ES2319891T3

ES2319891T3 - Factor implicado en la metastasis y usos del mismo.

Info

Publication number: ES2319891T3
Application number: ES03769423T
Authority: ES
Inventors: Anke Klippel-Giese; Jorg Kaufmann; Rolf Schwarzer
Original assignee: Silence Therapeutics GmbH
Current assignee: Silence Therapeutics GmbH
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2003-10-20
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2023-10-20
Also published as: US20100285038A1; PT1551868E; MXPA05004134A; KR20050056244A; DK1551868T3; CY1110313T1; JP4820092B2; ATE420102T1; SI1551868T1; US20060240022A1; CA2501333A1; EP1551868A2; DE60325754D1; AU2010246370A1; WO2004035615A3; KR101154130B1; IL167801A; BR0315411A; JP2006520183A; AU2003278112A1

Abstract

Uso in vitro de un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento de células en una matriz extracelular, en donde dicho factor: a) comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1; b) tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061931.1; c) está codificado por un ácido nucleico, en donde: ca) el ácido nucleico comprende: i) un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3; o ii) una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506686 o NM_019058.1; cb) el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y en donde el ácido nucleico se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico de acuerdo con ca); o cc) el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con ca); como una diana en dirección 3''o un marcador en dirección 3'' de la vía de la PI 3-quinasa, preferiblemente como una diana de fármaco en dirección 3'' de la vía de la PI 3-quinasa, en escrutinio de fármacos, diseño de fármacos y desarrollo de fármacos, en donde el fármaco es útil para cicatrización de heridas, inhibición del crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y el crecimiento de células en un matriz extracelular.

Description

Factor implicado en la metástasis y usos del mismo.

La presente invención se refiere al uso de un factor polipeptídico, y un ácido nucleico que lo codifica, como una diana en dirección 3' (downstream target), como un marcador para un proceso regulado por la fosfatidilinositol 3-quinasa (abreviadamente en lo sucesivo PI 3-quinasa) y en la generación y fabricación de un medicamento y un agente terapéutico.

El desarrollo de los modernos fármacos ya no se basa en un método más o menos heurístico, sino que típicamente implica la elucidación del mecanismo molecular que subyace bajo una enfermedad o estado, la identificación de moléculas dianas candidatos y la evaluación de dichas moléculas dianas. Es obvio que la identificación de una molécula diana candidato es esencial para dicho proceso. Con la secuenciación del genoma humano y la publicación de los datos de secuencias respectivos, en principio, están disponibles la totalidad de los ácidos nucleicos codificadores del hombre. Sin embargo, una importante limitación de estos datos es que típicamente no dan una indicación de la función de dicha secuencia. Aún más, el simple conocimiento de una secuencia de ácidos nucleicos codificante no es suficiente para predecir la función del polipéptido in vivo. Por consiguiente, a partir del estudio de las entradas de los bancos de datos, sin ninguna indicación apropiadamente validada, el experto en la técnica no puede obtener ninguna enseñanza técnica de cómo usar estos datos de ácidos nucleicos. Los métodos in silico permiten una primera posible indicación que, sin embargo, es propensa a errores y no refleja necesariamente la función real de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico respectiva. Situar dicho polipéptido en el contexto apropiado in vivo e in situ y elucidar su función en dicho contexto, es todavía una tarea pendiente que da lugar a hallazgos sorprendentes.

Una vez que está disponible una molécula diana validada, que también se denomina en la presente memoria diana o molécula diana, los candidatos de fármacos dirigidos a dicha molécula pueden ser escrutados o desarrollados y subsiguientemente ser sometidos a ensayos. En muchos casos dichos candidatos de fármacos son miembros de una quimioteca (compound library) que pueden consistir en compuestos naturales o sintéticos. También es usual el uso de quimiotecas combinatorias. Dichas quimiotecas también se denominan en la presente memoria quimiotecas de candidatos. Aunque en el pasado este método ha demostrado ser satisfactorio, todavía lleva mucho tiempo y es costoso.

Numerosos tumores y cánceres son todavía una gran amenaza para la salud humana. Para crear fármacos más seguros y potentes que tengan menos efectos secundarios, es necesario saber cómo las moléculas dianas, a las que son dirigidos los compuestos apropiados, pueden ser influenciadas específicamente y selectivamente en su actividad o presencia. Debido a la interacción, preferiblemente selectiva y específica, entre el compuesto, que puede ser un fármaco potencial o candidato, y la diana, puede ser influenciada la función de la diana en una enfermedad o estado morboso, tal como por ejemplo, cáncer, tumorigénesis y metástasis, y por tanto la enfermedad puede ser tratada o impedida y el estado morboso mejorado, respectivamente. Además del enfoque terapéutico basado en moléculas dianas recientemente identificadas y validadas, el método de diagnóstico también es importante. Dicho método de diagnóstico es adecuado para monitorizar el estado o enfermedad, bien sea antes del tratamiento o durante o después del tratamiento para permitir a las personas que toman decisiones, tales como los médicos, decidir si se debe proseguir con el tratamiento o adaptarlo a las necesidades del paciente individual.

El problema que subyace a la presente invención fue por tanto proporcionar una diana que sea específica para cánceres y tumores, respectivamente. Otro problema que subyace a la presente invención es proporcionar una diana que esté más particularmente implicada en la tumorigénesis y metástasis. Finalmente es un problema que subyace a la presente invención es proporcionar un marcador de diagnóstico relacionado con la tumorigénesis y metástasis.

Estos y otros problemas son resueltos por el objeto de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas pueden ser tomadas de las reivindicaciones dependientes.

La solicitud de patente internacional WO 02/46465 describe un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ.ID. NO. 2.

Shoshani et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 22, no. 7, pp. 2283 - 2293 describen la identificación de un gen sensible al factor-1 inducible por hipoxia.

En cualquier aspecto de la presente invención relacionado con un ácido nucleico, dicho ácido nucleico puede estar presente como DNA o RNA. También está dentro de la presente invención que el ácido nucleico pueda estar presente como un ácido nucleico monocatenario, parcialmente bicatenario o bicatenario. En una realización preferida el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está presente como un RNA monocatenario. Dicho RNA monocatenario se usa preferiblemente como un mRNA en un sistema de expresión, en donde el sistema de expresión es preferiblemente un sistema de expresión como se describe en la presente memoria. En una realización del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención dicho ácido nucleico es monocatenario y se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico que sea esencialmente complementario con el ácido nucleico que codifica el factor de acuerdo con la presente invención. En otra realización, el ácido nucleico monocatenario de acuerdo con la presente invención se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es esencialmente complementario con el ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que el factor polipeptídico que se denomina en la presente memoria factor 1 regulado por la vía de la PI 3-quinasa o PRF1 está implicado en cierto número de procesos biológicos a saber, cicatrización de heridas, metástasis, tumorigénesis, migración de células, motilidad celular en la matriz extracelular y crecimiento celular en la matriz extracelular. Estos procesos están bajo el control de la vía de la PI 3-quinasa.

La secuencia genómica del PRF1 está localizada en el cromosoma 10, más particularmente el locus es 10 pter-q 26.12. El gen comprende un total de 1.760 nucleótidos como se define usualmente. La entrada en el banco de datos respectivo que representa el cDNA se denomina NM_019058, más preferiblemente NM_019058.1 y gi 9506686. El cDNA que codifica el PRF1 se denomina en esta memoria SEQ ID NO. 2 y su secuencia codificadora SEQ ID NO. 3. Está dentro de la presente invención que el ácido nucleico que codifica el PRF1 pueda tener algunas variaciones, tales como en la posición 312, en donde C está reemplazado por G, en la posición 991, en donde A está reemplazado por T, en la posición 1247, en donde C está reemplazado por T, en la posición del complemento 1297, en donde C está reemplazado por T, en la posición 1958, en donde C está reemplazado por T, en la posición del complemento 1666, en donde A está reemplazado por G, y en la posición 1743, en donde A está reemplazado por C. Todas las posiciones se refieren al cDNA que también se denomina en la presente memoria SEQ ID NO. 2. El marco de lectura abierto empieza en la posición 198 y termina en la posición 896.

La secuencia de aminoácidos del PRF1 también se denomina en esta memoria SEQ ID NO. 1. La entrada respectiva que representa la secuencia de aminoácidos es NP 061931, más particularmente NP_061931.1 y gi 9506687.

El polipéptido de acuerdo con la presente invención también puede comprender variaciones, tales como, por ejemplo, en la posición del aminoácido 39 en donde R está reemplazado por G.

El polipéptido de acuerdo con la presente invención se ha denominado recientemente en la literatura científica REDD1, y como tal es descrito por Ellisen, L. W., en Molecular Cell, Vol. 10, 995-1005, Noviembre, 2002.

Ha de entenderse que puede haber algunos errores de secuenciación contenidos en cualquiera de dichas secuencias, sin embargo, se reconocerá por los expertos en la técnica que la secuencia básica es la especificada anteriormente que puede estar más madurada y a partir de los números de acceso anteriores puede obtenerse una secuencia corregida respectiva que por tanto también estará comprendida dentro del alcance de esta invención. También estarán comprendidas dentro del alcance de la presente invención las realizaciones en donde están contenidas o realizadas una o más de las variaciones anteriores.

Están dentro de la presente invención que los derivados o versiones truncadas del PRF1 o los ácidos nucleicos que los codifican puedan ser usados de acuerdo con la presente invención siempre y cuando puedan conseguirse los efectos deseados. Dichos efectos deseados, entre otros, pueden ser uno que todavía puedan ser escrutados o diseñados compuestos particulares, tales como ácidos nucleicos funcionales, anticuerpos, polipéptidos y pequeñas moléculas. En lo que se refiere al término PRF1 también comprende esta clase de derivados o versiones truncadas. Un derivado preferido del PRF1 es, entre otros, una versión fosforilada o una de sus versiones glicosiladas. La extensión de la derivatización y el truncamiento puede ser determinada, por tanto, por los expertos en la técnica mediante análisis habitual. Cuando se llega a las secuencias de ácidos nucleicos aquellas secuencias de ácidos nucleicos están también comprendidas por el término secuencias de ácidos nucleicos que codifican el PRF1 que se hibridan con el ácido nucleico especificado por los números de acceso antes mencionados o cualquier secuencia de ácido nucleico que pueda derivarse de las secuencias de aminoácidos antes mencionadas. Dicha hibridación y sus particularidades experimentales son conocidas por los expertos en la técnica. Las particularidades de dicha hibridación pueden, por ejemplo, ser tomadas de Ausubel et al., (1006) Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, New York. La hibridación restringida, tal y como se usa en la presente memoria significa, por ejemplo, 0,1 x SSC; SDS al 0,1%, 65ºC, 15 min. Además, el término ácido nucleico que codifica PRF1 comprende también una secuencia de ácido nucleico que es homóloga a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos antes mencionada, en donde el grado de homología es preferiblemente 75, 80, 85, 90 o 95% incluyendo cualquier porcentaje entre 70% y 99%.

El gen que codifica el PRF1 está descrito en la literatura científica sin indicar para él ninguna función. Se establece que el gen es inducible por hipoxia y sensible al factor 1 inducible por hipoxia (Shoshani T., et al., Molecular and Cellular Biology, Abril 2002, pp. 2283 - 2293).

En dicha publicación se dice que el PRF1 es regulado por hipoxia. Sin embargo, no se describe en dicha referencia que el PRF1 es un factor de supervivencia que se libera en la respuesta a la hipoxia y está implicado en dicha respuesta a la hipoxia. Los presentes inventores de esta solicitud han encontrado sorprendentemente que el PRF1 está regulado de una manera dependiente de PI 3-quinasa y/o HIF1\alpha (HIF es la abreviatura en inglés de Hypoxia inducible factor =
Factor inducible por hipoxia). La desactivación del PRF1 es adecuada para inhibir el crecimiento de células en un ensayo en Matrigel [(Matrigel es el nombre comercial de una mezcla gelatinosa de proteínas secretada por células tumorales de ratón, comercializada por BD Biosciences)] como se describe en los ejemplos de la presente memoria. En relación con esto, merece destacarse que la desactivación del PRF1 también puede ser mostrada al nivel de proteínas y la pérdida de función muestra la similitud de fenotipo inhibidor con el efecto de LY294002 confirmando el hallazgo de los inventores de que el PRF1 es una diana específica, más particularmente una diana de cáncer, que está situada en dirección 3' del HIF1\alpha y Akt. Esto es lo más relevante, puesto que hay numerosos datos disponibles que confirman que el HIF es altamente relevante en terapia de tumores. Además, la desactivación del PRF1 da como resultado una inhibición de un tumor como se pone de manifiesto usando células PC3 como modelo tumoral. De esto pueden derivarse diversas aplicaciones del PRF1 y más particularmente de los compuestos que inhiben el PRF1. Por consiguiente, el PRF1 como tal puede ser sobre-expresado en un sistema celular para permitir que las células sobrevivan en condiciones hipóxicas. Dichas condiciones son, por ejemplo, las que se producen en un ictus e insuficiencia cardiaca, de modo que la sobre-expresión o activación del PRF1 podría ser un medio adecuado para el tratamiento o prevención de esta clase de enfermedades. Asimismo los expertos en la técnica reconocerán que cualquier compuesto o mecanismo implicado en el aumento de la expresión o actividad del PRF1 puede ser, por tanto, un medio adecuado para el tratamiento y/o prevención de esta clase de enfermedades.

Además, está dentro de la presente invención que cualquier disminución de la expresión o, como se usa en este texto de manera sinónima, la actividad del PRF1 es adecuada para poner un sistema celular respectivo en un estado correspondiente a condiciones hipóxicas. En estas condiciones pueden comenzar otros procesos celulares, tal como, por ejemplo, la apoptosis. Inhibiendo el PRF1 pueden conseguirse las condiciones hipóxicas que a su vez son adecuadas para tratar aquellas enfermedades en donde se pretende que a las células no se les proporcione suficiente oxígeno. Existen enfermedades conocidas que pueden tratarse confiriendo a las células implicadas un estado que dichas células experimentan o están expuestas a experimentar o experimentarían bajo hipoxia. Algunas de dichas enfermedades son los tumores y cánceres que se describen en la presente memoria. Siempre que, cualesquiera compuesto(s), particularmente los descritos en la presente memoria, que sea/sean adecuado(s) para disminuir la expresión y/o actividad del PRF1 tanto al nivel de la transcripción como de la traducción puede(n) ser adecuado(s) para la prevención y/o tratamiento de esta clase de enfermedades. Estas enfermedades también se denominan en esta memoria enfermedades relacionadas con la hipoxia. Estos compuestos o medios puede ser eficaces en el tratamiento de, entre otros, tumores basados en la inhibición de la angiogénesis tumoral.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que el PRF1 es una diana valiosa en relación con el cáncer y tumores y otros procesos biológicos, tales como metástasis, tumorigénesis, migración de células, motilidad celular en la matriz extracelular y crecimiento celular en la matriz extracelular y cualesquiera enfermedades y estados morbosos basados en dichos procesos o que implican cualquiera de estos procesos. Más particularmente, dichos inventores han descubierto que el PRF1 es una diana en dirección 3' de la vía de la PI 3 quinasa/PTEN y/o la vía del HIF1\alpha. [PTEN corresponde a la expresión inglesa Phosphatase and Tensin Homolog]. Aún más sorprendentemente los presentes inventores han descubierto que el PRF1 está asociado a varias de las ramas de la vía de la PI 3-quinasa como se representa en la Figura 1 anexa. Adicionalmente, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el PRF1 está altamente regulado a través de la vía del HIF1\alpha que es paralela a la vía de la familia Akt también representada en la Figura 7. En relación con el PRF1 la rama relacionadas con la metástasis y migración es la más relevante. La importancia del PRF1 en estos procesos se muestra en el caso de pérdida de la función supresora, más particularmente la función supresora de tumor de la PTEN. Como se mostrará en los ejemplos el PRF1 estará sobre-regulado en las condiciones en donde no está activa la PTEN que es un inhibidor para la vía de la PI-3-
quinasa.

El PRF1 es un valioso marcador de diagnóstico cuya expresión se aumenta en células carentes de PTEN que son características de cierto número de tumores en fases tardías y estados morbosos (Cantley, L. C. y Neel, B. G. (1999) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4240-4245; Ali, I.U. (2000). I. Natl. Cancer Inst. 92, 861-883). Además, la pérdida de PTEN está correlacionada con un comportamiento agresivo e invasivo aumentado de las células tumorales respectivas. Por consiguiente, el PRF1 es un valioso agente de diagnóstico en relación con esto. Por otro lado, estos resultados también indican que el PRF1 es una valiosa diana de fármaco en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa/PTEN y/o la vía del HIF1\alpha a las que se puede acceder por consiguiente por los diferentes enfoques terapéuticos y agentes respectivos como se describirá en la presente memoria. Esto significa que un inhibidor del PRF1 es un medio adecuado para controlar el comportamiento metastásico y migracional de células y este es un medio adecuado para el tratamiento de tumores y cánceres, más particularmente los tumores y cánceres que son metastásicos y cuyas células muestran un comportamiento metastásico y/o migracional que se denomina generalmente en esta memoria "la enfermedad tal como se describe en esta memoria" o "el estado morboso tal como se describen en esta memoria". La enfermedad tal como se describe en esta memoria, así como el estado morboso tal como se describe en la presente memoria también comprende tumorigénesis y metástasis, pero no están limitados a ellas. Otras enfermedades y estados morbosos, respectivos, son los generalmente relacionados con cualquier enfermedad o estado patológico que implique la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HIF1\alpha y más particularmente los diferentes procesos representados en las Figura 1 y la Figura 12. Una de estas enfermedades relacionadas con la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HIF1\alpha es, entre otras, la diabetes. Esto se aplica particularmente a aquellas enfermedades tales como las descritas en la presente memoria y aquellos estados morbosos tales como los descritos en la presente memoria en donde las células implicadas en dichas enfermedades o estados morbosos son PTEN negativas que significa que el supresor de tumores PTEN no está activo o que tiene un nivel de actividad reducida o en los que está implicada la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HIF1\alpha. Además de los tumores metastásicos la diabetes pertenece a esta clase de enfermedades y estados morbosos, respectivamente. Por tanto, las células particularmente las que están implicadas en la enfermedad o estado morboso que se han descrito en la presente memoria y que son PTEN negativas, son susceptibles de tratamiento por un fármaco cuyo modo de acción es tal que reduce o elimina la actividad del PRF1 en las células respectivas implicadas. Por consiguiente, los pacientes cuyos tumores son PTEN negativos o que tienen células que son PTEN negativas, particularmente si estas células están implicadas en la enfermedad tal como se ha descrito en la presente memoria o en el estado morboso tal como se ha descrito en la presente memoria, pueden tratarse ventajosamente usando dichos fármacos. Lo mismo se aplica también a los agentes de diagnóstico o medicamentos respectivos.

Otro grupo de pacientes que pueden tratarse ventajosamente usando dichos fármacos son los que sufren cánceres que tienen una alta incidencia para la pérdida de la función de PTEN, especialmente en tumores en fase tardía (Cantley, L. C. y Neel, B. G. (1999), New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the fosfoinositide 3-kinase/AKT pathway and/or the HIF1\alpha pathway, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4240-4245; Ali. I. U. (2000), Gatekeeper for endometrium: the PTEN tumor suppressor gene. J. Natl. Cancer Inst. 92, 861-863). La pérdida de la PTEN está correlacionada con el comportamiento agresivo e invasivo aumentado de las células tumorales respectivas. Debido a esto, en realizaciones preferidas os agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos, respectivamente, dirigidos al PRF1\alpha pueden ser usados para cualquier tumor siempre que se cumpla el requisito previo antes mencionado, es decir, que el PTEN está correlacionado con el comportamiento agresivo e invasivo
aumentado.

A la luz de la descripción dada en la presente memoria, es decir que el PRF1\alpha es una diana en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HPF1\alpha, pero también para el control de proliferación, metástasis y migración, los expertos en la técnica pueden desarrollar tanto agentes terapéuticos como de diagnóstico para las enfermedades descritas en la presente memoria y estados morbosos descritos en la presente memoria, respectivamente. Una descripción representativa de cómo los fármacos pueden ser escrutados una vez que ha sido validada una diana, se describe, por ejemplo, en la publicación de Prendergast, Nature Biotechnology, Octubre 2001, Vol. 18. pp. 919 - 921 o la de Torrance C. J. et al., Nature Biotechnology, Octubre 2001, Vol. 19, pp. 940 - 945.

Debido a la implicación del PRF1 en los mecanismos que se han indicado antes, dicha proteína o un ácido nucleico que la codifica también pueden ser usados como un marcador para la diagnosis del estatus de una célula o paciente que tiene en su cuerpo dicha clase de células, si experimentará metástasis, tumorigénesis o cualquier otro proceso descrito en la presente memoria y si sufre de agotamiento de oxígeno y/o glucosa que a su vez es indicativo para las células tumorales, particularmente para el crecimiento rápido de células tumorales. Un ejemplo de que esta clase de funciona enfoque y es aplicable para tal fin es, por ejemplo, ICAM-1. La proteína ICAM-1 se usa en la prognosis de cánceres gástricos para experimentar metástasis (Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, Shimamura H, Yamada T, Tanaka N, Orita K. Int. J. Cancer, 1 de agosto de 2002; 100(4):486-490) en donde se encontró que los niveles de s-ICAM-1 eran elevados en pacientes con metástasis de hígado. En otro ejemplo, se usa la osteopontina como un marcador de pronóstico para cáncer de mama (Rudland PS, Platt-Higgins A, E1-Tanani M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howitt R, West CR. Cancer Res. 15 de junio de 2002; 62 (12):3417-3427). En cuanto a la presencia o nivel de presencia (proteína o mRNA) o el nivel de actividad del PRF1 puede usarse como un marcador y cualquier compuesto que más o menos específicamente interactúe con el PRF1 será por tanto un agente de diagnóstico apropiado y/o una herramienta o medio analítico apropiado.

A continuación se describirán los métodos y principios de diseño para fármacos y agentes de diagnóstico que en cualquier caso interaccionan específicamente y/o selectivamente con el PRF1.

A la luz de estos hallazgos el PRF1 demuestra ser una diana de fármacos en dirección 3' adecuada que permite la modulación selectiva de solo algunos aspectos que están relacionados típicamente con la vía de la PI 3-quinasa, tales como metástasis y migración, así como respuesta a la hipoxia, crecimiento celular, y cicatrización de heridas, y un método de diagnóstico selectivo y específico, es decir, la detección, de procesos típicamente relacionados con la vía de la PI 3-quinasa, más particularmente metástasis y migración.

La vía de la PI 3-quinasa se caracteriza por una actividad de PI 3-quinasa en la inducción del factor de crecimiento y una actividad de señalización paralela. La estimulación del factor de crecimiento de células conduce a la activación de sus receptores correspondientes en la membrana celular que a su vez están asociados con, y activan a, las moléculas de señalización intracelular tales como PI 3-quinasa. La activación de la PI 3-quinasa (que consiste en una subunidad p85 reguladora y una p110 catalítica) da como resultado la activación de la familia de las Akt por fosforilación y/o activación of HIF1\alpha, manteniendo con ello las respuestas celulares, tales como la proliferación, supervivencia o migración más lejos en dirección 3'. PTEN es por tanto una proteína supresora de tumores que está implicada en la vía de la fosfatidilinositol (PI)3-quinasa y que ha sido estudiada extensivamente en el pasado por su papel en regular el crecimiento y la transformación celular (para revisiones véanse, Stein, R. C. y Waterfield, M. D. (2000), PI3-kinase inhibition: a target for drug development?, en Mol. Med. Today 6, 347-357; Vazquez, F. y Sellers, W. R. (2000) y/o la vía de la HIF1\alpha, The PTEN tumor suppressor protein: an antagonist of fosfoinositide 3-kinase signaling, en Biochim. Biophys. Acta 1470, M21-35; Roymans, D. y Slegers, H. (2001). Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression, en Eur. J. Biochem. 268, 487-498). La PTEN supresora de tumores funciona como un regulador negativo de la PI 3-quinasa y/o la vía de la HIF1\alpha invirtiendo la reacción catalizada por la PI 3-quinasa y con ello asegura que la activación de la vía ocurre de una manera transitoria y controlada. La hiperactivación crónica de la PI 3-quinasa y/o la vía de la HIF1\alpha señalizante es causada por la inactivación funcional de la PTEN. La actividad de la PI 3-quinasa y/o la actividad de la HIF1\alpha pueden ser bloqueadas por adición de la pequeña molécula inhibidora LY294002. La actividad y las respuestas en dirección 3' de la MEK quinasa señalizante que actúa en una vía paralela, puede ser inhibida por ejemplo, por la pequeña molécula inhibidora PD98059.

Una activación, particularmente una activación crónica, de la vía de la PI 3-quinasa y/o la actividad del HIF1\alpha a través de la pérdida de la función de la PTEN es una contribución importante a la tumorigénesis y metástasis indicando que este supresor de tumores representa un punto de comprobación importante para una proliferación celular controlada.

Las células con el gen PTEN desactivado muestran características similares a las de las células en las cuales ha sido inducida la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HIF1\alpha, particularmente crónicamente inducidas, a través de las formas activadas de la PI 3-quinasa (Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C. y Pandolfi, P. P. (1998) en PTEN is essential for embryonic development and tumour suppression, Nat. Genet 19, 340-355. Klippel. A., Escobedo, M. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W. M. y Williams, LT. (1998), Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation, en Mol. Cell Biol. 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. y Fukui.Y. (1999). Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-kinase en Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80, 4874-4878).

Las diversas enfermedades que se describen en la presente memoria también pueden caracterizarse por una hiperactivación de la vía PI 3-quinasa y/o la activación, preferiblemente hiperactivación la vía del HIF1\alpha. Esta activación o hiperactivación es similar a la situación de una célula que carezca de actividad de PTEN. La hiperactivación la vía de la PI 3-quinasa y/o la activación la vía del HIF1\alpha tal como se usa en la presente memoria, significa particularmente una actividad aumentada de la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HIF1\alpha comparada con las actividades de dichas vías, es decir, la actividad de la vía de la PI 3-quinasa de la clase particular de células en donde la célula no es parte de, ni está implicada en, la enfermedad o estado morboso.

La proteína PTEN está implicada en varias vías que se denominan vías relacionadas con la PTEN, tales como la vía de PI 3-quinasa/PTEN, la vía de las Akt, el bucle autocrino relacionado con EGF, la vía de mTOR y, como ha sido documentado por los presentes inventores, también la vía de la HIF1\alpha. Una vía de la PI 3-quinasa es realmente cualquier vía que implique una PI 3-quinasa, bien sea directamente o indirectamente. La PI 3-quinasa puede actuar bien sea como un inhibidor o bien sea como un activador en dicha vía, o puede como tal ser regulada u otros elementos de la vía.

Hay una amplia técnica anterior que describe enfermedades y estados que implican la vía de la PI 3-quinasa y/o la vía del HIF1\alpha. Cualquiera de estos estados y enfermedades pueden ser abordados por los métodos de la invención y los fármacos y agentes de diagnóstico cuyo, diseño, escrutinio o su fabricación es enseñado en la presente memoria. Por razones de ilustración, pero no de limitación, se hará referencia a los siguientes: carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovario, cáncer de próstata (Ali, I. U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, 7 de junio de 2000, pp. 861 - 863), síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos) (Macleod, K., supra) enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcava-Riley (BRR), trichilemmomas, hamartomas gatrointestinales, lipomas, adenomas de tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displástico cerebelar, y enfermedades malignas de la mama y el tiroides (Vazquez, F., Sellers, W.R., supra).

En vista de esto, el PRF1 es una valiosa diana de fármacos en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa y/o de la vía de la HIF1\alpha a la que pueden ser dirigidos fármacos que tendrán menos efectos secundarios que otros fármacos dirigidos a dianas situadas en dirección 5' del PRF1. Por tanto la presente invención proporciona una diana para fármacos que es adecuada para el diseño, escrutinio, desarrollo y fabricación de compuestos farmacéuticamente activos que son más selectivos que los conocidos en la técnica, como tales, por ejemplo LY 294002. Teniendo el control sobre esta fracción particular de moléculas efectoras, es decir, el PRF1 y cualquier molécula situada más lejos en dirección 3' implicada en la vía, solamente es probable que causen efectos no deseados en un número muy limitado de sus ramas paralelas o dianas situadas más lejos en dirección 5' en la cascada de señalización. Por tanto, no serán influenciadas otras actividades de la vía de la PI-3 quinasa/PTEN y/o de la vía del HIF1\alpha relacionada con el ciclo celular, la reparación del DNA, la apoptosis, el transporte de glucosa y la traducción.

Además de ser una molécula diana valiosa en relación con las enfermedades y redes reguladoras antes especificadas, el PRF1 que se describe en esta memoria, tanto al nivel de ácidos nucleicos como al nivel de proteínas, es también una diana particularmente valiosa en relación con el desarrollo o aplicación de una terapia de combinación y los medicamentos usados para dicha terapia de combinación. En otra palabras, el PRF 1, es decir, el ácido nucleico que lo codifica, así como la proteína, pueden ser usados para el escrutinio, la generación, la fabricación o el diseño de un compuesto que puede usarse en sensibilizar una célula, tejido, órgano o un paciente, de tal modo que la célula, tejido, órgano o paciente sea susceptible de tratamiento, preferiblemente un tratamiento que usa un compuesto o medicamento que es diferente del compuesto y medicamento, respectivamente, que se dirige al PRF1 bien sea al nivel del ácido nucleico o bien sea al nivel de la proteína. Está dentro del alcance de la presente invención que dicho compuesto sea usado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de los estados y enfermedades, respectivamente, como se ha descrito en la presente memoria, bien sea solo o junto con el compuesto y medicamento, respectivamente, que se dirigen al PRF1.

Sin vincularse a ninguna teoría, parece ser que el PRF1 está regulado a través tanto de la rama HIF1\alpha como de la rama Akt de la vía de la PI 3-quinasa. Como el HIF1\alpha está sobre-regulado en condiciones hipóxicas y la Akt está sobre-regulada en condiciones de estrés para desencadenar una respuesta de supervivencia que actúa contra la reacción de apoptosis de una célula, un compuesto que se dirige al PRF1 como se ha descrito en la presente memoria y que también puede usarse como medicamento o pareja de interacción del PRF1, tanto al nivel del ácido nucleico y/o el nivel de la proteína, puede llevar la célula a un estado, en el cual los compuestos son particularmente eficaces. Por lo tanto está dentro del alcance de la presente invención usar dichos compuestos que se dirigen al PRF1 tanto para el escrutinio de compuestos que pueden usarse para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en la presente memoria, incluyendo, pero sin limitación, las enfermedades tumorales, como para el tratamiento de dichas enfermedades. Por tanto, el escrutinio puede llevarse a cabo, por ejemplo, en condiciones hipóxicas y/o aplicando estrés a una célula, tal como aplicando citostáticos, por ejemplo, cis-platino, radiación, preferiblemente como se usa en relación con el tratamiento de tumores, y hipertermia. Preferiblemente, hay por tanto dos dianas implicadas en el escrutinio, generación, fabricación y/o proceso de diseño para un compuesto y medicamento, respectivamente, para el tratamiento y/o desarrollo de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en la presente memoria, en donde una de dichas dianas es preferiblemente diferente del PRF1.

El escrutinio contra un factor de transcripción, tal como HIF1\alpha, puede realizarse satisfactoriamente, como se puede ver en la publicación de Welsh, S. J. et al., en Molecular Cancer Therapeutics Vol. 2, 235-243, Marzo 2003.

Además, la señalización de insulina no es inducida lo que significa que se evitan realmente las respuestas diabéticas u otros efectos secundarios observados en relación con el uso de LY294002. El compuesto LY294002 (2-(4-morfolinil)-8-fenilcromona) es uno de los diversos inhibidores de pequeño tamaño molecular constituido por derivados de cromona desarrollado por Lilly Research Laboratories (Indianapolis) como un inhibidor para la PI 3-quinasa (Vlahos et al. 1904. JBC 269, 5241 - 5248). Dicho compuesto va dirigido a la subunidad catalítica de la molécula PI 3-quinasa, p110 que actúa como diana, y funciona compitiendo con la unión a ADP por el centro catalítico. Sin embargo, LY294002 no puede distinguir entre las diferentes isoformas de p110 (alfa, beta, gamma, delta) que han sugerido tener diferentes funciones celulares.

El PRF1 también está más lejos en dirección 3' de mTOR que también es la diana de rapamicina. mTOR (la abreviatura mTOR corresponde a la expresión inglesa mammalian Target Of Rapamycin, es decir diana de la rapamicina en mamíferos), también conocida como Raft o FRAP, actúa en dirección 3' de la PI 3-quinasa para regular procesos tales como la entrada dependiente de pp70S6-quinasa en el ciclo celular. mTOR actúa como un sensor para el factor del crecimiento y la disponibilidad de nutrientes para controlar la traducción a través de la activación de pp70S6-quinasa y el factor de iniciación 4E. La función de mTOR es inhibida por la rapamicna bacteriana que es un macrólido que bloquea el crecimiento de las células T y ciertas células tumorales (Kuruvilla y Schreiber 1999, Chemistry & Biology 8, R129-R138).

El hecho de que la rapamicina y sus derivados sean fármacos adecuados que se usan corrientemente en clínica demuestra que una diana para fármacos es más útil y tiene menos efectos secundarios, cuanto más específica sea para un mecanismo molecular particular como, por ejemplo, fue demostrado por Yu et al., (Yu, K. et al., (2001) Endocrine-RelatCanc. 8, 249). Puesto que la rapamicina se usa para inmunosupresión en seres humanos los fármacos que interfieren con el PRF1 podrían ser incluso más específicos para esta indicación.

Debido a la especificidad del PRF1 indicada anteriormente en relación con su uso como una diana para fármacos potenciales, también puede ser usado como marcador de diagnóstico y como agentes de diagnóstico serán usados agentes diseñados respectivamente que permitan preferiblemente una detección selectiva y específica del PRF1. De nuevo, cuánto más próximo y más específico sea un marcador para cierto fenómeno biológico o en términos de vías de señalización, más cerca esté del efecto finalmente observado, más fiable es cualquier afirmación sobre si es probable que ocurra el proceso final, que en el presente caso, es metástasis y tumorigénesis, respectivamente. Por tanto, los agentes de diagnóstico basados en el PRF1 y que detectan el PRF1, respectivamente, son agentes de diagnóstico que permiten una determinación más fiable de la probabilidad de tumorigénesis y metástasis, respectivamente, o cualquiera de las otras enfermedades descritas en la presente memoria y estados morbosos descritos en la presente memoria. Estas predicciones están relacionadas particularmente con las enfermedades descritas en la presente memoria y los estados morbosos descritos en la presente memoria. En el diseño, escrutinio y/o fabricación de los agentes terapéuticos basados en el PRF1 como se describe en la presente memoria, el PRF1 puede usarse como el compuesto contra el que se dirigen compuestos químicos que pueden usarse como fármacos o candidatos de fármacos o como agentes de diagnóstico. Estos compuestos químicos pertenecen a diferentes clases de compuestos, tales como anticuerpos, péptidos, anticalinas, aptámeros, espiegélmeros, ribozimas, oligonucleótidos antisentido y RNA pequeño de interferencia (abreviadamente en lo sucesivo siRNA por la expresión inglesa small interference RNA) así como pequeñas moléculas. Los compuestos se diseñan, seleccionan, escrutan, generan y/o fabrican bien se usando el PRF1 por sí mismo como una entidad física o química o información relacionada con el PRF1. En el diseño, selección, escrutinio, generación y/o proceso de fabricación de dichas clases de compuestos el PRF1 también será denominado la diana que se usa en el proceso en lugar de en la aplicación final del compuesto a un paciente que lo necesite. En los procesos que proporcionan las diversas clases de compuestos, puede usarse bien sea el PRF1 o bien sea un ácido nucleico que codifica el PRF1 incluyendo cualquiera de sus realizaciones que tengan o comprendan cualquiera de las variaciones antes descritas. El término PRF1 como se usa en la presente memoria comprende cualquier fragmento o derivado del PRF1 que permita el diseño, la selección, el escrutinio, la generación y/o la fabricación de dichas clases de compuestos que a su vez es/son tras su aplicación como un medicamento o como un agente de diagnóstico activos como tales. El término ácido nucleico que codifica el PRF1 como se usa en la presente memoria comprenderá cualquier ácido nucleico que contenga un ácido nucleico que codifica el PRF1 como se ha definido antes o una de sus partes. Una parte de un ácido nucleico que codifica el PRF1 se considera como tal, siempre y cuando todavía sea adecuada para el diseño, la selección, el escrutinio, la selección, la generación y/o la fabricación de dichas clases de compuestos que a su vez son/es tras su aplicación como un medicamento o como un agente de diagnóstico activos como tales. El ácido nucleico que codifica el PRF1 puede ser ácido nucleico genómico, RNA nuclear heterogéneo (abreviadamente en lo sucesivo hnRNA por la expresión inglesa heterogenous nuclear RNA), mRNA, cDNA o una parte de cada uno de ellos.

Está dentro de la presente invención que los compuestos químicos como los descritos anteriormente, es decir, pero sin limitación, anticuerpos, péptidos, anticalinas, aptámeros, espiegélmeros, ribozimas, oligonucleótidos antisentido y siRNA puedan usarse para los mismo fines que los descritos para el PRF1 como tal.

Como se ha indicado anteriormente está dentro de la presente invención que además del PRF1 o una de sus partes o derivados o una secuencia de ácido nucleico para el mismo, como se describe en la presente memoria, también pueden ser usados otros medios o compuestos para crear o para suprimir los efectos que proceden del PRF1 o el ácido nucleico que codifica el PRF1. Dichos medios pueden ser determinados o seleccionados en un método de escrutinio. En dicho método de escrutinio una primera etapa es proporcionar uno varios de los llamados compuestos candidatos. Los compuestos candidatos tal como se usa la expresión en la presente memoria son compuestos cuya adecuabilidad ha de ser analizada o ensayada en un sistema de ensayo para tratar o aliviar las diversas enfermedades que se describen en la presente memoria y estados morbosos que se describen en la presente memoria o ser usados como un medio o agente de diagnóstico para esta clase de enfermedades y estados morbosos. Si un compuesto candidato muestra un efecto respectivo en un sistema de ensayo dicho compuesto candidato es un medio adecuado o un agente adecuado para el tratamiento de dichas enfermedades y estados morbosos y, en principio, así como un agente de diagnostico adecuado para dichas enfermedades y estados morbosos. En una segunda etapa el compuesto candidato es puesto en contacto con un sistema de expresión del PRF1 o un sistema de actividad del PRF1. El sistema de actividad del PRF1 también se denomina en la presente memoria un sistema que detecta la actividad del PRF1.

Un sistema de expresión del PRF1 es básicamente un sistema de expresión que muestra o exhibe la expresión del PRF1, en donde puede ser cambiada básicamente la extensión o nivel de expresión. Un sistema de actividad de PRF es esencialmente un sistema de expresión en donde se mide la actividad o estado de actividad en lugar de la expresión del PRF1. Más particularmente, se analiza si bajo la influencia de un compuesto candidato la actividad del PRF1 o del ácido nucleico que codifica el PRF1 es diferente de la situación sin el compuesto candidato. Independientemente de si el sistema particular es un sistema de expresión o un sistema de actividad, está dentro del alcance de la presente invención que pueda ocurrir y ser medido un aumento o una disminución de actividad y expresión, respectivamente. Típicamente, el sistema de expresión y/o el sistema de actividad es un sistema de reacción in vitro, tal como un extracto celular o una fracción del extracto celular, tal como un extracto del núcleo. Un sistema de expresión o un sistema de actividad del PRF1 como se usa en la presente memoria también puede ser una célula, un tejido o un órgano, preferiblemente una célula o una célula de un tejido u órgano implicado en las enfermedades como las descritas en la presente memoria y los estados morbosos como los descritos en la presente memoria.

También está dentro de la presente invención que el método para el escrutinio de un agente de acuerdo con la presente invención pueda realizarse de tal modo que después de la etapa d) el compuesto candidato obtenido o identificado en la primera ronda de las etapas 1 de la secuencia inherente al método, se someta a la etapa c), en donde el sistema de expresión o el sistema de actividad sea diferente del sistema de expresión o el sistema de actividad respectivo usado durante la primera ronda en la cual fue caracterizado el compuesto candidato. Por consiguiente, en la primera ronda el sistema de expresión y el sistema de actividad, respectivamente, pueden ser una célula implicada en las enfermedades que se han descrito en la presente memoria, mientras que en la segunda ronda la célula puede ser una célula que no esté implicada en dichas enfermedades. En una realización alternativa está invertido el orden de uso de los dos tipos de células.

Puede determinarse si hay un aumento o disminución en el sistema de actividad o el sistema de expresión en cada nivel de la expresión, por ejemplo, midiendo el aumento o disminución de la cantidad de ácido nucleico que codifica el PRF1, más particularmente mRNA o el aumento o disminución del PRF1 expresado bajo la influencia del compuesto candidato. Las técnicas requeridas para la medida, más particularmente la medida cuantitativa de esta clase de cambios, tales como para el mRNA o la proteína son conocidas por los expertos en la técnica. También son conocidos por los expertos en la técnica los métodos para determinar la cantidad del, o el contenido del, PRF1, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos apropiados. Los anticuerpos pueden ser generados como es conocido por los expertos en la técnica y se describe, por ejemplo, en la publicación de Harlow, E., y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

En el caso de un sistema de expresión del PRF1 puede determinarse un aumento o disminución de la actividad del PRF1, preferiblemente en una valoración funcional.

La puesta en contacto del compuesto candidato y el sistema de expresión y el sistema de actividad, respectivamente, se realiza usualmente añadiendo una solución acuosa del compuesto candidato a un sistema de reacción respectivo que en la presente memoria se denomina generalmente sistema de ensayo. Además de soluciones acuosas pueden usarse también suspensiones o soluciones del compuesto candidato en disolventes orgánicos. La solución acuosa es preferiblemente una solución tampón.

Preferiblemente solamente se usa un compuesto candidato en cada experimento que use el sistema de expresión y el sistema de actividad, respectivamente. Sin embargo, también está dentro de la presente invención que se realicen varias de estas clases de ensayos en paralelo en un sistema de alta producción.

Una etapa adicional en el método de acuerdo con la presente invención reside en determinar si bajo la influencia del compuesto candidato se cambia la expresión o actividad del sistema de expresión y sistema de actividad, respectivamente, en relación con el PRF1 o un ácido nucleico que lo codifica. Típicamente esto se hace comparando la reacción del sistema por adición del compuesto candidato con relación a una reacción sin la adición del compuesto candidato. Preferiblemente el compuesto candidato es un miembro de una quimioteca. Básicamente cualquier quimioteca es adecuada para los fines de la invención independientemente de la clase de compuestos. Las quimiotecas adecuadas son, otras, colecciones que constan de pequeñas moléculas, péptidos, proteínas, anticuerpos, anticalinas y ácidos nucleicos funcionales. Los últimos compuestos pueden ser generados como es conocido por los expertos en la técnica y se indica en la presente memoria.

La fabricación de un anticuerpo específico para el PRF1 o para el ácido nucleico que codifica el PRF1, es conocida por los expertos en la técnica y, descrita, por ejemplo en Harlow, E., y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferiblemente, en relación con la presente invención pueden usarse anticuerpos monoclonales que pueden prepararse de acuerdo con el protocolo de Cesar Milstein y posteriores desarrollos basados en dicho protocolo. El término anticuerpos como se usa en la presente memoria, incluye, pero sin limitación, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos o derivados tales como fragmentos Fab, fragmentos Fc y anticuerpos de una sola cadena, siempre y cuando sean adecuados y capaces de unirse a la proteína quinasa N beta. Además de los anticuerpos monoclonales también pueden usarse y/o generarse anticuerpos policlonales. La generación de anticuerpos policlonales también es conocida por los expertos en la técnica y descrita, por ejemplo, en Harlow, E., y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferiblemente, los anticuerpos usados para los fines terapéuticos son anticuerpos humanizados o humanos como se ha indicado antes.

Los anticuerpos que pueden usarse de acuerdo con la presente invención pueden tener uno o varios marcadores o etiquetas. Dichos marcadores o etiquetas pueden ser útiles para detectar el anticuerpo bien sea en su aplicación de diagnóstico o bien sea en aplicación terapéutica. Preferiblemente los marcadores o etiquetas se seleccionan del grupo que comprende avidina, estreptavidina, biotina, oro y fluoresceína. Estos y otros marcadores están descritos en Harlow et al., (Harlow, E., y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)).

También está dentro de la presente invención que el marcador o etiqueta exhiba una función adicional además de la detección, tal como interacción con otras moléculas. Tal interacción puede ser, por ejemplo, una interacción específica con otros compuestos. Estos otros compuestos pueden ser los inherentes al sistema en donde el anticuerpo se usa tal como el cuerpo humano o animal o la muestra que se analiza usando el respectivo anticuerpo. Los marcadores apropiados, pueden ser, por ejemplo, biotina o fluoresceína con sus parejas de interacción específica, tales como avidina y estreptavidina y similares que están presentes en el compuesto o estructura respectiva para interactuar con el anticuerpo así marcado o etiquetado.

Una clase adicional de medicamentos, así como agentes de diagnóstico que pueden generarse usando la proteína PRF1 o el ácido nucleico que codifica el PRF1, son péptidos que se unen a los mismos. Dichos péptidos pueden ser generados usando métodos de acuerdo con el estado de la técnica, tal como presentación de fagos. Básicamente, se genera una colección de péptidos, tal como en forma de fagos, y esta clase de colecciones se pone en contacto con la molécula diana, en el presente caso, por ejemplo, el PRF1. Los péptidos que se unen a la molécula diana se retiran subsiguientemente, preferiblemente en forma de un complejo con la molécula diana, a partir de la reacción respectiva. Es conocido por los expertos en la técnica que las características de unión, al menos en cierta extensión, dependen de los ajustes o puestas a punto particularmente realizadas, tal como la concentración de sal y similares. Después de separar los péptidos que se unen a la molécula diana, con mayor afinidad o una fuerza más grande, de los de los miembros de la colección que no se unen, y opcionalmente también después de retirar la molécula diana del complejo de molécula diana y péptido, el(los) péptido(s) respectivos pueden ser caracterizados subsiguientemente. Antes de la caracterización se realiza opcionalmente una etapa de amplificación tal como, por ejemplo, propagando los fagos que codifican el péptido. La caracterización comprende preferiblemente la secuenciación de los péptidos que se unen a la diana. Básicamente, los péptidos no están limitados en sus longitudes, sin embargo, los péptidos que tienen preferiblemente longitudes de aproximadamente 8 a 20 aminoácidos se obtienen preferiblemente en los métodos respectivos. El tamaño de las colecciones puede ser de 10^{2} a 10^{18}, preferiblemente 10^{8} a 10^{15} diferentes, sin embargo, no está limitado a dichos intervalos.

Una forma particular de polipéptidos que se unen a la diana son los denominados "anticalinas" que están descritos, entre otros textos, en la solicitud de patente alemana DE 19742706.

De acuerdo con la presente invención el PRF1, así como el ácido nucleico que codifica el PRF1, pueden ser usados como la diana para la fabricación o desarrollo de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades descritas en la presente memoria y de los estados morbosos descritos en la presente memoria, así como para la fabricación y/o desarrollo de medios para la diagnosis de dichas enfermedades y dichos estados, en un proceso de escrutinio, en donde en el proceso de escrutinio se usan moléculas pequeñas o colecciones de moléculas pequeñas. Este escrutinio comprende la etapa de poner en contacto la molécula diana con una sola molécula pequeña o una variedad de moléculas pequeñas al mismo tiempo o subsiguientemente, preferiblemente los de la colección especificada anteriormente, e identificar aquellas moléculas pequeñas o miembros de la colección que se unan a las moléculas dianas, que, si se realiza el escrutinio en relación con otras moléculas pequeñas, pueden separarse de las moléculas pequeñas que no se unen o no interactúan. Se reconocerá que la unión y la no unión pueden estar fuertemente influenciadas por el ajuste experimental particular. Modificando el carácter restringido de los parámetros de reacción es posible variar el grado de unión y de no unión que permite un ajuste fino de este proceso de escrutinio. Preferiblemente, después de la identificación de una o varias moléculas pequeñas que específicamente interactúan con la molécula diana, esta molécula pequeña puede ser más caracterizada. Esta caracterización adicional, puede residir, por ejemplo, en la identificación de la molécula pequeña y la determinación de su estructura molecular y demás características físicas, químicas, biológicas y/o médicas. Preferiblemente, los compuestos naturales tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a 1000 Da. También preferiblemente, las moléculas pequeñas son las que cumplen con la regla del cinco de Lepinsky. Alternativamente, las moléculas pequeñas pueden ser definidas como las moléculas pequeñas sintéticas, preferiblemente las que proceden de química combinatoria, en contraste con los productos naturales que preferiblemente no son sintéticos. Sin embargo, ha de advertirse que estas definiciones solo son subsidiarias para la comprensión general de los términos receptivos en la técnica.

También está dentro de la presente invención usar el PRF1 y/o un ácido nucleico que codifica el PRF1 como una molécula diana para la fabricación o selección de aptámeros y espiegélmeros que pueden ser usados luego directamente o indirectamente bien sea como medicamentos o como agentes de diagnóstico.

Los aptámeros son D-ácidos nucleicos que son monocatenarios o bicatenarios y que específicamente interactúan con una molécula diana. La fabricación o selección de aptámeros se describe, por ejemplo, en la patente europea EP 0533838. Básicamente se realizan las siguientes etapas. Primeramente se proporciona una mezcla de ácidos nucleicos, es decir, aptámeros potenciales, en donde cada ácido nucleico comprende típicamente un segmento de varios nucleótidos, preferiblemente al menos ocho subsiguientemente aleatorizados. Esta mezcla se pone en contacto subsiguientemente con la molécula diana en donde el (los) ácido(s) nucleico(s) se une(n) a la molécula diana, debido a la afinidad aumentada hacia la diana o con mayor fuerza de unión a dicha diana, comparado con la mezcla de candidatos. El (los) ácido(s) nucleico(s) unidos(s) se separa(n) subsiguientemente del resto de la mezcla. Opcionalmente, el (los) ácido(s) nucleico(s) así obtenido(s) se amplifica(n) usando, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa. Estas etapas pueden repetirse varias veces dando al final una mezcla que tiene una relación aumentada de ácidos nucleicos que se une específicamente a la diana de la cual se selecciona luego opcionalmente el ácido nucleico de unión final. Estos ácidos nucleico(s) que se unen específicamente se denominan aptámeros. Es obvio que en cualquier etapa del método para la generación o identificación de los aptámeros pueden tomarse muestras de la mezcla de ácidos nucleicos individuales para determinar su secuencia usando técnicas estándares. Está dentro de la presente invención que los aptámeros puedan estabilizarse tal como, por ejemplo, introduciendo grupos químicos definidos conocidos por los expertos en la técnica de generar aptámeros. Dicha modificación puede consistir, por ejemplo, en la introducción un grupo amino en la posición 2' del resto de azúcar del nucleótidos. Los aptámeros se usan corrientemente como agentes terapéuticos. Sin embargo, también está dentro de la presente invención que los aptámeros así seleccionados o generados puede ser usados para la validación de dianas y/o como compuestos principales para el desarrollo de medicamentos, preferiblemente de medicamentos basados en moléculas pequeñas. Esto se hace actualmente por un ensayo de competición en donde la interacción específica entre la molécula diana y el aptámero esta inhibida por un fármaco candidato, en donde por reemplazo del aptámero del complejo de diana y aptámero puede ser asumido que el respectivo candidato de fármaco permite una inhibición específica de la interacción entre la diana y el aptámero, y si la interacción es específica, dicho fármaco candidato será al menos en principio, adecuado para bloquear la diana y por tanto disminuir su disponibilidad o actividad biológica en un sistema de respectivo que comprende dicha diana. La molécula pequeña así obtenida puede someterse luego a más derivatización y modificación para optimizar sus características físicas, químicas, biológicas y/o médicas, tales como toxicidad, especificidad, biodegradabilidad y biodisponibilidad.

La generación o fabricación de espiegélmeros que puede usarse o generarse de acuerdo con la presente invención usando el PRF1 o un ácido nucleico que codifica el PRF1, se basa en un principio similar. La fabricación de espiegélmeros se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/08856. Los espiegélmeros son L-ácidos nucleicos, lo que significa que están compuestos de L-nucleótidos en lugar de D-nucleótidos como ocurre con los aptámeros. Los espiegélmeros se caracterizan porque tienen una estabilidad muy alta en sistemas biológicos y, al igual que los aptámeros, interactúan específicamente con la molécula diana contra la que van dirigidos. En el proceso de generar espiegélmeros se crea una población heterogénea de D-ácidos nucleicos y esta población se pone en contacto con el antípoda óptico de la molécula diana, en el presente caso, por ejemplo, con el D-enantiómero del L-enantiómero natural del PRF1. Subsiguientemente se separan los D-ácidos nucleicos que no interactúan con el antípoda óptico de la molécula diana. Pero aquellos D-ácidos nucleicos que interactúan con el antípoda óptico de la molécula diana se separan, opcionalmente se determinan y/o secuencian y subsiguientemente se sintetizan los correspondientes L-ácidos nucleicos basados en la información de la secuencia de ácidos nucleicos obtenida de los D-ácidos nucleicos. Estos L-ácidos nucleicos que son idénticos en términos de secuencia con los D-ácidos nucleicos antes mencionados que interactúan con el antípoda óptico de la molécula diana, interactuarán específicamente con la molécula diana natural en lugar de con sus antípoda óptico. Igual que con el método para la generación de aptámeros también es posible repetir las diversas etapas varias veces y por tanto enriquecer la mezcla en aquellos ácidos nucleicos que específicamente interactúan con el antípoda óptico de la molécula diana.

Otra clase de compuestos que pueden ser fabricados o generados basados en el PRF1 o un ácido nucleico que codifica el PRF1, como la molécula diana, que se describe en la presente memoria, son ribozimas, oligonucleótidos antisentido y siRNA. Debido a la función y modo de acción del PRF1 estas clases de moléculas, que también se denominan fármacos a base de ácidos nucleicos y se usan como tales, se crean y/o fabrican preferiblemente basándose en la descripción de la presente invención, más preferiblemente basándose en las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria.

Es una característica común de todos los ácidos nucleicos que no interactúan con la molécula diana al nivel del producto de la traducción que en el presente caso es el PRF1, sino que más bien interactúan con el producto de la transcripción, es decir, el ácido nucleico que codifica el PRF1 tal como el ácido nucleico genómico o cualquier ácido nucleico derivado del mismo, tal como los correspondientes hnRNA, cDNA y mRNA, respectivamente. En lo que respecta a la molécula diana de la clase antes mencionada de compuestos es preferiblemente el mRNA del PRF1.

Las ribozimas son ácidos nucleicos catalíticamente activos que consisten preferiblemente en RNA que básicamente comprende dos restos. El primer resto muestra una actividad catalítica mientras que el segundo resto es responsable de la interacción específica con el ácido nucleico diana, en el presente caso el ácido nucleico que codifica la proteína quinasa N beta. Por la interacción entre el ácido nucleico diana y el segundo resto de la ribozima, típicamente por hibridación y apareamiento de bases de Watson-Crick de tramos esencialmente complementarios de bases en las dos cadenas hibridantes, el resto puede llegar a ser catalíticamente activo lo que significa que cataliza, intramolecularmente o intermolecularmente, el ácido nucleico diana en el caso de que la actividad catalítica de los ribozimas sea una actividad de fosfodiésterasa. Subsiguientemente, puede haber una degradación adicional del ácido nucleico diana que al final da como resultado la degradación del ácido nucleico diana, así como de la proteína derivada de dicho ácido nucleico diana que en el presente caso es el PRF1 debido a la falta del PRF1 recientemente sintetizado y un recambio del PRF1 previo existente. Las ribozimas, su uso y principios de diseño son conocidas por los expertos en la técnica, y, se describen, por ejemplo en la publicación de Doherty y Doudna (Ribozyme structures and mechanism. Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30:457-75) y en la publicación de Lewen y Hauswirth (Ribozyme Gene Therapy: Applications for molecular medicine. 2001, 7: 221-8).

El uso de oligonucleótidos antisentido para la fabricación de un medicamento y como un agente de diagnóstico, respectivamente, está basado en un modo de acción similar. Básicamente, los oligonucleótidos antisentido se hibridan debido a su complementariedad, con un RNA diana, preferiblemente con un mRNA con lo cual activan la RNasa H. La RNasa H se activa tanto por DNA acoplado por fosfodiéster como por fosforotioato. El DNA acoplado a fosfodiéster, sin embargo, es degradado rápidamente celular por las nucleasas celulares con la excepción de DNA acoplado a fosforotioato. Estos derivados DNA no naturales resistentes no inhiben la RNasa H por hibridación con RNA. En otras palabras, los polinucleótidos antisentido solamente son eficaces en la forma de los complejos híbridos DNA-RNA. Ejemplos para esta clase de oligonucleótidos antisentido se describen, entre otros textos, en las patentes de EE.UU. 5.849.902 y 5.989.912. En otras palabras, en base a la secuencia de ácido nucleico de la molécula diana que en el presente caso es el ácido nucleico que codifica el PRF1, o bien a partir de la proteína diana o bien a partir de la cual puede deducirse en principio la secuencia de ácido nucleico, o conociendo la secuencia del ácido nucleico como tal, particularmente el mRNA, los oligonucleótidos antisentido pueden ser diseñados sobre la base del principio de complementariedad de las bases.

Los oligonucleótidos antisentido particularmente preferidos son los que tiene un corto tramo de DNA con fosforotioato (3 a 9 bases). Se requiere un mínimo de 3 bases de DNA para la activación de la RNasa H bacteriana y se requiere un mínimo de 5 bases para la activación de la RNasa H de mamíferos. En estos oligonucleótidos quiméricos hay una región central que forma un sustrato para la RNasa H que está flanqueado por "brazos" hibridantes constituidos por nucleótidos modificados que no forman sustratos para la RNasa H. Los brazos hibridantes de los oligonucleótidos quiméricos pueden ser modificados, tal como por 2'-O-metilo o 2'-flúor. Métodos alternativos usaron enlaces de metilfosfonato o fosforamidato en dichos brazos. Otras realizaciones del nucleótido antisentido útil en la práctica de la presente invención son P-metoxioligonucleótidos, P-metoxioligodesoxi-ribo-nucleótido parcial o P-metoxioligonucleótidos.

De particular relevancia y utilidad para la presente invención son los oligonucleótidos antisentido que se describen más particularmente en las dos patentes de EE.UU. antes mencionadas. Estos oligonucleótidos contienen nucleótidos no naturales con enlaces 5'->3'. En lugar de ello los oligonucleótidos tienen dos tipos de nucleótidos: el tipo 2'-desoxifosforotioato, que activa la RNasa H, y el tipo de nucleótidos modificados en la posición 2', que no activa dicha nucleasa. Los enlaces entre nucleótidos modificados en la posición 2' pueden ser fosfodiésteres, fosforotioato, o P-etoxifosfodiésteres. La activación de la RNasa H se consigue por una región activadora de RNasa H contigua, que contiene entre 3 y 5 nucleótidos de 2'-desoxifosforotioato para activar la RNasa H bacteriana y entre 5 y 10 nucleótidos de 2'-desoxifosforotioato para activar la RNasa H eucariótica y, particularmente, la de mamíferos. La protección contra la degradación se consigue haciendo altamente resistentes a la nucleasa las bases terminales 5' y 3' y, opcionalmente, colocando un grupo de bloqueo 3' terminal.

Más particularmente, el oligonucleótido antisentido comprende un extremo 5' y un extremo 3'; y desde 11 a 59 nucleótidos con enlaces 5'->3' seleccionados independientemente del grupo que consiste en nucleótidos de fosfodiéster modificados en la posición 2' y nucleótidos de P-alquiloxifosfotriéster modificados en las posición 2'; y en donde el nucleósido 5'-terminal está unido a una región activadora de RNasa H de entre tres y diez desoxi-ribonucleótidos unidos por fosforotioato contiguos, y en donde el extremo 3' de dicho oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en un desoxi-ribonucleótido invertido, un tramo contiguo de uno a tres ribonucleótidos modificados en la posición 2' con fosforotioato, un grupo biotina y un nucleótido de P-alquiloxifosfotriéster.

También puede usarse un oligonucleótido antisentido en donde el nucleósido 5' terminal no está unido a una región activadora de RNasa H, sino al nucleósido 3' terminal como se ha especificado antes. Además, el extremo 5' se selecciona del grupo particular en lugar del extremo 3' de dicho oligonucleótido.

También son adecuados y útiles oligonucleótidos antisentido que comprenden una región activadora de RNasa H 5' terminal y que tienen y entre 5 y 10 nucleótidos de desoxifosforotioato contiguos; entre 11 a 59 2'-metoxi-ribonucleótidos contiguos unidos con enlaces 5'->3'; y un grupo de bloqueo de exonucleasa presente en el extremo 3' del oligonucleótido que se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido no unido por un enlace 5'->3'-fosfodiéster, de uno a tres nucleótidos modificados con enlaces 5'->3' contiguos o un grupo de bloqueo químico no nucléotido.

Dos clases de oligonucleótidos antisentido particularmente preferidos se caracterizan como sigue:

La primera clase de oligonucleótidos antisentido, también se denomina en la presente memoria la segunda generación de oligonucleótidos antisentido, comprende un total de 23 nucleótidos que contienen, en dirección 5'->3', un tramo de siete 2'-O-metil-ribonucleótidos, un tramo de nueve 2'-desoxi-ribonucléotidos, un tramo de seis 2'-O-metil-ribonucleótidos y un 2'-desoxi-ribonucléotido 3'-terminal. Del primer grupo de siete 2'-O-metil-ribonucleótidos los cuatro primeros están enlazados por fosforotioato, mientras los cuatro (sic) subsiguientes 2'-O-metil-ribonucleótidos están enlazados por fosfodiéster. Además, hay un enlace fosfodiéster entre el último, es decir, el extremo más 3'-terminal de los 2'-O-metil-ribonucleótidos y el primer nucleótido del tramo que consiste en nueve 2'-desoxi-ribonucleótidos. La totalidad de los 2'-desoxi-ribonucleótidos están enlazados por fosforotioato. También está presente un enlace fosforotioato entre el último, es decir, el 2'-desoxinucleótido más 3'-terminal, y el primero 2'-O-metil-ribonucleótido del tramo subsiguiente que consiste en seis 2'-O-metil-ribonucleótidos. De este grupo de seis 2'-O-metil-ribonucleótidos los cuatro primeros de ellos, de nuevo en dirección 5'->3', están enlazados por fosfodiéster, mientras que los tres últimos de ellos, correspondientes a las posiciones 20 a 22 están enlazados por fosforotioato. El último, es decir el 2'-desoxinucleótido 3'-terminal está enlazado al último, es decir al 2'-O-metil-ribonucleótido 3'-terminal a través de un enlace fosforotioato.

Esta primera clase también puede describirse con referencia a la siguiente estructura esquemática: RRRnnnuNNN
NNNNNNnnnRRRN, en donde, R indica 2'-O-metil-ribonucleótidos (A,G,U,C) enlazados por fosforotioato; n representa for 2'-O-metil-ribonucleótidos (A,G,U,C); N representa desoxi-ribonucléotidos (A,G,T,C) enlazados por fosforotiato .

La segunda clase de oligonucleótidos antisentido particularmente preferida, también denominada en la presente memoria la tercera generación de oligonucleótidos antisentido o Gene Blocs, también comprende un total de 17 a 23 nucleótidos con la siguiente estructura básica (en dirección 5' ->3').

En el extremo 5'-terminal hay un nucléotido abásico invertido que es una estructura adecuada para conferir resistencia contra la actividad de exonucleasa y está descrito, por ejemplo en el documento WO 99/54459. Este nucleótido abásico invertido está unido a un tramo de cinco a siete 2'-O-metil-ribonucleótidos están enlazados por fosfodiéster. Siguiendo a este tramo de cinco a siete 2'-O-metil-ribonucleótidos hay un tramo de siete a nueve 2'-desoxi-ribonucleótidos todos los cuales están enlazados por fosfodiéster. El enlace entre el último, es decir el 2'-O-metil-ribonucleótido más 3-terminal y el primer 2'-desoxinucleótido de los 2'-desoxinucleótidos es a través de un enlace fosfodiéster. Adyacente al tramo de siete a nueve 2'-desoxinucleótidos está conectado un tramo consistente en cinco a siete 2'-O-metil-ribonucléotidos. El último 2'-desoxinucleótido está enlazado al primer 2'-O-metil-ribonucleótido del tramo últimamente mencionado que consiste en cinco a siete 2'-O-metil-ribonucleótidos que ocurre vía un enlace fosforotioato. El tramo de cinco a siete 2'-O-metil-ribonucleótidos están enlazados por fosfodiéster. En el extremo 3'-terminal del segundo tramo de cinco a siete 2'-O-metil-ribonucleótidos está unido otro nucleótido abásico
invertida.

Esta segunda clase también puede describirse con referencia a la siguiente estructura esquemática: (representando GeneBlocs la tercera generación de nucleótidos antisentido que también tiene la siguiente estructura esquemática):

cap-(n_{p})_{x}(N_{s})_{y}(n_{p})_{z}-cap

o

cap-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-cap.

en donde, cap representa modificaciones abásicas desoxi invertidas o similares en ambos extremos; n representa 2'-O-metil-ribonucleótidos (A,G,U,C); N representa desoxi-ribonucleótidos (A, G, T, C) enlazados por fosforotioato-; x representa un número entero de 5 a 7; y representa un número entero de 7 a 9; y z representa un número entero de
5 a 7.

Ha de advertirse que los números enteros x, y y z pueden elegirse independientemente unos de otros aunque se prefiere que x y z sean los mismos en un oligonucleótido antisentido. Por consiguiente, los diseños o estructuras básicas de los oligonucleótidos antisentido de la tercera generación pueden ser como sigue:

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{7}(n_{p})_{5}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{7}(n_{p})_{5}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{7}(n_{p})_{5}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{8}(n_{p})_{5}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{8}(n_{p})_{5}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{8}(n_{p})_{5}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{9}(n_{p})_{5}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{9}(n_{p})_{5}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{9}(n_{p})_{5}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{7}(n_{p})_{6}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{7}(n_{p})_{6}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{7}(n_{p})_{6}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{8}(n_{p})_{6}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{8}(n_{p})_{6}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{8}(n_{p})_{6}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{9}(n_{p})_{6}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{9}(n_{p})_{6}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{9}(n_{p})_{6}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{7}(n_{p})_{7}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{7}(n_{p})_{7}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{7}(n_{p})_{7}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{8}(n_{p})_{7}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{8}(n_{p})_{7}-cap, cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{8}(n_{p})_{7}-cap,

cap-(n_{p})_{5}(N_{s})_{9}(n_{p})_{7}-cap, cap-(n_{p})_{6}(N_{s})_{9}(n_{p})_{7}-cap, y

27)cap-(n_{p})_{7}(N_{s})_{9}(n_{p})_{7}-cap,

Otra clase adicional de compuestos que pueden ser generados basándose en las enseñanzas técnicas dadas en la presente memoria y que pueden usarse como medicamentos y/o agentes de diagnóstico son los RNA de interferencia pequeños (siRNA) dirigidos al ácido nucleico, preferiblemente mRNA, que codifica el PRF1. El siRNA es un RNA bicatenario que tiene típicamente una longitud de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos. La secuencia de una de las dos cadenas del RNA corresponde a la secuencia del ácido nucleico diana, tal como el ácido nucleico que codifica el PRF1, que ha de ser degradado. En otras palabras, conociendo la secuencia del ácido nucleico de la molécula diana, en el presente caso el PRF1, preferiblemente la secuencia de su mRNA, puede diseñarse una RNA bicatenario con una de las dos cadenas que sea complementaria a, por ejemplo, dicho, mRNA del PRF1 y, por aplicación de dicho siRNA a un sistema que contiene el gen, DNA genómico, hnRNA o mRNA que codifica el PRF1, la molécula de ácido nucleico diana respectiva será degradada y por tanto se reducirá el nivel de la proteína respectiva. Los principios básicos de diseño, construcción y uso de dicho siRNA como medicamento y agente de diagnostico, respectivamente, entre otros, están descritos en las solicitudes de patentes internacionales WO 00/44895 y WO 01/75164.

Basándose en el modo de acción de las clases antes mencionadas de compuestos, dichos anticuerpos, péptidos, anticalinas, aptámeros, espiegélmeros, ribozimas, oligonucleótidos antisentido, así como siRNA, por tanto está dentro de la presente invención usar cualquiera de estos compuestos que tienen como diana el PRF1 y el ácido nucleico que lo codifica, respectivamente, para la fabricación de un medicamento o un agente de diagnóstico para cualquiera de las enfermedades que se describen en la presente memoria y cualquiera de los estados morbosos que se describen en la presente memoria. Además, estos agentes pueden usarse para monitorizar el progreso de dichas enfermedades y estados morbosos y el éxito de cualquier terapia aplicada, respectivamente.

Las diversas clases de compuestos diseñados de acuerdo con la presente invención, tales como anticuerpos, péptidos, anticalinas, moléculas pequeñas, aptámeros, espiegélmeros, ribozimas, oligonucleótidos antisentido y siRNA también pueden estar contenidos en una composición farmacéutica. Preferiblemente dicha composición farmacéutica se usa para el tratamiento de las enfermedades como las descritas en la presente memoria o los estados morbosos como los descritos en la presente memoria. La composición farmacéutica puede comprender en una realización una o varias de las clases de compuestos y/o uno o más miembros de una sola clase, y opcionalmente un compuesto farmacéutico activo adicional, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser líquido o sólido, por ejemplo una solución, un tampón, una solución alcohólica o similar. Los vehículos sólidos adecuados son, entre otros, almidón y similares. Es conocido por los expertos en la técnica proporcionar formulaciones respectivas para los diversos compuestos de acuerdo con las clases antes mencionadas de compuestos, siendo dichas formulaciones para las vías particulares de administración, tal como oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular y similares.

Los diversos compuestos de las diferentes clases de compuestos como se han mencionado antes, también pueden estar, bien solos o en combinación, contenidos en un kit. Dicho kit comprende aparte del (de los) compuesto(s) respectivos adicionalmente uno o varios elementos o compuestos adicionales en donde los elementos se seleccionan del grupo que comprende tampones, controles negativos, controles positivos e instrucciones para el uso de los diversos compuestos. Preferiblemente, los diversos compuestos están presentes en forma seca o líquida, preferiblemente como una unida de dosificación para una sola administración cada vez. El kit puede usarse particularmente para la terapia, diagnosis o monitorización del progreso de la enfermedad o terapias aplicadas en relación con las enfermedades y estados morbosos que se describen en la presente memoria.

En un aspecto adicional el PRF1 tanto el ácido nucleico que lo codifica como, y preferiblemente, la secuencia de aminoácidos y el polipéptido o proteína PRF1 pueden ser usados para el desarrollo y/o generación y/o diseño de compuestos que son útiles en el tratamiento y/o prevención y/o diagnosis de cualquiera de las enfermedades y estados descritos en la presente memoria. Para tal fin, en una primera etapa se determina o escruta una pareja de interacción del PRF1, preferiblemente de la proteína PRF1. Más preferiblemente dicha pareja de interacción es una pareja de interacción de origen natural e incluso más preferiblemente dicha pareja de interacción es/son pareja(s) de de interacción natural(es). El método para determinar o escrutar dicha pareja de interacción es conocido por los expertos en la técnica. Una tecnología bien conocida es el denominado sistema de dos híbridos que se describe, por ejemplo, en Ausubel (supra), unidad 13.14 "Interaction Trap/Two-Hybrid System to Identify Interacting Proteins" de Fields S., Song, O., Nature, 20 de julio de 1989; 340 (6230):245-6. Una tecnología alternativa es precipitar la proteína PRF1 o uno de sus fragmentos a partir de extractos de células o lisados de células y determinar que otro factor está unido o co-precipitado con el PRF1. Dicho análisis puede efectuarse utilizando métodos estándares conocidos por los expertos en la técnica, tal como espectroscopía de masas. En una realización particular, la precipitación es una precipitación inmune. En otra realización la precipitación se realiza usando células radiomarcadas, preferiblemente células marcadas con ^{35}S. Además de las parejas de interacción, pueden determinarse particularmente parejas de interacción naturales usando medios cromatográficos y que caracterizan la fracción obtenida, es decir, eluida. En una realización preferida dichos medios cromatográficos pueden ser cromatografía de afinidad, en donde la proteína PRF1 está inmovilizada en el medio de separación. Debido a la interacción específica entre la proteína PRF1 y la posible pareja de interacción, esta pareja de interacción actuará como un ligando en el proceso cromatográfico y por tanto puede ser purificada y caracterizada adicionalmente.

En una segunda etapa la pareja de interacción así identificada puede ser usada en un proceso de escrutinio como se describe en la presente memoria para el PRF1. Adicionalmente o alternativamente, el ácido nucleico que codifica la pareja de interacción, si se trata de una pareja de interacción a base de un polipéptido o un ácido nucleico, puede ser usada para el diseño y/o fabricación y/o generación de las clases compuestos definidas en la presente memoria, tales como, pero sin limitación, anticuerpos, péptidos, anticalinas, moléculas pequeñas, aptámeros, espiegélmeros, ribozimas, moléculas antisentido (también denominadas en la presente memoria oligonucleótidos antisentido)y siRNA. En relación con el término siRNA estará comprendida cualquiera de sus formas, incluyendo pero sin limitación los siRNA que se describen en el documento WO 03/070918.

Ha de entenderse que la primera etapa antes descrita puede ser un método por sí mismo, siendo la segunda etapa solamente realizada con carácter opcional.

La presente invención se ilustra ahora por las siguientes figuras que no se pretende que limiten el alcance de la protección, sino que se dan solamente por razones de ilustración. De dichas figuras pueden deducirse características adicionales ilustrativas, realizaciones y ventajas de la invención, en donde:

La Figura 1 muestra una representación esquemática de activación inducida por el factor de crecimiento de la vía PI 3-quinasa;

La Figura 2 muestra una medida de la metástasis de los ganglios linfáticos en un modelo de ratón PC3 ortotópico del tratamiento con rapamicina (Rapamune);

La Figura 3 muestra el método experimental para identificar el PRF1 como una diana para fármacos en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa;

La Figura 4 muestra un escrutinio GeneBloc primario en células PC3;

La Figura 5 muestra el crecimiento células de PC3 transfectadas con GeneBlocs específicos del PRF1 en Matrigel, mostrando la Figura 5A la desactivación del mRNA en estas condiciones y mostrando la Figura 5B fotografías tomadas de células respectivas crecidas en Matrigel;

La Figura 6 muestra la extensión de la inhibición del crecimiento de tumor de próstata por interferencia de RNA específico del PRF1 (Figura 6C), y de las metástasis totales de ganglios linfáticos por uso de la misma interferencia de RNA específico del PRF1 (Figura 6D), mostrando la Figura 6A el diseño del vector básico para la expresión siRNA y mostrando la Figura 6B las secuencias de siRNA usadas;

La Figura 7 muestra el resultado de un experimento de expresión diferencial, en donde la expresión del PRF1 se monitorizó en líneas celulares diferentes crecidas en diversas superficies de crecimiento, siendo tratadas las células con compuestos diferentes de modo que se dirigen diferentes elementos a la vía de la PI 3-quinasa;

La Figura 8A muestra el resultado de un análisis de transferencia Western realizado para caracterizar la especificidad de un anticuerpo policlonal contra el PRF1;

La Figura 8B muestra dos fotografías de tejido de cáncer de próstata tenido con el anticuerpo policlonal caracterizado en la Figura 8A y usando suero pre-inmune;

La Figura 9A muestra el resultado de un análisis de transferencia Western de células tratadas con LY294002 (LY) o DMSO a las 24 horas, 48 horas, 72 horas 96 horas;

La Figura 9B muestra el resultado de un análisis de transferencia Western de células PC3 tratadas con una molécula antisentido (GB) específica para p110\beta;

La Figura 10A muestra el resultado de un análisis de transferencia Western de un experimento, en donde se trataron células PC3 con una molécula antisentido (GB) específica de Akt;

La Figura 10B muestra el resultado de un análisis de transferencia Western de células PC3 crecidas en condiciones hipóxicas y tratadas con una molécula antisentido específica para HIF1\alpha.

La Figura 11A muestra fotografías de células PC3 tratadas con diversas moléculas antisentido (GB) en una matriz extracelular;

La Figura 11B muestra un análisis de transferencia Western de las células PC3 mostradas en las fotografías de acuerdo con la Figura 5 A;

La Figura 12 muestra una representación esquemática del factor de crecimiento inducido por activación de la vía de la PI 3-quinasa que ahora también comprende HIF1\alpha como elemento en dirección 3' de la vía paralela a Akt que converge en el PRF1 denominada REDID1 en la presente memoria; y

La Figura 13a representa la secuencia de aminoácidos de acuerdo con NP_061931.1; y

Las Figuras 13b y c representan la secuencia del ácido nucleico de acuerdo con NM_019058.1

La Figura 1 muestra una representación esquemática de la activación, inducida por el factor de crecimiento, de la vía de la PI 3-quinasa. La estimulación de las células por el factor de crecimiento conduce a la activación de sus receptores correspondientes en la membrana celular, los cuales a su vez están asociados, y activan, las moléculas de señalización intracelular, tales como la PI 3-quinasa. El supresor de tumores PTEN interfiere con las respuestas en dirección 3' mediadas por la PI 3-quinasa y asegura que la activación de la vía ocurra de una manera transitoria. LY294002 es una pequeña molécula inhibidora de la PI 3-quinasa. Uno de los genes conocidos situados en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa es mTOR (diana de la rapamicina de mamíferos) que puede ser inhibido por el fármaco rapamicina (Rapamune) aprobado para uso en clínica. La PI 3-quinasa está implicada en el ciclo celular y la reparación del DNA, la regulación de la apoptosis, el transporte de glucosa, la traducción del factor de crecimiento, la metástasis y la migración. Los símbolos X están indicando potenciales dianas para fármacos en dirección 3' que se supone están implicadas en promover el comportamiento metastásico de las células cancerosas y pueden ser consideradas como mejores dianas para fármacos que las dianas situadas en dirección 5', tales como mTOR debido a los efectos secundarios reducidos.

La Figura 12 muestra una representación esquemática de la activación, inducida por el factor de crecimiento, de la vía PI 3-quinasa similar a la representación de la Figura 1. Sin embargo, debido a los hallazgos que subyacen bajo la presente invención la vía de la PI 3-quinasa ha sido más elaborada, de tal modo que la HIF1\alpha ha sido identificada como una rama de la vía de la PI 3-quinasa para el PRF1 que es paralela a la vía mediada por la Akt.

Una descripción más detallada de las otras figuras se dará en los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1 Materiales y métodos Cultivos de células

Las células PC3 de carcinoma de próstata humano se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en una mezcla nutriente F12K (modificación de Kaighn) que contenía, suero de ternero (CS) al 10%, gentamicina (50 \mug/ml) y anfotericina (50 ng/ml). Las transfecciones se realizaron en placas de 96 pocillos o 10 cm (a una confluencia de 30% a 50%) usando diversos lípidos catatónicos, tales como Oligofectamina, Lipofectamina (Life Technologies), NC388 (Ribozime Pharmaceuticals, Inc., Boulder, CO). o FuGene 6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los GeneBlocs se transfectaron añadiendo, complejo pre-formado concentrado 5 veces de GeneBloc y lípidos en medio exento de suero a las células en medio completo. El volumen de transfección total fue 100 \mul para las células cultivadas en placas de 96 pocillos y 10 ml para las células cultivadas en placas de 10 cm. La concentración final de lípidos era 0,8 a 1,2 \mug/ml dependiendo de la densidad celular; la concentración de GeneBloc se indica en cada experimento.

Las células cultivadas se sometieron a tripsinización y se cosecharon tras detener el efecto de la tripsina por el medio. Se llevaron a cabo métodos de de lavado (PBS; Centrifugación 5 min/1.000 rpm) y, finalmente, el sedimento se volvió a poner en suspensión considerando el número de células y el volumen a inocular.

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Determinación de las cantidades relativas de los niveles de RNA por análisis Taqman

El RNA de las células transfectadas en 96 pocillos se aisló y purificó usando el kit Invisorb RNA HTS 96 (InVitek GmbH. Berlin). La inhibición de la expresión del mRNA del PRF1 se detectó por análisis por RT-PCR en tiempo real (Taqman) usando cebador 5' del PRF1 300nM, cebador 3' del PRF1 300nM y 100 nM de la sonda Taqman del PRF1 marcada con Fam-Tamra. La reacción se llevó a cabo en 50 \mul y se valoró en un detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones el fabricante, bajo las siguientes condiciones: 48ºC durante 30 minutos; 95ºC durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC.

Crecimiento in vitro en matriz de Matrigel

Las células PC3 se trataron con LY294002 10\muM o DMSO cuando se sembraron en Matrigel. Si las células se transfectaron previamente a la siembra se transfectaron con GeneBloc y se sometieron a tripsinización 48 horas después de la transfección. Las células se lavaron en medio y se sembraron por duplicado en 24 pocillos (100.000 células por pocillo) se pre-revistieron con 250 \mul de matriz de membrana basada en Matrigel (Becton Dickinson).Después de incubación durante 24 a 72 horas se tomaron fotografías de 5 aumentos con una cámara conectada a un microscopio Axiovert S100 (Zeiss).

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Micromatriz ordenada Affymetrix

El RNA total de las células crecido en Matrigel se prepare usando el kit Totally RNA (AMBION) siguiendo el protocolo de los fabricantes. En la etapa final el RNA precipitado total se volvió a poner en suspensión en tampón de lisis Invisorb y se purificó usando el kit Invisorb de centrifugación de células-RNA (INVITE). El cRNA marcado con biotina se preparó siguiendo los protocolos de Affymetrix y 15 \mug de cRNA se hibridaron en el Affymetrix GeneChip set HE-U95.

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Análisis de datos

Los datos en bruto fueron analizados usando el programa de ordenador Microarray Suite v 4.0 de Affymetrix GeneChip. La intensidad de cada sonda se calcula como la diferencia de la señal de hibridación de los nucleótidos de apareamiento perfecto menos la señal de hibridación de los oligonucleótidos con desapareamiento promediada en el conjunto de 16 a 20 pares de sondas correspondientes a un transcrito. La diferencia media del conjunto de sondas es proporcional a la abundancia de un transcrito. Las intensidades de las señales totales de diferentes matrices se llevaron a escala al mismo valor antes de la comparación. Los cambios de plegamiento se calcularon usando el programa de Affynnetrix por comparación en el modo de pares de bases de las intensidades correspondientes de las matrices del experimento y la línea base. Usando las matrices de decisión descritas por Affymetrix el programa también genera llamadas absolutas (un transcrito está ausente, marginal o presente en un experimento) y llamadas de diferencia (abundancia de un transcrito en un experimento comparado con otro: aumento, aumento marginal, ausencia de cambio, disminución marginal, disminución). Los resultados se exportaron a Microsoft Excel (llamada absoluta, llamada de diferencia, cambio de plegamiento) y se filtraron. Todos los conjuntos de sondas con llamadas ausentes o sin cambio se desecharon y la tabla se clasificó por el cambio de plegamiento.

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Estudios en animales

Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para estudios no clínicos de laboratorio [Regulaciones GLP (Good Laboratory Practice)] de la Food and Drug Administration y de acuerdo con la ley alemana de protección de animales como base legal.

Ratones Shoe:NMRI-nu/nu (Tierzucht Schönwalde GmbH) mantenidos en condiciones SPF (equipo de flujo laminar de aire, Scantainer, Scanbur) actuaron como receptores de células de carcinoma de próstata humano. Los animales, que tenían una edad de 6-8 semanas y pesaban 28-30 g, se inocularon con 2x10^{6}/0,03 ml de células tumorales tanto en el lóbulo dorsolateral de la glándula prostática (inoculación intraprostática; ortotópica) como en la punta del lóbulo lateral izquierdo del hígado (inoculación hepática; ectópica). Para este fin, los ratones recibieron anestesia total del cuerpo usando una mezcla de Ketanest (Parke-Davis GmbH) y Rompun (Bayer Vital GmbH) 80:1 con dosis de 100 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente. Después de la esterilización a fondo de la superficie del cuerpo ventral se hizo una incisión a través de la piel abdominal y la pared peritoneal empezando cerca del borde de la glándula prepucial y que medía aproximadamente 1 cm. Por medio de un par de pinzas y una torunda de algodón se visualizó la glándula prostática. Los enfrentamientos celulares ortotópicos fueron seguidos con la ayuda de una lente y el uso de una jeringa de 1 ml (Henke Sass Wolf GmbH) que llevaba agujas de marca Microlance de 30G30x13(Becton Dickinson). Una administración fue satisfactoria si se observaba una ampolla marcada en el sitio de inoculación. La herida fue cerrada por material de sutura (PGA Resorba, Franz Hiltner GmbH) para la pared peritoneal y pinzas de Michel de 11x2 mm (Heiland) para la piel abdominal. La lesión se cubrió con una pulverización para heridas (Hansaplast Sprünpflaster, Beiersdorf, AG). Durante la fase pos-quirúrgica los animales se mantuvieron en un ambiente cálido hasta que despertaron completamente. Los animales fueron aleatorizados de acuerdo con el número de grupos de tratamiento consistente en 5-10 animales por grupo cada uno. Fueron inspeccionados sucesivamente incluyendo la protocolización de los hallazgos. Se les administró como dieta reforzada Ssniff NM-Z, de 10 mm, que puede ser tratada en autoclave (Ssniff Spezialdiäten GmbH) y el agua de beber estaba acidificada con HCl, ambos ad libitum.

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Evaluaciones

En los días de tratamiento se registraron los pesos de los animales después de recibir el nivel de dosis real. Al mismo tiempo, se puede deducir del desarrollo del peso las influencias de las modalidades de tratamiento sobre el organismo completo.

Se llevaron a cabo punciones de sangre en el día 0 (línea base); 14; 28; y 35 (Sacrificio). La sangre se sacó de la vena orbital del animal anestesiado a corto plazo (con éter dietílico, Otto Fischar GmbH). Los parámetros de evaluación que dan los datos para la compatibilidad y los efectos secundarios de los tratamientos son como sigue: Número de leucocitos; número de trombocitos; enzimas. Otros parámetros de la sangre (bilirrubina; creatinina; proteínas; urea; ácido úrico).

Todos los animales sacrificados se diseccionaron y documentaron fotográficamente. Los tumores (glándula prostática) y metástasis (caudal, lumbar, metástasis de los ganglios linfáticos renales) se midieron en dos dimensiones por medio de un par de calibres. El volumen se calculó de acuerdo con V (mm^{3}) = ab^{2}/2 con b<a. En general, el número de células afectado por la terapia se aproxima al que causa el 100% de inoculación del tumor (tumor take) concerniente a la glándula prostática. Se registraron los pesos de algunos órganos (hígado; bazo; riñón) para encontrar datos adicionales concernientes al conocimiento de los efectos secundarios.

Para el análisis histológico muestras de tejidos tumorales, es decir, tumor de próstata y metástasis de ganglios linfáticos, se fijaron en formaldehido al 5% y se incrustaron en parafina. Rutinariamente las secciones fueron teñidas con HE, si fue necesario se hicieron tinciones específicas (Azan, PAS).

Para detectar el origen humano del tumor y las células metastásica se congelaron en nitrógeno líquido muestras adecuadas de tejidos. Cuando se usan análisis PCR y Taqman con amplicón (trozo de DNA formado como producto de amplificación natural o artificial) específico de hipoxantina-fosforibolsil-transferasa humana (huHPRT) se podían detectar 50 células humanas en 5 mg de tejido.

Los resultados terapéuticos fueron verificados estadísticamente por el ensayo U de Mann y Whitney.

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Ejemplo 2 Prueba de concepto experimental sobre la idoneidad de las dianas para fármacos en dirección 3'

Como se ha indicado en la parte introductoria de esta memoria que se incorpora en el presente texto como referencia, las dianas situadas en la en dirección 3' vinculadas a una vía de señalización son valiosas para el diseño o desarrollo de tanto medicamentos o fármacos como agentes de diagnóstico. Es obvio que, si la diana particular está asociada a otra diferentes vías o, debido a su posición dentro de la vía de señalización, a un número de fenómenos biológicos, tales como por ejemplo metástasis y migración, traducción del factor de crecimiento, apoptosis, ciclo celular, reparación del DNA y similares como en el caso de la vía de la PI 3-quinasa, cualquier compuesto que se dirija a esta diana es probable que tenga una número de efectos secundarios que pueden ser perjudiciales para el sistema e indeseados desde el punto de vista médico, o causar un resultado analítico falso o no específico. Por consiguiente, las dianas situadas en dirección 3' deben ser las de primera elección.

Los presentes inventores han encontrado que bajo el control de la vía de la PI 3-quinasa están implicadas otras posibles dianas además de mTOR, las cuales son específicas para controlar los fenómenos de metástasis y migración y por tanto la tumorigénesis y, posiblemente, también la traducción del factor de crecimiento y el agotamiento de glucosa y/o aminoácidos. En la industria farmacéutica se ha encontrado que la rapamicina, vendida con el nombre comercial Rapamune es adecuada para inhibir la metástasis y migración, así como la inmunosupresión (por ejemplo para el trasplante de órganos). Esto confirma la idoneidad de la estrategia de dirigirse a dianas de fármacos situadas en dirección 3'.

Como puede verse de la Figura 2 la rapamicina es adecuada para reducir el volumen de la metástasis de los ganglios linfáticos y por tanto es comparable en sus efectos al bien conocido inhibidor de la PI 3-quinasa, LY294002, que, sin embargo, está asociado a cierto número de efectos secundarios, lo que no es sorprendente debido al hecho de que la PI-3 quinasa y el mTOR están asociados a cierto número de fenómenos biológicos. Como se representa en la Figura 2A se usó el modelo de la inoculación de tumor (tumor take model) y el tratamiento con Rapamune empezó el día 1. Las dos concentraciones usadas, es decir, las dosis de 0,4 mg/kg y 2 mg/kg condujeron a una tremenda disminución de la extensión de la metástasis de los ganglios linfáticos, expresado como mm^{3} en comparación con el control negativo que fue solución salina tamponada con fosfato (representada en la Figura 2A por sus iniciales en inglés,
PBS).

Los mismos resultados también fueron obtenidos básicamente en el caso de tratamiento con Rapamune de un modelo de tumor establecido, empezando el tratamiento el día 28 (Figura 2B).

La puesta a punto experimental subyacente fue tal que se midió la metástasis de los ganglios linfáticos en un modelo de ratón PC3 ortotópico después del tratamiento con rampamicina (Rapamune). En la Figura 2(A) se muestran los resultados del modelo de inoculación de tumor (tumor take model). Ratones atímicos Shoe:NMRI-nu/nu (8 por grupo) fueron inyectados con 2x10^{6} células PC3 en 0,03 ml de .... dentro de la próstata y el tratamiento se llevó a cabo usando Rapamune intraperitonealmente diariamente durante 28 días a dosis de 2 mg/kg y 0,4 mg/kg. Como control se usó solución salina tamponada con fosfato (PBS).

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Para el tratamiento de tumores establecidos (B), se dejó que las células crecieran dentro de la próstata durante 28 días y el tratamiento se llevó a cabo por vía oral usando Rapamune en los días 29 a 50 después del implante. Las dosis se eligieron como se describen en A. Los animales fueron sacrificados los días 29 y 51, respectivamente y se determinaron las metástasis totales de los ganglios linfáticos.

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Ejemplo 3 Identificación del PRF1 como diana para fármacos en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa

El método experimental básico se muestra en la Figura 3. Células PC3 crecidas en Matrigel se trataron con DMSO o el inhibidor de la PI 3-quinasa, LY204002, y se aisló el RNA total de cada muestra. Se realizó la identificación de la expresión génica diferencial con Affymetrix y la expresión se confinó usando una valoración por RT-PCR Taqman en tiempo real. Se usó p110\alpha como patrón no diferencial.

Las células PC3 P son PTEN -/- lo que significa que la proteína supresora de tumores PTEN falta de hecho en estas células, de modo que la vía de la PI 3-quinasa está permanentemente activada lo cual conduce a una actividad metastásica aumentada o comportamiento de las células que se expresa por su modelo de crecimiento en la valoración en Matrigel. (Petersen, O.W., Ronnov-Jessen, L. Howlett, A. R. y Bissell, M.J. (1992) Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 9064-9068. (Auch: Sternberger et al., 2002 Antisense & Nucleic Acid drug development 12:131-143).

En relación con esto ha de advertirse que las células PC3 fueron hechas crecer en Matrigel y que se tomó éste como un sistema modelo que está próximo al ambiente in vivo del RNA aislado de ellas, que se supone que está más próximo a la situación o a los resultados in situ que cualquier preparación obtenida de células crecidas en un ambiente que no es Matrigel, tal como una placa convencional de cultivo de células.

Además de las células PC3, se hicieron crecer y se ensayaron otras células tales como PNT-1A, MCF-10A y HELA. Se usaron diversas superficies de crecimiento y las células se trataron con compuestos que se considera o se sabe que afectan a la vía de la PI 3-quinasa. Los resultados se muestran en la Tabla representada en la Figura 7. Como puede deducirse de la lectura expresada como "cambio" en las dos columnas de la parte superior derecha, la señal obtenida en el perfil de expresión de genes con Affymetrix se aumentó excepto por las siguientes combinaciones de compuestos administrados a las células, es decir, en el caso de las células PC3 una combinación los GB de desapareamiento dirigidos contra las subunidades catalíticas de la PI 3-quinasa p110a y p110b y el mismo desapareamiento en relación con LY (que es LY 284002), en caso de las células PNT-1A una molécula antisentido denominada PTEN 17 y el respectivo desapareamiento, y en el caso de células HELA la combinación de Tam y DMSO después de 48 horas y 72 más 96 horas, respectivamente. Se han descrito líneas de células estables que expresan una forma inducible de la PI 3-quinasa constitutivamente activa, Mp110*ER, (Klippel et al., 1998; Stemberger et al., 2002). Las mezclas de células establemente transfectadas en medio de crecimiento, se estimularon con 200 nM del inductor 4-OHT-tamoxifeno (Tam) en DMSO como se ha descrito previamente.

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Ejemplo 4 Escrutinio de los oligonucleótidos antisentido óptimos dirigidos al PRF1

Para escrutar los oligonucleótidos antisentido óptimos dirigidos al PRF1 se eligieron ocho GeneBlocs sobre el total de secuencias de mRNA del PRF1.

Las células PC3 se transfectaron con diferentes concentraciones de GeneBlocs como los descritos y se determinaron los niveles de mRNA 24 horas después de la transfección usando valoraciones Taqman con 300nM de cebador delantero e inverso específico de NM_019058 y 100nM de sonda y 40nM de cebador delantero e inverso y 100nM de sonda para \beta-actina humana.

Los resultados de este procedimiento que también se denomina en la presente memoria escrutinio primario de GeneBlocs, se representa en la Figura 4. De los resultados obtenidos se seleccionaron los GeneBlocs 70034 y 70044 para estudios posteriores.

En relación con el término GeneBloc, tal como se usa en la presente memoria en los diversos ejemplos, ha de advertirse que todos son oligonucleótidos antisentido de tercera generación como se especifica en la presente memoria que significa, como también es obvio de la Tabla 1, que las letras mayúsculas representan los desoxi-ribonucleótidos que estaban unidos a través de un enlace fosforotioato en lugar de un enlace fosfodiéster.

TABLA 1 Visión general de los diversos GeneBlocs usados, sus denominaciones alternativas, desapareamientos (abreviadamente en la Tabla MM, por la expresión inglesa MISMATCHES) con relación al ácido nucleico diana y características estructurales de las secuencias

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1

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Además ha de advertirse que cualquiera de las "t" de la tabla anterior son realmente "u" debido al hecho de que los oligonucleótidos antisentido anteriores son GeneBlocs, es decir, oligonucleótidos antisentido de tercera gene-
ración.

Otras moléculas antisentido que se usan en los diversos ejemplos y realizaciones de la presente invención pueden tomarse de la Tabla 2 que indica los nombres, es decir, las referencias internas de las moléculas antisentido, sus secuencias y las características de las secuencias. Estas moléculas antisentido son GeneBlocs, es decir, oligonucleótidos antisentido de tercera generación. Los subrayados indican los desapareamientos con respecto a las secuencias
diana.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Resumen general de otros GeneBlocs usados

2

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Ejemplo 5 Desactivación selectiva del PRF1

Para demostrar que el PRF1 es una diana en dirección 3' adecuada de la vía de la PI 3-quinasa se usaron los dos GeneBlocs particularmente ventajosos como los obtenidos del ejemplo 4, es decir, 70004 y 70043 en un experimento de crecimiento basado en Matrigel. El experimento de crecimiento en Matrigel se toma como un modelo sustituto que muestra el comportamiento de metástasis y migración de la célula respectiva. Un crecimiento más confluente de las células se toma como una indicación de que se aumenta su comportamiento de metástasis y migración que permite que las células se extiendan sobre la estructura tridimensional proporcionada por el Matrigel. Lo resultado de este ejemplo se representa en la Figura 5.

Las células PC3 se transfectaron y sembraron en Matrigel como se ha descrito y se monitorizó el crecimiento. El mRNA se aisló a partir de una parte alícuota de las células sembradas en Matrigel y se analizaron usando una valoración Taqman (panel izquierdo). El mRNA específico del PRF1 (NM_019058) se estandarizó a niveles de mRNA de p110\alpha interno. Un GeneBloc específico de PTEN se usa como un control negativo en las células PTEN-/-PC3 y su usa un GeneBloc específico de p110\beta como control positivo para crecimiento en una matriz extracelular. La inhibición específica del crecimiento se muestra comparando el crecimiento de células tratadas con los GeneBlocs 70043 y 70044 específicos del PRF1, respectivamente, frente a sus oligonucleótidos 70168 y 70169 con desapareamientos correspondientes, respectivamente.

A partir de la Figura 5A y la Figura 5B puede deducirse que los dos GeneBlocs preferidos, es decir 70043 y 70044 dan como resultado una desactivación significativa del mRNA del PRF1 con lo cual este resultado corresponde a los obtenidos a partir de la valoración del crecimiento en Matrigel. El eje de las y representa la cantidad de mRNA como se determine por el método DCt de acuerdo con las instrucciones de Applied Biosystems.

Ejemplo 6 Generación y especificidad de un anticuerpo policlonal contra el PRF1

Se generó un anticuerpo policlonal contra el PRF1 usando técnicas estándares. El anticuerpo policlonal así obtenido se ensayó en cuanto a su especificidad para el PRF1. Para tal fin se prepararon lisados de células PC3 tratadas con moléculas antisentido específicas del PRF1, más particularmente bloques de genes, o sus desapareamientos y células transfectadas con plásmidos de expresión para PRF 1 con una cola de HA recombinante. Los lisados se analizaron por análisis de transferencia Western usando el anticuerpo policlonal y los resultados se representan en la Figura 8A.

Como puede verse de la Figura 8A las células PC3 tratadas con el GeneBloc número 70043 (GB43, véase la Tabla 1) que es específico para la secuencia de ácido nucleico que se describe en la presente memoria muestra una reducción clara en la proteína PRF1 expresada, con lo cual la PI 3-quinasa está todavía siendo extensivamente expresada como se ilustra por los anticuerpos específicos p110\alpha y p85. Una segunda molécula antisentido, a saber GB44, también diseñada contra el PRF1, también condujo a una disminución significativa en la expresión de la proteína PRF1. De nuevo, la molécula de desapareamiento como en el caso del desapareamiento para GB43, MM43, la proteína PRF1 fue significativamente expresada en las células. Los lisados de las células transfectadas con plásmidos de expresión para pRF1 con una cola de HA recombinante muestran dos bandas, una para el PRF1 con la cola de HA y la otra para el PRF1 endógeno.

Estos resultados confirman que el anticuerpo policlonal exhibe una especificidad para el PRF1 y por tanto es una herramienta útil para monitorizar la presencia y ausencia, respectivamente, del PRF1.

Ejemplo 7 Inmunotinción para el PRF1 en tejido de tumor de próstata

El anticuerpo cuya generación y caracterización se describe en el Ejemplo 6 se usó para teñir tejido de tumor de próstata humano. Usando el suero policlonal en una dilución 1:1000 la expresión del PRF1 al nivel de proteína puede ser claramente visualizada como se representa en la Figura 8B, en donde la fotografía de la parte izquierda representa la tinción usando el anticuerpo policlonal descrito en el Ejemplo 6, mientras que la fotografía de la parte derecha representa una rebanada de tejido de tumor de próstata teñido usando suero pre-inmune.

Ejemplo 8 La expresión de la proteína PRF1 depende de varios miembros de la vía de la PI 3-quinasa

Para demonstrar que el PRF1 es una diana en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa y de la vía de la HIF1\alpha, se llevaron a cabo diversos experimentos, en donde se usaron compuestos que se sabe que son específicos de los diversos elementos de las respectivas vías y se investigó impacto de dichos compuestos sobre el nivel de la proteína PRF1.

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a) Impacto de la actividad de PI 3-quinasa sobre la expresión de la proteína PRF1

Para investigar si la actividad de la PI 3-quinasa tiene un impacto sobre la expresión de la proteína PRF1, se trataron células PC3 con LY294002 o con DMSO como control. El análisis se realizó por transferencia Western usando el anticuerpo policlonal como medio de detección para la proteína PRF1. Además de la proteína PRF1, también se monitorizó la expresión de Akt y Akt fosforilada (P* Akt) usando anticuerpos específicos respectivos. Adicionalmente se monitorizó la expresión de p110\alpha y p85.

Los resultados se representan en la Figura 9A.

Después de 72 y 96 horas, respectivamente, la proteína PRF1 solamente pudo ser detectada en células tratadas con DMSO. Bajo la influencia de LY294002 fue sub-regulada la cascada que consiste en Akt y Akt fosforilada, respectivamente, y la proteína PRF1.

Usando los mismos marcadores, las células se trataron en esta ocasión con una molécula antisentido, a saber, GeneBloc (GB) denominada p110\beta-GB 88 para inhibir específicamente la PI 3-quinasa.

Los resultados se muestran en la Figura 9B.

Como puede verse de la tercera y quinta pistas de la Figura, el GeneBloc contra la subunidad catalíticamente activa p100\beta tenía un efecto similar que el inhibidor de PI 3-quinasa conocido, LY 294002, confirmando que el PRF1 es una diana en dirección 3' para la expresión de la proteína que está influenciada por la PI 3-quinasa. Una molécula antisentido dirigida contra p110\alpha o una molécula antisentido de desapareamiento o DMSO no tenía ningún efecto sobre la expresión del PRF1 al nivel de proteína.

b) Impacto de Akt y HIF1\alpha sobre la expresión de la proteína PRF1

Para investigar si la expresión del PRF1 al nivel de la proteína también sería dependiente de la actividad de Akt (PKB)y de la actividad de HIF1\alpha se trataron células PC3 con moléculas antisentido específicas de Akt. Más particularmente, se usaron dos moléculas antisentido, denominadas Akt1-GB y Akt2 siendo la lectura la misma que se indicó en relación con la Figura 9, en donde, adicionalmente, se monitorizó la expresión de la proteína HIF1\alpha usando un anticuerpo policlonal purificado específico de la proteína G comercialmente disponible (R&D Systems. Número de lote: IUGO13071). El resultado se muestra en la Figura 10A.como puede verse en la Figura 10A 72 horas después del tratamiento con la molécula antisentido las células tratadas el GeneBloc Akt2 mostraron una reducción y las células tratadas con el GeneBloc Akt1 junto con GeneBloc Akt2 mostraron una reducción en el nivel de la proteína PRF1 lo que indica que Akt1 y Akt2, respectivamente, exhiben un cierto efecto inhibidor sobre el nivel de expresión de la proteína PRF1.

Se llevó a cabo el mismo experimento usando los mismos marcadores para la monitorización, excepto que el uso de Akt y P*-Akt se llevó a cabo con células crecidas en condiciones hipóxicas lo que se consiguió tratando las células con CoCl_{2}. Se usaron dos formas diferentes de moléculas antisentido, a saber HlF1\alpha-GB66 y HIF1\alpha-GB67 y sus moléculas con desapareamiento respectivas se usaron como controles. Los GeneBlocs redujeron significativamente la expresión de HIF1\alpha al nivel de proteína lo que a su vez redujo la expresión de la proteína PRF1. Este resultado se obtuvo después de 72 horas de tratamiento con GeneBlocs y tratamiento con CoCl_{2} durante 24 horas.

De este resultado puede deducirse que el nivel de proteína, depende tanto de la actividad de Akt como de HIF1\alpha, aunque el impacto de HIF1\alpha en la expresión de PRF1 al nivel de la proteína parece ser más pronunciado que el de Ak1.

Estos resultados confirman que el PRF1 es un efector en dirección 3' de la señalización de la PI 3-quinasa y la HIF1\alpha. Los datos presentados en la deserción de la vía sugieren que el PRF1 es dependiente de la actividad de HIF1\alpha en condiciones de crecimiento hipóxicas. Además esto parece ser una dependencia adicional de Akt de la expresión del PRF1 que parece no ser de pendiente de HIF1\alpha. Esta relación de regulación se ilustra en la Figura 12.

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Ejemplo 9 Análisis fenotípico de células que tienen inhibidos la proteína HIF1 alfa y el PRF1

El fin del experimento que subyace en este ejemplo fue investigar los cambios fenotípicos de células que muestran una inhibición de la expresión de HIF1\alpha y PRF1, respectivamente, al nivel de la proteína.

Las células se hicieron crecer en una superficie de Matrigel y se trataron con las moléculas antisentido (GeneBlocs) y los controles respectivos bajo las condiciones descritas en los experimentos anteriores.

Los resultados se representan en la Figura 11A y la Figura 11B, en donde cada fila consiste en una parte de la Figura 11A y La Figura 11B que se estudiarán juntas.

La Figura 11A muestra a secuencia de fotografías de células crecidas en una superficie de Matrigel y tratadas con las moléculas antisentido respectivas, mientras que la Figura 11B muestra el resultado de una análisis por transferencia Western realizado en células que se obtuvieron de la superficie de Matrigel. Una pista de la transferencia representa el lisado celular de las células mostradas en la fotografía correspondiente. Como lectura, p110\alpha y p85 se muestran como control de carga y el componente de la vía de la PI 3-quinasa investigado, es decir, AKT, monitorizado como P*AKT,HIF1\alpha y PRF1.

La células no tratadas muestran el modelo de crecimiento de células tumorales normales en la valoración en Matrigel. Se observa un fenotipo similar cuando se usa un desapareamiento de la molécula antisentido dirigida contra p110\beta. Usando una molécula antisentido dirigida contra PTEN, que a su vez está inhibiendo la PI 3-quinasa, se muestra el fenotipo de una línea celular no afectada por este represor de tumores (Figura 11A, primera fila). Como se esperaba la P*-AKT está significativamente reducidas en estas condiciones y representa la lectura para la desactivación de la p110\beta funcional (Figura 11B, primera fila). Un fenotipo similar debido a la pérdida de función como ocurre con la desactivación de p110\beta se observa cuando se usan moléculas antisentido contra HIF1\alpha con los desapareamientos que no conducen a un cambio en el fenotipo (Figura 11A, segunda fila). El análisis Western confirmó esto e indica un nivel de proteína reducido de HlF1\alphapara ambas moléculas antisentido HlF1\alpha (Figura 11B, segunda fila)). Finalmente, usando moléculas antisentido específicas del PRF1 de nuevo puede observarse la misma pérdida de fenotipo de función (fotografías 1 y 3 de la tercera fila de la Figura 11A) siguiendo con una expresión disminuida de proteína PRF1 también en el análisis por transferencia Western (Figura 11B, tercera fila).

En resumen, estos resultados confirman que el PRF1 también es al nivel de proteína un efector en dirección 3' de la señalización de la PI 3-quinasa. Además, PFR1 es dependiente de la actividad de HIF1\alpha bajo condiciones hipóxicas. Además, parece haber una dependencia de Akt adicional de la expresión del PRF1 que parece no ser dependiente de HIF1\alpha.

Ejemplo 10 Inhibición del crecimiento prostático de tumores por interferencia de RNA específico

Este experimento es un ejemplo de un diseño satisfactorio de un RNA de interferencia pequeño (siRNA) que permite que sea específicamente alcanzada la diana de fármacos en dirección 3'. Las moléculas de siRNA moléculas fueron generadas por la expresión activada por el promotor (U6+2) de secuencias dianas específicas.

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Construcción de plásmidos de expresión de siRNA

Los casetes U6+2 del promotor pol III fueron generados por PCR usando oligonucleótidos sintéticos y clonados en un sitio de restricción EcoRI/XhoI de un vector derivado de pUC. La inserción de siRNA específico se clonó usando una enzima de restricción no palindrómica (BsmBl con TTTT sobresaliendo del extremo 5' y GGCA sobresaliendo del extremo 3'). Los insertos fueron generados asociando dos oligonucleótidos sintéticos con los extremos 5'CCGT y 3'AAAA sobresalientes. El casete de expresión que comprende el promotor, el siRNA que ha de ser expresado y una secuencia terminadora, se lee, en el caso del siRNA específico del PRF1 como sigue:

100

El promotor sintético U6+2 y el siRNA específico del PRF1 están en letras negritas, (EcoRI; XhoI).

Este casete de expresión, en principio, puede ser clonado en cualquier vector de expresión.

El diseño básico del siRNA que expresa la construcción también se representa en la Figura 6A de la cual puede deducirse que los siRNA son diseñados de tal modo que forman un bucle intracelular que es generado por el tramo poli-A. La Figura 6B muestra las diversas construcciones de siRNA usadas en el presente ejemplo, a saber, para p110\beta (SEQ ID NO. 14), p110\alpha (SEQ ID NO. 15) y para el mRNA del PRF1.

Las diversas construcciones de siRNA tales como las dirigidas a p 110\alpha, p110\beta y PTEN, así como los siRNA específicos del PRF1 se clonaron en la misma construcción de vector. Células PC3 (1 x10^{6} células) se transfectaron con 6 \mug de los plásmidos de expresión de siRNA respectivos o un plásmido de expresión EGFP expresión que usa Effectene^{TM} (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones de fabricante, que expresa los siRNA para p110\alpha p110\beta, o PRF1 o que expresan EGFP de longitud completa que sirvió como control para el crecimiento de tumores de células PC3 transfectadas establemente. 48 horas después de la transfección las células fueron tripsinizadas y diluidas y resembradas en discos de 150 mm que contenían 500 \mug/ml de geneticina. El medio con 500 \mug/ml de geneticina se reemplazó diariamente y 7 días después de la transfección se reemplazó por un medio que contenía 600 \mug/ml de geneticina. Las mezclas de células resistentes se expandieron y cosecharon, se determinó el número de células y se prepararon para experimentos en animales experimento como se ha descrito.

Los resultados se muestran en la Figura 6, en donde más particularmente en la Figura 6C se muestran el volumen de tumores de próstata primarios en mm^{3} 56 días después de la inoculación y en la Figura 6D se muestran los volúmenes de metástasis de ganglios linfáticos totales en mm^{3} 56 días después de la inoculación.

De dichas figuras puede deducirse que el crecimiento de tumores de próstata puede ser significativamente inhibido por administración de siRNa específicos del PRF1. La extensión de la inhibición es por tanto similar a la de una construcción de siRNA dirigida a p110\beta. Sin embargo, teniendo en cuenta la posición de p110\beta y PRF1, respectivamente, en la vía de la PI 3-quinasa, ha de entenderse que el siRNA específico para el PRF1 permite un direccionamiento a la diana más específico y por tanto la modulación de una parte o rama de la vía de la PI 3-quinasa y los procesos asociados a dicha vía, comparada con el direccionamiento a p110\beta como diana. Lo mismo es también es verdad en el caso de que se tenga en consideración la metástasis total de los ganglios linfáticos, en donde los efectos son menos prominentes.

<110> atugen AG

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<120> Nuevo factor para metástasis y sus usos

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<130> A 19011 PCT

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<160> 17

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 232

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> RASGO_MISCELÁNEO

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<223> secuencia de aminoácidos de NMF

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<400> 1

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3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1760

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 699

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato <220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

<223 DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DNA enlazado a través de enlaces de fosforotioato

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> RNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> siRNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> RNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> siRNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> RNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> siRNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm21

Claims

1. Uso in vitro de un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento de células en una matriz extracelular, en donde dicho factor:

a): comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1;

b): tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061931.1;

c): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

ca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3; o

ii): una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506686 o NM_019058.1;

cb): el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y en donde el ácido nucleico se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico de acuerdo con ca); o

cc): el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con ca);

\vskip1.000000\baselineskip

como una diana en dirección 3' o un marcador en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa, preferiblemente como una diana de fármaco en dirección 3' de la vía de la PI 3-quinasa, en escrutinio de fármacos, diseño de fármacos y desarrollo de fármacos, en donde el fármaco es útil para cicatrización de heridas, inhibición del crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y el crecimiento de células en un matriz extracelular.

2. Uso in vitro de un factor polipeptídico, en donde el factor:

a): comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1;

c): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

ca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO.3; o

cc): el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y en donde el ácido nucleico se hibrida, en condiciones restrictivas, con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con ca);

\vskip1.000000\baselineskip

como un marcador para un proceso, en donde el proceso es un proceso regulado por la vía de la PI 3-quinasa, en donde el proceso se selecciona del grupo que consiste en cicatrización de heridas, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento de células en una matriz extracelular.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el factor es un marcador para células transformadas, preferiblemente células invasivas.

\newpage

4. Uso de un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento de células en una matriz extracelular, en donde el factor

a): comprende una secuencia de aminoácidos acuerdo con la SEQ ID NO. 1;

b): tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061831.1;

c): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

ca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO.3; o

\vskip1.000000\baselineskip

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste tumor en fase tardía, cáncer con metástasis, y cualesquiera estados patológicos que implican la vía de la PI 3-quinasa,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), trichilemmomas, hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de mama y tiroides,

o en donde el medicamento es para cicatrización de heridas.

5. Uso de un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular, en donde el factor:

a): comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1;

c): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

ca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO.3; o

ii): un secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las entradas de bancos de datos gi 9506686 o NM_019058.1;

cc): el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con ca);

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para la fabricación de un agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste tumor en fase tardía, cáncer con metástasis, y cualesquiera estados patológicos que implican la vía de la PI 3-quinasa,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de mama y tiroides,

o en donde el agente de diagnóstico es para la cicatrización de heridas.

6. Uso de un ácido nucleico, en donde dicho ácido nucleico es:

a): un ácido nucleico que codifica un factor o uno de sus fragmentos, en donde el factor es:

i): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1; o

ii): un polipéptido que tiene una secuencia de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061931.1;

b): un ácido nucleico que codifica el factor como para a), en donde el ácido nucleico comprende

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO. 3; o

c): un ácido nucleico que codifica el factor como para a), en donde el ácido nucleico se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico de acuerdo con b); o

d): un ácido nucleico que codifica el factor como para a), en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con b);

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular,

en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste tumor en fase tardía, cáncer con metástasis, y cualesquiera estados patológicos que impliquen la vía de la PI 3-quinasa,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), trichilemmomas, hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de la mama y el tiroides,

o en donde el medicamento es para cicatrización de heridas.

7. Uso de un ácido nucleico, en donde dicho ácido nucleico es:

a): un ácido nucleico que codifica un factor o uno de sus fragmentos, en donde el factor es

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO. 3; o

para la fabricación de un agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular,

en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tumor en fase tardía, cáncer con metástasis, y cualesquiera estados que impliquen la vía de la PI 3-quinasa,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste en carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), lesiones mucocutáneas, tales como trichilemmomas, hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de la mama y el tiroides,

o en donde el agente de diagnóstico es para cicatrización de heridas.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7, en donde la enfermedad se caracteriza porque las células que están implicadas en dicha enfermedad carecen de actividad de PTEN, o muestran una hiperactivación de la vía de la PI 3-quinasa, o un comportamiento agresivo aumentado, o son células tumorales, preferiblemente células de un tumor en fase tardía.

9. Uso in vitro de un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el factor:

a): comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1;

c): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

ca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO.3; o

cc): el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b y en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con ca);

como una molécula diana para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, en donde el fragmento tiene los efectos de un factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumor, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular,

en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tumor en fase tardía, cáncer con metástasis, y cualesquiera estados patológicos que impliquen la vía de la PI 3-quinasa,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste en carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), trichilemmomas, hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de la mama y el tiroides,

o en donde el medicamento es para cicatrización de heridas.

10. Uso in vitro de un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el factor

a): comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1;

c): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

ca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 3;

ii): una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506686 o NP_019058.1;

cc): el ácido nucleico codifica el factor como para a) o b) y en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con el ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con ca);

como una molécula diana para el desarrollo de un agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad, en donde el fragmento o derivado tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular,

o en donde el agente de diagnóstico es para cicatrización de heridas.

11. Uso in vitro de un ácido nucleico, en donde dicho ácido nucleico es:

i): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO. 1; o

b): un ácido nucleico que codifica el factor como para a), en donde el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO. 3; o

ii): un ácido nucleico secuencia de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506686 o NM_019058.1;

como una molécula diana para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en la matriz extracelular y crecimiento celular en la matriz extracelular,

o en donde el medicamento es para cicatrización de heridas.

12. Uso in vitro de un ácido nucleico, en donde dicho ácido nucleico es:

ii): un polipéptido que tiene un secuencia de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061931.1;

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO. 3; o

como una molécula diana para el desarrollo de un agente diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular,

o en donde el agente de diagnóstico es para cicatrización de heridas.

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el medicamento y/o el agente de diagnóstico comprenden un agente que se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, péptidos de unión de alta afinidad, anticalinas, moléculas antisentido, aptámeros, espiegélmeros y moléculas de RNA.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el agente interactúa con un factor o uno de sus fragmentos como los definidos en la reivindicación 1.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el agente interactúa con el ácido nucleico como el definido en la reivindicación 6, en particular con mRNA, ácido nucleico genómico o cDNA que codifica el factor polipeptídico como el definido en la reivindicación 1.

16. El uso de un anticuerpo o una de sus partes que interactúa con el factor polipeptídico o uno de sus fragmentos como el definido en la reivindicación 1, para el desarrollo o fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la fabricación de una agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad,

o en donde el medicamento y/o el agente de diagnóstico es para cicatrización de heridas.

17. El uso de un aptámero o espiegélmero que interactúa con el factor polipeptídico o uno de sus fragmentos como el definido en la reivindicación 1, para el desarrollo o fabricación de un agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad,

o en donde el agente de diagnóstico es para cicatrización de heridas.

18. El uso de un ácido nucleico que interactúa con un ácido nucleico que codifica el factor polipeptídico o uno de sus fragmentos como el definido en la reivindicación 1, para el desarrollo o fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad y/o para la fabricación de un agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad,

o en donde el medicamento es para cicatrización de heridas,

en donde el ácido nucleico que interactúa es un oligonucleótido antisentido, una ribozima y/o siRNA.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica el factor polipeptídico o una de sus partes es cDNA, mRNA o hnRNA.

20. El uso de un kit para la caracterización de una enfermedad o estado que se selecciona del grupo que consiste en tumor en fase tardía, cáncer con metástasis, y cualesquiera estados que impliquen la vía de la PI 3-quinasa,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste en carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), trichilemmomas, hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de la mama y el tiroides, y cicatrización de heridas,

en donde el kit comprende al menos un agente que se selecciona del grupo que comprende:

a): el factor polipeptídico o uno de sus fragmentos como el definido en la reivindicación 1,

b): anticuerpos o sus partes específicos para el factor polipeptídico o uno de sus fragmentos como para a),

c): un ácido nucleico que codifica un factor, en donde el factor es:

d): un ácido nucleico que codifica el factor o uno de sus fragmentos como para a), en donde el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. o la SEQ ID NO. 3; o

e): un ácido nucleico que codifica el factor o uno de sus fragmentos como para a), en donde el ácido nucleico se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico de acuerdo con d); o

f): un ácido nucleico que codifica el factor o uno de sus fragmentos como para a), en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con d);

g): un ácido nucleico que interactúa con dicho factor polipeptídico o uno de sus fragmentos, en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas, crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular, y en donde los ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en aptámeros y espiegélmeros, y

h): ácidos nucleicos que interactúan con:

ha): un ácido nucleico que codifica un factor, en donde el factor es:

ii): un polipéptido que tiene una secuencia de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061931;

hb): un ácido nucleico que codifica un factor, en donde el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO, 3; o

ii): un ácido nucleico secuencia de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506686 o NM_019058,

hc): un ácido nucleico que codifica el factor o uno de sus fragmentos como para a), en donde el ácido nucleico se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico de acuerdo con d); o

he): un ácido nucleico que codifica el factor o uno de sus fragmentos como para a), en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con d);

y opcionalmente al menos otro compuesto.

21. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el factor polipeptídico está implicado en un proceso biológico, en donde el proceso es un proceso regulado por la vía de la PI 3-quinasa.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el proceso es un proceso seleccionado del grupo que consiste en cicatrización de heridas, metástasis, tumorigénesis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular.

23. Un método para el escrutinio de un agente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad y/o para el escrutinio de un agente para la fabricación de un agente de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad,

en donde dichos estados se seleccionan del grupo que consiste en carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), trichilemmomas, hematomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de la mama y el tiroides,

o en donde el medicamento y/o el agente de diagnóstico es para cicatrización de heridas,

que comprende las siguientes etapas:

a): proporcionar un compuesto candidato,

b): proporcionar un sistema de expresión para un factor polipeptídico o uno de sus fragmentos en donde el fragmento tiene los efectos del factor polipeptídico en términos de cicatrización de heridas crecimiento de tumores, tumorigénesis, metástasis, migración de células, motilidad celular en una matriz extracelular y crecimiento celular en una matriz extracelular, en donde el factor:

ba): comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO.1;

bb): tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las entradas del banco de datos gi 9506687 o NP_061931.1;

bc): está codificado por un ácido nucleico, en donde:

bca): el ácido nucleico comprende:

i): un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2 o la SEQ ID NO. 3; o

bcb): el ácido nucleico codifica el factor o uno de sus fragmentos como para b), ba) o bb) y en donde el ácido nucleico se hibridaría, salvo por la degeneración del código genético, con un ácido nucleico de acuerdo con bca); o

bcc): un ácido nucleico codifica el factor o uno de sus fragmentos como para b), ba) o bb) y en donde el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico de acuerdo con bca);

y/o un sistema, preferiblemente un sistema de actividad que detecta la actividad de dicho factor polipeptídico;

c): poner en contacto el compuesto candidato con el sistema de expresión para dicho factor polipeptídico y/o el sistema, preferiblemente un sistema de actividad, que detecta la actividad de dicho factor polipeptídico; y

d): determinar si la expresión y/o la actividad de dicho factor polipeptídico es cambiada bajo la influencia del compuesto candidato.

24. Método de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque el compuesto candidato está contenido en una quimioteca.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque el compuesto candidato se selecciona del grupo de clases de compuestos que consisten en péptidos de unión de alta afinidad, proteínas, anticuerpos, anticalinas, ácidos nucleicos funcionales, compuestos naturales y moléculas pequeñas.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque los ácidos nucleicos funcionales se seleccionan del grupo que comprende aptámeros, aptazimas, ribozimas, espiegélmeros, oligonucleótidos antisentido y siRNA (RNA pequeño de interferencia).

27. Uso in vitro del factor polipeptídico o uno de sus fragmentos como el definido en la reivindicación 1 como un marcador de la actividad de PI 3-quinasa.

28. Uso in vitro de un ácido nucleico como el definido en la reivindicación 6, como un marcador de la actividad de PI 3-quinasa.

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29. Uso de un ácido nucleico antisentido o un RNA de interferencia para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, en donde dicha enfermedad es cáncer y ácido nucleico antisentido y el RNA de interferencia están dirigidos contra un ácido nucleico como el definido en la reivindicación 6.

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el cáncer se selecciona de carcinomas colo-rectales, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, cáncer de mama-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duclos), enfermedades con hamartoma-macrocefalia incluyendo enfermedad de Cowden (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley (BRR), trichilemmomas, hamartomas gastrointestinales, lipomas, adenomas del tiroides, enfermedad fibroquística de la mama, gangliocitoma displásico cerebelar y enfermedades malignas de la mama y el tiroides.