ES2319939T3 - Mimeticos moleculares de epitopos de meningococos b. - Google Patents

Abstract

Un mimético molecular de un epitopo singular del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) que tiene la estructura siguiente: en la que X es O, NH, S o CH 2; R 3 es H o alquilo C 1-24; R 4 es -NH 2, -NHOH, -NHNH 2, -OH o -SH, y p = 0-3.

Description

Miméticos moleculares de epitopos de meningococos B.

Campo técnico

La presente invención concierne en general a patógenos bacterianos. En particular, la invención se refiere a miméticos moleculares de epitopos del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) identificados usando anticuerpos anti-MenB que carecen de actividad autoinmune.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis es un agente causante de meningitis y sepsis bacteriana. Los meningococos se dividen en grupos serológicos basados en las características inmunológicas de antígenos capsulares y de pared celular. Entre los serogrupos actualmente reconocidos están incluidos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E. Los polisacáridos responsables de la especifidad de los serogupos se han purificado a partir de varios de estos grupos, incluidos A, B, C, D, W-135 e Y.

El serogrupo B de N. meningitidis ("MenB") es responsable de aproximadamente 50% de la meningitis bacteriana en lactantes y niños que residen en EE.UU. y Europa. Este organismo causa también sepsis fatal en adultos jóvenes. En adolescentes, se ha encontrado que vacunas experimentales de MenB constituidas por vesículas de proteína de membrana exterior (PME) dan una protección de 50%. Sin embargo, no se ha visto protección en lactantes y niños vacunados, los grupos de las edades de mayor riesgo de enfermedad. Además, las vacunas de PME son específicas para serotipo y subtipo y las cepas dominantes de MenB están sometidas a variaciones geográficas y temporales, lo que limita la utilidad de tales vacunas.

Se han desarrollado vacunas eficaces basadas en polisacáridos capsulares contra la enfermedad por meningococos causada por los serogrupos A, C, Y y W135. Sin embargo, han fracasado intentos similares para desarrollar una vacuna de polisacárido de MenB debido a la mala inmunogenia del polisacárido capsular de MenB (denominado en esta memoria "MenB PS"). MenB PS es un homopolímero del ácido (N-acetil (\alpha 2\rightarrow8)neuramínico. Escherichia coli K tiene el polisacárico capsular idéntico. Los anticuerpos provocados por MenB PS reaccionan por cruce con ácido polisiálico (PSA) del hospedador. PSA se expresa abundantemente en tejido fetal y neonato, especialmente en moléculas adherentes de células neurales ("NCAM") halladas en tejido del cerebro. PSA se ha encontrado también en menor cuantía en tejidos de adultos, incluidos de riñón, corazón y nervio olfativo. Así, la mayoría de anticuerpos anti-MenB PS son también autoanticuerpos. Por tanto, tales anticuerpos tienen el potencial de afectar adversamente al desarrollo fetal o de conducir a una enfermedad autoinmune.

En un intento para salvar la mala inmunogenia de MenB PS se han preparado derivados de MenB PS. Por ejemplo, se han descrito derivados de MenB PS C_{3}-C_{6} N-acil sustituidos. Véase publicación EP nº. 504.202 B, expedida a Jennings y otros. Análogamente, la patente U.S. nº. 4.727.136, expedida a Jennings y otros, describe una molécula de PS de MenB N-propionilada, denominada en este contexto "NPr-MenB PS", Se ha hado cuenta de ratones inmunizados con glicoconjugados de NPr-MenB PS que provocan títulos altos de anticuerpos IgG. Jennings y otros, (1986) J. Immunol. 137:1708. En conejos, usando el derivado, se produjeron dos poblaciones distintas de anticuerpos, supuestamente asociadas con dos epitopos diferentes, uno compartido por MenB PS nativo y uno no compartido. Se encontró actividad bactericida en la población de anticuerpos que no reaccionaba por cruce con MenB PS. Jennings y otros (1987) J. Exp. Med. 165:1207. Se desconoce la identidad del(los) epitopo(s) que reacciona(n) con los anticuerpos protectores provocados por este conjugado.

Los péptidos pueden actuar como miméticos de polisacáridos por unión a anticuerpos específicos para polisacáridos así como a otras proteínas de unión de polisacáridos. Por ejemplo, se ha usado concanavalina A (Con A), que se une a oligosacáridos que presentan restos terminales de manosa o glucosa conectados en alfa, para seleccionar miméticos de péptidos de bibliotecas al azar de fagos bacterianos que presentan secuencias peptídicas cortas en el término amino de la proteína de revestimiento pIII. Oldenberg y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393; Scott y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5398. Análogamente, anticuerpos monoclonales han identificado miméticos de un hidrato de carbono presente en la superficie de células de adenocarcinoma de una biblioteca de fagos. Hoess y otros (1993) Gene 128:43.

Los péptidos también pueden provocar anticuerpos específicos para polisacáridos. Por ejemplo, Westerink y otros (1988) Infect. Immun. 56:1120, usaron un anticuerpo monoclonal al polisacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis ("MenC") para provocar un anticuerpo antiidiotipo. Ratones inmunizados con el anticuerpo antiidiotipo se protegieron frente a la infección con una dosis letal de bacterias MenC. Estos investigadores demostraron posteriormente que un fragmento de péptido de un anticuerpo antiidiotipo de MenC provocaba anticuerpos antiMenC de suero y protegía los animales de bacteremia y muerte después de reto letal con bacterias MenC. Westerink y otros (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4021.

Sin embargo, hasta la fecha no se ha hecho un enfoque así respecto al desarrollo de una vacuna de MenB. Es fácil apreciar que la producción de una vacuna segura y eficaz contra MenB sería particularmente deseable.

Sumario de la invención

En la solicitud de patente U.S. 08/925.002. presentada el 27 de agosto de 1997, de propiedad conforme a la tramitación habitual, se describen varios anticuerpos de funcionalidad activa dirigidos contra derivados de MenB PS. Estos anticuerpos no reaccionan por cruce, o son mínimamente reactivos por cruce, con los tejidos hospedadores y tienen por ello un riesgo mínimo de provocar una enfermedad autoinmune, denominándose aquí "no reactivos". Estos anticuerpos no autorreactivos se usan en esta memoria para identificar miméticos moleculares de epitopos singulares de MenB PS que se pueden usar en composiciones de vacunas.

Consecuentemente, en una realización, la presente invención se refiere a miméticos moleculares de epitopos singulares de MenB PS. Estos miméticos moleculares comprenden los nuevos compuestos identificados usando anticuerpos funcionalmente activos dirigidos contra derivados de MenB PS que no reaccionan por cruce, o que son mínimamente reactivos por cruce, con el tejido hospedador. .

Los miméticos moleculares se representan por la siguiente estructura 1:

1

en la que

R_{1} es -NR_{5}R_{6},

R_{2} es -(CH_{2})_{p}-R_{11}, en el que p es un número entero de 0 a 8,

R_{3} es H, alquilo C_{1-6}, arilo, alquil-arilo, alquenilo C_{1-6} y alquinilo C_{1-6},

R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH. -SH. o un resto conector seleccionado entre el grupo de aminas tales como -NH(CH_{2})_{q}SH, aminoácidos, peptoides y péptidos, siendo q un número entero de 1 a 5,

R_{5} es R_{2}, H , o R_{5} y R_{6} juntos forman un anillo carbocíclico o de arilo, anillo que opcionalmente contiene hasta dos heteroátomos constituidos por N, O y S,

R_{6} es -CO-(CH_{2})_{m}-R_{7}, siendo m un número entero de 1 a 6,

R_{7} =

2

en las que

n es un número entero de 0 a 5,

R_{8} es H, alquilo C_{1-3} y acilo,

R_{9} es -NH_{2}, -NH-NH_{2}, -CONH_{2}, acilo, -COOH, -SH, -S-alquilo, -S-arilo, ácido sulfónico y sulfonamida, con la condición de que, cuando n = 0, R_{9} no sea -NH-NH_{2},

R_{10} es H, alquilo C_{1-6}, halógeno, OH, alcoxi C_{1-6}, acilo, amino, alquil C_{1-6} amino, amida, -COOH, -SH, -S-alquilo, -S-arilo, ácido sulfónico y sulfonamida, y

R_{11} es un anillo carbocíclico o un arilo, que opcionalmente está sustituido, -CH=CH-(CH_{2})_{p}-CH_{3}, -CF_{3}, -OH, alcoxi C_{1-6}, acilo, amino, -N(CH_{3})_{2}, NH-NH_{2}, amida, -COOH, -SH, -S-alquilo, -S-arilo, ácido sulfónico y sulfonamida.

\newpage

El mimético molecular de la invención está representado por las siguientes estructuras:

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3

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en la que X es O, N, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o SH, y p = 0-3,

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4

\vskip1.000000\baselineskip

en la que X es O, N, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH, y p = 0-3,

\vskip1.000000\baselineskip

5

\newpage

en la que X es O, N, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH, y p = 0-3,

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

en las que X es O, N, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH, R_{8} es U o COCH_{3}; p = 0-3, y R_{9} es -COOH, -NH_{2}, -NHNH_{2} o

8

9

y

10

en las que X es O, N, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH, R_{8} es H p COCH_{3}; p = 0-3, y R_{9} es -COOH, -NH_{2}, -NHNH_{2} o

11

También se describe una composición que comprende un mimético molecular de un epitopo singular de MenB, según se ha descrito antes, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, un procedimiento para prevenir en un mamífero una enfermedad por MenB y/o E. Coli K1, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la composición anterior y un procedimiento para detectar anticuerpos del serogrupo B de Neisseria meningitidis y/o E. Coli K1 en una muestra biológica, que comprende:

(a)

proporcionar una muestra biológica,

(b)

hacer reaccionar la mencionada muestra biológica con un mimético molecular de la invención en condiciones que permiten que anticuerpos del serogrupo B de Neisseria meningitidis y/o E. Coli K1, cuando están presentes en una muestra biológica, se unan al mimético molecular para formar un complejo de anticuerpo/mimético, y

(c)

detectar la presencia o ausencia del complejo.

por lo que se detecta la presencia o ausencia de anticuerpos del serogrupo B de Neisseria meningitidis y/o E. Coli K1 en una muestra biológica.

A la vista de la presente discusión, se ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica de cualificación normal estas y otras realizaciones de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1D representan la inhibición dependiente de la concentración de la unión de (A) SEAM 3 (10 \mug/ml), (B) SEAM 7 (10 \mug/ml), (C) SEAM 18 (10 \mug/ml), (D) SEAM 30 (10 \mug/ml) a NPr-MenB PS por la estructura 5A(1) (marca de rombo), la estructura 5B (1) (marca de cuadrado), la estructura 6A(1) (marca de triángulo) y la estructura 6B(1) (marca de círculo) en formato de ELISA.

La Figura 2 representa la unión de SEAM 3 (10 \mug/ml), SEAM 7 (10 \mug/ml), SEAM 18 (10 \mug/ml) y SEAM 30 (10 \mug/ml) a la estructura 5A (1) (barras en negro), la estructura sub(1) (barras en blanco), la estructura 6A(1) (barras sombreadas) y la estructura 6B (1) (barras con rayas) en formato de ELISA.

La Figura 3 representa la reactividad por cruce de anticuerpos de SEAM con conjugados de BSA de las estructuras 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B(1). En particular, la Figura 3 representa la unión de SEAM 3 (10 mg/ml), SEAM 7 (10 mg/ml), SEAM 18 (10 mg/ml) y SEAM 30 (10 mg/ml) a la estructura 5A (1) (barras en negro), la estructura 5B1(1) (barras en blanco), la estructura 6A(1) (barras sombreadas) y la estructura 6B (1) (barras con rayas).

Descripción detallada de la invención

En la práctica de la presente invención se emplearán, a no ser que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de inmunología, microbiología y biología molecular de la especialidad. Tales técnicas se explican totalmente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª edición, 1989); Morrison y Boyd, Organic Chemistry (3ª edición, 1973); Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry (2ª edición, 1985); Smith, M.B., Organic Synthesis (1994); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), y Handbook of Experimental Immunology, volúms. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwesll Scientific Publications).

Tal como se usa en esta memoria y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias plurales a no ser que el contenido dicte claramente lo contrario.

I. Definiciones

Al describir la presente invención se emplearán los términos siguientes, que se definen como se indica seguidamente.

Tal como se usa aquí, el término "derivado de MenB PS" se refiere a una molécula obtenida por modificación química del polisacárido capsular nativo de MenB. Entre tales derivados de MenB PS están incluidos, no exclusivamente, moléculas de MenB PS que han sido modificadas por la sustitución de los grupos N-acetilo del resto de ácido siálico de la molécula nativa con grupos acilo apropiados tales como C_{3-8} o superiores, grupos acilo en los que el término "grupo acilo" abarca cualquier molécula acilada lineal, ramificada, alifática o aromática. Un derivado de MenB PS particularmente preferido para uso en este contexto comprende la sustitución de grupos N-acetilo de MenB PS nativo por grupos N-propionilo (denominados aquí "NPr-MenB-PS"). Son conocidos en la técnica procedimientos para sintetizar derivados de MenB PS sustituidos con N-acilo, incluido el NPr-MenB PS, y se describen en, por ejemplo, la patente U.S. nº. 4.727.136, expedida a Jennings, y en la publicación de EP nº. 504.202 B, expedida también a Jennings y otros.

"Miméticos moleculares" de MenB PS o derivados de MenB PS son moléculas que funcionalmente mimetizan como mínimo un epitopo "singular" epitopo expresado en una bacteria MenB. Un "epitopo singular" es un epitopo capaz de provocar la formación de anticuerpos anti-MenB funcionalmente activos (por ejemplo bactericidas opsónicos y/o mediados por complemento) que, o bien son no reactivos por cruce con ácido polisiálico en tejido hospedador y consecuentemente carecen de actividad autoinmune, o bien son mínimamente reactivos por cruce. Tales miméticos moleculares son útiles en composiciones de vacunas y en la provocación de anticuerpos para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas, como se describe más adelante. Entre los miméticos moleculares figuran, no exclusivamente: compuestos orgánicos pequeños, ácidos nucleicos y derivados de ácidos nucleicos; sacáridos u oligosacáridos; miméticos peptídicos incluidos péptidos, proteínas y derivados de proteínas tales como péptidos que contienen restos orgánicos no peptídicos, péptidos sintéticos que pueden contener o no aminoácidos y/o enlaces peptídicos pero que retienen los rasgos estructurales y funcionales de un ligando péptido; pirrolidinas; peptoides y oligopéptidos que son moléculas que comprenden glicina N-sustituida, tales como los descritas por Simon y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367; y anticuerpos, incluidos anticuerpos antiidiotipo. Se describen más adelante, detalladamente, procedimientos para la identificación y producción de miméticos moleculares.

El término "alquilo", tal como se usa aquí, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado, de cadena ramificada o no ramificada, de 1 a 24 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo, así como grupos cicloalquilo tales como ciclopentilo, ciclohexilo. Los grupos alquilo preferidos en este contexto contienen de 1 a 12 átomos de carbono, y los grupos alquilo muy preferidos en este contexto contienen de 1 a 6 átomos de carbono. Además, estos grupos están opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos alcoxi, hidroxilo, amino, amida, halógeno, nitro, acilo, carboxilo, tiol, ácido sulfónico, sulfonamida.

El término "alquenilo", tal como se usa aquí, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado, de cadena ramificada o no ramificada, de 2 a 24 átomos de carbono, que contiene al menos un enlace doble, tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-butenilo, isobutenilo, t-butenilo, octenilo, decenilo, tetradecenilo, hexadecenilo, eicosenilo, tetracosenilo, así como grupos alquinilo cíclicos de 3 a 8, preferiblemente de 5 o 6, átomos de carbono. Los grupos alquenilo preferidos en este contexto contienen de 1 a 12 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono. Además, estos grupos están opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos alquilo, alcoxi, hidroxilo, amino, amida, halógeno, nitro, acilo, carboxilo, tiol, ácido sulfónico, sulfonamida.

El término "alquinilo", tal como se usa aquí, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado, de cadena ramificada o no ramificada, de 1 a 24 átomos de carbono, que contiene al menos un enlace triple, tal como etinilo, n-propinilo, isopropinilo, n-butinilo, isobutinilo, t-butinilo, octinilo, decinilo. Los grupos alquinilo preferidos en este contexto contienen de 1 a 12 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono. Además, estos grupos están opcionalmente sustituidos como se ha indicado antes.

El término "arilo", tal como se usa aquí, se refiere a especies aromáticas monocíclicas, bicíclicas, tricíclicas y tetracíclicas que contienen anillos de 5, 6 o 7 miembros que opcionalmente contienen uno o varios heteroátomos tales como N, O o S. Entre los ejemplos están incluidos, no limitativamente, fenilo, bencilo, naftilo, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimdina, purina, quinolina, isoquinolina, carbazol, fenantreno, antraceno, benzopireno, azuleno, indol, indano. Además, estos grupos opcionalmente están sustituidos como se ha descrito en lo que antecede.

El término "alquilarilo", tal como se usa aquí, se refiere a un anillo de arilo unido a un alquilo, siendo los términos alquilo y arilo lo definido antes.

El término "anillo carbocíclico", tal como se usa aquí, incluye cicloalquilo, cicloalquenilo y cicloalquinilo, descritos antes, que opcionalmente contienen uno o varios heteroátomos tales como N, O y S. Además, estos grupos están opcionalmente sustituidos como se ha descrito antes.

El término "alcoxi", tal como se usa aquí, se refiere a un anillo de arilo unido mediante una única unión éter terminal; esto es, un grupo "alcoxi" se puede definir como -OR, siendo R alquilo, definido antes. En una realización preferente, un grupo alcoxi contiene de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono.

El término "acilo" se usa en su sentido convencional para refererirse a un sustituyente molecular RCO-, en el que R es alquilo según lo definido antes. En una realización preferente, un grupo acilo contiene alquilo que contiene de 1 a 6, más preferiblemente, de 1 a 4, átomos de carbono.

El término "peptoide", tal como se usa aquí, abarca oligómeros de glicina N-sustituida y se usa intercambiablemente con el término glicinas N-sustituidas oligómeras'' (NSG).

El término "resto conector multivalente" representa cualquier conector adecuado que puede unirse a cualquier resto adecuado o unible, incluida una ceramida, una proteína o un péptido, incluido un péptido antígeno múltiple, y preferiblemente es un grupo que presenta un grupo reactivo que permite su unión por covalencia a otras moléculas, tales como miméticos moleculares.

El término "anticuerpo" abarca preparaciones de anticuerpos monoclonales y policlonales, así como preparaciones que incluyen anticuerpos híbridos, anticuerpos alterados, fragmentos F(ab')_{2}, molécula F(ab), fragmentos Fv, fragmentos variables de cadena simple expuestos en fago (scFv), anticuerpos de dominio individual, anticuerpos quiméricos y sus fragmentos funcionales que presentan propiedades de unión inmunológicas de la molécula madre de anticuerpo.

Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población homogénea de anticuerpos. El término no está limitado por la manera en que está hecho. El término abarca moléculas enteras inmunológicas así como moléculas Fab, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos Fv, fragmentos variables de cadena simple expuestos a fago (scFv) y otras moléculas que presentan propiedades de unión inmunológicas de la molécula de anticuerpo monoclonal madre. Son conocidos y se describen detalladamente más adelante procedimientos para hacer anticuerpos policlonales y monoclonales.

Un "antígeno" se define de forma que incluya cualquier sustancia que puede ser unida específicamente por una molécula de anticuerpo. Un "inmunógeno" es un antígeno que es capaz de iniciar la activación de linfocítos que da por resultado una respuesta inmune específica del antígeno.

Por "epitopo" se entiende un sitio o un antígeno al que responden células B y células T específicas. El término se usa también de forma intercambiable con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los sitios epitopo de células B en proteínas, polisacáridos u otros biopolímeros pueden estar compuestos por restos de diferentes partes de la macromolécula que se han juntado por plegado. Los epitopos de esta clase se denominan epitopos conformacionales o discontinuos puesto que el sitio está compuesto por segmentos del polímero que son discontinuos en la secuencia lineal pero que son continuos en la(s) conformación(es) plegada(s). Los epitopos que están compuestos por segmentos individuales de biopolímeros u otras moléculas se denominan epitopos continuos o lineales. Generalmente, los epitopos de células T están restringidos a péptidos lineales. Un epitopo peptídico puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial singular para el epitopo. Generalmente, un epitopo está constituido por como mínimo 5 aminoácidos de esta clase, más usualmente, está constituido por como mínimo 8-10 aminoácidos de esta clase. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de aminoácidos son conocidos en la técnica y entre ellos están incluidos, por ejemplo, cristalografía de rayos X y espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la identificación de epitopos en una determinada proteína se realiza fácilmente usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Geysen y otros (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:3998 (procedimiento general de sintetizar rápidamente péptidos para determinar la localización de epitopos inmunógenos en un antígeno dado); patente U.S. nº. 4.708.871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epitopos de antigenos)); y Geysen y otros, (1986) Molecular Immunology 23:709 (técnica para identificar péptidos con una alta afinidad por un anticuerpo dado). Los anticuerpos que reconocen el mismo epitopo se pueden identificar en un simple inmunoensayo que revela la capacidad de un antígeno para bloquear la unión de otro antígeno a un antígeno diana.

Un "epitopo de MenB singular" se define aquí como un epitopo presente en una bacteria MenB, siendo los anticuerpos que se dirigen hacia el epitopo capaces de unirse específicamente a MenB y no reaccionar por cruce, o reaccionar mínimamente por cruce, con restos de ácido siálico presentes en la superficie del tejido hospedador. Los inmunógenos que contienen o mimetizan uno o varios "epitopos de MenB singulares" son así útiles en vacunas para prevenir una enfermedad de MenB, y no provocarán una respuesta inmune, o presentan un riesgo mínimo de provocar una respuesta inmune.

Un anticuerpo presenta "actividad funcional" contra un organismo de MenB cuando las moléculas del anticuerpo exhiben actividad bactericida mediada por complemento y/o actividad opsónica contra MenB determinada usando los ensayos descritos en esta memoria.

Un anticuerpo específico para un epitopo de MenB "singular" "carece de actividad inmune" y/o "no es autorreactivo" cuando el anticuerpo considerado no presenta propiedades de unión inmunológica de reacción por cruce con ácido polisiálico en tejido hospedador según determinación efectuada usando los ensayos descritos en esta memoria.

Un anticuerpo específico para un epitopo de MenB "singular" presenta "autorreactividad mínima" o "es mínimamente reactivo" cuando el anticuerpo requiere una concentración del anticuerpo considerado aproximadamente 10 veces mayor para presentar unión al ácido pollisiálico en tejidos hospedadores, en comparación con un autoanticuerpo de reactividad por cruce conocido considerado como positivo en los ensayos de unión descritos en esta memoria.

Tal como se usa aquí, los términos "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a interacciones no covalentes del tipo que se presenta entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica.

Tal como se usa aquí, el término "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido extraída de un sujeto, incluidas no limitativamente, muestras de, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula espinal, bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestra de la piel, secreciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células de la sangre, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivos de células in vitro, incluidos, no limitativamente, medios condicionados resultantes del crecimiento de células y tejidos en un medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes, y componentes de células.

Tal como se usa aquí, los términos "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una molécula capaz de detectar, incluidos, no limitativamente, isótopos radiactivos, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, cromóferos, colorantes, iones de metales, soles de metales, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos). El término "fluorescente" se refiere a una sustancia o porción de ella que es capaz de presentar fluorescencia en el intervalo detectable. Entre los ejemplos particulares de marcadores que se pueden usar al amparo de la invención están incluidos fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo de Texas, luminol, NADPH y \alpha-\beta-galactosidasa.

II. Modos de realizar la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de miméticos moleculares de epitopos singulares del serogrupo B de Neisseris meningitidis (MenB), identificados usando anticuerpos funcionales dirigidos contra MenB. Los anticuerpos no son reactivos por cruce, o son mínimamente reactivos por cruce, con ácido polisiálico en un tejido hospedador y, por ello, los anticuerpos tienen un riesgo menor de provocar una actividad autoinmune que los anticuerpos que tienen una reactividad por cruce alta con tejido hospedador. Los miméticos se pueden usar como reactivos diagnósticos y/o en composiciones para prevenir una enfermedad de "MenB" y E. coli K1.

Como se ha explicado antes, el polisacárido capsular activo de MenB, denominado aquí "MenB PS", es poco inmunogénico en seres humanos y otros mamíferos. Además, el MenB PS nativo puede provocar la producción de autoanticuerpos y, por ello, puede ser inapropiado para uso en composiciones de vacunas. Así, la presente invención usa anticuerpos preparados contra derivados de MenB PS. Estos anticuerpos se seleccionaron sobre la base de su actividad para exhibir actividad funcional contra bacterias Mean, siendo la actividad funcional importante en cuanto a conferir protección contra una enfermedad de MenB. Los anticuerpos se seleccionaron también sobre la base de que presentaban una actividad autoinmune mínima o indetectable.

Más en particular, los derivados de MenB PS se prepararon para obtener moléculas de anticuerpo usadas para identificar los miméticos moleculares de la presente invención. Generalmente, los derivados comprenden sustituciones acilo C_{3-8} de grupos N-acetilo de restos de ácido siálico de la molécula nativa. Los derivados de MenB PS particularmente preferidos comprenden la sustitución de grupos N-acetilo de MenN PS nativo por grupos N-propionilo y se denominan aquí "NPr-MenB PS". Tales derivados y los procedimientos para sintetizarlos se describen por ejemplo, en la patente U.S. nº. 4.727.136 y en la publicación de EP nº. 504.202 B, ambas expedidas a Jennings y otros.

Los derivados acilo C_{3-8} se pueden preparar tratando primeramente MenB nativo (obtenido, por ejemplo, de cultivos de N. meningitidis) en presencia de una base fuerte para eliminar cuantitativamente los grupos N-acilo y proporcionar un grupo amina reactivo en las partes del resto de ácido siálico de la molécula. Los fragmentos desacilados de MenB PS se N-acilan luego. Por ejemplo, en el caso de NPr-MenB PS, la molécula desacilada se N-propionila luego usando una fuente de grupos propionilo tales como anhídrido propiónico o cloruro de propionilo, como se describe en la patente U.S. nº. 4.727.136 expedida a Jennings y otros. La cuantía de N-acilación se puede determinar usando, por ejemplo, espectroscopia de RMN. En general, las condiciones de reacción se seleccionan de manera que la cuantía de N-acilación sea como mínimo de aproximadamente 80%.

Con el fin de aumentar la inmunogenia de los derivados de MenB PS, los derivados se pueden conjugar a una molécula soporte adecuada para obtener glicoconjugados. En particular, se pueden formar preparaciones de conjugados de MenB PS N-acilados que tienen configuraciones estructurales definidas y controladas a partir de oligosacáridos de MenB N-acilados de tamaño medio como se describe más adelante.

Así, un grupo de glicoconjugados de MenB PS N-acilados, de los que un ejemplo se denomina en esta memoria "CONJ-2", se puede preparar como sigue. Una preparación de MenB PS N-acilado que sustancialmente tiene restos de ácido siálico 100% N-acilados según se determina mediante, por ejemplo análisis por RMN, se puede fragmentar en condiciones ligeramente ácidas, para obtener una población de moléculas de oligosacáridos de tamaños variables. Los productos fragmentados se fraccionan por tamaños usando, por ejemplo, técnicas cromatográficas estándar de intercambio iónico combinadas, por ejemplo, con gradientes salinos escalonados, para obtener moléculas de MenB N-aciladas de tamaños homogéneos. Las fracciones que contienen oligosacáridos de tamaño mediano, por ejemplo, de Dp de aproximadamente 5 a aproximadamente 22, preferiblemente de 10 a aproximadamente 20 y, más preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 18, se activan químicamente en los terminales no reductores y se conjugan a vehículos proteínicos mediante una técnica de aminación reductora para obtener los glicoconjugados CONJ-2. Una conjugación satisfactoria se puede determinar, por ejemplo, por filtración en gel, y la relación final de sacárido a proteína (p/p) se puede estimar por un ensayo colorimétrico.

Los glicoconjugados formados a partir de derivados de MenB PS, tales como CONJ-2, se usan luego para provocar la formación de anticuerpos antisacárido en un hospedador inmunizado. Un subconjunto de tales anticuerpos se uniría a bacterias MenB, no reaccionaría por cruce o reaccionaría mínimamente, con restos de ácido siálico de un tejido hospedador, según determinación efectuada usando los ensayos de unión descritos en esta memoria. Los anticuerpos se pueden caracterizar totalmente respecto al isotipo, la especifidad antigénica fina, la actividad funcional y la reactividad por cruce con el tejido hospedador.

Por ejemplo, los sujetos mamíferos, convenientemente animales estándar de laboratorio tales como roedores y conejos, se pueden inmunizar con composiciones que contienen los glicoconjugados junto con un coadyuvante adecuado para provocar la producción de sueros policlonales. Generalmente se inmunizan grupos de animales y se vuelven a administrar varias veces inmunizaciones de recuerdo de las composiciones. Se pueden obtener antisueros de los animales inmunizados y se pueden obtener sueros policlonales que no reaccionan por cruce con tejido hospedador usando absorción in situ o técnicas convencionales de cromatografía de afinidad. Se pueden identificar antígenos glicoconjugados satisfactorios por su capacidad para provocar una respuesta sustancial de anticuerpo del derivado de IgG anti-MenB PS, característica de un antígeno dependiente de células T. Son particularmente preferidos para uso en los procedimientos de la presente invención los conjugados que se encuentra que son altamente inmunogénicos y producen predominantemente anticuerpos de IgG.

Los derivados de MenB PS que son capaces de provocar la formación de antisueros bactericidas son adecuados para uso en la producción de cuerpos monoclonales. Más en particular, el procedimiento diseñado para producir los varios conjugados derivados de MenN PS se diseña para producir inmunógenos superiores que presentan epitopos singulares asociados a sacárido que mimetizan los encontrados en la superficie de organismos de MenB y se expresan mínimamente en el hospedador. Los derivados de MenB PS descritos en esta memoria son así capaces de provocar la producción de anticuerpos específicos para MenB que se usan para averiguar el mimetismo de antígenos polisacárido de MenB que proporcionarán epitopos singulares para vacunas anti MenB.

Así, en la práctica de la invención, se usan derivados de MenB para proporcionar anticuerpos monoclonales y sus equivalentes funcionales El término "equivalente funcional" respecto a un anticuerpo monoclonal particular, como se usa aquí, significa una molécula que (a) bloquea por cruce un anticuerpo monoclonal ejemplificado; (b) se une selectivamente al derivado de MenB PS o glicoconjugado en cuestión; (c) no reacciona por cruce, o reacciona mínimamente por cruce, con el PSA hospedador, según se determina usando los ensayos de unión descritos en esta memoria; y, opcionalmente, la actividad (por ejemplo, la actividad bactericida mediada por complemento y/o la actividad opsónica) frente a células bacterianas de MenB determinada por ensayos estándar que se describen más adelante. Además, tal como se usa en esta memoria en cuanto a un hibridoma de la invención que produce un anticuerpo nonoclonal particular, el término "progenie" incluye todos los derivados, tejidos y vástagos del hibridoma madre que producen el anticuerpo monoclonal producido por la madre, independientemente de la generación o la identidad cariotípica.

Los anticuerpos monoclonales se preparan usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica, tales como el método de Kohler y Milstein, Nature (1975) 256:495, o una modificación de él tal como la descrita por Buck y otros (1982) In Vitro 18:377. Típicamente se inmuniza un ratón o una rata con el derivado de MenB PS conjugado a un soporte de proteína, se inocula repetidamente y se extrae el bazo (y opcionalmente varios nódulos linfáticos grandes) y se disocian en células individuales. Si se desea, se pueden explorar las células del bazo (después de eliminar células no adherentes específicamente) aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo revestido con el antígeno. Las células, que expresan inmunoglobulina unida a membrana, específicas para el antígeno, se unirán a la placa y no se eliminarán por enjuagadura con el resto de la suspensión. Las células R resultantes, o todas las células de bazo disociadas, son inducidas luego a fusionarse con las células de mieloma para formar hibridomas. Entre las líneas de mieloma de murino representativas para uso en la hibridaciones están incluidas las adquiribles de la American Type Culture Collection (ATCC).

Más en particular, se pueden preparar híbridos de células somáticas por el procedimiento de Buck y otros (supra) usando la línea de células P3X63-Ag8.653 de mieloma de murino no secretora, resistentes a azaguanina (obtenible de ATCC). Generalmente, las líneas de células de hibridoma se clonan por dilución limitante y se ensayan en cuanto a la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante y que no se unen a antígenos no afines. Los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales seleccionados se cultivan luego in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejidos o reactores de fibra hueca), o in vivo (por ejemplo, como ascites en ratones).

El material sobrenadante de hibridoma se puede ensayar en cuanto a anticuerpo reactivo a derivado anti-MenB PS usando, por ejemplo, ELISA en fase sólida o un ensayo indirecto de inmunofluorescencia con un derivado de MenB PS inmunizante o con MenB PS nativo (Nac-MenB PS). La selectividad de anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas se puede estimar usando ensayos competitivos de unión específica tales como ELISA de inhibición o similares. Por ejemplo, moléculas de anticuerpo, diluidas en tampón, o tampón que contiene derivados solubles de MenB PS o Nac-MenB PS, se hacen reaccionar en un recipiente de ELISA en presencia de derivados de MenB PS unidos. Después de lavar, se detecta el anticuerpo unido por anti-Ig marcado (anti-IgM, IgG e IgA) como anticuerpo secundario. Los anticuerpos que son inhibidos por los derivados de MenB PS solubles se pueden considerar específicos y se seleccionan así para posterior estudio, incluyendo la determinación de isotipos y la exploración adicional en cuanto a reactividad por cruce, actividad funcional y autorreactividad.

Específicamente, moléculas de anticuerpo monoclonal parcialmente purificadas se pueden evaluar individualmente en cuanto a su capacidad de unirse a células hospedadoras que expresan restos de ácido polisiálico en su superficie celular. Tales células representan dianas sucedáneas para la detección de anticuerpos que presentan actividad inmune. Una diana comprende la línea de células de neuroblastoma humano, CHP-134, que expresa ácido \alpha2-8 polisiálico de cadena larga (NCAM) en su superficie celular, según describen Livingston y otros (1988) J. Biol. Chem. 263:9443. También Granoff, D.M. y otros (1988). J. of Immunology 160:5028-5036 describen anticuerpos monoclonales bactericidas que definen epitopos de MenB PS singulares que no reaccionan por cruce con ácido polisiálico humano. Entre otras dianas adecuadas están incluidas, no limitativamente, células de cerebro de neonato, tejidos derivados de, por ejemplo, riñón, corazón y nervio olfativo, células endoteliales de vena safena cultivadas, linfocitos T citotóxicos y células letales naturales (NK). Véase, por ejemplo, Brandon y otros (1993) Intl. J. Immunopathology and Phamacology 6:77. A poblaciones en cultivo de células de ensayo adecuadas se pueden añadir moléculas de anticuerpo monoclonal obtenidas de los hibridomas, y se puede detectar y cuantificar directamente la unión potencial de los monoclonales a las dianas celulares usando monoclonales marcados, o indirectamente usando un reactivo secundario apropiadamente marcado que reacciona específicamente con cada anticuerpo monoclonal (por ejemplo, proteína A y G de estafilococos y moléculas de anticuerpo antimurino). A los fines de la presente invención no se consideran autorreactivos los anticuerpos que no reaccionan por cruce con PSA de tejido hospedador de ensayo o que presentan una mínima reactividad. Así, estos anticuerpos son apropiados para ulterior uso. Además, algunos anticuerpos que presentan unión con el tejido de ensayo, unión que no es afectada por pretratamiento de las células de ensayo con neuraminidasa, pueden ser también apropiados para posterior uso. La autorreactividad de tales anticuerpos se denomina en esta memoria "indeterminada".

La actividad funcional se puede determinar por estimación de la actividad bactericida mediada por complemento y/o la actividad opsónica. En particular, la actividad bactericida mediada por complemento de los anticuerpos se puede evaluar usando ensayos estándar tales como los descritos por Gold y otros (1970) Infect. Immun. 1:479, Westerink y otros (1988) Infect. Im. 56:1120, Mandrell y otros (1995) J. Infect. Dis. 172:1279 y Granoff y otros (1995) Clin. Diagn. Laboratory Immunol. 2:574. En estos ensayos se hace reaccionar N. meningitidis con una fuente de complemento así como con el anticuerpo a ensayar. Se hacen recuentos de bacterias al cabo de varios tiempos de muestreo. Para los fines de la presente invención, se considera que tienen actividad bactericida los anticuerpos que demuestran actividad bacteriana mediada por complemento, demostrada por una reducción de como mínimo 50% en los recuentos de células bacterianas viables determinada después de 60 minutos de incubación con anticuerpo y complemento, en comparación con recuentos de colonias al tiempo cero, y que son adecuadas para posterior uso.

Se cree que la bacteriolisis mediada por complemento es un mecanismo importante responsable de la protección del hospedador frente a una enfermedad invasiva por meningococos. Sin embargo, la evidencia soporta también un importante papel protector para la opsonización (véase, por ejemplo, Bjerknes y otros (1995) Infect. Immun. 63:160). Consecuentemente, la actividad opsónica de los anticuerpos producidos aquí se puede evaluar como una segunda medida, o como una medida alternativa, para estimar la actividad funcional. Los resultados de un ensayo opsónico se pueden usar para suplementar datos bactericidas y para ayudar en la selección de anticuerpos capaces de conferir protección. La evaluación de la actividad opsónica es también particularmente útil para la evaluación de los anticuerpos monoclonales de murino de la invención que tienen un isotopo de IgG1. La IgG1 de murino (a diferencia con la IgG1 humana) es ineficaz en la activación del complemento. De esta manera, los anticuerpos IgG1 de murino no activan la bacteriolisis de MenB mediada por complemento en los ensayos descritos antes. Sin embargo, la actividad funcional de anti-
cuerpos monoclonales IgG1 anti-MPr-MenB PS puede ser estimada por opsonización en ausencia de complemento.

En la técnica son conocidos una variedad de procedimientos opsónicos de ensayo y se pueden usar para evaluar la actividad funcional de los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Entre tales ensayos están incluidos los descritos por Sjursen y otros (1987) Acta Path. Microbio/Immunol. Scand., Sec. C 95:283, Halstensen y otros (1989) Scand. Infect. Dis. 21:207, Lehmann y otros (1991) APMIS 99:769, Halstensen y otros (1991) NIPH Annals 14:157; Fredlung y otros (1992) APMIS 100:449, Guttormsen y otros (1992) Infect. Immun. 60:2777, Guttormsen y otros (1993) J. Infec. Dis. 167:1314, Bjerknes 1995) Infect. Immun. 63:160, Hayrinen y otros (1995) J. Ifect. Dis. 171:1481, de Velasco y otros (1995) J. Infect. Dis. 172:262, y Verheul, A.F.M. (1991) Meningococcal LPS Derived Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccines, Immunochemical and Immunological Aspects, Tesis, Universidad de Utrecht, Países Bajos, págs. 112-135.

Los anticuerpos monoclonales seleccionados se pueden expandir in vitro usando procedimientos rutinarios de cultivo de tejidos, o in vivo usando sujetos mamíferos. Por ejemplo, ratones a los que se administró pristane se pueden inocular con células de hibridoma en fase log en PBS para la producción de ascites. El fluido de ascites se puede almacenar a -70ºC antes de posterior purificación.

Se pueden producir usando técnicas conocidas fragmentos de moléculas de anticuerpo, por ejemplo, moléculas de F(ab')_{2}, Fv, sFv, y scFv, que son capaces de exhibir propiedades inmunológicas de unión a la molécula de anticuerpo monoclonal madre. Inbar y otros (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659; Hochman y otros (1979) Biochem. 15:2706; Ehrlich y otros (1980) Biochem. 19:4091; Huston y otros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(16):5879; y patentes U.S. nº. 5.091.513 y nº. 5.132.405 expedidas a Huston y otros; y nº. 4.946.778, expedida a Ladner y otros.

Como alternativa, se puede usar un sistema de exposición de fago para expandir las poblaciones de moléculas del anticuerpo monoclonal in vitro. Saiki y otros (1986) Nature 324:163; Scharf y otros (1986) Science 233:1076; patentes U.S. nº. 4.683.195 y nº. 4.683.202; Yang y otros (1995) J. Mol. Biol. 254:392; Barbas, III y otros (1995) Methods: Comp. Meth. Enzymol. 6:94; Barbas, III y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978.

Una vez generada, la biblioteca de exposición de fagos se puede usar para mejorar la afinidad de unión inmunológica de las moléculas de Fab usando técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Figini y otros (1994) J. Mol. Biol. 239:68.

Las secuencias de codificación para las porciones pesada y ligera de la cadena de las moléculas de Fab seleccionadas de la biblioteca de exposición de fagos se pueden aislar o sintetizar y clonar en cualquier vector o replicón adecuado para expresión. Se puede usar cualquier sistema de expresión adecuado, incluidos, por ejemplo, sistemas de bacterias, levaduras, insectos anfibios y mamíferos. Entre los sistemas de expresión en bacterias están incluidos los descritos por Chang y otros (1978) Nature 275:615; Goeddel y otros (1979) Nature 281:544; Goeddel y otros (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057; solicitud de patente europea nº. EP.36.776, patente U.S. nº. 4.551.433, de Boer y otros (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 y Siebenlist y otros (1980) Cell 20:269.

Entre los sistemas de expresión en levaduras están los descritos por Hinnen y otros (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, Ito y otros (1983) J. Bacteriol 153:163, Kurtz y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142, Kunze y otros (1985) J. Basic Microbiol. 25:141, Gleeson y otros (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y otros (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302, Das y otros (1984) J. Bacteriol. 158:1165, De Louvencourt y otros (1983) J. Bacteriol. 154:737, Van den Berg y otros (1990) Bio/Technology 8:135, Kunze y otros (1985) J. Basic Microbiol. 25:141, Cregg y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376, patentes U.S.º. 4.837.148 y nº. 4.929.555, Beach y otros (1981) Nature 300:706, Davidow y otros (1985) Curr. Genet. 10:380, Gaillardin y otros (1985) Curr. Genet. 10:49, Ballance y otros (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, Tilbum y otros (1983) Gene 26:205-221, Yelton y otros (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, Kelly y otros (1985) EMBO J. 4:475479; solicitud de patente europea nº. EP 244.234 y Publicación Internacional nº. WO 91/00357.

La expresión de genes heterólogos en insectos se puede realizar como se describe en la patente U.S. nº. 4.745.051, las solicitudes europeas nº. EP 127.839 y nº. EP 155.476, Vlak y otros (1988) J. Gen. Virol. 69:765-776, Miller y otros (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177, Carbonell y otros (1988) Gene 73:409, Maeda y otros (1985) Nature 315:592-594, Lebacq-Verheyden y otros (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3129, Smith y otros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8404, Miyajima y otros, (1987) Gene 58:273 y Martin y otros (1988) DNA 7:99. Luckow y otros (1988) Bio/Technology 6:47-55, Miller y otros (1986), Genetic Engineering, eds. Setlow, J.K. y otros, vol. 8, Plenum Publishing, págs. 277-279, y Maeda y otros (1985) Nature, 315:592-594.

La expresión en mamíferos se puede realizar como describen Dijkema y otros (1985) EMBO J. 4:761, Gorman y otros (1982) Proc- Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, Boshart y otros (1985) Cell 41:521 y patente U.S. nº.4.309.216. Se pueden facilitar otros rasgos de la expresión en mamíferos según lo descrito por Ham y otros (1979) Meth. Enz. 58:44, Barnes y otros, (1980) Anal. Biochem. 102 255, en las patentes U.S. nº. 4.767.704, nº. 4.657.866, nº. 4.927.762 y 4.560.655 y la patente U.S. reexpedida nº. RE 30.985, y en las publicaciones internacionales WO 90/103430 y WO 87/00195.

Los anticuerpos anti-MenB de la presente invención, descritos antes, se usan convenientemente como receptores para explorar diversas bibliotecas moleculares con el fin de identificar miméticos moleculares de epitopos singulares de MenB. Los procedimientos para identificar miméticos en bibliotecas moleculares generalmente implican el uso de uno o varios de los procedimientos siguientes: (1) purificación por afinidad con un receptor diana inmovilizado; (2) unión de un receptor soluble a ligandos amarrados, y (3) ensayo directo de compuestos solubles en ensayos de competición de antígenos o para actividad biológica. Entre las moléculas exploradas como posibles miméticos moleculares están incluidos, no limitativamente, compuestos orgánicos pequeños, bibliotecas combinatorias de compuestos orgánicos, ácidos nucleicos, derivados de ácidos nucleicos, sacáridos y oligosacáridos, peptoides, péptidos solubles, péptidos fijados a una fase sólida, péptidos expuestos en proteínas de superficie de fagos bacterianos, proteínas de superficie o anticuerpos bacterianos y/o péptidos que contiene restos orgánicos no peptídicos.

Por ejemplo, se pueden hacer bibliotecas de diversas especies moleculares usando síntesis orgánica combinatoria. Véase, por ejemplo Gordon y otros (1994) J. Med. Chem. 32:1335. Entre los ejemplos figuran, no limitativamente, pirrolidinas, oligocarbamatos (Cho y otros (1993) Science 261:1303), peptoides tales como polímeros de glicina N-sustituida (Simon y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367) y polipéptidos vinílogos (Hagihara y otros (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:6568).

Para rastrear los bloques de construcción a medida que se añaden se pueden usar una variedad de enfoques, conocidos en la técnica, de manera que se puede determinar la historia de los miembros individuales de la biblioteca. Entre estos enfoques está incluida la colocación dirigible sobre un chip fotolitográfico (oligocarbamatos), una estrategia de deseenredo en la que se identifican "hitos" mediante adiciones recurrentes de monómeros a bibliotecas parcialmente sintetizadas (peptoides, pirrolidinas, péptidos) y bibliotecas combinatorias de codificación por la síntesis separada de nucleótidos (Nielsen y otros (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:9812) u otros restos orgánicos (Ohlmeyer y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10992) ("etiquetas"). Las etiquetas codificadas asociadas con cada miembro de la biblioteca se pueden descodificar luego después de haber seleccionado un mimético. Por ejemplo, se pueden descodificar etiquetas de ácido nucleico por secuenciación del ADN.

Las bibliotecas combinatorias de peptoides son particularmente útiles para identificar miméticos moleculares de epitopos singulares de MenB. Los peptoides son oligómeros de glicina N-sustituida (Simon y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367) y se pueden usar para generar bibliotecas químicamente diversas de moléculas nuevas. Los monómeros pueden incorporar una cadena lateral basada en t-butilo y una protección de a-amina con 9-fluoroenil-metoxi-carbonilo. La incorporación de monómeros en los oligómeros peptoides se puede realizar, por ejemplo, sobre una fase sólida usando el "procedimiento de submonómeros" de Zuckermann y otros (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:10646. En este procedimiento, las síntesis se realizan con resina de poliestirenoamida de Rink (Rink y otros (1987) Tetrahedron Lett. 28:3787). Las aminas unidas a resina se bromoacetilan por activación in situ de ácido bromoacético con diisopropilcarbodiimida. Seguidamente se desplazan las bromoacetamidas unidas a resina por adición de una amina. Las aminas pueden incorporar protección de grupos reactivos adicionales basada en t-butilo. Se repite el ciclo de dos etapas hasta que se añade el número de monómeros deseado. Luego se libera el polipéptido de la resina por tratamiento con 95% de ácido trifluoroacético/5% de agua. Preferiblemente, las síntesis se realizan usando un sintetizador robótico. Véase, por ejemplo, Zuckermann y otros (1002) Pept. Protein. Res. 40:498, y Zuckermann y otros (1996) Methods in Enzymology 267:437. En la alternativa, la oligomerización de los monómeros peptoides se puede realizar por activación in situ por hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio o hexa-fluorofosfato de bromotris(pirrolidino)fosfonio. En este procedimiento alternativo, las otras etapas son idénticas a la síntesis convencional de péptidos usando ácidos \alpha-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino (véase, por ejemplo, Simon y otros (1992), supra).

Una vez que se han hecho las librerías de peptoides, se pueden explorar, por ejemplo, añadiendo los anticuerpos monoclonales de la presente invención, junto con varios agregados de peptoides combinatorios, a los pocillos de placas de microtitulación revestidos con derivados de MenB PS o bacterias de MenB, bien solos o bien como glicoconjugados. Después de un período de incubación y un lavado para eliminar anticuerpos no unidos, se determina la presencia de anticuerpo unido por ensayos ELISA estándar. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 553. Los pocillos que no contienen anticuerpo unido indican la presencia de miméticos de peptoides que se unen al anticuerpo. Las identidades particulares de los miméticos de peptoides de los agregados se determinan añadiendo recurrentemente unidades de monómero a miembros parcialmente sintetizados de las bibliotecas. Zuckermann y otros (1994) J. Med. Chem. 37:2678. Otros procedimientos para identificar compuestos activos en agregados de moléculas pequeñas incluyen el fraccionamiento del agregado por HPLC en fase inversa o espectroscopía de masas/selección de afinidad (Nedved M.L. y otros (1996) Anal. Chem. 68:4228).

Una vez que se han identificado miméticos moleculares putativos, se ensayan en cuanto a su capacidad para provocar anticuerpos funcionalmente activos (por ejemplo, bactericida y/u opsónica) que carecen de aurorreactividad, o tienen una minima reactividad, como se ha descrito antes. Los miméticos que tienen estas propiedades son apropiados para posterior uso, por ejemplo, en composiciones de vacunas.

Los miméticos moleculares identificados usando los anticuerpos anti MenB funcionalmente activos de la invención se pueden usar para generar reactantes anticuerpo para uso en ensayos diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos reactivos con los miméticos moleculares se pueden usar para detectar antígeno bactericida en muestras biológicas usando técnicas inmunodiagnósticas tales como ensayos de competición, reacción directa o de tipo emparedado. Tales ensayos incluyen transferencia Western, ensayos de aglutinación; inmunoensayos marcados y mediados por enzima, tales como ELISA; ensayos del tipo de biotina/avidina; radioinmuneensayos; inmunoelectroforesis, inmunoprecipitación. Generalmente, las reacciones incluyen el revelado de marcas tales como marcas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, enzimáticas o moléculas colorantes u otros procedimientos para detectar la formación de un complejo entre el mimético y el anticuerpo o anticuerpos que han reaccionado con el mimético.

Generalmente, los ensayos mencionados implican separación de anticuerpo no reaccionado en una fase líquida de un soporte en fase sólida al que están unidos los complejos de mimético-anticuerpo. Los soportes sólidos que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillo de microtitulación); poli(cloruro de vinilo) (por ejemplo, hojas o pocillos de microtitulación), látex de poliestireno (por ejemplo, perlas o placas de microtitulación); poli(fluoruro de vinilideno), papel diazotizado, membranas de nailon; perlas activadas, perlas magnéticamente sensibles.

Típicamente, primeramente se hace reaccionar un soporte sólido con un componente en fase sólida (por ejemplo, un mimético molecular de MenB o varios) en condiciones de unión adecuadas tales que el componente esté suficientemente inmovilizado al soporte. Algunas veces, se puede intensificar la inmovilización del mimético al soporte acoplando primeramente el mimético a una proteína con mejores propiedades de unión. Entre las proteínas de acoplamiento adecuadas están incluidas, no limitativamente, macromoléculas tales como albúminas de suero, incluida albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Entre otras moléculas que se pueden usar para unir los miméticos al soporte están incluidos polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos. Tales moléculas y procedimientos de acoplamiento de estas moléculas a los antígenos son bien conocidos por los expertos en la técnica de cualificación normal. Véase, por ejemplo, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida y otros, J. Appl. Biochem. (1984) 6:36-63; y Anjaneyulu y Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124.

Después de hacer reaccionar el soporte sólido con el componente en fase sólida, se eliminan del soporte, por lavado, cualesquier componentes en fase sólida no inmovilizados y luego el componente unido al soporte se pone en contacto con una muestra biológica que se sospecha que contiene restos de ligando (por ejemplo, anticuerpos de MenB y/o E. coli K1) en condiciones de unión adecuadas. Después de lavar para eliminar cualquier ligando no unido, se añade un resto aglutinante secundario en condiciones de unión adecuadas, siendo capaz el aglutinante secundario de asociarse selectivamente con el ligando unido. Luego se puede detectar la presencia del aglutinante secundario usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Más en particular, se puede usar un procedimiento ELISA en el que pocillos de una placa de microtitulación se revisten con un mimético de acuerdo con la presente invención. Luego se añade a los pocillos revestidos una muestra biológica que contiene. o se sospecha que contiene, moléculas de inmunoglobulina anti MenB o E. coli K1. Después de un período de incubación suficiente para que el anticuerpo se pueda unir al mimético inmovilizado, se puede(n) lavar la(s) placa(s) para eliminar restos no unidos y se añade una molécula de unión secundaria marcada. Se deja que la molécula de unión secundaria reaccione con cualesquier anticuerpos capturados de la muestra, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

De esta manera, en una realización, se puede detectar fácilmente la presencia de ligandos de antígenos de MenB/E. coli K1 unidos de una muestra biológica usando un aglutinante secundario que comprende un anticuerpo dirigido contra los ligandos del anticuerpo. En la técnica son conocidas varias moléculas de inmunoglobulina antibovina (Ig) que se pueden conjugar fácilmente a un marcador enzimático detectable, tal como peroxidasa de rábano amargo, fosfatasa alcalina o ureasa, usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Luego se usa un sustrato de enzima apropiado para generar una señal detectable. En otras realizaciones afines, se pueden practicar técnicas ELISA de tipo competitivo usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Los ensayos se pueden realizar también en solución, de manera que los miméticos y los anticuerpos específicos para esos miméticos forman complejos en condiciones de precipitación. En una realización particular, los miméticos se pueden anexionar a una partícula en fase sólida (por ejemplo, una perla de agarosa o similar) usando procedimientos de acoplamiento conocidos en la técnica, como puede ser por acoplamiento químico directo o indirecto. La partícula revestida con mimético se pone luego en contacto en condiciones de unión adecuadas con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos de MenB y/o E. coli K1. La reticulación entre anticuerpos unidos causa la formación de agregados del complejo de partícula-mimético-anticuerpo que se pueden precipitar y separar de la muestra usando lavado y/o centrifugación. La mezcla de reacción se puede analizar para determinar la presencia o ausencia de complejos de anticuerpo-mimético usando cualquiera de varios procedimientos estándar, tales como los procedimientos inmunodiagnósticos, descritos antes.

En otra realización más, se puede proporcionar una matriz de inmunoafinidad, en el que una población de anticuerpos de una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos de MenB y/o E. coli K1 se inmoviliza a un sustrato. A este respecto, se puede llevar a cabo una purificación inicial por afinidad usando antígenos inmovilizados. La preparación de muestra resultante contendrá así sólo restos anti-MenB y/o E. coli, evitando potenciales propiedades de unión no específicas en el soporte de afinidad. En la técnica son conocidos varios procedimientos para inmovilizar inmunoglobulinas (intactas o en fragmentos específicos) con un rendimiento alto y una buena retención de la actividad de unión del antígeno. No estando limitadas por cualquier procedimiento particular, se pueden usar la proteína A o la proteína G inmovilizada para inmovilizar inmunoglobulinas.

Consecuentemente, una vez que se han inmovilizado las moléculas de inmunoglobulina para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, se ponen en contacto moléculas marcadas con los anticuerpos unidos en condiciones de unión adecuadas. Después de haber lavado cualquier mimético unido no específicamente del soporte de inmunoafinidad, se puede determinar la presencia de antígeno unido ensayando el marcador usando procedimientos conocidos en la técnica.

Un procedimiento particularmente preferido para diagnosticar una infección por MenB y/o E. coli K1 usando la presente invención implica el uso de técnicas de ensayo de inmunotransferencia de tiras (SIA), tales como las conocidas en la técnica que combinan las técnicas habituales de transferencia Western y de transferencia de manchas, por ejemplo, el ensayo RIBA® (Chiron Corp., Emeryville, CA). En estos ensayos, se inmovilizan uno o varios miméticos de acuerdo con la presente invención como bandas discretas individuales sobre una tira soporte de ensayo. La visualización de reactividad anti MenB y/o E. coli en la muestra biológica se realiza usando conjugados de enzima de IgG antihumana junto con un sustrato de enzima colorimétrico. También pueden estar presentes en la tira controles internos tales como IgM antihumano e IgG humano. El ensayo se puede realizar manualmente o en formato
automatizado.

Los reactantes de ensayo descritos, incluidos los miméticos de la invención o anticuerpos de ellos, se pueden proporcionar en kits con unas instrucciones adecuadas y otros reactantes adecuados con el fin de realizar el inmunoensayo según se ha descrito antes. El kit puede contener también, dependiendo del inmunoensayo particular usado, marcadores adecuados y otros reactantes y materiales adecuados (esto es, tampones de lavado). Usando estos kits se puede realizar inmunoensayos estándar tales como los descritos antes.

Además, se pueden usar en este contexto composiciones de miméticos moleculares, epitopos de MenB singulares (por ejemplo, no autoinmunes) identificados usando los miméticos moleculares para diagnosticar o prevenir una enfermedad por MenB en sujetos mamíferos. Particularmente se pueden usar composiciones de vacunas de los miméticos moleculares para la prevención de una enfermedad de MenB en sujetos vacunados.

Las composiciones de vacunas pueden comprender uno o varios de los miméticos moleculares o epitopos no autoinmunes de M=B. Las vacunas también se pueden administrar junto con otros antígenos y un agente inmunorregulador, por ejemplo, inmunoglobulinas, citocinas, linfocinas y quimiocinas, incluidas, no limitativamente, IL-2, IL-2 modificada (Cys 125\rightarrowser125), GM-CSF, IL-12, interferón \gamma, IP-10, MIP1\beta y RANTES.

Generalmente, las vacunas incluyen uno o varios "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables", tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, en tales vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsivos y sustancias estabilizadoras del pH.

También se pueden usar coadyuvantes para intensificar la eficacia de las vacunas. Los coadyuvantes se pueden añadir directamente a las composiciones de vacunas o se pueden administrar separadamente, bien concurrentemente o bien poco después de la administración de la vacuna. Entre tales coadyuvantes están incluidos, no limitativamente: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsiones de aceite en agua (con o sin agentes inmunoestimuladores tales como péptidos de muramilo (véase más adelante) o componentes bacterianos de la pared celular) tales como, por ejemplo, (a) MF50 (Publicación Internacional nº. WO 90/14837) que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span 85 (opcionalmente conteniendo diferentes cantidades de MTP-PE (véase más adelante), aunque no se requiere) formuladas en partículas submicrónicas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% del polímero plurónico L121 y thr-MDP (véase más adelante) microfluidizadas en emulsión submicrónica o centrifugadas remolinando para generar una emulsión de un tamaño de partícula grande, y (c) sistema de coadyuvante Ribi^{MC} (RAS) (Ribi Immunochem. Hamilton, MT) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80, y uno o varios componentes bacterianos de la pared celular del grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL+CWS (Detox^{MC}); (3) se pueden usar coadyuvantes de saponina tales como Stimulon^{MC} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de ellos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (4) coadyuvante completo de Freund (FCA) y coadyuvante incompleto de Freund (FICA); (5) citocinas tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF); (6) mutantes detoxificados de una toxina ribosilante-ADP bacteriana tal como la toxina del cólera (CT), una toxina de pertussis (PT) o una toxina de E. coli lábil al calor (LT) en particular LT-K63 (en la que el aminoácido de tipo salvaje de la posición 63 está sustituido por lisina), LT-R72 (en la que el aminoácido de tipo salvaje de la posición 72 está sustituido por arginina), CT-S109 (en la que el aminoácido de tipo salvaje de la posición 109 está sustituido por serina) y PT-K9/G129 (en la que el aminoácido de tipo salvaje de la posición 9 está sustituido por lisina y el de la posición 129 está sustituido por glicina) (véase, por Ejemplo, Publicación Internacional n^{os}. WO 93/13202 y WO 92/19265; y (7) otras sustancias que actúan como agentes estimuladores para intensificar la eficacia de la composición.

Entre los péptidos de muramilo están incluidos, no limitativamente, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isogluatme (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'.2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (MTP-PE), etc.

Con el fin de intensificar la eficacia de composiciones formadas de un mimético molecular, puede ser necesario conjugar el mimético a una molécula soporte. Tales moléculas soporte no inducen en sí la producción de anticuerpos perjudiciales. Típicamente, los soportes adecuados son macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (tales como gotitas o liposomas), partículas de virus inactivos, CRM_{197} (una toxina de difteria mutante no tóxica). Tales soportes son conocidos por los expertos en la técnica. Los conjugados miméticos se seleccionan por su capacidad para expresar epitopos que se asemejan estrechamente a los encontrados en la superficie de células bacterianas de MenB. Los conjugados adecuados provocan así la formación de anticuerpos que tienen actividad funcional contra bacterias y no reaccionan por cruce, o son mínimamente reactivas por cruce, con ácido polisiálico en tejido hospedador, según se determina usando los ensayos de unión descritos en esta memoria.

Típicamente, las composiciones de vacunas se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar en formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. El preparado también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas, o ser absorbido en partículas para un efecto intensificado del coadyuvante, como se ha discutido antes.

Las vacunas comprenderán una cantidad eficaz del mimético molecular y de cualesquier otros componentes antes mencionados, según sea necesario. Por una "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de una molécula que inducirá una respuesta inmunológica en un individuo al que se administra y que presenta un riesgo mínimo de estimular una respuesta autoinmune en el individuo. Generalmente, tal respuesta dará por resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta a la vacuna secretora, celular y/o inmune mediada por anticuerpo. Usualmente, tal respuesta incluye, no limitativamente, uno o varios de los efectos siguientes: la producción de anticuerpos de cualesquiera de las clases inmunológicas, tales como inmunoglobulinas A, D, E, G o M; la proliferación de linfocitos B y T; la provisión de señales de activación, crecimiento y diferenciación en células inmunológicas; expansión de célula cooperadoras T; células supresoras T y/o células citotóxicas T y/o poblaciones de células gdT.

Una vez formuladas, las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, por inyección, subcutánea o intramuscular. Entre las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración están incluidas formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una dosis única o un programa de dosis múltiples.

III: Experimental

Seguidamente se presentan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se presentan sólo a fines ilustrativos y no limitan en forma alguna el alcance de la presente invención.

Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, obviamente, será permisible algún error y alguna desviación experimentales.

Ejemplo 1 Preparación de glicoconjugados "a tamaño"

Se preparó a modo de ejemplo una vacuna de conjugado toxoide de oligosacárido-tétano de NPr-MenB, que se denominará CONJ-2. Se eliminaron los grupos N-acetilo del polisacárido B de Men B calentando el polisacárido a 110ºC en NaOH 2 M durante 6 horas en presencia de NaBH_{4}. El polisacárido desacetilado se dializó exhaustivamente en tampón de bicarbonato sódico saturado y luego se agitó con exceso de anhídrido propiónico durante 12 horas a temperatura ambiente. La solución se dializó exhaustivamente en agua y se recuperó por liofilización el polisacárido de meningococo B N-propionilado (NPr-MenB PS).

Para la preparación de la vacuna de conjugado, el polisacárido de NPr-MenB se hidrolizó parcialmente en acetato sódico 10 mM a pH 5,5 a 50ºC durante 2 horas. La mezcla de oligosacáridos resultante se fraccionó en Q-sefarosa. Se eluyeron primeramente con NaCl 100 mM los oligosacáridos que tenían un grado de polimerización medio (Dp) de 2-6 y se descartaron. Se eluyeron con NaCl 500 mM los oligosacáridos de tamaño intermedio. Seguidamente se determinó por cromatografía analítica de intercambio iónico usando una columna MonoQ que el tamaño de los oligosacáridos de tamaño intermedio era de Dp 13 a 20 (media, Dp = 13).

Se generó un grupo aldehído terminal en el extremo no reductor de los oligosacáridos de tamaño intermedio haciéndolos reaccionar con peryodato sódico 100 mM durante 15-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se usó exceso de etilenglicol para apagar la reacción oxidante y el producto se desaló en una columna Sephadex G-25. El conjugado de oligosacárido-proteína se preparó agitando una mezcla del aldehído terminal que contenía oligosacárido de NPr MenB con toxoide de tetano (relación molar 200:1, respectivamente) en tampón de fosfato potásico 0,75 M, pH 9,0, con 40 mg/ml de cianoborohidruro sódico durante un día a 40ºC y dos días a temperatura ambiente. Finalmente, el conjugado de oligosacárido de NPr-MenB-toxoide de tétano (CONJ-2) se purificó por cromatografía de penetración en gel sobre Sephadex G-100 usando como tampón eluyente fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, y cloruro sódico 150 mM. Las composiciones de proteína y ácido siálico de la vacuna de conjugado se midieron por los ensayos de Svennerholm de reacción con resorcinol (Svennerholm, L. (1957) Biochim. Biophys. Acta 24:604) y Lowry, respectivamente. Sobre base ponderal, la relación final de sacárido a proteína de los conjugados CONJ-2 era de 0,10 a 0,25,

Ejemplo 2 Caracterización de los glicoconjugados

El glicoconjugado CONJ-2 se caracterizó como sigue. Para demostrar covalencia (por ejemplo, estableciendo un enlace covalente entre NPr-MenB OS y el soporte proteínico) se pueden usar varias técnicas fisoquímicas, incluidas SDS-PAGE; transferencia Western; filtración en gel en Sephadex G-100, o similares. A los fines de la presente invención se usó SDS-PAGE para establecer unión covalente de los glicoconjugados de NPR-MenB OS/TT CONJ-2 por revelación de un desplazamiento a un peso molecular más alto para la banda del conjugado en comparación con la banda de la proteína en sí. El análisis por transferencia Western de los glicoconjugados CONJ-2 demostró covalencia por la coincidencia de señales inmunorreactivas positivas para TT y NPr-MenB PS con antisueros específicos anti-TT y anti-NPr-MenB PS.

Sobre la base de factores estéricos, el uso de oligosacáridos en vez de polisacáridos de alto peso molecular en la preparación de los glicoconjugados CONJ-2 permite una mayor eficiencia de acoplamiento de los antígenos de sacárido a la molécula del soporte de proteína. La relación final de sacárido a proteína de estos conjugados de NPr-MenB basados en oligosacárido varía de aproximadamente 0,10 a 0,25, que corresponde a aproximadamente de 3 a 5 cadenas de oligosacárido de NPr-MenB unidas covalentemente por cada soporte de proteína. Sobre base ponderal, los glicoconjugados CONJ-2 parece que tienen una carga mayor de oligosacárido que un conjugado de NPr-MenB basado en polisacárido considerado en la bibliografía (patente U.S. nº. 4.727.136), polisacárido que contiene de media aproximadamente de 7,5 a 18,8 veces más sacárido (usando como peso molecular de NPr-MenB 10.000 daltons).

Además, es de esperar que, construyendo los glicoconjugados CONJ-2 para que tengan restos de sacárido sustancialmente de tamaño uniforme de una longitud de cadena intermedia bien definida (por ejemplo, Dp de 10-20), resulten glicoconjugados que presenten un comportamiento inmunológico más consistente. Además, la activación terminal selectiva (por ejemplo, introducción selectiva del grupo aldehído en el término no reductor) de los oligosacáridos de NPr-MenB purificados por cromatografía en Q-Sepharose evita la posibilidad de estructuras heterogéneas reticuladas por cruce que podrían derivar del uso de moléculas de NPr-MenB PS con grupos aldehído "activos" introducidos en ambos términos. A este respecto, es probable que pudiera derivarse PS biterminalmente activado (que tiene grupos activados en ambos términos) de una oxidación con peryodato de MenB Ps N-acilado previamente expuesto a NaBH_{4} durante el proceso de N-desacetilación.

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales

Se vacunaron por inyección ratones hembra CD1 de 4 a 6 semanas con una composición que contenía un antígeno glicoconjugado de NPr-MenB OS/TT (CONJ-2) y (excepto para la última inyección de recuerdo) FCA. Las vacunaciones se hicieron a intervalos de un mes con un total de 2 a 3 dosificaciones (incluida la inmunización de recuerdo). Tres días antes de la fusión, los animales primados recibieron una inyección de recuerdo de antígeno del glicoconjugado NPr-Men OS/TT (CONJ-2) en ausencia de coadyuvante. El volumen final de cada dosis era de 0,1 ml, que contenía 2,5 \mug/ml de ácido siálico. Después de la inyección de recuerdo, se extrajo el bazo de los animales y las células del bazo se prepararon para la fusión con células de mieloma.

Aproximadamente una semana antes de la fusión, se expandieron células de mieloma P3X63-Ag8.653 de murino, no secretoras (asequibles de ATCC bajo el número de acceso ATCC-1580-CRL) en medio completo RPMI-1640 con tampón HEPES 25 mM y L-glutamina (GIBCO BRL 041-02400). Los cultivos de células se evaluaron periódicamente para controlar el crecimiento de células, el número de células y para explorar la contaminación.

El día de la fusión, las células de bazo y las células asociadas de mieloma P3X63-Ag8.653 (células Ag8) se lavaron, cosecharon y se mezclaron en una relación 5:1 (células de bazo:células de mieloma). Las fusiones de células se realizaron a 37ºC en presencia de 50% de polietilenglicol (PEG). Sedimentos de células resultantes se cosecharon y cultivaron en placas de cultivo de células de 96 pocillos de fondo redondo (COSTAR 3596) y se incubaron en condiciones adecuadas (por ejemplo, a 37ºC en CO_{2} al 5%). Después de un día de incubación, se añadió a cada pocillo un medio selectivo que contenía hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT).

Después de aproximadamente 2 semanas de incubación en el medio selectivo HAT, se seleccionaron para exploración hibridomas de los pocillos que contenían células en crecimiento y que presentaban una confluencia de aproximadamente 10 a 25%. Se exploraron los materiales sobrenadantes de hibridomas seleccionados usando un ensayo ELISA en fase sólida basado en NPr-MenB PS, biotinilado con avidina. Se determinó la especifidad de la unión del anticuerpo en los materiales sobrenadantes usando como inhibidor NPr-MenB PS soluble. Los controles negativos incluían el medio RPMI, sobrenadante de mieloma de Ag8 y preparaciones de anticuerpo monoclonales irrelevantes. Como control positivo se usó agregados de suero policlonal de ratones inmunizados con el glicoconjugado de NPr-MenB OS/TT (CONJ-2). Después de incubación durante la noche con los materiales sobrenadantes, se lavaron los pocillos de reacción y se detectó inmunoglobulina unida con inmunoglobulinas antimurino polivalentes marcadas con fosfatasa alcalina (IgG, IgA, IgM).

Los hibridomas candidato se identificaron sobre la base de su demostrada afinidad por NPr-MenB PS en el ensayo ELISA descrito antes. Se clonaron hibridomas que secretaban moléculas de anticuerpo altamente reactivas mediante dilución limitativa. En particular, se cultivaron líneas de células de hibridoma candidato a 0,3, 1,0 y 3,0 células/pocillo en placas Terasaki (NUNC) en 20 \mug/ml de medio de clonación/expansión (RPMI-1640 completo con IL6). Después de 2 semanas se inspeccionaron visualmente los cultivos en cuanto a su crecimiento. El análisis de frecuencia se realizó usando el método de mínimos cuadrados descrito por Lefkovits y otros (1984) Immun. Today 5(9):265. Se repitió el ensayo ELISA usado para identificar el material sobrenadante reactivo entre los pocillos patrón para estimar la actividad del anticuerpo los días 7 y 14. Luego se expandieron clones seleccionados y se congelaron para posterior uso en cultivo de tejidos y producción de ascites. Se produjo así un panel de 39 hibridomas y se prepararon para posterior evaluación moléculas de anticuerpo monoclonal secretadas obtenidas de ellos (denominados "anticuerpos monoclonales SEAM", en particular anticuerpos monoclonales SEAM-1 a SEAM-24, SEAM-26, SEAM-28 a SEAM-31, SEAM-33 a SEAM-36, SEAM-38 a SEAM-42 y SEAM-48).

Más en particular, se produjeron anticuerpos monoclonales seleccionados en cultivo de tejidos o en fluido ascítico usando ratones Balb/c macho de 7 a 8 semanas de edad a los que se administró pristane. A cada animal se inyectaron i.p. 0,5 ml de pristane una semana antes de la inoculación de células de hibridoma. Antes de la inoculación, se ajustaron las concentraciones de células de hibridoma a entre 2,5 x 10^{6} y 3 x 10^{6} células/ml usando PBS estéril. A los animales primados con pristane se inoculó i.p. 1 ml de células de hibridoma, habiéndose inoculado cada línea de células en tres ratones diferentes. Una o dos semanas después de la inoculación, se inició la recogida de fluido de ascites y se continuó durante un tiempo de aproximadamente una semana. El fluido recogido se centrífugo a temperatura ambiente durante 10 minutos a 2700 rpm (1500 x g). Se recogieron los materiales sobrenadantes y se desecharon los sedimentos. El fluido de ascites aislado se almacenó a 4ºC en el transcurso de la recolección y se agregaron los fluidos recogidos en días diferentes, el agregado se dividió en partes alícuotas que se congelaron a -70ºC.

Ejemplos Caracterización de los anticuerpos monoclonales

Se determinaron las concentraciones de anticuerpos monoclonales no purificados usando un ensayo ELISA de captura y un ensayo de inmunodifusión radial. En particular se usó un procedimiento ELISA de captura para determinar la concentración de cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-NPr-MenB PS. Se incubaron durante la noche a 4ºC placas de microtitulación (Immulon 2, adquiribles de Dynatech Laboratories, Inc) que contenían 100 \mul de IgG antimurino de conejo purificado por afinidad, IgM e IgA (H y L, Zymed) diluidos a 1 \mug/ml en PBS 10 mM (pH 7,4). Después de lavar tres veces con PBS, los pocillos se llenaron con 250 \mul de tampón de bloqueo (PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1% de azida sódica, pH 7,4) y se incubó durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente para bloquear sitios de unión no específica. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía 01% de Tween 20 y 01% de azida sódica). Los anticuerpos a ensayar se diluyeron en tampón de dilución (PBS que contenía 1% de BSA, 0,1% de Tween 20 y 0,1% de azida sódica, pH 7,4) y luego se añadieron 100 \mul por cada pocillo. Se cubrieron las placas y se incubaron durante la noche a 4ºC. Para construir curvas patrón para cuantificar las concentraciones de anticuerpo se usaron patrones de inmunoglobulinas IgG1 de murino, IgG2b, IgG3 e IgM (adquiribles de Southern Biotechnology Associates) a concentraciones que varían de 500 ng/ml a 4 ng/ml.

Después de incubar durante la noche, se lavaron los pocillos 5 veces con tampón de lavado frío y se incubaron durante 3 horas a 4ºC con 100 \mul/pocillo de anticuerpos policlonales IgG antimurino, IgM e IgA (H y L, Zymed) conjugados con fosfatasa alcalina que se diluyeron 1:2000 en tampón de dilución. Las placas se lavaron luego con tampón de lavado frío y a cada pocillo se añadieron 100 \mul de sustrato recientemente preparado (fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) diluido a 1 mg/ml en tampón de sustrato (dietanolamina 1,0 M, MgCl_{2} 0,5 mM, pH 9,8). Después de aproximadamente 30 minutos, se midieron los valores de la absorbancia a 405 nm. Las concentraciones de inmunoglobulina de las preparaciones de anticuerpo monoclonal se calcularon a partir de las curvas patrón.

Los ensayos de inmunodifusión radial se realizaron como sigue. Las placas y los reactantes se obtuvieron de The Binding Site Limited (Birmingham, England). El protocolo de ensayo estaba basado en las instrucciones específicas del fabricante suministradas con el kit RID. En resumen, el anticuerpo calibrador suministrado con el kit se reconstituyó con una cantidad apropiada de agua destilada. Se prepararon diluciones 1:2 y 1:10 de anticuerpo calibrador. Se pueden diluir muestras de ensayo en 1% de BSA, si es necesario. Se aplicaron a pocillos separados de la placa partes alícuotas de 10 \mul (20 \mul para anticuerpos de las subclase IgAs e IgG2a) para el anticuerpo calibrador (neto y diluciones 1:2 y 1:10) y muestras de ensayo y se incubaron durante 120 horas a temperatura ambiente. Las concentraciones de los anticuerpos se determinaron midiendo los diámetros del anillo de precipitación y comparando estos valores con una tabla de referencia incluida en el kit RID.

Los anticuerpos monoclonales del cultivo de tejido o el fluido ascítico se purificaron luego parcialmente como sigue. El material sobrenadante del cultivo de tejido o los ascites que contienen los monoclonales (200 ml o el volumen indicado) se añadieron lentamente a un volumen igual de sulfato amónico frío saturado al 100% (SIGMA, Saint Louis, MO) mientras que la solución se agitaba suavemente. La mezcla de anticuerpo monoclonal y sulfato amónico se incubó durante la noche a 4ºC. A la mañana siguiente, la mezcla se agitó suavemente a homogeneidad y se centrífugó a 5000 rpm en un rotor Sorvall SS34 durante 30 minutos a 4ºC. Después de decantar el material sobrenadante, se usó un volumen igual de solución de sulfato amónico al 50% (esto es, el mismo volumen que el sulfato amónico saturado al 100%) para lavar y poner en suspensión el sedimento. La mezcla resultante se centrífugo a 5000 rpm en un rotor Sorvall SS34 durante 30 minutos a 4ºC. El material sobrenadante se decantó luego y se drenó.

Para los ascites, se reconstituyó el sedimento en 0,3-0,5 volúmenes del volumen inicial en tampón de PBS (fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,4). Para el material sobrenadante del cultivo de tejido, se reconstituyó el sedimento en 0,1 volúmenes del volumen de partida del tampón de PBS. La mezcla reconstituida de anticuerpo monoclonal y sulfato amónico se puso en un tubo de diálisis (corte a un peso molecular de 10.000-12.000) y se dejó dializar durante la noche en 4 l de PBS. La solución de PBS se cambió 3-4 veces a lo largo de los dos días siguientes. Las moléculas de anticuerpo monoclonal de los tubos de diálisis se pasaron a una jeringa y se esterilizaron filtrando a través de un filtro de membrana de 0,2 \mum y luego se almacenaron a -20ºC.

Las preparaciones de anticuerpo monoclonal parcialmente purificado se caracterizaron luego en cuanto a: (a) isotipo de inmunoglobulina (b) unión a NPr-MenB PS dependiente de la concentración, (c) capacidad de varios oligómeros de NPr-MenB de inhibir la unión a NPr-MenB PS, (d) reactividad por cruce con MenB PS nativo, (e) reactividad por cruce con cepas virulentas de MenB, (f) actividad bactericida mediada por complemento, (g) actividad opsónica y (h) autorreactividad demostrada por unión a una línea de células de neuroblastoma que expresa ácido polisiálico de cadena larga unido en \alpha2-8 en la superficie celular. En estos experimentos, las concentraciones de anticuerpo monoclonal se midieron por los ensayos ELISA de captura y RID descritos antes.

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(a) Determinación de isótopos de los anticuerpos

Los isotipos de los anticuerpos monoclonales (cadenas pesadas y ligeras) se determinaron por ELISA usando el protocolo descrito antes para ELISA de anti NPr-MenB PS con la única diferencia de que el anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina era específico para subclases de IgG, IgM, IgA y cadenas ligeras \kappa y \lambda. También se usó un kit para determinar los isotipos de las moléculas de anticuerpo. El kit estaba constituido por sustratos pegajosos de determinantes del tipo revestidos con anticuerpos de cabra específicos para los diferentes tipos de cadenas peptídicas de inmunoglobulina. El kit proporciona una especie marcada con peroxidasa específica para inmunogobulina antimurino para detectar los anticuerpos monoclonales de murino unidos a anticuerpos de cabra sobre el sustrato.

Como se representa en la Tabla 1, se encontró que la distribución isotípica entre los 39 anticuerpos monoclonales era de un IgM y treinta y ocho IgG (ocho IgG1, cinco IgG2a, dieciséis IgG2b y nueve IgG3). Además, todas las moléculas de anticuerpo tenían cadenas ligeras \kappa.

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(b). Unión a NPr-MenB PS dependiente de la concentración

Para estimar la unión dependiente de la concentración de las moléculas de anticuerpo a NPr-MenB PS en presencia de tampón solo o 25 \mug/ml de solución de inhibidor de NPr-MenB.PS se usó un procedimiento ELISA en fase sólida. Se preparó NPr-MenB PS-ADH usando el procedimiento de Sutton y otros (1985) J. Immunol. Methods 8,2:215. Se incubaron durante la noche a 4ºC placas de microtitulación (Immulon 2, adquiribles de Dynatech Laboratories, Inc.) que contenían 100 \mul/pocillo de avidina (4 \mug/ml de Extr Avidin, Sigma) en PBS 10 mM (pH 7,4). Después de lavar tres veces con PBS, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de NPr-MenB PS biotinilado en PBS y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Las placas se lavaron tres veces con PBS y los pocillos se llenaron con 250 \mul de tampón de bloqueo y se incubaron durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente para bloquear sitios de unión no específicos.

Después de bloquear, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado. Se añadieron partes alícuotas de 50 \mul de varias diluciones de los monoclonales a pocillos de placas reproducidas que contenían 50 \mul de tampón de dilución o 50 \mul de tampón de dilución que contenía 50 \mug de NPr-MenB PS soluble por ml (para una concentración final de inhibidor de 25 \mul/ml). Luego se cubrieron las placas y se incubaron durante la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavaron los pocillos 5 veces con tampón de lavado frío y luego se incubaron a 4ºC durante 3 horas con 100 \mul/pocillo de anticuerpos policlonales IgG, IgM e IgA antimurino conjugados con fosfatasa alcalina (Zymed) diluidos 1:2000 en tampón de dilución. Luego se lavaron las placas con tampón de lavado frío y a cada pocillo se añadieron 100 \mul de sustrato recientemente preparado (fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) diluido a 1 mg/ml en tampón de sustrato. Después de aproximadamente 30 minutos se midieron los valores de la absorbancia a 405 nm.

La Tabla 1 resume los respectivos intervalos de concentración de anticuerpo requeridos para que resultara una DO de 0,5 en un ensayo ELISA para cada uno de los 39 anticuerpos monoclonales SEAM. La explicación más probable de la gran heterogeneidad de los valores medidos es la de diferencias en la avidez del anticuerpo por NPr-MenB PS.

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(c). Inhibición de la unión de anticuerpo a NPr-MenB PS por oligómeros

Para estimar la capacidad de inhibidores de oligómeros de NPr-MenB para inhibir la unión de las moléculas de anticuerpos monoclonales a NPr-MenB PS en fase sólida se usó un procedimiento ELISA competitivo en fase sólida. El ensayo se realizó como se ha descrito antes para ELISA de anti NPr-MenB PS con la excepción que los anticuerpos monoclonales se prediluyeron a concentraciones que dieran una DO de 0,5 a 1. Los anticuerpos monoclonales se añadieron a pocillos de placas reproducidas, conteniendo cada uno uno de los siguientes inhibidores solubles para que resultara una concentración final de inhibidor de 25 \mug/ml: NPr-MenB PS de alto peso molecular (HMW); o NPr-MenB OS de bajo peso molecular (LMW) (que tiene un Dp medio de 3,8).

Las placas se cubrieron y se incubaron durante la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavaron los pocillos 5 veces con tampón de lavado frío y luego se incubaron a 4ºC durante 3 horas con 100 \mul/pocillo de anticuerpos policlonales IgG, IgM e IgA antimurino conjugados con fosfatasa alcalina (Zymed) diluidos 1:2000 en tampón de dilución. Luego se lavaron las placas con tampón de lavado frío y a cada pocillo se añadieron 100 \mul de sustrato recientemente preparado (fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) diluido a 1 mg/ml en tampón de sustrato. Después de aproximadamente 30 minutos se midieron los valores de la absorbancia a 405 nm. La inhibición porcentual se calculó comparativamente con la unión en ausencia de inhibidor.

El inhibidor NPr-MenB PS de HWM dio aproximadamente de 75% a 95% de inhibición en todos los anticuerpos monoclonales ensayados. Las diferencias en la especifidad antigénica fina en los anticuerpos monoclonales son evidentes consideradas las configuraciones de inhibición con el inhibidor de LMW ensayado. Por ejemplo, la unión de SEAM-3 y SEAM 18 a NPr-MenB PS es inhibida completamente por el inhibidor de LMW soluble. A diferencia, SEAM-2 y SEAM-16 no son inhibidos significativamente por los oligómeros (menos del 20%). En la Tabla 1 se muestran los resultados de la inhibición por NPr-MenB OS de LMW para todos los anticuerpos monoclonales. Además, como se describe más adelante, resultan evidentes otras diferencias en la especifidad antigénica fina de los monoclonales al considerar las diferencias observadas en la reactividad por cruce con Nac-MenB PS en ELISA y las diferencias en la unión a ácido polisiálico hospedador.

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(d). Reactividad por cruce con NAc-MenB PS

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales en cuanto a su capacidad para reaccionar por cruce con el polisacárido de NAc-MenB demostrada por unión directa a NAc-MenB PS en formato ELISA en fase sólida. El procedimiento usado era similar al descrito antes para ELISA con NPr-MenB PS, con la excepción de que como antígeno en fase sólida se usó NAc-MenB PS-ADH en vez de NPr-MenB-PS biotinilado.

Se añadieron partes alícuotas de 50 \mul de varias diluciones de los monoclonales a pocillos de placas duplicadas que contenían 50 \mul de tampón de dilución o 50 \mul de tampón de dilución que contenía 50 \mug de NAc-MenB PS por ml (para una concentración final de inhibidor de 25 \mul/ml). Luego se cubrieron las placas y se incubaron durante la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavaron los pocillos 5 veces con tampón de lavado frío y luego se incubaron a 4ºC durante 3 horas con 100 \mul/pocillo de anticuerpos policlonales IgG, IgM e IgA antimurino conjugados con fosfatasa alcalina (Zymed) diluidos 1:2000 en tampón de dilución. Luego se lavaron las placas con tampón de lavado frío y a cada pocillo se añadieron 100 \mul de sustrato recientemente preparado (fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) diluido a 1 mg/ml en tampón de sustrato. Después de aproximadamente 30 minutos se midieron los valores de la absorbancia a 405 nm.

La reactividad por cruce de cada uno de los anticuerpos monoclonales con el NAc-MenB PS se calificó en un intervalo de (++) para altamente reactivo por cruce a no reactivo por cruce (0). Los resultados se recogen en la Tabla 1. Como se puede ver, 16 de los anticuerpos monoclonales reaccionaron por cruce con el NAc-MenB PS y 4 reaccionaron mínimamente (+). La especifidad de la reactividad por cruce de estas 25 preparaciones positivas, o débilmente positivas, se confirmó por la inhibición de unión usando NAc-MenB PS soluble. Los 26 anticuerpos monoclonales no reactivos por cruce no presentaban unión significativa al NAc-MenB PS en fase sólida cuando se ensayaron a concentraciones de anticuerpo hasta de 25 \mug/ml.

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(e). Ensayo de unión bacteriana

La capacidad de los anticuerpos de polisacárido anti N-Pr-meningococo B para unirse a la superficie de cepas patógenas del grupo B de N. meningitidis se determinó usando la detección citométrica de flujo de un ensayo indirecto de inmunofluorescencia. Se usaron 2 organismos encapsulados de ensayo de meningococo B, cepa 8047 (la cepa usada para medir actividad bacteriana, véase más adelante) y NmB. Se usó una tercera cepa encapsulada, M7, que es un mutante de NmB que contiene transposón (Stephens y otros (1991) Infect,. & Immun. 59:4097-4102) como control negativo de la especifidad de la unión de anticuerpo al polisacárido capsular. Se recogieron células bacterianas crecidas a fase log-med en caldo de Mueller-Hinton y 0,25% de glucosa y se volvieron a poner en suspensión en tampón de bloqueo a una densidad de aprox. 10^{8} células por ml. Luego se añadieron los anticuerpos monoclonales (concentración de 10 o 100 \mug/ml) y se dejó que se unieran a las células sobre hielo durante 2 horas. Después de dos lavados con tampón de bloqueo, se incubaron las células con IgG antirratón de cabra de fragmento F(ab')_{2} conjugado a FITC (H+L) (Jackson Inmune Research, West Grove, PA), se fijaron con 0,25% de formaldehído en tapón de PBS y se analizaron por citometría de flujo.

Los anticuerpos de control positivo incluían anticuerpos monoclonales de serotipos y subtipos específicos para meningococos (MN2C3B, MN16C13F4, RIVM, Bilthoven, Países Bajos). El control negativo estaba constituido por un anticuerpo monoclonal de IgG de ratón de especifidad irrelevante.

Como se resume en la Tabla 1, 24 de los anticuerpos de polisacárido anti NPr-de meningococo B presentaron evidencia de unión bacteriana cuando se ensayaron a 100 \mug/ml. Dos anticuerpos adicionales presentaron evidencia de unión mínima a cepas mutantes tanto encapsuladas como no encapsuladas. La unión bacteriana de estos anticuerpos se calificó de indeterminante (i).

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(f). Actividad bactericida mediada por complemento

Se realizó un ensayo bactericida usando los procedimiento descritos por Mandrell y otros (1995) J. Infect. Dis. 172:1279 con las siguientes modificaciones: el organismo creció en caldo de Mueller-Hinton que contenía 0,25% de glucosa y tampón diluyente de suero constituido por tampón de Gey en vez de tampón de barbitol. En varios experimentos se usaron diferentes fuentes de complemento: entre éstas estaban incluidas dos diferentes agregados de suero de conejo lactante (denominados Rab C I y Rab CII) y suero \gamma-globulinémico humano (denominado Hu C).

La capacidad de cada uno de los anticuerpos monoclonales de activar lisis bacteriana mediada por complemente se presenta en la Tabla 1. Hay ejemplos de anticuerpos bacterianos que reaccionan por cruce con NAc-MenB PS por ELISA (por ejemplo, SEAM -18, SEAN-30 y SEAM-35). Hay también ejemplos de anticuerpos bactericidas que no presentan reactividad por cruce alguna con NAc-MenB PS (por ejemplo, SEAM-2, SEAM-5, SEAM-7 y SEAM-8).

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(g). Actividad opsónica

La actividad opsónica de anticuerpos monoclonales se puede medir por una variedad de procedimientos establecidos. Sjursen y otros (1987) Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand., Sec. C 95:283, Halstensen y otros (1989) Scand. J. Infect. Dis. 21:267, Lehmann y otros (1991) APMIS 99:769, Halstensen y otros (1991) NIPH Annals 14:157, Fredlund y otros (1992) APMIS 100:449, Guttormsen y otros (1992) Infect. Immun. 60:277, Guttormsen y otros (1993) J. Infec. Dis. 167:1314, Bjerknes y otros (1995) Infect. Immun, 63:160 y Hayrinen y otros (1995) J. Infect. Dis. 171:1481.

En un ensayo de opsonización, para inocular 8 ml de caldo de Mueller-Hinton (Difco, Detroit, MI) se usó N. meningitidis crecidos recientemente en placas de agar GN (Greiner Labortechniek, Greiner BV, Alphen a/d Rijn, Países Bajos) a 37ºC para obtener una DO inicial de 0,1. Las bacterias crecieron a fase log (absorbancia a 660 nm de 0,75-0,85) con vigorosas sacudidas. Las células se pasaron a tubos de plástico estériles con caperuzas y se centrifugaron durante 10 minutos a 3500 rpm.

Las células se fijaron añadiendo 4 ml de etanol al 70% e incubando durante como mínimo 1 hora a 4ºC. La células fijadas se sedimentaron nuevamente por centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm y se volvieron a poner en suspensión en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), resultando una DO de 1,0. La suspensión de células (1,35 ml) se añadió a un tubo Eppendorf y se centrífugo a 10.000 rpm durante 5 minutos. Se descartó el material sobrenadante y se añadieron otros 1,35 ml al mismo tubo, centrifugándose seguidamente para obtener 1 x 10^{9} células por tubo. Se preparó una solución de 1,0 mg/ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en PBS (Sigma, St. Louis, MO) y se sonicó durante 5 minutos, luego se centrífugo a 10.000 rpm durante 5 minutos. Se añadió la solución de FITC-PBS (50 \mul) a cada tubo de bacterias y luego se incubó a 37ºC durante 1 hora con una ligera agitación. A cada tubo se añadió PBS (950 \mul) y se centrífugó durante 2 minutos a 10.000 rpm. El sedimento se lavó una vez con 1 ml de PBS y una vez con 1 ml de BSA-solución salina equilibrada de Hank (BSA-HBBS). Se reconstituyeron los meningococos marcados con FITC en 1% de BSA-HBBS y se dividieron en partes alícuotas de 100 \mul que se almacenaron a -20ºC hasta que se usaron en el ensayo.

Se aislaron células polimórficas humanas (PMN) de sangre periférica de adultos sanos en tubos que contenían heparina (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se diluyó un volumen de 10 ml de sangre con una cantidad igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) y se separó en un gradiente de histopaque de Ficoll constituido por 10 ml de Paque^{MC} de Ficoll (Pharmacia, Uppsalla, Suecia) en la parte superior de 12 ml de histopaque (densidad 1,119, Sigma Diagnostic, St. Louis, MO). Después de centrifugación a 400 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente, se recogieron las células PMN de la parte superior del histopaque y se añadió medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute, NY) enfriado con hielo que contenía 1% de gelatina. Se centrifugaron las células a 250 x g y se lisaron los eritrocitos residuales poniendo nuevamente en suspensión las células en 9 ml de agua destilada-hielo. Después de 1 minuto, se añadió PBS concentrado y RPMI-gelatina para hacer isotónica la suspensión de células. Se centrifugaron las PMN y se volvieron a poner en suspensión en medio de RPMI a una densidad de 1 x 10^{7}/ml. La pureza y viabilidad de las PMN era mayor que 95%.

A una placa de microtitulación se añadieron diluciones apropiadas del anticuerpo monoclonal a ensayar (diluido en PBS-HBBS), 5 \mul de complemento humano (en BSA-HBBS) al 10% y 25 \mul de una suspensión de bacterias marcadas con FITC para obtener un volumen total de 50 \mul. Se ensayaron anticuerpos seleccionados sin complemento y con hasta tres fuentes diferentes de complemento: suero normal humano agregado; un suero \gamma-globulinémico, y suero de conejo lactante, variando la concentración de complemento de 1 a 10%. Cada ensayo incluía un control de anticuerpo positivo y negativo, así como un control de complemento, no de opsonización y de control de sólo células. La reacción de opsonización se dejó que transcurriera durante 30 minutos a 37ºC en un dispositivo de sacudidas antes de terminar la reacción poniendo la placa de microtitulación sobre hielo.

Se añadió suspensión de células de fagocito (50 \mul) a una concentración final de 5 x 10^{6} células/ml. Esto daba una relación de bacterias a fagocitos de 10:1. Se dejó que la fagocitosis transcurriera durante 30 minutos a 37ºC en un dispositivo de sacudidas, tiempo después del cual se puso sobre hielo. Se añadió a cada pocillo BSA-HBBS frío (100 \mul). Se centrifugaron las placas durante 10 minutos a 1100 rpm. Se aspiró el material sobrenadante de los pocillos y las células se lavaron dos veces más con 150 \mul de BSA-HBBS frío. Luego se añadió BSA-HBBS frío (150 \mul) y las suspensiones de células resultantes se pasaron a tubos estériles. Se añadió una solución de 2% de paraformaldehído (Polysciences, Inc., Warrington, PA) en PBS para fijar las células. Luego se analizaron las muestras por citometría de flujo fluorescente indirecta.

Los resultados de los experimentos de opsonización para 16 anticuerpos monoclonales SEAM representativos se recogen en la Tabla 1. Todos los anticuerpos que se encontró que eran opsónicos eran también bactericidas en el ensayo descrito antes usando como mínimo una de las fuentes de complemento. Sin embargo, como se puede ver en la Tabla 1, hay ejemplos de anticuerpos que eran bactericidas pero no opsónicos (véase, por ejemplo, SEAM-2, SEAM-5, SAM-7, SEAM-16 y SEAM-41).

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(h). Evaluación de la autorreactividad

Se evaluaron en cuanto a la autorreactividad al ácido polisiálico hospedador sustancias sobrenadantes parcialmente purificadas que contenían los 39 anticuerpos monoclonales. En un ensayo, se estimó la capacidad de reacción por cruce de los anticuerpos monoclonales con la línea de células de neuroblastoma humano CHP-134 (Livingston y otros (1988) J. Biol. Chem. 263:9443) usando la detección citométrica de flujo de inmunofluorescencia indirecta. En este ensayo, las células CHP-134, que expresan ácido polisialico (PSA) de cadena larga asociado con la molécula de adherencia de células neuronales (NCAM) en su superficie, actúan como marcadores celulares para antígenos de PSA humano. En experimentos de control, se recogieron células de cultivo cuasiconfluentes en tubos de centrifugadora de 50 ml y se centrifugaron a 1000 x g. Después de decantar el material sobrenadante, se añadieron 5 ml de tampón de bloqueo a las células puestas en suspensión. Se hizo luego un recuento de células en un hematocitómetro y se dividieron en dos partes alícuotas iguales. Una parte alícuota se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con exoneuraminidasa (10 unidades/10^{8} células, Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO), la otra parte alícuota se trató idénticamente pero sin enzima. Después de la incubación, las células de cada parte alícuota se distribuyeron entre tubos de reacción individuales de manera que cada tubo contuviera 10^{6} células. Para lavar las células se añadieron a cada tubo de reacción 2 ml de tampón de bloqueo, los tubos se centrifugaron a 1000 rpm en un Sorvall RT-600B durante 6 minutos a 20ºC y se eliminó por aspiración el material sobrenadante. Las células lavadas se incubaron durante 2 horas en un volumen total de 200 \mul sobre hielo sin anticuerpo o a la concentración indicada (usualmente 10 o 100 \mug/ml) del anticuerpo a ensayar (esto es, SEAM MAbs).

Los anticuerpos de control del ensayo incluían: (1) un anticuerpo monoclonal IgG de especifidad irrelevante (VIIG10, como control negativo); (2) un anticuerpo monoclonal antiácido polisiálico IgM (2-1B como control positivo), y (3) un anticuerpo monoclonal anti CD56 específico para el esqueleto de la proteína de NCAM (Immunotech, Marsella, Francia). A cada tubo se añadió tampón de bloqueo (2 ml) y los tubos se centrifugaron a 1000 rpm en el Sorvall RT-600B durante 6 minutos a 20ºC. Tras la centrifugación, se eliminó por aspiración el material sobrenadante y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 150 \mul de IgG (H+L) antirratón de cabra de fragmento F(ab')_{2} conjugado con isocianato de fluoresceína (FITC) (diluido a 4 \mug/ml) (Jackson Immune Research, West Grove, PA). Después de lavar con tampón de bloqueo, se añadieron a las células 400 \mul/ml de formaldehído al 0,25% en tapón de PBS (fosfato sódico 50 mM, pH 7,0; cloruro sódico 150 mM) y se analizaron las células por citometría de flujo usando un separador celular FACSCAN^{MC} (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Todos los anticuerpos se ensayaron a una concentración final de 10 y 100 \mug/ml de anticuerpo en muestras repetidas usando células no tratadas y células que se habían pretratado con neuraminidasa. Este tratamiento escinde el ácido polisiálico de la superficie y proporciona un control en el ensayo de la especifidad de la unión del anticuerpo al ácido polisiálico, En un experimento típico, las células incubadas sin anticuerpo primario, o con un anticuerpo monoclonal que tiene una especifidad antigénica irrelevante, muestran muy poca fluorescencia (aproximadamente 98% de las células tienen menos de 10 unidades de fluorescencia) . A diferencia, virtualmente la totalidad de las células tratadas con el anticuerpo monoclonal anti NAc MenB Ps, 2-1B, tienen una fuerte fluorescencia. La fluorescencia disminuye para controlar niveles cuando el anticuerpo se incuba con células que han sido pretratadas con neuraminidasa. Análogamente, las células tratadas con anti CD56 presentan una fuerte fluorescencia. Con este anticuerpo, la fluorescencia no es afectada por tratamiento de las células con neuraminidasa puesto que el determinante de CD56 está localizado en el esqueleto de la proteína de NCAM y la eliminación del ácido polisiánico no le afecta.

El anticuerpo SEAM-5 no da una unión detectable cuando se ensaya a 100 \mug/ml y se considera negativo en este ensayo. El anticuerpo SEAM 35 presenta una fuerte unión al ácido polisiálico cuando se ensaya a 10 o 100 \mug/ml y se considera positivo. Unos pocos anticuerpos monoclonales anti NPr-MenB PS presentan unión cuando se ensayan a 100 \mug/ml, pero aparecen como negativos cuando se ensayan a 10 \mug/ml (por ejemplo, SEAM-12). Tales anticuerpos se consideran mínimamente autorreactivos a los fines de esta solicitud. Un anticuerpo poco común reveló tener una débil reactividad con la línea de células de neuroblastoma, que no estaba afectada por el tratamiento de las células con neuraminidasa (por ejemplo, SEAM-7). La autorreactividad de tales anticuerpos con ácido polisiálico se calificó de indeterminante en el ensayo y, a los fines de esta solicitud, se consideró también que estos anticuerpos tienen una mínima autorreactividad al PSA hospedador.

La Tabla 1 resume la actividad del anticuerpo para cada anticuerpo, determinada en este ensayo de citometría de flujo de fluorescencia indirecta. La reactividad por cruce con antígenos del ácido polisiálico expresados en células CHP-134 se correlacionaba estrechamente con la reactividad de los anticuerpos con Nac-MenB PS en el ensayo ELISA. Como se muestra en la Tabla 1, los anticuerpos monoclonales que no reaccionaban por cruce con NAc-MenB PS en el ensayo ELISA tampoco se unieron a células CHP-134, mientras que la totalidad de los anticuerpos que reaccionaban por cruce con NAc-MenB PS en el ensayo ELISA también reaccionaba por cruce con PSA. Esta correlación entre los dos ensayos no era inesperada puesto que la estructura covalente del polisacárido de NAc-MenB PS y la del PSA hospedador se indica que son la misma.

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Ejemplo 5 Identificación de miméticos moleculares de antígeno de menú usando anticuerpos monoclonales SEAM

Se realizaron los procedimientos siguientes con el fin de identificar miméticos moleculares que interaccionan con los anticuerpos monoclonales SEAM de la presente invención. Se sintetizaron moléculas sintéticas combinatorias de acuerdo con los procedimientos de Zuckermann y otros descritos antes. (Véase Zuckerman y otros (1996) Methods in Enzymology 267:437, y Zuckermann y otros (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:10646). Se identificaron miméticos moleculares por fraccionamiento de agregados por HPLC en fase inversa. El agregado (aprox. 200 \mul o una solución 10 \muM/molécula en DMSO) se inyectó en una columna de fase inversa Dynamax C18 (Varian, Palo Alto, CA) y se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo de 0% a 80% (v/v) en ácido trifluoroacético al 0,1% en un período de 60 minutos. Se liofilizaron las fracciones y se volvieron a poner en suspensión en 40 \mul de DMSO o acetonitrilo/agua (1:1). Se ensayaron luego partes alícuotas (5 \mul) de cada fracción inhibiendo la unión de anticuerpos monoclonales SEAM a NPr-MenB PS en ELISA. Luego se identificaron por LC/MS (HP1100LC/MSD, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) las moléculas de las fracciones que tenían actividad inhibidora.

Se añadieron anticuerpos monoclonales SEAM (100 \mul), diluidos an PBS a una concentración aproximadamente igual a la concentración requerida para que resultara una DO_{405} en 30 min en el ensayo estándar ELISA descrito antes, a pocillos de una placa revestida con NPr-MenB PS. A las soluciones de anticuerpo monoclonal se añadieron soluciones (1-2 \mul) (concentración final de 1 \muM por molécula de agregado) y se incubó a 4ºC durante la noche. Los controles incluían pocillos con (1) anticuerpo solo, (2) tampón solo y (3) anticuerpo y tampón, cada uno con 1-2 \mul de DMSO. Las placas se lavaron 4 veces con PBS y se revelaron como se ha descrito antes. Los agregados se exploraron con los anticuerpo monoclonales SEAM, SEAM-2, SEAM-3, SEAM-5, SEAM-12, SEAM-16, SEAM-18 y SEAM-28 y se juzgó que eran positivos si la inhibición, comparada con el anticuerpo con DMSO, era > 80% de la unión observada en ausencia de inhibidor.

Los miméticos moleculares de estructura 1, según lo descrito antes, se identificaron como que inhiben la unión de anticuerpos monoclonales SEAM particulares a NPr-MenB PS en ensayos ELISA. Los valores de CI_{50} (concentración estimada del compuesto individual suficiente para inhibir en 50% la unión de de anticuerpos monoclonales SEAM a NPr-MenB PS) se determinaron por dilución serial de los agregados en el ensayo ELISA descrito antes. Las concentraciones CI_{50} de los miméticos moleculares de la invención varían de aprox. 3 nM a 700 nM suponiendo una molécula activa individual en el agregado.

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Ejemplo 6 Preparación de composiciones de vacunas de miméticos moleculares

Se preparan composiciones de vacunas que contienen moléculas pequeñas que corresponden a los miméticos antes descritos por asociación no covalente o unión covalente del mimético a proteínas soporte. A los miméticos se añaden grupos hidrófobos o no reactivos para facilitar la asociación de la molécula mimética pequeña a la proteína soporte de manera que proteja la capacidad del mimético de inhibir la unión del anticuerpo monoclonal SEAM al NPr- MenB PS en un ensayo ELISA.

Preparación de vesículas de PME Se preparan vesículas de PME a partir de una cepa multante deficiente capsular del grupo B de Neisseria meningitidis (cepa M7) usando una combinación de las técnicas descritas por Lowell y otros (1988) J. Expt. Med. 167:658-663 y Zollinger y otros (1979) J. Clin. Invest. 6,3:836-848. En resumen, se hacen crecer bacterias en caldo MH, se sedimentan por centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en 15 ml de tampón que contiene Tris-HCl 0,05M, NaCl 0,15 M y EDTA 0,01 M (pH 7,4), y luego se calientan a 56ºC durante 30 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, la suspensión se cizalla en un aparato Polytron (Kinematica GmbH, Lucerna, Suiza) a toda velocidad durante 3 minutos y luego se centrífuga a 16000 x g durante 15 minutos. El sedimento resultante se vuelve a poner en suspensión con 10 ml de tampón (cloruro sódico 500 mM, fosfato sódico 50 mM) y se trata con 5 ml de solución detergente (desoxicolato sódico al 10% (DOC) (Calbiochem, La Jolla, CA), glicina 0,15 M (Biorad, Hercules, CA) y ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 30 mM (Sigma, St. Louis, MO). Se centrífuga la suspensión a 16.000 x g durante 15 minutos. Se recoge luego el material sobrenadante y se centrífuga a 100.000 xg durante 2 horas. Se vuelve a poner en suspensión un sedimento que contiene la preparación de proteína de membrana exterior en 10 ml de agua y se almacena a 4ºC.

Los 10 ml de suspensión de proteína de membrana exterior se tratan nuevamente con 5 ml de solución detergente y luego se calientan a 56ºC durante 30 minutos. Después de enfriar, se elimina el liposacárido (LPS) de la proteína de membrana exterior por cromatografía, 2 ml cada vez, usando una columna Sephadex G-100 de 2 cm x 20 cm (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) en una segunda solución detergente (1% de DOC, glicina 0,05 M y EDTA 0,005 M, pH 8,8). Se recogen las fracciones de pico, se calientan a 30ºC y se esterilizan filtrando a través de un filtro de membrana de 0,2 \mum directamente a 4 volúmenes de etanol frío esterilizado por filtración. Esta mezcla se incuba a 4ºC durante la noche. El precipitado resultante se recoge por centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos y se vuelve a poner en suspensión en 1 ml de agua destilada estéril. La preparación de la PME resultante se almacena a -60ºC.

Un mimético molecular que contiene un grupo lauroil-GLY-GLY se compleja a vesículas de PME mediante interacciones hidrófobas combinando cantidades iguales en peso del derivado de lauroil-GLY-GLY y vesículas de PME solubilizadas en solución de detergente (1% de DOC, glicina 0,05 M y EDTA 0,005 M). La solución se coloca en un tubo de diálisis con un corte del peso molecular a 10.000 daltons y se dializa frente a 3 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato sódico 50 mM), pH 7,0, NaCl 150 mM) en 3 cambios de tampón de 1 l cada uno a lo largo de un período de 24 horas.

Preparación de conjugados de mimético molecular-proteína soporte. Se pone en suspensión en 2 ml de agua destilada hemocianina de lapa de California (KLH, por ejemplo, Imject®, Pierce, Rockford, IL) para obtener una concentración final de 10 mg/ml. Se añaden 200 \mul de esta solución a un tubo de microcentrifugadora de 1,5 ml. Se disuelve en 1 ml de tampón de conjugación (fosfato sódico 0,083 M, cloruro sódico 0,9 M, EDTA 0,1 M, pH 7,2) un reactivo de reticulación heterobifuncional (2 mg) que contiene un éster activo de N-hidroxisuccinimida y un grupo maleiimida tal como Sulfo-SMCC® (Pierce, Rockford, IL). Se combinan inmediatamente 100 \mul de la solución de sulfo-SMCC con la solución de KLH y se deja que reaccionen durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución se aplica a una columna Sephadex G-25 de 1,5 cm x 10 cm equilibrada con tampón de conjugación. Se recoge la KLH activada con maleiimida que eluye en el volumen vacío y se retiene Se pone en suspensión en 100 \mul de DMSO un mimético molecular, descrito antes, que contiene un aminoácido de cisteína y se añade a la solución de KLH activada con maleiimida. Se deja que la mezcla reaccione a temperatura ambiente durante 18 horas. Se termina la reacción añadiendo \beta-mercaptoetanol a una concentración final de 5 mM. Finalmente, el conjugado de hapteno-soporte se purifica por cromatografía de penetración en gel en una columna Sephadex G-25 de 2 cm x 25 cm equilibrada con PBS. La columna se controla por absorbancia de luz UV a 280 nm.

Ejemplo 7 Inhibición de la unión de anticuerpo a NPr-MenB PS por miméticos de molécula pequeña a epitopos de NPr-MenN PS

Se sintetizaron como se ha descrito antes moléculas pequeñas de epitopos de NPr-MenB PS (estructuras 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B(2). Los miméticos moleculares tienen las estructuras siguientes:

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Se usó un procedimiento de ELISA competitivo de fago sólido para estimar la capacidad de miméticos de molécula pequeña de epitopos de NPr-MenB PS de inhibir la unión de moléculas de anticuerpo monoclonal a NPr-MenB PS en fase sólida. El ensayo se realizó como se ha descrito antes para la inhibición de anticuerpo a NPr-MenB PS por ELISA de oligómeros, con la excepción de que los anticuerpos monoclonales se diluyeron a concentraciones que dieran una DO de 0,5 a 1 en PBS. Los anticuerpos monoclonales se añadieron luego a pocillos de placas repetidas, conteniendo cada una de ellos 70 \mul de PBS y 5 \mul de inhibidor diluido en acetonitrilo/agua (1:1), que se añadió antes de añadir 50 \mul de la solución de anticuerpo. El inhibidor y el anticuerpo se incubaron en la placa de ELISA de NPr-MenB PS a temperatura ambiente durante 1 hora. Los resultados de la inhibición por 4 miméticos moleculares de 4 anticuerpos SEAM se representan gráficamente en las Figuras 1A-1D. En particular, la Figura 1 ilustra la inhibición dependiente de la concentración de (A) SEAM 3 (10 mg/ml); (B) SEAM 7 (10 mg/ml); (C) SEAM 18 (10 mg/ml) y (D) SEAM 30 (10 mg/ml) por la estructura 5A (1), 5B (1), 6A (1) y 6B (1).

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(a). Reactividad por cruce con miméticos moleculares revestidos directamente sobre placas de ELISA

Los anticuerpos monoclonales se evaluaron en cuanto a su capacidad de reaccionar por cruce con miméticos moleculares demostrada por unión indirecta a los miméticos moleculares en un formato de ELISA en fase sólida. El procedimiento usado era similar al descrito antes para ELISA de NPr-MenB PS con las excepciones siguientes. Los anticuerpos se diluyeron en PBS y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y los anticuerpos monoclonales IgG, IgM e IgA antimurino (Zymed) conjugados a fosfatasa alcalina se diluyeron en PBS y se incubaron a temperatura ambiente sobre las placas de ELISA. La Figura 2 representa la unión de SEAM 3 (10 mg/ml), SEAM 7 (10 mg/ml), SEAM 18 (10 mg/ml) y SEAM 30 (10 mg/ml) a las estructuras 5A (1), 5B (1), 6A (1) y 6B(1).

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Ejemplo 8 Preparación de conjugados de albúmina de suero bovino de las estructuras 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B (2)

Una solución de estructura 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B (2).(150 \mul, aprox. 50 mM) en dimetilsulfóxido se combinó con 50 \mul de MBS 17 M (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) en dimetilsulfóxido. Se añadieron aproximadamente 20 \mul de tampón Hepes 1 M (Sigma), pH 8,0, para neutralizar el ácido liberado de la reacción. Después de incubar a temperatura ambiente durante 1 hora, se añadieron 0,5 ml de 10 mg/ml de BSA (Imject, Pierce). Después de una incubación durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla se puificó haciéndola pasar a través de una columna de filtración en gel 10-DG (Bio-Rad, Richmond, CA) equilibrada con PBS. Se recogieron fracciones (0,5 ml) y se ensayaron en cuanto a la presencia de proteína usando un ensayo de proteína BCA (Pierce). Se combinaron las tres primeras fracciones que eluyeron de la columna que contenían proteína.

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(a). Reactividad por cruce de anticuerpos SEAM con conjugados de BSA de las estructuras 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B (2)

Los conjugados de BSA de las estructuras 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B (2) se diluyeron 1:1000 en PBS y 100 \mul de cada uno se añadieron a los pocillos de placas de microtitulación (Immulon 2, adquiribles de Dynatech Laboratories, Inc.) Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS, se llenaron con 250 \mul de tampón de bloqueo y se incubaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente para bloquear sitios de unión no específica. Luego se lavaron las placas 3 veces con tampón de lavado. Los anticuerpos a ensayar se diluyeron en PBS y luego se añadieron 100 \mul por cada pocillo. Las placas se cubrieron e incubaron durante la noche a 4ºC.

Después de incubación durante la noche, los pocillos se lavaron 5 veces con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 \mul/pocillo de anticuerpos policlonales IgG, IgM e IgA antimurino conjugados a fosfatasa alcalina.(Zymed) que se diluyeron 1:2000 en PBS. Luego se lavaron las placas con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 \mul de sustrato (fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) recientemente preparado diluido en 1 mg/ml de tampón de sustrato. Después de aproximadamente 30 minutos se midieron los valores de absorbancia a 405 nm. La Figura 3 representa la unión de SEAM 3 (10 mg/ml), SEAM 7 (10 mg/ml), SEAM 18 (10 mg/ml) y SEAM 30 (10 mg/ml) a las estructuras 5A(1), 5B(1), 6A(1) y 6B1) descritas antes.

De este modo se han descrito nuevos miméticos moleculares de epitopos singulares de MenB y procedimientos para obtener y usar los mismos. Aunque se han descrito con algún detalle realizaciones preferentes de la presente invención, ha de entenderse que se pueden hacer desviaciones obvias sin desviarse de la invención según se define en las reivindicaciones anexas.

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Depósito de cepas útiles en la práctica de la invención

Se hicieron depósitos de cultivos biológicamente puros de las siguientes líneas de células de hibridomas en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. Se asignaron los números de acceso indicados después de ensayos de viabilidad satisfactorios y se pagaron las tarifas requeridas. Los depósitos se hicieron en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento del Depósito de Microorganismos con el Fin del Procedimiento de Patente y las Regulaciones impuestas (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables durante un período de treinta (30) años desde la fecha del depósito. La ATCC hará asequibles los organismos en los términos del Tratado de Budapest y con sometimiento a un acuerdo entre Chiron Corporation y la ATCC que asegura una disponibilidad permanente y no restringida de la progenie a alguien determinado por el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks, con derecho a ello, de acuerdo con 35 U.S.C \NAK 122 y las reglas del Comisario de acuerdo con ello (incluidas 37 C.F.R \NAK 1.12 con referencia particular a 886 OG 638). Después de la concesión de una patente, todas las restricciones sobre la asequibilidad al público de los cultivos depositados se eliminarán irrevocablemente.

Estos depósitos se proporcionan meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no suponen que se admita que se requiere un depósito según 35 U.S.C. \NAK 112. Las secuencias de ácidos nucleicos de estos hibridomas, así como las secuencias de aminoácidos de las moléculas de anticuerpos codificadas como resultado de ello, son decisivas en el caso de cualquier conflicto con la descripción en este documento. Se puede requerir una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados y por la presente no concede tal licencia.

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Claims (5)

1. Un mimético molecular de un epitopo singular del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) que tiene la estructura siguiente:

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en la que X es O, NH, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo C_{1-24}; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH, y p = 0-3.

2. Un mimético molecular de un epitopo singular del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) que tiene la estructura siguiente:

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en la que X es O, NH, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo C_{1-24}; R_{1} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH, y p = 0-3.

3. Un mimético molecular de un epitopo singular del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) que tiene la estructura siguiente:

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en la que X es O, NH, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo C_{1-24}; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OR o -SH, y p = 0-3.

4. Un mimético molecular de un epitopo singular del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) que tiene una estructura seleccionada entre el grupo constituido por las estructuras siguientes

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y

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en las que X es O, NH, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo C_{1-24}; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH; p = 0-3; R_{8} es H o COCH_{3}; y R_{9} es -COOH, -NH_{2}, NHNH_{2} o

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5. Un mimético molecular de un epitopo singular del serogrupo B de Neisseria meningitidis (MenB) que tiene una estructura seleccionada entre el grupo constituido por las estructuras siguientes

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y

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en las que X es O, NH, S o CH_{2}; R_{3} es H o alquilo C_{1-24}; R_{4} es -NH_{2}, -NHOH, -NHNH_{2}, -OH o -SH; p = 0-3; R_{8} es H o COCH_{3}; y R_{9} es -COOH, -NH_{2}, NHNH_{2} o

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