ES2319424T3 - Virus mutantes de la estomatitis vesivular y sus usos. - Google Patents

Virus mutantes de la estomatitis vesivular y sus usos. Download PDF

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Abstract

Un virus de la estomatitis vesicular (VSV) mutante que tiene la mutación DELTAM51 en la proteína de la matriz (M).

Description

Virus mutantes de la estomatitis vesicular y sus usos.
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de los virus y, en particular, a virus mutantes que son útiles como vectores virales y vacunas.
Antecedentes
Virus atenuados o aquellos que tienen un reducido potencial de replicación se han utilizado ampliamente para un cierto número de aplicaciones terapéuticas, por ejemplo como vacunas o vectores de vacunas, o como vectores en la terapia génica. Típicamente, la producción de virus atenuados ha implicado el aislamiento de mutaciones al azar mediante el paso repetido de virus de tipo salvaje por hospedantes no naturales. Avances en la tecnología del ADN recombinante y técnicas de ingeniería genética han proporcionado las herramientas para un mejor desarrollo de virus en calidad de agentes terapéuticos y profilácticos. Las técnicas recombinantes permiten la introducción de mutaciones específicas en una región seleccionada del genoma del virus y minimizan también la reversión del virus mutante en el de tipo salvaje.
La capacidad de muchos virus de estimular la inmunidad tanto humoral como la mediada por células les hace ideales vectores de vacunas y, por lo tanto, se ha desarrollado un cierto número de virus como vectores de vacunas para una amplia gama de enfermedades, incluidos VIH, VHC y cáncer. Los virus son también bien adecuados para uso como vectores en la terapia génica. La terapia génica, es decir la modificación de la expresión génica por parte de la transferencia, transitoria o permanente, de genes funcionales a células somáticas, está siendo intensamente desarrollada como un nuevo enfoque para prevenir y tratar la enfermedad.
A pesar de que se conoce una diversidad de métodos físicos y químicos para introducir ácidos nucleicos exógenos en células eucarióticas, los virus han demostrado, generalmente, ser mucho más eficaces para este fin. Se han explorado varios virus, tales como parvovirus, adenovirus, virus herpes, retrovirus, rhabdovirus y virus de la varicela, como posibles vectores para la terapia génica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nºs 6.440.422; 6.531.123 y 6.451.323).
Se ha descrito la ingeniería de un cierto número de virus para producir virus recombinantes con propiedades específicas. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.497.873 describe un rhabdovirus recombinante que expresa la proteína F de la cepa SV5 de paramixovirus. En este virus recombinante, la proteína F se expresa en forma de una proteína de fusión con una parte de la proteína G de rhabdovirus. Las patentes de EE.UU. nºs 6.022.726 y 6.468.544 describen virus atenuados por ingeniería que incluyen una mutación en una secuencia no codificadora o codificadora de un gen no estructural (NS - siglas en inglés) viral. También se describen virus atenuados quiméricos que expresan proteínas virales alteradas o quiméricas. La patente de EE.UU. nº 6.468.544 describe, además, un virus de la gripe vivo atenuado que puede inducir la producción de interferón en una célula infestada.
Los virus tratados por ingeniería han sido también descritos como agentes oncolíticos, los cuales explotan defectos genéticos, únicos para que se repliquen células neoplásticas y lisen células neoplásticas, pero no células no neoplásticas. Por ejemplo, las solicitudes de patente internacional WO 97/26904 y WO 96/03997 describen un virus herpes simplex mutante (HSV-1716) que inhibe el desarrollo de la célula tumoral, la patente de EE.UU. nº 6.296.845 describe un adenovirus mutado que se piensa replica, de preferencia, en células tumorales p53-negativas, la patente de EE.UU. nº 6.110.461 enseña el uso de un reovirus para el tratamiento de neoplasma mediado por Ras y la patente de EE.UU. nº 6.531.456 describe un vector de virus adeno-asociado recombinante que porta un gen de susceptibilidad a fármacos y un segundo gen capaz de producir un efecto complementario (tal como un gen supresor de interferones o tumores) para uso en el tratamiento del cáncer.
Como una alternativa a virus tratados mediante ingeniería genética, se pueden emplear virus no patógenos, por ejemplo el documento WO 01/19380 describe el uso de un rhabdovirus y, en particular, el virus de la estomatitis vesicular (VSV - siglas en inglés), en calidad de un agente oncolítico selectivo contra células tumorales, caracterizado por tener bajos niveles, o ninguno, de actividad de PKR (siglas en inglés de quinasa dependiente de ARN de doble cadena). El documento WO 01/19380 describe también la identificación de cuatro VSVs mutantes que eran susceptibles al interferón y su uso como agentes oncolíticos.
Los siguientes documentos describen el papel celular de la proteína de la matriz del virus de la estomatitis vesicular (VSV):
Petersen J M et al., Molecular and Cellular Biology, Estados Unidos, nov. 2000, vol. 20, nº 22, páginas 8590-8601; Von Kobbe et al., Molecular Cell., Estados Unidos, nov. 2000, vol. 6, nº 5, páginas 1243-1252; Jayakar Himangi R, et al., Journal of Virology. Estados Unidos, ago. 2002, vol. 76, nº 16, páginas 8011-8018; Desforges Marc, et al., Virus Research, vol. 76, nº 1, julio 2001, páginas 87-102; y Desforges Marc, et al., Virology, Estados Unidos, vol. 295, nº 1, 30 de marzo de 2002, páginas 63-73.
Se proporciona esta información de antecedentes con el fin de poner en conocimiento información que por parte de la solicitante se piensa que es de relevancia para la presente invención. No se pretende necesariamente admisión alguna, ni debería interpretarse que cualquier información precedente constituye técnica anterior contra la presente invención.
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Sumario de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar virus mutantes y usos de los mismos.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un virus de la estomatitis vesicular (VSV) mutante que tiene la mutación \DeltaM51 en la proteína de la matriz (M). En una realización preferida, dicho VSV mutante comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en \DeltaM51-54, \DeltaM51-57, V221F, S226R, \DeltaV221-S226, V221X, S226X, o una combinación de las mismas. En otra realización preferida, dicho VSV mutante comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: \DeltaM51/V221F; \DeltaM51-54/V221F; \DeltaM51-57/V221F; \DeltaM51/S226R; \DeltaM51-54/S226R y \DeltaM51-57/S226R. Todavía en otra realización preferida, dicho VSV mutante comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: \DeltaM51/V221F/S226R; \DeltaM51-54/V221F/S226R y \DeltaM51-57/V221F/S226R.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un vector viral que comprende un VSV mutante según se describe antes.
Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de vacuna que comprende un VSV mutante según se describe antes y un ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más antígenos.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un adyuvante de vacuna que comprende un VSV mutante según se describe antes y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un agente oncolítico selectivo que comprende un VSV mutante según se describe antes y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable.
Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un VSV mutante según se describe antes y un soporte farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un VSV mutante según se describe antes y un soporte farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de un VSV mutante según se describe antes en calidad de un aditivo para preparaciones de virus farmacéuticas destinadas a proteger contra revertantes virulentos que surgen en dichas preparaciones.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de un VSV mutante según se describe antes para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que puede ser aliviado por la liberación de citoquinas.
Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende uno o más recipientes y un VSV mutante según se describe antes.
La solicitud describe también un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada, en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
La solicitud describe también un vector viral que comprende un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada, en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
También se describe un vector de vacuna que comprende un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada y un ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más antígenos, en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
La solicitud describe, además, un adyuvante de vacuna que comprende un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable, siendo capaz dicho rhabdovirus mutante de desencadenar la producción de una o más citoquinas en una célula. en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
También se describe un agente oncolítico selectivo que comprende un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
Además, la solicitud describe una composición farmacéutica que comprende un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada y un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
La solicitud también describe una composición inmunogénica que comprende un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada y un soporte farmacéuticamente aceptable, siendo capaz dicho rhabdovirus mutante de desencadenar la producción de una o más citoquinas en una célula. en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
También se describe un uso del rhabdovirus mutante según se describe antes en calidad de un aditivo para preparaciones de virus farmacéuticas destinadas a proteger contra revertantes virulentos que surgen en la preparación.
Además, la solicitud describe un uso del rhabdovirus mutante según se describe antes en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que puede ser aliviado por la liberación de citoquinas.
La solicitud describe también un uso del rhabdovirus mutante según se describe antes en calidad de un vector viral para el suministro de dicho ácido nucleico heterólogo a un sujeto que lo necesita.
También se describe un kit que comprende uno o más recipientes y un rhabdovirus mutante que tiene una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada, en donde dicha mutación resulta en el rhabdovirus mutante que tiene una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, cuando se compara con el virus de tipo salvaje.
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Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa que la toxicidad in vivo disminuida de virus VSV mutantes AV1 y AV2 es mediada por interferón. (A) Células de carcinoma de próstata humanas (PC3) y células de carcinomas renales humanas (CAKI-1) se infestaron simuladamente o se infestaron con cepas de tipo salvaje (WT - siglas en inglés), AV1 o AV2 de VSV. Los medios de cultivo se analizaron mediante ELISA para detectar la producción de IFN-\alpha humano 18 horas después de la infestación. (B) Toxicidad in vivo de cepas de VSV WT frente a mutantes por parte de la vía de administración y raza de ratón. IN = intranasal; IV = intravenosa; nd = no determinado. (C) AV2 puede proteger a ratones en trans frente a una infección de VSV WT letal. Ratones PKR^{-/-} fueron infestados por vía intranasal con cepas WT, AV2 o combinaciones de ambas cepas y fueron vigilados en cuanto a morbosidad o mortalidad. Los valores indican el número de ratones por grupo que muestran síntomas de infección (morbosidad) o el número de ratones por grupo que sucumbieron a la infección (mortalidad). (D) Ratones Balb/C y Balb/C IFNR^{-/-} fueron infestados por vía intranasal con VSV WT, virus AV1 o AV2 y fueron vigilados en cuanto a la morbosidad.
La figura 2 representa que la respuesta transcripcional secundaria es inhibida por VSV WT, pero no por AV1 o AV2. (A) La respuesta primaria a la infección viral es mediada por IRF-3, cJUN/ATF-2 y NF\kappaB (aquí mostrado formando parte del complejo de reforzador ("enhancesome") en el promotor IFN-\beta). Los datos de microdisposición indican genes de respuesta transcripcional primaria robustamente suprarregulados en células infestadas tanto con virus WT como mutantes. (a: se sabe que ISG15 requiere ISGF3 para una inducción completa). Los valores representan la inducción completa frente a los infestados simuladamente. (B) IFN-\beta es luego traducido y secretado para estimular, de una manera autocrina, la señalización de JAK/STAT para formar complejos de ISGF3 en el núcleo que media en la inducción de genes de la respuesta transcripcional secundaria. Mientras que células infestadas con AV1 o AV2 muestran una robusta suprarregulación de estos genes, células infestadas con WT no muestran expresión en absoluto (A = ausente), (C) Sin la consiguiente expresión de IRF-7 en células infestadas con VSV WT no puede tener lugar la onda transcripcional terciaria, que incluye casi todos los genes IFN-\alpha (b: IFN-\alpha7 es marginalmente detectado por la disposición en muestras WT). En contraposición, células infestadas con AV1 y AV2 inducen eficazmente la expresión de genes IFN-\alpha. (D) Datos de RT-PCR a las 4 horas después de la infestación de células A549 mostraban genes de respuesta primaria RANTES e IFN-\beta inducido a niveles similares en células infestadas con VSV WT y mutante, mientras que la suprarregulación de MX1 (respuesta secundaria) estaba afectada en células infestadas por WT. (E) El análisis de transferencia Western mostró una cinética similar de la activación de IRF-3 entre VSVs WT y mutantes, pero la expresión de proteínas por ISG56 (respuesta primaria) se vió seriamente afectada en células infestadas con WT. La proteína IRF-7 se detecta únicamente en células infestadas con AV1 y AV2. IRF-7\Delta parece ser capaz de inducir la expresión de IRF-7 endógena.
La figura 3 muestra que los ARNms de IFN-\beta están seriamente mermados en fracciones de citoplasma procedentes de células infestadas con VSV WT, según se determina por RT-PCR cuantitativa. (A) Fracciones de ARN total nuclear (N) y citoplásmico (C) procedentes de células infestadas con VSV de WT, AV1 o AV2 se sometieron a ensayo en cuanto a ARNm de IFN-\beta; ARNm normalizado a HPRT procedente de la misma muestra. * indicaba que no se detectó ARNm de IFN-\beta. (B) Células infestadas con cepas de VSV WT o mutantes se sometieron a ensayo mediante ELISA en cuanto a la producción de IFN-\beta. Células infestadas con AV1 y AV2 y no las células infestadas con VSV WT muestran IFN-\beta secretado detectable.
La figura 4 representa que las cepas de VSV mutantes demuestran eficacia in vivo en una diversidad de modelos de tumores. (A) VSV mutante es eficaz para tratar tumores de ascitis de ovarios humanos por xenoinjerto mediante tratamiento intraperitoneal. Células de carcinoma de ovarios ES-2 humanas se inyectaron en la cavidad intraperitoneal de ratones hipotímicos CD-1 para establecer tumores con ascitis. Doce días después de la inyección de 1 x 10^{6} células ES-2, los animales fueron tratados un día si y otro no (3 dosis en total) con VSV AV2 o VSV AV2 inactivados por UV. Cada dosis (1 x 10^{9} ufp) se administró a la cavidad intraperitoneal. Los animales fueron evaluados en cuanto a morbidez y mortalidad y fueron eutanizados tras la aparición de una formación moderada de ascitis. "n" significa el número de animales por grupo. (B) Tratamiento sistémico de tumores subcutáneos en un animal competente inmune. Los tumores subcutáneos se establecieron en ratones Balb/C inyectando 1 x 10^{6} células de carcinoma de colon CT26 en la región del flanco de la extremidad. Cuando los tumores alcanzaban aproximadamente 10 mm^{3}, los ratones fueron tratados un día sí y otro no cada 10 días (6 dosis en total) con una inyección intravenosa de 5x10^{8} ufp del virus indicado. "Trojan" se refiere a la inyección de 3x10^{5} células CT26 infestadas con VSV AV1 a una multiplicidad de infección (MOI - siglas en inglés) de 20. Ratones testigo recibieron 6 dosis de 5x10^{8} equivalentes de ufp de VSV AV2 inactivados por UV. Los tumores se midieron diariamente para calcular los volúmenes de los tumores. Los animales fueron eutanizados cuando se consideró que la carga de tumores era excesiva (aproximadamente 750 mm^{3}). (C) muestra el cambio en los pesos de los ratones medidos diariamente, para cada grupo, durante los 3 días antes del tratamiento hasta el día 11 después del tratamiento. Las barras de errores significan EMT (error medio típico). (D) Tratamiento de tumores diseminados en pulmones en un modelo de ratón inmuno-competente. Los tumores en los pulmones se establecen inyectando 3x10^{5} células CT26 en la vena de la cola de ratones Balb/C. El día 12 los ratones fueron tratados como sigue: UV AV2 IV = 1 dosis por vía intravenosa (5x10^{8} equivalentes de ufp), AV2 IV = 1 dosis de VSV mutante 3 por vía intravenosa (5x10^{8} ufp), AV2 IN = 1 dosis de VSV AV2 por vía intranasal (5x10^{7} ufp), AV2 IV e IN = dosis de VSV AV2 por vía intravenosa (5x10^{8} ufp) y 1 dosis de VSV AV2 por vía intranasal (5x10^{7} ufp). Cuatro días después del tratamiento se sacrificó a todos los ratones y se retiraron sus pulmones (los corazones están visibles para su medición). Las flechas indican tumores residuales. (E) Los tumores pulmonares se establecieron como se describe antes. El día 12 los ratones fueron tratados como se indica con 5x10^{7} ufp, suministradas por instilación intranasal, un día sí y otro no durante 2 semanas (6 dosis en total). La morbidez y la mortalidad se vigilan diariamente, y se eutaniza a ratones que muestran síntomas de distrés respiratorio y se les examina en cuanto a la carga tumoral. "n" indica el número de ratones en el grupo de tratamiento.
La figura 5 representa un modelo que describe cómo cepas de VSV mutante pueden ser capaces de prevenir el brote de cepas WT virulentas procedentes de una población mixta. (A) VSV WT puede bloquear la secreción de IFN a partir de células infestadas que hacen que células vecinas queden desprotegidas y sean susceptibles a partículas virales nacientes, lo que resulta en una difusión viral. (B) Se induce una "nube de citoquinas" de IFNs y, quizás, de otras citoquinas, tras la infección con cepas de VSV que codifican proteínas M defectuosas para el bloqueo del transporte nuclear/citoplásmico. Las células vecinas son protegidas de la infección por parte de VSV mutante y cualesquiera cepas revertantes que tratan de emerger de la población.
La figura 6 describe ejemplos de mutaciones que se pueden producir de acuerdo con la presente invención en el gen que codifica la proteína M de VSV.
La figura 7 describe la secuencia de la porción relevante de la proteína M de VSV para XNDG M4 y M5 mutantes rescatados.
La figura 8 describe que los VSVs para XNDG M4 y M5 mutantes rescatados tienen tamaños de placas similares al VSV mutante Mut2.
Las figuras 9A, B y C describen células transfectadas con 72 aminoácidos amino-terminales de VSV condensados a GFP (WT + 72-GFP-N1, verde) y OCT-DsRed2 (marcador mitocondrial, rojo). C. Imagen fusionada que muestra la co-localización de M-GFP y OCT-DsRed2. D, E y F. Células transfectadas con WT+72-GFP-N1 y teñidas con rojo Mitotracker. La fecha indica una típica célula transfectada que exhibe mitocondrias puntuadas y tinción con Mitotracker reducida. El asterisco indica una célula transfectada con mitocondrias reticulares (normales), lo que indica una co-localización de WT+72-GFP-N1 y la tinción con Mitotracker (imagen fusionada F). G y H. Células transfectadas con WT+72-GFP-N1 y teñidas con rojo Mitotracker. Las células transfectadas tienen mitocondrias puntuadas y una tinción con Mitotracker reducida (flecha).
Las figuras 10A, B y C describen imágenes de una célula viva co-transfectada con los 72 aminoácidos amino-terminales de M de VSV condensados a GFP (WT + 72-GFP-N1, verde) y OCT-DsRed2 (marcador mitocondrial, rojo). Las imágenes fusionadas indican la co-localización, así como la fragmentación progresiva de las mitocondrias inicialmente reticulares de esta célula, ya que la célula es exterminada por esta proteína tóxica. D. Una célula viva co-transfectada como antes. De nuevo, esto indica la co-localización de WT + 72-GFP-N1 y OCT-DsRed2 con una relativa concentración de la proteína de fusión M-GFP de VSV y protuberancias y uniones en la mitocondria
(verde).
La figura 11 describe la secuencia de ácidos nucleicos para el genoma del AV1 mutante de VSV [SEQ ID Nº: 1].
La figura 12 describe la secuencia de ácidos nucleicos para el gen de la proteína M del AV mutante de VSV [SEQ ID Nº: 2].
La figura 13 describe la secuencia de aminoácidos para la proteína M mutante del AV1 mutante de VSV [SEQ ID Nº: 3].
La figura 14 describe la secuencia de ácidos nucleicos para el genoma del AV2 mutante de VSV [SEQ ID Nº: 4].
La figura 15 describe la secuencia de ácidos nucleicos para el gen de la proteína M mutante del AV2 mutante de VSV [SEQ ID Nº: 5].
La figura 16 describe la secuencia de aminoácidos para la proteína M mutante del AV2 mutante de VSV [SEQ ID Nº: 6].
Las figuras 17A y B demuestran gráficamente el efecto protector de un VSV mutante de acuerdo con una realización de la presente invención, en donde la figura 17A describe el porcentaje de supervivencia de ratones después de la administración de una dosis intracraneal letal de VSV; y la figura 17B describe cambios en los pesos de los ratones con el tiempo tras la dosis intracraneal letal de VSV.
La figura 18 describe gráficamente la producción relativa de [\beta-IFN] en células OVCAR 4, CAKI-1 y HOP62 infestadas con VSV WT o un VSV mutante (AV1 o AV2).
Las figuras 19A y B demuestran gráficamente la actividad citotóxica de linfocitos T anti-CT26 procedente de esplenocitos obtenidos de ratones tratados con VSV WT y VSV AM51 y con tumores CT26 establecidos (figura 19A) y la lisis de células CT26 dependiente e independientes de NK, causada por los esplenocitos obtenidos de ratones no portadores de tumores, tratados con VSV WT y VSV AM51 (figura 19B).
La figura 20 describe secciones de tumores CT26, teñidas inmunohistoquímicamente, procedentes de ratones tratados con GFP de VSV \Delta51M que portan tumores CT26 subcutáneos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona virus mutantes que portan una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína responsable del bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteínas en una célula infestada. Así, los virus mutantes tienen una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear cuando se compara con el virus de tipo salvaje y se atenuan in vivo. Los virus mutantes pueden ser capaces de disparar los sistemas anti-virales de una célula hospedante normal, al tiempo que siguen siendo sensibles a los efectos de estos sistemas. Los virus mutantes son adecuados para una amplia gama de aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer e infecciones crónicas, en calidad de vacunas y adyuvantes, en calidad de vectores virales y en calidad de agentes oncolíticos y citolíticos para la lisis selectiva de células malignas o infestadas.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo sentido que el que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En esta memoria se utilizan de manera indistinta las anotaciones convencionales de tres letras y una letra para aminoácidos.
La expresión "secuencia de ácidos nucleicos heteróloga", tal como se utiliza en esta memoria en relación con un virus específico, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que procede de una fuente distinta del virus especificado.
El término "mutación", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una deleción, una inserción de ácido nucleico heterólogo, una inversión o una sustitución.
El término "gen", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un segmento de ácido nucleico que codifica una proteína individual o ARN (a la que se alude también como una "secuencia codificadora" o "región codificadora") junto con regiones reguladoras asociadas tales como promotores, operadores, terminadores y similares, que pueden estar situados más arriba o más abajo de la secuencia codificadora.
La expresión "virus mutante", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un virus que comprende una o más mutaciones en su genoma, que incluyen, pero no se limitan a deleciones, inserciones de ácidos nucleicos heterólogos, inversiones, sustituciones o combinaciones de las mismas.
La expresión "que se produce de forma natural", tal como se utiliza en esta memoria, con referencia a un virus, indica que el virus puede encontrarse en la naturaleza, es decir puede aislarse de una fuente en la naturaleza y no ha sido intencionadamente modificado por el hombre en el laboratorio.
La expresión "virus de tipo salvaje", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere al genotipo más frecuente de un virus encontrado en la naturaleza y contra el cual se definen mutantes.
La expresión "sistemas anti-virales", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a los componentes de una respuesta de la célula a la infección viral e incluyen, por ejemplo, interferones y otras citoquinas, óxido nítrico sintasa; quinasa dependiente de CKNA de doble cadena (PKR, oligoadenilato sintasa (OAS), Mx A y Mx B GTPasas y similares.
La expresión "respuesta anti-viral", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una respuesta de la célula a la infección viral e incluye, por ejemplo, producción de interferones, liberación de citoquinas, producción de quimioquinas, producción de linfoquinas, o una combinación de los mismos.
La expresión "célula hospedante normal", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una célula no cancerosa y no infestada con una respuesta anti-viral intacta.
El término "vacuna", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una preparación de material capaz de estimular una respuesta inmune en un animal sin inducir enfermedad alguna.
La expresión "agente oncolítico", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un agente capaz de inhibir el crecimiento de y/o de exterminar células tumorales.
El término "adyuvante", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una sustancia que, cuando se añade a una vacuna, es capaz de reforzar la respuesta inmune estimulada por la vacuna en un sujeto.
Virus mutantes
La presente invención proporciona virus mutantes que comprenden una o más mutaciones en un gen que codifica una proteína que está implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula hospedante infestada. Como resultado de ello, los virus mutantes tienen una capacidad reducida de bloquear el transporte nuclear y son atenuados in vivo. El bloqueo de la exportación nuclear de ARNm o proteína inutiliza los sistemas anti-virales en el interior de la célula infectada, así como el mecanismo mediante el cual la célula infestada puede proteger a células que la rodean frente a una infección (es decir, sistema de aviso temprano) y, en última instancia, conduce a la citolisis. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, los virus mutantes tienen propiedades citolíticas disminuidas en comparación con su equivalente de tipo salvaje.
Dado que el virus mutante es incapaz de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteína, la infestación de una célula hospedante normal por parte del virus mutante puede dar como resultado el disparo de los sistemas anti-virales de la célula que, normalmente, están bloqueados o son derivados por el virus de tipo salvaje. Por lo tanto, de acuerdo con otra realización de la presente invención, el virus mutante es capaz de disparar y es sensible a los sistemas anti-virales de una célula hospedante normal.
Se conoce una diversidad de virus que bloquean el transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada como parte de su ciclo de replicación y, así, son adecuados para la mutación con el fin de producir un virus mutante, por ejemplo virus de ADN, un virus de ARN de cadena positiva o un virus de ARN de cadena negativa. Ejemplos de virus de ADN adecuados incluyen virus herpes, adenovirus, parvovirus, papovavirus, iridovirus, hepadenavirus, poxvirus, virus de las paperas, virus de la parainfluenza humana, virus del sarampión o virus de la rubeola. Ejemplos de virus de ARN de sentido positivo, adecuados, incluyen togavirus, flavivirus, picornavirus o coronavirus. Ejemplos de virus de ARN de sentido negativo, adecuados, incluyen los de las familias Orthomyoxiviridae, Rhabdoviridae y Paramyoxoviridae.
El virus puede, por ejemplo, seleccionarse de las familias Poxviridae, Picornaviridae, Orthomyoxiviridae o Rhabdoviridae, por ejemplo el virus puede ser un virus vacunal, poliovirus, rhinovirus, virus de la influenza, virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular, virus de la enfermedad de Newcastle o vesiculovirus.
Los rhabdovirus son particularmente bien adecuados para uso terapéutico, ya que no son patógenos humanos comunes. Una respuesta inmune pre-existente a una cepa viral, similar a la utilizada como un agente terapéutico, puede atenuar la eficacia del virus mutante en calidad de agente terapéutico y, por lo tanto, es indeseable. Además, los rhabdovirus son virus de ARN que pasan todo su ciclo vital en el citoplasma, minimizando así el riesgo de una integración indeseada en el genoma de un paciente.
El rhabdovirus puede ser un vesiculovirus. Ejemplos de vesiculovirus incluyen, pero no se limitan a Piry, Chandipura y virus de la estomatitis vesicular (VSV).
VSV es un miembro de los Vesiculoviridae que ha demostrado el potencial terapéutico. Infecciones por VSV en seres humanos son asintomáticas o se manifiestan como una "gripe" suave. No existen casos reseñados de enfermedad grave o muerte entre seres humanos infestados por VSV. Otras características útiles de VSV incluyen el hecho de que éste se replica rápidamente y puede concentrarse fácilmente a títulos elevados. Es un virus simple que comprende solamente cinco genes y, así, es fácilmente dócil a la manipulación genética, y tiene una amplia gama de hospedantes y es capaz de infestar a la mayoría de los tipos de células humanas. En la presente invención, el virus mutante es un VSV mutante. En la técnica se conoce un cierto número de cepas diferentes de VSV y son adecuadas para uso en la presente invención. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a las cepas Indiana y New Jersey. Un experto en la técnica apreciará que surgirán y/o se descubrirán en el futuro nuevas cepas de VSV que también serán adecuadas para uso en la presente invención. Se considera que este tipo de cepas caen también dentro del alcance de la
invención.
1. Preparación de virus mutantes
De acuerdo con la presente invención, los virus mutantes pueden ser mutantes que se producen de forma natural o pueden ser mutantes obtenidos por ingeniería genética. Por lo tanto, los virus mutantes se pueden obtener por selección utilizando condiciones de desarrollo o presiones de selección definidas, o pueden ser virus recombinantes que se han obtenido específicamente por ingeniería utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas en la técnica.
Por ejemplo, para la selección de los virus mutantes que disparan y se mantienen sensibles a sistemas anti-virales en una célula infestada, una población del virus se puede desarrollar en células que normalmente son susceptibles a la infección por parte del virus de tipo salvaje y se aíslan los virus que se desarrollan deficientemente (es decir, forman placas más pequeñas) en estas células. Estos virus aislados son virus mutantes candidato. Un ejemplo de una técnica de selección de este tipo para virus tales como VSV, que normalmente bloquean la respuesta del interferón en células infestadas, sería la selección para un desarrollo deficiente en células que responden al interferón, tales como líneas de células epiteliales, cuando se compara con virus de tipo salvaje. La formación de grandes placas cuando estos mutantes candidato se desarrollan en células que no responden al interferón (tales como células tumorales) confirmarían que el desarrollo deficiente es debido a la respuesta al interferón (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 01/19380).
Una vez que se ha identificado y aislado un virus mutante que se produce de forma natural, se pueden determinar la o las mutaciones en el genoma viral utilizando técnicas convencionales, por ejemplo técnicas de secuenciación, análisis de restricción, técnicas de hibridación, análisis de microdisposición, o combinaciones de estas técnicas. Un virus mutante recombinante se puede luego tratar mediante ingeniería genética utilizando técnicas convencionales (véase más abajo) para que contenga una mutación o mutaciones idénticas, o una mutación o mutaciones similares en la misma región del genoma. Virus que han sido tratados mediante ingeniería genética (es decir, virus recombinantes) para que contengan mutaciones por deleción o inserción tienen típicamente una tasa de reversión menor que los mutantes que se producen de forma natural y, por lo tanto, son particularmente bien adecuados para fines terapéuticos.
Alternativamente, si ya se ha identificado un gen candidato en un virus, los virus mutantes recombinantes se pueden tratar mediante ingeniería genética utilizando técnicas bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, A Laboratory Manual. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Un gen candidato a este respecto sería un gen del que se sospecha que codifica una proteína que está implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteína en una célula infestada. En una realización de la presente invención, el virus mutante es un virus mutante recombinante.
Por ejemplo, virus de ADN (por ejemplo, vacunal, adenovirus, baculovirus) y virus de ARN de cadena positiva (por ejemplo poliovirus) se pueden tratar mediante ingeniería genética utilizando técnicas de ADN recombinante tales como las descritas en la patente de EE.UU. 4.769.330; patente de EE.UU. 4.215.051 y por Racaniello et al. (1981, Science 214: 916-919). Virus de ARN de cadena negativa (por ejemplo virus de la influenza y VSV) se pueden tratar mediante ingeniería genética utilizando técnicas "genéticas inversas" bien establecidas, tales como el sistema genético inverso que ha sido establecido para VSV (Roberts A. y J.K. Rose, Virology, 1998, 247: 1-6).
Así, se pueden utilizar técnicas genéticas, tales como las descritas anteriormente, para tratar mediante ingeniería genética una o más mutaciones en un gen candidato. Un experto en la técnica apreciará que el gen puede codificar una proteína estructural o no estructural, dependiendo del virus que se esté utilizando. La mutación puede ser una deleción de nucleótidos, inserción, inversión o sustitución de uno o más nucleótidos, o una inserción de un ácido nucleico heterólogo, o una combinación de las mismas. Como se conoce en la técnica, a veces los virus mutantes son capaces de sufrir una inversión a tipo salvaje mediante corrección de la mutación introducida. Por lo tanto, se pueden utilizar mutaciones que son difíciles de corregir, tales como deleciones y/o mutaciones de múltiples nucleótidos para crear virus mutantes con el fin de minimizar la inversión. En una realización de la presente invención, la mutación introducida es una deleción. En otra realización, la mutación introducida es una mutación que implica dos, tres o más nucleótidos. Es bien conocido en la técnica que la expresión de proteínas se puede ver afectada por mutaciones en la región codificadora de un gen o en las regiones reguladoras asociadas con la misma. Mutaciones en una región no codificadora o en una región codificadora de un gen candidato, o combinaciones de las mismas, quedan abarcadas por la presente invención. En una realización, se introducen por ingeniería genética una o más mutaciones en la región codificadora de un gen que codifica una proteína no estructural.
Un ejemplo de un gen adecuado que codifica una proteína no estructural es un gen que codifica la proteína de la matriz, o M, de rhabdovirus. Se ha estudiado bien la proteína M de VSV y se ha demostrado que es una proteína multifuncional requerida para varias funciones virales clave: germinación (Jayakar, et al. 2000, J Viral, 74(21): 9818-27), montaje del virión (Newcomb, et al. 1982, J Viral, 41(3): 1055-62), efecto citopático (Blondel, et al. 1990, J Virol, 64(4): 1716-25) e inhibición de la expresión del gen en el hospedante (Lyles, et al. 1996, Virology 225(1): 172-80). La última propiedad ha demostrado ser en esta memoria debida a la inhibición del transporte nuclear tanto de las proteínas como de los ARNms hacia y fuera del núcleo hospedante. Ejemplos de mutaciones adecuadas que se pueden hacer en el gen que codifica la proteína M de VSV incluyen, pero no se limitan a inserciones de ácidos nucleicos heterólogos en la región codificadora, deleciones de uno o más nucleótidos en la región codificadora, o mutaciones que resultan en la sustitución o deleción de uno o más de los residuos aminoácidos en las posiciones 33, 51, 52, 53, 54, 221, 226 de la proteína M, o una combinación de las mismas.
El extremo amino de la proteína M de VSV ha demostrado dirigir la proteína a las mitocondrias, lo cual puede contribuir a la citotoxicidad de la proteína. Por lo tanto, una mutación introducida en esta región de la proteína podría dar como resultado una toxicidad incrementada o disminuida del virus. Ejemplos de mutaciones adecuadas que se pueden hacer en la región del gen de la proteína M que codifica el extremo N de la proteína incluyen, pero no se limitan a las que resultan en una o más deleciones, inserciones o sustituciones en los primeros 72 aminoácidos (N-terminales) de la proteína.
Los números de los aminoácidos a los que se ha aludido antes describen posiciones en la proteína M de la cepa Indiana de VSV. Resultará fácilmente evidente para un experto en la técnica que la secuencia de aminoácidos de proteínas M procedentes de otras cepas de VSV y Rhabdoviridae pueden ser ligeramente diferentes a la de la proteína M de Indiana de VSV debido a la presencia o ausencia de algunos aminoácidos, dando como resultado una numeración ligeramente diferente de correspondientes aminoácidos. Por parte de un experto en la técnica se pueden llevar fácilmente a cabo alineaciones de las secuencias relevantes de la proteína con la secuencia de la proteína M de Indiana de VSV, con el fin de identificar aminoácidos adecuados para la mutación que corresponden a los descritos en esta memoria, utilizando técnicas y software convencionales (tal como el programa BLASTX disponible de la página web de Centro Nacional para la Información de Biotecnología).
Los aminoácidos, así identificados, son candidatos para la mutación de acuerdo con la presente invención.
El virus mutante puede ser un VSV con una o más de las siguientes mutaciones introducidas en el gen que codifica la proteína M (la notación es: aminoácido de tipo salvaje/posición de aminoácido/aminoácido mutante; el símbolo \Delta indica una deleción y X indica cualquier aminoácido): M51R, M51A, M51-54A, \DeltaM51, \DeltaM51-57, V221F, S226R, \DeltaV221-S226, M51X, V221X, S226X, o combinaciones de las mismas. El virus mutante puede ser un VSV con una de las siguientes combinaciones de mutaciones introducidas en el gen que codifica la proteína M: mutaciones dobles - M51R y V221F; M51A y V221F; M51-54A y V221F; \DeltaM51 y V221F; \DeltaM51-54 y V221F; \DeltaM51-57 y V221F; M51R y S226R; M51A y S226R; M51-54A y S226R; \DeltaM51 y S226R; \DeltaM51-54 y S226R; \DeltaM51-57 y S226R; mutaciones triples - M51R, V221F y S226R; M51A, V221F y S226R; M51-54A, V221F y S226R; \DeltaM51, V221F y S226R; \DeltaM51-54, V221F y S226R; \DeltaM51-57, V221F y S226R. En la figura 6 se representan ejemplos de proteínas M mutantes.
La presente descripción se dirige también a moléculas de ácido nucleico aisladas (ADN o ARN) que tienen una secuencia del virus mutante, o un fragmento del mismo, y secuencias complementarias al mismo. Secuencias de este tipo son útiles en la generación de virus mutantes recombinantes, o en calidad de cebadores o sondas. En una realización, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una secuencia de un VSV mutante, fragmentos del mismo y secuencias complementarias al mismo. En otra realización, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una secuencia de un VSV con una o más mutaciones en la proteína M, fragmentos de la misma y secuencias complementarias a la misma.
2. Ensayo de virus mutantes
De acuerdo con la presente invención, los virus mutantes se caracterizan por una capacidad disminuida de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteínas cuando se compara con el virus de tipo salvaje. La pérdida de esta capacidad puede dar como resultado que los virus mutantes exhiban una actividad citolítica disminuida y/o que los virus mutantes disparen los sistemas anti-virales de la célula, que normalmente están bloqueados por el virus de tipo salvaje.
2.1 Ensayo in vitro
Se puede hacer un rastreo in vitro de virus mutantes candidatos en cuanto a una disminución o la pérdida de "su" capacidad de bloquear el transporte nuclear de ARNm o proteínas. Por ejemplo, una línea de células apropiada se puede infestar con un virus mutante candidato, las células se pueden recolectar y se pueden aislar las fracciones nucleares y citoplásmicas. De cada una de estas fracciones se puede aislar ARNm y se puede analizar utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo mediante RT-PCR, transferencia Northern o análisis de la microdisposición. Luego se puede comparar el contenido de las fracciones nuclear y citoplásmica con controles adecuados, tal como el contenido en ARN de fracciones análogas para células infestadas con virus de tipo salvaje y/o para células simuladamente infestadas.
Alternativamente, se pueden utilizar análisis de hibridación in situ para testar virus mutantes candidatos. Análisis de este tipo se pueden establecer utilizando uno o más ARNms diana que, de manera intrínseca, tienen semividas cortas, o se puede tratar por ingeniería para que las tengan. Después se emplea una hibridación in situ para detectar estos ARNms diana en células previamente infestadas con un virus mutante candidato. La detección de uno o más ARNms diana en el citoplasma después de la infección indica una capacidad disminuida del virus candidato para bloquear la exportación de ARNm fuera del núcleo, cuando se compara con controles no infestados, y/o controles infestados con un virus de tipo salvaje. Este tipo de análisis se puede adaptar fácilmente para un rastreo de alto rendimiento por parte de los expertos en la técnica.
De manera similar, se pueden establecer análisis para testar mutantes candidatos, utilizando una línea de células que ha sido tratada mediante ingeniería por técnicas convencionales para que exprese una proteína fluorescente codificada por un ARNm que tiene una semivida corta. Luego, células de esta línea de células que ha sido tratada mediante ingeniería se infestan por separado con virus de tipo salvaje y un virus mutante candidato y se vigilan en cuanto a fluorescencia utilizando técnicas establecidas. En aquellas células infestadas con virus de tipo salvaje, se perderá la fluorescencia debido al bloqueo por parte del virus del transporte nuclear citoplásmico del ARNm naciente que codifica la proteína fluorescente. Por otra parte, virus mutantes que tienen una capacidad disminuida de bloquear el transporte de ARNm, tendrán una fluorescencia durante un mayor periodo de tiempo. Este tipo de análisis también se puede adaptar fácilmente para un rastreo de alto rendimiento por parte de los expertos en la
técnica.
En células que están infestadas con un virus mutante, se detectará en el citoplasma más de un ARNm de referencia particular que el detectado en el citoplasma de células infestadas con el virus de tipo salvaje. De acuerdo con la presente descripción, la infestación de una célula con un virus mutante da como resultado un aumento de al menos 20 veces en la cantidad de un ARNm de referencia en el citoplasma de la célula en comparación con la cantidad en el citoplasma de una célula infestada con el virus de tipo salvaje.
En una realización, la infestación de una célula con un virus mutante da como resultado un aumento de al menos 50 veces en la cantidad de un ARNm de referencia en el citoplasma de la célula. En otras realizaciones, el aumento es de 100 veces, 250 veces, 500 veces o de al menos 1000 veces.
Tal como se ha indicado antes, los virus mutantes pueden disparar los sistemas anti-virales en una célula infestada que, normalmente, están bloqueados o derivados por el virus de tipo salvaje. Por lo tanto, también se puede hacer un rastreo de virus mutantes candidatos en cuanto a su deficiente desarrollo en células con sistemas anti-virales intactos cuando se compara con virus de tipo salvaje. Los virus mutantes deberían ser capaces de desarrollarse igual de bien que los virus de tipo salvaje en células deficientes en uno o más componentes de la respuesta anti-viral. Por ejemplo, virus mutantes que disparan el sistema de interferón se desarrollarían deficientemente en células que responden al interferón, pero se desarrollarían igual de bien que los virus de tipo salvaje en células en las que se haya inutilizado la respuesta al interferón, tales como células tumorales. La capacidad de los virus mutantes de disparar sistemas anti-virales en células también se puede determinar analizando la expresión de los genes que codifican componentes de la respuesta anti-viral en células infestadas mediante técnicas convencionales, por ejemplo mediante transferencia Western o análisis de Northern, o mediante análisis de la microdisposición, y comparando los niveles de expresión con controles apropiados.
Virus mutantes que disparan una respuesta anti-viral también pueden ser capaces de proteger a células vecinas frente a una infestación por el virus de tipo salvaje. Esta capacidad se puede testar mediante experimentos de co-infestación, utilizando los virus mutantes y de tipo salvaje con células que normalmente son susceptibles a una infestación por parte del virus de tipo salvaje y determinando el desarrollo del virus de tipo salvaje en las células co-infestadas. En la técnica se conocen métodos para realizar experimentos de co-infestación.
2.1 Ensayo in vivo
Una vez que se han identificado virus mutantes apropiados, se pueden utilizar modelos con animales adecuados para evaluar la eficacia y toxicidad de los virus mutantes, utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica.
Por ejemplo, la toxicidad se puede determinar efectuando tests de DL_{50}. El virus mutante puede tener una DL_{50} entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10.000 veces mayor que la del virus de tipo salvaje. Alternativamente, modelos con animales apropiados se pueden tratar con concentraciones variables del virus mutante y luego se pueden evaluar los efectos tóxicos del virus a lo largo de un periodo de tiempo apropiado, vigilando la salud general y el peso corporal de los animales. Después de la compleción del periodo de evaluación, se puede sacrificar a los animales y determinar el aspecto y el peso de los órganos relevantes. Ejemplos de modelos animales adecuados incluyen, pero no se limitan a ratones Balb/C y ratones CD-1. Otros modelos animales adecuados incluyen los que son particularmente susceptibles a la infestación por parte de un virus de tipo salvaje, tales como los que son defectuosos en un componente de la respuesta anti-viral. Un ejemplo serían ratones PKR-/-, que han demostrado ser exquisitamente susceptibles a la infestación por VSV.
La capacidad de los virus mutantes de disparar una respuesta anti-viral se puede testar in vivo utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, los animales pueden ser tratados con el virus mutante y, subsiguientemente, ser enfrentados al virus de tipo salvaje o a un segundo virus. La supervivencia de estos animales se puede comparar con un grupo control que no recibió tratamiento previo alguno con el virus mutante.
Como se ha indicado antes, virus mutantes que disparan una respuesta inmune también pueden ser capaces de proteger a un sujeto frente a una co-infestación simultánea por parte del virus de tipo salvaje. Con el fin de evaluar este efecto protector del virus mutante, se puede determinar la respuesta anti-viral y el perfil de toxicidad para animales co-infestados con virus de tipo salvaje y mutante y se puede comparar con animales infestados con sólo virus tipo salvaje.
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Usos
Resultará evidente para un experto en la técnica que los virus mutantes de la presente invención son útiles en una amplia gama de aplicaciones. Seguidamente se proporcionan ejemplos no limitantes.
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1. Vectores virales
La presente descripción proporciona el uso de los virus mutantes de la invención como vectores virales. Cuando se utilizan como vectores virales, los virus mutantes se tratan mediante ingeniería para que incorporen al menos una secuencia de ácidos nucleicos heterólogos que codifica una molécula terapéuticamente activa. El vector viral se puede utilizar para infestar células que, después, expresan la molécula terapéuticamente activa codificada por la secuencia de ácidos nucleicos heterólogos. Así, se pueden utilizar vectores virales para suministrar el ácido nucleico heterólogo a las células de un sujeto para la expresión in vivo de la molécula terapéuticamente activa.
La secuencia de ácidos nucleicos heterólogos incorporada en el vector viral se puede derivar de ADN genómico, ADNc o ARN, por ejemplo, a través del uso de técnicas convencionales de clonación y/o de amplificación de ácidos nucleicos, o se puede sintetizar químicamente por métodos conocidos en la técnica. La secuencia de ácidos nucleicos se puede insertar en una región o gen no esencial en el genoma del virus o en un gen que codifica una proteína implicada en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o de proteínas, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en esta memoria y en otras partes.
Para los fines de la presente invención, la molécula terapéuticamente activa codificada por la secuencia de ácidos nucleicos heterólogos puede ser, por ejemplo, una proteína que, cuando se expresa en una célula, suplementa o proporciona una actividad que es deficiente en la célula, permitiendo así que la célula combata un estado patológico. Proteínas de este tipo incluyen, pero no se limitan a enzimas, derivados de la sangre, hormonas, linfoquinas, factores de crecimiento, neurotransmisores, factores tróficos, apolipoproteínas y genes supresores de tumores, antígenos o epítopes antigénicos virales o específicos para tumores, moduladores inmunes, factores reguladores de interferones, citoquinas y genes suicidas. Los expertos en la técnica comprenderán que el ADN/ARN heterólogo insertado puede incluir, además, promotores, reforzadores, terminadores, señales de poliadenilación, sitios de entrada al ribosoma interno y otros elementos reguladores requeridos para una expresión eficaz de un gen codificado por el ADN o ARN. Alternativamente, la expresión del ácido nucleico heterólogo puede depender, en su totalidad o en parte, de secuencias reguladoras endógenas del vectro viral.
La presente descripción también contempla secuencias de ácidos nucleicos heterólogos que codifican oligonucleótidos antisentido, ribozimas o siARNs. La expresión de estas secuencias en la célula diana permite controlar la expresión de genes celulares y/o la transcripción de ARNm celular.
Cuando se utilizan como vectores virales, los virus mutantes de la presente invención se pueden utilizar para tratar mediante ingeniería células donantes ex vivo, devolviéndose luego las células tratadas mediante ingeniería al donante o a otro paciente, o los virus mutantes de la invención se pueden utilizar para tratar mediante ingeniería las células de un paciente in vivo. Métodos de este tipo son bien conocidos en la técnica.
En una realización de la presente invención, los vectores virales se utilizan como "vectores para la terapia de genes" para suministrar a un sujeto un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína, que luego, cuando se expresa en las células del sujeto, suplementa o proporciona una actividad que, por lo demás, es deficiente en la célula.
En otra realización de la presente invención, los vectores virales se utilizan como vectores vacunales que portan una secuencia de ácidos nucleicos heterólogos que codifica uno o más antígenos y se utilizan para inmunizar a un individuo frente a una enfermedad y/o infección. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno de tumor, viral o bacteriano. También se contempla el uso de los vectores virales como vectores vacunales "polivalentes", en donde el vector comprende antígenos contra diferentes organismos y, así, proporciona inmunización frente a más de una enfermedad o frente a la infestación por parte de más de un organismo.
Virus mutantes que disparan los sistemas anti-virales de una célula hospedante, tal como la producción de diversas citoquinas, son particularmente útiles como vectores vacunales. La inducción de citoquinas puede conducir a la estimulación de respuestas inmunes tanto humorales como celulares y, así, mejoran la eficacia del vector vacunal.
La cantidad eficaz del virus mutante de la invención a administrar a un sujeto cuando se usa como un vector vacunal variará dependiendo del o de los antígenos codificados, del peso, del sexo del sujeto y del modo de administración. Un experto en la técnica puede determinar la dosificación requerida para la inmunización de un sujeto específico, utilizando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica.
Con el fin de evaluar la eficacia de los virus mutantes de la invención en calidad de vectores vacunales, se pueden realizar estudios de enfrentamiento. Estudios de enfrentamiento de este tipo se realizan típicamente utilizando animales de laboratorio, e implican la inoculación de grupos de animales con un virus mutante mediante diversas técnicas, p. ej. por vía intranasal, intramuscular. En paralelo deberían establecerse grupos control con los cuales se puedan comparar los efectos del virus mutante. Grupos control pueden incluir animales no inoculados y animales inoculados, por ejemplo con vacunas alternativas comercialmente disponibles. Después de un apropiado periodo de tiempo post-inoculación, los animales son enfrentados al agente patógeno (es decir, el microorganismo, virus o células
tumorales).
Luego se analizan muestras de sangre tomadas de los animales antes y después de la inoculación, así como después del enfrentamiento en cuanto a la respuesta del anticuerpo al agente patógeno. Ensayos adecuados para la respuesta del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a análisis de la transferencia Western y análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA). Alternativamente, cuando los animales han sido enfrentados a células tumorales, el desarrollo de las células tumorales se vigila, por ejemplo, vigilando el aumento en el tamaño o peso del tumor.
La respuesta inmune celular también se puede evaluar mediante técnicas tales como blastogénesis de linfocitos para vigilar la inducción de la inmunidad celular (linfodictos T) y la liberación del interferón, para vigilar la inducción de citoquinas.
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2. Agentes oncolíticos
Tal como se conoce en la técnica, determinados virus son capaces de actuar como agentes oncolíticos selectivos. Ejemplos incluyen VSV, virus de la enfermedad de Newcastle, parvovirus H-1 y determinados virus tratados mediante ingeniería genética tal como el adenovirus humano ONYX-015 (véase, por ejemplo, las solicitudes de patente internacional WO 01/19380 y WO 00/62735 y Bell, JC, Lichty BD y Stojdl D. 2003 Cancer Cell 4:7-11). La eficacia de la supresión del desarrollo de las células tumorales por parte del virus oncolítico reside, en parte, en la susceptibilidad diferencial de células tumorales, en comparación con células normales, a la infestación viral. Las células cancerosas adquieren una ventaja de supervivencia frente a sus equivalentes normales al adquirir mutaciones en las vías inhibidoras del desarrollo o apoptóticas. Un defecto, frecuentemente seleccionado durante la evolución del tumor, es una pérdida de la respuesta al interferón (IFN). El interferón es también un mediador clave en la respuesta anti-viral de células individuales y, así, células tumorales que adquieren mutaciones que las permiten escapar de los programas de control del desarrollo mediados por interferones, comprometerán simultáneamente su respuesta anti-viral
innata.
En células de este tipo, en las que está comprometida la respuesta anti-viral innata, la incapacidad de los virus mutantes de bloquear la exportación nuclear de ARNm o proteínas no afectará a la capacidad del virus mutante de replicarse en la célula. Los virus mutantes de la presente invención, que son capaces de disparar sistemas anti-virales en una célula infestada al tiempo que siguen siendo sensibles a esos sistemas anti-virales, serán, así, capaces de replicarse selectivamente y de inhibir el desarrollo de células tumorales, o de exterminarlas, pero serán incapaces de replicarse en células normales. Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de los virus mutantes en calidad de agentes oncolíticos mejorados.
Se apreciará que proteínas virales implicadas en el bloqueo del transporte nuclear de ARNm o proteínas también pueden tener otros efectos sobre una célula infestada. Por ejemplo, la proteína M de VSV ha demostrado ser importante para dirigir la proteína a la mitocondria de una célula infestada, conduciendo a efectos citotóxicos. La proteína M también ha demostrado interactuar con la proteína hospedante TSG101 para fomentar la germinación eficaz de viriones de la progenie a partir de la célula infestada.
Por lo tanto, la presente invención proporciona VSV mutante recombinante con una o más mutaciones en la proteína M que no sólo disminuyen la capacidad del virus mutante de bloquear el transporte nuclear, sino que también altera la interacción de la proteína M con las mitocondrias de la célula hospedante. El extremo N de la proteína M de VSV ha demostrado ser importante para dirigir esta proteína a las mitocondrias de una célula infestada. Mutaciones en esta región de la proteína que refuerzan o anulan esta localización modularán, así, las propiedades citotóxicas del vector viral. Dependiendo de la mutación introducida, se puede aumentar o disminuir la citotoxicidad del virus mutante. Aquellos virus mutantes, tratados mediante ingeniería para que tengan una o más mutaciones en la proteína M que resulte en una citotoxicidad incrementada, serán agentes oncolíticos particularmente eficaces.
La presente invención contempla, además, el uso de VSV recombinante con una o más mutaciones en la proteína M que alteran la interacción del virus con la proteína hospedante TSG101. TSG101 es una proteína supresora de tumores, cuya expresión y función están a menudo alteradas en células malignas. La introducción de mutaciones en la proteína M que interfieran con esta interacción puede resultar en virus recombinantes que se replican más eficazmente en células tumorales, conduciendo a agentes oncolíticos más eficaces.
La actividad oncolítica de los virus mutantes de la invención se puede determinar utilizando modelos de tumores por xenoinjerto convencionales, en los cuales se ha implantado un tumor humano en un animal inmunemente comprometido. Ejemplos de modelos por xenoinjerto de cáncer humano incluyen, pero no se limitan a xenoinjertos de tumores sólidos humanos en ratones, implantados mediante inyección subcutánea y utilizados en ensayos del desarrollo de tumores; isoinjertos de tumores sólidos humanos en ratones, implantados mediante inyección en la almohadilla infrarrotuliana y utilizados en ensayos de desarrollo de tumores; modelos experimentales de linfoma y leucemia en ratones, utilizados en ensayos de supervivencia, y modelos experimentales de metástasis a los pulmones en
ratones.
La actividad oncolítica de los virus mutantes se puede determinar comparando el desarrollo del tumor en animales de xenoinjerto tratados con virus mutantes y controles no tratados. También se pueden utilizar animales control que han sido infestados con el virus oncolítico de tipo salvaje. Los virus mutantes se pueden administrar directamente al tumor o de modo sistémico, o se pueden utilizar para infestar células ex vivo con las células que son subsiguientemente administradas al animal. También se pueden utilizar sistemas de modelos de ratones singeneicos en los cuales los tumores se establecen sub-cutáneamente o mediante inyección intravenosa (para formar tumores pulmonares) para testar la actividad oncolítica de los virus mutantes.
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3. Adyuvantes vacunales
Virus mutantes de la invención que son capaces de disparar los sistemas anti-virales en una célula hospedante son candidatos ideales para adyuvantes vacunales. Como es conocido en la técnica, muchos antígenos no son fuertemente inmunógenos y, cuando se utilizan como vacunas, requieren la adición de un adyuvante para estimular una fuerte respuesta inmune en el sujeto. La presente invención contempla el uso de los virus mutantes en calidad de adyuvantes vacunales para reforzar la inmunogenicidad de la vacuna disparando la respuesta anti-viral del hospedante. En una realización de la presente invención, el virus mutante actúa como un adyuvante vacunal, al estimular la producción de interferones y otras citoquinas.
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4. Agentes protectores en preparaciones farmacéuticas
Como se ha indicado antes, virus mutantes de la presente invención que disparan los sistemas anti-virales de las células a las que infestan pueden limitar la replicación del virus de tipo salvaje y de otros virus que intentan infestar células vecinas. Por lo tanto, la infestación de las células con estos virus mutantes no es sólo auto-limitante, sino que también protege frente a la aparición de revertantes. Así, los virus mutantes pueden utilizarse como aditivos para preparaciones farmacéuticas de virus que protegen frente a revertantes virulentos que surgen en las preparaciones, ya sea durante la producción o después de la administración a un sujeto.
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5. Otras aplicaciones terapéuticas
Como se ha indicado antes, el disparo de los sistemas anti-virales de la célula hospedante por parte de un virus mutante de la invención da como resultado la producción de diversas citoquinas. Por lo tanto, estos virus mutantes se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades o trastornos que pueden ser aliviados mediante la liberación de citoquinas, por ejemplo cáncer, enfermedades autoinmunes e infecciones bacterianas, virales y fúngicas.
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6. Otras aplicaciones citolíticas
Como es conocido en la técnica, muchos virus, tales como VIH y VHC, regulan de forma reductora los sistemas anti-virales de la célula infestada. Otros virus, tales como el virus de la viruela, BVDV, Bunyaviridae, Rotavirus, virus de la influenza y PVH (papilomavirus humano) bloquean la respuesta anti-viral de una célula hospedante como parte de su ciclo replicativo. Como resultado de ello, células infestadas con uno de estos virus pueden tener una susceptibilidad incrementada a la infección por parte de los virus mutantes de la invención. Como se ha indicado antes, en células con respuestas anti-virales comprometidas, los virus mutantes seguirán siendo capaces de replicarse. Por consiguiente, los virus mutantes de la presente invención se pueden utilizar como agentes citolíticos que se pueden replicar selectivamente en y exterminar células infestadas de este tipo.
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Composiciones farmacéuticas
La presente invención proporciona, además, composiciones farmacéuticas que comprenden los virus de la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de suspensiones acuosas que contienen el virus mutante en mezcla con excipientes adecuados que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes de suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, metil-celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma de acacia; agentes dispersantes o humectantes, tales como fosfátidos que se producen de forma natural, por ejemplo lecitina. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo p-hidroxi-benzoato de etilo o n-propilo. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión inyectable estéril. Esta supensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, utilizando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión tales como los antes mencionados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico, parenteralmente aceptable. Vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a agua, solución de Ringer, solución de Ringer lactada y solución de cloruro de sodio
isotónica.
Otras composiciones farmacéuticas y métodos para preparar composiciones farmacéuticas son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice od Pharmacy" (antes "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA (2000).
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Kits
La presente invención proporciona kits que contienen un virus mutante de la invención para uso en la inmunización, y kits que contienen un virus mutante de la invención que porta uno o más genes heterólogos para uso como un vector para el suministro de uno o más genes heterólogos a un sujeto. Los virus mutantes pueden proporcionarse en los kits en forma de composiciones farmacéuticas. Componentes individuales de los kits estarían empaquetados en recipientes separados o comunes y, asociada con recipientes de este tipo, puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, nota que puede reflejar la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para la administración animal o
humana.
Los componentes del kit también se pueden proporcionar en forma seca o liofilizada, y el kit puede contener adicionalmente un disolvente adecuado para la reconstitución de los componentes liofilizados. Independientemente del número o tipo de recipientes, los kits de la invención también pueden comprender un instrumento para asistir a la administración de la composición a un sujeto. Un instrumento de este tipo puede ser un inhalante, jeringa, pipeta, cuentagotas o vehículo de suministro médicamente aprobado similar.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Cepas YSV oncolíticas con defectos en la desconexión de señalización de IFN-\beta Materiales y Métodos Virus
A lo largo de este estudio se utilizó el serotipo Indiana de VSV y se propagó en células L929.T1026R (Desforges, et al. 2001, Virus Research 76(1):87-102) y TP3 (Desforges, et al. 2001, ibid), a los que se alude en esta memoria como AV1 (o Mut2) y AV2 (o Mut3), respectivamente, demostraron en este estudio y en otras partes ser mutantes inductores de IFN de la cepa HR de Indiana de VSV de tipo salvaje (Francoeur, et al. 1987, Virology 160(1): 236-45).
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Producción de IFN por ELISA
Los niveles de interferón \alpha se midieron en medios de cultivos de células utilizando el kit ELISA de interferón-alfa humano (PBL Biomedical) según las directrices del fabricante. En síntesis, se recogieron 100 \mul de medio de cultivo a las 48 horas después de la infestación y se incubaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos junto con componentes en blanco y patrones suministrados por el fabricante. Las muestras se procesaron según las instrucciones del fabricante y luego se leyeron en un lector de placas DYNEX^{TM} a 4,50 nm.
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Determinación de la toxicidad in vivo de virus mutantes VSV
Ratones hembras de ocho (8) a 10 semanas de edad (razas como las indicadas) se dividieron en grupos de 5 y se infestaron con diluciones 1 log ó ½ log de virus a partir de 1x10^{10} ufp a 1x10^{2} ufp (dependiendo del virus y de la raza de ratón) por la vía indicada. Se vigiló a los animales en cuanto a la pérdida de peso, deshidratación, erección pilosa, comportamiento de acurrucamiento, distrés respiratorio y parálisis del miembro trasero. Ratones que mostraban una morbilidad de moderada a grave fueron eutanizados conforme a las buenas prácticas de laboratorio prescritas por la CCAS. Los valores de dosis letal 50 se calcularon por el método de Karber-Spearman.
Ratones Balb/C o ratones Balb/C inactivados en el receptor de interferón alfa de cuatro semanas de edad (IFNAR^{-/-}) (Steinhoff et al., 1995, J. Virol., 69:2153-2158) fueron infestados por vía intranasal con 10^{4} ufp de: VSV WT, AV1 o AV2. Se vigiló a los ratones en cuanto a síntomas de morbilidad y se eutanizaron tras mostrar síntomas de grave distrés respiratorio.
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Determinación de la toxicidad in vivo de muestras mixtas de cepas de VSV de tipo salvaje y mutante
Se determinó previamente que ratones Balb/C PKR^{-/-} eran muy sensibles a una infestación por vía nasal con VSV WT con una DL100 de aproximadamente 10 ufp (Stojdl et al., 2000, J. Virol., 79:9580-9585). Grupos de 3 ratones fueron infestados mediante instilación intranasal con: WT, AV2 o mezclas de estas cepas. Se vigiló a los ratones en cuanto a síntomas de morbilidad y se les eutanizó tras mostrar síntomas de distrés respiratorio grave o parálisis del miembro trasero.
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Cáncer por xenoinjerto de ovarios en ratones atímicos
Aproximadamente 1x10^{6} células de carcinoma de ovarios humano ES-2 se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones CD-1 atímicos. El desarrollo de ascitis se observa generalmente el día 15 después de la inyección de las células. Los días 12, 14 y 16 los ratones fueron tratados, mediante inyección intraperitoneal, de 1x10^{9} virus AV2 ó 1x10^{9} ufp equivalentes de VSV AV2 inactivado por UV. Los ratones fueron vigilados en cuanto a la morbilidad y se eutanizaron tras el desarrollo de ascitis.
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Modelo de tumor subcutáneo
Para establecer tumores subcutáneos, se rasuró a ratones hembras Balb/C, de 8-10 semanas de edad, en el flanco derecho y se les inyectaron 1x10^{6} células de carcinoma de colon CT26 (Kashtan, et al., 1992, Surg Oncol 1(3):251-6) singeneicas para ratones Balb/C. Se dejó que estos tumores se desarrollaran hasta que alcanzaron aproximadamente 10 mm^{3}, momento en el cual se iniciaron los tratamientos con virus. Un día sí y otro no los grupos de animales recibieron 1, 6 ó 12 dosis de los virus indicados. Cada una de las dosis de 5x10^{8} ufp fue administrada mediante inyección en la vena de la cola. Los tumores se midieron diariamente y los volúmenes se calcularon utilizando la fórmula ½ (LxWxH). Se pesó a los ratones diariamente y se vigiló su pérdida de peso, deshidratación, erección pilosa, comportamiento de acurrucamiento, distrés respiratorio y parálisis del miembro trasero. Se eutanizó a los animales cuando su carga de tumores alcanzó el punto final (750 mm^{3}).
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Modelo de pulmones
Se establecieron tumores en los pulmones en ratones Balb/C hembras de 8-10 semanas de edad mediante inyección en la vena de la cola de 3x10^{5} células CT26 (Specht, et al. 1997, J Exp Med 186(8):1213-21). Los días 10, 12, 14, 17, 19 y 21 grupos de ratones recibieron 5x10^{7} ufp del virus indicado mediante instilación intranasal según se describe en otra parte (Stjdl, et al. 2000, Journal of Virology 74(20):9580-5). Los ratones se pesaron diariamente y se vigilaron en cuanto a pérdida de peso, deshidratación, erección pilosa, comportamiento de acurrucamiento, distrés respiratorio y parálisis del miembro trasero. Los animales se eutanizaron en el brote del distrés respiratorio y sus pulmones se examinaron para confirmar el desarrollo del tumor.
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Análisis de MTS
En cada experimento, la línea de células de ensayo se sembró en placas de 96 pocillos a razón de 3 x 10^{4} células/pocillo en medio de crecimiento (DMEM-F12-HAM + FBS al 10%). Tras incubación durante una noche (37ºC, 5% de CO_{2}), los medios se retiraron mediante aspiración y a cada pocillo se añadieron 20 \mul de medios que contenían virus (\alpha-MEM, sin suero) oscilando a incrementos de 10 veces desde 3 x 10^{6} ufp/pocillo a 3 ufp/pocillo o medios control negativos que no contenían virus alguno. Cada dosis de virus testada se hizo en réplicas de seis. Después de incubación durante 60 minutos para permitir la fijación del virus, se añadieron a cada pocillo 80 \mul de medio de crecimiento y las placas se incubaron durante otras 48 horas. La viabilidad de las células se midió utilizando el reactivo CellTitre 96^{TM} AQ_{ueous} MTS (Promega Corp.), que utiliza soluciones de un compuesto de tetrazolio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna (MTS) y un reactivo de acoplamiento de electrones (metosulfato de fenazina; PMS). MTS es biorreducido por parte de células a un producto de formazan que es soluble en medio de cultivo tisular. La absorbancia del producto de formazan a 490 nm se puede medir directamente a partir de placas de ensayo de 96 pocillos. La cantidad de producto de formazan, según se determina a partir de la absorbancia a 490 nm, es directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo.
Para analizar defectos de IFN, se pretrataron líneas de células con 5 unidades/ml de IFN-\alpha o IFN-\beta durante 12 horas y luego se enfrentaron a un intervalo de dosis de VSV WT según se describe antes. Se efectuó un análisis MTS estándar y los resultados se compararon con los resultados de células no pretratadas.
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Microdisposición
Células OVCAR4 tratadas simuladamente o infestadas con cepas de VSV de tipo salvaje (WT) y mutantes se recolectaron en PBS, se sedimentaron y se resuspendieron en 250 \mul de tampón de resuspensión (Tris 10 mM pH 7,4, NaCl 15 mM, MgCl_{2} 12,5 mM). Se añadieron 600 \mul de tampón Lysis (Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 15 mM, MgCl_{2} 12,5 mM, sacarosa al 5% y NP-40 al 1%) y los lisados se incubaron a 4ºC durante 10 min con sometimiento a vórtice ocasional. Los núcleos se recogieron mediante centrifugación a 1000 x g durante 3 min. El sobrenadante (fracción de citoplasma) se recogió y se congeló a -80ºC, al tiempo que el sedimento (fracción nuclear) se lavó una vez con 250 \mul de tampón lysis y se congeló. El ARN total se aisló de las fracciones tanto nuclear como citoplásmica utilizando el kit Qiagen RNeasy^{TM} (según las instrucciones del fabricante; Qiagen, Mississauga, Canadá), seguido de precipitación con LiCl para concentrar cada muestra. Veinte microgramos de cada muestra de ARN se trataron de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante (Affymetrix; Santa Clara CA; EE.UU.) y se hibridaron a una disposición de Genoma Humano U133A Affymetrix GeneChip^{TM} (chip HG U133A). Cada chip se ajustó a 1500, se normalizó a la normalización 100 de genes de control en cada chip HG U133A, después todas las muestras nucleares se normalizaron a la muestra nuclear simulada sobre una base de genes y las fracciones citoplásmicas se normalizaron a la muestra citoplásmica simulada correspondiente. Los datos se analizaron utilizando el software Genespring^{TM} correspondiente (Silicon Genetics; Redwood City CA, EE.UU.).
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Transferencia Western
Células OVCAR4 se desarrollaron en RPMI (Wisent), suplementado con suero de bovino fetal (SBF) al 10% (Wisent). 1,0 x 10^{7} células se extendieron en placas de 10 cm el día antes de la infestación. Tras la infestación, se retiraron los medios y se reemplazaron por RPMI solo, antes de la adición de 5x10^{7} ufp por cada cepa voral VSV. Una hora después de la adición del virus, se retiraron los medios y se reemplazaron por RPMI suplementado con SBF 10% para el periodo restante del experimento. Las células se lisaron en tampón NP-40 lysis estándar y el extracto de células enteras se hizo pasar sobre gel de SDS-poliacrilamida y se manchó con los siguientes anticuerpos según se indica: IRF-7 (sc-9083), IRF-3 (sc-9082), ISG56 (un regalo de Genes Sen), VSV-N (policlonal dirigido contra la proteína N de Indiana de longitud completa) y Actin (sc-8432).
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Construcciones y rescate viral
La creación de la IRF-7\Delta constitutivamente activa (IRF-7\Delta247-467) ha sido descrita previamente en otra parte (Libn et al., 2000, J. Biol. Chem., 275: 34320-34327). IRF-7\Delta247-467 se amplificó mediante PCR, utilizando un cebador directo al epítope Flag con una señal del casquete 5' VSV adicional y un enlazador Xho1:
5'-ATCGCTCGAGAACAGATGACTACAAAGACGATGACGACAAG-3' [SEQ. ID. Nº: 7] 
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junto con un cebador reverso de IRF-7 específico que contiene una señal de poli A de VSV y un enlazador
Nhe1:
5'-ATCGGCTAGCAGTTTTTTTCAGGGATCCAGCTCTAGGTGG GCTGC-3' [SEQ. ID. Nº: 8]
El fragmento de la PCR se clonó luego en los sitios Xho1 y Nhe1 del vector pVSV-XN2 de replicón de rVSV (proporcionado por John Rose). La recuperación de rVSV ha sido previamente descrita (Lawson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92;4477-4481).
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PCR cuantitativa de ARNm de interferón beta
Se aisló ARN total nuclear y citoplásmico de células OVCAR4 infestadas o infestadas simuladamente según las instrucciones del fabricante (RNeasy; Qiagen, Canadá). Cuatro microgramos de ARN total se trataron con DNasa y se transcribieron inversamente. Se realizó una PCR cuantitativa por triplicado para amplificar IFN-\beta y dianas de hipoxantina.guanina fosforribosiltransferasa (HPRT) a partir de cada una de ellas, utilizando la tecnología Lightcycler^{TM} de Roche (Roche Diagnostics, Laval, Canadá). Los puntos de cruce fueron convertidos en cantidades absolutas, basadas en curvas patrón generadas a partir de cada amplicón diana. Subsiguientemente se normalizó la señal de IFN-\beta a HPRT, ya que los niveles de HPRT no se modifican durante el transcurso de estas infestaciones, datos no mostrados. Los cebadores utilizados para amplificar IFN-\beta eran:
sentido 5'-TTGTGCTTCTCCACTACAGC-3' [SEQ. ID. Nº:9];
antisentido 5'-CTGTAAGTCTGTTAATGAAG-3' [SEQ. ID Nº: 10] 
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y los cebadores de HPRT eran:
sentido 5'-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3' [SEQ. ID. Nº:11];
antisentido 5'-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3' [SEQ. ID Nº: 12]. 
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RT-PCR de genes estimulados con interferón alfa e interferón beta
Células A549A cultivadas en medio F12K suplementado con SBF al 10% se infestaron con cepas de VSV WT o mutantes (MDI 10, en donde MDI se refiere a multiplicidad de infección, que es la relación de partículas de virus infecciosas a células). El ARN se extrajo 4 horas después de la infestación utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un microgramo de ARN de transcribió inversamente con cebadores Oligo dT y 5% de RT se utilizó como plantilla en una Taq PCR. Los cebadores utilizados eran como sigue:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 cebador directo Mx \+ 5'-ATG GTT GTT TCC GAA GTG
GAC-3' \+ [SEQ. ID. Nº:13];\cr \+\+\cr  cebador
reverso Mx \+ 5'-TTT CTT CAG TTT CAG CAC
CAG-3' \+ [SEQ. ID. nº:14];\cr \+\+\cr  cebador
directo de N de VSV \+ 5'-ATG TCT GTT ACA GTC AAG
AGA ATC-3'  \+ [SEQ. ID. Nº: 15];\cr \+\+\cr 
cebador reverso de N de VSV \+ 5'-TCA TTT GTC AAA
TTC TGA CTT AGC  ATA-3' \+ [SEQ. ID. Nº:16];\cr
\+\+\cr  cebador directo RANTES \+ 5'-TAC ACC AGT
GGC AAG TGC TCC AAC CCA G-3' \+ [SEQ. ID. Nº:17];\cr
\+\+\cr  cebador reverso RANTES \+ 5'-GTC TCG AAC
TCC TGA CCT CAA GTG ATC  C-3' \+ [SEQ. ID.
Nº:18];\cr \+\+\cr  cebador directo de
 \beta -actina \+ 5'-ACA ATG AGC TGC
TGG TGG CT-3' \+ [SEQ. ID.  Nº:19] y\cr \+\+\cr 
cebador reverso de  \beta -actina \+
5'-GAT GGG CAC AGT GTG GGT GA -3' \+ [SEQ.  ID.
Nº:20].\cr}
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Resultados La atenuación de VSV in vivo depende de las vías de interferón intactas
Se encontró que dos variantes de VSV que producen pequeñas placas en células que responden a interferón (a las que se alude en esta memoria como AV1 y AV2) inducen de veinte a veinticinco veces más VSV de interferón alfa (IFN-\alpha) que el VSV de tipo salvaje (WT) tras la infestación de líneas de células epiteliales (Figura 1A). La secuenciación genómica completa de las variantes reveló que diferían de la cepa de tipo salvaje en sus proteínas M con solamente una sola sustitución de aminoácido en el caso de AV1 (M51R) y dos aminoácidos (V221 F y S226R) en AV2. Se determinó que la DL_{50} de AV1 y AV2, cuando se administran intranasalmente a ratones Balb/C era 10.000 veces mayor que VSV WT suministrado por la misma vía (Figura 1B). Se observaron resultados similares en ratones CD-1 (WT = 1 x 10^{6} AV1 = 2 x 10^{8} ufp). De manera significativa, AV1 yAV2 eran tan tóxicos como el virus de tipo salvaje cuando se utilizan para infestar animales inactivados con el receptor de interferón, indicando que la atenuación del desarrollo de AV1 y AV2 in vivo depende de un sistema de interferón intacto (Figura 1C). Además, cuando se utilizan en combinación con VSV WT, se encontró que la cepa AV2 mutante protegía a ratones muy susceptibles (PKR^{-/-}) de VSV WT (Figura 1D). De hecho, incluso a una dosis 100 veces mayor que la DL_{100} para VSV WT no resultaron evidentes síntomas de morbidez (deshidratación, erección pilosa, malestar, actividad reducida, distres respiratorio, parálisis de las extremidades traseras) cuando se enfrentó a los ratones a AV2 y VSV WT simultáneamente. Junto con la observación de que estos mutantes permiten la producción de IFN tras la infestación, estos datos son consistentes con un modelo, en el cual la infestación con cepas mutantes AV1 o AV2 de VSV inducen la producción de interferón en el hospedante, estableciendo con ello un estado antiviral que protege al hospedante frente a una infestación
patológica.
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Mutantes de VSV tanto de tipo salvaje como atenuados disparan respuestas anti-virales innatas
Con el fin de determinar en qué punto durante la infestación los virus de tipo salvaje y atenuados divergen en sus capacidades para inducir o inactivar respuestas anti-virales de células hospedantes, se necesitó primeramente establecer los sucesos de señalización temprana que se producen durante la infestación por VSV de una célula hospedante. El uso del análisis de la microdisposición a lo largo del tiempo de la infestación por virus debería permitir detectar sucesos de señalización temprana disparados por la infestación por VSV que conducen, directa o indirectamente, a la activación transcripcional de genes anti-virales. A partir de los datos de la microdisposición es evidente que la infestación por VSV conducen a la suprarregulación de un cierto número de genes en un orden secuencial específico. Por lo tanto, se agruparon juntos genes en base a: (1) su cinética de suprarregulación a lo largo del tiempo y (2) su modelo de inducción en respuesta a la infestación por VSV WT frente a mutante. Estos cohortes de genes corresponden, probablemente, a 3 ondas transcripcionales separadas (Tabla 1 y Figuras 2A, B y C). Consistente con esto, los subtipos IFN-\beta. IRF-7 e IFN-\alpha se segregaron cada uno a cohortes separados. Otros grupos han establecido que, en respuesta a un cierto número de estímulos, los factores de transcripción latentes IRF-3, NF\kappaB y c-JUN/ATF-2 se activan y ensamblan junto con CBP/p300 en el promotor de IFN-\beta para inducir la expresión (Wathelet et al., 1998, Mol. Cell 1:507-518). También, se sabe que IFN-\beta actúa de una manera de autoclave para inducir la activación del complejo transcripcional ISGF3 que conduce a la inducción de IRF-7 y otros genes que contienen elementos ISRE en sus promotores (Lu et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:31805-31812; Zhang y Pagano, 1997, Mol. Cell. Biol., 17:5748-5757; Zhang y Pagano, 2001, J. Virol. 75: 341-350). Además, la expresión ectópica de IRF-7 ha demostrado ser crítica para la expresión de IFN-\alpha en células incapaces de formar complejos ISGF3 (Sato et al., 1998, FEBS Lett. 441: 106-110). Esta dependencia atribuida de la inducción de IFN-\alpha sobre IRF-7 y la expresión de IRF-7 sobre IFN-\beta es reminiscente de los perfiles cinéticos de los genes en la disposición descrita. A la vista de estas observaciones, y asumiendo que IFN-\beta, IRF-7 e IFN-1\alpha son genes arquetípicos en un modelo general, parece ser que estos cohortes de genes pueden corresponder a 3 ondas transcripcionales separadas; cada una dependiente de y disparada por la onda transcripcional previa (Tabla 1 y Figuras 2A, B y C).
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TABLA 1 Análisis de microdisposición de la respuesta transcripcional a una infestación por VSV a lo largo del tiempo 
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1
2
3 
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La proteína M de VSV WT bloquea la señalización de interferón beta, mientras que la proteína M de AV1 y AV2 no puede
Para una mejor comprensión de la respuesta transcripcional temprana a una infestación por VSV se buscó una comprensión de la diferencia en estas respuestas entre las cepas WT e "inductoras de IFN". Mediante transferencia Western, parece ser que los virus WT, AV1 y AV2 disparan la fosforilación de IRF-3 con cinéticas similares (Figura 2E). Además, se encontró que algunos de los genes directamente regulados por los factores de transcripción IRF-3, NF\kappaB y c-JUN/ATF-2 estaban suprarregulados al mismo grado en células infestadas con virus WT, AV1 o AV2 (Figura 2A). Por ejemplo, genes de respuesta primaria eran robustamente inducidos 3-6 horas post-infestación por parte de los tres virus (Figuras 2A, D y E). Por otro lado, genes de respuesta secundaria, que requieren la producción de IFN-\beta y la activación autocrina de la vía JAK/STAT (Figura 2B), eran diferencialmente inducidos por parte de los virus de tipo salvaje y atenuados (véase IRF-7 en las Figuras 2B y 2E). Como consecuencia de la producción perjudicada de IRF-7 en células infestadas con VSV WT, productos génicos de respuesta terciaria, tales como los transcritos IFN-\alpha, no eran inducidos en células infestadas con VSV de tipo salvaje (Figura 2C), aunque eran fuertemente expresados en células infestadas con AV1 y AV2. Considerados juntos, estos resultados sugieren que VSV de tipo salvaje, a través de su proteína M, afecta a un bloque entre las respuestas transcripcionales antivirales primarias y secundarias mostradas en la Figura 2. En experimentos de transfección anteriores se ha sugerido que la proteína M de VSV bloquea la transcripción de IFN-\beta (Ferran y Lucas-Lenard, 1997, J. Virol., 71: 371-377), inhibe la exportación nuclear de ARNms (Her et al., 1997, Science, 276: 1845-1848; von Kobbe et al., 2000, Mol. Cell., 6:1243-1252) o interfiere con la señalización Jak/Stat (Terstegen et al., 2001, J. Immunol., 167:5209-5216). Los estudios que esbozan el transcrito, descritos en esta memoria, serían consistentes con uno cualquiera de los dos últimos mecanismos, pero no se observó perjuicio alguno en la inducción de la vía Jak/Stat por parte de interferón exógeno en células infestadas (datos no mostrados). Por otra parte, cuando se utilizó una microdisposición o el análisis por RT-PCR para comparar y contrastar transcritos en fracciones nucleares y citoplásmicas, se encontraron diferencias claras entre células infestadas con virus de tipo salvaje y atenuados (Figura 3). De manera importante, el ARNm de IFN-\beta, a pesar de que era inducido en fracciones nucleares por parte de los tres virus, no se encontró en grado significativo en la agrupación citoplásmica de ARNms en células infestadas de tipo salvaje.
En conjunto, estos resultados son consistentes con la idea de que tras la infestación, VSV de tipo salvaje dispara una respuesta antiviral primaria, pero a través de la expresión coordinada de productos génicos virales entorpece respuestas secundarias y terciarias bloqueando la exportación nuclear de ARNms antivirales críticos. En apoyo de este modelo, se construyó un VSV de tipo salvaje que expresa una versión constitutivamente activa de IRF-7. Como era de esperar, este virus tiene un fenotipo atenuado y es capaz de inducir la expresión de genes de IFN-\alpha en el espacio de 4 horas post-infestación, incluso en presencia de proteína M de VSV de tipo salvaje (Figura 2D; IFN-\alpha no se expresa hasta 12 horas post-infestación en el caso de infestaciones por AV1 y AV2; Tabla 1).
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Virus AV1 y AV2 atenuados conservan su capacidad de exterminar células tumorales
Para evaluar las propiedades oncolíticas de las cepas de VSV atenuadas, el panel de células tumorales humanas NCI (60 líneas de células de un espectro de malignidades) fue enfrentado a: virus WT, AV1 o AV2, y se sometió a ensayo en cuanto a la muerte metabólica de las células 48 horas más tarde, según se describe en Materiales y Métodos. Resulta claro de la Tabla 2A que VSV WT es capaz de infestar productivamente y exterminar una amplia gama de diferentes tipos de células cancerosas. Además, como ya había indicado un trabajo anterior de los autores de esta invención (Stojdl DF, Lichty B, Knowles S, Marius R, Atkins H, Sonenberg N, Bell JC 2000 Nature Medicine 6:821-5), la mayor parte de las líneas de células cancerosas sometidas a ensayo (aproximadamente el 80%) demostraron respuestas perjudicadas a IFN-\alpha o IFN-\beta (Tabla 2B). Por lo tanto, de manera no sorprendente, AV1 y AV2 eran tan eficaces para exterminar estas líneas de células tumorales como VSV WT, presumiblemente debido a los defectos de señalización de IFN en estas células (Tablas 2A y B).
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TABLA 2A Cepas de VSV mutantes son altamente líticas en miembros del panel NCI 60 de líneas de células cancerosas 
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TABLA 2B La mayoría de las líneas de células en el panel de células NCI 60 muestra defectos de IFN
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Actividad oncolítica in vivo de AV1 y AV2
Anteriormente, se informó del tratamiento con éxito de tumores de xenoinjerto subcutáneos en ratones hipotímicos con VSV WT (Stojdl, et al. 2000, Nature Medicine 6(7): 821-5, pero en estos experimentos se requirió proteger a los animales inmunodeficientes frente a los tratamientos con virus. Los resultados descritos más arriba sugieren que AV1 y AV2 deberían exterminar eficazmente a células tumorales con una escasa toxicidad en modelos de ratones hipotímicos, incluso en ausencia de interferón administrado de forma exógena. Células de carcinoma de ovarios humano se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones hipotímicos CD-1 y se dejó que se desarrollaran durante 12 días. La mayor parte de los ratones (14/15) que recibieron virus inactivado por UV desarrollaron una ascitis hacia el día 15 post-tratamiento (el ratón restante en este cohorte alcanzó un punto final el día 39). En contraposición, 3 dosis de AV2 suministradas en la cavidad peritoneal proporcionaron curaciones duraderas del 70% de los ratones (Figura 4A). De manera sorprendente, mientras que una dosis individual intraperitoneal de VSV WT es uniformemente letal para ratones hipotímicos, ninguno de los animales tratados con tres dosis de AV2 exhibía incluso síntoma alguno de una infestación por virus (p. ej. malestar, pérdida de peso, deshidratación).
Tratamiento sistémico de tumores subcutáneos con AV1 y AV2
Mientras que las cepas AV1 y AV2 son eficaces cuando se inyectan en el sitio primario de asentamiento del tumor, se necesitó determinar la eficacia terapéutica de cepas atenuadas sistémicamente suministradas. Para ello, se establecieron tumores subcutáneos inyectando células de carcinoma de colon CT26 en el flanco trasero de ratones Balb/c singeneicos. Una vez que los tumores se volvieron palpables (aproximadamente 10 mm^{3}) se administró el virus a través de inyección en la vena de la cola. Doce días después del tratamiento, los ratones que recibieron VSV inactivado por UV alcanzaron el punto final con un tamaño medio del tumor de 750 mm^{3}. En contraposición, un tratamiento sencillo con AV2 mostró una eficacia significativa, demorando el tiempo hasta el punto final en casi 3 veces (34 días), De los 8 animales en este grupo de tratamiento, se consideró que 7 respondían parcialmente, mientras que solamente 1 ratón no respondía al tratamiento (Tabla 3). Cuando se administraron múltiples dosis de AV1 o AV2 por vía intravenosa, se incrementó acusadamente la eficacia de los tratamientos (Figura 4B y Tabla 3). Con la excepción de un animal, todos los tumores respondieron al tratamiento con AV1, mostrando 3/6 ratones una regresión completa del tumor. Dos de estos ratones mostraron regresiones completas en una fase tan temprana como los días 8 y 9, respectivamente, post-infestación. Dos de los animales restantes mostraron respuestas parciales, demorando la progresión del tumor en casi 2 veces en comparación con controles. Todos los ocho ratones infestados con AV2 respondieron bien al tratamiento, desarrollando cinco de ocho regresiones duraderas de los tumores. Además, estos ratones no consiguieron producir tumores cuando se les volvió a enfrentar a células CT26 7 meses después del tratamiento, sin traza alguna de virus detectable (datos no mostrados), indicando quizás que se había desarrollado una inmunidad, mediada por el hospedante, al tumor.
La duplicación del número de dosis virales administradas a animales portadores del tumor no aumentaba el número de regresiones duraderas (Tabla 3), sugiriendo que la inmunidad anti-viral que surge durante el transcurso del tratamiento puede influir sobre el resultado. También, en un enfoque descrito previamente con VHS oncolítico (Lambright et al., 1999, Ann. Thorac. Surg., 68: 1750-1760 y 1761-1772), se testó la utilidad de inyectar células infestadas con el virus, en lugar del virus solo, como una modalidad terapéutica. Se razonó que células infestadas pudieran funcionar como "caballos de Troya" enmascarando al virus mientras que se encuentran en el sistema vascular y facilitando el suministro del virus cuando se depositan en la neo-vasculatura del tumor. Para este fin, células CT-26 infestadas in vitro durante dos horas con AV2 fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones portadores de tumores. En estos experimentos, pareció que células CT-26 infestadas eran tan eficaces como un modo de suministrar virus a sitios del tumor como el utilizar virus purificados (tres regresiones completas y una respuesta parcial; Figura 4B).
Todas las formas de tratamiento intravenoso eran bien toleradas por los ratones, sin que se produjeran muertes, y síntomas mínimos de morbidez. Los ratones infestados tenían una erección pilosa de suave a media, una suave deshidratación y una cierta pérdida transitoria de peso corporal tras el tratamiento inicial (Figura 4C). Estos síntomas solamente fueron observados después de la infestación inicial, todas las dosis subsiguientes no consiguieron provocar síntoma alguno de infección.
TABLA 3 Tasa de respuesta incrementada con el número incrementado de dosis en el modelo de tumores subcutáneos
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La administración sistémica de AV1 y AV2 es eficaz contra una enfermedad diseminada
Células CT-26, cuando se inyectan en la vena de la cola, siembran tumores por todo el ratón, aunque, predominantemente, en los pulmones, conduciendo a una mortalidad en el espacio de 3-4 semanas. Se examinaron los pulmones de cuatro ratones 16 días después de la inyección de células tumorales y cuatro días después del tratamiento con virus inactivados por UV (Figura 4D). Estos pulmones tenían 3 veces su masa normal debido a la carga del tumor, que se evidencia como nódulos sobre la superficie de los pulmones. En contraposición, ratones compañeros de jaula portadores de tumores que recibieron una dosis única intravenosa de AV2, 4 días antes del momento del sacrificio, tenían pulmones con una masa normal y unos pocos nódulos tumorales obvios. AV2 administrado por instilación intranasal mostraron también una eficacia significativa, mientras que parecía óptima una combinación de administración intravenosa e intranasal (Figura 4D).
La Figura 4E muestra los lugares de supervivencia de ratones a los que se sembraron tumores en los pulmones y luego se trataron por vía intranasal con virus inactivados por UV, AV1 o AV2. El tiempo medio hasta la muerte (MTD - siglas en inglés) de los animales tratados con virus inactivados por UV era de aproximadamente 20 días. Sin embargo, ratones tratados con AV1 o AV2 estaban protegidos por completo. Este experimento demuestra la capacidad sorprendente de AV1 y AV2 de producir curaciones duraderas en un modelo de tumores agresivo, diseminado, inmuno-competente.
Discusión
Una diferencia clave entre estos virus atenuados y las versiones oncolíticas de VSV, de las que se informó previamente, es la incapacidad de proteínas M mutantes de bloquear la producción de interferón en células infestadas. M de VSV es una proteína multifuncional, requerida para varias funciones virales claves, que incluyen: germinación (Jayakar, et al. 2000, J Viral, 74: 9818-9827), montaje del virión (Newcomb, et al. 1982, J Viral, 41: 1055-1062), efecto citopático (Blondel, et al. 1990, J. Virol., 64: 1716-1725) e inhibición de la expresión del gen en el hospedante (Lyles, et al. 1996, Virology 225: 172-180). La última propiedad ha sido atribuida a la capacidad de M de bloquear la actividad de la ARN polimerasa en el hospedante (Yuan et al., 2001, J. Virol., 75:4453-4458) o de inhibir el transporte nuclear tanto de las proteínas como de los ARNms hacia y fuera del núcleo hospedante (Her et al., 1997, ibid; von Kobbe et al., 2000, ibid). Los resultados que se presentan aquí utilizando una infestación con virus son consistentes con los bloqueos en el transporte nuclear que son el mecanismo principal mediante el cual cepas de VSV de tipo salvaje mitigan la respuesta antiviral en el hospedante. El presente análisis de transcritos de células infestadas proporcionó poca evidencia que sustentara un papel de la proteína M en la inhibición de la transcripción de células hospedantes, sino que, más bien, demuestra que la infestación por VSV dispara una estimulación, mediada por IRF-3, de genes antivirales, seguido de un bloqueo, mediado por la proteína M, de transcritos de respuesta primaria procedentes de núcleos de células infestadas. Particularmente vinculado a este estudio está el trabajo del grupo de Dahlberg (Petersen et al., 2000, Mol. Cell. Biol., 20:8590-8601) y otros (von Kobbe et al., 2000, ibid) que ha demostrado, mediante estudios de transfección, que la proteína M se puede asociar con proteínas de poro nucleares y realizan un bloqueo en la exportación de ARNm.
Aunque no se pretende estar ligado por la teoría, parece ser que los programas antivirales en células hospedantes se inician mediante activación de los factores de transcripción latentes NF\kappaB, c-JUN/ATF2 e IRF-3. Tras la entrada del virus en la célula hospedante, los factores de transcripción c-JUN e IRF-3 son fosforilados por parte de JNK y una quinasa viralmente activada, recientemente identificada (John Hiscott, comunicación personal), respectivamente, mientras que NF\kappaB es liberado desde su inhibidor IkB a través de la acción de IKK(s) situados más arriba (DiDonato et al., 1997, Nature, 388:548-554). Los factores de transcripción activados se desplazan al núcleo y forman coordinadamente un complejo de potenciosoma ("enhanceosome") en el promotor de IFN-\beta, conduciendo a la inducción de IFN-\beta (Wathelet et al., 1998, ibid). A esto se alude en esta memoria como la respuesta transcripcional primaria a una infestación por virus. Se ha postulado que una onda transcripcional secundaria es disparada por la inducción, dependiente de IFN-\beta, de una diversidad de genes estimulados por interferones. Los datos presentados en esta memoria con la proteína M de tipo salvaje ayudan a delinear la distinción entre estos eventos transcripcionales primarios y secundarios, así como a identificar varios nuevos genes de respuesta viral (GADD34, PUMA). Tras la infestación con virus que albergan proteínas M mutantes, resulta claro que la estimulación autocrina de la vía de señalización JAK/STAT por parte de IFN-\beta conduce a la producción de genes de respuesta secundaria, tal como IRF-7, que, a su vez, son críticos para la inducción terciaria de genes de IFN-\alpha (Morin et al., 2002, J. Mol. Biol., 316:1009-1022). De hecho, el bloqueo por parte de la proteína M de transcritos secundarios y terciarios se puede superar expresando una versión de IRF-7 constitutivamente activa (a partir de un promotor viral), incluso en presencia de proteína M de tipo salvaje.
Una de las limitaciones de la terapia oncolítica puede ser la neutralización del virus por parte de anticuerpos pre-existentes, presentes en la población humana (Ikeda et al., 1999, Nature Medicine, 5:881-887). El uso de un virus oncolítico, tal como VSV, el cual no es endémico en la población humana, debería proporcionar una significativa ventaja terapéutica. Mientras que en este estudio se encontró en algún instante una dependencia de la dosis a la actividad oncolítica (seis tratamientos son superiores a uno), presumiblemente ya que se desarrollan anticuerpos neutralizantes, dosis adicionales no proporcionan beneficio terapéutico alguno. Estos resultados sugieren que uno de los determinantes críticos para una terapia viral con éxito será el suministro eficaz al lugar del tumor antes del desarrollo de una respuesta inmune anti-viral. Probablemente será importante suministrar la dosis de virus máxima tolerable con la mayor frecuencia posible antes de la evolución de la respuesta anti-viral mediada por el hospedante. La determinación de la dosis exacta requerida para pacientes individuales es bien conocida dentro de las capacidades de los médicos que trabajan en el sectro y, por lo tanto, no es necesario discutir en esta memoria dosificaciones
específicas.
En principio, podrían ser útiles estrategias que implicaran una inmunosupresión de los pacientes antes de la terapia vírica, pero se ha encontrado que un componente importante de la terapia oncolítica viral es una respuesta anti-tumor la cual se inicia por la expresión de proteínas virales en las superficies de células tumorales (datos no mostrados y Todo et al., 1999, Human Gene Therapy, 10:2741-2755). Quizás otras estrategias, tales como la infusión de células infestadas con virus tal como se muestra en esta memoria, o el revestimiento con polímeros de preparaciones virales (Fisher et al., 2001, Gene Ther., 8:341-348) proporcionarán una oportunidad de suministrar productos terapéuticos a sitios de tumores sin comprometer valiosas respuestas inmunes del hospedante.
Los datos presentados en esta memoria indican que durante la evolución del tumor se producen, con frecuencia, defectos en la señalización de interferones, teniendo una gran mayoría de las líneas de células en el panel NCI una respuesta perjudicada. Datos acumulativos han indicado que el interferón es una citoquina multifuncional que puede regular de forma coordinada el desarrollo de la célula, la apoptosis y las vías antivirales. Quizás, durante la evolución del tumor, la selección de un desarrollo incesante y la pérdida de la apoptosis sobrepasa la necesidad ocasional de una actividad anti-viral.
De manera ideal, un virus oncolítico se replicará, de manera preferente, en células malignas, tendrá la capacidad de diseminarse desde el tumor primario a sitios de la metástasis y, en última instancia, será desalojado por parte del hospedante. En esta memoria se presenta una evidencia de que los virus AV1 y AV2 atenuados encarnan todos estos tratados y, debido a su capacidad de disparar respuestas antivirales en células normales, pueden estar excepcionalmente seguros in vivo. Hasta la fecha ha demostrado ser imposible seleccionar variantes de VSV que sean resistentes a los efectos antivirales de los interferones (Novella et al., 1996, J. Virol., 70:6414-6417) y se ha demostrado la capacidad de estos mutantes inductores de IFN de proteger al hospedante en trans frente a una infestación con VSV WT (Figura 1D). Por lo tanto, es posible que en una población de virus, en la que la mayoría de las partículas son potentes inductores de interferón, es remota la posibilidad de que surja con dominancia una variante de tipo salvaje. La "nube de citoquinas" resultante, producida por la infestación con el virus inductor de IFN, protegería al hospedante de una cepa WT más virulenta (véase la Figura 5). Sin embargo, no se vería afectado el exterminio del tumor, ya que estas células han demostrado ser defectuosas para responder a una "nube de citoquinas" de este tipo. Por ello, se incremente el índice terapéutico, mejorando adicionalmente el potencial de los virus oncolíticos en calidad de agentes terapéuticos contra el cáncer.
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Ejemplo 2
VSV's mutantes rescatados
Se construyó una serie de virus recombinantes para testar el intervalo de mutaciones que son útiles para la generación de mutantes inductores de interferón. Para este fín se creó una cadena principal que contenía los genes N, G y L del plásmido pXN-1 (Scnell MJ, Buoncore L, Whitt MA y Rose JK (1996) J. Virology 4, 2318-2323) y los genes P y M de AV1. Una vez creada una serie de virus que diferían solamente en sus genes M, sustituyendo secuencialmente variantes en el gen M tal como se muestra en las figuras acompañantes (Figuras 6 y 7). Por ejemplo, XNDG M4 contiene los genes N, G y L de pXN-1, el gen P de AV1 y un gen M con la metionina 51 suprimida. XNDG M5 alberga un gen M que tiene una deleción de cuatro aminoácidos de metionina 51.
Aspartato 52, treonina 53 e histidina 54 (Figura 7). Tal como muestran los autores de la invención en la Tabla 4 (que figura más abajo), estos dos mutantes son igualmente eficaces para exterminar tres líneas de células humanas de células tumorígenas como un mutante que se produce de forma natural (Mut2 o AV1) que tiene una metionina 51 convertida en una arginina ( es decir, M51R). Dado que XNDG M4 y M5 son mutantes por deleción, resultará mucho más difícil que estos virus recombinantes reviertan de nuevo al genotipo de metionina 51 original. Además, mientras que virus tratados mediante ingeniería siguen siendo capaces de exterminar eficazmente células tumorales, forman pequeñas placas en células que responden a interferones, indicando que estos virus están atenuados para el desarrollo en células que no pueden responder a interferones (Figura 8).
Para ejecutar el ensayo de placa, se sembraron células Vero en placas de cultivo tisular de 60 mm de diámetro a una confluencia en aMEM + suero bovino al 10% y se permitió que se fijaran durante al menos 3 horas bajo condiciones de cultivo tisular normales. Se realizan diluciones en serie de la suspensión de virus de muestra a incrementos de semi-log (p.ej. 10-4, 10-4 ½, 10-5, 10-5 ½, ... etc.) en aMEM exento de suero. Los medios se aspiraron de las placas de 60 mm, se añadieron 100 \mul de suspensión de virus por cada placa y las placas se incubaron bajo condiciones de cultivo tisular normales durante 45 minutos. Tras la incubación durante 45 minutos, las placas se cubrieron con 3 ml de una mezcla 1:1 de agarosa al 1% + (2X aMEM + suero bovino fetal al 20%) a 42ºC. Después, las placas se incubaron durante una noche y se hizo el recuento de las placas a la mañana siguiente.
Líneas de células OVCAR (una línea de células de cáncer de ovarios humana), 283T (una línea de células de riñón humanas transformada por el antígeno-T grande de SV 40) y U2OS (línea de células de osteosarcoma humana) se infestaron con virus AV1 (Mut2), XNDG M4 y XNDG M5 y se determinó la viabilidad de las células después de un periodo de tiempo, utilizando el ensayo MTS según se describe más arriba. Los datos proporcionados en la Tabla 4 demuestran que VSVs mutantes rescatados tienen propiedades de exterminio similares en comparación con
AV1.
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TABLA 4 MOI requerida para exterminar el 50% de células en 48 horas, según se mide por el ensayo MTS
8 
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Ejemplo 3
Proteínas de fusión de la proteína M de GFP
Cuando se condensa al extremo amino de la proteína fluorescente verde (GFP - siglas en inglés), el extremo amino de la proteína de la matriz (M) de VSV (aminoM + 72-GFP-N1) fija como objetivo esta proteína de fusión a las mitocondrias (Figuras 9 y 10). Los primeros 72 aminoácidos de la M de Indiana de VSV son capaces de fijar como objetivo a GFP. Una proteína de fusión iniciada en la metionina 33 (M33) es también capaz de fijar como objetivo GFP a las mitocondrias, mientras que los primeros 50 aminoácidos solos no son capaces. No se requiere metionina 51 (M51). Cuando se condensa al extremo C de la GFP, estas secuencias no fijan como objetivo la proteína de fusión a las mitocondrias, por lo tanto estas secuencias deben estar en el extremo amino de una proteína recombinante para ejecutar esta fijación.
Como se muestra en las Figuras 9 y 10, cuando una fusión entre los 72 aminoácidos amino-terminales y GFP (aminoM + 72-GFP-N1) se expresa transitoriamente en células cultivadas: 1) la proteína de fusión es fijada como objetivo a las mitocondrias, 2) las mitocondrias pierden la organización reticulotubular usual y se desmoronan en estructuras perinucleares punteadas que 3) pierden el potencial de la membrana. Estas son las características distintivas de una célula moribunda.
Se ha reconocido a la proteína de la matriz de VSV como una proteína tóxica que juega un papel en la citotoxicidad del virus. La transcripción de la proteína M se inicia en tres codones ATG alternativos (M1, M33 y M51) y un virus mutado en M33 y M51 de modo que no pueda producir las isoformas más cortas tiene una citotoxicidad significativamente reducida. Un virus que tiene una proteína M de VSV mutante, que ya no fija como objetivo las mitocondrias, será menos citotóxico.
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Ejemplo 4
Protección contra la morbidez inducida por VSV
Este estudio demuestra que VSV mutante (\DeltaM51) sistémicamente administrado puede proteger frente a una dosis intracraneal letal de VSV.
A grupos de ratones Balb/C hembras de 8 semanas de edad se les inyectaron por vía intravenosa (se les cebó) con PBS, VSV WT GFP (1e8 ufp) o VSV \DeltaM51 GFP (1e8 ufp). Veinticuatro horas más tarde, todos los ratones fueron inoculados intracranealmente con 2e7 ufp de VSV \DeltaM51 (en 5 \mul de PBS) y se les vigiló en cuanto a síntomas de morbidez y parálisis.
Los resultados se presentan en las Figuras 17A y 17B. La Figura 17A proporciona una gráfica de supervivencia de Kaplan Meyer que demuestra que sobrevivió el 100% de ratones cebados con \DeltaM51, mientras que todos los ratones cebados con WT y PBS control desarrollaron una parálisis de las extremidades traseras y fueron eutanizados. La Figura 17B es una gráfica de los pesos de los ratones a lo largo del tiempo, tras tratamiento intravenoso. Los ratones cebados con \DeltaM51 no mostraron pérdida de peso alguna, mientras que los ratones WT y PBS control mostraron una pérdida de peso extrema antes de la eutanasia.
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Ejemplo 5
Producción de interferón tras infestación con VSV
Los datos que se presentan en este estudio demuestran que las células infestadas con VSV mutante secretaban IFN-\alpha e IFN-\beta, mientras que las células infestadas con VSV WT no producían IFN-\alpha e IFN-\beta, o lo hacían en cantidades mucho menores.
Interferón-\beta
Células OVCAR4, CAKI-1 y HOP62 fueron infestadas (MOI de 10 ufp) con cepas de VSV WT o mutante. Las células infestadas fueron analizadas mediante ELISA para la producción de IFN-\beta 10 horas post-infestación. Células infestadas con AV1 y AV2 y células no infestadas con VSV WT producen IFN-\beta secretado. El ELISA se realizó utilizando un kit de detección de IFN-\beta humano comercialmente disponible (TFB INC; Tokio, Japón). Los resultados de este estudio se muestran gráficamente en la Figura 18.
Las tres líneas de células son todos cánceres humanos que se seleccionaron para este estudio, ya que caen en el 20% de cánceres que en cierta medida responden a interferones. OVCAR son células de cáncer de ovarios, HOP62 son células de cáncer de pulmón y CAKI-1 son cánceres renales. En cada caso, las células fueron infestadas según se describe en el ensayo MTS (véase el Ejemplo 1).
Interferón-\alpha
Se analizaron los niveles de IFN-\alpha en suero de ratones utilizando un kit ELISA de Interferón-Alfa de ratón (PBL Biomedical). A ratones Balb/C hembras (de 10 semanas de edad; Charles River) se les inyectaron por vía intravenosa PBS ó 1 x 10^{8} ufp de GFP WT o GFP AV3 (en donde AV3 es una versión tratada mediante ingeniería de VSV, en donde la metionina 51 ha sido suprimida por completo) diluida en PBS. A los instantes post-infestación indicados se recogió sangre de la vena sáfena de cada uno de los ratones en tubos heparinizados y se centrifugó para obtener suero. Para cada muestra 5 \mul de suero se diluyeron en 95 \mul de PBS y se analizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados proporcionados en la Tabla 5 que figura más abajo demuestran que los ratones infestados con el \DeltaM51 producían IFN-\alpha en una fase más temprana y en mayores cantidades que los ratones infestados con VSV WT. Los ratones nativos no producían cantidades detectables de IFN-\alpha.
TABLA 5 Interferón-\alpha en el suero (pg/ml)
9
Ejemplo 6
Se encontró que el tratamiento in vivo de ratones con \Delta51-VSV aumentaba drásticamente la lisis de dianas de células tumorales CT26 mediada por linfocitos T citotóxicos (CTL - siglas en inglés), en comparación con la lisis por parte de esplenocitos procedentes de ratones portadores de tumores y no tratados con VSV.
Ratones Balb/c con tumores subcutáneos de CT26 establecidos fueron tratados, por vía intravenosa, con o sin 5x10^{8} ufp de \DeltaM51-VSV. Al cabo de 7 días, se recolectaron los esplenocitos y se cultivaron en una relación 5:1 con células tumorales CT26 irradiadas. Después de 7 días de estimulación in vitro se analizaron los esplenocitos en cuanto a actividad de CTL anti-CT26. Los resultados de este estudio se representan gráficamente en la Figura 19A, en la que se representa el % de lisis específica para tumores por encima del fondo de lisis espontánea de células tumorales diana CT26 en ausencia de esplenocitos efectores frente a la relación efector:diana (las células diana son las células tumorales, los esplenocitos son las células efectoras o exterminadoras).
También se observaron diferencias cualitativas en las respuestas inmunes provocadas por virus WT o \DeltaM51. Ratones Balb/c fueron tratados, por vía intravenosa, con 5x10^{8} ufp de VSV de tipo salvaje o \Delta51, y al cabo de 7 días se recolectaron los esplenocitos y se co-cultivaron con células tumorales CT26 irardiadas. Después de 7 días en cultivo, los esplenocitos se analizaron en cuanto a la lisis contra células CT26, con o sin un agotamiento previo de células NK con perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. El tratamiento de los ratones con VSV tanto de tipo salvaje como con \DeltaM51-VSV, cebó a los esplenocitos para la potente generación de respuesta inmune primaria a antígenos tumorales CT26 in vitro, sin exposición previa in vivo a los antígenos tumorales durante la infestación viral. Esto indica que la terapia con VSV ceba a los esplenocitos in vivo para la subsiguiente generación de la respuesta primaria in vitro contra antígenos nuevos. La actividad lítica contra células CT26 tras una terapia con VSV de tipo salvaje era dependiente de NK. La actividad lítica contra células CT26 tras una terapia con \DeltaM51-VSV fue mediada por CTL, lo que indica eventos de cebado inmunológicos cualitativamente distintos tras una terapia con \DeltaM51-VSV frente a VSV WT. Estos resultados se representan en la Figura 19B. Estos datos sugieren también la superior capacidad de \DeltaM51-VSV para provocar potentes respuestas inmunes adaptativas (lisis mediada por células T CD8+) con un potencial para el desarrollo de una memoria inmunológica protectora, en contraposición con una infestación de tipo salvaje que generaba un mecanismo efector mediado por células NK, fundamentalmente innato, contra células CT26.
Este estudio demuestra que el virus mutante induce una respuesta cualitativamente diferente a la del virus de tipo salvaje. La inducción de células CTL en este ensayo sólo se observa con el virus mutante. La respuesta por parte de CTL también será una respuesta protectora a largo plazo, mientras que la respuesta por NK no tendrá memoria. La inducción de esta respuesta diferenciada es posiblemente atribuible a la inducción de citoquinas por parte del virus mutante.
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Ejemplo 7
Tinción inmunohistoquímica de tumores tratados con VSV mutante
Con el fin de estudiar el efecto de VSV mutante sobre tumores, ratones Balb/c, portadores de tumores CT26 subcutáneos, fueron tratados por vía intravenosa con GFP de \DeltaM51-VSV. Al cabo de 2, 5 u 8 días, se eutanizó a los ratones y los tumores fueron congelados instantáneamente y posteriormente seccionados (5 \mum) y fueron teñidos inmunohistoquímicamente para VSV, caspasa 3 activa y CD45, un marcador de panleucocitos. En este estudio se utilizaron técnicas convencionales. En la Figura 20 se muestran fotografías de las secciones teñidas. La mancha positiva es de color pardo, mientras que todos los núcleos se tiñen de azul con hematoxilina. La tinción H&E muestra la morfología del tumor (la tinción H&E es una mancha no específica que muestra la estructura global del tumor).
La tinción inmunohistoquímica de tumores tratados con VSV mutante reveló una apoptosis masiva y la acumulación de leucocitos. Este estudio demuestra que VSV mutante es un excelente agente oncolítico, ya que induce la muerte de células tumorales que incluso no habían sido infestadas ( es decir, células caspasa 3+ que han sufrido apoptosis). Aun cuando no se pretende estar ligado por la teoría, esto es probable, ya que de nuevo el virus mutante indica la producción de citoquinas citotóxicas que exterminan células tumorales antes que el virus infestante. Además, el virus mutante recluta leucocitos (células CD45+) que pueden infiltrarse y atacar al tumor. Las células CD45+ penetran después de las células infestadas con el virus mutante, de nuevo en respuesta a las citoquinas inducidas por la infestación con virus de células tumorales.
<110> Ottawa Health Research Institute Wellstat Biologics Corporation
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<120> Virus mutantes y sus usos
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<130> 16666
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<150> 60/457.591
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<151> 27-03-2003
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<160> 20
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 11161
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<212> ADN
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<213> Virus de la estomatitis vesicular
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 690
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<212> ADN
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<213> Virus de la estomatitis vesicular
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<400> 2
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17 
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> Virus de la estomatitis vesicular
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<400> 3
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<211> 11161
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<212> ADN
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<213> Virus de la estomatitis vesicular
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<400> 4
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19
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Virus de la estomatitis vesicular
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<212> PRT
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<213> Virus de la estomatitis vesicular
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<212> ADN
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<212> ADN
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<223> Cebador de PCR
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Claims (15)

1. Un virus de la estomatitis vesicular (VSV) mutante que tiene la mutación \DeltaM51 en la proteína de la matriz (M).
2. El VSV mutante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en \DeltaM51-54, \DeltaM51-57, V221F, S226R, \DeltaV221-S226, V221X, S226X, o una combinación de las mismas.
3. El VSV mutante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en \DeltaM51/V221F; \DeltaM51-54/V221F; \DeltaM51-57/V221F, \DeltaM51/S226R, \DeltaM51-54/S226R y \DeltaM51-57/S226R.
4. El VSV mutante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en \DeltaM51/V221F/S226R; \DeltaM51-54/V221F/S226R y \DeltaM51-57/V221F/S226R.
5. Un vector viral que comprende un VSV mutante de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
6. El vector viral de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende, además, un ácido nucleico heterólogo.
7. Un vector de vacuna que comprende un VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más antígenos.
8. Un adyuvante de vacuna que comprende un VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable.
9. Un agente oncolítico que comprende un VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica que comprende un VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
11. Una composición inmunogénica que comprende un VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
12. Uso del VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en calidad de un aditivo para preparaciones farmacéuticas de virus para la protección frente a revertantes virulentos que surgen en dicha preparación.
13. Uso del VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que puede ser aliviado por la liberación de citoquinas.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha enfermedad o trastorno es cáncer, infección bacteriana, infección viral o infección por hongos.
15. Un kit que comprende uno o más recipientes y un VSV mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
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