ES2319636T3 - Purificacion de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar una proteína, que comprende una región C H2/C H3, de una solución contaminada de la misma mediante cromatografía de Proteína A, que comprende: (a) adsorber la proteína de dicha solución contaminada a la Proteína A inmovilizada en una fase sólida; (b) eliminar los contaminantes mediante el lavado de la fase sólida con una composición que comprende detergente en una concentración entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 5% y sal a una concentración de entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 2 M, teniendo la composición un pH de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 5,5; y (c) recuperar la proteína de la fase sólida con un tampón de elución que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
Description
Purificación de proteínas.
La presente invención se refiere en general a la
purificación de proteínas. En particular, la presente invención se
refiere a un procedimiento para purificar proteínas que contienen la
región C_{H}2/C_{H}3, tales como anticuerpos e inmunoadhesinas,
mediante cromatografía de afinidad de Proteína A.
La purificación económica a gran escala de
proteínas es un importante problema creciente para la industria de
la biotecnología. En general, las proteínas se producen mediante el
cultivo celular utilizando líneas celulares de mamífero o
bacterianas diseñadas para producir la proteína de interés mediante
la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para
esa proteína. Dado que las líneas celulares utilizadas son
organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento
complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores de
crecimiento, normalmente suministradas a partir de preparaciones de
suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de
compuestos suministrados a las células y de los subproductos de las
propias células hasta una pureza suficiente para su uso como
producto terapéutico humano plantea un tremendo desafío.
Los procedimientos para la purificación de
proteínas a partir de debris celular dependen inicialmente del
sitio de expresión de la proteína. Se puede provocar que algunas
proteínas se secreten directamente desde la célula a los medios de
crecimiento circundantes; otros se realizan intracelularmente. Para
estas últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de
purificación implica la lisis de la célula, que se puede realizar
mediante una serie de procedimientos, incluyendo cizalla mecánica,
choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicha rotura libera
todo el contenido de la célula en el homogenato y, además, produce
fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su
pequeño tamaño. Éstos se eliminan generalmente mediante
centrifugación diferencial o mediante filtración. Los mismos
problemas aparecen, aunque a menor escala, con proteínas secretadas
directamente debido a la muerte natural de las células y la
liberación de proteínas intracelulares de células huésped en el
transcurso del proceso de producción de la proteína.
Una vez se ha obtenido una solución purificada
que contiene la proteína de interés, su separación de las otras
proteínas producidas por la célula se intenta normalmente utilizando
una combinación de técnicas cromatográficas diferentes. Estas
técnicas separan mezclas de proteínas en base a su carga, el grado
de hidrofobicidad o el tamaño. Están disponibles diversas resinas
para cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas,
permitiendo un ajuste preciso del esquema de purificación para la
proteína concreta implicada. La esencia de cada uno de estos
métodos de separación es que se puede provocar que las proteínas se
muevan a diferentes velocidades bajando por una columna larga,
consiguiendo una separación física que aumenta a medida que sigue
bajando por la columna, o se adhieren de manera selectiva al medio
de separación, eluyéndose a continuación de manera diferencial
mediante diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína
deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren
específicamente a la columna y la proteína de interés no lo hace,
es decir, la proteína de interés está presente en "flujo de
paso".
La cromatografía de afinidad, que aprovecha la
interacción específica entre la proteína a purificar y un agente de
captura inmovilizado, también puede ser una opción para algunas
proteínas. La proteína A es un adsorbente útil para la
cromatografía de afinidad de proteínas, tales como anticuerpos, que
contienen una región Fc. La proteína A es una proteína de la pared
celular de 41 kD de Staphylococcus aureas que se une con una
afinidad elevada (aproximadamente 10^{-8} M a IgG humanas) a la
región Fc de los anticuerpos.
La proteínas se pueden purificar utilizando un
cristal de poro controlado (Sulkowski, E. Protein Purification:
Micro to Macro, pág. 177-195 (1887); Cada et
al., Preparative Biochemistry 11 (4): 467-482
(1981)) o sílice no derivado (Reifsnyder et al. J.
Chromatography 753: 73-80 (1996)).
Las Patentes US Nos. 6.127.526 y 6.333.398
(Blank, G.) describen una etapa de lavado intermedio durante la
cromatografía de la Proteína A utilizando electrolitos hidrofóbicos,
por ejemplo, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) y cloruro de
tetraetilamonio (TEAC), para eliminar los contaminantes, pero no la
Proteína A inmovilizada o la proteína de interés, unidos a la
columna de Proteína A.
Iyer et al. (Biopharm, 1:
14-20, 2002) considera factores que afectan a la
purificación de anticuerpos de cultivos celulares utilizando la
cromatografía de Proteína A.
La presente invención proporciona varios
tampones de lavado intermedios, diferentes de TMAC o TEAC, para su
uso en la cromatografía de Proteína a.
En una realización, la presente invención
proporciona un procedimiento para purificar una proteína que
comprende la región C_{H}2/C_{H}3, de una solución contaminada
de la misma mediante cromatografía de Proteína A que comprende: (a)
adsorber la proteína a la Proteína A inmovilizada en una fase
sólida; (b) eliminar contaminantes mediante el lavado de la fase
sólida con una composición que comprende detergente en una
concentración entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 5% y sal
a una concentración entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 2
M, teniendo la composición un pH de aproximadamente pH 4,5 a
aproximadamente 5,5; y (c) recuperarla proteína de la fase
sólida.
En realizaciones preferidas, la proteína es un
anticuerpo (por ejemplo, uno que se une a HER2, factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), IgE, CD20, CD40, CD11a,
factor tisular (TF), antígeno de células madre de próstata (PSCA),
interleuquina-8 (IL-8), receptor del
factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER3, HER4,
\alpha4\beta7 o \alpha5\beta3) o una inmunoadhesina (por
ejemplo, una inmunoadhesina de receptor de TNF).
Las figuras 1A-B muestran la
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (SEC ID No. 1) y la
secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (SEC ID No. 2) de
Trastuzumab (HERCEPTIN®).
La figura 2 representa el cribado
("screening") de varios tampones de lavado intermedios con
respecto al antígeno anti-IgE E26. Se representa la
cantidad de contaminación de Proteína de Ovario de Hámster Chino
(CHOP) en el pool de elución (ppm).
La figura 3 muestra el cribado de tampones de
lavado intermedios que contienen polietilenglicol (PEG). El
anticuerpo es E26.
La figura 4 ilustra el cribado de lavados
intermedios de urea, en el que el anticuerpo es E26.
La figura 5 representa el cribado de varios
tampones de lavado intermedios con respecto al anticuerpo
anti-HER2 Trastuzumab. Se representa la cantidad de
CHOP en el pool de elución (ppm).
La figura 6 representa el cribado de varios
tampones de lavado intermedios con respecto a Trastuzumab y un
anticuerpo CD11a humanizado.
La figura 7 muestra CHOP en el pool de Proteína
A para Trastuzumab y un tampón de lavado intermedio que incluye sal
de citrato sódico o acetato sódico; o E26 y un tampón de lavado
intermedio que incluye sal de sulfato sódico o citrato sódico.
La figura 8 representa la alteración de
polisorbato 20 en el tampón de lavado intermedio para E26.
La figura 9 ilustra el efecto del pH en CHOP en
el pool de elución para Trastuzumab y E26.
Cuando se utiliza en la presente invención
"Proteína A" comprende Proteína A recuperada de una fuente
nativa de la misma, Proteína A producida sintéticamente (por
ejemplo, mediante síntesis de péptidos o mediante técnicas
recombinantes), y variantes de la misma que mantienen la capacidad
de unirse a proteínas que tienen una región C_{H}2-/C_{H}3. La
Proteína A se puede adquirir comercialmente en Repligen, Pharmacia y
Fermatech.
La Proteína A se inmoviliza en una fase sólida.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que la
Proteína A se adhiere. La fase sólida de interés en la presente
invención es generalmente aquella que comprende una superficie de
vidrio, sílice, agarosa o poliestireno. La fase sólida puede ser una
columna de purificación o una fase discontinua de partículas
discretas. En realizaciones preferidas, la fase sólida es una
columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido
silícico. En ciertas realizaciones, la fase sólida está recubierta
con un reactivo (tal como glicerol) que pretende evitar la
adherencia no específica de contaminantes a la fase sólida.
La proteína de interés de la presente invención
es aquella que comprende una región C_{H}2/C_{H}3 y, por lo
tanto, es susceptible de purificación mediante la cromatografía de
Proteína A. El término "región C_{H}2/C_{H}3" cuando se
utiliza en la presente invención se refiere a aquellos residuos de
aminoácidos en la región Fc de una molécula de inmunoglobulina que
interacciona con la Proteína A. En realizaciones preferidas, la
región C_{H}2/C_{H}3 comprende una región C_{H}2 intacta
seguida de una región C_{H}3 intacta, y lo más preferible,
comprende una región Fc de una inmunoglobulina. Entre los ejemplos
de proteínas que contienen la región C_{H}2/C_{H}3 se incluyen
anticuerpos, inmunoadhesinas y proteínas de fusión que comprenden
una proteína de interés fusionada a, o conjugada con, una región
C_{H}2/C_{H}3.
La "etapa de lavado intermedia" es una
etapa realizada después de cargar la proteína de interés en la fase
sólida y de adsorberse a la Proteína A, pero antes de que la
proteína A se recupere de la columna. La etapa de lavado intermedia
sirve para eliminar los contaminantes unidos no específicamente a la
fase sólida, anticuerpo y/o Proteína A, sin eluir
significativamente la proteína de interés o la proteína A de la fase
sólida. En la etapa de lavado intermedia, la fase sólida se lava
con el "tampón de lavado intermedio" deseado (por ejemplo, el
tampón de lavado intermedio se pasa a través de la columna de
Proteína A, en la que la fase sólida es una columna).
Un "tampón" es una solución tamponada que
resiste cambios en el pH mediante la acción de sus componentes
conjugados ácido-base.
Un "tampón de equilibrio" en la presente
invención es aquel que se usa para preparar la fase sólida (con
Proteína A inmovilizada) para cargar la proteína de interés. El
tampón de equilibrio es preferiblemente isotónico y habitualmente
tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente
8. El tampón de equilibrio del ejemplo era 25 mM Tris, 25 mM NaCl,
5 mM EDTA, pH 7,1.
El "tampón de carga" es aquel que se
utiliza para cargar la mezcla de la proteína que contiene la región
C_{H}2/C_{H}3 y un contaminante o contaminantes sobre la fase
sólida a la que se inmoviliza la Proteína A. A menudo, los tampones
de equilibrio y carga son los mismos.
El "tampón de elución" se utiliza para
eluir la proteína que contiene la región C_{H}2/C_{H}3 de la
Proteína A inmovilizada. Preferiblemente, el tampón de elución tiene
un pH bajo y, por tanto, rompe las interacciones entre la Proteína
A y la proteína de interés. Preferiblemente, el tampón de elución de
pH bajo tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2 a
aproximadamente 5, lo más preferible en el intervalo de
aproximadamente 3 a aproximadamente 4. Entre los ejemplos de
tampones que controlarán el pH en este intervalo se incluyen
tampones fosfato, acetato, citrato y amonio, así como combinaciones
de los mismos. Entre estos los tampones preferidos son los tampones
citrato y acetato, lo más preferible tampones de citrato sódico o
acetato sódico. Entre otros tampones de elución que se contemplan se
incluyen tampones de pH elevado (por ejemplo, aquellos que tienen
un pH de 9 o más) o tampones que comprenden un compuesto o
composición, tal como MgCl_{2} (2 mM) para eluir la proteína de
interés.
El "tampón de lavado intermedio" es el
tampón utilizado para eliminar el contaminante o contaminantes,
tales como CHOP, de la Proteína A inmovilizada sin eliminar
cantidades significativas de la proteína de interés unida a la
Proteína A. El tampón de lavado intermedio comprende preferiblemente
(a) sal y detergente (por ejemplo, polisorbato); (b) sal y
disolvente (por ejemplo, hexilenglicol); (c) sal de concentración
elevada (por ejemplo, tampón Tris de molaridad elevada); o (d) sal
y polímero (por ejemplo, PEG).
Una "sal" es un compuesto formado por la
interacción de un ácido y una base. La sal preferida en la presente
invención es acetato (por ejemplo, acetato sódico), citrato (por
ejemplo, citrato sódico), cloruro (por ejemplo, cloruro sódico),
sulfato (por ejemplo, sulfato sódico) o una sal potásica.
Tal como se utiliza en la presente invención,
"disolvente" se refiere a una sustancia líquida capaz de
disolver o dispersar una o más de otras sustancias para proporcionar
una solución. El disolvente preferido es un disolvente orgánico, no
polar, tal como etanol, metanol, isopropanol, acetonitrilo,
hexilenglicol, propilenglicol y 2,2-tiodiglicol.
El término "detergente" se refiere a
tensioactivos no iónicos, tales como polisorbatos (por ejemplo,
polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (poloxámero 188(); Tritón;
dodecilsulfato sódico (SDS); laurel sulfato sódico; octil glicósido
sódico; lauril-, miristil-, linoleil- o
estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-,
linoleil- o estearil-sarcosina; lauril-, miristil-,
o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-,
linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o
isostearamidopropil-betaína (por ejemplo,
lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o
isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil
sódico, o metil oleil taurato disódico; y la serie MONAQUAT^{TM}
(Mona industries, Inc, Paterson, Nueva Jersey). El detergente
preferido es un polisorbato, tal como polisorbato 20 (TWEEN 20®) o
polisorbato 80 (TWEEN 80®).
Un "polímero" en la presente invención es
una molécula formado mediante un enlace covalente de dos o más
monómeros, en el que los monómeros no son residuos de aminoácidos.
Entre los ejemplos de polímeros se incluyen polietil glicol,
polipropil glicol y copolímeros de etilenglicol y propilenglicol
(por ejemplo, Pluronics, PF68 etc). El polímero preferido es
polietilenglicol (PEG), por ejemplo, PEG 400 y PEG 8000.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales
(incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa),
anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por
ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos,
siempre y cuando mantengan, o se modifiquen para comprender, una
región C_{H}2/C_{H}3 tal como se define en la presente
invención.
"Fragmentos de anticuerpos" comprenden una
parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región
de unión a antígeno o región variable de la misma. Ente los ejemplos
de fragmentos de anticuerpos se incluyen fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2} y Fv; moléculas de anticuerpo de cadena única;
diabodies, anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespecíficos
formados de fragmentos de anticuerpos.
El término "anticuerpo monoclonal" tal como
se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo
obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden
la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones
naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los
anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose
contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las
preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que
incluyen habitualmente diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se
dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha
obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente
homogénea y no debe interpretarse que se requiere la producción del
anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo,
los anticuerpos monoclonales que se utilizarán según la presente
invención pueden prepararse por el procedimiento del hibridoma
descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495
[1975], o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN
recombinante (véase por ejemplo la patente EEUU No. 4.816.567). Los
"anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de
bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas
descritas en Clackson et al., Nature,
352:624-628 [1991] y Marks et al., J. Mol.
Biol., 222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales descritos en la
presente invención incluyen específicamente anticuerpos
(inmunoglobulinas) "quiméricos" en los cuales una parte de la
cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular
o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular,
mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga
a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra
especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así
como fragmentos de dichos anticuerpos, mientras muestren la
actividad biológica deseada (patente US No. 4.816.567; y Morrison
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6851-6855 [1984]).
El término "región hipervariable" cuando se
utiliza en la presente invención se refiere a los residuos de
aminoácidos de un anticuerpo que son sensibles a la unión a
antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos
de una "región determinante de complementariedad" o "CDR"
(es decir, residuos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variables de la cadena ligera y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service,
National institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los
residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2), y
91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera
y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada;
Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
Los residuos "armazón" o "FR" son aquellos residuos de
dominio variable diferentes de los residuos de la región
hipervariable tal como se define en la presente invención.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, múridos) son anticuerpos quiméricos que
contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no
humana. Por lo general, los anticuerpos humanizados son
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los
residuos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por
residuos de la región hipervariable de una especie no humana
(anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no
humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.
En algunos casos, los residuos de la región armazón Fv (FR) de la
inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos
correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden
comprender residuos que no se encuentran ni el anticuerpo receptor
ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para
refinar mejor el rendimiento del anticuerpo. En general, el
anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente como mínimo uno,
y habitualmente dos, dominios variables en los cuales todos o
sustancialmente todos los bucles hipervariables correspondientes a
los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas
las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana.
El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente por lo
menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc),
habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles,
véase Jones et al., Nature, 321:522-525
(1986); Reichmann et al., Nature, 332:
323-329 [1988]; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2: 593-596 (1992).
Tal como se utiliza en la presente invención, el
término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo anticuerpo
que combinan el "dominio de unión" de una proteína
"adhesina" heteróloga (por ejemplo, un receptor, ligando o
enzima) con las funciones efectoras de un dominio constante de
inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden
una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la
especificidad de unión deseada diferente del sitio de
reconocimiento y unión a antígeno (sitio de combinación a antígeno)
de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia
del dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio
constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina deriva
preferiblemente de las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 o
\gamma4, ya que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones
se pueden purificar mediante cromatografía de Proteína A (Lindmark
et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13
(1983)).
El término "dominio de unión a ligando" tal
como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier
receptor nativo de la superficie celular o cualquier región o
derivado de la misma que mantiene por lo menos una unión de ligando
cualitativa de un receptor nativo correspondiente. En una
realización específica, el receptor es de un polipéptido de la
superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo
a un miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulinas. Otros
receptores, que no son miembros de la familia de supergenes de
inmunoglobulinas pero, sin embargo, están cubiertos por esta
definición, son receptores para citoquinas y, en particular,
receptores concretos con actividad tirosina quinasa (receptor
tirosina quinasa), miembros de las superfamilias del receptor de
hematopoyetina y factor de crecimiento nervioso, y moléculas de
adhesión celular, por ejemplo selectinas (E. L y P).
El término "dominio de unión a receptor" se
utiliza para designar cualquier ligando nativo para un receptor,
incluyendo moléculas de adhesión celular, o cualquier región o
derivado de dicho ligando nativo que mantiene por lo menos la
capacidad de unión cualitativa al receptor de un ligando nativo
correspondiente. Esta definición, incluye específicamente, entre
otras, secuencias de unión de ligandos para los receptores
mencionados anteriormente.
Una "quimera
anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula
que combina por lo menos un dominio de unión de un anticuerpo (tal
como se define en la presente invención) con por lo menos una
inmunoadhesina (tal como se define en esta solicitud). Algunos
ejemplos de quimeras anticuerpo-inmunoadhesina son
las quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas en
Berg et al., PNAs (USA) 88:4723-4727 (1991) y
Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 (1994).
"Trastuzumab" o "HERCEPTIN®" es un
anticuerpo anti-HER2 humanizado que comprende la
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEC ID No. 1 y
la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEC ID No. 2 o
variantes de las secuencias de aminoácidos de las mismas que
mantienen la capacidad de unirse a HER2 e inhibir el crecimiento de
células tumorales que sobreexpresan HER2 (Véase Patente de Estados
Unidades 5.677.171).
El proceso de la presente invención implica la
purificación de una proteína que contiene la región
C_{H}2/C_{H}3 de contaminantes mediante la cromatografía de
Proteína A. En realizaciones preferidas, la proteína a purificar
utilizando la cromatografía de Proteína A es un anticuerpo, una
inmunoadhesina o una proteína fusionada o conjugada con una región
C_{H}2/C_{H}3. A continuación, se describirán técnicas para
generar dichas moléculas.
La proteína preferida a purificar según la
presente invención es un anticuerpo. Los anticuerpos dentro del
alcance de la presente invención incluyen, pero sin limitación:
anticuerpos anti-HER2 que incluyen Trastuzumab
(HERCEP-TIN®) (Carter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992), Patente de
Estados Unidos No. 5.725.856); anticuerpos
anti-CD20, tales como anti-CD20
quimérico "C2B8" como en la Patente de Estados Unidos No.
5.736.137 (RITUXAN®), una variante quimérica o humanizada del
anticuerpo 2H7 como en la Patente de Estados Unidos No. 5.721.108,
o Tositumomab (BEXXAR®); anti-IL8 (St John et
al., Chest, 103: 932 (1993), y la Publicación Internacional No.
WO 95/23865); anticuerpos anti-VEGF que incluyen
anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o maduros por
afinidad, tales como el anticuerpo anti-VEGF
humanizado huA4.6.1 AVASTIN® (Kim et al., Growth Factors, 7:
53-64 (1992), Publicación Internacional No. WO
96/30046, y WO 98/45331, publicada el 15 de octubre de 1998);
anticuerpos anti-PSCA (WO01/40309), anticuerpos
anti-CD40, que incluyen S2C6 y variantes
humanizadas de los mismos (WO00/75348); anti-CD11a
(Patente de Estados Unidos No. 5.622.700, WO 98/23761, Steppe et
al., Transplant Intl. 4: 3-7 (1991), y Hourmant
et al., Transplantation 58: 377-380 (1994));
anti-IgE (Presta et al., J. Immunol. 151:
2623-2632 (1993), y la Publicación Internacional No.
WO 95/19181); anti-CD18 (Patente de Estados Unidos
No. 5.622.700, concedida el 22 de abril de 1997, o como en WO
97/26912, publicada el 31 de Julio de 1997);
anti-IgE (que incluye E25, E26 y E27; Patente de
Estados Unidos No. 5.714.338, concedida el 3 de febrero de 1998 o
la Patente de Estados Unidos No. 5,091,313, concedida el 25 de
febrero de 1992, WO 93/04173 publicada el 4 de marzo de 1993, o la
Solicitud Internacional No. PCT/US98/13410 solicitada el 30 de
junio de 1998, la Patente de Estados Unidos No. 5.714.338);
anticuerpo anti- receptor Apo-2 (WO 98/51793
publicada el 19 de noviembre de 1998); anticuerpos
anti-TNF-\alpha que incluyen cA2
(REMICADE®), CDP571 MAK-195 (Véase, Patente de
Estados Unidos No. 5.672.347 concedida el 30 de septiembre de 1997,
Lorenz et al. J. Immunol. 156 (4): 1646-1653
(1996), y Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23 (9):
1461-1469 (1995)); anti-Factor
Tisular (TF) (Patente Europea No. 0 420 937 B1 concedida el 9 de
noviembre de 1994); integrina \alpha4\beta7
anti-humana (WO 98/06248 publicada el 19 de febrero
de 1998); anti-EGFR (anticuerpo 225 quimerizado o
humanizado como en WO 96/40210 publicada el 19 de diciembre de
1996); anticuerpos anti-CD3, tales como OKT3
(Patente de Estados Unidos No. 4.515.893 concedida el 7 de mayo de
1985); anticuerpos anti-CD25 o
anti-tac, tales como CHI-621
(SIMULECT®) y (ZENAPAX®) (Véase la Patente de Estados Unidos No.
5.693.762 concedida el 2 de diciembre de 1997); anticuerpos
anti-CD4, tales como el anticuerpo
cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum 39 (1):
52-56 (1996)); anticuerpos
anti-CD52, tales como CAMPATH-1 H
(Riechmann et al. Nature 332: 323-337
(1988)); anticuerpos anti-receptor Fc, tales como el
anticuerpo M22 dirigido contra FcyRl como en Graziano et al.
J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 (1995); anticuerpos
anti-antígeno carcinoembriónico (CEA), tales como
hMN-14 (Sharkey et al. Cancer Res. 55
(23Suppl): 5935s-5945s (1995); anticuerpos dirigidos
contra células epiteliales de mama que incluyen
huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani
et al. Cancer Res. 55 (23): 5852s-5856s
(1995); y Richman et al. Cancer Res. 55 (23 Supp):
5916s-5920s (1995)); anticuerpos que se unen a
células de carcinoma de colon, tales como C242 (Litton et
al. Eur J. Immunol. 26 (1): 1-9 (1996));
anticuerpos anti-CD38, por ejemplo, AT 13/5 (Ellis
et al. J. Immunol. 155 (2): 925-937 (1995));
anticuerpos anti-CD33, tales como Hu M195 (Jurcic
et al. Cancer Res 55 (23 Suppl): 5908s-5910s
(1995) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos
anti-CD22, tales como LL2 o LinfoCide (Juweid et
al. Cancer Res 55 (23 Suppl): 5899s-5907s
(1995)); anticuerpos anti-EpCAM, tales como
17-1A (PANOREX®): anticuerpos
anti-GpIIb/IIIa, tales como abciximab o c7E3 Fab
(REPRO®); anticuerpos anti-RSV, tales como
MEDI-493 (SYNAGIS®); anticuerpos
anti-CMV, tales como PROTOVIR®; anticuerpos
anti-VIH, tales como PRO542; anticuerpos
anti-hepatitis, tales como el anticuerpo
anti-Hep B OSTAVIR®, anticuerpo
anti-CA 125 OvaRex; anticuerpos del epítopo GD3
anti-idiotípico BEC2; anticuerpo
anti-\alphav\beta3 VITAXIN®; anticuerpos de
carcinoma de células renales anti-humano, tales como
ch-G250; ING-1; anticuerpos
17-1A anti-humano (3622W94);
anticuerpo de tumor colorrectal anti-humano (A33);
anticuerpos de melanoma anti-humano R24 dirigido
contra el gangliósido GD3; anti-carcinoma de células
escamosas humanas (SF-25); y anticuerpos
anti-antígenos de leucocitos humanos (HLA), tales
como ID10 y el anticuerpo DR anti-HLA Oncolym
(Lym-1). Los antígenos Diana preferidos para el
anticuerpo de la presente invención son: HER2 receptor, VEGF, IgE,
CD20, CD11a, y CD40.
A parte de los anticuerpos identificados
específicamente anteriormente, el experto en la materia podría
generar anticuerpos dirigidos contra un antígeno de interés, por
ejemplo, utilizando las técnicas descritas a continuación.
El anticuerpo de la presente invención está
dirigido contra un antígeno de interés. Preferiblemente, el
antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la
administración del anticuerpo a un mamífero que padece de una
enfermedad o trastorno puede dar lugar a un beneficio terapéutico en
dicho mamífero. Sin embargo, se contemplan los anticuerpos
dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos
de glicolípidos asociados a tumores; véase la Patente de Estados
Unidos 5.091.178). Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser
una molécula transmembrana (por ejemplo, receptor) o ligando, tal
como un factor de crecimiento. Los antígenos de ejemplo incluyen
aquellas proteínas descritas en la sección (3) siguiente. Las dianas
moleculares de ejemplo para anticuerpos comprendidas en la presente
invención incluyen proteínas CD tales como la CD3, la CD4, la CD8,
la CD19, la CD20, la CD22 y la CD34; miembros de la familia del
receptor ErbB tales como el receptor EGF, el receptor HER2, HER3 o
HER4; moléculas de adhesión celular tales como la
LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4,
ICAM-1, VCAM y la integrina \alphav/\beta3
incluyendo las subunidades \alpha o \beta de la misma (por
ejemplo, los anticuerpos anti-CD11a,
anti-CD18 o anti-CD11b); factores de
crecimientos tales como VEGF; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; el
receptor de flk2/flt3; el receptor de obesidad (OB); el receptor
mpI; CTLA-4; la proteína C, o cualquiera de
los otros antígenos mencionados en la presente invención.
Los antígenos solubles o fragmentos de los
mismos, opcionalmente conjugados a otras moléculas, se pueden
utilizar como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las
moléculas transmembrana, tales como receptores, se pueden utilizar
fragmentos de éstos (por ejemplo, el dominio extracelular de un
receptor) como inmunógeno. Alternativamente, las células que
expresan la molécula transmembrana se pueden utilizar como
inmunógeno. Dichas células se pueden derivar a partir de una fuente
natural (por ejemplo, líneas de células cancerígenas) o pueden ser
células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para
expresar la molécula transmembrana.
Otros antígenos y formas de los mismos útiles
para la preparación de anticuerpos serán evidentes para los expertos
en la materia.
Los anticuerpos policlonales se desarrollan
preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones
subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y
un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno a una proteína
que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, la
hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero,
tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un
agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de
maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los
residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a
través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico,
SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{2} son grupos alquilo
diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antígeno,
conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación, por
ejemplo de 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para
conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante
completo de Freund y la inyección de la solución de manera
intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales son
reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de antígeno o
conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección
subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, los
animales sangran y se analiza el suero para la concentración de
anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que la concentración
es constante. Preferiblemente, los animales se refuerzan con el
conjugado del mismo antígeno, pero se conjugan a una proteína
diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente.
Los conjugados también se pueden producir en cultivos de células
recombinantes como fusiones de proteínas. Además, se utilizan de
manera adecuada agentes de agregación, tales como alumbre para
aumentar la respuesta inmune.
Los anticuerpos monoclonales se pueden fabricar
utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez
por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975) o se pueden
fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante (Patente de
Estados Unidos No. 4.816.567).
En el procedimiento del hibridoma, un ratón u
otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono macaco,
se inmuniza tal como se ha descrito anteriormente para obtener
linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que
se unirán específicamente a la proteína utilizada para la
inmunización. De modo alternativo, los linfocitos se pueden
inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se
fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión
adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de
hibridoma Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
Academia Press, (1986), páginas 59-103).
Las células de hibridoma preparadas de esta
manera se cultivan y desarrollan en un medio de cultivo adecuado
que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa
(RGPRI o RPRI), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá
habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT),
cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.
\newpage
Las células de mieloma preferidas son aquéllas
que se fusionan de manera eficaz, inducen un nivel de producción
elevado estable de anticuerpo por las células productoras de
anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como
medio HAT. Entre éstas, las líneas de células de mieloma preferidas
son líneas de mieloma múrido, tales como las derivadas de tumores
de ratón MOPC-21 y MPC-11 que se
pueden obtener del Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, California Estados Unidos y las células SP-2
o X-63-Ag8-653 que
se pueden obtener de la American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, Estados Unidos. Las líneas celulares de
mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano
también se han descrito para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur
et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, páginas, 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,
Nueva York, (1987)).
Se analiza el medio de cultivo en que las
células de hibridoma crecen para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la
especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por
las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o
mediante un ensayo de unión in vitro, tal como
radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima
(ELISA).
Después de identificar las células de hibridoma
que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o
actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, páginas 59-103 (Academia Press
1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se
incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o
RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se
pueden desarrollar in vivo como tumores de ascitis en un
animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido
ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita,
eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Preferiblemente, se utiliza el procedimiento de la cromatografía de
Proteína A descrita en la presente invención
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
se se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos
monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente
preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en
vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células
huésped, tales como células E. coli, células COS de simio,
células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no
producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la
síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped
recombinantes.
El ADN también puede modificarse, por ejemplo,
mediante la sustitución de la secuencia codificante para los
dominios constantes de la cadena pesada y ligera en lugar de las
secuencias de murino homólogas (Patente de Estados Unidos No.
4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
6851 (1984)), o mediante unión covalente a la secuencia codificante
de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante
para un polipéptido que no es inmunoglobulina.
Habitualmente, dichos polipéptidos que no son
inmunoglobulinas están sustituidos por los dominios constantes de
un anticuerpo, o están sustituidos por los dominios variables de un
sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un
anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación
a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de
combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno
diferente.
En una realización adicional, los anticuerpos
monoclonales se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en
fagos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty
et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson
et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks
et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)
describen el aislamiento de anticuerpos múridos y humanos,
respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones
posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de
afinidad elevada (rango de nM) mediante la recombinación de cadena
(Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783
(1992)), así como una infección combinatoria y recombinación in
vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy
grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:
2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son
alternativas viables a las técnicas de hibridoma tradicionales para
el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
Un anticuerpo humanizado tiene uno o más
residuos de aminoácido introducidos en el mismo de un origen que es
no humano. Estos residuos de aminoácido no humanos se indican
frecuentemente como residuos "importados", que se adquieren
habitualmente de un dominio variable "importado". La
humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el
procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al.,
Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen
et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)),
mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por
las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por
consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que
sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido
sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no
humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son
habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de
CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos
de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de dominios variables humanos, tanto
ligeros como pesados, a utilizar en la fabricación de anticuerpos
humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según
el procedimiento denominado "mejor ajuste", la secuencia del
dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda
la biblioteca de secuencias humanas de dominio variable conocidas.
La secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta
entonces como la FR humana para el anticuerpo humanizado (Sims et
al., J. Immunol., 151: 2296 (1993)). Otro procedimiento utiliza
una FR particular derivada de la secuencia de consenso de todos los
anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o
pesadas. La misma FR se puede utilizar para varios anticuerpos
humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623
(1993)).
Es importante además que los anticuerpos se
humanicen manteniendo la afinidad elevada por el antígeno y otras
propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo,
según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se
preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias
parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando
modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas.
Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas estás disponibles
habitualmente y son familiares para los expertos en la materia.
Existen disponibles programas informáticos que ilustran y muestran
probables estructuras conformacionales tridimensionales de
secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. El examen
de estas observaciones permite el análisis del probable papel de
los residuos en el funcionamiento de la secuencia de
inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que
influencian en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para
unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y
combinar residuos FR a partir de las secuencias del receptor e
importadas, de manera que se consigue la característica deseada del
anticuerpo, tal como la mayor afinidad por el antígeno o antígenos
diana. En general, los residuos de CDR están directamente y más
sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión a
antígeno.
De modo alternativo, ahora es posible producir
animales transgénicos no humanos (por ejemplo, ratones), que son
capaces, después de inmunización, de producir un repertorio completo
de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de
inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la
supresión homocigótica del gen de la región de unión (J_{H}) de
la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes en
la línea germinal da lugar a la inhibición completa de la producción
de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de
inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones
mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de
anticuerpos humanos después de la estimulación de los antígenos.
Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:
255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in
Immuno., 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258
(1992). Los anticuerpos también puede derivar de bibliotecas de
expresión de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381
(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:
591-597 (1991); Vaughan et al., Nature
Biotech 14: 309 (1996)).
Se han desarrollado varias técnicas para la
producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos
fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de
anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al.,
Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:
107-117 (19921 y Brennan et al., Science
229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir
ahora directamente mediante células huésped recombinantes. Por
ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las
bibliotecas de anticuerpos en fagos descritas anteriormente. De
modo alternativo, los fragmentos Fab'-SH se pueden
recuperar directamente de E. coli y se pueden acoplar
químicamente para formar fragmentos de F(ab')_{2} (Carter
et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)).
Según otra estrategia, los fragmentos F(ab')_{2} se pueden
aislar directamente de un cultivo de células huésped recombinantes.
Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán
evidentes para el técnico habitual. En otras realizaciones, el
anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de cadena única
(scFv). Véase WO 93/16185.
Los anticuerpos multiespecíficos tienen
especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes.
Aunque dichas moléculas sólo se unirán normalmente a dos antígenos
(es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), anticuerpos con
especificidades adicionales, tales como anticuerpos triespecíficos,
están comprendidos por esta expresión cuando se utilizan en la
presente invención.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción habitual
de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la
coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas tienen especificidades
diferentes (Millstein et al., Nature, 305:
537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de
cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas
diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de
cromatografía de afinidad, es bastante incómoda, y los rendimientos
del producto son bajos. En WO 93/08829, y en Traunecker et
al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) se describen
procedimientos similares.
Según otra estrategia descrita en WO 96/27011,
se puede diseñar la interfase entre una pareja de moléculas de
anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se
recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase
preferida comprende por lo menos una parte del dominio de C_{H}3
de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o
más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la
primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales
mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades"
compensatorias de tamaño similar o idéntico a la cadena o cadenas
laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula
de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes
de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del
heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como
homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen
anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno
de los anticuerpos en el heteroconjugado puede estar acoplado a
avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto,
por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no
deseadas (Patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el
tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/300373, y EP
03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar
utilizando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los
agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y
se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980, junto
con una serie de técnicas de reticulación.
Las técnicas para generar anticuerpos
biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han
descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos
biespecíficos se pueden preparar utilizando uniones químicas.
Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un
procedimiento en el que los anticuerpos intactos se dividen
proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos
fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de
ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y
evitar la formación de disulfuro intermolecular. A continuación,
los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de
tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados de
Fab'-TNB se reconvierte al Fab'-tiol
mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una
cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB
para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos
biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la
inmovilización selectiva de enzimas.
El progreso reciente ha facilitado la
recuperación directa de fragmentos de Fab'-SH de
E. coli, los cuales se pueden acoplar químicamente para
formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp.
Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de
una molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado
F(ab')_{2}. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado
de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido
in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El
anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse
a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T
humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de
linfocitos citotóxicos humanos contra tumores de mama humana
dianas.
Se han descrito también varias técnicas para
fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se
han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):
1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de
leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab'
de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los
homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para
formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los
heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede
utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La
tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha
proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de
anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio
variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable
de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado
corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la
misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de
un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y
V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios
de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para
fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la
utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase Gruber
et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Alternativamente, los
anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" tal como se ha
descrito en Zapata et al. Protein Eng. 8 (10):
1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos
comprenden una pareja de segmentos Fd en tándem
(V_{H}-C_{H}1-V_{H}C_{H}1)
que forman una pareja de regiones de unión a antígeno. Los
anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
El diseño de inmunoadhesina más simple y
sencillo combina el dominio o dominios de unión de la adhesina (por
ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con las
regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina.
Normalmente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente
invención, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión de la
adhesina se fusionará por el extremo C terminal al ácido nucleico
que codifica el extremo N terminal de una secuencia del dominio
constante de inmunoglobulina, aunque las fusiones
N-terminales también son posibles.
Habitualmente, en dichas fusiones el polipéptido
quimérico codificado mantendrá por lo menos los dominios bisagra,
dominios C_{H}2 y C_{H}3 funcionalmente activos de la región
constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones
también se realizan al extremo C terminal de la parte Fc de una
región constante, o al N-terminal inmediato al
C_{H}1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la
cadena ligera. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no
es crítico; se conocen bien sitios concretos y se pueden
seleccionar con el fin de optimizar la actividad biológica, la
secreción, o características de unión de la inmunoadhesina.
En una realización preferida, la secuencia de
adhesina se fusiona al extremo N-terminal del
dominio Fc de la inmunoglobulina G_{1} (IgG_{1}). Es posible
fusionar la región constante de cadena pesada completa con la
secuencia de adhesina. Sin embargo, más preferiblemente, en la
fusión se utiliza una secuencia que empieza en la región bisagra
justo corriente arriba del sitio de división por papaína que define
químicamente Fc de IgG (es decir, el residuo 216, tomando como el
primer residuo de la región constante de cadena pesada el 114), o
sitios análogos de otras inmunoglobulinas. En una realización
particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos de la
adhesina se fusiona a (a) la región bisagra y C_{H}2 y C_{H}3 o
(b) los dominios C_{H}1, bisagra, C_{H}2 y C_{H}3, de una
cadena pesada de IgG.
Para inmunoadhesinas biespecíficas, las
inmunoadhesinas se ensamblan como multímeros, y particularmente
como heterodímeros heterotetrámeros. Generalmente, estas
inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias
conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la
forma en la que existen IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro
cadenas se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular más
elevado; IgM existe generalmente como un pentámero de cuatro
unidades básicas que se mantienen juntas mediante enlaces disulfuro.
La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden
existir en forma multimérica en el suero. En el caso del multímero,
cada una de las cuatro unidades puede ser la misma o diferente.
A continuación, se muestran esquemáticamente
varias inmunoadhesinas ensambladas de ejemplo dentro del alcance de
la presente invención:
- (a)
- AC_{L}-AC_{L};
- (b)
- AC_{H}-(AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H});
- (c)
- AC_{L}AC_{H}-(AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}V_{H}C_{H})
- (d)
- AC_{L}-V_{H}C_{H}-(AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H});
- (e)
- V_{L}C_{L}-AC_{H}-(AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}); y
- (f)
- (A-Y)_{n}-(V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H})_{2},
en las que cada A representa secuencias de
aminoácidos de adhesina iguales o diferentes;
V_{L} es un dominio variable de cadena ligera
de inmunoglobulina;
V_{H} es un dominio variable de cadena pesada
de inmunoglobulina;
C_{L} es un dominio constante de cadena ligera
de inmunoglobulina;
C_{H} es un dominio constante de cadena pesada
de inmunoglobulina;
n es un número entero superior a 1;
Y designa el residuo de un agente de
reticulación covalente.
Por brevedad, las estructuras anteriores sólo
muestran características claves; no indican los dominios de unión
(J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los
enlaces disulfuro. Sin embargo, cuando se necesiten dichos dominios
para la actividad de unión, se interpretará que están presentes en
las posiciones habituales que ocupan en las moléculas de
inmunoglobulina.
Alternativamente, las secuencias de adhesina se
pueden insertar entre las secuencias de cadena pesada y cadena
ligera de inmunoglobulina, de manera que se obtiene una
inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En esta
realización, las secuencias de adhesina se fusionan al extremo 3' de
una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una
inmunoglobulina, entre el dominio bisagra y el dominio C_{H}2, o
entre los dominios C_{H}2 y C_{H}3_{.} Se han descrito
construcciones similares por Hoogenboom et al., Mol. Immunol.
28: 1027-1037 (1991).
Aunque la presencia de una cadena ligera de
inmunoglobulina no es necesaria en las inmunoadhesinas de la
presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina podría
estar presente asociada covalentemente a un polipéptido de fusión
de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina, o
directamente fusionada a la adhesina. En el primer caso, el ADN que
codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se coexpresa
habitualmente con el ADN que codifica la proteína de fusión
adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la
secreción, el híbrido de cadena pesada y cadena ligera se asociará
covalentemente para proporcionar una estructura de tipo
inmunoglobulina que comprende dos parejas de cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidas por
enlaces disulfuro. Lo procedimientos adecuados para la preparación
de dichas estructuras se describen, por ejemplo, en la Patente de
Estados Unidos No. 4.816.567 concedida el 28 de marzo de 1989.
Las inmunoadhesinas se construyen de manera más
conveniente mediante la fusión de la secuencia de ADNc que codifica
la parte de adhesina en el marco de lectura a una secuencia de ADNc
de inmunoglobulina. Sin embargo, también se puede utilizar la
fusión a fragmentos genómicos de inmunoglobulina (véase, por
ejemplo, Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313
(1990); y Stamenkovic et al., Cell 66:
1133-1144 (1991)). El último tipo de fusión
requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la
expresión. Los ADNcs que codifican las regiones constantes de
cadena pesada de IgG se pueden aislar en base a secuencias
publicadas de bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos de bazo y
sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNcs que codifican la
"adhesina" y las partes de inmunoglobulina de la inmunoadhesina
se insertan en tándem en un vector plasmídico que dirige la
expresión eficaz en las células huésped elegidas.
En otras realizaciones, la proteína a purificar
es aquella que se fusiona o se conjuga con una región
C_{H}2_{/}C_{H}3. Dichas proteínas de fusión se pueden
producir para incrementar la vida media de la proteína en el suero
y/o para facilitar la purificación de la proteína mediante
cromatografía de Proteína A.
Entre los ejemplos de proteínas biológicamente
importantes que se pueden conjugar de esta manera se incluyen
renina; una hormona del crecimiento, que incluye hormona del
crecimiento humano y hormona del crecimiento bovino; factor de
liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroide;
hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena A de
insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora
de folículos; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores
de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular,
y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes, tales como
Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un
activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o
activador de plasminógeno de tejido similar (t-PA);
bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor
alfa y beta de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (regulador de
la activación de las células T normalmente expresadas y
secretadas); proteína inflamatoria de macrófagos humana
(MIP-1-alfa); una albúmina de
suero, tal como albúmina de suero humana; sustancia inhibidora
Muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina;
prorrelaxina; péptido asociado con gonadotropina de ratón; una
proteína microbiana, tal como betal-lactamasa;
DNasa; IgE; un antígeno asociado con linfocitos T citotóxicos
(CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor
de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas
o factores de crecimiento; Proteína A o D; factores reumatoides; un
factor neurotrópico, tal como factor neurotrópico derivado de hueso
(BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ó 6
(NT-3, NT-4, NT-5 o
NT-6), o un factor del crecimiento nervioso, tal
como NGF-\beta; factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como
aFGF y bFGf; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de
crecimiento transformante (TGF), tal como TGF-alfa
y TGF-beta, que incluye
TGF-\beta1, TGF-\beta2,
TGF-\beta3, TGF-\beta4 o
TGF-\beta5; factor de crecimiento I y II de tipo
insulina (IGF-I e IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro), proteína de unión del factor de
crecimiento de tipo insulina; proteínas CD, tales como CD3, CD4,
CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos;
inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un
interferón, tal como interferón-alfa,
interferón-beta e interferón-gamma;
factores estimuladores de colonias (CSFs), por ejemplo,
M-CSf, GM-CSF y
G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo,
IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa;
receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor
acelerante de la degradación; antígeno viral, tal como, por
ejemplo, una parte de la cubierta del SIDA; proteínas de transporte;
receptores de conducción; adresinas; proteínas reguladoras;
integrinas, tales como CD11a, Cd11b, CD11c, CD18, una ICAM,
VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado con tumores, tal
como receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los
polipéptidos indicados anteriormente.
La proteína a purificar utilizando el
procedimiento descrito en la presente invención se produce
generalmente utilizando técnicas recombinantes. Se describen
procedimientos para producir proteínas recombinantes, por ejemplo,
en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.534.615 y 4.816.567,
incorporadas específicamente en la presente invención por
referencia. En realizaciones preferentes, la proteína de interés se
produce en una célula CHO (ver, por ejemplo WO 94/11026).
Anteriormente se han descrito ejemplos de proteínas que pueden
purificarse utilizando el proceso descrito en la presente
invención.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, se
puede producir la proteína intracelularmente, en el espacio
periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si la proteína
se produce intracelularmente, como una primera etapa, se eliminan
los residuos particulados, ya sean células huésped o fragmentos
lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración.
Cuando la proteína se secreta en el medio, pueden separarse las
células huésped recombinantes del medio de cultivo celular mediante
filtración en flujo tangencial, por ejemplo.
La Proteína A inmovilizada en una fase sólida se
utiliza para purificar la proteína que contiene la región
C_{H}2/C_{H}3. Preferiblemente la fase sólida es una columna que
comprende una superficie de vidrio, sílice, agarosa o poliestireno
para inmovilizar la Proteína A. Preferiblemente, la fase sólida es
una columna de cristal de poro controlado o una columna de ácido
silícico. A veces, se ha cubierto la columna con un reactivo, tal
como el glicerol, en un intento de evitar la adherencia no
específica a la columna. La columna PROSEP A^{TM}, disponible
comercialmente en Bioprocessing Limited, es un ejemplo de una
columna de cristal de poro controlado de Proteína A que está
cubierta con glicerol. Otros ejemplos de columnas contempladas en la
presente invención incluyen la columna POROS 50 A^{TM}
(poliestireno) o la columna de Proteína A SEPHAROSE FAST FLOW^{TM}
(agarosa).
La fase sólida para la cromatografía de Proteína
A se equilibra con un tampón adecuado. Por ejemplo, el tampón de
equilibrado puede ser Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1.
Se carga la preparación contaminada derivada de
las células huésped recombinantes en la fase sólida equilibrada
utilizando un tampón de carga que puede ser el mismo que el tampón
de equilibrado. A medida que la preparación contaminada fluye a
través de la fase sólida, la proteína se adsorbe a la Proteína A
inmovilizada y otros contaminantes (como las Proteínas de Ovario de
Hámster Chino, CHOP, cuando la proteína es producida en una célula
CHO) se pueden unir de manera no específica a la fase sólida.
La siguiente etapa realizada secuencialmente
comprende eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida, el
anticuerpo y/o la Proteína A, mediante el lavado de la fase sólida
en una etapa de lavado intermedia. Tras la carga, puede
equilibrarse la fase sólida con tampón de equilibrado antes de
empezar la etapa de lavado intermedia.
El tampón de lavado intermedio puede comprender
sal y un compuesto adicional, donde el compuesto adicional es (a)
detergente (preferiblemente polisorbato, por ejemplo polisorbato 20
o polisorbato 80); (b) disolvente (preferiblemente hexilenglicol);
y (c) polímero (preferiblemente PEG).
La sal utilizada puede seleccionarse en base a
la proteína de interés, pero preferiblemente es acetato (por
ejemplo acetato sódico), especialmente cuando el anticuerpo es un
anticuerpo anti-HER2, tal como Trastuzumab; o
citrato (por ejemplo citrato sódico), especialmente cuando el
anticuerpo es un anticuerpo anti-IgE tal como
E26.
Las cantidades de la sal y el compuesto
adicional en la composición son tales que la suma combinada eluye
el contaminante o contaminantes, sin eliminar sustancialmente la
proteína de interés. Las concentraciones preferentes de sal en
tales tampones de lavado son desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 2 M, y más preferiblemente desde aproximadamente
0,2 M hasta aproximadamente 0,6 M. Las concentraciones de detergente
útiles son desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5%, más
preferiblemente desde aproximadamente 0,1% hasta 1%, y lo más
preferible aproximadamente 0,5%, por ejemplo cuando el detergente es
polisorbato. Concentraciones de disolvente de ejemplo son desde
aproximadamente 1% hasta 40%, preferiblemente desde aproximadamente
5 hasta aproximadamente 25%. Por ejemplo, en los ejemplos de la
presente invención, la concentración preferida del disolvente
(hexilenglicol) para E26 fue de aproximadamente 20%, mientras que
para Trastuzumab la concentración preferida del disolvente (de
nuevo hexilenglicol) fue de aproximadamente 10%. Cuando el compuesto
adicional es un polímero (por ejemplo PEG 400 o PEG 8000), la
concentración del mismo puede ser, por ejemplo, desde
aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20%, preferiblemente desde
aproximadamente 5% hasta aproximadamente 15%.
En otra realización, la etapa de lavado
intermedia implica el uso de una solución de tampón altamente
concentrada, por ejemplo un tampón a una concentración de más de
aproximadamente 0,8 M, por ejemplo hasta aproximadamente 2 M, y
preferiblemente en el intervalo desde aproximadamente 0,8 M hasta
aproximadamente 1,5 M, siendo lo más preferible aproximadamente 1
M. En esta realización, el tampón es preferiblemente un tampón de
Tris, tal como Tris acetato.
El pH del tampón de lavado intermedio es
preferiblemente desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8,
más preferiblemente desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente
5,5, y siendo lo más preferible aproximadamente 5,0. En otra
realización preferente, el pH es aproximadamente 7,0.
Después de la etapa de lavado intermedia del
párrafo anterior, la proteína de interés se recupera de la columna.
Esto se consigue normalmente utilizando un tampón de elución
adecuado. La proteína puede eluirse, por ejemplo, de la columna
utilizando un tampón de elución que tiene un pH bajo, por ejemplo en
el intervalo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5, y
preferiblemente en el intervalo desde aproximadamente 2,5 hasta
aproximadamente 3,5. Ejemplos de tampones de elución para este
objetivo incluyen tampones de citrato o acetato.
La preparación de proteína eluída puede
someterse a etapas de purificación adicionales ya sea antes, o
después, de la etapa de cromatografía de Proteína A. Las etapas de
purificación adicionales de ejemplo incluyen cromatografía de
hidroxilapatita; diálisis; cromatografía de afinidad utilizando un
anticuerpo para capturar la proteína; cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC); precipitación con sulfato de amonio;
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico; precipitación
con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice;
"chromatofocusing"; y filtración en gel. En los ejemplos de la
presente invención, la etapa de cromatografía de Proteína A va
seguido de etapas de purificación de intercambio catiónico
(SP-Sefarosa) e intercambio aniónico
(Q-Sefarosa) corriente abajo.
La proteína recuperada de este modo puede
formularse en un portador farmacéuticamente aceptable y se utiliza
para diversos usos diagnósticos, terapéuticos u otros usos conocidos
para tales moléculas.
Los siguientes ejemplos se muestran a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron recombinadamente el anticuerpo
anti-HER2 Trastuzumab (Figs. 1A-B;
HERCEPTIN®), el anticuerpo anti-IgE (E26; Patente
de Estados Unidos 5.994.511, Lowman et al.) y el anticuerpo
anti-CD11 humanizado (XANELIM®; Patente de Estados
Unidos Nº 6.037.454) en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y
se purificaron mediante cromatografía de Proteína A como una
primera etapa cromatográfica para eliminar las proteínas de CHO
contaminantes (CHOP). No obstante, las CHOP tienden a unirse de
manera no específica a ProSepA, la resina utilizada para esta
etapa. ProSep A tiene la Proteína A de unión a anticuerpo
inmovilizada en cristal de poro controlado cubierto de glicerol.
Aunque la cubierta de glicerol reduce la unión no específica,
algunas CHOP aún se adhieren a la estructura de cristal de la
resina. Durante la fase de elución de la operación de Proteína A,
cualquier CHOP unida de manera no específica se
co-eluirá con el anticuerpo, comprometiendo la
pureza del pool del producto. Para eliminar esta CHOP antes de la
fase de elución, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.127.526 y
6.333.398 (Blank, G.) ponen como ejemplo una etapa de lavado
intermedio utilizando cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para
eliminar CHOP. Aunque el TMAC es efectivo en la eliminación de CHOP
unida de manera no específica, es difícil de manejar y administrar,
es tóxico, requiere una eliminación costosa como residuo peligroso,
y es corrosivo en concentraciones altas y pH bajo. El siguiente
estudio muestra que las composiciones de lavado alternativas, sin
los inconvenientes de TMAC, pueden utilizarse en una etapa de lavado
intermedia. Los otros tampones (tampones de equilibrado, carga,
elución y regeneración) fueron como en el Ejemplo de las Patentes
de Estados Unidos Nº 6.127.526 y 6.333.398.
Se cribó una amplia variedad de "tampones de
lavado intermedio" con respecto al anticuerpo
anti-IgE E26, el anticuerpo
anti-HER2 Trastuzumab, y el anticuerpo
anti-CD11a XANELIM^{TM}. Los tipos de tampón de
lavado eran: (a) detergente y sal; (b) disolvente y sal; (c)
polímero y sal; (d) tampón de alta concentración; y (e) urea.
Se determinaron el rendimiento de proteína, la
eliminación de CHOP, y la agregación de proteína en pools de la
Proteína A para cada uno de los tampones de lavado intermedios. Para
todas los procesados ("runs"), el rendimiento fue superior al
94% a excepción de la solución de lavado intermedio con
hexilenglicol al 20% donde la proteína era Trastuzumab. En las
Figs. 2-6 se representa la eliminación de CHOP
conseguida con los diversos tampones de lavado intermedios. La
agregación de proteínas determinada mediante cromatografía de
exclusión por tamaño era inferior al 1,5% para todos los
procesados.
Los tampones de lavado intermedios preferentes,
tomando en consideración la depuración de CHOP, el rendimiento
final de proteína y la facilidad en el uso, fueron: (a)
polisorbato/sal; (b) hexilenglicol/sal; y (c) tampón Tris de alta
concentración. Se seleccionó el tampón de lavado intermedio de
polisorbato/sal para estudios adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó el efecto de (a) el tipo y la
concentración de sal, (b) la concentración de polisorbato, y (c) el
pH del tampón de lavado intermedio en la eliminación de CHOP. Los
anticuerpos eran el anticuerpo anti-IgE E26, y el
anticuerpo anti-HER2 Trastuzumab.
La Fig. 7 representa el efecto del tipo y la
concentración de sal en la eliminación de CHOP. Para E26, el nivel
de CHOP en el pool de elución no se vio afectado significativamente
por la concentración de citrato o sulfato en la solución de lavado.
Para Trastuzumab, el nivel de CHOP en el pool de elución se vio
afectado por la concentración de sal en el tampón de lavado
intermedio. Las concentraciones preferentes de la sal iban desde
aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 0,6 M.
También se evaluó el efecto de la concentración
de polisorbato en el nivel de CHOP en el pool de elución. Tal y
como se muestra en la Fig. 8, a medida que aumentaba la
concentración de polisorbato en el tampón de lavado intermedio,
disminuía la cantidad de contaminación por CHOP. La concentración
preferente de polisorbato es desde aproximadamente 0,5% hasta
aproximadamente 1%.
También se evaluó el efecto del pH en CHOP y se
muestran los resultados de estos experimentos en la Fig. 9. Un pH
menor dio lugar a menos contaminación por CHOP en la proteína
eluída. El pH preferente es aproximadamente 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la acción corriente abajo en
términos de eliminación de CHOP, rendimiento, etc
(SDS-PAGE, HPLC-IEC, cromatografía
por exclusión de tamaño (SEC), y filtrado con proteína A), para E26
y Trastuzumab. Las etapas de purificación corriente abajo fueron la
cromatografía de intercambio catiónico (SP-Sefarosa)
y cromatografía de intercambio aniónico
(Q-Sefarosa).
\newpage
Para E26, los tampones de lavado intermedio
fueron: (a) polisorbato 20 al 0,5%/acetato de sodio 0,2 M, (b)
hexilenglicol al 20%/citrato sódico 0,2 M, y (c) Tris acetato 1 M.
Los resultados se muestran en la siguiente Tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para Trastuzumab, los tampones de lavado
intermedio fueron: (a) polisorbato 20 al 0,5%/acetato de sodio 0,5
M, (b) hexilenglicol al 10%/acetato sódico 0,5 M, y (c) Tris acetato
1 M. Los resultados se resumen en las Tablas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
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Los rendimientos y la eliminación de CHOP fueron
similares para los dos anticuerpos probados. El polisorbato,
hexilenglicol y Tris mostraron una buena depuración y rendimiento de
CHOP después de la cromatografía de Proteína A y posteriores etapas
de cromatografía de intercambio iónico.
Se realizaron la Cromatografía por Exclusión de
Tamaño (SEC) para medir el porcentaje de agregados y
SDS-PAGE en pools de Q-Sefarosa. Se
realizaron un Análisis de Intercambio Iónico (IEX) para medir el
porcentaje del pico principal, y SEC para evaluar la agregación en
pools de Proteína A y SP-Sepharose. Tanto para
Trastuzumab como para E26, los ensayos mostraron resultados
similares entre el control positivo (TMAC) y los tampones de lavado
intermedios alternativos.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este experimento fue determinar
si el polisorbato 20 en el tampón de lavado intermedio afecta a la
vida de la resina. Se reciclaron tampones (equilibrado, lavado
intermedio de polisorbato 20, elución y regeneración) en una
columna de 6,84 ml (0,66 cm x 20 cm) durante 400 ciclos. Se realiza
una curva de ruptura de HER2 cada 50 ciclos para determinar la
capacidad de unión de la resina. La descripción actual para la
capacidad de unión máxima es 20 gramos de anticuerpo por litro de
resina. Un descenso en la capacidad de unión con ciclos crecientes
indicaría que el polisorbato 20 reduce la vida de la resina. Este
experimento demostró que el polisorbato 20 no reduce la vida de la
resina. La reutilización se ha completado en realidad durante 140
ciclos y no se ha observado ningún cambio en el rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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\bulletSTAMENKOVIC et al. Cell,
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Claims (12)
1. Procedimiento para purificar una proteína,
que comprende una región C_{H}2/C_{H}3, de una solución
contaminada de la misma mediante cromatografía de Proteína A, que
comprende:
(a) adsorber la proteína de dicha solución
contaminada a la Proteína A inmovilizada en una fase sólida;
(b) eliminar los contaminantes mediante el
lavado de la fase sólida con una composición que comprende
detergente en una concentración entre aproximadamente 0,01% y
aproximadamente 5% y sal a una concentración de entre
aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 2 M, teniendo la
composición un pH de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 5,5;
y
(c) recuperar la proteína de la fase sólida con
un tampón de elución que tiene un pH en el intervalo de
aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la fase sólida comprende sílice, vidrio, agarosa o
poliestireno.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la fase sólida comprende sílice o vidrio.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la proteína es un anticuerpo o una inmunoadhesina.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la proteína es un anticuerpo.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado del grupo
que consiste en HER2, factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF), IgE, CD20, CD40, CD11a, factor tisular (TF), antígeno de
células madre de próstata (PSCA), interleuquina-8
(IL-8), receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGFR), HER3, HER4, \alpha4\beta7 y
\alpha5\beta3.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-HER2.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-IgE.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el detergente es polisorbato.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la concentración del polisorbato en la composición es de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1%.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la sal es acetato o citrato.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la concentración de la sal en la composición es de
aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,6 M.
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