoproteína D induce una activación intensa de las células secretoras de IFN-\gamma a nivel mucoso y sistémico, similar a la observada tras una infección primaria.

Los resultados abren la posibilidad de preparar una vacuna profiláctica contra VHS. El éxito de esta estrategia de inmunización para evitar la infección se podría deber al hecho de que se induce una respuesta inmunitaria correcta en los lugares correctos, es decir, una activación intensa de las células secretoras de IFN-\gamma en los compartimentos sistémicos y mucosos, que incluyen el aparato genital.

Por lo tanto, la invención proporciona:

Una vacuna contra el virus herpes simplex (VHS) que comprende una bacteria invasiva y atenuada o invasiva y apatógena, cuya bacteria comprende una secuencia codificante que codifica un antígeno de VHS en una forma que permite que dicha secuencia codificante se transfiera a una célula hospedadora de un hospedador humano o animal que la bacteria es capaz de invadir, y que sea expresada por dicha célula para formar dicho antígeno sin la introducción de un agente antimicrobiano para lisar la bacteria.

La invención también proporciona:

Una bacteria como se acaba de definir (una bacteria de la invención).

La invención también proporciona:

Una bacteria de la invención para el uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal.

La invención también proporciona:

El uso de una bacteria de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad humana o animal mediada por VHS.

La invención también proporciona:

Una composición farmacéutica para la vacunación contra una enfermedad mediada por VHS que comprende una bacteria de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: A) Distribución de subclases de la respuesta de anticuerpos específicos en suero. Los ratones se inmunizaron con salmonela que albergaba el plásmido pCIgD o pCI. Quince días después de la última dosis se determinaron los niveles de anticuerpos contra los epítopos 8-23 mediante ELISA en una dilución 1/100. B) Desarrollo de la reacción de DTH en ratones inmunizados con SL7207pCIgD o SL7207pCI. Cada grupo de seis ratones se inmunizó como se describió en los métodos. Para el ensayo de DTH, se inyectó a cada ratón 10^{8} VHS inactivados mediante UV (titulados antes de la inactivación) en la oreja derecha, o extracto de BHK en la oreja izquierda. *p<0,01. C) Expresión de IL-2R por células de bazo CD4+ tras la estimulación in vitro con VHS inactivados mediante UV (panel izquierdo) o con antígeno simulado (panel derecho). Se definió una ventana de células T CD4+ y se exhibieron los histogramas de la expresión de IL-2R. Los valores representan la media \pm DE de cinco animales por grupo. Para el análisis estadístico se usó la prueba U de Mann-Whitney.

Figura 2: Los ratones se inmunizaron con salmonela. Quince días después de la última inmunización las suspensiones de células de bazo, de placas de Peyer (PP) y de nódulo linfático de íleon (NLI) se reestimularon in vitro con VHS inactivados mediante UV o antígeno simulado durante un periodo de 24 h. Las frecuencias de células productoras de citocinas en bazo (A), PP (B) e NLI se midieron mediante el ensayo ELISPOT. Se presentan los datos acumulados de tres experimentos (tres ratones por grupo en cada experimento). Las barras representan la media \pm EE. *p<0,001, **p<0,05.

Figura 3: Perfil de citocinas liberadas por células de bazo estimuladas con VHS, antígeno simulado o péptido 291-306. Se cultivaron 10^{7} células/ml por cuadruplicado en placas de 24 pocillos, y después de 24 y 48 h de cultivo se recogieron los sobrenadantes y se determinó el nivel de citocinas mediante ELISA tipo sándwich. Las barras representan la media \pm EE. *p<0,001.

Figura 4: Respuesta inmunitaria protectora tras inmunización genética oral. Se inmunizaron grupos de cinco ratones como se describió en los métodos con salmonela que albergaba el plásmido pCIgD o pCI. Quince días después de la última inmunización se inyectó a los ratones 3 mg de DP. Cinco días tras la administración de DP, los ratones se expusieron de forma intravaginal con 5x10^{6} UFP de la cepa VHS2 MS. Se asignaron índices numéricos a los signos específicos de enfermedad mediante el uso de la siguiente escala: 0, sin síntomas; 1, inflamación leve; 2, hinchazón moderada; 3, inflamación grave; 4, parálisis y 5, muerte. El índice de lesiones medio diario se calculó dividiendo la suma de los índices de lesiones de un grupo por el número de observaciones. Los gráficos presentan los datos acumulados de tres experimentos independientes con cinco ratones por grupo en cada experimento.

Figura 5: Expresión de GFP en macrófagos peritoneales. Se inoculó de forma intraperitoneal a tres ratones por grupo 5x10^{6} salmonelas que albergaban uno de los siguientes plásmidos: pCIgD, pCIGFP o pCIGFPint. Dos días después de la inoculación se recogieron las células de la cavidad peritoneal y se determinó la expresión de GFP mediante análisis de citometría de flujo. La caracterización del subgrupo de células que expresaban GFP se llevó a cabo mediante análisis fluorimétrico de dos colores tras la tinción con PE-MAC3 o PE-CD19. No se observó la expresión de GFP en las células B CD19+. Los valores son la media \pm DE de cuatro ratones por grupo.

Figura 6: Caracterización de la transferencia génica de ADN mediada por S. typhimurium in vivo. Se administró oralmente a los ratones salmonela que albergaba uno de los siguientes plásmidos: pCI, pCIGFP o pCIGFPint. Cinco días después de la última dosis se determinó la expresión de GFP mediante citometría de flujo en placas de Peyer (A, B, C), lámina propia del intestino delgado (D, E, F) y en el bazo (G, H, I). Se identificaron los subgrupos de células que expresaban GFP mediante análisis fluorocitométrico de dos colores tiñendo con PE-anti CD19 (células B), PE-anti CD3 (células T) o PE-MAC3 (macrófagos). Solamente el subgrupo de macrófagos expresó GFP. No se halló expresión de GFP en las células B o T. Los valores mostrados representan la media \pm DE de cuatro ratones).

Descripción detallada de la invención Bacterias

Las bacterias de la invención están atenuadas o son apatógenas. Esto es para evitar que las bacterias provoquen enfermedad en el sujeto a tratar. Una alternativa es usar bacterias que no tengan características patógenas de manera natural. Otra alternativa es usar bacterias atenuadas, es decir, bacterias cuyas características patógenas se han eliminado o reducido hasta un nivel clínicamente aceptable. En el presente documento, el término "atenuado" cubre cualquier bacteria cuyas características indeseables se han reducido hasta un nivel aceptable por cualquier medio. Las bacterias se pueden atenuar así mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica.

Bacterias atenuadas

En general, la atenuación se lleva a cabo introduciendo una o más mutaciones de atenuación. Se pueden usar las técnicas y mutaciones de atenuación conocidas, o los expertos en la técnica pueden idear técnicas y mutaciones de atenuación nuevas en el contexto de la invención.

Las mutaciones de atenuación se pueden introducir en los patógenos bacterianos mediante el uso de mutagénesis inespecífica químicamente, mediante el uso de agentes tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, o mediante el uso de técnicas de ADN recombinante; técnicas genéticas clásicas, tales como mutagénesis mediante Tn10, transducción mediada por P22, entrecruzamiento mediado por fago \lambda, y transferencia conjugacional; o mutagénesis dirigida mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Se prefieren las técnicas de ADN recombinante. Los ejemplos de tales mutaciones de atenuación incluyen:

(i)

mutaciones auxótrofas, tales como las mutaciones aro (Hoiseth et al, Nature, 291: 238-239 (1981)), gua (McFarland et al, Microbiol. Path., 3:129-141 (1987)), nad (Park et al, J. Bact., 170:3725-3730 (1988)), thy (Nnalue et al, Infect. Immun. 55:955-962 (1987)), y asd (Curtiss, anteriormente mencionado);

(ii)

mutaciones que inactivan funciones reguladoras globales, tales como las mutaciones cya (Curtiss et al, Infect. Immun., 55:3035-3043 (1987)), crp (Curtiss et al (1987), anteriormente mencionado), phoP/phoQ (Groisman et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:7077-7081 (1989); y Miller et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5054-5058 (1989)), phoP^{c} (Miller et al, J. Bact., 172: 2485-2490 (1990)) o ompR (Dorman et al, Infect. Immun., 57: 2136-2140 (1989));

(iii)

las mutaciones que modifican la respuesta a las agresiones, tales como las mutaciones recA (Buchmeier et al, Mol. Micro., 7:933-936 (1993)), btrA (Johnson et al, Mol. Micro., 5:401-407 (1991)), htpR (Neidhardt et al, Biochem. Biophys. Res. Com., 100:894-900 (1981)), hsp (Neidhardt et al, Ann. Rev. Genet., 18:295-329 (1984)) y groEL (Buchmeier et al, Sci., 248:730-732 (1990));

(iv)

las mutaciones en factores de virulencia específicos, tales como las mutaciones IsyA (Libby et al, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 91:489-493 (1994)), pag o prg (Miller et al (1990), anteriormente mencionado; y Miller et al (1989), anteriormente mencionado), iscA o virG (d'Hauteville et al, Mol. Micro., 6:833-841 (1992)), plcA (Mengaud et al, Mol. Microbiol., 5:367-72 (1991); Camilli et al, J. Exp. Med., 173:751-754 (1991)), y act (Brundage et al, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 90:11890-11894 (1993));

(v)

las mutaciones que afectan a la topología del ADN, tal como la mutación topA (Galan et al, Infect. Immun., 58:1879-1885 (1990));

(vi)

las mutaciones que bloquean la biogénesis de los polisacáridos de la superficie, tales como las mutaciones rfb, galE (Hone et al, J. Infect. Dis., 156:164-167 (1987)) o via (Popoff et al, J. Gen. Microbiol., 138:297-304 (1992));

(vii)

las mutaciones que modifican los sistemas de apoptosis, tales como las mutaciones sacB (Recorbet et al, App. Environ. Micro., 59:1361-1366 (1993); Quandt et al, Gene, 127:15-21 (1993)), nuc (Ahrenholtz et al, App. Environ. Micro., 60:3746-3751 (1994)), hok, gef, kil, o phlA (Molin et al, Ann. Rev. Microbiol., 47:139-166 (1993));

(viii)

las mutaciones que introducen sistemas de apoptosis, tales como los lisógenos codificados por P22 (Rennell et al, Virol., 143:280-289 (1985)), \lambda mureína transglicosilasa (Bienkowska-Szewczyk et al, Mol. Gen. Genet., 184:111-114 (1981)) o gen S (Reader et al, Virol., 43:623-628 (1971)); y

(ix)

las mutaciones que interrumpen o modifican el ciclo celular correcto, tal como la mutación minB (de Boer et al, Cell, 56:641-649 (1989)).

Las mutaciones de atenuación se pueden expresar de manera constitutiva o bajo el control de promotores inducibles, tales como la familia de promotores de choque térmico sensibles a la temperatura (Neidhardt et al, anteriormente mencionado), o el promotor nirB inducido de forma anaerobia (Harborne et al, Mol. Micro., 6:2805-2813 (1992)), o promotores reprimibles, tales como uapA (Gorfinkiel et al, J. Biol. Chem., 268:23376-23381 (1993)) o gev (Stauffer et al, J. Bact., 176:6159-6164 (1994)).

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Bacterias invasivas

Además de estar atenuadas o ser apatógenas, las bacterias de la invención son invasivas. Una bacteria invasiva es una bacteria que es capaz de entrar en el organismo del sujeto de forma que puede administrar la secuencia codificante que codifica el antígeno de VHS de la invención de una manera que permite la expresión de esa secuencia en las células del hospedador. Las bacterias invasivas incluyen las bacterias que son capaces de entrar de forma natural en el citoplasma o en el núcleo de las células animales, y también las bacterias que no son capaces de ello de forma natural, pero que se han alterado para darles esa capacidad. Así, se puede usar cualquier bacteria invasiva. La bacteria a usar se puede elegir para complementar al hospedador a tratar. Por ejemplo, cuando la finalidad es el tratamiento de humanos, se puede usar una bacteria que infecte de forma natural a los humanos.

Las bacterias invasivas naturales preferidas incluyen Salmonella spp., Shigella spp., Listeria spp., Rickettsia spp. y Escherichia coli enteroinvasiva. Se prefiere Salmonella.

Entre estas especies, se puede usar cualquier cepa adecuada de la bacteria.

Un ejemplo de una cepa de Salmonella adecuada (véanse los ejemplos) es la cepa SL7207 AroA^{-} de S. typhimurium auxótrofa. Otros ejemplos de Salmonella incluyen Salmonella typhi (ATCC nº 7251) y S. typhimurium (ATCC nº 13311). Se usan preferiblemente cepas de Salmonella atenuadas en la presente invención, e incluyen S. typhi aroAaroD (Hone et al, Vacc., 9:810-816 (1991) y el mutante de S. typhimurium aroA (Mastroeni et al, Micro. Pathol., 13:477-491 (1992)).

De manera alternativa, se pueden construir cepas atenuadas nuevas mediante la introducción de una mutación de atenuación independientemente o en conjunción con una o más mutaciones de atenuación adicionales. Esto mismo es aplicable a la construcción de cepas atenuadas nuevas de otras bacterias.

Los ejemplos de cepas de Shigella incluyen Shigella flexneri 2a (ATCC nº 29903), Shigella sonnei (ATCC nº 29930), y Shigella disenteriae (ATCC nº 13313). Se emplea preferiblemente una cepa de Shigella atenuada, tal como el mutante de Shigella flexneri 2a 2457T \DeltaaroA\DeltavirG CVD 1203 (Noriega et al, anteriormente mencionado), el mutante de Shigella flexneri M90T \DeltaicsA (Goldberg et al, Infect. Immun., 62:5664-5668 (1994)), el mutante de Shigella flexneri Y SFL114 aroD (Karnell et al, Vacc., 10:167-174 (1992)), y el mutante de Shigella flexneri \DeltaaroA\DeltaaroD (Verma et al, Vacc., 9:6-9 (1991)).

Los ejemplos de cepas de Listeria que se pueden emplear en la presente invención incluyen Listeria monocytogenes (ATCC nº 15313). Las cepas de Listeria atenuadas incluyen el mutante de L. monocytogenes \DeltaactA (Brundage et al, anteriormente mencionado) o L. monocytogenes \DeltaplcA (Camilli et al, J. Exp. Med., 173:751-754 (1991)).

Los ejemplos de cepas de Rickettsia incluyen Ricketsia rickettsiae (ATCC n^{os} VR149 y VR891), Ricketsia prowaseckii (ATCC nº VR233), Ricketsia tsutsugamuchi (ATCC n^{os} VR312, VR150 y VR609), Ricketsia mooseri (ATCC nº VR144), Ricketsia sibirica (ATCC nº VR151), y Rochalimaea quitana (ATCC nº VR358).

Los ejemplos de cepas de Escherichia enteroinvasivas incluyen las cepas de Escherichia coli 4608-58, 1184-68, 53638-C-17, 13-80, y 6-81 (Sansonetti et al, Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur). 132A:351-355 (1982)).

Los ejemplos de bacterias que se pueden modificar genéticamente para que sean invasivas incluyen Yersinia spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Bordetella spp., Neisseria spp., Aeromonas spp., Franciesella spp., Corynebacterium spp., Citrobacter spp., Chlamydia spp., Haemophilus spp., Brucella spp., Mycobacterium spp., Legionella spp., Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp., Salmonella spp., Vibrio spp., Bacillus spp. y Erysipelothrix spp. Estos organismos se pueden modificar para imitar las propiedades invasivas de bacterias tales como Shigella spp., Listeria spp., Rickettsia spp., o E. coli spp. enteroinvasiva mediante la inserción de genes que les permiten acceder al citoplasma de una célula animal. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Los ejemplos de tales genes incluyen los genes que codifican las proteínas invasivas de Salmonella, Shigella, u otras bacterias invasivas, p.ej. como se menciona en el presente documento, hemolisina o el plásmido de invasión de Escherichia, o listeriolisina O de Listeria, ya que se sabe que tales técnicas dan como resultado cepas que son capaces de entrar en el citoplasma de las células animales infectadas (Formal et al, Infect. Immun., 46:465 (1984); Bielecke et al, Nature, 345:175-176 (1990); Small et al, en: Microbiology 1986, páginas 121-124, Levine et al, Eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1986); y Zychlinksy et al, Molec. Micro., 11:619-627 (1994)). Será suficiente cualquier gen o combinación de genes, de una o más fuentes, que actúe como mediador en la entrada en el citoplasma de las células animales. Así, tales genes no se limitan a los genes bacterianos, e incluyen genes virales, tales como la hemaglutinina HA-2 del virus de la gripe que estimula la endosmosis (Plank et al, J. Biol. Chem., 269:12918-12924 (1994)).

Se pueden introducir genes invasivos en la cepa seleccionada como objetivo mediante el uso de la movilización de cromosomas o plásmidos (Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1992); Bothwell et al, anteriormente mencionado; y Ausubel et al, anteriormente mencionado), transducción mediada por bacteriófagos (de Boer, anteriormente mencionado; Miller, anteriormente mencionado; y Ausubel et al, anteriormente mencionado), o química (Bothwell et al, anteriormente mencionado; Ausubel et al, anteriormente mencionado; Felgner et al, anteriormente mencionado; y Farhood, anteriormente mencionado), electroporación (Bothwell et al, anteriormente mencionado; Ausubel et al, anteriormente mencionado; y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, N.Y.) y técnicas de transformación física (Johnston et al, anteriormente mencionado; y Bothwell, anteriormente mencionado). Los genes se pueden incorporar en un bacteriófago (de Boer et al, Cell, 56:641-649 (1989)), vectores plasmídicos (Curtiss et al, anteriormente mencionado) o se pueden incorporar en el cromosoma (Hone et al, anteriormente mencionado) de la cepa seleccionada como objetivo.

Los ejemplos de cepas de Yersinia incluyen Y. enterocolitica (ATCC nº 9610) o Y. pestis (ATCC nº 19428). Las cepas de Yersinia atenuadas incluyen Y. enterocolitica Ye03-R2 (al-Hendy et al, Infect. Immun., 60:870-875 (1992) o Y. enterocolitica aroA (O'Gaora et al, Micro. Path., 9:105-116 (1990)).

Los ejemplos de cepas de Escherichia incluyen E. coli H10407 (Elinghorst et al, Infect. Immun., 60:2409-2417 (1992), y E. coli EFC4, CFT325 y CPZ005 (Donnenberg et al, J. Infect. Dis., 169:831-838 (1994)). Las cepas de Escherichia atenuadas incluyen el mutante de E. coli 02 carAB patógeno de pavo atenuado (Kwaga et al, Infect. Immun., 62:3766-3772 (1994)).

Los ejemplos de cepas de Klebsiella incluyen K. pneumoniae (ATCC nº 13884).

Los ejemplos de cepas de Bordetella incluyen B. bronchiseptica (ATCC nº 19395).

Los ejemplos de cepas de Neisseria incluyen N. meningitidis (ATCC nº 13077) y N. gonorrhoeae (ATCC nº 19424). Las cepas de Neisseria atenuadas incluyen el mutante de N. gonorrhoeae MS11 aro (Chamberlain et al, Micro. Path., 15:51-63 (1993)).

Los ejemplos de cepas de Aeromonas incluyen A. eucrenophila (ATCC nº 23309).

Los ejemplos de cepas de Franiesella incluyen F. tularensis (ATCC nº 15482).

Los ejemplos de cepas de Corynebacterium incluyen C. pseudotuberculosis (ATCC nº 19410).

Los ejemplos de cepas de Citrobacter incluyen C. freundii (ATCC nº 8090).

Los ejemplos de cepas de Chlamydia incluyen C. pneumoniae (ATCC nº VR1310).

Los ejemplos de cepas de Haemophilus incluyen H. sornnus (ATCC nº 43625).

Los ejemplos de cepas de Brucella incluyen B. abortus (ATCC nº 23448).

Los ejemplos de cepas de Mycobacterium incluyen M. intracellulare (ATCC nº 13950) y M. tuberculosis (ATCC nº 27294).

Los ejemplos de cepas de Legionella incluyen L. pneumophila (ATCC nº 33156). Las cepas de Legionella atenuadas incluyen el mutante de L. pneumophila mip (Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161-176 (1994).

Los ejemplos de cepas de Rhodococcus incluyen R. equi.

Los ejemplos de cepas de Pseudomonas incluyen P. aeruginosa (ATCC nº 23267).

Los ejemplos de cepas de Helicobacter incluyen H. mustelae (ATCC nº 43772).

Los ejemplos de cepas de Vibrio incluyen Vibrio cholerae (ATCC nº 14035) y Vibrio cincinnatiensis (ATCC nº 35912). Las cepas atenuadas incluyen el mutante virulento de V. cholerae RSI (Taylor et al, J. Infect. Dis., 170:1518-1523 (1994)) y el mutante de V. cholerae ctxA, ace, zot, cep (Waldor et al, J. Infect. Dis., 170:278-283 (1994)).

Los ejemplos de cepas de Bacillus incluyen Bacillus subtilis (ATCC nº 6051). Las cepas atenuadas incluyen el mutante de B. anthracis pX01 (Welkos et al, Micro. Pathol., 14:381-388 (1993)) y las cepas BCG atenuadas (Stover et al, Nat., 351:456-460 (1991)).

Los ejemplos de cepas de Erysipelothrix incluyen Erysipelothrix rhusiopathiae (ATCC nº 19414) y Erysipelothrix tonsillarum (ATCC nº 43339). Las cepas atenuadas incluyen E. rhusiopathiae Kg-1a y Kg-2 (Watarai et al, J. Vet. Med Sci., 55:595-600 (1993)) y el mutante de E. rhusiopathiae ORVAC (Markowska-Daniel et al, Int. J. Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis., 277:547-553 (1992)).

Antígenos

Se puede administrar cualquier antígeno de VHS. Los antígenos pueden proceder de cualquier cepa de ambos serotipos (VHS-1 o VHS-2) de VHS. Los antígenos de VHS preferidos incluyen la glicoproteína D, glicoproteína H, glicoproteína B e ICP27. Se puede usar cualquier proteína antigénica adecuada, y tales proteínas antigénicas pueden ser de naturaleza estructural o no estructural.

Según la invención, así se puede llevar a cabo la vacunación contra cualquier cepa de VHS. En general, se preferirá la vacunación contra las cepas de VHS que son problemáticas médicamente para los humanos. Sin embargo, también son interesantes los aspectos veterinarios. Así, también es un aspecto de la invención la vacunación de animales contra cepas de VHS que los infectan. En este contexto se prefiere la vacunación de mamíferos. Es deseable la vacunación del ganado, que incluye el ganado bovino, ovino, porcino y equino, tal como vacas, ovejas, cabras, cerdos y caballos, al igual que la vacunación de animales de compañía tales como gatos y perros. También se prefiere la vacunación de hospedadores aviares, es decir, aves. Se prefieren especialmente las especies de aves de corral, p.ej. gallinas, pavos, patos, gansos y faisanes para la vacunación en este contexto.

En general, se usará un antígeno de VHS de tamaño completo que tiene la secuencia del antígeno natural. Sin embargo, también se pueden usar antígenos modificados. Por ejemplo, se pueden usar fragmentos de antígenos naturales, al igual que mutantes que tengan una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente. Tales antígenos modificados se pueden preparar mediante cualquier medio conocido en la técnica, generalmente medios recombinantes, por ejemplo mutagénesis dirigida. Se considera que los antígenos modificados, p.ej. mutados y truncados, son antígenos de VHS en el contexto de la invención. Tales antígenos modificados se pueden usar si mantienen un grado suficiente de antigenicidad, p.ej. si tienen un grado de antigenicidad equivalente al del antígeno de tamaño completo. Preferiblemente, si un antígeno modificado tiene un grado menor de antigenicidad que el antígeno natural, todavía tendrá un grado suficientemente alto para asegurar que se consiga un efecto profiláctico suficiente para asegurar el aclaramiento viral completo de las mucosas del sujeto. Sin embargo, la invención también abarca el uso de antígenos modificados que alcanzan grados menores de aclaramiento.

En este contexto, una vacuna de la invención puede asegurar cualquier grado estadísticamente significativo de aclaramiento viral, p.ej. del aparato genital, por ejemplo hasta el 99%, hasta el 95%, hasta el 90%, hasta el 80%, hasta el 70%, hasta el 50%, hasta el 20% o hasta el 10%. Como se discute con más detalle más adelante, esto se puede medir con respecto a los títulos virales en sujetos vacunados y sin vacunar, o con respecto a los títulos antes y después de la vacunación en único sujeto en algunos casos. Cuando se alcance un grado menor de aclaramiento, puede ser deseable usar un tratamiento anti-VHS alternativo en combinación con el tratamiento de la invención.

Expresión de antígenos

Según la invención, los antígenos de VHS se expresan, mediante cualquier mecanismo adecuado, en las células eucarióticas del hospedador, lo cual es la primera etapa en la vía de vacunación contra una enfermedad mediada por VHS. Se administran las secuencias codificantes que codifican los antígenos de VHS a las células por medio de una bacteria atenuada o apatógena pero invasiva, tal como se discute en el presente documento. Dentro de la bacteria, la secuencia codificante está unida generalmente de manera operable a secuencias reguladoras capaces de asegurar la expresión en la célula hospedadora seleccionada como objetivo. En principio, sin embargo, la secuencia codificante se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora de forma que la expresión se controla mediante secuencias reguladoras del hospedador.

Así, la secuencia codificante se une generalmente de manera operable a un promotor capaz de controlar la expresión en la célula hospedadora. En general, éste sería un promotor eucariótico, aunque podría ser cualquier promotor capaz de asegurar la expresión. Por ejemplo, en vez de un promotor derivado de un organismo eucariótico, podría ser un promotor derivado de un virus que infecte células eucarióticas.

Se puede usar cualquier promotor capaz de asegurar la expresión en la célula hospedadora. Los promotores adecuados incluyen los promotores de SV40, CMV y LTR retrovirales, así como los promotores HEF 1\alpha y PDGF.

En general, la secuencia codificante estará comprendida en una construcción de expresión. Tales construcciones comprenden en general: un promotor (véase anteriormente) capaz de dirigir la expresión de la secuencia codificante de la invención, y opcionalmente un regulador del promotor, un codón de inicio de la transcripción, y, unida de manera operable al promotor, una secuencia codificante según la invención. Preferiblemente, estos componentes se disponen en una orientación 5'-3'.

La construcción puede comprender también otros componentes adecuados. Por ejemplo, la construcción puede comprender un ácido nucleico que codifica una secuencia de señalización, colocada en una posición tal respecto de la secuencia codificante que, cuando se traduce, es capaz de dirigir la proteína expresada a un tipo de célula o compartimento celular dado. Dicha secuencia de señalización estará colocada en general inmediatamente en 3' o inmediatamente en 5' respecto de la secuencia codificante, de forma que la secuencia de señalización y la secuencia codificante se traducen en forma de una única proteína de fusión, con la secuencia de señalización en el extremo C- o N-terminal.

La construcción puede comprender también un potenciador que potencia el grado de expresión proporcionado por el promotor. Se puede usar cualquier potenciador que potencie la expresión proporcionada por el promotor seleccionado.

De forma opcional, la construcción puede comprender un terminador de la transcripción en posición 3' respecto de la secuencia codificante. Se puede usar cualquier terminador adecuado.

De forma opcional, la construcción puede comprender una señal de poliadenilación unida de manera operable en posición 3' respecto de la secuencia codificante.

De forma opcional, la construcción puede comprender uno o más genes indicadores seleccionables, p.ej. genes de resistencia a antibióticos, para permitir la selección de las células transformadas en cultivo. Por ejemplo, las células se pueden seleccionar en función de la resistencia a antibióticos.

De forma opcional, la construcción puede comprender uno o más intrones, u otras secuencias no codificantes, por ejemplo en posición 3' o 5' respecto de la secuencia codificante. En el contexto de la invención, éstos pueden ser útiles para comprobar que la expresión tiene lugar en las células eucarióticas del hospedador, y no en las células bacterianas del sistema de administración.

Se pueden incluir elementos genéticos adicionales. Tales elementos incluyen elementos de cromosomas artificiales de mamíferos o elementos de los minicromosomas circulares de replicación autónoma, tales como los hallados en las células de cáncer colorrectal DiFi, para permitir la retención estable sin integración del casete de expresión (Huxley et al, Bio/Technology, 12:586-590 (1994); y Untawale et al, Canc. Res., 53:1630-1636 (1993)), la integrasa para la integración directa del casete de expresión en el cromosoma de la célula del receptor (Bushman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:9233-9237 (1994)), las repeticiones invertidas del virus adenoasociado para favorecer la integración no homóloga en el cromosoma de las células del receptor (Goodman et al, Blood, 84:1492-1500 (1994)), recA o una enzima de restricción para favorecer la recombinación homóloga (documento WO9322443 (1993); y documento WO9323534-A (1993)), o elementos que dirigen el destino nuclear del casete de expresión eucariótico (Hodgson, anteriormente mencionado; y Lewin, anteriormente mencionado).

En general, la construcción de expresión estará comprendida dentro de un vector, preferiblemente por ejemplo un vector plasmídico.

Según la invención, no es necesario introducir un agente antimicrobiano para lisar la bacteria. Esta es una distinción entre los métodos de la presente invención y los del documento WO 98/44131 (Walter Reed, anteriormente mencionado), en los que el ADN que codifica el antígeno no se puede liberar excepto mediante la lisis de la bacteria con un agente antimicrobiano introducido para ese fin.

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Enfermedad mediada por VHS

Se puede tratar cualquier enfermedad mediada por VHS según la invención. Se pueden tratar las enfermedades mediadas por VHS-1, al igual que las enfermedades mediadas por VHS-2. En particular, el herpes dental, las infecciones orofaciales (p.ej., gingivoestomatitis, herpes labial, faringitis), infecciones cutáneas (p.ej., panadizo, herpes gladiatorum), infecciones oculares, herpes neonatal, encefalitis herpética, infección diseminada y eritema multiforme. Se prefiere especialmente el tratamiento del herpes genital. Como se discute en el presente documento, se puede tratar y prevenir una enfermedad mediada por VHS tanto humana como animal según la invención.

Como se discutió anteriormente, la presente invención se refiere principalmente a vacunas profilácticas, es decir, vacunas que evitan que tenga lugar la infección. Preferiblemente, se alcanza la prevención completa, medida mediante el aclaramiento completo del VHS de un sujeto, medido en general en una superficie mucosa del sujeto, p.ej. el tracto vaginal, tras la exposición a VHS. Como ensayo específico, el aclaramiento del tracto vaginal tras la exposición intravaginal con 5x10^{6} UFP de VHS se puede medir mediante la determinación de los títulos virales antes y después de la exposición o en sujetos vacunados y sin vacunar. Preferiblemente, se alcanza el aclaramiento completo. Sin embargo, las vacunas que alcanzan un grado menor de aclaramiento están también dentro del alcance de la invención. Una vacuna de la invención puede alcanzar cualquier grado estadísticamente significativo de aclaramiento, por ejemplo hasta el 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 50% y 20% de aclaramiento. Cuando se alcanzan grados menores de aclaramiento, puede ser deseable combinar la vacunación según la presente invención con otro tipo de vacunación o tratamiento.

En el contexto de las vacunas profilácticas, el aclaramiento se medirá en general comparando el grado de aclaramiento viral en sujetos vacunados y sin vacunar. Esto se puede medir comparando los títulos virales en los dos tipos de sujetos. Los títulos virales se pueden medir mediante cualquier medio adecuado, p.ej. como se describe en los ejemplos o mediante cualquier otro método conocido.

Aunque la presente invención se refiere principalmente a las vacunas profilácticas, la invención se puede aplicar también al diseño de vacunas terapéuticas según sea apropiado. Así, se proporcionan vacunas profilácticas y terapéuticas.

En el contexto de las vacunas terapéuticas, la eficacia se medirá en general de una manera similar a la descrita anteriormente para las vacunas profilácticas, es decir, midiendo el grado de aclaramiento viral alcanzado mediante la medición de los títulos virales en los sujetos. Sin embargo, la comparación será en general entre los títulos virales en un único sujeto en momentos diferentes, es decir, antes y después de la administración de la vacuna.

Como se discutió anteriormente, las vacunas de la invención actuarán en general generando inmunidad celular, específicamente inmunidad mucosa celular. Tal inmunidad puede aparecer en cualquiera o en todas las superficies mucosas del organismo, lo más preferiblemente en las mucosas genitales.

Formulaciones farmacéuticas, vías de administración y dosis

En general, una vacuna de la invención contendrá bacterias de la invención en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos de diluyentes incluyen una solución salina tamponada con fosfato, un tampón para tamponar el ácido gástrico del estómago, tal como tampón citrato que contiene sacarosa, tampón bicarbonato solo (Levine et al, J. Clin. Invest., 79:888-902 (1987); y Black et al, J. Infect. Dis., 155:1260-1265 (1987)), o tampón bicarbonato que contiene ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo (Levine et al, Lancet, II:467-470 (1988)). Los ejemplos de vehículos incluyen proteínas, p.ej., tal como se hallan en la leche descremada, hidratos de carbono, p.ej. sacarosa, o polivinilpirrolidona. En general, estos vehículos se usarían en una concentración de alrededor del 0,1-90% (p/v), pero preferiblemente en un intervalo del 1-10% (p/v).

Las vacunas de la invención se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada, y se formularán en consecuencia. Preferiblemente, la administración será en una superficie mucosa, lo más preferiblemente una superficie mucosa genital (p.ej., vaginal). Otra vía de administración preferida es la administración oral. De forma alternativa, se puede usar la administración intrarrectal o intranasal, al igual que la administración en las vías respiratorias, en cuyo caso la vacuna se puede formular en forma de un nebulizador respiratorio.

La cantidad de las bacterias invasivas vivas de la presente invención a administrar variará dependiendo de la especie del sujeto, así como de la enfermedad o el trastorno que se está tratando. En general, la dosis empleada será de alrededor de 10^{3} a 10^{11} organismos viables, preferiblemente alrededor de 10^{5} a 10^{9} organismos viables, p.ej. alrededor de 10^{6}, 10^{7} o 10^{8}. Para Salmonella, las dosis estarán en general en el intervalo de 10^{5} a 10^{11} organismos viables. Pueden ser posibles dosis inferiores con otros microorganismos que sean invasivos de forma natural o que estén modificados para ser invasivos.

Tratamientos de combinación

Esta eficacia de una vacuna de la invención se puede incrementar mediante el uso de agentes estimuladores capaces de estimular la inmunidad celular, preferiblemente la inmunidad mucosa celular. Estos se pueden coadministrar con la vacuna, por ejemplo, como parte de la vacuna (mediante el mismo medio de administración), o al mismo tiempo que la vacuna pero mediante un medio diferente de administración. De forma alternativa, el agente estimulador se puede administrar en un momento diferente, pero suficientemente cercano en el tiempo a la administración de la vacuna para que tenga un efecto profiláctico o terapéutico combinado. Así, la vacuna y el agente estimulador se pueden administrar de forma simultánea, secuencial o por separado.

Se puede usar cualquier agente capaz de estimular la inmunidad celular. Las citocinas que tienen esta propiedad son una opción. Se prefiere el GMCSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos), al igual que la interleucina-12 (IL-12).

También se puede usar la interleucina-14 (IL-14) para estimular otros tipos de respuestas inmunitarias en combinación con los tratamientos de la invención.

Además, los tratamientos de la invención se pueden combinar con cualquier otro tipo de tratamiento para la infección por VHS, p.ej. otros tratamientos profilácticos o terapéuticos.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos Métodos Ratones

Se adquirieron ratones BALB/c hembra, de 6 a 8 semanas de edad, de Harlan (Italia), y se mantuvieron en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología en condiciones estándar según las Directrices Institucionales.

Virus

Se cultivó el virus Herpes simplex de tipo 2 en células BHK y se almacenó en alícuotas a -80ºC hasta su uso. Los títulos se midieron en células Vero y se expresaron en forma de UFP por mililitro.

Medios y Reactivos

Las células se cultivaron en RPMI con un 10% de suero bovino fetal (Seromed, Alemania). Se usó medio Luria Bertani (LB) sólido y líquido para cultivar cepas de E. coli y S. typhimurium. Los medios se complementaron, cuando fue necesario, con 100 \mug/ml de ampicilina.

Cepas Bacterianas y Plásmidos

La cepa auxótrofa de S. AroA SL7207 (derivado de S. 2337-65 hisG46, DEL407 [aroA::Tn10{Tc-s}]) fue suministrada amablemente por B.A.D. Stocker (Universidad de Stanford, Facultad de Medicina, Stanford, CA). Se usó la E. coli DH5\alpha como hospedador durante los experimentos de clonación y para propagar los plásmidos. Las cepas bacterianas se cultivaron de forma rutinaria a 37ºC en caldo o agar de LB, complementado con 100 \mug/ml de ampicilina según fue necesario. Se usó el vector de expresión eucariótico pCI (Promega) para clonar la glicoproteína D (gD) del virus herpes simplex y la proteína fluorescente verde.

Técnicas de ADN recombinante

Se llevó a cabo la preparación de ADN, las manipulaciones genéticas, la PCR y la transformación de las bacterias según los protocolos habituales (Sambrook et al, 1989).

Clonación de gD y GFP en el vector de expresión eucariótico pCI

El ADN de la cepa de VHS-2 MS (ATCC nº VR-540), usado como molde para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), se preparó a partir de nucleocápsides aisladas de las células BHK. Para la construcción del vector de expresión eucariótico pCIgD, se amplificó un fragmento de 1,2 kb que codificaba el gen precursor de gD mediante PCR con el uso de los siguientes cebadores: directo, GTTCGGTCATAAA-CTGCATTGCGAACCACTAGTCG (ID SEC Nº 1); inverso, CCTAGTTTCCCTCCTTCT-AGACTCCCTTTATGCGG (ID SEC Nº 2). El producto de la PCR se clonó en el sitio EcoRI-XCba del vector de expresión eucariótico pCI y se secuenció completamente. La GFP se amplificó mediante PCR con el uso como molde del plásmido indicador de CMV2 (Invitrogen), y después se subclonó en el sitio EcoRI-Xba del vector de expresión pCI (pCIGFP). Se introdujo el intrón 1 del gen de \alpha-globina humana (117 pb) en la GFP mediante mutagénesis dirigida por PCR en la posición 283. El producto de la PCR se clonó como se describió anteriormente para la GFP (pCIGFPint).

Análisis in vitro

Se transfectaron los plásmidos pCIgD, pCIGFP y pCIGFPint en células COS mediante el uso de lipofectina (Boehringer) según las instrucciones del fabricante. Se analizó la expresión de la GFP mediante citometría de flujo (Becton Dickinson). Se analizó la expresión de la glicoproteína D mediante inmunotransferencia. Brevemente, después de 48 h los lisados celulares se resolvieron mediante electroforesis y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las inmunotransferencias se procesaron con un anticuerpo monoclonal anti-gD (ViroStat) y se revelaron con un equipo de detección de quimioluminiscencia amplificada (Amersham).

Inmunización y exposición

Se cultivaron las bacterias durante la noche hasta que alcanzaron la fase estacionaria. Se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS con un 5% de bicarbonato sódico. Los ratones recibieron tres grupos de dosis a intervalos de 15 días administrándoles oralmente la suspensión bacteriana con el uso de una cánula flexible. Cada grupo de dosis consistió en tres dosis a intervalos de 2 días de 5-10 x 10^{7} ufc de la cepa de S. typhimurium AroA que albergaba uno de los plásmidos descritos. Como control se usó la bacteria transformada con el vector pCI solo. Para los estudios de protección, 15 días después de la última dosis de salmonelas, los ratones inmunizados se expusieron mediante instilación intravaginal de la cepa VHS-2 MS. Para sincronizar el ciclo estral, se inyectó a los ratones inmunizados de forma subcutánea Depo-Provera (DP) (Upjohn Co., Kalamazoo, Mich) a una concentración de 3 mg por ratón en 100 \mul de agua destilada (Parr et al, 1994). Cinco días después de la administración de DP, los animales se anestesiaron con Avertina y la cavidad vaginal se lavó con PBS previamente a la instilación de 5x10^{6} UFP de VHS en 20 \mul. Los ratones se examinaron diariamente en busca de inflamación vaginal, enfermedad neurológica y muerte. La gravedad de la enfermedad se puntuó de 1 a 5 (0, sin síntomas; 1, inflamación leve; 2, hinchazón moderada; 3, inflamación grave; 4, parálisis y 5, muerte) (Overall et al, 1975). Los lavados vaginales se recogieron en diferentes momentos tras la exposición intravaginal pipeteando 200 \mul de PBS en la cavidad vaginal. Las muestras se filtraron mediante filtros de 0,45 \mum y se almacenaron a -80ºC hasta que se titularon.

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ELISA de anticuerpos

Para determinar los niveles de IgG total específica o de las subclases de IgG en el suero y en los lavados vaginales, se empleó un ELISA indirecto estándar. Se determinaron los niveles de IgG total, IgG1 e IgG2a mediante el uso de un anticuerpo anti-ratón de conejo purificado mediante afinidad hacia \gamma, \gamma1 o \gamma2a respectivamente, y como segundo anticuerpo se usó un conjugado HRPO-IgG anti-conejo de cabra purificado mediante afinidad (Zymed Lab. Inc. San Francisco, CA). Como antígeno para la unión a las placas, se usó el gD completo y los péptidos sintéticos (aa 8-23, y aa 222-252) que correspondían a los epítopos neutralizantes in vitro principales (Cohen et al, 1984; Nicola et al, 1998).

Determinación de citocinas tras la estimulación in vitro

Se midieron las citocinas en los sobrenadantes de los cultivos mediante ELISA tipo sándwich con el uso de los pares de anticuerpos monoclonales ID11/BVD6-24G2, JES6-1A12/JES6-5H4, y R4-6A2/XMG1.2 (Pharmingen, San Diego, CA) para la determinación de interleucina-4 (IL-4), interleucina-2 (IL-2) e interferón-\gamma (IFN-\gamma), respectivamente.

Ensayo ELISPOT de citocinas

Quince días después de la última dosis de salmonelas, los ratones se sacrificaron y se extrajo el bazo, las placas de Peyer, el nódulo linfático mesentérico y el nódulo linfático del íleon, y se cultivaron durante 24 h en presencia de VHS inactivado o antígeno simulado. Tras esto, las células se añadieron a placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (Millipore, HA) prerrevestidas con anticuerpo anti-citocina. Las células se cultivaron durante 24 h y se extrajeron. Tras la adición del segundo anticuerpo monoclonal anti-citocina conjugado con biotina, se dispensó la estreptavidina conjugada a HRPO. Los puntos se revelaron con el sustrato AEC (Fujihashi et al, 1993).

Determinación de la expresión de CD25 tras la estimulación in vitro

La expresión de IL-2R en respuesta a la estimulación con Ag in vitro se determinó mediante análisis de FACS. Las células de bazo (1x10^{7}/ml) cultivadas durante 96 h en presencia de una dilución 1/20 de VHS inactivado mediante UV o antígeno simulado, se recogieron y se tiñeron doblemente con anticuerpos monoclonales anti-CD4 de ratón marcados con PE y anticuerpos monoclonales anti-IL-2R de ratón marcados con FITC (Pharmingen) durante 30 min a 4ºC. Las células se lavaron dos veces con medio, y se llevó a cabo un análisis de inmunofluorescencia de dos colores mediante el uso de un FACScalibur (Becton Dickinson), con ventanas ajustadas mediante la luz dispersada hacia adelante y la dispersada lateralmente. Las ventanas se ajustaron para incluir la población mononuclear discreta y excluir las células muertas y los restos, y se analizaron 20x10^{3} por muestra.

Hipersensibilidad de tipo retardado

La respuesta de DTH hacia VHS se analizó 15 días después de la inmunización. Los antígenos se inyectaron en volúmenes de 20 \mul en la oreja derecha, y se midió el grosor de la oreja con un calibre micrométrico (Oditest, Mitutoyo, Japón) 24 h más tarde. Los antígenos de ensayo incluyeron VHS-2 inactivado mediante UV con un título de 10^{8} antes de la inactivación, y se inyectó antígeno simulado (extracto de células BHK) en la oreja izquierda como control negativo. Se midió el grosor de las orejas de una manera enmascarada antes y 24 h después de la inyección. La reacción de DHT se expresó como el incremento en el grosor de la oreja tras la inyección en la oreja respecto el grosor antes de la exposición.

Determinación de la transferencia génica in vivo

Se administró oralmente a los ratones SL7207 que albergaba alguno de los vectores pCIGFP, pCIGFPint o pCIgD, siguiendo el calendario de administración descrito anteriormente. Se prepararon suspensiones celulares de la lámina propia y de las placas de Peyer como describieron previamente Franco et al (1998). Las células que expresaban GFP en PP, NLM y LP se detectaron mediante citometría de flujo 5 días después de la última dosis. El fenotipo de las células GFP+ se determinó mediante análisis de doble fluorescencia tras teñir con anti-CD3-PE, anti-CD19-PE, anti-MAC3-PE o anti-CD11c-PE en presencia de reactivo de bloqueo de Fc (Pharmingen). En otros experimentos, se administró una dosis de 4x10^{6} ufc de SL7207 que albergaba los plásmidos mencionados anteriormente de forma intraperitoneal a 3 grupos de ratones. Dos días más tarde se recogieron las células peritoneales y se detectaron las células GFP+ mediante análisis de doble fluorescencia tras teñir con MAC3-PE o CD19-PE.

Resultados Respuesta de anticuerpos en suero y mucosa

Los ratones inmunizados de forma transgénica oralmente mediante el uso de salmonela atenuada (cepa SL7207) que albergaba el plásmido pCIgD generaron una débil respuesta inmunitaria de anticuerpos en suero. La reactividad de los anticuerpos fue principalmente contra el epítopo 8-23, mientras se detectaron niveles muy bajos contra el epítopo 222-252. El análisis de la distribución de subclases de IgG en los sueros inmunes indicaron que la IgG2a era el principal isotipo, pero también fue evidente la IgG1 (Figura 1A). También se observó una respuesta muy débil de anticuerpos séricos de IgA con un patrón de reactividad similar al descrito para la IgG. Además, no se observó reactividad de anticuerpos en los lavados vaginales cuando se unió a las placas gD completa o péptidos.

Patrón de la respuesta inmunitaria mediada por células

Cuando se cultivaron células de bazo de ratones inmunizados con SL7207 que albergaba el plásmido pCIgD o pCI en presencia de VHS inactivado o antígeno simulado, se observó un incremento en la expresión de IL-2R en el subgrupo de CD4 (Figura 1C). Esto se consideró una indicación de que la inmunización transgénica mediante el uso de salmonela da como resultado una activación de CD4 específica. Para determinar si las respuestas mediadas por células específicas de antígeno se podrían detectar in vivo, se midió la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) 15 días después de la última dosis de salmonela. Se indujo una respuesta de DTH significativa en los ratones inmunizados, lo que indica que hubo presente una respuesta inmunitaria de tipo Th1 (Figura 1B). El patrón de respuesta inmunitaria mediada por células se analizó directamente enumerando el número de células en las placas de Peyer, los nódulos linfáticos del íleon y el bazo, que producían citocinas de tipo Th1 o Th2 tras la estimulación secundaria in vitro con VHS inactivado o con péptido sintético (aa 291-306). Los ratones inmunizados con SL7207 que albergaba el vector pCIgD mostraron un incremento drástico de las células secretoras de IFN-\gamma en el bazo, el nódulo linfático del íleon (NLI) y las placas de Peyer (PP) (Figura 2). Sin embargo, se observó un incremento débil del número de células secretoras de IL-2 específicas. Sorprendentemente, se observó un incremento de células productoras de IL-4 en el bazo de los ratones inmunizados, lo que podría ser responsable de la respuesta inmunitaria de IgG1 observada en el suero. Cuando se analizó el patrón de citocinas en el sobrenadante de los linfocitos cultivados tras la estimulación in vitro, los resultados fueron coherentes con los descritos anteriormente (Figura 3). Sin embargo, no se hallaron diferencias significativas en los niveles de IL-4 entre los diferentes grupos de ratones. Esto puede indicar que el análisis de células individuales podría ser más sensible que la medida de las citocinas en los sobrenadantes.

Resistencia contra la invasión viral tras exposición intravaginal

Quince días después de la última dosis, los ratones se expusieron de forma intravaginal con 5x10^{6} UFP. Los animales se observaron en busca de signos de enfermedad, y se recogieron los lavados vaginales para la titulación del virus. Todos los animales inmunizados estuvieron protegidos y sobrevivieron a la exposición, mientras que todos los controles murieron en 13 días tras la exposición (Figura 4). Durante el periodo de observación, los animales sin inmunizar mostraron lesiones herpéticas. Por otra parte, los controles mostraron inflamación, hinchazón y parálisis antes de la muerte (Figura 4). Un punto de importancia fundamental fue determinar si la respuesta inmunitaria desarrollada en los ratones inmunizados fue suficiente para evitar la invasión viral. Si la inmunidad generada en los animales inmunizados dio como resultado la exclusión total del virus, entonces el virus debería eliminarse rápidamente de los tejidos vaginales, y los animales no deberían mostrar signos de una respuesta inmunitaria secundaria sistémica hacia VHS. De hecho, no se pudo recuperar ningún virus del lavado vaginal de los ratones inmunizados (Tabla 1). Además, cuando se determinó el nivel de anticuerpos séricos contra gD o VHS, no se halló ninguna respuesta inmunitaria secundaria.

Caracterización de la transferencia génica in vivo desde las salmonelas hasta las células eucarióticas

Un punto a abordar fue determinar si la respuesta inmunitaria observada fue contra una proteína sintetizada in vivo por las células eucarióticas, o si por otra parte resultó de la expresión del antígeno en el vehículo bacteriano. Para determinarlo, se introdujo el intrón 1 del gen de la \alpha-globina humana en la GFP, de forma que para obtener una proteína fluorescente se necesita un proceso de corte y empalme que puede ocurrir solamente en el núcleo. El análisis mediante citometría de flujo de los macrófagos peritoneales obtenidos de los ratones inoculados con una dosis de salmonelas que albergaban el vector pCIGFP o pCIGFPint mostró una expresión similar de la GFP (Figura 5). Este resultado confirma de manera irrefutable que ha ocurrido una transferencia génica real desde las bacterias, con una síntesis de novo por parte de la célula hospedadora.

Caracterización de las células transfectadas tras la administración oral de salmonelas que albergan el vector pCIGFPint

Para determinar qué tipo de células expresan el transgén administrado mediante el vehículo de salmonelas administradas oralmente y en qué órganos se pueden hallar estas células, se administró a los ratones oralmente la cepa SL7207 que albergaba los vectores pCIGFP, pCIGFPint o pCI. El análisis mediante citometría de flujo mostró la expresión de la GFP en las células de PP, bazo y LP del intestino delgado. El fenotipo de las células que expresaban GFP se caracterizó mediante análisis de doble fluorescencia. Solamente los macrófagos y las células dendríticas expresaron GFP (Figura 6). Los linfocitos CD19+ o CD3+ no fueron positivos para la expresión de GFP.

Estos datos confirman que el uso de salmonelas como vehículo para administrar un plásmido de ADN da como resultado la transfección específica de las células presentadoras de antígenos a nivel mucoso y sistémico, lo que podría ser muy importante para obtener una respuesta inmunitaria mediada por células contra virus o parásitos intracelulares que entran a través de las superficies mucosas.

TABLA 1 Resistencia a la exposición a VHS en ratones inmunizados con SL7207 pCIgD y controles

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Referencias

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- Karem et al, J. Gen. Virol. 1997; 87:427-434.

Claims (24)

1. Una vacuna contra el virus herpes simplex (VHS) que comprende una bacteria invasiva y atenuada o invasiva y apatógena, cuya bacteria comprende una secuencia codificante que codifica un antígeno de VHS en una forma que permite que dicha secuencia codificante se transfiera a una célula hospedadora de un hospedador humano o animal que la bacteria es capaz de invadir, y que sea expresada por dicha célula para formar dicho antígeno sin la introducción de un agente antimicrobiano para lisar la bacteria.

2. Una vacuna según la reivindicación 1 que es una vacuna profiláctica.

3. Una vacuna según la reivindicación 1 que es una vacuna terapéutica.

4. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el antígeno de VHS es un antígeno VHS-1 o VHS-2.

5. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia codificante está comprendida dentro de un vector y unida de manera operable a una o más secuencias reguladoras capaces de asegurar su expresión en dicha célula hospedadora.

6. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la bacteria comprende una secuencia que codifica un antígeno de VHS seleccionado de la glicoproteína D, H o B e ICP27.

7. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la bacteria es una bacteria Salmonella, Shigella o Listeria.

8. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la bacteria es una bacteria que no es invasiva de forma natural, pero que se ha alterado de forma que se ha hecho invasiva.

9. Una vacuna según la reivindicación 8, en la que la bacteria es una bacteria E. coli.

10. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está formulada para la administración en una superficie mucosa.

11. Una vacuna según la reivindicación 10 que está formulada para la administración oral, intrarrectal, intranasal o intravaginal, o en forma de un nebulizador respiratorio.

12. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está formulada para la administración a un hospedador humano.

13. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está formulada para la administración a un hospedador animal.

14. Una vacuna según la reivindicación 13 que está formulada para la administración a un hospedador animal mamífero o aviar.

15. Una vacuna según la reivindicación 14 que está formulada para la administración a un hospedador bovino, ovino, porcino o equino, o a un hospedador de una especie de ave de corral.

16. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además un agente capaz de estimular la inmunidad celular.

17. Una vacuna según la reivindicación 16, en la que el agente es capaz de estimular la inmunidad mucosa celular.

18. Una bacteria como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

19. Una bacteria según la reivindicación 18 para el uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal.

20. Una bacteria según la reivindicación 18 para el uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal en combinación con un agente como se definió en la reivindicación 16 ó 17.

21. El uso de una bacteria según la reivindicación 18 en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o la prevención de una enfermedad humana o animal mediada por VHS.

22. El uso según la reivindicación 21, en el que la vacuna es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

23. El uso según la reivindicación 21 ó 22, en el que la enfermedad mediada por VHS es una enfermedad mediada por VHS-1 o una enfermedad mediada por VHS-2.

24. Una composición farmacéutica para la vacunación contra una enfermedad mediada por VHS que comprende una bacteria como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.