ES2319660T3 - Uso de mioblastos en la fabricacion de un medicamento para tratar la incontinencia urinaria de esfuerzo. - Google Patents

Uso de mioblastos en la fabricacion de un medicamento para tratar la incontinencia urinaria de esfuerzo. Download PDF

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Abstract

Uso de mioblastos derivados de músculo esquelético histocompatibles con un receptor en la preparación de un medicamento para usar en la reparación de la disfunción muscular lisa en el tracto urinario.

Description

Uso de mioblastos en la fabricación de un medicamento para tratar la incontinencia urinaria de esfuerzo.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de mioblastos en la preparación de un medicamento para usar en la reparación de disfunción muscular lisa en el tracto urinario.
Antecedentes de la invención
Una serie de defectos, enfermedades y afecciones patológicas en una variedad de áreas de la medicina, se beneficiarían del desarrollo de tratamientos no invasivos que usen vehículos y sistemas de suministro de genes mejorados que permitan la producción segura, eficaz y sostenida de productos génicos en el sitio de un tejido u órgano afectado. En particular, los vehículos y procedimientos mejorados de suministro de genes mediado por células, tendrían un amplio uso en la mejora de patologías no mortales pero debilitantes del sistema musculoesquelético, tales como artritis y enfermedad de las articulaciones (p. ej, ligamento, menisco y cartílago); el hueso, tal como defectos óseos segmentales y no uniones; y el sistema genitourinario, tal como la incontinencia urinaria y afecciones de la vejiga.
Aunque se han usado células sinoviales para suministrar agentes potencialmente terapéuticos en la articulación, la expresión de dichos agentes disminuye con el tiempo, haciendo que estos agentes en general se vuelvan indetectables después de aproximadamente cuatro a seis semanas (G. Bandara y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(22): 10764-10768; C.H. Evans y P.D. Robbins, 1995, Ann. Med., 27(5):543-546; C.H. Evans y P.D. Robbins, 1994, J. Rheum., 21 (5):779-782). Esta disminución de la expresión con el tiempo se puede mejorar mediante el uso del suministro de genes mediado por células, usando un tipo de célula miógena que se convierta en post-mitótica con diferenciación, según la presente invención.
Los defectos óseos segmentales y no uniones son problemas relativamente frecuentes a los que se enfrentan todos los cirujanos ortopédicos. Las proteínas osteógenas, p. ej., proteína morfogénica ósea-2, BMP-2) pueden promover la consolidación ósea en defectos óseos segmentales. Sin embargo, se necesita una gran cantidad de la proteína recombinante humana para potenciar el potencial de consolidación ósea. Además, los modos actuales de suministrar dichas cantidades de proteínas, es decir, un aloinjerto biológico o un vehículo sintético, están dificultadas por la limitada disponibilidad, posible transmisión de enfermedades y la necesidad de más investigación.
La terapia génica mediada por células en el defecto óseo permitiría una expresión sostenida de proteínas osteógenas, potenciar más la consolidación ósea y ofrecer una solución a los problemas que rodean los procedimientos actuales de suministro de proteínas óseas. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, el uso de células derivadas de músculo, p. ej., mioblastos, como vehículos celulares de suministro de genes para corregir o mejorar un defecto óseo, proporciona una paso importante para establecer un tratamiento menos invasivo para no uniones y defectos óseos segmentales.
La terapia génica ex vivo y el transplante de mioblastos son dos procedimientos estrechamente relacionados, que requieren el aislamiento y cultivo de células in vitro. Las técnicas ex vivo implican biopsia muscular y aislamiento de células miógenas (T.A. Rando y col., 1994, J. Cell Biol., 125:1275-1287; Z. Qu y col., 1998, J. Cell Biol., 142(5): 1257-1267). Las células aisladas derivadas de músculo son transducidas in vitro con el vector que lleva el gen deseado. Las células satélite después se vuelven a inyectar en el músculo esquelético, se fusionan para formar miotubos y miofibras post-mitóticos, y empiezan la producción de factores de crecimiento. Esta técnica es factible con vectores adenovíricos, retrovíricos y de virus herpes simplex.
A continuación se dan ejemplos de aplicaciones ortopédicas para terapia génica basada en músculo y transformación de tejidos relacionados con la práctica de la presente invención:
Lesión muscular y reparación
Las lesiones musculares comprenden un gran porcentaje de las lesiones atléticas de recreo y competición. Las lesiones musculares pueden resultar tanto de traumatismo directo (p. ej., contusiones, laceraciones) como indirecto (p. ej., distensiones, isquemia y lesiones neurológicas). Tras la lesión las células satélite son liberadas y activadas con el fin de diferenciarse en miotubos y miofibras, promoviendo así la curación muscular. Sin embargo, este proceso de reparación normalmente es incompleto y va acompañado de una reacción fibrosa que produce tejido de cicatriz. Este tejido de cicatriz limita el potencial del músculo para la recuperación funcional (T. Hurme y col., 1991; Med. Sci. Sports Exerc., 23:801-810; T. Hurme y col., 1992, Med. Sci. Sports Exerc., 24:197-205).
Investigaciones en animales han identificado posibles aplicaciones clínicas para la transformación de tejidos basada en músculo para tratar lesiones musculares (W.E. Garrett y col., 1984; J. Hand Surgery (Am). 9A:683-692; W.E. Garrett y col., 1990, Med. Sci. Sports Exerc., 22:436-443). El músculo esquelético lesionado libera numerosos factores de crecimiento que actúan de modo autocrino y paracrino para modular la curación muscular. Estas proteínas activan las células satélite para que proliferen y se diferencien en miofibras (T. Hurme, 1992, Med. Sci. Sports Exerc., 24:197-205; R. Bischoff, 1994, "The satellite cell and muscle regeneration". Myology. 2nd Edition. New York, McGraw-Hill, Inc, pp. 97-118; H.S. Allamedine y col., 1989; Muscle Nerve, 12:544-555; E. Schultz y col., 1985, Muscle Nerve, 8:217; E. Schultz, 1989, Med. Sci. Sports Exerc., 21:181).
La transformación de tejidos basada en músculo ofrece terapias potenciales fascinantes para los trastornos musculares. Un gran número de lesiones atléticas de profesionales y aficionados implican el músculo esquelético (Garrett y col., 1990, Med. Sci. Sports Exerc., 22: 436-443). Las terapias para mejorar la recuperación funcional y acortar la rehabilitación pueden tanto optimizar rendimientos como minimizar la morbosidad. Se están llevando a cabo investigaciones adicionales para perfeccionar estas aplicaciones de transformación de tejidos basada en músculo. Los resultados de dichas investigaciones pueden proporcionar tratamientos revolucionarios para estas lesiones musculares comunes. La presente invención proporciona nuevos y fascinantes tratamientos para la reparación muscular después de lesiones basadas en músculo, en particular para la aplicación en el marco clínico.
Consolidación ósea
Múltiples especialidades quirúrgicas, incluyendo la ortopédica, plástica y maxilofacial, tienen interés por el aumento de la consolidación ósea. Los médicos de estas disciplinas se basan en técnicas de aumento óseo para mejorar la consolidación de no uniones de fracturas, reconstrucciones de defectos óseos oncológicos y traumáticos, fusiones de articulaciones y de columna, y estabilizaciones de implantes artificiales. Desgraciadamente, las técnicas actuales de autoinjerto, aloinjerto y estimulación eléctrica con frecuencia no son óptimas. Por lo tanto, los procedimientos de transformación de tejidos hacia la formación ósea tienen grandes implicaciones.
La formación de hueso intramuscular es un fenómeno que se entiende poco. Puede estar presente en estados patológicos clínicos de osificación heterotópica, miositis osificante, fibrodisplasia osificante progresiva y osteosarcoma. La terapia con radiación y el fármaco antiinflamatorio indometacina pueden suprimir la miositis osificante. Sin embargo, no se entienden claramente ni el mecanismo de formación ni de supresión de hueso ectópico. Se ha reconocido una familia creciente de proteínas morfogenéticas óseas (BMP), miembros de la superfamilia de factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta), como capaz de estimular el hueso intramuscular. El ADNc que codifica la BMP y la BMP-2 humana en forma recombinante (rhBMP-2) contenido en una construcción de plásmido, induce la formación ósea cuando se inyecta en músculo esquelético (E.A. Wang y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2220-2224; J. Fang y col, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5753-5758). Las aplicaciones actuales se centran en la inyección de rhBMP-2 directamente en defectos óseos y no uniones. Sin embargo, la transformación de tejidos basada en músculo es muy prometedora en el campo de la consolidación ósea y puede arrojar luz sobre el mecanismo fisiológico de la formación de hueso ectópico.
Trastornos intraarticulares
Los trastornos degenerativos y traumáticos de las articulaciones se encuentran con frecuencia a medida que la población se hace más activa y vive más tiempo. Estos trastornos incluyen artritis de diferentes etiologías, roturas de ligamentos, desgarro de menisco y lesiones osteocondriales. Actualmente, las herramientas de los médicos consisten principalmente en procedimientos quirúrgicos dirigidos a la alteración biomecánica de la articulación, tal como reconstrucciones de ligamento cruzado anterior (LCA), sustitución total de rodilla, reparación o escisión de menisco, desbridamiento de cartílago, etc. La transformación de tejidos aplicada a estos estados de enfermedad intraarticular ofrece teóricamente un procedimiento de reparación más biológico y menos disruptivo.
Se han publicado procedimientos de terapia génica tanto directos (I. Nita y col., 1996, Arthritis Rheum., 39:820-828) como ex vivo (G. Bandara y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10764-10768) en modelos de artritis. El procedimiento ex vivo mediado por células sinoviales, aunque ofrece las ventajas de la transferencia de genes ex vivo, tales como la seguridad de la manipulación genética in vitro y la selección celular precisa, está dificultada por una disminución de la expresión génica después de 5-6 semanas (Bandara y col., 1993, véase antes). Debido a su capacidad post-mitótica para formar miotubos y micofibras, la célula satélite ofrece las ventajas teóricas de un periodo más largo y una producción de proteínas más abundante.
Es posible el suministro de genes ex vivo mediado por células musculares a numerosas estructuras intraarticulares. La inyección intraarticular de mioblastos primarios, transducidos con adenovirus que llevan el gen marcador de \beta-galactosidasa, da como resultado el suministro de genes a muchas estructuras intraarticulares (C.S. Day y col., 1997, J. Orthop. Res., 15:227-234). Los tejidos que expresan la \beta-galactosidasa 5 días después de inyección en la rodilla de conejo incluyen el revestimiento sinovial, superficie del menisco y ligamento cruzado (véase antes). En contraste, la inyección de células sinoviales transducidas da como resultado la expresión de \beta-galactosidasa sólo en la sinovia (véase antes). Igualmente, la inyección de mioblastos inmortalizados transducidos da como resultado el suministro de genes a diferentes estructuras intraarticulares, incluyendo el revestimiento sinovial y la superficie del ligamento rotuliano. Sin embargo, los mioblastos inmortalizados purificados se fusionaban más rápidamente y daban como resultado más miofibras intraarticulares nuevas que los mioblastos primarios. Esto ilustra la importancia de obtener una población pura de células miógenas, desprovista de la contaminación de fibroblastos y adipocitos que a menudo se ve en los mioblastos primarios.
Los procedimientos ex vivo mediados por células musculares están basados en la fusión de mioblastos para formar miofibras, las fabricas productoras de proteínas plurinucleares. La inyección intraarticular de mioblastos inmortalizados transducidos en un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) da como resultado la formación de miotubos y la expresión de transgenes en múltiples estructuras a los 35 días. Por lo tanto, la expresión de genes intraarticular (durante al menos 35 días) que resulta de la transformación de tejidos mediada por células musculares es posible en modelos animales. Basado en estos datos, un procedimiento de transferencia de genes mediada por células musculares puede suministrar genes para mejorar la curación de varias estructuras intraarticulares, específicamente para el LCA y el menisco.
El LCA es el segundo ligamento de rodilla lesionado con más frecuencia. Desgraciadamente, el LCA tiene una baja capacidad de curación, posiblemente secundario a la vaina sinovial que lo rodea o al líquido sinovial que lo rodea. Debido a que los desgarros completos del LCA no pueden curarse espontáneamente, las opciones de tratamiento actuales están limitadas a la reconstrucción quirúrgica usando autoinjerto o aloinjerto. EL injerto de sustitución, a menudo procedente del ligamento rotuliano o del tendón de la corva, experimenta formación de ligamento con eventual remodelación de colágeno (S.P. Arnosczky y col., 1982, Am. J. Sports Med., 10:90-95). Por lo tanto, mediante la práctica de los procedimientos descritos en el presente documento, se prevé el aumento de este proceso de formación de ligamento usando factores de crecimiento para afectar al comportamiento de los fibroblastos. Los datos in vivo sugieren que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) promueven la curación de ligamentos (N.A. Conti y col., 1993, Trans. Orthop. Res. Soc., 18:60). No es probable que los niveles transitorios bajos de estos factores de crecimiento que resultan de su inyección directa en el ligamento lesionado produzcan una respuesta significativa. Por lo tanto, es esencial un mecanismo de suministro eficaz para el desarrollo de una terapia clínicamente aplicable. La terapia génica ex vivo mediada por células musculares de acuerdo con las enseñanzas del presente documento, ofrece el potencial de lograr la expresión de genes local persistente y el posterior suministro de factores de crecimiento al LCA.
Mirando de forma más específica a la rodilla, el menisco de la rodilla tiene una función crítica en el mantenimiento de la biomecánica normal de la rodilla. Las funciones principales del menisco incluyen la transmisión de carga, absorción de choque, lubricación de articulaciones y estabilización tibiofemoral en la rodilla con LCA deficiente. El tratamiento histórico de la menisectomía para desgarros de menisco se ha sustituido por la reparación de menisco cuando el desgarro implica el tercio periférico vascular del menisco. Los factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), son capaces de potenciar la curación del menisco (K.P. Spindler y col., 1995, J. Orthop. Res., 13(2):201-207). Sin embargo, son necesarios tanto para el médico como para el paciente mejores procedimientos de suministro de dichos factores al menisco para proporcionar la curación y reparación.
Aplicaciones urológicas
La incontinencia urinaria es una afección médica y social devastadora. La incidencia de la incontinencia urinaria está aumentando en los Estados Unidos debido al envejecimiento de la población. A partir de enero de 1997, el Instituto Nacional de la Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales lanzó una campaña de salud pública para abordar el hecho de que hay más de 11 millones de mujeres y 4 millones de hombres en los Estados Unidos que tienen problemas de incontinencia urinaria. Aproximadamente la mitad de los quince millones de personas con incontinencia tienen incontinencia urinaria de esfuerzo; sin embargo, menos de la mitad de las personas aquejadas buscan ayuda y reciben los tratamientos que están disponibles (Agency for Health Care Policy and Research, AHCPR, 1992 y 1996).
Actualmente, el coste anual calculado para el tratamiento de personas con incontinencia urinaria es de más de 16 mil millones de dólares en los Estados Unidos. La mayor parte de este dinero se gasta en medidas de gestión, tales como pañales y compresas para adultos, más que en el tratamiento. Puesto que la mayor parte de los tratamientos quirúrgicos e invasivos para la incontinencia urinaria implican el tratamiento de la incontinencia urinaria de esfuerzo, se calcula que el coste de gestión de la incontinencia urinaria de esfuerzo es 9 mil millones de dólares por año en los Estados Unidos (AHCPR 1996).
Cuando se evalúa un individuo con incontinencia, se pueden identificar tres de los tipos y causas más comunes de la incontinencia: a) incontinencia urgente, b) incontinencia de esfuerzo, o c) incontinencia por rebosamiento (M. B. Chancellorand J.G. Blaivas, 1996, Atlas of Urodynamics, Williams and Wilkins, Philadelphia, PA).
La incontinencia de esfuerzo es la pérdida de orina involuntaria cuando se tose, estornuda, ríe u otras actividades físicas que aumentan la presión abdominal. Esta afección se puede confirmar observando la pérdida de orina coincidente con un aumento de la presión abdominal, en ausencia de una contracción de la vejiga o la vejiga sobredistendida. La afección de incontinencia de esfuerzo se puede clasificar como por hipermovilidad uretral o por deficiencia intrínseca del esfínter. En la hipermovilidad uretral, el cuello de la vejiga y la uretra descienden durante la tos o tensión en el estudio urodinámico y la uretra se abre con pérdida de orina visible (presión del punto de escape entre 60-120 cm de H_{2}O). En la deficiencia intrínseca de esfínter, el cuello de la vejiga se abre durante el llenado de la vejiga sin contracción de la vejiga. Se observa pérdida urinaria visible con un esfuerzo mínimo o sin esfuerzo. El cuello de la vejiga y el descenso uretral es variable, a veces no hay, y la presión del punto de escape es bajo (<60 cm de H_{2}O) (J.G. Blaivas, 1985, Urol. Clin. N. Amer, 12:215-224; D.R. Staskin y col. 1985, Urol. Clin. N. Amer., 12:271-
278).
La incontinencia de urgencia se define como la pérdida de orina involuntaria asociada con un deseo repentino y fuerte de evacuar. Aunque las contracciones involuntarias de la vejiga se pueden asociar con trastornos neurológicos, también pueden ocurrir en individuos que parecen neurológicamente normales (P. Abrams y col., 1987, Neurol. & Urodynam., 7:403-427). Los trastornos neurológicos comunes asociados con la incontinencia de urgencia son la apoplejía, diabetes y esclerosis múltiple (E.J. McGuire y col, 1981, J. Urol., 126:205-209). La incontinencia de urgencia es causada por contracciones involuntarias del detrusor que también pueden deberse a inflamación de la vejiga y contractilidad deteriorada del detrusor, en la que la vejiga no se vacía completamente.
La incontinencia por rebosamiento se caracteriza por la pérdida de orina asociada con la sobredistensión de la vejiga. La incontinencia por rebosamiento puede deberse a la contractilidad deteriorada de la vejiga o la obstrucción de la salida de la vejiga que conduce a la sobredistensión y rebosamiento. La vejiga puede estar subactiva secundariamente a afecciones neurológicas tales como la diabetes o la lesión de médula espinal, o después de cirugía pélvica
radical.
Otra causa común y grave de la incontinencia urinaria (de tipo urgencia y rebosamiento) es la contractilidad deteriorada de la vejiga. Esta es una afección común creciente en la población geriátrica y en pacientes con enfermedades neurológicas, en especial diabetes mellitus (N.M. Resnick y col., 1989, New Engl. J. Med., 320:1-7; M.B. Chancellor y J.G. Blaivas, 1996, Atlas of Urodynamics, Williams and Wilkins, Philadelphia, PA). Con la contractilidad inadecuada, la vejiga no puede vaciar su contenido de orina; esto causa no sólo incontinencia, si no también infección del tracto urinario e insuficiencia renal. Actualmente, los médicos tienen muy limitada su capacidad para tratar la contractilidad deteriorada del detrusor. No hay medicamentos eficaces para mejorar la contractilidad del detrusor. Aunque la urecolina puede aumentar ligeramente la presión intravesical, no se ha mostrado en estudios controlados que ayude eficazmente al vaciado de la vejiga (A. Wein y col., 1980, J. Urol., 123:302). El tratamiento más común es evitar el problema con cateterismo intermitente o permanente.
Hay una serie de modalidades de tratamiento para la incontinencia urinaria de esfuerzo. Los tratamientos actuales que se practican más habitualmente para la incontinencia de esfuerzo incluyen los siguientes: productos absorbentes; cateterismo permanente; pesario, es decir, anillo vaginal puesto para soportar el cuello de la vejiga; y medicación (Agency for Health Care Policy and Research. Public Health Service: Urinary Incontinence Guideline Panel. Urinary Incontinence in Adults: Clinical Practice Guideline. AHCPR Pub. Nº 92-0038. Rockville, MD. EE.UU. Department of Health and Human Services, Marzo de 1992; M.B. Chancellor, Evaluation and Outcome. En: The Health of Women With Physical Disabilities: Setting a Research Agenda for the 90's. Eds. Krotoski D.M., Nosek, M., Turk, M., Brooks Publishing Company, Baltimore, MD, capítulo 24, 309-332, 1996). Mirando específicamente la medicación, hay varios fármacos aprobados para el tratamiento de la incontinencia de urgencia. Sin embargo, no hay fármacos aprobados o eficaces para la incontinencia urinaria de esfuerzo.
El ejercicio es otra modalidad de tratamiento para la incontinencia urinaria de esfuerzo. Por ejemplo, el ejercicio de Kegel es un procedimiento común y popular para tratar la incontinencia de esfuerzo. El ejercicio puede ayudar a la mitad de las personas que lo hacen cuatro veces al día durante 3-6 meses. Aunque el 50% de los pacientes describen alguna mejora con el ejercicio de Kegel, la tasa de curación de la incontinencia después del ejercicio de Kegel es sólo de 5 por ciento. Además, la mayoría de los pacientes cesan el ejercicio y abandonan el protocolo debido al tiempo muy largo y disciplina diaria requeridas.
Otro procedimiento de tratamiento para la incontinencia urinaria es el tapón uretral. Esto es un tapón de tipo corcho desechable, barato y nuevo para mujeres con incontinencia de esfuerzo. Debe usarse un nuevo tapón después de cada micción, con un coste diario calculado de aproximadamente 15-20 dólares. El coste anual calculado es de más de 5.000 dólares. El tapón está asociado con más de 20% de infección del tracto urinario, y desgraciadamente no cura la incontinencia.
También se usan la biorretroalimentación y estimulación eléctrica funcional que usa una sonda vaginal para tratar la incontinencia urinaria de urgencia y de esfuerzo. Sin embargo, estos procedimientos requieren tiempo y son caros, y los resultados son solo moderadamente mejores que el ejercicio de Kegel. También se usan las cirugías, como las suspensiones de cuello vaginal laparsocópicas o de abdomen abierto; procedimientos transvaginales de suspensiones de cuello vesical abdominal; esfínter urinario artificial (procedimiento quirúrgico complejo y caro con una tasa de inversión de 40%), para el tratamiento de la incontinencia urinaria de esfuerzo.
Otros tratamientos incluyen los procedimientos de inyección uretral con materiales inyectables exógenos tales como Teflón, colágeno y grasa autóloga. Cada uno de estos inyectables tiene sus desventajas. Más específicamente, hay reservas importantes entre la comunidad médica en lo que se refiere al uso de Teflón. Las complicaciones de la inyección de Teflón incluyen granuloma, divertículo, quistes y formación de pólipos uretrales. Es más preocupante la migración (por los sistemas linfático y vascular) de partículas de Teflón a puntos lejanos, que dan como resultado fiebre y neumonitis.
Las inyecciones de colágeno en general usan colágeno bovino, el cual es caro y a menudo es reabsorbido, dando como resultado la necesidad de inyecciones repetidas. Otra desventaja del colágeno es que aproximadamente el 5% de los pacientes son alérgicos al colágeno de origen bovino y desarrollan anticuerpos.
El injerto de grasa autóloga como un agente de carga inyectable tiene un inconveniente importante en cuanto que la mayoría de la grasa inyectada es reabsorbida. Además, sigue siendo controvertida la extensión y duración de la supervivencia de un injerto de grasa autóloga. En general se produce una reacción inflamatoria en el sitio del implante. Las complicaciones del injerto de grasa incluyen resorción de grasa, nódulos y asimetría de tejido.
En J. Reproductive Medicine for the Obstetrician and Gynecologist, 40, 1995, 503-6 (base de datos Embase, resumen número EMB-1995233867), se describe el tratamiento quirúrgico de mujeres con incontinencia urinaria de esfuerzo por el procedimiento de Ball-Burch.
En vista de las limitaciones y complicaciones mencionadas antes del tratamiento de la incontinencia urinaria y contractilidad de la vejiga, son necesarias modalidades nuevas y eficaces en este campo en la técnica. De acuerdo con la presente invención, se proporciona la terapia por inyección de células musculares usando únicamente células transformadas derivadas de músculo, como un medio nuevo e mejor para tratar y curar diferentes tipos de incontinencia, en particular la incontinencia urinaria de esfuerzo y para potenciar la continencia urinaria. Como una ventaja, la inyección de células derivadas de músculo puede ser preferiblemente autóloga, de modo que no habrá reacciones alérgicas o serán mínimas, a diferencia del uso mencionado del colágeno. También, a diferencia del colágeno, las células miógenas como los blastos no son absorbidas; por lo tanto, pueden proporcionar una tasa de mejora y curación
mejor.
Los mioblastos, los precursores de las fibras musculares, son células musculares mononucleadas que difieren de muchas formas de otros tipos de células. Los mioblastos se fusionan de forma natural para formar miotubos multinucleados post-mitóticos que dan como resultado la expresión y liberación de proteínas bioactivas durante un periodo largo (T.A. Partridge y K.E. Davies, 1995, Brit. Med. Bulletin, 51:123-137; J. Dhawan y col., 1992, Science, 254: 1509-1512; A.D. Grinnell, 1994, En: Myology. Ed 2, Ed. Engel AG y Armstrong CF, McGraw-Hill, Inc, 303-304; S. Jiao y J.A. Wolff, 1992, Brain Research, 575:143-147; H. Vandenburgh, 1996, Human Gene Therapy, 7:2195-2200). Los mioblastos se han usado para el suministro de genes a músculos para enfermedades relacionadas con los músculos, tales como la distrofia muscular de Duchenne (E. Gussoni y col., 1992, Nature, 356:435-438; J. Huard y col., 1992, Muscle & Nerve, 15:550-560; G. Karpati y col., 1993, Ann. Neurol., 34:8-17; J.P. Tremblay y col., 1993, Cell Transplantation, 2: 99-112), así como para enfermedades no relacionadas con el músculo, p. ej., suministro de genes de adenosina desaminasa humana para el síndrome de deficiencia de adenosina desaminasa (CM. Lynch y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1138-1142); transferencia de genes de proinsulina humana para la diabetes mellitus (G.D. Simonson y col., 1996, Human Gene Therapy, 7:71-78); transferencia de genes para la expresión de la tirosina hidroxilasa para la enfermedad de Parkinson (S. Jiao y col., 1993, Nature, 362:450); transferencia y expresión del Factor IX para la hemofilia B (Y. Dai y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10892), suministro de hormona de crecimiento humana para el retraso de crecimiento (J. Dhawan y col., 1992, Science, 254:1509-1512).
El uso de mioblastos para tratar la degeneración muscular, reparar daño tisular o tratar una enfermedad se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.130.141 y 5.538.722. También se ha usado el transplante de mioblastos para la reparación de la disfunción miocárdica (S.W. Robinson y col., 1995, Cell Transplantation, 5:77-91; C.E. Murry y col., 1996, J. Clin. Invest., 98: 2512-2523; S. Gojo y col., 1996, Cell Transplantation, 5:581-584; A. Zibaitis y col., 1994, Transplantation Proceedings, 26:3294).
Se ha reconocido que el óxido nítrico (NO) es un importante transmisor en la función del tracto urinario. El NO media la relajación del músculo liso y también es clave para lograr la erección. Recientemente, se ha demostrado la óxido nítrico sintasa constitutiva e inducible (NOS o iNOS) en el urotelio, vejiga y pared de la uretra, y una deficiencia en NO urinario en pacientes que tienen inflamación de vejiga con cistitis intersticial (M.A. Wheeler y col., 1997, J. Urol., 158(6):2045-2050; S.D. Smith y col., 1997, J. Urol., 158(3 Pt 1):703-708). Además, los pacientes con cistitis intersticial tienen mejora de los síntomas urinarios y mayor producción de NO urinario cuando se tratan con L-Arginina oral (M.A. Wheeler y col., 1997, J. Urol., 158(6):2045-2050). Pruebas recientes han demostrado que la relajación del músculo liso uretral es mediada por la liberación de NO y que el NO también media la relajación del músculo liso de la próstata (H. Kakizaki y col., 1997, Am. J. Phys., 272: R1647-1656; A.L. Burnett, 1995, Urology, 45:1071-1083; M. Takeda y col., 1995, Urology, 45:440-446; W. Bloch y col., 1997, Prostate, 33:1-8).
Resumen de la invención
La invención reivindicada se define en la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas se reivindican en las reivindicaciones dependientes.
Los objetos y ventajas adicionales que proporciona la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y ejemplos en lo sucesivo.
Descripción de los dibujos
Los dibujos de las figuras adjuntos se presentan para describir mejor la invención y ayudar a su entendimiento mediante la clarificación de sus diferentes aspectos.
las figs. 1A-1I presentan análisis de microscopía óptica y de fluorescencia de tejido uretral y de cuello, que demuestran la persistencia de los mioblastos inyectados que llevan el gen de \beta-galactosidasa y producen \beta-galactosidasa, es decir lacZ (manchas azules) y microesferas de látex fluorescente (verde fluorescente). Se muestran los aumentos crecientes (de 40x a 100x) de la misma muestra, siendo las figuras 1A, 1D y 1G las que tienen los menores aumentos, y las figuras 1C, 1F y 1 I las que tienen los mayores aumentos. Las Figs 1A-1C representan la inyección de mioblastos en el cuello de la vejiga. Las Figs 1D-1F representan la inyección uretral de mioblastos. Las Figs. 1G-11 representan la inyección uretral de mioblastos usando una técnica de tinción doble en la que se pueden visualizar tanto la tinción de lacZ (azul) como el marcaje de las microsferas de látex fluorescentes (verde fluorescente). Se observan muchas miofibras regenerativas que expresan \beta-galactosidasa en la pared de la uretra y del cuello de la vejiga. Hay muchas formas grandes y desorganizadas de miofibras entremezcladas con microsferas de látex fluorescentes. Se usó tinción de tejido con hematoxilina-eosina (H y E);
la fig. 2 muestra un aumento alto (es decir, 100x) de la inyección de mioblastos en la pared uretral como se muestran en la Fig. 1I. Se ven los mioblastos transducidos, miotubos y miofibras que expresan \beta-galactosidasa (color azul, flechas) en la pared uretral cerca del epitelio uretral (cabezas de flechas). Se usó la tinción con H y E;
las figs. 3A-3F muestra los resultados de la transducción de mioblastos frente a células sinoviales in vitro (Ejemplo 9). Las células sinoviales (Figs. 3A, 3B) y los mioblastos (Figs. 3C, 3D) son de líneas celulares hechas crecer en cultivo. Ambas líneas celulares se infectaron con un vector adenovírico que llevaba el gen indicador LacZ usando una multiplicidad de infección similar (MDI = 25). La expresión de \beta-galactosidasa por ambos tipos de células se observó usando histoquímica de LacZ a los 2 días (Figs. 3A, 3C) y 6 días (Figs. 3B, 3D) después de infección. Se mostró que los mioblastos transducidos conservaban su capacidad para diferenciarse en miotubos que expresaban \beta-galactosidasa (Fig. 3D). La inmunofluorescencia para desmina de los cultivos de mioblastos indicaba la presencia de múltiples miotubos plurnucleados y largos, cuando los mioblastos se dejaron diferenciar usando medio de fusión (Fig. 3E). La cantidad de producción de \beta-galactosidasa por los cuatro cultivos de células diferentes 2 días después de la infección se cuantificó usando en ensayo de LacZ. Los mioblastos inmortalizados produjeron casi 5 veces más \beta-galactosidasa de lo que hicieron los mioblastos primarios, las células sinoviales primarias y las células sinoviales inmortalizadas. Aumentos de A-E: 10x;
la fig. 4 muestra la producción de proteína agonista del receptor de interleuquina 1 (IRAP) (ng/ml/10^{6} células, medido por ELISA) después de usar células sinoviales (syn) o mioblastos (myo) transducidos con vector adenovírico que llevaba el gen que codifica la IRAP (ad-IRAP) para infectar la articulación de conejo. La figura se proporciona sólo con propósito informativo;
las figs 5A-5D muestran los resultados de la transferencia de genes ex vivo mediada por mioblastos en meniscos de conejo. Se inyectaron mioblastos transducidos con un vector adenovírico que llevaba el gen que codifica la \beta-galactosidasa (LacZ);
las figs. 5A y 5B muestran la expresión de LacZ en el menisco después de inyección y expresión de \beta-galactosidasa;
la fig. 5C muestra que la tinción de LacZ está colocalizada con las microsferas de látex fluorescentes en la zona inyectada. La Fig. 5D muestra la expresión de desmina, un marcador miógeno (verde fluorescente) que muestra la presencia de células musculares en el menisco. Las figuras se proporcionan sólo con propósito informativo;
las figs. 6A-6D muestran los resultados de la transferencia de genes ex vivo mediada por mioblastos en ligamento de conejo. Se inyectaron mioblastos transducidos con un vector adenovírico que llevaba el gen que codifica la \beta-galactosidasa (LacZ) en el ligamento de conejo;
las figs. 6A y 6B muestran la expresión de LacZ en el ligamento después de inyección y expresión de \beta-galactosidasa;
la fig. 6C muestra que la tinción de LacZ está colocalizada con las microsferas de látex fluorescentes en la zona inyectada. La fig. 6D muestra la expresión de desmina, un marcador miógeno (verde fluorescente) que muestra la presencia de células musculares en el ligamento. Las figuras se proporcionan sólo con propósito informativo;
las figs. 7A-7H representan la caracterización de la supervivencia de diferentes poblaciones de células derivadas de músculo después de transplante en músculo esquelético. La inyección de células derivadas de músculo obtenidas después de la presiembra nº 1 se perdió rápidamente 48 horas después de inyección (Fig. 7A): se midió sólo 17% de expresión del transgén LacZ presente en los mioblastos inyectados antes de inyección, en el músculo inyectado. Las células aisladas en la presiembra nº 2 (Fig. 7E) condujeron a 55% de pérdida de mioblastos; la presiembra nº 3 (Fig. 7B) a 12% de pérdida; y la presiembra nº 6 (Fig. 7F) a 124% de ganancia en el nivel de expresión del transgén en las células antes de transplante. Se observó una pérdida de 96% de la población de mioblastos puros aislados de las miofibras a las 48 horas después de transplante (mioblastos de fibra, FMb, Fig. 7C). Igualmente, la línea celular de mioblastos mdx inmortalizados mostró pérdida de células después de transplante: se observó 93% del nivel de expresión del transgén presente en el cultivo celular después de implantación, 2 días después de inyección (línea celular Mdx, Fig. 7G). Las PP nº 3 y PP nº 6 (Figs. 7D y 7H) presentan una mejor supervivencia celular a los 2 días después de inyección, aunque se observa una disminución de la cantidad de gen indicador LacZ en el músculo inyectado a los 5 días después de inyección. Sin embargo, las células que presentaban una mejor supervivencia (PP nº 3 y PP nº 6) permanecieron con un nivel mayor de transferencia de genes a los 5 días después de inyección. "*" indica una diferencia significativa (P<0,05) cuando se comparaba con mioblastos transducidos no inyectados (0 horas). Las figuras se proporcionan sólo con propósito informativo;
las figs. 8A-8D muestran la capacidad de los mioblastos transformados que expresan sustancia antiinflamatoria IRAP para evitar la baja supervivencia de las células inyectadas. La supervivencia de los mioblastos transformados para expresar la proteína antagonista del receptor de interleuquina 1 (IL-1Ra) (Fig. 8B) se comparó con las células de control no transformadas (Fig. 8A). Las células no transformadas se perdieron rápidamente a las 48 horas después de inyección (mioblastos de control). En contraste, las células transformadas para expresar IL-1Ra redujeron significativamente la pérdida temprana de las células inyectadas (mioblastos que expresan IL-1Ra): sólo se perdieron el 20% de las células inyectadas a las 48 horas después de inyección. Sin embargo, se observó una reducción significativa de la cantidad de expresión de \beta-galactosidasa a las 24 horas después de inyección comparado con los mioblastos no inyectados. Persistía un gran número de miofibras transducidas entre el día 2 y el día 5 después de inyección (Figs. 8C, 8D). La ausencia de una diferencia significativa para ambas poblaciones de células a las 0 y 0,5 horas después de inyección, sugería que la pérdida de mioblastos era mínima durante la inyección. "*" indica una diferencia significativa (P<0,05) comparado con mioblastos transducidos no inyectados (0 horas). Las figuras se proporcionan sólo con propósito informativo;
la fig. 9 presenta los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), U/l, después de estimular diferentes poblaciones de células derivadas de músculo (pp1-pp6) con proteína osteógena BMP-2, t=30 minutos. Los tipos de células son células de estroma (control) y células presembradas (pp) nº 1, 2, 3, 5 y 6 como se describe. Las pp nº 6 corresponden a BMP-2 que producen fosfatasa alcalina en una forma dependiente de la dosis y con un nivel similar al observado con las células de estroma (SC);
la fig. 10 presenta el porcentaje de células positivas para desmina después de diferentes números de dosis (100 ng/ml) de BMP-2. Se observó que la estimulación de BMP-2 no sólo aumentaba el nivel de expresión de la fosfatasa alcalina por las células derivadas de músculo, si no que también disminuía el número de células positivas para desmina en la población de células derivadas de músculo;
la fig. 11 muestra que las células derivadas de músculo inyectadas (PP nº 6) estimuladas con BMP-2 e insertadas en un dispositivo de inmunoaislamiento de Theracyte (descrito en el Ejemplo 1) que se implantaron por vía subcutánea son capaces de participar en la formación de hueso como se ve por la reacción de von Kossa (mineralización) y con hematoxilina/eosina. Estos resultados sugieren que las células derivadas de músculo son capaces de formar hueso. La figura se proporciona sólo con propósito informativo;
la fig. 12 muestra una representación esquemática de la construcción de un plásmido lanzadera para construir un virus adenoasociado para llevar la expresión de IGF-1 (lesiones musculares), VEGF (curación de hueso y cartílago) y BMP-2 (curación de hueso y cartílago). El plásmido lanzadera, denominado pXX-UF1, se usa para construir un virus adenoasociado.
la fig. 13 muestra los resultados del uso de una biopsia muscular para la curación de cartílago. En los marcos mostrados en la fig. 13, la biopsia de músculo se ve que encierra el defecto del cartílago a las 3 semanas después de inyección, y es evidente la formación de músculo y cartílago. Por lo tanto, la biopsia de músculo se puede usar como armazón biológico para suministrar factores de crecimiento, así como una fuente de células derivadas de músculo pluripotentes para mejorar la curación del defecto del cartílago. En esta figura, "M" representa músculo, mientras que "C" representa cartílago. La figura se proporciona sólo con propósito informativo;
las figs. 14A-14C muestra los resultados de la transferencia de genes ex vivo mediada por mioblastos a cartílago de conejo. Se inyectaron mioblastos transducidos con un vector adenovírico que llevaba el gen que codifica la \beta-galactosidasa (LacZ) en cartílago de conejo. Las Figs. 14A y 14B muestran la expresión de desmina, un marcador miógeno (verde fluorescente), que revela la presencia de células musculares en el cartílago. La Fig. 14C muestra la expresión de \beta-galactosidasa en el cartílago inyectado con mioblastos transducidos con adenovirus que llevan la expresión de \beta-galactosidasa. Las figuras se proporcionan sólo con propósito informativo;
las figs. 15A-15C muestra los resultados de la inyección de células primarias derivadas de músculo, en el tracto urinario inferior (Ejemplo 4). Se inyectaron mioblastos transducidos con un vector adenovírico que llevaba el gen que codifica la \beta-galactosidasa (LacZ) en la vejiga y uretra de ratón. La fig. 15A muestra la persistencia de 6 meses después de inyección sin daño en la pared de la vejiga. La Fig. 15B muestra los ensayos para la \beta-galactosidasa en la vejiga inyectada que se mantiene aproximadamente en un 66% después de 70 días. La Fig. 15C muestra la sección transversal de una uretra de rata. La inyección de células primarias derivadas de músculo de rata dio como resultado un gran efecto de carga en la pared de la uretra.
Descripción detallada de la invención
En el presente documento se describen células derivadas de músculo transformadas genéticamente que contienen al menos un ácido nucleico heterólogo (es decir, exógeno a las células musculares) que codifica un producto génico deseado, tal como una proteína, polipéptido, péptido, hormona, metabolito, enzima o un factor trófico, incluyendo citoquinas, en el que el o los productos génicos son expresados de una forma sostenida en las células, y son suministrados terapéuticamente por las células transformadas a un punto de un tejido u órgano para promover la curación después de lesión, o remediar una disfunción de un órgano o tejido localizado. Los tejidos y órganos adecuados para el suministro de genes mediado por células derivadas de músculo, incluyen el sistema musculoesquelético (p. ej., articulación), hueso, y sistema urogenital (p. ej., uretra, vejiga, esfínter).
Dichas células derivadas de músculo genéticamente transformadas, p. ej., mioblastos, pueden mejorar y expandir el tratamiento de varios tipos de disfunción de la vejiga incluyendo la contractilidad deteriorada de la vejiga. La presente invención proporciona por primera vez, el uso de células de músculo esquelético en la preparación de un medicamento para la reparación de la disfunción muscular lisa del tracto urinario.
Mediante este medicamento es posible un tratamiento nuevo y revolucionario para la incontinencia urinaria causada por el deterioro o disfunción de la uretra y la vejiga. Los hombres y mujeres aquejados de incontinencia de esfuerzo se tratan usando inyección de células autólogas derivadas de músculo (es decir, tal como mioblastos, recogidos del paciente) para construir y sostener el esfínter urinario. La presente invención se refiere a células derivadas de músculo inyectadas en la pared de la vejiga como una técnica de mioplastia celular para mejorar la contractilidad del detrusor; y también se describe la expresión mediada por células derivadas de músculo de la óxido nítrico sintasa (NOS) como terapia génica para el tratamiento de la disfunción del tracto urinario inferior.
En la presente invención se pretenden usar mioblastos esqueléticos de músculo esquelético, en particular para usar en la reparación de la disfunción muscular lisa en el tracto urinario.
De acuerdo con la presente invención. Las células derivadas de músculo, incluyendo mioblastos, pueden ser células primarias, células cultivadas o clonadas. Estas células son histocompatibles (por ejemplo son autólogas) con el receptor, que incluye seres humanos. Dichas células en general pueden estar genéticamente transformadas para llevar genes específicos que codifican productos génicos particulares y/o fármacos.
Las células en la presente invención son mioblastos y más preferido son mioblastos autólogos que no serán reconocidos como extraños para el receptor. En relación con esto, los mioblastos que se pueden usar para el suministro o transferencia de genes mediada por células se emparejarán convenientemente con respecto al sitio principal de histocompatibilidad (MHC o HLA en seres humanos). Dichas células emparejadas con MHC o HLA pueden ser autólogas. Alternativamente, las células pueden 
\hbox{ser de una persona que tiene el mismo
o similar perfil  de antígeno de MHC o HLA.}
Los mioblastos, las células musculares mononucleadas, son excepcionalmente diferentes de otras células en el cuerpo en una serie de formas: i) los mioblastos se diferencian naturalemente para formar túbulos musculares capaces de contracción muscular, 2) cuando los mioblastos se fusionan para formar miotubos, estas células se convierten en post-mitóticas (dejan de dividirse) con maduración, permitiendo esto el control del número y cantidad de mioblastos por inyección, y 3) como miotubos, las células expresan grandes cantidades de proteína que es producida en las células debido a la multinucleación.
Los mioblastos derivados de músculo pueden transformarse genéticamente por una variedad de técnicas moleculares y procedimientos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, por transfección, infección o transducción. La transducción, tal como se usa en el presente documento, se refiere a células que se han transformado genéticamente para contener un gen extraño o heterólogo por introducción de un vector vírico en las células. Los mioblastos derivados de músculo se pueden transducir mediante diferentes vectores víricos y por lo tanto pueden servir como vehículos de suministro de genes para transferir proteínas expresadas al músculo.
Aunque se prefieren los vectores víricos, los expertos en la materia observarán que la transformación genética de las células para que contengan secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas o polipéptidos, citoquinas y similares deseados, se puede llevar a cabo por procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.538.722, que incluyen fusión, transfección, lipofección mediada por el uso de liposomas, electroporación, precipitación con DEAE-dextrano o fosfato cálcico, bombardeo de partículas (biolística) con partículas recubiertas con ácido nucleico (p. ej., partículas de oro), microinyección, y similares.
También se describen vehículos o construcciones de vectores para introducir ácido nucleico (ADN o ARN) heterólogo (es decir, extraño), o un segmento de ácido nucleico que codifica un producto bioactivo funcional, en células derivadas de músculo, en los que los vectores comprenden una secuencia de ácido nucleico leída en la fase correcta para la expresión. Por supuesto, dichos vectores o vehículos tendrán una secuencia promotora, ventajosamente puesta secuencia arriba de la secuencia que se va a expresar. Los vectores también pueden contener, opcionalmente, uno o más genes marcadores para la expresión como una indicación de la transfección satisfactoria y expresión de las secuencias de ácido nucleico contenidas en el vector. Par asegurar la expresión, los vectores contienen una secuencia promotora para la unión de la ARN polimerasa celular adecuada, que dependerá de la célula en la que se ha introducido el vector. Por ejemplo, el promotor para la expresión en células derivadas de músculo, tales como mioblastos, es una secuencia promotora a la que se unirán las ARN polimerasas celulares.
Los ejemplos ilustrativos de vehículos o construcciones de vectores para la transfección o infección de células derivadas de músculo incluyen vectores víricos de replicación defectuosa, vectores de virus de ADN o virus de ARN (retrovirus), tales como adenovirus, virus herpes simplex y vectores víricos adenoasociados. Los vectores víricos adenoasociados son monocatenarios y permiten el suministro eficaz de múltiples copias del ácido nucleico a los núcleos de las células. Se prefieren los vectores adenovíricos. Normalmente los vectores no tendrán sustancialmente ningún ADN procariota y pueden comprender una serie de diferentes secuencias funcionales de ácido nucleico. Un ejemplo de dichas secuencias funcionales puede ser una región de ADN que comprende secuencias reguladoras de inicio y terminación de la transcripción y la traducción, que incluyen promotores (p. ej., promotores fuertes, promotores inducibles, y similares) y potenciadores que son activos en las células musculares. También está incluido como parte de las secuencias funcionales, un marco de lectura abierto que codifica una proteína de interés, y también pueden comprender secuencias flanqueadoras para la integración dirigida al sitio. Como ejemplo particular, en algunas situaciones, la secuencia 5'-flanqueadora permitirá la recombinación homóloga, cambiando así la naturaleza de la región de inicio de la transcripción, para proporcionar así transcripción inducible o no inducible para aumentar o disminuir el nivel de transcripción, como un ejemplo.
En general, el ácido nucleico que se desea que exprese la célula derivada de músculo es el de un gen estructural, o un fragmento, segmento o porción funcional del gen, que es heterólogo para la célula derivada de músculo y codifica una proteína o producto polipeptídico deseado, por ejemplo. El producto codificado y expresado puede ser intracelular, es decir retenido en el citoplasma, núcleo o un orgánulo de una célula, o puede ser secretado por la célula. Para la secreción, puede retenerse la secuencia señal natural presente en el gen estructural, o se puede usar una secuencia señal que no está naturalmente presente en el gen estructural. Cuando el polipéptido o péptido es un fragmento de una proteína que es más larga, se puede proporcionar una secuencia señal de modo que tras la secreción y procesamiento en el sitio del procesamiento, la proteína deseada tendrá la secuencia natural. Los ejemplos más específicos de genes de interés para usar de acuerdo con la presente invención, incluyen los genes que codifican la óxido nítrico sintasa; factores tróficos, incluyendo factores de crecimiento y citoquinas, tales como factores de crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos (bFGF y aFGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-\alpha), factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y similares; hormonas; productos metabólicos, en general de peso molecular bajo; productos difundibles; proteínas del suero; proteínas osteógenas, p. ej., BMP-2.
Como se ha mencionado antes, puede estar presente un marcador para la selección de células que contienen la construcción del vector. El marcador puede ser un gen inducible o no inducible y normalmente permitirá la selección positiva con inducción, o sin inducción, respectivamente. Los ejemplos de genes marcadores incluyen neomicina, dihidrofolato reductasa, LacZ, y similares.
El vector usado en general también incluirá un origen de replicación y otros genes que son necesarios para la replicación en las células huésped, usados de forma rutinaria por los expertos en la materia. Como un ejemplo, se puede incluir como parte de la construcción el sistema de replicación que comprende el origen de replicación y cualesquiera proteínas asociadas con la replicación codificada por un virus particular. Como advertencia, el sistema de replicación debe seleccionarse de modo que los genes que codifican productos necesarios para la replicación no transformen finalmente las células derivadas de músculo. Dichos sistemas de replicación están representados por adenovirus de replicación defectuosa construidos como describen G. Acsadi y col., 1994, Human Mol. Genetics, 3(4):579-584, y por virus Epstein-Barr. Los ejemplos de vectores de replicación defectuosa, en particular vectores de retrovirus que son de replicación defectuosa, son BAG, descrito por Price y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:156; y Sanes y col., 1986, EMBO J., 5:3133. Se entenderá que la construcción del gen final puede contener uno o más genes de interés, por ejemplo, un gen que codifica una molécula metabólica bioactiva, p. ej., NOS, iNOS o NO, y un gen que codifica una citoquina, p. ej., bFGF, junto con las secuencias que permiten la expresión y producción adecuadas de los productos génicos por las células transformadas. Además, se puede usar ADNc, ADN producido sintéticamente o ADN cromosómico, usando procedimientos y protocolos conocidos y practicados por los expertos en la materia.
Si se desea, se pueden usar vectores de virus de replicación defectuosa para la transformación genética de células antes de la inyección in vivo de las células. En relación con a esto, los vectores se pueden introducir en células productoras de retrovirus para el empaquetamiento amfotrófico. La expresión natural de células derivadas de músculos, tales como mioblastos, en regiones adyacentes obvia un gran número de inyecciones en las fibras musculares en el o los sitios de interés.
En una realización de la presente invención, las células derivadas de músculo son transducidas con ácido nucleico que codifica un producto génico particular, p. ej., un gen que codifica la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Las células derivadas de músculo transducidas, que contienen, expresan y producen el producto iNOS, se usan en técnicas de terapia génica o transplante mediado por células, para el tratamiento de la disfunción del tracto genitourinario. Los ejemplos de disfunción del tracto urinario inferior incluyen, pero no se limitan a la disfunción eréctil del pene, enfermedad de Peyronie del pene; disfunción de vaciado; disfunciones de la vejiga tales como contractilidad deteriorada de la vejiga, vejiga neurogénica, cistitis y enfermedad inflamatoria de la vejiga; y disfunción sexual femenina y de los órganos reproductivos, tales como la vagina, cuello de útero, útero, trompas de falopio y ovarios.
También se pueden contransducir las mismas o diferentes células derivadas de músculo con ácidos nucleicos heterólogos que codifican factores tróficos cuya expresión en y producción por las células derivadas de músculo ayuda a lograr y/o potenciar los usos terapéuticos de las células derivadas de músculo transducidas en la terapia génica mediada por células. Preferiblemente se usan los factores tróficos tales como las citoquinas. Más específicamente, las citoquinas útiles incluyen las presentadas en lo sucesivo, entre las cuales están el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento nervioso (NGF) e interleuquinas, tales como IL-1 e IL-6.
Las células derivadas de músculo transformadas para contener ácido nucleico que codifica uno o más factores tróficos, se pueden administrar como un tratamiento al mismo tiempo que las células derivadas de músculo que contienen ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica o una molécula bioactiva, tal como una proteína, polipéptido, péptido, hormona, metabolito, fármaco, enzimas y similares. Alternativamente, las células derivadas de músculo transformadas para expresar factores tróficos se pueden administrar antes o más tarde dependiendo del tipo de tratamiento deseado.
En general, una inyección de células derivadas de músculo transformadas genéticamente, incluyendo mioblastos y células madre derivadas de músculo, en un tejido dado o sitio de lesión, comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células en solución o suspensión, preferiblemente, aproximadamente 10^{5} a 10^{6} células por cm^{3} de tejido que se va a tratar, en un medio fisiológicamente aceptable, tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato, y similares.
También se describe el suministro de genes ex vivo a células y tejidos de un huésped mamífero receptor, incluyendo seres humanos, mediante el uso de células derivadas de músculo, p. ej., mioblastos, que se han transducido con virus usando un vector adenovírico transformado para contener un gen heterólogo que codifica un producto génico deseado. Dicho procedimiento ex vivo proporciona la ventaja de la transferencia vírica de gen eficaz, que en los casos de tratamiento de disfunción y defectos relacionados con músculos como se describen en el presente documento, es superior a los procedimientos de transferencia de genes directa. El procedimiento ex vivo implica el establecimiento de un cultivo primario de células derivadas de músculo de células aisladas de tejido muscular. La biopsia de músculo que servirá como fuente de células derivadas de músculo, se puede obtener del sitio de la lesión o de otra zona de la que el cirujano la pueda obtener más fácilmente.
Las células derivadas de músculo primero se infectan con vectores víricos transformados que contienen al menos un gen heterólogo que codifica un producto génico deseado, y después se inyectan en el mismo huésped. En el caso de mioblastos, como ejemplo, las células derivadas de músculo isógenas, transducidas e inyectadas después se fusionan para formar miotubos en y cerca del sitio de inyección. El producto génico deseado es expresado por las células inyectadas que así introducen el producto génico en el tejido inyectado, p. ej., el músculo. Los productos génicos introducidos pueden promover y potenciar la regeneración muscular y la fuerza muscular in vivo para mejorar la curación muscular después de lesiones.
La inyección de células derivadas de músculo, preferiblemente inyección de mioblastos autólogos, en la pared uretral se usa como un tratamiento para la incontinencia urinaria de esfuerzo, para potenciar, mejorar y/o reparar el esfínter urinario. Las células derivadas de músculo, preferiblemente mioblastos, que llevan uno o más ácidos nucleicos heterólogos transducidos o transfectados que codifican una molécula bioactiva y/o un factor trófico, son inyectadas en la pared de la uretra y sobreviven y se diferencian en miofibras para mejorar la función del esfínter. La viabilidad y supervivencia de la inyección de mioblastos en la pared de la uretra se demuestra en el Ejemplo 2. De acuerdo con esta realización, las inyecciones de células autólogas derivadas de músculo (es decir, células derivadas de músculo recogidas de y cultivadas para un paciente específico con incontinencia urinaria) se pueden usar como un agente no alergeno para cargar la pared uretral, potenciando así la coaptación y mejora del músculo del esfínter urinario.
En otra realización de la presente invención, se inyectan células derivadas de músculo en la pared de la vejiga para mejorar la contractilidad del detrusor. Las células derivadas de músculo, tales como los mioblastos, inyectadas en la pared de la vejiga son capaces de supervivir y diferenciarse en miofibras que pueden aumentar la contractilidad del detrusor, como se demuestra en el Ejemplo 3. Además, las células derivadas de músculo que se han transformado genéticamente para llevar un gen extraño, expresan el producto del gen extraño después de inyección en la pared de la vejiga.
De acuerdo con la presente invención, las células derivadas de músculo autólogas administradas directamente en la vejiga y la uretra presentan supervivencia a largo plazo. El uso de la terapia génica mediada por células que implica células derivadas de músculo transformadas genéticamente, es ventajoso frente al uso de otras formas de terapia génica, es decir, terapias génicas que implican la administración directa de virus o vectores plasmídicos, por ejemplo. Como un ejemplo, el tipo de células derivadas de músculo puede contribuir a la supervivencia de las células inyectadas después de transplante. En relación con esto, pueden cosecharse mioblastos primarios autólogos y los mioblastos cultivados pueden almacenarse y usarse en cantidades suficientes para las inyecciones de uretra y vejiga repetidas. La inyección de mioblastos autólogos da como resultado la supervivencia segura y no inmunógena a largo plazo de miofibras en el tracto urinario inferior (véase el Ejemplo 4 y Figuras 15A-15C).
La terapia génica mediada por células derivadas de músculo de la presente invención, implica además células derivadas de músculo, p. ej., mioblastos, transducidos con un vector adenovirus que lleva el gen de bFGF, permitiendo así la expresión del bFGF por las células derivadas de músculo transducidas en un tejido dado. Las células derivadas de músculo transformadas con bFGF se inyectan en la uretra para tratar la incontinencia de esfuerzo y también en la pared de la vejiga para mejorar la contractilidad del detrusor. La inyección de células derivadas de músculo transformadas con bFGF permite la mejora de la supervivencia y la función frente a células derivadas de músculo no transformadas. Después de experimentos a corto plazo, se llevaron a cabo experimentos a largo plazo usando la inyección de mioblastos-bFGF primarios autólogos en la vejiga y la uretra en los días 4, 14 y 30, como se describe en el Ejemplo 6. La terapia génica mediada por células que usa mioblastos transducidos que segregan el factor trófico bFGF, proporcionaba una mejora del éxito en la superación de disfunciones en la uretra y la vejiga comparado con mioblastos que no segregaban bFGF.
Se pueden introducir vectores adenovíricos que llevan el gen de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en células derivadas de músculo y las células transducidas resultantes se usan en terapia génica mediada por células. Cuando dichas células derivadas de músculo transducidas se administrar localmente en la uretra o la vejiga, se demuestran modificaciones funcionales espectaculares, p. ej., disminución de la inflamación de la vejiga y mejora de la relajación uretral (véase el Ejemplo 7). La terapia génica mediada por células derivadas de músculo transformadas con iNOS en la vejiga proporcionaba una disminución de la inflamación de la vejiga. Además, se demostró que la inyección de mioblastos transformados con iNOS en la uretra era útil para disminuir la obstrucción de la salida uretral. La terapia génica con iNOS mediada por mioblastos dio como resultados un aumento de la producción local de NO en el tejido inyectado. La terapia génica con iNOS en la vejiga también disminuyó la respuesta inflamatoria de la vejiga inducida por ciclofosfamida (CYP). La terapia génica con iNOS en la uretra además inducía la relajación de músculo listo uretral sostenida, como se describe en el Ejemplo 7.
Un gran porcentaje de las células aisladas de una biopsia de músculo esquelético son mioblastos, mientras que sólo el 1 a 2% de las células de la médula ósea tienen capacidad osteógena. Los mioblastos en cultivo celular se pueden purificar más usando una tecnología establecida (T.A. Rando y H.M. Blau, 1994, J. Cell. Biol., 125:1275-1287) y las células musculares son relativamente fáciles de cultivar in vitro; se pueden hacer crecer millones de células en unos pocos días.
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Ejemplos
Los ejemplos presentados en el presente documento son para ilustrar los diferentes aspectos de la presente invención y no se pretende que limiten la invención de ninguna forma.
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Ejemplo 1
Materiales y procedimientos
Los materiales y procedimientos descritos en el Ejemplo 1 están relacionados con la descripción de la invención y los otros ejemplos se exponen en lo sucesivo.
Animales e inyección de mioblastos: Se usaron ratas hembra Sprague Dawley (S.D.) adultas (Hilltop Laboratories, Pittsburgh, PA), que pesaban aproximadamente 250 g, en los experimentos descritos. Sólo se usaron animales certificados sin virus. Los animales se albergaron en una instalación P-2 de terapia génica con virus aprobada en la University of Pittsburgh Medical Center. Se siguió una estricta observancia del protocolo P-2. Los animales se anestesiaron con pentobarbital (50 mg/kg) para recoger mioblastos, la inyección de mioblastos y durante la medición de la presión de la vejiga.
Después de la preparación quirúrgica, se hizo una incisión en la línea media inferior para exponer la vejiga y la uretra proximal. Durante la inyección usando una jeringa Hamilton, se inyectaron 10-20 microlitros (\mul) de suspensión de mioblastos (aproximadamente 1-2 x 10^{6} células por 10 \mul) en la vejiga o la submucosa uretral proximal dorsal de loa animales experimentales (Grupo 1) en dos sitios. Se inyectó en los mismos sitios en todos los animales. A los animales de control (Grupo 2) se les inyectó un volumen igual de solución salina estéril. Durante la primera semana después de la implantación, se siguió atentamente cualquier suceso adverso en los animales.
Modelo de lesión criogénica: Se usó una varilla de aluminio de 8 mm de diámetro (Harvard Scientitic) como sonda criogénica para producir una lesión en la pared de la uretra o vejiga de grosor completo sin producir la rotura de la vejiga. La sonda criogénica se puso en hielo seco durante 1 minuto y después se puso inmediatamente contra la pared de la vejiga o la pared de la uretra durante 10 segundos sin producir la rotura de la vejiga, como se determinó por histología. Se encontró que este procedimiento producía una lesión transmural fiable y reproducible. En los animales con tratamiento simulado, la sonda criogénica se puso contra el tejido a temperatura ambiente. Para la lesión de la vejiga, la vejiga se llenó con 1 ml de volumen usando solución salina estéril por un catéter uretral. Cada vejiga se lesionó en un sitio (cúpula vesical). La inyección de mioblastos se hizo 15 minutos después de la lesión criogénica o lesión simulada en el sitio de la lesión. La lesión uretral se llevó a cabo en la posición ventral de las 12 en punto de la uretra proximal con el cuello de la vejiga como límite superior.
Medición de la pauta de micción: Los perfiles de la pauta de micción se obtuvieron usando una jaula metabólica especializada que desvía la orina evacuada para recogerla y cuantificarla a lo largo de un periodo de 24 horas. Los parámetros de micción evaluados en los experimentos descritos incluían la producción total de orina/24 horas, el número de micciones/24 horas y el volumen medio por micción (M.D. Chancellor y col., 1994, J. Urol., 151:250-254; T. Watanabe y col., 1996, J. Urol., 156:1507-1510).
La orina desviada se recogió en una copa puesta en un transductor extensómetro (Grass, F3) conectado a un preamplificador del extensómetro (Word Precision Instruments, Saratoga, FL). Los datos se introdujeron en un sistema de adquisición de datos: la adquisición de datos se hizo en una tarjeta AD (DATAQ) puesta en un ordenador Gateway 2000. Se instalaron en el ordenador un software de adquisición de datos (es decir, DI-200, DATAQ) y un software de reproducción (es decir, WindaqEx) adecuados.
Cistometograma (CMG): Se llevó a cabo el CMG (es decir, medición de la inyección uretral de mioblastos; medición de inyección vesical de mioblastos y medición de la presión uretral) bajo anestesia con uretano (2,4 mg/kg^{2}). Las técnicas específicas del CMG para la inyección uretral y vesical se describen a continuación.
Medición de la inyección uretral de mioblastos: La vejiga se canuló usando un catéter p-50 puesto a través del sitio de punción en la cúpula vesical y se fijó con una ligadura de seda. Este catéter se conectó a un conector en Y, y tanto a una bomba de infusión Harvard como a un polígrafo Grass. La evaluación urodinámica por infusión continua se llevó a cabo con un caudal de carga constante de 0,075 ml/min usando una bomba Harvard. Se determinaron el volumen de la capacidad de la vejiga, la presión máxima de evacuación y el volumen de orina residual.
Medición de la inyección vesical de mioblastos: La vejiga se canuló usando un catéter p-50 puesto por la uretra. Este catéter se conectó a un conector en Y, y tanto a una bomba de infusión Harvard como a un polígrafo Grass. La evaluación urodinámica por infusión continua se llevó a cabo con un caudal de carga constante de 0,075 ml/min, usando una bomba Harvard. Se determinaron el volumen de la capacidad de la vejiga, la presión máxima de evacuación y el volumen de orina residual. Se canuló la uretra como se describe en los experimentos, en lugar de la vejiga como se ha resumido en la medición de la inyección uretral de mioblastos, para así no alterar la función de la
vejiga.
Medición de la presión uretral: La presión de perfusión uretral y la presión vesical isovolumétrica se midieron con catéteres insertados a través de la cúpula vesical en ratas hembra S.D. anestesiadas con uretano. El montaje de catéter descrito previamente (H. Kakizaki y col., 1997, Am. J. Physiol., 272:R1647-1656) se aseguró en el cuello de la vejiga para bloquear el paso de fluido entre la vejiga y la uretra sin afectar al suministro nervioso de los órganos. La uretra externa no se cateterizó. Las respuestas se examinaron a una velocidad de infusión salina uretral de 0,075 ml/min.
Se preparó como sigue una perfusión intrauretral transvesical de doble lumen y catéter de registro de presión: Se construyó un catéter de vejiga de doble lumen de tubo de PE 200 (lumen exterior, de extremo libre ensanchado con llama) y tubo de PE 50 (lumen interior). El tubo de PE 200 se conectó a una jeringuilla para llenar la vejiga y el tubo de PE 50 se conecto a un transductor de presión. Ambos tubos también se podían conectar, mediante llaves de paso, a un sistema de bomba peristáltica puesta para el intercambio de fluido isovolumétrico como un procedimiento para el suministro de fármaco intravesical.
Se construyó un catéter uretral de doble lumen de tubo de PE 160 (lumen exterior) y tubo de PE 50 (lumen interior). El tubo de PE 160 se equipó con una punta de pipeta en un extremo y se conectó a una bomba de infusión para la perfusión intrauretral de solución salina o de solución de fármaco. El lumen interior de tubo de PE 50 se extendía pasando ligeramente el lumen exterior, pero permanecía dentro de la punta de la pipeta. El otro extremo se conectó a un transductor de presión para la medición de la presión de perfusión intrauretral.
El sistema de catéter uretral se pasó por la cúpula vesical y se ajustó bien en el cuello de la vejiga. Los catéteres tanto de la vejiga como de la uretra se fijaron en el sitio en la cúpula vesical con sutura.
Medición de la contracción de las tiras de vejiga y uretra provocadas por estimulación eléctrica
La vejiga y la uretra se sacaron rápidamente del abdomen después de decapitación. Se preparó una tira longitudinal a partir de cada vejiga y se preparó una tira espiral a partir de la uretra. Las preparaciones se montaron en baños de órganos de 5 ml que contenían solución de Krebs (mmol/l: NaCl 113, KCl 4,7, CaCl_{2} 1,25, MgSO_{4} 1,2, NaHCO_{3} 25, KH_{2}PO_{4} 1,2, glucosa 11,5) y con burbujeo continuo con una mezcla de O_{2} al 95% y CO_{2} al 5%. La tensión inicial se fijó a 10 mN y las contracciones isométricas se midieron con transductores extensiómetros acoplados con un amplificador de extensiómetro TBM4 (World Precision Instruments) y se registraron en el ordenador usando un programa de adquisición de datos (Windaq, DATAQ Instruments Inc., Akron, OH, EE.UU.). La velocidad de toma de muestra por canal se fijó a 100 Hz. La amplitud de las contracciones provocadas por estimulación se calculó mediante un programa de cálculo (WindaqEx, DATAQ). Después de 20 minutos de equilibrado, se aplicaron estímulos con campos eléctricos a través de dos electrodos de cable de platino puestos en la parte superior e inferior del baño de órganos, separados 4 cm.
Paradigma de estimulación: Las tiras de vejiga y uretra se estimularon con pulsos de ondas cuadradas de 0,25 ms de duración con voltaje máximo (100 V) y se construyó una curva de respuesta de frecuencia usando 10 y 80 choques a 1, 2, 5, 10, 20 y 40 Hz. Posteriormente, se añadió carbacol 5 y 50 \muM a la preparación de la vejiga para provocar contracciones por activación del receptor muscarínico M3 postsináptico, y se aplicó K^{+} 90 mM para activar directamente el mecanismo contráctil del músculo liso. En las preparaciones uretrales, se aplicó una estimulación de 20 Hz/10 choques para provocar la contracción por la estimulación nerviosa. Posteriormente, se añadió fenilefrina 2 \muM al baño para comprobar las contracciones del músculo liso por la activación postsináptica del receptor adrenérgico alfa-1. Después se usó K^{+} 90 mM para comprobar la sensibilidad del músculo liso a la despolarización
directa.
Modelo de inflamación de la vejiga: Las ratas recibieron una sola inyección intraperitoneal de CYP (100 mg/kg) (Sigma Chemical) para el modelo de inflamación de vejiga. Se inyectaron en las ratas los mioblastos transducidos con adenovirus que llevaban el gen de la iNOS o los mioblastos con tratamiento simulado, en la misma sesión con una corta anestesia con pentobarbital. Los animales de control con tratamiento simulado recibieron inyección de solución salina estéril. Se controló en los animales el modelo de micción durante 4 días antes de los estudios de CMG y se sacrificaron. El tejido de la vejiga se recogió para los estudios de contractilidad y después se procesó para los estudios inmunohistoquímicos.
Modelo de obstrucción uretral: Se usó una modificación de la técnica descrita por B. Uvelius y A. Mattiasson, 1984, J. Urol., 132:587-590 y W.D. Steers y col., 1991, J. Urol., 155:379-385, para crear la obstrucción parcial de la salida de la vejiga.
Brevemente, se sometió a ratas S.D. hembra (aproximadamente 250 gramos) a ligamiento por sutura parcial de la uretra proximal con una corta anestesia con pentobarbital a través de una pequeña incisión en la línea media. El diámetro de la uretra se redujo a 1 mm por ligadura de dos suturas de nailon 4-0 alrededor de la uretra y un tubo de polietileno colocado extraluminal (1 mm D.O.). Después se quitó el tubo y la incisión abdominal se reaproximó. Los animales de control se sometieron a cirugía simulada en la que la uretra se diseccionó de forma circunferencial, pero no se ligó. Se siguieron atentamente en los animales las complicaciones y la incontinencia por rebosamiento. Cuatro semanas después, se inyectaron mioblastos transducidos con una construcción de adenovirus que albergaba el gen que codifica la iNOS humana (mioblasto-iNOS), o solución salina simulada, en los animales con obstrucción y los de control (aproximadamente 8 animales en cada uno de los 4 grupos). Cuatro días después, se siguió en los animales la pauta de micción antes del estudio de CMG y sacrificio. La pauta de micción también se llevó a cabo durante las 24 horas inmediatamente antes de la inyección de mioblastos. Se recogieron el tejido de la uretra y de la vejiga para los estudios de contractilidad y después se procesaron para los estudios inmunohistoquímicos y PCR.
Purificación de mioblastos primarios: Se sacaron las extremidades anteriores y posteriores de ratones neonatales (T.A. Rando y col., 1994, J. Cell Biol., 125:1275-1287; Z. Qu y col., 1998, J. Cell Biol., 142:1257-1267) y se diseccionó el hueso. El resto de la masa muscular se trituró en una suspensión gruesa usando cuchillas de afeitar. Las células musculares se disociaron enzimáticamente por adición de colagenasa de tipo X1 (al 0,2%) durante 1 hora a 37ºC, dispasa (calidad II 240 ml) durante 30 minutos y tripsina (al 0,1%) durante 30 minutos. El extracto de células musculares se presembró en matraces recubiertos con colágeno. Se aislaron diferentes poblaciones de células derivadas de músculo basándose en el número de presiembras realizadas en matraces recubiertos con colágeno. La presiembra nº 1 (PP nº 1) representaba una población de células derivadas de músculo que se adhirieron en la primera hora después del aislamiento; la PP nº 2 representaba una población de células derivadas de músculo que se adhirieron en las siguientes 2 horas; la PP nº 3 representaba una población de células derivadas de músculo que se adhirieron en las siguientes 18 horas; y las posteriores presiembras se obtuvieron a intervalos de 24 horas (PP nº 4-6). Se evaluó la población miógena en cada matraz por tinción de desmina y por la capacidad de diferenciación cuando se cultivaba en un medio de fusión. El medio de proliferación era Ham F10 complementado con suero bovino fetal al 20% y penicilina/estreptimicina al 1%; el medio de fusión era Ham F10 complementado con suero bovino fetal al 2% y solución de antibióticos al 1% (penicilina/estreptomicina). Todos los suministros de los medios de cultivo se adquirieron a través de Gibco, BRL, Gran Island, NY, EE.UU. Los primeros matraces presembrados contenían una mayoría de fibroblastos y el último presembrado estaba muy enriquecido en células miógenas (positivas para desmina).
Las diferentes poblaciones de células se infectaron con adenovirus que expresaba \beta-galactosidasa. El adenovirus, un adenovirus recombinante con E1-E3 suprimidos obtenido generosamente de GeneVec Inc (Dr. I. Kovesdi), tenía el gen indicador de la \beta-galactosidasa bajo control del promotor de citomegalovirus humano (HCMV), seguido del intrón T de SV40 y una señal de poliadenilación (PolyA). Después, las células transducidas con adenovirus se transplantaron al músculo de las extremidades posteriores (gastrocnemio y sóleo) de ratones mdx y se ensayó su supervivencia después de la implantación.
También se obtuvieron mioblastos puros de miofibras viables aisladas como sigue: inmediatamente después de dislocación cervical o decapitación de ratones mdx, se prepararon fibras musculares solas a partir del músculo sóleo o extensor largo de los dedos (EDL) por disgregación enzimática en colagenasa de tipo 1 al 0,2% (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Se usaron las fibras musculares aisladas de 2 días, 15 días, 1 mes, 6 semanas y 6 meses de edad. Debido al pequeño tamaño de los ratones de 1 a 3 días de edad, se sacaron el sóleo y gastrocnemio en bloque de la pierna inferior para la disgregación.
Los músculos del compartimento anterior se prepararon cortando la pierna en las articulaciones del tobillo y la rodilla, y añadiendo la pierna inferior entera a la solución de colagenasa. Después de aislar 200 miofibras por músculo, se sembraron en placa un mínimo de 5-10 miofibras por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con Matrigel 1 mg/ml (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, EE.UU.) en medio 2 ml de medio DMEM que contenía suero de caballo al 10% y extracto de embrión de pollo al 1%, L-glutamina al 2% y penicilina/estreptomicina al 1% (Sigma Co.). Las placas se pusieron en un incubador a 37ºC y CO_{2} al 5% durante varios días. Las células que surgían de las miofibras cultivadas se hicieron crecer hasta confluencia, se ensayó la expresión de desmina, se transdujeron con adenovirus que llevaba el gen indicador LacZ y se ensayó la supervivencia de mioblastos después de implantación de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento.
También se usó una línea de células mdx inmortalizadas. Esta línea celular se aisló de un animal transgénico que llevaba un antógeno T de SV40 termolábil bao el control de un promotor inducible como describen J.E. Morgan y col., 1994, Develop. Biol., 162:486-498. La línea de células mdx inmortalizadas proliferaba indefinidamente en condiciones permisivas (33ºC con interferón gamma) en medio de proliferación (DMEM + FBS al 20%) y experimentaban diferenciación normal a 37-39ºC sin interferón gamma en medio de fusión (DMEM + FBS al 2%).
Vectores adenovíricos: Se han construido vectores adenovíricos que llevan el gen que codifica la \beta-galactosidasa (es decir, adenovirus-lacZ), el gen que codifica bFGF (es decir, adenovirus-bFGF) y el gen que codifica iNOS (es decir, adenovirus-iNOS) como se describe en el presente documento. Se clonó el gen de iNOS y las construcciones de vector se produjeron como describen D.A. Geller y col., 1993, "Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes", Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 90:3491-3495; E. Tzeng y col., 1997, "Adenoviral transfer of the inducible nitric oxide synthase gene blocks endothelial cell apoptosis", Surgery, 122(2):255-263; y E. Tzeng y col., 1996, "Gene Therapy" (Review), Current Problems in Surgery, 33(12): 961 -1041. La construcción molecular de un adenovirus de replicación defectuosa como el usado en el presente documento se describe en G. Ascadi y col., 1994, Human Mol. Genetics, 3(4):579-584. La técnica, que implica construcción, propagación, purificación y valoración de la primera y tercera generación de vector adenovírico, la han descrito S. Kochanek y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5731-5736 y G. Ascadi y col., 1994, Human Mol. Genetics, 3(4):579-584.
El ADNc de iNOS recombinante humano se clonó de hepatocitos humanos cultivados estimulados con citoquina como describen D.A. Geller y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3491-3495. (Secuencia completa de ADNc en GenBank nº de acceso L0921 0). El ADNc de iNOS clonado se subclonó en el vector de adenovirus junto con un gen de resistencia a la neomicina, para dar la construcción DFGiNOS. El vector de control BaglacZ previamente construido es un retrovirus que expresa el gen lacZ de E. coli (que codifica la \beta-galactosidasa) bajo el control transcripcional de la repetición terminal larga del virus de leucemia murina Moloney (MoMLV 5' LTR) y el codón de inicio de la traducción gag pr65 y el gen de resistencia a la neomicina bajo el control del promotor temprano de SV40 (Price y col., 1987, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84:156-160). Los líquidos sobrenadantes víricos BaglacZ y DFR-iNOS sin virus auxiliadores se generaron a partir de células empaquetadas CRIP (E. Tzeng y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11771-11775; E. Tzeng y col., 1996, I. Surgery, 120:315-321).
Preparación de mioblastos: Se sembraron mioblastos primarios con una densidad de 5 x 10^{4} células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se lavaron con una solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Se pusieron partes alícuotas suficientes de reserva de adenovirus en cada pocillo para lograr una multiplicidad de infección igual a 50 (MDI = 50). Las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC para permitir la infección adecuada. Después se añadió medio de proliferación (véase a continuación) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 34ºC durante 48 horas. Las células pueden inmunoteñirse para evaluar la expresión del transgén o recogerse en HBSS para inyección en animales. Las inyecciones estaban en el intervalo de 1,33 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células por 100 \mul. El tejido se recogió a las 48 horas después de inyección.
Transducción de mioblastos con adenovirus: Se hicieron crecer mioblastos primarios en cultivo durante 5 días en medio de proliferación que contenía DMEM y suero bovino fetal al 15-20% (GIBCO-BRL; NY EE.UU.). Se infectaron 6 x 10^{5} mioblastos con adenovirus usando una multiplicidad de infección (MDI) de 20. Se añadieron microsferas de látex fluorescentes (FLM) a lo mioblastos cultivados con una dilución 1:1000 para marcar los mioblastos, permitiendo así el seguimiento temprano in vivo del destino de los mioblastos inyectados (J. Huard y col., 1994, J. Clin. Invest, 93:586-599; J. Huard y col., 1994, Muscle & Nerve, 17:224-234; J. Huard y col., 1995, Gene Therapy, 2:107-115). A las 24 horas después de la infección, los mioblastos se desprendieron usando tripsina (al 0,25%) durante aproximadamente 1 minuto, se centrifugaron durante 5 minutos a 3500 rpm, y el sedimento de mioblastos se reconstituyó con 25 \mul de HBSS (Gibco-BRL, NY EE.UU.). Las células recogidas se transplantaron usando la técnica descrita a continuación.
Recogida de tejido e histología: Se recogió tejido en diferentes tiempos dependiendo del experimento. Todas las muestras de vejiga y uretra se congelaron o se fijaron en formalina tamponada al 10% dependiendo del requisito del ensayo. La zona alrededor de cada sitio de inyección se examinó con microscopio, se tiñó para estudiar el gen indicador LacZ y la inmunohistoquímica y se fotografió. Se llevaron a cabo los ensayos adecuados para el gen indicador LacZ y la expresión del gen del factor de crecimiento de fibroblastos.
Tinción de LacZ por técnica histoquímica: Las secciones de criostato de los tejidos inyectados y de control se tiñeron para ver la expresión de LacZ como sigue. Primero se fijaron las secciones con glutaraldehído al 1,5% (Sigma) durante 1 minuto, se aclararon dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubaron en sustrato X-gal [5-bromo-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa 0,4 mg/ml (Boehringer-Mannheim, Indianapolis IN, EE.UU.), MgCl_{2} 1 mM, K_{4}Fe(CN)_{6} 5 mM/K_{3}Fe(CN)_{6} 5 mM en PBS) toda la noche a 37ºC.
Ensayo de la actividad de \beta-galactosidasa: Esta técnica proporcionó mejor cuantificación y comparación del nivel de expresión del transgén en células infectadas así como en tejidos inyectados (p. ej., músculo, vejiga, uretra). El músculo inyectado se congeló en nitrógeno líquido y se homogeneizó en Tris-HCl 0,25 M (pH 7,8) y los homogeneizados se centrifugaron a 3500 x g durante 5 min. El homogeneizado de músculo se alteró mediante 3 ciclos de congelación/descongelación y el líquido sobrenadante se recogió por centrifugación 12.000 x g/5 min a 4ºC) y se transfirió a un tubo de microcentrífuga limpio. Después, se mezclaron 30 \mul de este extracto con 66 \mul de 1x o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido; ONPG (ONPG 4 mg/ml en fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5), 3 \mul de 100 x solución de Mg (MgCl_{2} 0,1 M, \beta-mercaptoetanol 4,5 M), 201 \mul de fosfato sódico 0,1 M (41 ml de Na_{2}HPO_{4} \cdot 2H_{2}O 0,2 M, 9 ml de NaH_{2}PO_{4}. 2H_{2}O 0,2 M y 50 ml de H_{2}O) y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos, o hasta que se hubo desarrollado un ligero color amarillo. Finalmente, la reacción se paró por adición de 500 \mul de Na_{2}CO_{3} 1 M y se leyó la densidad óptica en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 420 nm. El nivel de actividad de \beta-galactosidasa (nº de unidades/muestra) se extrapoló en una curva de calibración que convierte la densidad óptica a 420 nm en concentración de la enzima \beta-galactosidasa.
Determinación de la persistencia de la inyección de mioblastos: Se incubaron mioblastos con FLM y se transdujeron con adenovirus que llevaba el gen indicador de \beta-galactosidasa. Cada matraz de 500.000 células se tripsinizó usando Tripsina-EDTA al 0,5%, se centrifugó a 3500 rpm durante 5 min y se volvió a suspender en 100 \mul de medio. La solución de un matraz se inyectó en la uretra o la vejiga de los animales. Se inyectó una solución de 25 \mul de células musculares infectadas (1 x 10^{6} células) en la uretra usando una jeringa Hamilton).
En diferentes intervalos de sacrificios, se sacaron la uretra y la vejiga. Después de los estudios de contractilidad, el tejido se congeló rápidamente usando 2-metilbutano previamente enfriado en nitrógeno líquido. Los análisis de las secciones incluían tinción con hematoxilina-eosina; tinción de gal-X; inmunohistoquímica de desmina y localización de las FLM. A partir de estos análisis, se determinó la localización y viabilidad de las células inyectadas. Además, usando diferentes marcadores miógenos, tales como las cadenas pesadas de la desmina y miosina, se podía determinar si se había producido alguna fusión de mioblastos con las estructuras internas de la articulación. Se ensayaron las cadenas pesadas de desmina y miosina para demostrar que las células derivadas de músculo llevaban el gen indicador y que la proteína indicador es expresada, p. ej., LacZ. Por colocalización del gen indicador LacZ con genes que codifican las proteínas estructurales del músculo (p. ej., cadenas pesadas de desmina y miosina), se podía determinar que la expresión de LacZ resulta de la fusión de las células inyectadas. Las cadenas pesadas de miosina sólo son expresadas en células musculares que se están diferenciando (es decir, miotubos y miofibras).
La comparación estadística de la eficacia de la fusión de mioblastos entre los cultivos primarios se hizo contando el número de mioblastos transducidos y miofibras en la uretra. Además, usando el ensayo de ONPG, se pudieron hacer las comparaciones estadísticas del nivel de expresión de \beta-galactosidasa mediada por inyección de mioblastos transducidos, en cada intervalo de tiempo. Se podía determinar el número de mioblastos transducidos y miofibras que disminuía a lo largo del tiempo en la uretra y vejiga inyectadas.
Inmunohistoquímica de iNOS: Se recogió y fijó tejido como se ha descrito para la tinción de la \beta-galactosidasa. Las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina. Las peroxidasas endógenas se inactivaron con H_{2}O_{2} al 0,5% en MeOH absoluto durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con anti-iNOS (monoclonal de ratón, Transduction Laboratory) en suero de cabra normal (1:50). Se incubó el anticuerpo anti-ratón biotinilado (cabra, Kirkengaard-Perry) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos. Los portaobjetos se revelaron por adición del reactivo diaminobencidina (1 mg/ml)/peróxido de hidrógeno (al 0,03%) y se dejó que se desarrollaran durante 3 a 5 minutos.
Inmunotinción de NOS de mioblastos: Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y se permeabilizaron con metanol frío (-20ºC) durante 10 minutos. Se usó albúmina de suero bovino al 1% en PBS para bloquear las células y diluir los reactivos. El anticuerpo anti-iNOS diluido (dilución 1:250, policlonal de conejo, Santa Cruz) se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. El anticuerpo anti-ratón biotinilzado (cabra, Kirkengaard-Perry) se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con estreptavidina-cy3 (estreptavidina unida a un marcador fluorescente rojo) durante 30 minutos. Los pocillos se examinaron con un microscopio. Además, el anticuerpo de proteína antiadenovirus (Santa Cruz) se usó selectivamente para confirmar que los mioblastos se habían transducido con el vector adenovírico adecuado.
Medición de nitrito (NO_{2}^{-}): Las células se pasaron a placas de 24 pocillos. Después de 24 horas, el medio de células se sustituyó con medio solo o medio que contenía H4B (100 \muM; Sigma). Se cuantificó el NO_{2}^{-} acumulado en los líquidos sobrenadantes usando la reacción de Griss (L.C. Green y col., 1982, J. Analyt. Biochem., 126:131-138) usando nitrato sódico como patrón.
Determinación de la formación de óxido nítrico (NO): Se midió la formación de NO y se comparó en la vejiga y uretra de animales tratados con iNOS frente a los animales con tratamiento simulado. La formación de NO se calculó comparando el contenido en el tejido de su producto de oxidación estable, el nitrito, en las tiras estimuladas y no estimuladas. El contenido de nitrito en el tejido se midió usando una técnica colorimétrica previamente descrita (L.J. Ignarro y col., 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:843-850). Las muestras de tejido pesadas se pusieron en un tubo de vidrio y se descongelaron en 0,5 ml de metanol enfriado con hielo. Después, el tejido se homogenizó usando una mano de mortero de vidrio. El homogeneizado se dejó reposar durante 18 h a 4ºC para asegurar la extracción completa de nitrito. Después, las muestras se pusieron en una centrífuga refrigerada a 4ºC y se centrifugaron a 15.000 x g durante 15 minutos. Se mezcló una parte alícuota (0,3 ml) de cada muestra con 0,4 ml de ácido sulfanílico al 1% en HCl 0,4 M. Después de 10 min, se añadieron 0,3 ml de N-(1-naftil)etilendiamina al 1% en metanol y se midió la absorbancia del complejo rosa resultante en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 548 nm. La concentración de nitrito se interpoló de una recta patrón construida llevando a cabo un ensayo idéntico usando patrones de nitrito sódico en el intervalo de 0,5-5 \muM, junto con blancos de metanol.
Ensayo de actividad de la NOS: Se midió la actividad de la NOS y se comparó en la vejiga y uretra de animales tratados con iNOS frente a animales con tratamiento simulado, mediante seguimiento de la conversión de [^{3}H]-L-arginina a [^{3}H]-L-citrulina como describen A.L. Burnett, 1995, Urology, 45:1071-1083; D.S. Bredt y S.H. Snyder, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:682-685).
Brevemente, los tejidos se homogeneizaron en tampón de homogeneización helado. Los ensayos de enzima contenían 25 \mul de líquido sobrenadante de tejido y 100 \muml de [^{3}H]-L-arginina 1 \muCi/ml, NADPH 1,2 mM y CaCl_{2} 0,7 mM. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, los ensayos se terminaron por la adición de 3 ml de Hepes 20 mM (pH 5,5) con EDTA 2 mM. La mezcla entera se aplicó a columnas de 0,5 ml de resina de intercambio de cationes Dowex-50W (forma Na^{+}) para separar la [^{3}H]-L-arginina sin reaccionar. La [^{3}H]-L-citrulina en la columna eluida se cuantificó por espectroscopía de centelleo de líquidos. Se midió la tasa de recuperación de [^{3}H]-L-citrulina de las columnas para todos los tejidos por preincubación del líquidos sobrenadante de cada tejido con una concentración conocida de [^{3}H]-L-citrulina y después medición de la [^{3}H]-L-citrulina en cada eluato de columna. También se hicieron estudios de saturación de columna para asegurar que toda la [^{3}H]-L-arginina era retenida en la columna. Se llevaron a cabo ensayos adicionales en presencia de exceso de éster de metilo de la L-nitroarginina (L-NAME), un inhibidor competitivo de la NOS, para verificar la especificidad del ensayo para la producción de [^{3}H]-L-citrulina por la catálisis de NOS.
Las variaciones entre ensayos se controlaron por normalización de la mediciones de la actividad de NOS en tejido frente a la actividad medida en el cerebelo de rata rico en NOS que se analizó en paralelo para cada ensayo. El nivel de citrulina se expresará como picomoles por mg de tejido por minuto.
Aislamiento de ARN y análisis de transferencia Northern: Se aisló ARN celular total de animales no infectados, tratados con BaglacZ y con iNOS humana usando RNA-zol B como se ha descrito previamente (P. Chomczynski y N. Sacchi, 1987, Analytical Biochemistry, 162:156-159). Se trataron por electroforesis partes alícuotas (20 \mumg) de ARN en un gel de agarosa al 0,9% y se transfirieron sobre GeneScreen (DuPont-NEN, Boston, MA). Después de prehibridación, las membranas se hibridaron con una sonda de ADN (D.A. Geller y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:522-526; D.A. Geller y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3491-3495). Un fragmento de ADNc de iNOS humano de 2,3 kb servía como sonda de iNOS, mientras que un fragmento de ADNc de cNOS endotelial humana de 4,1 kb (ecNOS) servía como la sonda de ecNOS. El ARNr 18S servía como un control para la carga relativa de ARN.
Amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR)
Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Se extrajo el ARN celular total de las muestras usando el procedimiento de P. Chomczynski y N. Sacchi, 1987, Analytical Biochemistry, 162:156-159. El ARN total se sometió a síntesis de ADNc monocatenario usando cebador oligo(dT) y transcriptasa inversa MMLV (E.S. Kawasaki, PCR Protocols: a guide to methods and applications, Eds. MA Innis, DH Gelfang, JJ Sninsky, y TJ White, Academic Press, New York. pp. 22-27, 1990). Los cebadores se diseñaron para amplificar la iNOS con la ayuda de un programa de diseño de cebadores, PCR Plan (Intelligenetics, Mountain View, CA). La secuencia del cebador oligonucleótido 5' de iNOS (18 pb) usada era 5'-AGGACATCCTGCGGCAGC-3' (ID SEC Nº 1) (E. Tzeng y col., 1996, Mol. Med., 2(2): 211-225) que se extiende del par de bases 3426 al 3444 de la secuencia de ADNc de iNOS humana (D. A. Geller y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3491-3495). La secuencia del cebador oligonucleótido 3' de iNOS (18 pb) era 5'-GCTTTAACCCCTCCTGTA-3' (ID SEQ Nº: 2) (E. Tzeng y col., 1996, Mol. Med., 2(2):211-225) que se extiende del par de bases 3724 al 3741 de la secuencia de ADNc de iNOS humana (D. A. Geller y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3491-3495). La identidad del fragmento de ADNc amplificado obtenido de la reacción de RT-PCR con cebadores de iNOS (aproximadamente 316 pb) se confirmó usando análisis con enzimas de restricción.
Las condiciones de la PCR eran las siguientes: desnaturalización a 94ºC durante 1 min; reasociación a 57ºC durante 1 min; polimerización a 72ºC durante 2 min. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Perkin Elmer 480 usando diferentes números de ciclos para detectar un intervalo lineal de ARN de entrada. El número de ciclos óptimo se identificó como 30 ciclos. Los macrófagos peritoneales de rata escindidos con tioglicolato y células RAW (línea celular de macrófagos RAW 264.7) estimuladas in vitro con LPS sirvieron como controles positivos para el ARNm de iNOS. El control negativo para cada grupo de reacciones de PCR contenía agua en lugar de molde de ADN. El producto de la PCR (20% de volumen de reacción) de RT-PCR cualitativa se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se tiñó con bromuro de etidio.
Para la RT-PCR semicuantitativa (E.S. Kawasaki: Amplification of RNA. PCR Protocols: A guide to methods and applications, Eds. M.A. Innis, D.H. Gelfang, J. J. Sninsky y T. J. White, Academic Press, New York. pp. 22-27, 1990) se usó cebador 5' marcado en el extremo con ^{32}P. Se separaron 15 \mul de la reacción de PCR en un gel de poliacrilamida al 10%. Después de secar el gel y exposición a una pantalla Phosphorlmager (Molecular Dynamics Phosphorimager, Sunnyvale, CA), se determinó la radiactividad relativa de las bandas por integración del volumen usando densitometría de barrido láser. Cada gel contenía el mismo control positivo, lo cual permitía la normalización de las muestras y la comparación entre geles.
Ensayo de formación de hueso extraesquelético in vivo
En estos experimentos se usaron un vector retrovírico que llevaba la expresión del gen de la \beta-galactosidasa (rv-lacZ) y adenovirus diseñado para expresar el gen de BMP-2 (AdV-BMP-2). El plásmido BMP2-125 se hizo digerir con SalI y se aisló el fragmento de 1237 pb que contenía el ADNc entero para la BMP-2 humana. Después, el ADNc de la BMP-2 se insertó en el sitio SalI del plásmido pAd.lox de modo que el sitio de inicio de la traducción después se obtuvo por cotransfección de pAd.lox con ADN vírico psi-5 en células CRE-8 como han descrito previamente S. Hardy y col., 1997, J. Virol., 71:1842-1849).
Las células mdx pp6 primarias se transdujeron con rv-lacZ como un procedimiento para seguir el destino in vivo de estas células. Se sembraron 1 x 10^{6} células en un matraz T-75. El medio de proliferación (medio F10/HAM contenía suero bovino fetal al 20%) se lavó con varios aclarados de solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco BRL). Se incubaron aproximadamente 3 ml de suspensión de rv-lacZ con una concentración de aproximadamente 5 x 10^{5}, y 6 \mul de polibreno con 2 ml de HBSS, con las células durante 6 a 8 horas a 37ºC. Después, se añadió medio de proliferación a las células y las células se dejaron un periodo de recuperación de 24 horas antes de infección con AdV-BMP. Después del periodo de 24 horas, estas células se aclararon otra vez con HBSS y se transdujeron con AdV-BMP con una multiplicidad de infección (MDI) de 50. Las células se incubaron con la suspensión vírica durante 4-6 horas, momento en el que se añadió medio de proliferación sin separar las partículas de
virus.
Antes de inyección, las células se aclararon múltiples veces en HBSS y se contaron. Se llevaron a cabo inyecciones de 3,0 x 10^{5} células suspendidas en 20 \mul de HBSS en músculo de extremidad posterior de ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Después la suspensión de células se inyectó con una aguja de calibre 30 en una jeringuilla estanca para gases en el tríceps sural expuesto. Los animales se sacrificaron a las 2, 3, 4 y 5 semanas después de inyección.
Se analizó la formación de hueso ectópico en la extremidad inyectada por inspección general, radiografía e histología estándar. Se hizo la radiografía de las extremidades de los ratones sacrificados con una máquina de radiografías dentales. Después las extremidades se congelaron rápidamente en tampón de 2-metilbutano previamente enfriado en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas se seccionaron en secciones de 10-12 \mum usando un criostato (Fisher Scientific). Después de fijar con glutaraldehído (al 1%), las secciones de músculo se incubaron con el sustrato X-gal durante 1-3 horas para poner de manifiesto la actividad de \beta-galactosidasa. Los análisis histológicos adicionales incluían reacción de von Kossa, tinción con hematoxilina y eosina. Todos los procedimientos con animales estaban dentro de las directrices y aprobadas por el Children's Hospital and the University of Pittsburgh Animal Care Committee de acuerdo con el protocolo 1/98.
Implantaciones en cámara de difusión
Se transdujeron células pp6 primarias in vitro con AdV-BMP-2 usando una MDI de 50. Las células se tripsinizaron, se contaron y se suspendieron 1 x 10^{6} células en medio de proliferación. En condiciones estériles, las células se cargaron en dispositivos de inmunoaislamiento Theracyte de 5 \mul (Device Engineering Group, Baxter Healthcare, Round Lake, IL) usando una jeringuilla estanca para gases y agujas de acero inoxidable de punta roma (J. Brauker y col., 1998, Human Gene Ther, 9:879-888). El puerto de carga se selló con adhesivo de silicona estéril (Dow Corning, Midland, MI). El dispositivo Theracyte consistía en una membrana de politetrafluoroetileno bicapa (PTFE) con un tamaño de poros de la membrana exterior de 5 \mum y un tamaño de poros de la membrana interior de 0,4 \mum. La membrana de PTFE bicapa impide que las células del huésped entren en el dispositivo y que las células implantadas salgan del dispositivo. Los dispositivos se implantaron por vía subcutánea en ratones SCID con anestesia de ketamina y xilazina. Los ratones se sacrificaron tres semanas después usando anestesia con metoxiflurano y dislocación cervical. Los dispositivos se congelaron rápidamente en 2-metilbutano previamente enfriado con nitrógeno líquido. Se hicieron secciones de 10 \mum de grosor usando un criostato (Microm, HM 505 E) y se tiñeron con hematoxilina y eosina, con y sin tinción de von Kossa.
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Ejemplo 2
Los experimentos se llevaron a cabo usando inyección de mioblastos en la pared de la uretra como un tratamiento para la incontinencia urinaria de esfuerzo.
En estos experimentos, se cultivaron mioblastos de la línea celular de mioblastos GH8 (disponible en el almacén de la American Type Cell culture) transducidos con un vector adenovírico que albergaba un gen indicador que codifica la \beta-galactosidasa (adenovirus de primera generación con E1-E3 suprimidos), y se inyectaron en la pared de la uretra proximal de la rata hembra S.D.
Además, las células se incubaron con microesferas de látex fluorescente (FLM) para seguir el destino de las células inyectadas (véase el Ejemplo 1). Las células transducidas marcadas con FLM se inyectaron en ratas hembra S.D, adultas (n=20). Se hizo una incisión en la línea media y se inyectaron mioblastos en la pared de la uretra proximal en dos sitios con una microjeringa Hamilton de 10 \mul. La concentración de mioblastos estaba en el intervalo de 1,33 x 10^{5} a 1 x 10^{6}. El tejido se recogió 2-4 días después de inyección y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido. Después, el tejido se seccionó, se tiñó con sustrato x-gal y después se contratiñó con hematoxilina y eosina (H y E). Se tomaron fotografías de los portaobjetos por microscopía óptica y de fluorescencia.
La inyección se hizo en la uretra de animales de control y también en animales que tenían lesión uretral hecha usando una sonda de aluminio de 8 mm de diámetro enfriada con hielo seco y después puesta en una uretra ventral durante 10 segundos (véase el Ejemplo 1). Después de 2, 4 y 7 días, se practicó la eutanasia a los animales con y sin lesión uretral, y la parte de la uretra que contenía los mioblastos injertados, así como la uretra y vejiga normales adyacentes, se sacaron y se sometieron a estudios funcionales y microscópicos. Veinticuatro horas antes del sacrificio, los animales se sometieron a un análisis de pauta de micción en una jaula metabólica para determinar el cambio del volumen de evacuación y la frecuencia (véase el Ejemplo 1).
Los animales con y sin uretras injertadas con mioblastos también se sometieron a análisis de las pautas de micción de 24 horas en una jaula metabólica usando los procedimientos descritos por M.B. Chancellor y col., 1994, J. Urol., 151:250-254.
Inmediatamente antes del sacrificio, los animales se sometieron a estudio urodinámico de presión (cistometograma (CMG)) con anestesia de uretano usando catéteres urodinámicos especialmente diseñados para permitir la medición simultánea pero aislada de la presión de la vejiga y la uretra (H. Kakizaki y col., 1997, Am. J. Phy., 272:R1647-1656).
Se midieron la presión de perfusión uretral y la presión vesical isovolumétrica con catéteres insertados a través de la cúpula vesical. Estos parámetros se compararon en animales inyectados con mioblastos y animales con inyección simulada, con o sin lesión con sonda criogénica. Para estas evaluaciones, se usaron catéteres urodinámicos especialmente diseñados para permitir la medición simultánea pero aislada de las presiones de la vejiga y la uretral. El montaje de catéter se encajó en el cuello de la vejiga para bloquear el paso de fluido entre la vejiga y la uretra sin afectar al suministro nervioso de los órganos, como se ha descrito en el Ejemplo 1. La uretra externa no se cateterizó. Las respuestas se examinaron con una velocidad de infusión de solución salina uretral de 0,075 ml/min.
Después de los experimentos urodinámicos, se recogieron las tiras uretrales y se pusieron en cámaras con baño lleno de Krebs para evaluar la contractilidad. Se evaluaron los animales de control y los de inyección simulada. Se llevaron a cabo la tinción histoquímica de lacZ y el análisis por microscopía de fluorescencia para evaluar y cuantificar la supervivencia y diferenciación de mioblastos y para evaluar la producción de miotubos. Los experimentos a largo plazo usando inyección de mioblastos primarios autólogos descritos en el presente documento, en la uretra se llevaron a cabo durante 30-69 días.
Los resultados de los análisis anteriores se presentan en la Tabla 1.
TABLA 1
1
Estos experimentos demostraban un gran número de células en la pared uretral que expresaban la \beta-galactosidasa y que contenían FLM por microscopía de fluorescencia. También se observaron muchas miofibras regenerativas que expresaban \beta-galactosidasa en la pared uretral. Los mioblastos primarios inyectados en ratones SCID sobrevivieron a lo largo de 30 días. Se descubrió que los animales tratados con inyección de mioblastos tienen mayor presión uretral. En los animales que tenían uretras lesionadas con sondas criogénicas, la inyección con mioblastos dio como resultado una contractilidad mejorada.
Los resultados de los experimentos demostraron la viabilidad y supervivencia de la inyección de mioblastos en la pared de la uretra. En vista de estos resultados, se pueden usar satisfactoriamente mioblastos autólogos (es decir, mioblastos recogidos de y cultivados de un paciente específico con incontinencia por estrés) como agentes no alergenos después de inyección para cargar la pared uretral, potenciando así la coaptación y mejorando el músculo esfínter urinario. A este respecto, se aislaron mioblastos humanos de biopsia de músculo y se cultivaron a una concentración mayor que 1 x 10^{7}.
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Ejemplo 3
Los experimentos se llevaron a cabo para demostrar la viabilidad de la inyección de mioblastos en la pared de la vejiga para mejorar la contractilidad del detrusor. Para estos experimentos se usó una línea celular de mioblastos transducida con un vector adenovírico que llevaba el gen indicador de la \beta-galactosidasa como se ha descrito en lo que antecede. Las células se incubaron con microsferas de látex fluorescente (FLM) para seguir el destino de las células inyectadas. Las células se inyectaron en ratas hembra y macho S.D adultas (n=18). Los mioblastos se inyectaron en la cúpula vesical y en las paredes laterales derecha e izquierda cerca de la cúpula con una microjeringa de Hamilton de 10 \mul. La concentración de mioblastos estaba en el intervalo de 1,33 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células. El tejido se recogió después de 2-5 días, se seccionó y se ensayó la expresión de la \beta-galactosidasa. Para los experimentos de terapia génica, los miobastos se transdujeron con el adenovirus que contenía el gen de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) humana con una multiplicidad de infección de 50 (MDI=5) y se inyectaron en la vejiga y se estudiaron después de 2 a 7 días. Los resultados de estos experimentos demostraron que en la pared de la vejiga había un gran número de células que expresaban la \beta-galactosidasa y que contenían FLM determinado por microscopía de fluorescencia. También se vieron muchas miofibras regenerativas que expresaban la \beta-galactosidasa en la pared de la vejiga. Usando un microsensor porfirínico para medir el NO, se detectó un aumento de la liberación base de NO (20 nM) en la zona de la pared de la vejiga inyectada con mioblastos que se habían transfectado con el gen de la iNOS.
Estos estudios demostraban la supervivencia de los mioblastos y la expresión de genes extraños en mioblastos después de inyección en la pared de la vejiga. Así pues, se mostró que la inyección de mioblastos y la terapia génica mediada por mioblastos eran útiles para modular la contractilidad del detrusor y para contrarrestar la función hiperactiva de la vejiga.
La lesión criogénica de la vejiga o la pared de la uretra se llevaron a cabo en un modelo de rata (S.D.) como se describe en el Ejemplo 1. Dos animales se sometieron cada uno a lesión criogénica y lesión simulada con y son inyección de mioblastos. Cuatro días después de la lesión criogénica e inyección de mioblastos, se llevó a cabo la evaluación de la contractilidad. Se observaron daños histológicos significativos en la vejiga y pared de la uretra después de la lesión criogénica (Figura 2). La contractilidad muscular por estimulación con campo eléctrico desapareció después de la lesión criogénica comparado con los animales con lesión simulada en los que no había cambio.
Se montaron tiras de vejiga o uretra en baños de órganos de 5 ml y se estimularon eléctricamente con 100 V, 0,25 ms a diferentes frecuencias. Las tiras dañadas criogénicamente tanto de la vejiga como de la uretra mostraron actividad baja y no mostraron actividad de contracción por la estimulación con campo eléctrico, por la activación indirecta del músculo liso por estimulación del receptor M3 con carbacol, o por activación directa del músculo liso con K^{+} alto, comparado con los controles no dañados. Después del tratamiento con mioblastos de la vejiga y uretra dañados criogénicamente, hubo una recuperación significativa de la actividad contráctil por estimulación eléctrica.
Los resultados se presentan en la Tabla 2.
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TABLA 2
2
Estos experimentos demostraban claramente una alteración de la función de la vejiga y la uretra con el modelo de lesión criogénica.
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Ejemplo 4
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar la supervivencia a largo plazo de mioblastos autólogos transducidos en la vejiga y la uretra.
Estos experimentos se llevaron a cabo en ratones que tenían inmunodeficiencia combinada severa, es decir, el modelo de ratones SCID, y posteriormente en ratones no inmunodeficientes. Se recogieron y cultivaron mioblastos autólogos y células derivadas de músculo en suficiente cantidad para inyecciones repetidas en la vejiga.
Los cultivos de mioblastos primarios se hicieron crecer durante 3 días en un medio de proliferación complementado que contenía DMEM y suero bovino fetal al 15% (Gibco-BRL). Los mioblastos se infectaron con vector adenovírico. También se añadieron microsferas de látex fluorescentes (0,5 \mum) a los mioblastos cultivados con una dilución 1:1000 para permitir el seguimiento in vivo del destino de los mioblastos inyectados (A. Satoh y col., 1993, J. Histochem. Cytochem., 41:1579-1582; S. Floyd y col., 1997, Basic Appl. Myol., 7(3&4)). A las 48 horas después de inyección, los mioblastos se desprendieron del recipiente de cultivo usando tripsina (al 0,25%), se centrifugaron durante 5 minutos a 3.500 rpm y el sedimento de mioblastos se reconstituyó con 25 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco-BRL, NY EE.UU.).
La solución de mioblastos transducida se inyectó en la pared del detrusor en el lado izquierdo, con el mismo número de partículas víricas inyectadas en el lado contrario del animal. Los ratones inyectados se sacrificaron a los 4 días después de inyección. Las vejigas de los animales inyectados se sacaron y se congelaron rápidamente en isopentano previamente enfriado en nitrógeno líquido. Después el músculo se seccionó en el criostato en su totalidad con un grosor de 10 \mum y se preparó para la tinción.
La misma solución vírica (i) se inyectó por vía intramuscular o (ii) se usó para transducir mioblastos in vitro antes de la transferencia de genes ex vivo al mismo animal. Se inyectó en ratones normales recién nacidos (dos a cinco días de edad) y adultos (dos meses de edad) los mioblastos isógenos (en el lado derecho de la vejiga con la misma cantidad de partículas víricas que se usaba para infectar los mioblastos que se inyectaron en el lado izquierdo de la vejiga) y se sacrificaron a los tres días después de inyección. Se evaluaron aproximadamente 8 animales en cada grupo. En los músculos inyectados se ensayó tanto la actividad de la \beta-galactosidasa como la tinción de LacZ, y se hizo el seguimiento de la eficacia del suministro de genes. Después de 2, 4, 7, 14, 30, 60 y 90 días, se practicó la eutanasia en los animales, y la parte de la vejiga que contenía los mioblastos injertados, así como la vejiga adyacente normal, se sacaron y se analizaron.
El nivel de expresión de transgenes se comparó estadísticamente entre los procedimientos de transferencia de genes directa y ex vivo, usando adenovirus. Las vejigas inyectadas con mioblastos isógenos se seccionaron longitudinalmente para determinar la presencia de miofibras que se regeneraban. La tinción inmunohistológica de lacZ y el análisis por microscopía de fluorescencia se llevaron a cabo para evaluar y cuantificar la supervivencia y diferenciación de mioblastos y para evaluar la producción de miofibras. La localización de miofibras transducidas que contenían una distribución no uniforme de las FLM, permitió la determinación de la presencia de miofibras mosaico. Usando tinción inmunohistoquímica para LacZ y análisis de FLM, se determinó que había supervivencia y diferenciación de los mioblastos inyectados en las miofibras.
Los resultados de estos análisis demuestran que las células mioblastos autólogas se pueden caracterizar, cultivar y almacenar. Además, se mostró que los mioblastos autólogos se injertaban con éxito en la vejiga y la uretra sin inmunorreactividad significativa durante al menos 90 días hasta 6 meses. Más específicamente, la inyección de células madre primarias derivadas de músculo en la vejiga podía lograr la supervivencia a largo plazo y una persistencia de alrededor de 50% a los 6 meses. Además, se demostró el mantenimiento del efecto de carga persistente en la pared de la uretra. Dicho mantenimiento es necesario para el tratamiento de la incontinencia urinaria de esfuerzo (Figuras 15A-15C).
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Ejemplo 5
Se llevaron a cabo experimentos adicionales en este ejemplo para evaluar y mejorar la supervivencia de los mioblastos inyectados, después de inyección. Con el fin de realizar esta evaluación, se inyectaron diferentes líneas celulares de mioblastos mdx (véase a continuación), así como mioblastos primarios, con diferentes purezas como se describe a continuación, en el músculo de ratones mdx adultos. Los mioblastos se transdujeron con adenovirus o se transfectaron con un plásmido que expresaba \beta-galactosidasa y se evaluó el destino temprano de las células inyectadas después de la inyección.
El plásmido que contenía el gen que codificaba la \beta-galactosidasa se construyó en un esqueleto de plásmido pBluescript, en el que el gen indicador de la \beta-galactosidasa es dirigido por el promotor de citomegalovirus humano (HCMV), y el gen de resistencia a la neomicina es dirigido por el promotor de PGL (J.A. Wolff y col., 1990, Science, 247:1465-1468; S. Jiao y col., 1992, Human Gene Therapy, 3:21-33).
Se ensayaron diferentes poblaciones de mioblastos primarios que se habían purificado por presiembra (Ejemplo 1) y que tenían un porcentaje de mioblastos en el intervalo entre aproximadamente 10% y 90%. Finalmente, también se usaron mioblastos mdx primarios obtenidos de miofibras aisladas y se compararon entre los grupos de supervivencia de células inyectadas (véase, J. Huard y col., 1994, Human Gene Ther, 5:949-958 y J. Huard y col., 1994, J. Clin. Invest, 93:586-599).
Las diferentes poblaciones de células mioblastos presembradas se infectaron con adenovirus que expresaba la \beta-galactosidasa. El adenovirus, un adenovirus recombinante con E1-E3 suprimido obtenido generosamente de GeneVec Inc. (Dr. I. Kovesdi), tenía el gen indicador de la \beta-galactosidasa bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (HCMV) seguido del intrón T de SV40 y señal de poliadenilación (PolyA). Las células transducidas con adenovirus después se transplantaron en el músculo de la extremidad posterior (gastrocnemio y sóleo) de ratones mdx y se ensayó su supervivencia después de implantación.
Se aislaron mioblastos de miofibras viables solas. Las fibras musculares solas se prepararon a partir de músculo extensor largo de los dedos (EDL) por disgregación enzimática en colagenasa de tipo 1 al 0,2% (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), como se ha descrito previamente (D.J. Rosenblatt y col., 1995, In Vitro Dev. Siol. 31:773-779; W.G. Feero y col., 1997, Gene Ther, 4:371-380). Se usaron fibras musculares aisladas de ratones de 6 semanas de edad. Después de aislar aproximadamente 200 miofibras por músculo, se sembraron un mínimo de 5-10 miofibras por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con Matrigel 1 mg/ml (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, EE.UU.) en 2 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero de caballo al 10%, extracto de embrión de pollo al 1%, L-glutamina al 2% y pencilina/estreptomicina al 1% (Gibco, BRL, Gran Island, NY, EE.UU.). Las placas se pusieron en un incubador a 37ºC y CO_{2} al 5% durante varios días. Las células que surgían de estas miofibras se hicieron crecer hasta confluencia, se ensayó la expresión de desmina, se trasndujeron con adenovirus que llevaba el gen indicador de LacZ, y se ensayó la supervivencia de los mioblastos después de implantación, siguiendo el protocolo descrito a continuación.
Se usó una línea celular mdx inmortalizada aislada de un animal transgénico que llevaba un antígeno T de SV40 termolábil bajo el control de un promotor inducible (J.E. Morgan y col., 1994, Develop. Biology 162:486-498). La línea celular mdx inmortalizada proliferaba indefinidamente en condiciones permisivas de 33ºC con interferón gamma (medio de proliferación; DMEM + suero bovino fetal al 20%) y experimentaba diferenciación normal a 37-39ºC sin interferón gamma (medio de fusión; DMEM + suero bovino fetal al 2%). Se ensayó en esta línea celular de mioblastos la inmunorreactividad de desmina y la capacidad de diferenciarse cuando se cultivaban en un medio de fusión. Posteriormente, estas células se transdujeron con adenovirus que llevaban el gen de expresión del indicador LacZ, y se analizó la supervivencia de los mioblastos inyectados como se describe a continuación.
Los mioblastos se transformaron para expresar agentes antiinflamatorios. Se usó la línea celular de mioblastos mdx para la transformación genética de los mioblastos que expresan sustancias antiinflamatorias. Los mioblastos se infectaron con un vector retrovírico que llevaba el gen que codifica la proteína antagonista del receptor de interleuquina 1 (IL-1 Ra) y un gen de resistencia a la neomicina (G. Bandara y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10764-10768). Después de infección, los mioblastos se seleccionaron usando neomicina (100 \mug/ml de medio) para obtener cerca de 100% de células infectadas, porque las células no infectadas murieron cuando se sometieron a tratamiento con neomicina.
En los mioblastos seleccionados primero se analizó in vitro su capacidad para expresar IL-1 Ra (80 ng/1 x 10^{6} células a las 48 horas después de infección). Se encontró que los mioblastos transformados eran capaces de diferenciarse en miotubos in vitro y de formar miofibras después de transplante intramuscular in vivo. Los mioblastos modificados posteriormente se infectaron con adenovirus que llevaba el gen indicador LacZ y se inyectaron en músculo mdx. Se siguió el destino temprano de las células inyectadas y se comparó con el de las células no transformadas usando el protocolo descrito a continuación.
Inmunohistoquímica para desmina: Las diferentes poblaciones de mioblastos se fijaron con metanol a -20ºC durante 1 minuto, seguido de 2 aclarados en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los cultivos de células se bloquearon con suero de caballo al 10% durante 1 hora y se incubaron con el primer anticuerpo (antidesmina monoclonal de ratón 1/200, Sigma Co., St. Louis, MO, EE.UU.) durante 1 hora. Después de 3 aclarados en PBS, las secciones se incubaron con un segundo anticuerpo (anti-ratón conjugado con Cy3, inmunofluorescencia, 1/200, Sigma Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Después, la inmunotinción se visualizó por microscopía de fluorescencia y se computó el número de células positivas para desmina y se comparó entre los diferentes grupos.
Se usaron diferentes poblaciones de mioblastos para estos experimentos. Se inyectaron de 0,5 a 1 x 10^{6} células por vía percutánea en la porción media del músculo gastrocnemio para cada grupo experimental; los grupos experimentales que se compararon entre sí recibieron exactamente el mismo número de células. Se transdujeron mioblastos mdx primarios, mioblastos aislados de fibras musculares solas y cultivos de mioblastos mdx inmortalizados, con un adenovirus que llevaba el gen indicador LacZ usando una multiplicidad de infección de 50 (MDI=50). Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se recogieron los diferentes grupos de mioblastos transducidos por tripsinización (tripsina al 0,1%), se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS), y se inyectaron por vía intramuscular con una jeringuilla Drummond. En diferentes puntos de tiempo después de inyección (0,5, 12, 24, 48 horas y 5 días) los animales se sacrificaron y en los músculos inyectados se ensayó la expresión de LacZ (histoquímica y ONPG). La expresión de \beta-galactosidasa obtenida de los músculos inyectados se comparó con la del extracto de células transducidas antes del transplante (0 horas después de inyección). Se usaron 5 ratones C57BL10/J mdx/mdx de 2 meses de edad para cada grupo. Los animales del experimento se mantuvieron en el Rangos Research Center Animal Facility of Children's Hospital of Pittsburgh. Las normas y procedimientos del laboratorio de animales estaban de acuerdo con los detallados en la guía "Care and Use of Laboratory Animals" publicada por el departamento de Sanidad y Servicios Humanos de EE.UU.
Tinción de LacZ por técnica histoquímica: Las secciones del crisotato de los músculos inyectados y de control se tiñeron para ver la expresión de LacZ usando la técnica descrita a continuación: las secciones se fijaron con glutaraldehído al 1,5% (Sigma Co., St. Louis, MO, EE.UU.) durante 1 minuto y se aclararon 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en sustrato X-gal [5-bromo-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosida 0,4 mg/ml (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, EE.UU.), MgCl_{2} 1 mM, K_{4}Fe(CN)_{6} 5 mM/K_{3}Fe(CN)_{6} 5 mM en PBS] toda la noche (37ºC). Después de la histoquímica de LacZ, las secciones de músculo se contratiñeron con hematoxilina/eosina y se visualizaron por microscopía óptica (microscopio Optiphot, Nikon).
Se ensayó la actividad de la \beta-galactosidasa con el fin de lograr una mejor cuantificación y comparación del nivel de expresión del trangén en las células infectadas y los músculos inyectados (J. Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1.21-1.52.). Los músculos o células inyectados se congelaron en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en Tris-HCl 0,25 M (pH 7,8), y el homogeneizado se centrifugó a 3.500 x g durante 5 minutos. El músculo homogeneizado se alteró por 3 ciclos de congelación/descongelación y el líquido sobrenadante se centrifugó (12.000 x g/5 min a 4ºC) y se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se mezclaron 30 \mul de este extracto con 66 \mul de ONPG 4 mg/ml (O-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido, Sigma Co.) disueltos en fosfato sódico 0,1 M (pH 7,5), 3 \muml de \beta-mercaptoetanol 4,5 M disuelto en MgCl_{2} 0,1 M, y 201 \muml de fosfato sódico 0,1 M. Después, la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La reacción se paró por adición de 500 \mul de Na_{2}CO_{3} 1 M, y se leyó la densidad óptica en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 420 nm. El nivel de actividad de \beta-galactosidasa (nº de unidades/muestra) se extrapoló en una curva de calibración que convierte la densidad óptica a 420 nm en concentración de la enzima \beta-galactosidasa. El nivel de enzima \beta-galactosidasa se comparó en los mioblastos no inyectados transducidos con el obtenido en el músculo inyectado a las 0,5, 12, 24 y 48 horas y 5 días después de inyección.
Tinción inmunoquímica de las isoformas de cadena pesada de la miosina (MyHC)
Se usó un anticuerpo monoclonal específico para las isoformas de la cadena pesada de miosina. La anti-cadena pesada de miosina lenta (M 8421, Sigma Co., St. Louis, MO, EE.UU.) monoclonal reacciona con la MyHC lenta del músculo esquelético adulto. La tinción de la MyHC se llevó a cabo usando técnicas indirectas de inmunoperoxidasa. Las secciones del criostato seriadas de 10 \mum se recogieron en portaobjetos de vidrio, se fijaron con acetona fría (-20ºC) durante 1 minuto y se bloquearon con suero de caballo al 5% durante 1 hora. Las secciones se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una cámara húmeda con anticuerpos primarios diluidos 1:500 en PBS, pH 7,4, que contenían suero de caballo al 4%. Las secciones de músculo del criostato se aclararon posteriormente 3 veces en PBS y se incubaron con anticuerpos anti-ratón de oveja conjugados con peroxidasa de rábano picante (A7282, Sigma Co., St. Louis, MO, EE.UU.) diluido 1:100 en PBS durante 90 minutos. Después de 3 aclarados en PBS, se determinó la actividad de la peroxidasa por incubación con diamino-bencidina 1 mg/ml en PBS que contenía peróxido de hidrógeno al 0,01%. Después, se llevó a cabo la reacción de la peroxidasa y se paró por aclarados repetidos en PBS. Las secciones se montaron en GelMount (Biomeda, Corp. Foster City, CA) y se observaron con microscopio óptico (microscipio Nkon Optiphot). Después se llevaron a cabo la colocalización de LacZ y las fibras musculares que expresaban la cadena pesada de la miosina lenta, en las secciones seriadas de músculo.
Análisis estadístico: se computó el nivel medio de transducción en diferentes momentos de tiempo para cada grupo (n=5= y se comparó a lo largo del tiempo por un análisis de varianza de un factor (ANOVA; factorial de tipo multicomparación) usando software estadístico (Stat View 512+; Brain power, Calabasas, CA, EE.UU.).
En este ejemplo, se demostró que diferentes poblaciones de células derivadas de músculo primario aisladas del músculo gastrocnemio de diferentes presiembras contiene un porcentaje diferente de células positivas para desmina. Las diferentes poblaciones de células consistían en una mezcla de células derivadas de músculo que incluían mioblastos, fibroblastos y adipocitos. Se encontró que las poblaciones de células derivadas de músculo presentaban diferentes inmunorreactividades para la desmina, que estaban en el intervalo de 7 a 80% después de presiembra. Por ejemplo, la primer presiembra contenía 7% de células positivas para desmina, mientras que las presiembras secuenciales estaban enriquecidas en su contenido en células positivas para desmina (es decir, PP nº 2=14%, PP nº 3=25%, PP nº 4=72%, PP nº 5=77%, y PP nº 6=80%).
Estas poblaciones de células tenían capacidad variable para diferenciarse en miotubos cuando se cultivaban en un medio de fusión. De hecho, el número de miotubos obtenido en la presiembra nº 1 y presiembra nº 3 era muy bajo comparado con el obtenido en la presiembra nº 5 y presiembra nº 6. Los resultados demuestran que las poblaciones de células derivadas de músculo con mayor número de células positivas para desmina presentan una capacidad mejor para diferenciarse en miotubos.
El 97% de las células positivas para desmina se obtuvieron de una miofibra sola aislada del músculo extensor largo de los dedos (EDL). Además, la línea celular de mioblastos mdx, aislada de ratones trasngénicos que llevaban el antígeno T de SV40, era casi 100% positiva para desmina. Estas células también eran capaces de diferenciarse en miotubos, lo cual demostraba el alto índice de miogenicidad de estos cultivos celulares.
En diferentes poblaciones de células derivadas de músculo aisladas y purificadas de ratones mdx (distróficos) y normales por técnica de presiembra, se ensayó la presencia de diferentes marcadores. Se encontró que una población de células derivadas de músculo tenía las siguientes características: aproximadamente 95% positivas para desmina; aproximadamente 95% positivas para BCL-2; aproximadamente 95% positivas para CD34; aproximadamente 95% de expresión de isoformas de cadena pesada de la miosina (MyHC); aproximadamente 30-60% de expresión de MyoD; aproximadamente 30-60% de expresión de miogenina; y menos de aproximadamente 10% de expresión de M-caderina, sugiriendo así sus cualidades de células madre.
Las células derivadas de músculo obtenidas de la presiembra nº 1 e inyectadas en el músculo gastrocnemio se perdieron rápidamente a las 48 horas después de infección: se midió en el músculo inyectado sólo 17% de expresión del gen introducido presente en los mioblastos inyectados. Sin embargo, se obtuvo una mejora de la supervivencia de los mioblastos inyectados con el uso de células de las posteriores presiembras para inyección. De hecho, las células aisladas de la presiembra nº 2 dieron una pérdida de mioblastos de 55% a las 48 horas después de inyección, las de la presiembra nº 3 dieron un 12% de pérdida de mioblastos, y las de la presiembra nº 6 dieron un 124% de ganancia comparado con el nivel de expresión del transgen LacZ presente en las células antes de inyección y transplante (Figuras 7A-7H). Estos resultados sugieren que las poblaciones de células derivadas de músculo se aislaron durante la presiembra que presentaba una mejora tasa de supervivencia después de transplante.
Sorprendentemente, la población pura de mioblastos obtenida de las miofibras aisladas (mioblastos de fibras Fmb) que presentaban más de 95% de inmunorreactividad para desmina, sufrieron una pérdida rápida después del transplante de mioblastos. De hecho, se observó una pérdida de 95% de los mioblastos inyectados a las 48 horas después de transplante. Igualmente, la línea celular de mioblastos mdx (línea celular), (Figs. 7D y 7H) se perdió rápidamente después de transplante: 93% del nivel de expresión del transgén LacZ presente en el cultivo celular después de implantación desapareció 2 días después de la inyección. Estos resultados muestran que el alto porcentaje de células positivas para desmina presente en la población de células derivadas de músculo en la presiembra nº 6 era solo uno de los factores para explicar la mejora de la supervivencia de las células después de la implantación.
Incluso aunque se han aislado poblaciones de células derivadas de músculo que presentaban una supervivencia mejor después de inyección (PP nº 3, PP nº 6), todas las poblaciones de células condujeron a una disminución de la expresión del gen indicador entre los días 2 y 5 después de inyección. Sin embargo, las células con la mejor tasa de supervivencia, retuvieron una mejor expresión del transgén el día 5.
Se ha encontrado que todas las poblaciones de mioblastos después de transducción de adenovirus eran capaces de suministrar el gen indicador de la \beta-galactosidasa al músculo esquelético a los 2 y 5 días después de infección. Usando el mismo número de células, se observó que la PP nº 6 y, en menor medida, la PP nº 3 ofrecían una mejor transferencia de genes que la población de células derivadas de músculo aisladas de las presiembras nº 1 y nº 2. La capacidad de las células musculares purificadas para evitar la pobre supervivencia de las células inyectadas, puede explicar la mejor eficacia de la transferencia de genes en el músculo inyectado. Sin embargo, también se observó que la PP nº 6 presentaba una mejor capacidad de fusionarse con las miofibras del huésped, comparado con las células derivadas de músculo aisladas de presiembras más tempranas. La línea celular de mioblastos (línea celular) y el cultivo de mioblastos muy puros aislados de miofibras (FMb) también presentaron una reducción de la transferencia de genes cuando se compararon con las células aisladas de músculo de la presiembra nº 6, sugiriendo que la capacidad de las células para evitar la pobre supervivencia después de inyección, conduce a una mejora de la transferencia de genes al músculo esquelético.
Después de la inyección de las células musculares, las células se fusionaban entre sí para formar miotubos o se fusionaban con mioblastos del huésped y fibras musculares para formar miofibras mosaico. Las secciones seriadas del criostato mostraron que los mioblastos transducidos obtenidos de las miofibras aisladas se fusionaban entre sí para formar miotubos y miofibras inmaduras que expresaban las cadenas pesadas de la miosina rápidas, o se fusionaban con las miofibras del huésped expresando las cadenas pesadas de la miosina rápidas. Estos sugería que las miofibras usadas para aislar los mioblastos probablemente expresaban las cadenas pesadas rápidas. En contraste, las células derivadas de músculo aisladas de la PP nº 6 se fusionaban entre sí y con las miofirbras del huésped expresando las cadenas pesadas de la miosina tanto rápidas como lentas, lo que sugería que las células derivadas de músculo en la PP nº 6 tienen la capacidad de fusionarse con las miofibras de las cadenas pesadas de la miosina rápidas y lentas.
Para investigar si las células capaces de expresar sustancias antiinflamatorias pueden mejorar la supervivencia de las células después de inyección, se transformaron genéticamente los mioblastos para que expresaran la proteína antagonista del receptor de interleuquina 1 (IL-1 Ra), que puede competir con la citoquina inflamatoria IL-1 por la unión al receptor de IL-1, pero no induce la señalización del receptor de IL-1. Después se comparó la supervivencia de los mioblastos transformados con las células de control no transformadas. Los mioblastos usados para este experimento, la línea celular mdx, presentaba una pérdida drástica de células inyectadas después de inyección (Fig. 7G). Se observó una pérdida de 84% de las células no transformadas a las 48 horas después de inyección por la disminución significativa en la cantidad de expresión de \beta-galactosidasa en comparación con los mioblastos transducidos no inyectados en el tiempo 0. Además, se detectó un ligero aumento de la cantidad de gen indicador a las 120 horas después de inyección, que sigue siendo significativamente diferente de lo observado en las células de control (Fig. 8A).
En contraste, las células transformadas para expresar IL-1 Ra, redujeron significativamente la pérdida temprana de células inyectadas. Se observó una pérdida de 60% de la cantidad de \beta-galactosidasa expresada en las células no inyectadas (P<0,05) a las 24 horas después de inyección, pero en contraste con el resultado observado con las células no transformadas, se encontró que el nivel de expresión de \beta-galactosidasa detectado a los 2 días después de inyección no era significativamente diferente del encontrado en los mioblastos que expresaban IL-1 Ra no inyectados. Estos descubrimientos sugieren que la inflamación también tiene una función en la tasa de supervivencia pobre de las células inyectadas; por consiguiente, los procedimientos capaces de bloquear la inflamación pueden ayudar en el desarrollo de estrategias para lograr un transplante de mioblastos eficaz (Figs. 8B-8D).
Los experimentos en este ejemplo se llevaron a cabo ara determinar si la inflamación es el único factor implicado en la pobre supervivencia de los mioblastos inyectados. El intervalo extremadamente amplio de actividades biológicas de IL-1 Ra puede mejorar la supervivencia de las células al bloquear la acción de una citoquina inflamatoria (IL-1). Como se describe en el presente documento, los mioblastos se transformaron genéticamente para expresar IL-1 Ra antiinflamatoria, y se ensayó la prevención de la pérdida rápida de las células inyectadas. Los mioblastos transformados que expresaban IL-1 RA permitieron una mejor tasa de supervivencia de los mioblastos inyectados 48 horas después de la inyección. La línea celular de mioblastos no transformados presentaba una supervivencia pobre de las células inyectadas, pero la misma línea celular que expresaba IL-1 Ra mejoró significativamente la tasa de supervivencia de las células inyectadas.
Se observó una mejora de 80% de la supervivencia de las células inyectadas por la expresión local de una sustancia antiinflamatoria. Había una disminución significativa de la cantidad de gen indicador de la \beta-galactosidasa a las 24 horas comparado con las células de control no inyectadas, lo que sugería que los mioblastos que expresaban IL-1 Ra probablemente se fusionaban entre las 24 y 48 horas después de inyección y conducían a un aumento de la expresión del gen indicador de la \beta-galactosidasa. Se observó una ligera disminución de la cantidad de expresión del gen indicador de la \beta-galactosidasa a los 5 días después de inyección, lo cual puede estar relacionado con el rechazo inmunitario.
Se logró una reducción sustancial de la pérdida de mioblastos inyectados con las células que expresaban IL-1 Ra, pero todavía se observaba una pérdida de 20% a las 48 horas después de inyección. Por lo tanto, es probable que la inflamación sea sólo un factor implicado en la pérdida bastante rápida de mioblastos inyectados después de la implantación.
Se evaluaron diferentes poblaciones de células derivadas de músculo para ayudar al desarrollo de procedimientos para evitar la pobre supervivencia de los mioblastos inyectados después del transplante. Para llevar a cabo esta evaluación, se inyectaron líneas celulares de mioblastos mdx, mioblastos puros aislados de miofibras y células primarias derivadas de músculo con diferentes purezas, en músculo mdx adulto. Los mioblastos se transdujeron con adenovirus como se ha descrito, y se evaluó el destino temprano de las células inyectadas después de inyección en diferentes puntos de tiempo después de inyección (es decir, 0,5, 12, 24, 48 horas y 5 días). Se observó que las poblaciones de células derivadas de músculo primario aislados de un músculo gastrocnemio presentaban una capacidad diferente de expresar la desmina y se diferenciaban en miotubos. Además, la supervivencia de células después de inyección era diferente. De hecho, el mismo número de células musculares derivadas de la presiembra nº 1 frente a la presiembra nº 6 dieron como resultado un 83% de pérdida y un 124% de ganancia, respectivamente, de la expresión de transgén, comparado con las células transducidas no inyectadas en el tiempo 0. Esto sugiere que el aislamiento de poblaciones específicas de células derivadas de músculo supera totalmente la rápida pérdida de las células inyectadas.
Este ejemplo evaluaba si la fuente de las células derivadas de músculo podía tener una función importante en la supervivencia temprana de los mioblastos inyectados. Ya se ha observado una gran diferencia en el contenido de células satélite entre los músculos de contracción lenta y rápida (H. Schmalbruch y U. Hellhammer, 1977, Anat. Rec, 189:169; A.M. Kelly, 1978, Dev. Biol., 65:1; M.C. Gibson y E. Schultz, 1982, Anat. Rec, 202:329). Los tipos de células satélite aisladas de estos músculos posiblemente presentan un destino diferente después de transplante.
Se encontró que las células derivadas de músculo de la PP nº 6 tenían la capacidad de fusionarse con miofibras que expresaban las isoformas de la miosina tanto lenta como rápida, en contraste con los mioblastos obtenidos de miofibras aisladas, que se fusionaban entre sí o se fusionaban con miofibras que expresaban la isoforma rápida de la miosina. La incapacidad de los mioblastos obtenidos de miofibras aisladas para fusionarse con miofibras que expresan la isoforma lenta de la miosina puede estar implicada en la diferente supervivencia de los mioblastos inyectados, puesto que el músculo inyectado (gastrocnemio) contiene una mezcla de miofibras que expresan las isoformas rápida y lenta de la miosina. Los mioblastos inyectados que no pueden fusionarse con miofibras del huésped probablemente morirán en el sitio de inyección. Sin querer estar ligados por la teoría, esto puede explicar por qué la línea celular de mioblastos que presenta una alta inmunorreactividad para la desmina todavía muestra una supervivencia pobre después de inyección.
Incluso aunque las diferentes poblaciones de células derivadas de músculo y los mioblastos que expresan IL-1 Ra presentan una mejor supervivencia después de la implantación en el músculo esquelético, parece que la persistencia a largo plazo de las células inyectadas esta dificultada por las respuestas inmunitarias. En general, todas las poblaciones de células musculares presentan una reducción en la cantidad de expresión de la \beta-galactosidasa entre los días 2 y 5 después de inyección. Se encontró que el número de miofibras que expresaban LacZ disminuía con el tiempo en el músculo inyectado, incluso cuando se usaron mioblastos que expresaban IL-1 Ra. Por consiguiente, la transformación de las poblaciones específicas de células derivadas de músculo no sólo para expresar IL-1 Ra, si no también para expresar factores o agentes de supresión inmunitarios adicionales podría prevenir probablemente la pobre supervivencia y cualesquiera respuestas inmunitarias adversas que pueden acompañar la transferencia de mioblastos.
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Ejemplo 6
Se llevaron a cabo experimentos para determinar la viabilidad de la terapia génica mediada por células usando mioblastos transducidos por un vector adenovírico que lleva el gen que codifica el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Se inyectaron mioblastos transformados con bFGF en la uretra para tratar la incontinencia de esfuerzo y también en la pared de la vejiga para mejorar la contractilidad del detrusor. Los vectores adenovíricos usados se produjeron como han descrito H. Ueno y col., 1997, Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology, 17(11):2453-60 y J.C. Takahashi y co., 1997, Atherosclerosis, 132(2): 199-205.
Se llevaron a cabo experimentos similares a los descritos para la inyección de la uretra y la vejiga en los Ejemplos 2 y 3, para comparar los animales de control con tratamiento simulado frente a los animales inyectados con mioblastos transducidos con vectores adenovíricos genéticamente transformados para contener el gen del bFGF; los mioblastos transducidos expresaban la proteína bFGF después de transducción.
Brevemente como se ha descrito, se evaluaron 4 grupos de animales; animales de control de la vejiga y de control de la uretra con inyección de mioblastos-bFGF o solución salina simulada. Se evaluaron aproximadamente 8 animales en cada grupo. Los animales se sacrificaron 4 días después de inyección. Los animales que habían recibido inyección uretral se sometieron a evaluación fisiológica como se ha descrito en el Ejemplo 2. Los animales que habían recibido inyección en la vejiga se sometieron a evaluación fisiológica como se ha descrito en el Ejemplo 3.
En estos experimentos, los mioblastos se transdujeron con un vector adenovírico que llevaba tanto el gen de bFGF como el gen indicador de la \beta-galactosidasa, descrito antes, y también se marcaron con microsferas de látex fluorescentes (FLM) (P. Cuevas y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11196-12001; Y. Nakahara y col., 1996, Cell Transpl., 5:191-204). Se llevaron a cabo la tinción histoquímica de bFGF, lacZ y el análisis por microscopía de fluorescencia, para evaluar y cuantificar la supervivencia y la diferenciación de mioblastos y para evaluar la generación de miofibras.
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Ejemplo 7
Los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que los mioblastos infectados con un vector adenovírico que lleva el gen de la iNOS e inyectados localmente en la uretra y la vejiga, disminuyen la inflamación de la vejiga, mejoran la relajación de la uretra y afectan a la disfunción eréctil. En lo que este ejemplo se refiere al tratamiento de la disfunción eréctil, está fuera del alcance de la presente invención.
Brevemente y de acuerdo con la presente invención, se infectaron mioblastos con adenovirus transformados para llevar el gen de la iNOS (Ejemplo 1). Los mioblastos transducidos se inyectaron en la uretra o la vejiga de ratas S.D. Se llevaron a cabo experimentos fisiológicos como se describe en los Ejemplos 2 y 3 para la vejiga y la uretra para evaluar el o los efectos fisiológicos de la terapia con gen de la iNOS en estos tejidos.
Se usó el modelo de la ciclofosfamida (CYP) para la inflamación de la vejiga y se usó un modelo de ligamiento parcial de la uretra para la obstrucción uretral. Para el modelo de CYP de inflamación de la vejiga, se evaluaron 4 grupos de animales: los animales de control y de CYP recibieron inyecciones en la vejiga de mioblastos-iNOS o simuladas de solución salina. Aproximadamente 8 animales comprendían cada grupo. La inyección de CYP (100 mg/kg i.p.) se realizó al mismo tiempo que la inyección de mioblastos-iNOS o la simulada. Los animales se sacrificaron 4 días después de inyección, basándose en determinaciones de inflamación de la vejiga persistentes más allá de 4 días después de CYP, y expresión óptima de iNOS a los 4 días (E. Tzeng y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11771-11775; E. Tzeng y col., 1996, I. Surgery, 120:315-321).
Para el modelo de obstrucción de la uretra, también se estudiaron 4 grupos de animales: animales de control y con ligamiento de la uretra con inyección en la uretra de mioblastos-iNOS o simulada de solución salina. Los mioblastos se transdujeron con vector adenovírico que llevaba el gen indicador de la \beta-galactosidasa y se marcaron con microsferas de látex fluorescentes (FLM). Se llevaron a cabo la tinción histoquímica de lacZ y el análisis por microscopía de fluorescencia para evaluar y cuantificar la supervivencia y diferenciación de los mioblastos y evaluar el desarrollo de miofibras. Se llevó a cabo en todas las muestras la tinción inmunohistoquímica de iNOS y de proteínas de adenovirus. Se evaluó el análisis de transferencia Northern para la producción de ARN de iNOS humana en los animales transfectados con genes y en los controles adecuados.
Los experimentos y sus resultados relacionados con la producción de NO intrauretal e intravesical se presentan de forma más específica a continuación:
A. Donantes de NO intrauretral al músculo liso uretral relajado
Para evaluar primero el papel de los donantes de NO en el músculo liso, se midieron la presión de perfusión uretral y presión isovolumétrica vesical con catéteres insertados a través de la cúpula vesical en ratas hembra S.D. (250-300 g) anestesiadas con uretano (n=9). El montaje del catéter se ajustó en el cuello de la vejiga para bloquear el paso de fluido entre la vejiga y la uretra sin afectar al suministro nervioso de los órganos. La uretra externa no se cateterizó. Las respuestas se examinaron en el estado de control con una velocidad de infusión de solución salina uretral de 0,075 ml/min. Después de bloquear el esfínter uretral estriado con administración intravenosa de alfabungarotoxina (100 \mug/kg), se administraron fármacos por vía intrauretral.
Los resultados de estos experimentos pusieron de manifiesto que las respuestas reflejas presentadas por la uretra caracterizadas por una disminución inicial de la presión uretral al inicio de las contracciones reflejas de la vejiga. A esto le siguió un periodo de oscilaciones de alta frecuencia para suprimir la alfabungarotoxina. La infusión intrauretral de donantes de NO (es decir, S-nitroso-N-acetilpenicilamina [SNAP] (2 mM) y nitroprusida (1 mM), disminuyeron inmediatamente la presión uretral base en 30 a 37% y la relajación uretral máxima en 24% a 50%. Además, aumentó la duración de la relajación uretral refleja en 96% a 100%, lo cual se debía probablemente al NO exógeno que potenciaba la relajación por NO endógeno. Ninguno de los donantes de NO cambió la amplitud de contracción de la vejiga. La relajación uretral persistía durante 15 minutos después de parar la infusión de donantes de NO. Los donantes de NO intrauretrales no afectaban a la presión sanguínea media. La N-nitro-L-arginina (L-NAME) (20 mM) bloqueó sólo parcialmente la relajación refleja por el NO endógeno.
Los resultados de estos experimentos demuestran que el NO tienen una función clave en la relajación del músculo liso uretral reflejo durante la micción. Los donantes de NO intrauretrales tópicos indujeron rápidamente la relajación uretral sin afectar a la vejiga. Basándose en estos resultados, la aplicación intrauretral de donantes de NO puede ser clínicamente eficaz en casos de espasticidad del esfíneter muscular liso uretral y obstrucción.
B. NO intravesical en la cistitis inducida por ciclofosfamida
Para evaluar primero la función del NO intravesical en la cistitis inducida por ciclofosfamida, ratas hembra S.D. recibieron una sola inyección intraperitoneal de CYP (100 mg/kg) o vehículo. Después se hizo el seguimiento durante 24 horas de los parámetros de evacuación (volumen medio evacuado y número de evacuaciones) en una jaula metabólica. Cuarenta y ocho horas después de inyección de CYP, se estudió la función de la vejiga usando infusión de solución salina continua (0,04 ml/min), cistometría por el catéter transuretral PE-50 con anestesia de uretano. Se administraron por vía intravesical los donantes de NO S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP) (2 mM) y nitroprusida sódica (SNP) (1 mM), así como el inhibidor de la NOS éster metílico de la N-nitro-L-arginina (L-NAME) (20 mM).
Los resultados mostraron que el número de micciones durante las 24 horas después de inyección de CYP era significativamente mayor durante 24 horas (117\pm86, n=8) que para las ratas de control (24\pm4, n=4) (p<0,001). Después de 7 días, la frecuencia de evacuación era todavía persistentemente elevada (38\pm4, n=4) (p<0,05). No había diferencia en el volumen de micción total entre las ratas tratadas con CYP (20,5 \pm9,2 ml) y las de control (15,2\pm6,1 ml). La infusión de un donante de NO (SNAP: n=5 o SNP: n=3) aumentó el intervalo de intercontracción (ICI) (64%), pero no cambió la amplitud de las contracciones de la vejiga. El tratamiento con L-NAME (n= 8) no alteró la ICI o amplitud (Tabla 3).
Además, las ratas inyectadas con CYP se siguieron durante más de 7 días y se demostró la frecuencia de evacuación elevada persistente, de acuerdo con la irritación de la vejiga.
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TABLA 3 
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3
Los experimentos anteriores demostraron que la CYP causaba irritación de la vejiga a largo plazo y que los donantes de NO intravesicales invertían de forma aguda y eficaz la actividad de la vejiga inducida por la CYP. Sin querer estar ligados por la teoría, se plantea la hipótesis de que este efecto del fármaco no se debe a una relajación del músculo liso, si no más bien es mediada por un cambio en la excitabilidad del nervio aferente que aumenta el intervalo de intercontracción, pero no cambia la amplitud de la contracción. Los donantes de NO tópicos se pueden considerar como un tratamiento para la cistitis mediada por ciclofosfamida y otros agentes inflamatorios.
C. Terapia génica de iNOS mediada por mioblastos en el sistema genito(urinario)
Después se llevaron a cabo experimentos para demostrar que la terapia génica de iNOS de acuerdo con la presente invención es ventajosa y eficaz para el uso terapéutico en el sistema genitourinario.
1. Terapia génica de iNOS para la disfunción eréctil: comparación entre plásmidos, adenovirus y vectores de mioblastos transducidos con adenovirus
Se insertó el gen que codificaba la forma inducible de la NOS (iNOS) en un plásmido y en un vector adenovírico. El plásmido de iNOS era como han descrito D.K. Nakayama y col., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 7:471-476. El vector adenovírico de iNOS era como han descrito D.A. Geller y col., 1993, Proc. Natl. Acad Sci USA, 90:3491-3495 y en las patentes de EE.UU. nº 5.658.565 y 5.468.630. Mediante la inyección de una solución de plásmido, virus o mioblastos transducidos con virus, se introdujo en el pene de rata la iNOS humana exógena.
Se inyectó en el pene de ratas adultas macho mioblastos transfectados con vectores adenovíricos que llevaban el gen de la \beta-galactosidasa. Después de 2, 4 y 7 días, se evaluó la tinción de X-gal y los efectos fisiológicos de X-gal. Se ensayaron inyecciones de 100 \mul de adenovirus con títulos de 10^{6}-10^{9}. Los mioblastos se sembraron con una densidad de 5x10^{4} células por pocillo y se transdujeron con reserva de adenovirus (MDI=50). Las inyecciones estaban en el intervalo de 1,33 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células por 100 \mul. Se midieron la presión intracavernosa (ICP) base y la ICP máxima después de estimulación del nervio cavernoso. También se llevaron a cabo la inmunohistoquímica de la iNOS y la PCR del cebador de la iNOS humana. Para los experimentos con plásmidos, se inyectaron 100 \mug de plásmido en 100 \mul de sacarosa al 20%/PBS para inyectar en la vejiga, pene y uretra.
Las condiciones óptimas para la transfección de genes se determinaron variando el número de partículas de virus (ufc), concentración, volumen y vehículo de la solución inyectada. El nivel de expresión de la iNOS o del gen indicador dependía del tiempo. La expresión máxima se encontró a los 4 días, con niveles inferiores el día 2 y niveles mínimos el día 7. El día 4, la expresión de genes era la mayor para mioblastos+adenovirus > adenovirus > plásmido. Se detectaron en el pene tratado la tinción inmunohistoquímica de la iNOS y proteínas del adenovirus. El análisis de transferencia Northern para la iNOS humana era positivo sólo en los animales transfectados con genes. No había diferencia en la ICP base o máxima entre los animales de control y los tratados con el gen indicador de la \beta-galactosidasa: sin embargo, había un aumento significativo de la ICP base (52\pm23 cm H_{2}O) en el pene tratado con genes frente al control (5\pm6 cm H_{2}O). La ICP máxima aumentó el doble en las ratas transfectadas con iNOS.
Los resultados demostraron que la terapia génica mediada por mioblastos era más satisfactoria para suministrar iNOS en el pene que los procedimientos de transfección directos de virus o plásmido. La terapia génica de NOS de acuerdo con la presente invención es, por lo tanto, prometedora para proporcionar un nuevo tratamiento para la disfunción eréctil.
2. Medición de la terapia génica de iNOS
La liberación de NO se confirmó usando un microsensor porfirínico puesto directamente en los tejidos tratados con la terapia génica de NOS inducible (iNOS) (L.A. Birder y col., 1998, American Urological Association Meeting, 1998). Se usó la transferencia de genes ex vivo para poner el gen de la iNOS humana en el pene y la vejiga de ratas macho S.D. Se inyectaron inyecciones de 100 \mul de mioblastos infectados suspendidos en solución salina con un recuento total de células de 1,33 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células por inyección en el cuerpo cavernoso de la rata. Se inyectó en la vejiga una solución similar; sin embargo, la concentración de células estaba en el intervalo de 1,33 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células por 10 \mul de inyección. Los mioblastos transducidos se prepararon incubándolos durante 24 horas con el vector adenovírico que contenía el gen de la iNOS con una multiplicidad de infección de 50 partículas de virus por célula. Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica en las células cultivadas para asegurar la infección adecuada y la producción de proteína iNOS.
La liberación de NO en la vejiga y el pene se midieron poniendo la punta de un microsensor porfirínico recubierto con Naflon (dia. 10 \muM; límite de detección, 5 nM; tiempo de respuesta, 1 ms) directamente en la superficie de la vejiga (mucosa y serosa) y en el cuerpo cavernoso, respectivamente. La concentración máxima de liberación de NO de 1-1,3 \muM la provocó el agonista adrenérgico norepinefrina (3 \muM) y también el cofactor de la iNOS, tetrahidrobiopterina (TBH4).
La incorporación del gen de la iNOS en el pene y la vejiga se detectaron por tinción inmunohistoquímica positiva de los anticuerpos de iNOS y adenovirus, y el análisis de transferencia Northern para la producción de ARN de iNOS humana era positivo sólo en animales transfectados con el gen de la iNOS humana. El microsensor porfirínico midió niveles bajos pero similares de liberación de NO constitutivo en diferentes zonas de la vejiga. La adición de TBH4 100 \muM produjo un pico breve (< 5 segundos) en la liberación de NO (1-5 nM) en zonas de control de la vejiga.
En las zonas inyectadas con genes de iNOS, había una liberación sostenida (> 1 min) de grandes cantidades de NO (> 20 nM). El microsensor porfirínico demostró mayor liberación de NO en zonas de la vejiga tratadas con terapia génica de iNOS mediada por células mioblastos.
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Ejemplo 8
(Ejemplo sólo informativo)
El uso de cofactores tales como factores tróficos, es decir, citoquinas, expresados por mioblastos genéticamente transformados para contener genes que codifican dichos factores, es un aspecto beneficioso de la presente invención.
Las lesiones relacionadas con el músculo son un problema estimulante en muchos campos de la medicina. Incluso aunque los músculos retienen su capacidad para la regeneración después de lesión, se ha encontrado que el proceso de curado de los músculos después de dichas lesiones es muy lento y a menudo conduce a una recuperación muscular incompleta. Para desarrollar procedimientos para mejorar la curación de músculos después de lesión, p. ej., lesión de la pared de la vejiga o uretra (lesión criogénica), los autores de la presente invención han desarrollado modelos de lesión reproducibles para la contusión, distensión y laceración musculares.
Las investigaciones relacionadas con la presente invención han mostrado que se produce la regeneración muscular después de las lesiones mencionadas, pero que el desarrollo de la formación de tejido de cicatriz limita mucho el procedimiento de curación natural. Así pues, se ha determinado ahora que podría usarse una potenciación del crecimiento muscular y regeneración para mejorar la curación muscular después de lesiones. Por consiguiente, se identificaron factores de crecimiento que potenciaban, no sólo la proliferación y diferenciación de mioblastos in vitro, si no también la regeneración muscular en músculos lesionados, lo cual mejoraba la curación muscular después de lesiones. Estos descubrimientos también tienen aplicación directa en casos de lesión del músculo liso del tracto urinario inferior asociado con la incontinencia urinaria de esfuerzo y la contractilidad deteriorada de la vejiga.
A. Desarrollo de modelos animales para lesión muscular
La caracterización de procedimientos para mejorar la curación muscular después de lesiones requería el desarrollo de modelos de lesión muscular ortopédica reproducibles y bien definidos, incluyendo contusiones, laceraciones y distensiones, como se describe en el presente documento. La caracterización de la regeneración muscular después de estas lesiones permitió la determinación de la curación natural del músculo después de lesión. Los modelos de laceración, contusión y distensión musculares se desarrollaron en ratones.
Brevemente, la laceración muscular se realizó cortando el músculo gastrocnemio de un ratón con tijeras en un 60% de su longitud desde su inserción distal, 75% de su anchura y 50% de su grosor. La contusión muscular se hizo lanzando una bola de 16 gramos mediante un dispositivo de impacto, desde una altura de 100 cm al músculo gastrocnemio del ratón, y a distensión muscular se realizó alargando la unidad de músculo-tendón a un punto de distensión predeterminado a la velocidad de 1 cm/min.
Con el fin de evaluar la curación muscular después de lesión, se usó la tinción histológica (hematoxilina-eosina) junto con las técnicas de inmunohistoquímica para evaluar la expresión de desmina y vimentina. Puesto que la desmina es una proteína citoesquelética expresada de forma uniforme en las miofibras que se regeneran, se ha usado para localizar específicamente las miofibras que se regeneran. La vimentina es expresada en fibrocitos mononucleados y macrófagos y se ha usado en el presente documento como un marcador para la fibrosis.
Se ha observado que el músculo lesionado era capaz de curarse debido a una regeneración muscular masiva que se producía después de la lesión. El alto nivel de regeneración de miofibras musculares visto a los 7 y 10 días después de la lesión empezó a disminuir después de aproximadamente 14 días y continuó disminuyendo hasta los 35 días después del traumatismo. El desarrollo de una formación de tejido de cicatriz grande en el músculo lesionado puso de manifiesto que la curación del músculo no se había completado hasta los 35 días después de la lesión. De hecho, se observó que el desarrollo de la formación de tejido de cicatriz empezaba a los 14 días después de lesión y aumentaba gradualmente hasta los 35 días. Es probable que el desarrollo de fibrosis, que parece dificultar el proceso de curación, pueda estar relacionado con la reducción de la regeneración muscular que también se observa a los 14 días después de la lesión.
B. Caracterización de los efectos de varios factores de crecimiento en la proliferación y fusión de mioblastos in vitro
Un enfoque para mejorar la curación muscular después de lesión es acelerar la regeneración muscular. Un modo de lograr esta aceleración es aumentando la actividad miógena de las células musculares en el músculo lesionado. Las sustancias que potencian la proliferación y diferenciación de mioblastos in vitro pueden aumentar también la regeneración muscular in vivo y prevenir el desarrollo de formación de tejido de cicatriz.
Durante la regeneración muscular, el músculo lesionado libera numerosos factores de crecimiento para modular la regeneración muscular. Estas proteínas activan las células satélite para que proliferen y se diferencien en miofibras para mantener la regeneración muscular (E. Schultz, 1989, Med. Sci. Sports Exer, 21:181; T. Hurme y H. Kalimo, 1992, Med. Sci. Sports Exer., 24:197-205; R. Bischoff, "The satellite cell and muscle regeneration. Myology". 2nd Edition. New York, McGraw-Hill, Inc, pp.97-118, 1994). Se ha encontrado que durante el crecimiento y desarrollo del músculo esquelético, numerosas sustancias de crecimiento son capaces de inducir diferentes respuestas desde el músculo esquelético. De hecho, se han mostrado efectos individuales de estos factores de crecimiento en etapas específicas de la regeneración muscular (R.L. Chambers y J.C. McDermott, 1996, Can. J. Appl. Physiol., 21:155-184; J.R. Florini y K. Magri, 1989, Am. J. Physiol., 256:701-711; M.D. Ground, 1991, Path. Res. Pract, 187:1-22).
Se ha estudiado en varios factores de crecimiento, que incluyen factores de crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos (aFGF y bFGF); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento transformante \beta o \alpha (TGF-\beta o TGF-\alpha); y factor de crecimiento nervioso (NGF), su capacidad de potenciar la actividad miógena de las células musculares in vitro. Se cultivaron mioblastos con estos factores tróficos con diferentes concentraciones (1, 10 y 100 ng/ml), y se hizo el seguimiento de la proliferación y diferenciación de mioblastos a las 48 y 96 horas después de incubación. Los descubrimientos del presente documento pusieron de manifiesto que b-FGF, IGF-1 y NGF, potenciaban significativamente cada uno la proliferación de mioblastos in vitro.
Además, se encontró que bFGF, aFGF, IGF-1 y NGF eran capaces de aumentar la diferenciación de mioblastos en miotúbulos (Tabla 4). Otros factores de crecimiento no eran capaces de aumentar significativamente la proliferación ni la diferenciación de mioblastos. Estos resultados mostraron que bFGF, NGF y IGF-1 potenciaban significativamente la proliferación de mioblastos, mientras que b-FGF, \alpha-FGF, IGF-1 y NGF aumentaban la diferenciación de mioblastos en miotúbulos. Por lo tanto, estos factores proporcionan resultados beneficiosos cuando se suministraban a un músculo lesionado, para mejorar la curación muscular después de lesión, de acuerdo con la presente invención (Tabla 5).
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TABLA 4
4
C. Transferencia de genes directa y ex vivo de factores tróficos seleccionados
La técnica elegida para suministrar factores de crecimiento prospectivos a músculos lesionados es de suma importancia para optimizar el beneficio terapéutico. Las opciones incluyen la inyección directa de factores de crecimiento, la terapia génica directa, terapia génica ex vivo y transplante de mioblastos.
El suministro ex vivo del gen marcador de la \beta-galactosidasa al músculo lesionada produce muchas miofibras positivas para \beta-galactosidasa. El procedimiento mediado por células musculares ex vivo proporciona no sólo un procedimiento eficaz para suministrar genes seleccionados, si no que también proporciona células capaces de participar en el proceso de reparación, similar al transplante de mioblastos. Sin embargo, el transplante de mioblastos carece de manipulaciones genéticas in vitro. Además de esta aplicación, frente a enfermedades musculares heredadas, se ha mostrado que el transplante de mioblastos mejora la regeneración de miofibras en músculo lesionado experimentalmente con agentes mionecróticos. Por lo tanto, las técnicas estrechamente relacionadas de terapia génica ex vivo mediada por células musculares y transplante de mioblastos, son ambas aplicables a las lesiones musculares.
Las inyecciones directas individuales de b-FGF, IGF-1 y NGF en el músculo lesionado (p. ej., laceración, contusión y distensión) pueden aumentar el número de miofibras que se regeneran in vivo y aumentar tanto la contracción muscular como la tensión tetánica 15 días después de lesión. Sin embargo, secundario a la rápida eliminación y a las cortas semividas, el efecto de las inyecciones directas de factores de crecimiento es bastante transitoria y no es óptima, debido a la rápida eliminación del producto de los sitios lesionados y la corta semivida de estas proteínas. En contraste, la expresión de genes persistente mediante la terapia génica mediada por células, de acuerdo con la presente invención, puede mejorar más la curación muscular después de lesiones. La transformación de vectores capaces de expresar estos factores de crecimiento abre nuevas vías de tratamiento de los músculos lesionados. También de acuerdo con la presente invención, la terapia génica basada en la transferencia de genes directa y ex vivo es capaz de suministrar un gen (p. ej., un marcador génico) en el músculo lesionado (es decir, laceración, contusión o distensión).
La terapia génica directa para suministrar genes al músculo esquelético es posible usando retrovirus de ADN desnudo, adenovirus, virus herpes simplex y virus adenoasociados. La mayoría de estos vectores transducen relativamente pocas miofibras adultas. Sin embargo, el adenovirus es capaz de transducir un gran número de fibras musculares que se regeneran, una condición presente en el músculo lesionado.
La inyección directa de adenovirus que contiene el gen marcador de la beta-galactosidasa en el músculo lacerado, contusionado y con distensión, da como resultado muchas miofibras transducidas a los 5 días. Además, la inyección directa de adenovirus que lleva genes de factores de crecimiento (es decir, bFGF, IGF-1, NGF) debería dar como resultado la producción sostenida de proteína en el músculo lesionado. La inyección directa de virus adenoasociados (AAV) da como resultado un alto nivel de transducción de miofibras adultas tanto en el músculo lesionado como el no lesionado. El AAV puede ser el vector preferido para el suministro directo de genes al músculo esquelético maduro, aunque sólo puede llevar genes de 1-4 kpares de bases.
De acuerdo con la práctica de la presente invención, la inyección de células derivadas de músculo transformadas que expresan IGF-1, pueden mejorar la curación muscular después de lesión por laceración, cuando se inyectan por vía intramuscular en el sitio lesionado. El músculo inyectado con las células derivadas de músculo que expresan IGF-1, presenta una contracción y tensión tetánica rápidas y mayores que el músculo lesionado tratado con solución salina. Estos resultados sugieren que la inyección de células derivadas de músculo transformadas para expresar IGF-1 puede usarse para mejorar la curación muscular después de lesiones ortopédicas, que incluyen laceración, contusión, distensión, isquemia y denervación (Tabla 5). Puesto que se ha encontrado que el adenovirus es inmunógeno, se construyó un virus adenoasociado para llevar el gen para la expresión de IGF-1 (Fig. 12). Este virus se usa para transformar células musculares que se inyectarán después de transformación in vitro para expresar IGF-1 en el músculo lesionado y por consiguiente mejorar la curación muscular después de lesión.
Se ha determinado también que la transferencia de genes ex vivo mediada por mioblastos podría suministrar eficazmente adenovirus que expresan \beta-galactosidasa en el músculo lesionado. De hecho, el procedimiento ex vivo mediado por mioblastos daba como resultado la producción de muchas miofibras positivas para \beta-galactosidasa en el músculo lesionado después de laceración, contusión y distensión. Por consiguiente, es probable que los mioblastos inyectados que expresan factores de crecimiento puedan mejorar la regeneración muscular por la producción de factores de crecimiento, y servir como una reserva de mioblastos adicionales que son capaces de formar nuevas miofibras.
TABLA 5
5
D. Transplante de mioblastos para potenciar la regeneración muscular y mejorar la curación muscular después de lesión
El transplante de mioblastos, que consiste en la implantación de precursores de mioblastos (células satélite), potencia la regeneración muscular y crea un depósito de mioblastos normales que pueden fusionarse y suministrar genes al músculo esquelético.
Para mejorar la curación muscular después de lesión, se obtiene una biopsia muscular de un músculo no lesionado del mismo individuo que servirá como un donante autólogo para la transferencia de mioblastos del músculo lesionado. El uso de la transferencia de mioblastos autólogos evita el problema de rechazo inmunitario bien documentado, que es un obstáculo importante en el transplante de mioblastos (J. Huard y col., 1994, Human Gene Ther, 5:949-958; J. Huard y col., 1994, J. Clin. Invest., 93:586-599), y conduce a una mejor curación muscular después de lesión.
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Ejemplo 9
(Ejemplo sólo informativo)
En este ejemplo se evaluó la transferencia de células mediada por mioblastos para mejorar, reducir o eliminar una serie de afecciones ortopédicas. Los modelos animales usados eran conejos recién nacidos y ratones SCID adultos. Dichos experimentos se dirigen a la utilidad de la terapia génica mediada por células mioblastos para afecciones patológicos del sistema musculoesquelético, por ejemplo, la artritis y daño de las articulaciones, ligamentos, cartílago y menisco.
Los autores de la presente invención han realizado un número grande de experimentos que investigan la transferencia de genes mediada por mioblastos para afecciones ortopédicas. Aunque se ha mostrado que la transferencia de genes ex vivo usando células sinoviales suministra genes que codifican proteínas antiartríticas en la articulación de la rodilla del conejo, el éxito del uso de células sinoviales está limitado por una expresión transitoria del transgén. De acuerdo con la presente invención, se usaron células musculares como un vehículo alternativo de suministro de genes a la articulación tanto de conejos recién nacidos como de ratones SCID adultos. Se demostró que los mioblastos eran transducidos con una eficacia mayor que las células sinoviales usando la misma preparación de adenovirus para infectar/transducir las células in vitro. Después de la inyección intraarticular de las células musculares genéticamente transformadas, los mioblastos transformados se adherían a varias estructuras en la articulación, incluyendo el ligamento, cápsula y sinovia. Además, los mioblastos se fusionaban para formar muchos miotubos y miofibras postmitóticos en diferentes sitios de la articulación de conejo recién nacido, 5 días después de la inyección.
En las rodillas de los ratones SCID adultos, los mioblastos se fusionaban y expresaban el gen indicador durante al menos 35 días después de la inyección. La presencia de miofibras postmitóticas en la articulación de la rodilla pone de manifiesto las ventajas de la presente invención para la expresión a largo plazo de la proteína secretada. Actualmente, muchos tejidos en la articulación (ligamento, menisco, cartílago) tienen una capacidad de curación intrínseca pequeña y con frecuencia necesitan correcciones quirúrgicas. Un vehículo de suministro de genes estable a la articulación, que produce proteínas que mejoran estas diferentes afecciones musculoesqueléticas, proporciona un cambio para las implicaciones clínicas de las patologías de las articulaciones.
A. Preparación de mioblastos primarios y células sinoviales
Se sacaron los músculos de pierna de conejo recién nacidos (2 días de edad), y se aisló el tejido muscular de otros tejidos conectivos, vascular, cartilaginoso y óseo con un microscopio de disección. El tejido miógeno aislado se disoció por tratamiento enzimático con colagenasa al 0,2% (1 hora) y tripsina al 0,1% (30 minutos) para aislara las células satélite. Los cultivos primarios de células miógenas se enriquecieron por presiembra (1 hora) de la suspensión de células en matraces de cultivo tisular de 24 cm^{2} recubiertos con gelatina al 2%. Puesto que los fibroblastos tienden a adherirse al sustrato más rápido que los mioblastos, el líquido sobrenadante que contenía mioblastos y otros tipos de células se volvió a sembrar y se mantuvo en medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS) durante tres días para obtener aproximadamente 5 x 10^{6} células mioblastos por matraz.
Los cultivos primarios de fibroblastos sinoviales se prepararon a partir de sinovia diseccionada de conejos blancos adolescentes de Nueva Zelanda. Las células se hicieron crecer en medio Ham F-12 complementado con FBS al 10% (S. Floyd y col., 1997, Basic Appl Myol., 7(3&4)).
B. Preparación de mioblastos y células sinoviales a partir de líneas celulares inmortalizadas
Se aisló la línea celular de mioblastos mdx de un ratón mdx transgénico que llevaba un antígeno T de SV40 termolábil bajo el control de un promotor inducible (J. Huard y col., 1994, Human Gene Ther, 5:949-958; J. Huard y col., 1994, J. Clin. Invest., 93:586-599). La línea celular mdx permanente prolifera indefinidamente en condiciones permisivas (33ºC con interferón gamma) y experimenta diferenciación normal a 37-39ºC sin interferón gamma. La línea de células sinoviales derivadas de conejo, inmortalizadas HIG-82 (H.I. Georgescu y col., 1988, In Vitro Cell. Dev. Biol., 24:1015-1022) se propagó en medio Ham F-12 complementado con FBS al 10%.
C. Comparación de la eficacia de transducción de los diferentes tipos de células
Una vez preparados todos los tipos de células (es decir, mioblastos primarios e inmortalizados y células sinoviales primarias e inmortalizadas), se sembraron 50.000 células de cada tipo en placas de 6 pocillos. Cada pocillo después se incubó durante 48 horas con un vector adenovírico que llevaba el gen indicador LacZ bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (AV-HCMV-LacZ de Genvec) con una multiplicidad de infección de 25 (MDI=25). Después, las células se tiñeron para ver la presencia de \beta-galactosidasa usando histoquímica con X-gal. También se cuantificó la actividad de \beta-galactosidasa usando el ensayo de LacZ (J. Huard y col., 1997, Human Gene Ther, 4:439-450).
D. Diferenciación de mioblastos in vitro y tinción de desmina
Algunos cultivos de mioblastos se dejaron diferenciar usando un medio de fusión que contenía DMEM complementado para contener FBS al 2%. Este medio de fusión redujo la proliferación celular y promovió la fusión de mioblastos. Después de formarse miotubos en el cultivo, también se llevó a cabo la tinción de X-gal. Además, también se llevó a cabo la inmunohistoquímica de desmina patrón (marcador muscular específico) para validar el índice de miogenicidad de estos cultivos celulares (J. Huard y col., 1995, Gene Therapy, 2:1-9; D.K. Booth II y col., 1997, J. Tissue Eng., 32:125-132; J. VanDeutekom y col., Human Gene Therapy, 1997).
E. Determinación del destino temprano de las células musculares inyectadas en la articulación de conejo recién nacido
Las células sinoviales primarias, células sinoviales inmortalizadas, células musculares primarias y cultivos de mioblastos inmortalizados se infectaron primero con una MDI de 25 con AV-HCMV-LacZ durante 24 horas como se ha descrito antes. Después de la infección vírica, las células se aclararon y se incubaron más con una dilución 1:1000 de microesferas de látex fluorescentes (FLM) (Microprobes, Inc.) durante 12 horas adicionales. Las FLM son microesferas fluorescentes que son fagocitadas por las células y pueden servir como un marcador adicional para seguir el destino temprano de las células inyectadas en la articulación (A. Satoh y col., 1993, J. Histochem. Cytochem., 41:1579-1582):
Las células infectadas incubadas con FLM se inyectaron en las rodillas de crías de conejo recién nacidas. Cada matraz de 1 x 10^{6} células se tripsinizó usando Tripsina-EDTA al 0,5%, se centrifugaron a 3500 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en 100 \mul de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Las crías recién nacidas se anestesiaron usando inhalación de metofano durante 1 minuto. Se inyectaron 100 \mul de soluciones de células musculares infectadas (1 x 10^{6} células) en la articulación de la rodilla por el tendón de la rótula usando una aguja de calibre 30. Se usó un total de 10 crías de conejo: a 2 (4 rodillas) se les inyectaron las células musculares primarias; a 2 (4 rodillas) se les inyectaron las células sinoviales inmortalizadas; a 4 (8 rodillas) se les inyectaron los mioblastos inmortalizados; a 1 (2 rodillas) se le inyectó solución salina; y 1 (2 rodillas) sirvió como un control no inyectado simulado.
Las crías se sacrificaron 5 días después de inyección, y se sacaron las rodillas en su totalidad. Las rodillas se congelaron rápidamente y se seccionaron en el criostato en su totalidad en láminas de 10 \mum de grosor. Se llevaron a cabo diferentes análisis en estas secciones de rodilla, que incluían: tinción histológica (hematoxilina-eosina); detección de \beta-galactosidasa; localización de FLM y marcaje de inmunofluorescencia de desmina. La distribución de las FLM y desmina se visualizó usando microscopía de fluorescencia (Nikon Optiphot-2). Se usó la colocalización de FLM y \beta-galactosidasa para confirmar la expresión del transgén de las células inyectadas. Este marcador adicional minimizaba los cambios de los resultados positivos falsos que ocurren a menudo debido a la expresión endógena de LacZ. Además, se investigó la fusión de mioblastos en las estructuras intraarticulares usando marcaje con desmina.
Se usaron conejos recién nacidos para esta fase del análisis porque sus rodillas no empiezan a calcificar hasta los 15 días de edad. Por lo tanto, se pueden congelar rápidamente en su totalidad y analizar la rodilla entera de forma sistemática. El análisis sistemático de las secciones de criostato que demuestran la terapia génica en la articulación, no se ha hecho previamente. Este procedimiento permitía la caracterización de las diferentes estructuras intraarticulares a las que se habían adherido las células transducidas.
F. Determinación de la expresión a largo plazo de las células musculares transducidas inyectadas en las articulaciones de ratones SCID adultos
Se incubaron 5 x 10^{5} células musculares inmortalizadas transducidas infectadas con el vector AV-HCMV-LacZ (MDI=25) con FLM, se volvieron a suspender en 10 \mul de HBSS y se inyectaron en las rodillas de 12 ratones adultos SCID (inmunodeficientes). Se sacrificaron 3 ratones los días 5, 15, 25 y 35 después de inyección. Las rodillas primero se descalcificaron a 4ºC en una dilución 50:50 de EDTA 0,5 M y solución de glucosa 1 M durante 3 días. Después se congelaron rápidamente y se seccionaron en el criostato en su talidad en láminas de 10 \mum de grosor. Se analizó la expresión de \beta-galactosidasa usando histoquímica de X-gal y la localización de las FLM se visualizó usando microscopía de fluorescecia (Nikon Optiphot-2). En este experimento se usaron ratones SCID para evitar las potenciales complicaciones inmunológicas asociadas con la primera generación de adenovirus. Los ratones adultos se usaron para asegurar que la capacidad de los mioblastos para adherirse a estructuras intraarticulares era reproducible en la rodilla madura.
Este estudio se subdividió en tres secciones interrelacionadas, que se describen en lo sucesivo con gran detalle. Primero, se caracterizó in vitro la eficacia de la transducción vírica de mioblastos primarios, mioblastos inmortalizados, células sinoviales primarias y células sinoviales inmortalizadas, usando una primera generación de vector adenovírico. Esta fase comparaba los mioblastos con tipos de células que ya se han usado como vehículos de suministro de genes a la articulación.
Se analizó el destino temprano (5 días después de inyección) de las células musculares inyectadas en la articulación. Esta segunda fase incluía la evaluación de la viabilidad de las células inyectadas in vivo, determinación de las estructuras internas de la articulación a las que se adherían los mioblastos, evaluación de la transferencia génica de \beta-galactosidasa mediada por mioblastos y la caracterización de la capacidad de las células musculares para diferenciarse en miotubos y miofibras en la articulación.
La tercera fase analizaba la expresión a largo plazo de la transferencia de genes mediada por mioblastos en la rodilla adulta. Brevemente, se aisló un cultivo de células de mioblastos de una biopsia muscular. Después, estas células se transdujeron in vitro mediante un vector adenovírico que llevaba el gen indicador LacZ. Los mioblastos transducidos se inyectaron en la articulación de la rodilla.
I) Análisis in vitro
Los cuatro tipos de células: células sinoviales primarias, células sinoviales inmortalizadas, mioblastos primarios y mioblastos inmortalizados se aislaron, se hicieron crecer y se transdujeron con el vector AV-HCMV-LacZ in vitro. Se observo la expresión de \beta-galactosidasa en las células sinoviales (Figs. 3A y 3B) y en mioblastos (Figs. 3C y 3D) a los 2 días (Figs. 3A y 3C) y 6 días (Figs. 3B y 3D) después de infección. Sin embargo, cuando se permitió que los mioblastos inmortalizados transducidos se fusionaran en cultivo, se vieron múltiples miotubos multinucleados fusionados que expresaban la \beta-galactosidasa (Fig. 3D). La tinción fluorescente positiva para desmina (verde fluorescente - FITC) validaba el alto índice de miogenicidad del cultivo de mioblastos (Fig. 3E).
Cuando se analizaron los diferentes tipos de células en el ensayo de LacZ a los 2 días después de infección, las células sinoviales primarias, sinoviales puras y musculares primarias habían producido de 2,5 a 5,0 picogramos de \beta-galactosidasa por 1 millón de células. En contraste, los mioblastos inmortalizados, transducidos produjeron más de 20 picogramos de \beta-galactosidasa por 1 millón de células. Esto era significativamente mayor (ensayos T pareados) que en los otros tipos de células, p<0,05 (Fig. 3F). Además, la transducción de mioblastos y células sinoviales con adenovirus que llevan la expresión de IL-1 Ra conduce también a una mayor producción de IRAP por las células mioblastos que las células sinoviales (Fig. 4).
II) Determinación del destino temprano de células musculares inyectadas en la articulación
El examen histológico de las secciones de rodilla de conejo recién nacido demostró que los mioblastos inyectados se habían fusionado con la mayoría de las estructuras de la rodilla. El transplante de células sinoviales transducidas en la rodilla producía \beta-galactosidasa, pero sólo en algunas partes del revestimiento sinovial (S) de la articulación. Sin embargo, mediante la inyección de mioblastos primarios, se encontró que numerosos tejidos de la articulación, es decir, sinovia (S), menisco (M) y ligamento, contenían células que expresaban la \beta-galactosidasa. Con tinción de desmina (verde fluorescente - FITC), se detectaron muy pocos miotubos en la articulación inyectada con los mioblastos primarios.
El bajo nivel de la transferencia de genes mediada por inyección de mioblastos primarios, se puede atribuir a una disminución del número de células musculares y también a la población heterogénea de las células en estos cultivos (fibroblastos, adipocitos, etc.). De hecho, se logró una mejor complementación de genes en células musculares in vitro usando el cultivo de mioblastos inmortalizados comparado con el cultivo de mioblastos primarios que contienen otros tipos de células. Con el fin de validar esta hipótesis, después se investigaron los mioblastos de una línea celular inmortalizada usando un procedimiento ex vivo similar.
El transplante de mioblastos inmortalizados produjo parches grandes de células musculares que expresaban \beta-galactosidasa en el revestimiento sinovial adyacente a la rótula. Con la tinción inmunofluorescente de desmina, se visualizaron múltiples miotubos y miofibras fusionadas en la misma zona. Algunos de los miotubos se veían longitudinalmente y otros de otros se veía la sección transversal (estructuras circulares redondeadas). Estos miotubos y miofibras se formaban definitivamente por la fusión de mioblastos transplantados debido a la colocalización de células positivas para FLM y desmina. Además, algunos mioblastos inyectados se adherían al ligamento de la rótula y expresaban \beta-galactosidasa dentro de las estructuras de ligamento estriado. En esta misma zona, se describieron múltiples miotubos teñidos para desmina, demostrando así la presencia de células miógenas en este sitio.
La mayoría de las rodillas mostraron una propensión a que los mioblastos se congregaran y fusionaran en la cápsula de la articulación del receso lateral femoral. En contraste con las inyecciones de células sinoviales y mioblastos primarios, los mioblastos inmortalizados podían producir parches grandes de miotubos y miofibras que expresaban \beta-galactosidasa en la cápsula de la articulación. También se observaron en el mismo sitio modelos desorganizados grandes de miofibras que expresaban desmina colocalizada con FLM. Esto era muy diferente de los músculos in vivo extracapsulares que también se teñían positivos para la desmina, pero no tenían FLM. Con mayores aumentos, se vieron secciones transversales de fibras musculares positivas para desmina de diámetro grande colocalizadas con FLM, en la cápsula de la articulación (Day y col, 1997 J. Orthop. Res., 15, 894-903).
En partes de los ligamentos cruzados localizados en la escotadura femoral (FN), se observó la presencia de mioblastos que expresaban \beta-galactosidasa después de transplante de mioblastos inmortalizados, en la articulación. Sin embargo, se detectaron células positivas para desmina de forma más irregular y más pequeñas, sugiriendo la presencia de mioblastos que todavía no se habían diferenciado en miofibras. Con más aumentos, todavía se visualizaban secciones transversales de miotubos pequeños que contenían FLM en la escotadura femoral.
III) Determinación de la expresión a largo plazo de células musculares inyectadas en la rodilla de ratón adulto
Cuando se inyectaron mioblastos inmortalizados transducidos en la rodilla de ratones adultos SCID, también se vio la transferencia de genes mediada por mioblastos del gen indicador LacZ, en diferentes estructuras en la rodilla, incluyendo la sinovia, cápsulas y tejidos de la escotadura femoral. Se vio la producción de \beta-galactosidasa colocalizada con FLM a los 35 días después de inyección. En el grupo de 35 días, se vieron agregados grandes de estructuras redondeadas que sugerían miotubos y miofibras que producían \beta-galactosidasa en la escotadura femoral, sinovia y cápsula de la articulación.
La inyección directa de las células musculares transducidas en las estructuras intraarticulares conduce a un nivel alto de transferencia de genes en el menisco y el ligamento cruzado anterior. Las Figs, 5A-5D muestran los resultados de la transferencia de genes ex vivo mediada por mioblastos en menisco de conejo. Se inyectaron mioblastos transducidos con un vector adenovírico que llevaba el gen que codifica la \beta-galactosidasa (LacZ) en menisco de conejo. Las Figs. 5A y 5B muestran la expresión de LacZ en el menisco después de inyección y la expresión de \beta-galactosidasa. La fig. 5C muestra que la tinción de LacZ se colocaliza con las microsferas de látex fluorescentes en la zona de inyección. La fig. 5D muestra la expresión de desmina, un marcador miógeno (verde fluorescente).
Las Figs. 6A y 6B muestran los resultados de la transferencia de genes ex vivo mediada por mioblastos en el ligamento LCA de conejo. Se inyectaron mioblastos transducidos con adenovirus que llevaba el el gen que codifica la \beta-galactosidasa (LacZ) en el ligamento de conejo. Las Figs. 6A y 6B muestran la expresión de LacZ en el ligamento después de inyección y la expresión de \beta-galactosidasa. La fig. 6C muestra que la tinción de LacZ se colocaliza con las microsferas de látex fluorescentes en la zona de inyección. La fig. 6D muestra la expresión de desmina, un marcador miógeno (verde fluorescente), poniendo de manifiesto la presencia de células musculares en el ligamento.
Los datos in vitro destacan los efectos de numerosos factores de crecimiento sobre la proliferación de fibroblastos y producción de colágeno. De hecho, de acuerdo con la presente invención, se observó que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante \alpha (TGF-\alpha) y factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), mejoraban la proliferación de fibrocondrocitos del menisco y la expresión de colágeno y proteínas no colagenosas.
Independientemente de que factor de crecimiento se use para la curación del menisco, debe abordarse el problema principal del suministro de proteínas. Las inyecciones intrameniscales directas de la proteína factor de crecimiento recombinante no es probable que produzcan niveles sostenidos sin necesitar múltiples inyecciones, un escenario que no es apropiado clínicamente. El suministro eficaz y sostenido de los factores de crecimiento deseados se puede llevar a cabo mejor por el suministro de genes. Como se describe en el presente documento, el suministro de genes ex vivo mediado por células musculares ofrece la posibilidad de la expresión de genes con nivel alto y sostenido.
El procedimiento ex vivo mediado por células musculares se usó además para el suministró de genes marcadores al menisco de ratón. Los resultados demostraron que las células derivadas de músculo se pueden usar como un vehículo de suministro de genes al menisco (Figs. 5A-5D). La capacidad de las células derivadas de músculo para ser usadas como un depósito de moléculas secretoras para potenciar la curación del menisco y la capacidad de algunas poblaciones de células derivadas de músculo de diferenciarse en diferentes linajes, permite que dichas células participen en el proceso de curación del menisco. Estos descubrimientos pueden conducir a nuevas terapias para lesiones de menisco, que prevengan la morbosidad significativa de estas lesiones incapacitantes crónicas.
Además, la capacidad del cartílago del menisco de curarse en la parte central avascular del menisco es muy limitada, posiblemente directamente relacionado con el suministro de sangre que existe sólo en el tercio periférico del menisco. Estudios experimentales han mostrado que el proceso de curación en la parte central del menisco debe ser promovida por algunos estímulos quimiotácticos o mitógenos suministrados por el coágulo de fibrina o tejido sinovial. El uso del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que promueve la angiogénesis, es probable que sea útil para mejorar la curación de menisco. La Fig. 12 presenta un esquema de una construcción de virus adenoasociado que lleva la expresión del VEGF para suministrar mediante terapia génica basada en músculo y transformación de tejido.
IV) Uso de células musculares para suministrar genes en un defecto de cartílago
El cartílago articular tiene una capacidad limitada para la reparación después de lesión. Los defectos del cartílago articular que no penetran en el hueso subcondrial no pueden curar de forma eficaz y dan como resultado la degeneración del cartílago articular. Por otra parte, las lesiones que penetran en el hueso subcondrial dan como resultado la formación de fibrocartílago o cartílago de tipo hialina, que es diferente del cartílago articular normal, y finalmente conducen a la degeneración del cartílago de la articulación. De acuerdo con esta invención, las células musculares se usaron para suministrar genes en un defecto de cartílago (Fig. 14).
Además, la transposición de un colgajo muscular en un defecto de cartílago también se puede usar para mejorar la curación del cartílago (Fig. 13). Se prevé que la terapia génica basada en músculo y la transformación de tejido de acuerdo con la presente invención, se puedan usar para mejorar la curación de defecto de cartílago articular. El uso de virus adenoasociados que codifican moléculas tales como BMP-2, VEGF y IGF-1 se puede usar para mejorar la curación del cartílago articular, como se describe en la representación esquemática de la Fig. 12.
Además, muchas afecciones musculoesqueléticas adquiridas serían susceptibles de nuevos vehículos que suministren genes y su expresión de forma segura y eficaz, en concreto, en la artritis degenerativa, daño de cartílago, daño de ligamento, uniones demoradas o no uniones en fracturas, osteosarcoma y diferentes enfermedades reumatoides. Puesto que la articulación de la rodilla padece muchas de estas afecciones, la terapia génica mejorada en la articulación, por ejemplo, como un sistema de suministro de fármacos, es un logro importante y necesario en la técnica, y lo proporciona fácilmente la presente invención.
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Ejemplo 10
(Ejemplo solo informativo)
Este ejemplo presenta experimentos que se llevaron a cabo para demostrar el uso y ventajas de la transferencia de genes mediada por mioblastos para mejorar un defecto óseo.
Se aisló una línea celular de mioblastos de un ratón mdx transgénico que llevaba un antígeno T de SV40 termolábil bajo el control de un promotor inducible (J.E. Morgan et al., 1994, Dev. Biol., 162:486-498). La línea celular mdx inmortalizada proliferaba indefinidamente a 33ºC con interferón gamma y experimenta diferenciación normal a 37-39ºC sin interferón gamma. Estos mioblastos se mantuvieron en cultivo celular y se infectaron con el vector adenovírico-lacZ (MDI=25). Las células también se incubaron con microesferas de látex fluorescentes (FLM) que servían como otro marcador por el cual se podía seguir el destino de estas células en el defecto óseo. Antes de inyección, se analizó en algunos matraces que contenían las células transducidas, la producción de \beta-galactosidasa y expresión de desmina por tinción inmunofluorescente.
Se pusieron fijadores externos por cirugía en las tibias derechas de 8 conejos adultos. Se creó un defecto óseo de la tibia de 0,7 - 1 cm en el conejo mediante una osteotomía entre la segunda y tercera clavija del fijador externo. Se tripsinizaron 7 x 10^{6} mioblastos transducidos y se inyectaron en el músculo que rodeaba el defecto óseo durante la osteotomía. También se inyectó el mismo número de mioblastos transducidos por vía percutánea en el defecto óseo 24 horas después de la osteotomía. Un conejo osteotomizado no recibió las inyecciones de mioblastos y sirvió como un control de tratamiento simulado. Los animales se sacrificaron a los 6 días después de inyección, y en la pierna entera con el fijador externo en el sitio se analizó macroscópicamente la expresión de lacZ. Después, el tejido en el defecto y los músculos que lo rodean, se congeló rápidamente, se seccionó en el crisotato, y se ensayó la \beta-galactosidasa por histoquímica y la desmina por inmunofluorescencia como describen Day y col., 1997, J. Orthop. Res., 15:894-903). Las FLM se localizaron usando microscopía de fluorescencia.
Todos los defectos de tibia de los conejos a los que se inyectaron mioblastos transducidos demostraron producción de \beta-galactosidasa macroscópicamente en los músculos que rodeaban el defecto y en el propio defecto. En contraste, el defecto de control operado de forma simulada no demostró ninguna producción de \beta-galactosidasa. Cuando el tejido en el defecto se seccionó en el criostato y se analizó microscópicamente la expresión de lacZ, se vio que muchas células redondeadas que producían \beta-galactosidasa en el medio de los fibroblastos mucho más pequeños. Además, cuando se analizaron de forma concomitante con microscopía de fluorescencia, se colocalizaron numerosas FLM con las miofibras redondeadas que expresaban el gen indicador lacZ. La expresión de lacZ también se vio en los músculos que rodeaban el defecto que había recibido las inyecciones de mioblastos, el día 7 después de inyección.
También se analizó en el tejido con defecto seccionado la expresión de desmina, y también se colocalizaron con las FLM muchas zonas en el hueso inyectado que expresaban desmina. La tinción de desmina era indicativa de la presencia de células musculares que se habían fusionado en miofibras en la zona no muscular del defecto óseo segmental. Por lo tanto, los mioblastos suministraron satisfactoriamente el gen marcador en un defecto óseo, se expresó el producto proteínico, y las miofibras se habían formado, permitiendo así la persistencia de la expresión del producto génico en las células de miotubo fusionadas derivadas de células mioblastos genéticamente transformadas inyectadas en el hueso.
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Ejemplo 11
(Ejemplo sólo informativo)
Para confirmar que una población de células en el músculo esquelético era capaz de diferenciarse en hueso, se estimularon poblaciones variables de células derivadas de músculo con proteína BMP-2 y se analizó la diferenciación osteogénica in vitro como se describe a continuación.
Se obtuvieron cultivos de células primarias de un ratón mdx adulto (T.A. Rando y H.M. Blau, 1994, J. Cell. Biol., 125:1275-1287). Brevemente, se practicó la eutanasia en el ratón por dislocación cervical y se diseccionaron y trituraron inmediatamente 500 mg de músculo de extremidad posterior. El músculo se hizo digerir enzimáticamente por incubación seriada en colagenasa al 0,2%, dispasa (2,5 unidades/ml) y tripsina al 0,1%, cada una durante 1 hora a 37ºC. Cualquier acumulación celular restante se desasoció pasándola por una aguja de calibre 20. Después las células se sembraron en matraces recubiertos de colágeno en Ham F10 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), complementado para contener suero de caballo al 10%, suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomincina al 1%, y bFGF (recombinante humano, Life Technologies). Las células se subdividieron de acuerdo con sus características de adhesión celular por paso seriado del líquido sobrenadante celular a un nuevo matraz después de que 15-20% de las células se adhirieran al matraz. Esta técnica, denominada presiembra se describe en el Ejemplo 1, en la purificación de mioblastos primarios, en el presente documento. Este procedimiento se repitió seis veces dando 6 presiembras. Las células que se adherían antes a los matraces permanecían en las presiembras inferiores, mientras que las que pasaban a lo líquidos sobrenadantes se adherían en presiembras superiores. Los fibroblastos se adhieren más rápido de lo que lo hacen los mioblastos en las condiciones de este procedimiento; por lo tanto, las presiembras superiores están enriquecidas en mioblastos.
Las diferentes subpoblaciones de células se sembraron a 2 x 10^{4}/pocillo en placas de 12 pocillos. Las células de cada presiembra se incubaron en medio o en medio complementado que contenía BMP 50 ng/ml o 200 ng/ml. Se añadió BMP a los pocillos adecuados a los 1, 3 y 5 días después de la siembra. Se obtuvo un lisato celular 24 horas después de la estimulación final con BMP-2 para el ensayo de la actividad de la fosfatasa alcalina. Las células que se encontró que eran más sensibles se volvieron a examinar con estimulación con 100 ng/ml de BMP-2 en el mismo periodo de tiempo. Para estudiar el efecto de la estimulación de BMP-2 a lo largo del tiempo, después de cada adición de BMP-2 se separó una porción de las células para el análisis de la expresión de desmina y actividad de ALP.
El análisis de la expresión de desmina en las células se llevó a cabo por técnicas inmunohistoquímicas estándar. Las células se fijaron con metanol frío durante 1 minuto, se aclararon en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquearon con suero de caballo al 10% durante 1 hora. Después, las células se incubaron con una dilución 1/100 de anticuerpo anti-desmina de ratón (Sigma) durante 6-10 horas a 37ºC. Después de los aclarados con PBS, las células se incubaron con una dilución 1/100 de anticuerpo anti-ratón conjugado con el marcador fluorescente Cy3 (Sigma) durante 1 hora. La tinción se evaluó con un microscopio de inmunofluorescencia (Nikon). Los datos se cuantificaron examinando cinco campos diferentes con 10x aumentos y contando las células positivas y negativas para establecer una relación. La actividad de fosfatasa alcalina (en U/l) se determinó por la hidrólisis de fosfato de p-nitrofenol en p-nitrofenol y fosfato inorgánico usando un reactivo y protocolos disponibles en el comercio (Sigma). Cuando era adecuado, se llevó a cabo el análisis estadístico por ANOVA ensayando la diferencia estadística a intervalos de confianza mayores de 95%.
Los resultados mostraron que antes de la estimulación con BMP-2, las diferentes subpoblaciones de células derivadas de músculo se caracterizaban por tinción de desmina. Para las siembras de células, las células en la presiembra nº 1 se tiñeron positivas para la desmina en 3% frente a 70,5% de las células positivas en la presiembra nº 6. El porcentaje de células positivas para desmina aumentó con aumentos estadísticamente significativos entre la presiembra nº 3 y la presiembra nº 5, y entre la presiembra nº 5 y la presiembra nº 6. Es interesante que las células que tienen el nivel más alto de valor positivo para desmina tendían a aparecer redondas y se dividían más despacio que las de las presiembras más tempranas.
Después de estimulación con BMP-2, se ensayó en las subpoblaciones de células la inducción de la fosfatasa alcalina, un indicador bioquímico de la actividad osteoblástica (A. I. Caplan, 1991, J. Orthop. Res., 9:641-650). Se usó una población de células de estroma derivadas de ratón como un control positivo. Las células derivadas de músculo que no recibieron BMP-2 no expresaron actividad de ALP. Sólo la subpoblación obtenida de la presiembra nº 6 mostró un aumento en la actividad de ALP en respuesta a la estimulación con BMP-2. Se vio una tendencia dependiente de la dosis cuando se compararon los datos para la presiembra nº 6 usando BMP-2 en una concentración de 50 ng/ml frente a 200 ng/ml (Fig. 9).
De forma correspondiente al aumento en la actividad de ALP en respuesta a la estimulación con BMP-2 en la presiembra nº 6, disminuyó el porcentaje de células que se teñían para la desmina (Fig. 10). Después de una sola dosis de BMP-2, el porcentaje de células positivas para desmina en la presiembra nº 6 disminuyó de 70,5% a 47%. Dosis adicionales de 100 ng/ml de BMP-2 no produjeron una disminución como esa; el nivel de células positivas para desmina permaneció en aproximadamente 40%.
Además, se aislaron diferentes poblaciones de células derivadas de músculo de una biopsia de músculo humano y se purificaron por la técnica de presiembra. Cuando se estimularon con BMP-2 como se ha descrito antes, las células de algunas de las presiembras (es decir, pp2, pp3 y pp4 en menor medida) expresaron la fosfatasa alcalina (marcador para preosteoblastos). Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se pueden aislar y purificar células derivadas de músculo humanas y se ha mostrado que tienen características de células madre.
Las células aisladas de músculo esquelético son capaces de responder al recombinante humano (rhBMP-2) tanto in vitro como in vivo. Las células miógenas primarias de roedor en cultivo celular responden de una forma dependiente de la dosis a la rhBMP-2 produciendo fosfatasa alcalina, una proteína osteogénica. Además, cuanto más pura es la población de células miógenas, como se pone de manifiesto por la tinción de desmina, mayor es la producción de fosfatasa alcalina. La BMP-2 recombinante humana inhibe la diferenciación miógena puesto que estimula la diferenciación osteoblástica de células derivadas de músculo (A. Yamaguchi y col., 1991, J. Cell Biol., 113:681-687; T. Katagiri y col., 1994, J. Cell Biol., 127:1755-1766; K. Kawasaki y col., 1998, Bone, 23:223-231). Por consiguiente, los datos in vitro sugieren que 
\hbox{las
células miógenas son capaces  de responder a la
rhBMP-2 e introducir un linaje
osteogénico.}
Se transformaron células primarias derivadas de músculo de roedor para producir hueso intramuscular in vivo. El procedimiento ex vivo se usó para transducir las células primarias derivadas de músculo con un adenovirus que llevaba el ADNc de BMP-2. La inyección intramuscular de tan poco como 300.000 células transducidas produjo hueso en el ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID). El hueso producido contenía elementos osteoides y médula ósea como se puso de manifiesto por la histología regular y reacción de von Kassa para la mineralización. No sólo las células musculares transducidas producían BMP-2, si no que las células inyectadas también respondían a BMP-2 produciendo hueso.
Además, las células derivadas de músculo transformadas dentro de cámaras de difusión (véase el ejemplo 1) que impide la entrada de las células huésped debido al tamaño del poro, producían hueso cuando se implantaron por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Estos resultados sugieren que estas poblaciones específicas de células derivadas de músculo son capaces de producir hueso (Fig. 11). La capacidad de las células para diferenciarse en otros linajes tales como hueso, confirma la naturaleza pluripotente de estas células derivadas de músculo, es decir, células madre derivadas de músculo.
Como se ha descrito en lo que antecede, la técnica de presiembra proporcionaba un medio para conseguir diferentes poblaciones de células derivadas de músculo en diferentes presiembras. Con presiembras selectivas de células, se logró la formación de hueso (p. ej. Fig. 11), y por lo tanto, sugiere firmemente la presencia de células madre musculares. La Tabla 6 resume la expresión de diferentes marcadores por células derivadas de músculo de ratón purificadas.
TABLA 6
6
En la tabla 6, las Mdx pp nº 6 y normales pp nº 6 se obtuvieron de músculo de extremidad posterior de ratones mdx y normales recién nacidos, respectivamente, por la técnica de la presiembra como se describe en el presente documento. "+" indica que más de 95% de las células en el cultivo expresaban niveles altos de antígeno. "+/-" indica que aproximadamente 60% o 30% de las células en los cultivos expresaban el antígeno de MyoD o miogenina, respectivamente. "-/+" indica que menos de 10% de las células en el cultivo expresaban M-caderina, y "(+)" indica que más de 95% de las células en el medio de 
\hbox{fusión de tres días expresaba
la isoforma de la cadena  pesada de la miosina (MyHC).}
Además del procedimiento ex vivo, una transferencia de gen de BMP-2 directa mediada por adenovirus produjo grandes cantidades de hueso intramuscular. Por consiguiente, los datos tanto in vitro como in vivo apoyan la hipótesis de que las células musculares se pueden transformar para convertirse en células osteógenas. Las ramificaciones de la capacidad de las células miógenas para formar hueso son inmensas. De hecho, la capacidad del adenovirus que lleva la expresión de BMP-2 para inducir la formación de hueso ectópico radiográfica e histológica a las 2, 3 y 4 semanas después de inyección, sugiere que el colgajo de músculo se puede usar finalmente como un armazón biológico con la capacidad de mejorar la curación de tejido duro, incluyendo hueso y cartílago. De hecho, el uso de un colgajo de músculo tratado con adenovirus-BMP-2 puede ser capaz de mejorar la curación de hueso.
Puesto que el uso de vectores adenovíricos puede estar obstaculizado por las respuestas inmunitarias contra los vectores, se ha determinado que se requiere el uso de un vector menos inmunógeno para mejorar la formación de hueso usando el músculo como un armazón biológico. Por lo tanto, se han usado los virus adenoasociados como un nuevo vector vírico para mejorar la eficacia de la transferencia de genes al músculo esquelético maduro. Este vector se puede usar para suministrar BMP-2 en el colgajo de músculo para mejorar la curación del hueso. En la Fig. 12 se presenta una representación esquemática del uso de plásmidos para construir un virus adenoasociado que lleva la expresión de BMP-2.
La transformación de tejido basada en músculo para producir hueso se puede aplicar a múltiples anomalías esqueléticas. Uno de estos escenarios son los defectos óseos grandes que resultan de traumatismo o resecciones oncológicas. Las células derivadas de músculo capaces de formación de hueso se pueden explotar para reconstruir el defecto óseo y minimizar el uso de autoinjerto, aloinjerto y elongación ósea. Se puede transformar un colgajo de músculo para producir hueso y, por lo tanto, reconstruir un defecto óseo experimental. Las técnicas de terapia génica tanto ex vivo como in vivo son susceptibles de formación ósea y reconstrucción de defectos óseos.
Otro enfoque es transformar músculo, restringido a los límites de un molde de silicona, en hueso de la geometría deseada tal como un fémur proximal o parte media de la tibia (R.K. Khouri y col., 1991, JAMA, 266:1953). El procedimiento basado en músculo para reconstrucciones de defecto óseo es especialmente atrayente a la luz de la frecuente pobre vascularidad de los defectos óseos traumáticos y oncológicos. La combinación de músculo vascularizado y formación de hueso nuevo ofrece posibilidades revolucionarias para la reparación ósea.
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Ejemplo 12
Este ejemplo proporciona una aplicación típica y muy práctica de la terapia génica mediada por células derivadas de músculo y transformación de tejido, como proporciona la presente invención, para el tratamiento de la disfunción del tracto urinario en pacientes humanos. La presente invención ha proporcionado la capacidad de realizar suministro de genes en el tracto urinario inferior. Además, la presente invención ha demostrado que la terapia génica mediada por mioblastos era más satisfactoria en el suministro de iNOS que el uso de procedimientos de infección/transfección directa de virus o plásmidos.
La utilidad clínica directa de la presente invención ofrece a los expertos en la materia la capacidad para tratar a los pacientes de forma sencilla, segura y eficaz, de forma ambulatoria, e incluso en la consulta del médico. Por ejemplo, en una consulta de urología, los pacientes con incontinencia urinaria de esfuerzo se someten a una sencilla aspiración con aguja de su músculo, por ejemplo, el tríceps, que dura 5 minutos.
Las células musculares se hacen crecer en las condiciones de cultivo celular adecuadas en un laboratorio, preferiblemente, un laboratorio de un centro de biotecnología. Esta etapa tarda aproximadamente 1-4 semanas. Las células musculares cultivadas, ahora ampliamente aumentadas en número, se vuelven a enviar al médico que está haciendo el tratamiento y se vuelven a inyectar al paciente en un procedimiento endoscópico ambulatorio breve de 10 minutos. La inyección se lleva a cabo usando un pequeño citoscopio y una aguja citoscópica. Con la observación directa del cirujano, la punta de la aguja se inserta en el mecanismo del esfínter de la uretra y se inyecta la suspensión de mioblastos en la pared de la uretra para producir coaptación y cierre uretral.
Los mioblastos cultivados se pueden congelar y almacenar de forma indefinida para un posible uso futuro. Como se ha descrito, las células derivadas de músculo también se pueden usar para la terapia génica mediada por células con diferentes factores tróficos para aumentar y/o potenciar el tratamiento y el proceso de reparación en un tejido dado. También se pueden hacer procedimientos similares de inyección de mioblastos y terapia génica en la vejiga de pacientes con contractilidad deteriorada de la vejiga.
El número de células que se sacan del paciente no es necesario que sea muy grande, si las células posteriormente se ponen en cultivo donde proliferarán y aumentarán en número antes de la inyección. Para la inyección, el número de células usado lo puede determinar el médico usando medios rutinarios, dependiendo de la lesión, enfermedad o disfunción específica que se va a tratar, el tejido u órgano que se va a inyectar y la construcción de gen usada. En general, se usa un número de células menor para los procedimientos de suministro de genes/terapia génica, mientras que se usa un número mayor de células para la transformación de tejido y carga, es decir, del orden de aproximadamente 1 x 10^{4} a aproximadamente 1 x 10^{14}, preferiblemente de aproximadamente 1 x 10^{4} a aproximadamente 1 x 10^{6} para el suministro de genes. Si se encuentra que el número de células es demasiado pequeño para producir una cantidad eficaz del producto génico en y cerca del sitio de inyección, se pueden llevar a cabo fácilmente inyecciones repetidas y se pueden administrar según sean necesarias.
En la práctica del protocolo de los autores de presente invención, se ha encontrado que las células derivadas de músculo inyectadas permanecen en, y cerca de, el sitio de inyección en la vejiga, uretra, pene, músculo de la pierna, articulaciones de la rodilla y hueso, por ejemplo. Además, la histología de los diferentes tejidos después de inyección no ha mostrado una formación de tejido de cicatriz significativa, incluso si se usaban células alógenas. Con células derivadas de músculo autólogas, la formación de tejido de cicatriz es prácticamente nula.
En y cerca del sitio de inyección, los mioblastos inyectados se fusionaban y formaban miotubos según al espacio circundante. Una vez que las células han llenado la zona en el sitio de inyección, las miofibras formadas y las células ya no proliferan ni crecen. Las miofibras multinucleadas permanecen casi del mismo tamaño después de formarse y no proliferan ni mueren, Por lo tanto, a largo plazo las miofibras producían y segregaban establemente el producto génico del gen codificante expresado suministrado en la zona de inyección.

Claims (7)

1. Uso de mioblastos derivados de músculo esquelético histocompatibles con un receptor en la preparación de un medicamento para usar en la reparación de la disfunción muscular lisa en el tracto urinario.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los mioblastos derivados de músculo esquelético histocompatibles son mioblastos autólogos al receptor.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento está adaptado para inyectarse en la pared de la vejiga para mejorar la contractilidad del detrusor o en la pared de la uretra, como tratamiento para la incontinencia urinaria de esfuerzo.
4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho medicamento comprende los mioblastos derivados de músculo esquelético suspendidos en un medio.
5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medicamento está adaptado para una inyección de los mioblastos derivados de músculo esquelético en una concentración de 1,33 x 10^{5} a 10^{6} células.
6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la población clonada de mioblastos derivados de músculo esquelético se usa en la preparación de dicho medicamento.
7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los mioblastos derivados de músculo esquelético se han puesto en contacto con un factor de crecimiento, que comprende el factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) o factor de crecimiento nervioso (NGF).
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