ES2319958T3 - Citoquinas de mamifero: reactivos y procedimientos asociados. - Google Patents

Abstract

Un complejo soluble aislado que comprende: a) un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13; o b) un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R.

Description

Citoquinas de mamífero: reactivos y procedimientos asociados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones relacionadas con proteínas que funcionan controlando la biología y fisiología de células de mamífero, p. ej., las células de un sistema inmunitario de mamífero. En concreto, proporciona genes, proteínas, anticuerpos purificados, reactivos relacionados, y métodos útiles, p. ej., para regular la activación, el desarrollo, la diferenciación, y la función de diferentes tipos celulares, incluyendo las células hematopoyéticas.

Antecedentes de la invención

La tecnología del ADN recombinante hace referencia generalmente a la técnica de integración de la información genética de una fuente donadora en vectores para su posterior tratamiento, tal como a través de la introducción en un anfitrión, con lo que la información genética transferida es copiada y/o expresada en el nuevo entorno. Comúnmente, la información genética existe en forma de ADN complementario (ADNc) derivado de ARN mensajero (ARNm) que codifica un producto proteico deseado. El portador es frecuentemente un plásmido que tiene la capacidad de incorporar ADNc para la posterior replicación en un anfitrión y, en algunos casos, controlar realmente la expresión del ADNc y de ese modo dirigir la síntesis del producto codificado en el anfitrión.

Durante algún tiempo, se ha sabido que la respuesta inmunitaria de mamíferos está basada en una serie de interacciones celulares complejas, denominadas "red inmunitaria". Véase, p. ej., Paul (1998) Fundamental Immunology (4^{a} ed.) Raven Press, NY. La investigación reciente ha proporcionado nuevas percepciones de los trabajos internos de esta red. Si bien queda claro que mucha de la respuesta no gira, de hecho, en torno a las interacciones de tipo red de linfocitos, macrófagos, granulocitos, y otras células, los inmunólogos mantienen ahora generalmente la opinión de que las proteínas solubles, conocidas como linfoquinas, citoquinas, o monoquinas, juegan un papel crítico en el control de estas interacciones celulares. Así, existe un interés considerable en el aislamiento, la caracterización, y los mecanismos de acción de los factores moduladores celulares, cuya comprensión conducirá a avances significativos en la diagnosis y la terapia de numerosas anomalías médicas, p. ej., trastornos del sistema inmunitario. Algunos de estos factores son los factores de crecimiento hematopoyéticos, p. ej., el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). Véanse, p. ej., Thomson (ed. 1998) The Cytokine Handbook (3d ed.) Academic Press, San Diego; Mire-Sluis y Thorpe (ed. 1998) Cytokines Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge Universidad Press; y Aggarwal y Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.

Las linfoquinas median aparentemente las actividades celulares de varias formas. Se ha demostrado que apoyan la proliferación, el crecimiento, y/o la diferenciación de células troncales hematopoyéticas pluripotenciales en enormes números de progenitores que comprenden linajes celulares diversos que constituyen un sistema inmunitario complejo. Las interacciones apropiadas y equilibradas entre los componentes celulares son necesarias para una respuesta inmunitaria saludable. Los diferentes linajes celulares responden a menudo de manera diferente cuando las linfoquinas se administran junto con otros agentes.

Los linajes celulares especialmente importantes para la respuesta inmunitaria incluyen dos clases de linfocitos: células B, que pueden producir y secretar inmunoglobulinas (proteínas con la capacidad de reconocer y unirse a materia foránea para efectuar su eliminación), y células T de diferentes subgrupos que secretan linfoquinas e inducen o suprimen las células B y otras células diferentes (incluyendo otras células T) que constituyen la red inmunitaria. Estos linfocitos interactúan con muchos otros tipos celulares.

La investigación para la mejor comprensión y tratamiento de diferentes trastornos inmunitarios ha sido impedida por la incapacidad general de mantener las células del sistema inmunitario in vitro. Los inmunólogos han descubierto que el cultivo de estas células se puede lograr a través del uso de sobrenadantes de células T y de otros sobrenadantes celulares, que contienen diferentes factores de crecimiento, incluyendo muchas de las linfoquinas.

De lo anterior, resulta evidente que el descubrimiento y el desarrollo de nuevas linfoquinas, p. ej., relacionadas con G-CSF y/o IL-6, podría contribuir a nuevas terapias para un amplio rango de condiciones degenerativas o anormales que impliquen directamente o indirectamente al sistema inmunitario y/o a las células hematopoyéticas. En concreto, el descubrimiento y el desarrollo de linfoquinas que aumenten o potencien las actividades beneficiosas de las linfoquinas conocidas podrían ser muy ventajosos. La presente invención proporciona nuevas composiciones de interleuquinas y compuestos relacionados, y métodos para su uso.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a la interleuquina-B60 (IL-B60) de mamífero, p. ej., de primate o roedor, y sus actividades biológicas, y se dirige a complejos de IL-B60 y CLF-1 o cadena alfa de CNTF-R. Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un complejo soluble aislado que comprende:

1. (a) un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13; o

2. (b) un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R.

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Esta descripción incluye los ácidos nucleicos que codifican los propios polipéptidos y los métodos para su producción y uso. Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria están caracterizados, en parte, por su homología con secuencias de ADN complementario (ADNc) descritas en la presente memoria, y/o por análisis funcionales de las actividades de tipo factor de crecimiento o de tipo citoquina, p. ej., G-CSF (véase Nagata (1994) en Thomson The Cytokine Handbook 2^{a} ed., Academic Press, San Diego) y/o IL-6 (véase Hirano (1994) en Thomson The Cytokine Handbook 2^{a} ed., Academic Press, San Diego). También se proporcionan polipéptidos, anticuerpos, y métodos para utilizarlos, incluyendo el uso de métodos de expresión de ácidos nucleicos. Se describen los métodos para modular o intervenir en el control de una fisiología dependiente del factor de crecimiento o de una respuesta inmunitaria.

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de una nueva secuencia de citoquina que muestra una similitud de secuencia y estructural significativa con G-CSF e IL-6. En concreto, en la presente memoria se describen genes de primate, p. ej., humanos, y de roedor, p. ej., ratón, que codifican una proteína cuyo tamaño maduro es de aproximadamente 198 aminoácidos. Los equivalentes funcionales que muestran una homología de secuencia significativa estarán disponibles de otros mamíferos, p. ej., especies de vaca, caballo, y rata.

Por otra parte, la presente invención identifica un segundo componente asociado de un complejo. Se proporcionan las composiciones relacionadas con la combinación de componentes del complejo, junto con los métodos de uso.

En la presente memoria se describe un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4. Preferiblemente, los polipéptidos descritos en la presente memoria, incluyendo los complejos de la invención están: marcados detectablemente; no glucosilados; desnaturalizados; anclados a un sustrato sólido; conjugados a otro radical químico; o en una composición estéril. Las formas de los kits descritas en la presente memoria incluyen aquellas que comprenden el polipéptido y: un compartimento que comprende el polipéptido; o con instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

Los compuestos de unión descritos en la presente memoria incluyen aquellos que comprenden un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido descrito. El compuesto de unión también puede estar en un kit que comprende: un compartimento que comprende el compuesto de unión; o con instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

También se describe en la presente memoria un método para producir un complejo de antígeno:anticuerpo, que comprende poner en contacto, en condiciones apropiadas, un polipéptido IL-B60 de primate con un anticuerpo que se une específicamente o selectivamente al polipéptido de la invención, permitiendo de ese modo que se forme el complejo.

Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria incluyen un polinucleótido aislado o recombinante que codifica la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un complejo soluble aislado que comprende la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4, y la porción proteica madura del SEQ ID NO: 12 o 13. Preferiblemente el complejo: comprende un polipéptido recombinante del SEQ ID NO: 2, 4, 12, o 13; está marcado detectablemente; está en una disolución tamponada; está en una disolución estéril. Se proporcionan kits que contienen tal complejo y: un compartimento que comprende el complejo; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

Los compuestos de unión de la invención son los anticuerpos y sus fragmentos de unión al antígeno, como se define en las reivindicaciones adjuntas. De este modo, la invención se refiere a composiciones de unión que comprenden un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al complejo soluble pero no al polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13. Se describe que los kits comprenden el compuesto de unión y: un compartimento que comprende el compuesto de unión; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

Se proporcionan métodos, p. ej., para producir un complejo antígeno:anticuerpo, que comprenden poner en contacto, en condiciones apropiadas, un complejo de primate que comprende los polipéptidos IL-B60 y CLF-1 con un anticuerpo que se une selectivamente o específicamente a un complejo soluble aislado que comprende la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4, y la porción proteica madura del SEQ ID NO: 12 o 13, permitiendo así que se forme el complejo.

Las realizaciones de ácido nucleico incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4, y la porción proteica madura del SEQ ID NO: 12 o 13.

También se describe en la presente memoria una composición de materia seleccionada entre: un polipéptido aislado que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4; un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende al menos dos segmentos no solapantes distintos de al menos cinco aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4; un polipéptido de secuencia natural que comprende los SEQ ID NO: 2 o 4 maduros; o un polipéptido de fusión que comprende la secuencia IL-B60. En algunas realizaciones de la descripción, los segmentos no solapantes de distinta identidad incluyen: uno de al menos ocho aminoácidos; uno de al menos cinco aminoácidos y un segundo de al menos seis aminoácidos; al menos tres segmentos de al menos cuatro, cinco, y seis aminoácidos, o uno de al menos doce aminoácidos. En otras realizaciones el polipéptido de la composición de materia: es el polipéptido que: comprende una secuencia madura de la Tabla 1; es una forma no glicosilada de IL-B60; es de un primate, tal como un ser humano; comprende al menos diecisiete aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o 4; muestra al menos cuatro segmentos no solapantes de al menos siete aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o 4; es una variante alélica natural de IL-B60; tiene una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; muestra al menos dos epítopos no solapantes que son específicos para un IL-B60 de primate; está glucosilado; tiene un peso molecular de al menos 30 kD con glucosilación natural; es un polipéptido sintético; está anclado a un sustrato sólido; está conjugado con otro radical químico; es una sustitución de cinco veces o menos de la secuencia natural; es una variante por deleción o inserción de una secuencia natural; o que comprende adicionalmente: al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 12 o 13; al menos dos segmentos no solapantes distintos de al menos cinco aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 12 o 13; un polipéptido de secuencia natural que comprende los SEQ ID NO: 12 o 13 maduros; o CLF-1 de primate. En realizaciones adicionales de la descripción, la composición comprende: IL-B60 y CLF-1 sustancialmente puros; un polipéptido IL-B60 estéril que comprende la proteína madura del SEQ ID NO: 2 o 4; o el polipéptido descrito y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, disolución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral. También se describen en la presente memoria polipéptidos de fusión que comprenden: la secuencia de proteínas madura de la Tabla 1; una etiqueta de detección o purificación, incluyendo una secuencia FLAG, His6, o Ig; o la secuencia de otra proteína de la familia de receptores de citoquina, incluyendo CLF-1. Las realizaciones de los kits descritos en la presente memoria incluyen aquellas que comprenden el polipéptido de la composición y: un compartimento que comprende la proteína o el polipéptido; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

También se describen en la presente memoria los métodos para utilizar los polipéptidos descritos: para marcar el polipéptido, que comprende el marcaje del polipéptido con una marca radiactiva; para separar el polipéptido de otro polipéptido en una mezcla, que comprende someter a ensayo la mezcla en una matriz cromatográfica, separando de ese modo los polipéptidos; para identificar un compuesto que se une selectivamente al polipéptido, que comprende incubar el compuesto con el polipéptido en condiciones apropiadas; haciendo de ese modo que el componente se una al polipéptido; o para conjugar el polipéptido con una matriz, que comprende derivatizar el polipéptido con un reaccionante reactivo, y conjugar el polipéptido con la matriz.

Los compuestos de unión relacionados descritos en la presente memoria incluyen aquellos que comprenden un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente o selectivamente a un polipéptido natural, como se ha descrito antes, donde: el compuesto de unión está en un recipiente; el polipéptido IL-B60 es de un ser humano; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; el compuesto de unión está conjugado con otro radical químico; o el anticuerpo: está originado contra un polipéptido maduro de la Tabla 1; está originado contra un IL-B60 maduro; está originado para un IL-B60 humano purificado; está inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a un IL-B60 desnaturalizado; muestra una Kd para el antígeno de al menos 30 \muM; está anclado a un sustrato sólido, incluyendo una cuenta o membrana de plástico; está en una composición estéril; o está marcado detectablemente, incluyendo una marca radiactiva o fluorescente. Se proporcionan kits que comprenden tal compuesto de unión y: un compartimento que comprende el compuesto de unión; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos del kit.

Se describen métodos para producir un complejo de antígeno:anticuerpo, que comprenden poner en contacto, en condiciones apropiadas, un polipéptido IL-B60 de primate con un anticuerpo descrito, permitiendo que se forme el complejo. Preferiblemente, en el método: el complejo se purifica a partir de otras citoquinas; el complejo se purifica a partir de otro anticuerpo; el contacto es con una muestra que comprende una citoquina; el contacto permite la detección cuantitativa del antígeno; el contacto es con una muestra que comprende el anticuerpo; o el contacto permite la detección cuantitativa del anticuerpo.

En otra realización la invención se incluye una composición que comprende: el compuesto de unión estéril, es decir un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno, como se define en las reivindicaciones adjuntas, o el compuesto de unión y un portador, donde el portador: es un compuesto acuoso, incluyendo agua, disolución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

Las realizaciones de los ácidos nucleicos descritas en la presente memoria incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica el polipéptido descrito, donde: el IL-B60 es de un ser humano; o el ácido nucleico: codifica una secuencia peptídica antigénica de la Tabla 1; codifica una pluralidad de secuencias peptídicas antigénicas de la Tabla 1; codifica una pluralidad de secuencias peptídicas antigénicas de la Tabla 4; muestra identidad a lo largo de al menos trece nucleótidos con respecto a un ADNc natural que codifica el segmento. La invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que codifica una forma proteica de fusión del complejo de la invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas. En las realizaciones preferidas, el ácido nucleico de la invención: es un vector de expresión; comprende adicionalmente un origen de replicación; comprende una marca detectable; comprende una secuencia de nucleótidos sintética; tiene menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb; es de un primate; comprende una secuencia codificante completa natural. También se describe en la presente memoria una sonda de hibridación para un gen que codifica IL-B60; es un cebador de PCR, un producto de la PCR, o un cebador de mutagénesis; y un ácido nucleico de una fuente natural. Las realizaciones preferidas incluyen el caso en el que el ácido nucleico recombinante está en una célula o tejido. La célula puede ser: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate; o una célula humana.

Se proporcionan kits que comprenden el ácido nucleico de la invención y: un compartimento que comprende el ácido nucleico; un compartimento que comprende adicionalmente un polipéptido IL-B60 de primate; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

También se describen en la presente memoria métodos para formar un dúplex con un polinucleótido descrito antes, que comprenden poner en contacto el polinucleótido con una sonda que hibrida, en condiciones restrictivas, con al menos 25 nucleótidos contiguos de la porción codificante del SEQ ID NO: 1, 3, o que codifica el SEQ ID NO: 12 o 13 maduros; formándose de ese modo el dúplex.

También se describe en la presente memoria un ácido nucleico que: hibrida en condiciones de lavado de 30 minutos a 30ºC y sal menor de 2M con respecto a la porción codificante del SEQ ID NO: 1; o muestra identidad a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos con respecto a IL-B60 de primate. En realizaciones preferidas de la descripción, las condiciones de lavado son a 45ºC y/o sal 500 mM; o a 55ºC y/o sal 150 mM; o el tramo es de al menos 55 nucleótidos, p. ej., al menos 75 nucleótidos.

Se describen métodos p. ej., de modulación de la fisiología o el desarrollo de una célula o células de cultivo de tejidos que comprenden poner en contacto la célula con un agonista o antagonista de un IL-B60 de mamífero; o poner en contacto la célula con un agonista o antagonista de un complejo que comprende IL-B60 y CLF-1 de mamífero.

Adicionalmente, la invención proporciona un método in vitro para incrementar la secreción de: una secuencia IL-B60, que comprende expresar el polipéptido con CLF-1; o un CLF-1, que comprende expresar el CLF-1 con una secuencia de IL-B60. En realizaciones preferidas del método, el incremento es de al menos 3 veces, 5X, 7X, 10X, o más; o la expresión es de un ácido nucleico recombinante que codifica uno o ambos del polipéptido y el CLF-1.

También se describe un método de escrutinio en busca de un receptor que se une a un complejo soluble aislado que comprende la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4, y la porción proteica madura del SEQ ID NO: 12 o 13, que comprende poner en contacto el complejo con una célula que expresa el receptor en condiciones que permiten que el complejo se una al receptor, formándose de ese modo una interacción detectable. Preferiblemente, la interacción da como resultado una respuesta fisiológica en la célula.

También se describen en la presente memoria, p. ej., un complejo soluble aislado que comprende al menos 6 aminoácidos de la porción proteica madura del SEQ ID NO: 2 o 4, y: al menos 6 aminoácidos de la porción proteica madura del SEQ ID NO: 12 o 13; o al menos 6 aminoácidos de la porción proteica madura del CNTF-R. Tal complejo puede comprender, p. ej., un polipéptido recombinante del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro; comprender un polipéptido recombinante del SEQ ID NO: 12 o 13 maduro; comprender un polipéptido recombinante del CNTF-R maduro. Los complejos de la invención comprenden un polipéptido recombinante del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro, y un polipéptido recombinante del SEQ ID NO: 12 o 13 maduro; o comprenden un polipéptido recombinante del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro, y un polipéptido recombinante del CNTF-R maduro. Los complejos de la invención se pueden marcar detectablemente; estar en una disolución tamponada; o estar en una disolución estéril. Las realizaciones preferidas de la descripción incluyen aquellas que: comprenden un polipéptido IL-B60 maduro; comprenden un polipéptido CLF-1 maduro; comprenden un polipéptido CTNF-R maduro; muestran al menos cuatro segmentos no solapantes de al menos siete aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o 4; muestran epítopos de IL-B60 de primate y de CLF-1 de primate; muestran epítopos de IL-B60 de primate y de CNTF-R de primate. Los complejos de la invención pueden preferiblemente: no estar glucosilados; estar anclados a un sustrato sólido; estar conjugados con otro radical químico; o comprender una etiqueta de detección o purificación, incluyendo una secuencia FLAG, His6, o Ig.

Se proporcionan kits, p. ej, que comprenden el complejo y: un compartimento que comprende el complejo, y/o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

Se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden (a) el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13; o (b) el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y el polipéptido maduro de la cadena alfa de CNTF-R. También se describen en la presente memoria polipéptidos de fusión que incluyen, p. ej., un polipéptido aislado o recombinante que comprende: un primer segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4, y un segundo segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 12 o 13 maduro; al menos dos segmentos no solapantes distintos de al menos cinco aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro, y un tercer segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 12 o 13 maduro; al menos un segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro, y dos segmentos no solapantes distintos de al menos cinco aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 12 o 13 maduro; un primer segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4, y un segundo segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del CNTF-R de primate maduro; al menos dos segmentos no solapantes distintos de al menos cinco aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro, y un tercer segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del CNTF-R de primate maduro; o al menos un segmento que comprende al menos siete aminoácidos idénticos a los segmentos del SEQ ID NO: 2 o 4 maduro, y dos segmentos no solapantes distintos de al menos cinco aminoácidos idénticos a los segmentos del CNTF-R de primate maduro. Algunas realizaciones de la descripción incluyen aquellas en las que los segmentos de identidad no solapantes distintos: incluyen uno de al menos ocho aminoácidos; incluyen uno de al menos cinco aminoácidos y un segundo de al menos seis aminoácidos; incluyen al menos tres segmentos de al menos cuatro, cinco, y seis aminoácidos, o incluyen uno de al menos doce aminoácidos. Otras realizaciones de la descripción incluyen aquellas que: comprenden una secuencia de IL-B60 madura; comprenden una secuencia de CLF-1 madura; comprenden una secuencia de CNTF-R madura; muestran al menos cuatro segmentos no solapantes de al menos siete aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o 4; tienen una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; muestran epítopos de IL-B60 de primate y CLF-1 de primate; muestran epítopos de IL-B60 de primate y CNTF-R de primate.

Las proteínas de fusión descritas en la presente memoria incluyendo la de la invención, incluyen realizaciones que no están glucosiladas; tienen un peso molecular de al menos 30 kD; son un polipéptido sintético; están ancladas a un sustrato sólido; están conjugados con otro radical químico; o comprenden una etiqueta de detección o purificación, incluyendo una secuencia FLAG, His6, o Ig.

También se describe en la presente memoria una composición que comprende: una combinación de IL-B60 y CLF-1 esencialmente pura; una combinación de IL-B60 y CNTF-R esencialmente pura; un polipéptido estéril descrito antes; o el polipéptido descrito antes y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, disolución salina, y/o tampón; y/o formulada para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral. Se proporciona un kit que comprende un polipéptido como se ha descrito, y: un compartimento que comprende el polipéptido; y/o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit.

También se proporcionan métodos, p. ej. para elaborar un anticuerpo que reconoce un complejo como se ha descrito, que comprende inducir una respuesta inmunitaria en un animal con el complejo; para inmunoseleccionar anticuerpos, que comprende poner en contacto una población de anticuerpos con un complejo como se ha descrito, y separar los anticuerpos que se unen de los que no se unen; o para formular una composición, que comprende mezclar un complejo como se ha descrito con un portador.

Los compuestos de unión de la invención son los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Tales anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno se unen específicamente a un complejo descrito, pero no a cualquiera de los polipéptido maduros del SEQ ID NO: 2, 4, 12, 13, o CNTF-R. Algunas realizaciones incluyen aquellas en las que: el compuesto de unión: está en un recipiente; es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; o está conjugado con otro radical químico; o el anticuerpo: está originado contra un complejo de IL-B60 con CLF-1 esencialmente puro; está originado contra un complejo de IL-B60 con CNTF-R esencialmente puro; está inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; muestra una Kd con respecto al antígeno de al menos 30 \muM; está anclado a un sustrato sólido, incluyendo una cuenta o membrana de plástico; está en una composición estéril; o está marcado detectablemente, incluyendo una marca radiactiva o fluorescente. Las realizaciones adicionales incluyen una composición que comprende: un compuesto de unión estéril como se ha descrito, o el compuesto de unión como se ha descrito y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, disolución salina, y/o tampón; y/o formulado para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral.

Con la composición de unión se proporcionan en esta invención un kit que comprende el compuesto de unión, esto es un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno, como se define en las reivindicaciones adjuntas y: un compartimento que comprende el compuesto de unión; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit. También se proporcionan métodos para producir un complejo de antígeno:anticuerpo, que comprende poner en contacto en condiciones apropiadas un complejo de primate que comprende: polipéptidos IL-B60 y CLF-1; o polipéptidos IL-B60 y CNTF-R; con un anticuerpo como se ha descrito, permitiéndose de ese modo que se forme el complejo. Preferiblemente, en el método, el complejo se purifica a partir de otras citoquinas; el complejo se purifica a partir de otro anticuerpo; el contacto es con una muestra que comprende una citoquina; el contacto permite la detección cuantitativa del antígeno; el contacto es con una muestra que comprende el anticuerpo; o el contacto permite la detección cuantitativa del anticuerpo.

Se describen diferentes ácido nucleicos p. ej., un ácido nucleico aislado o recombinante: que codifica las porciones de aminoácidos descritas antes; que codifica las porciones de aminoácidos como se ha descrito, y que comprenden un segmento al menos 30 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 1 o 3; que coexpresará un segmento de al menos siete aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 2 o 4, y un segmento de al menos siete aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 12 o 13; o que coexpresará un segmento de al menos siete aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 2 o 4, y un segmento de al menos siete aminoácidos contiguos del CNTF-R. También se describen ácidos nucleicos incluyendo aquellos que, p. ej.: codifican IL-B60 de un ser humano; codifican CLF-1 de un ser humano; codifican CNTF-R de un ser humano; son un vector de expresión; comprenden adicionalmente un origen de replicación; comprenden una marca detectable; comprenden una secuencia de nucleótidos sintética; o tienen menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb. Se proporciona una célula que comprende el ácido nucleico recombinante, p. ej., donde la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate; o una célula humana. Se describen diferentes kits de ácido nucleico, p. ej., que comprenden el ácido nucleico y: un compartimento que comprende el ácido nucleico; un compartimento que comprende adicionalmente un polipéptido IL-B60 de primate; un compartimento que comprende adicionalmente un polipéptido CLF-1 de primate; un compartimento que comprende adicionalmente un polipéptido CNTF-R de primate; o instrucciones para el uso o la disposición de los reactivos en el kit. También se describen métodos, p. ej., para elaborar un ácido nucleico dúplex, que comprende poner en contacto tal ácido nucleico con un ácido nucleico complementario en condiciones apropiadas, formándose de ese modo dicho dúplex; para expresar un polipéptido, que comprende expresar el ácido nucleico, produciéndose de ese modo el polipéptido; o para transfectar una célula, que comprende poner en contacto dicha célula en condiciones apropiadas con el ácido nucleico, transfectándose de ese modo la célula.

En una realización alternativa de esta descripción, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica al menos 5 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 12, 13, o CNTF-R de primate y: hibrida en condiciones de lavado de 30 minutos a 30ºC y sal menos de 2M con la porción codificante del SEQ ID NO: 1; o muestra identidad a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de un IL-B60 de primate. Las realizaciones preferidas de la descripción incluyen: el ácido nucleico aislado, donde: los aminoácidos contiguos suman al menos 8; las condiciones de lavado son a 45ºC y/o sal 500 mM; o el tramo tiene al menos 55 nucleótidos; o el ácido nucleico recombinante, donde: los aminoácidos contiguos suman al menos 12; las condiciones de lavado son a 55ºC y/o sal 150 mM; o el tramo tiene al menos 75 nucleótidos.

También se describen en la presente memoria métodos para modular la fisiología o el desarrollo de una célula o células de cultivo de tejidos que comprenden poner en contacto la célula con un agonista o antagonista de un complejo que comprende IL-B60 de mamífero y: CLF-1; o CNTF-R. La invención también proporciona métodos para producir las proteínas, p. ej., producir un complejo descrito, que comprende coexpresar un IL-B60 recombinante con un CLF-1 o CNTF-R recombinante; aumentar la secreción de un polipéptido IL-B60 que comprende expresar el polipéptido con CLF-1 o CNTF-R; o aumentar la secreción de un polipéptido CLF-1, que comprende expresar el CLF-1 con un IL-B60. Típicamente, el aumento es de al menos 3 veces; o la expresión es de un ácido nucleico recombinante que codifica uno o ambos del polipéptido y CLF-1.

También se describen métodos de escrutinio en busca de un receptor que se une al complejo descrito, que comprende poner en contacto el complejo con una célula que expresa el receptor en condiciones que permiten que el complejo se una al receptor, formándose de ese modo una interacción detectable. Preferiblemente, la interacción da como resultado una respuesta fisiológica en la célula.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. General

La presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y secuencias de ADN que codifican diferentes proteínas de mamífero que son citoquinas, p. ej., que son moléculas secretadas que pueden mediar una señal entre las células inmunitarias u otras. Véase, p. ej., Paul (1998) Fundamental Immunology (4^{a} ed.) Raven Press, N.Y. Las citoquinas completas, y los fragmentos, o antagonistas serán útiles, p. ej., en la modulación fisiológica de las células que expresan un receptor. Es probable que IL-B60 tenga efectos estimuladores o inhibidores sobre las células hematopoyéticas, incluyendo, p. ej., células linfoides, tales como las células T, las células B, las células asesinas naturales ("NT" en sus siglas en Inglés), los macrófagos, las células dendríticas, los progenitores hematopoyéticos, etc. Las proteínas también serán útiles como antígenos, p. ej., inmunógenos, para originar anticuerpos contra diferentes epítopos de la proteína, epítopos tanto lineales como conformacionales.

Se identificó una secuencia que codifica IL-B60 a partir de una secuencia genómica humana. La molécula se denominó huIL-B60. También se describe una secuencia de roedor, p. ej., de ratón.

El gen humano codifica una proteína de tipo citoquina soluble pequeña, de aproximadamente 198 aminoácidos. La secuencia señal pronosticada psort probablemente tiene aproximadamente 17 restos, e iría de Met a aproximadamente Ala. Véanse la Tabla 1 y los SEQ. ID. NO: 1 y 2. IL-B60 muestra motivos estructurales característicos de un miembro de las citoquinas de cadena larga. Comparar, p. ej., las secuencias de IL-B60, G-CSF, e IL-6, disponibles de GenBank. El emparejamiento más próximo es con CT-1, oncostatina M, y CNTF. Véase también la Tabla 2.

TABLA 1 Ácido nucleico (SEQ ID NO:1) que codifica IL-B60 de un primate, p. ej., humano. Se indica el sitio de escisión de la señal pronosticado. El nucleótido 375 puede ser A. La secuencia de aminoácidos traducida es el SEQ ID NO:2

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TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 1 (continuación)

3

4

TABLA 2 Comparación de las realizaciones de primate y roedor de IL-B60, secuencias tanto de nucleótidos como de aminoácidos

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TABLA 2 (continuación)

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TABLA 3 Comparación de diversas citoquinas comparadas con IL-B60. IL-B60 de humano es el SEQ ID NO:2; IL-B60 de ratón es el SEQ ID NO:4; LIF de ratón (mLIF) es el SEQ ID NO:5 y el Número de acceso X06381; LIF humano (hLIF) es el SEQ ID NO:6 y los Números de acceso M63420 J05436; CT-1 humano (hCT-1) es el SEQ ID NO: 7 y el Número de acceso U43030: CT-1 de ratón (mCT-1) es el SEQ ID NO: 8 y el Número de acceso U18366; CNTF humano (hCNTF) es el SEQ ID NO: 9 y el Número de acceso X60542: CNTF de ratón (mCNTF) es el SEQ ID NO: 10 y el Número de acceso U05342; ADNX IL-40 humano (hDIL-40) es el SEQ ID NO: 11

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TABLA 3 (continuación)

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La homología estructural de IL-B60 con proteínas citoquinas relacionadas sugiere la función relacionada de esta molécula. IL-B60 es una citoquina de cadena larga que muestra una similitud de secuencia con IL-6 y G-CSF.

Los agonistas, o los antagonistas de IL-B60, pueden actuar también como antagonistas funcionales o de receptores, p. ej., que bloquean IL-6 o G-CSF uniéndose a sus respectivos receptores, o mediando las acciones opuestas. De este modo, IL-B60, o sus antagonistas, pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones médicas anómalas, incluyendo trastornos inmunitarios, p. ej., deficiencias inmunitarias de células T, inflamación crónica, o rechazo de tejidos, o en condiciones cardiovasculares o neurofisiológicas.

Los antígenos naturales son capaces de mediar diferentes respuestas bioquímicas que conducen a respuestas biológicas o fisiológicas en células diana. La realización preferida caracterizada en la presente memoria es de ser humano, pero existen en la naturaleza otras contrapartes de primate, de otras especies. También deben estar disponibles secuencias adicionales para proteínas en otras especies de mamíferos, p. ej., primates, cánidos, félidos, y roedores. Véase más abajo. Las descripciones de más abajo están dirigidas, con fines ilustrativos, a una IL-B60 humana, pero son aplicables igualmente a realizaciones relacionadas de otras especies.

En concreto, se ha confirmado la asociación de IL-B60 con un compañero. Las moléculas de IL-B60 y CLF-1 han evolucionado juntas probablemente, reflejándose en su homología entre especies. Por ejemplo, la coevolución de su función es sugerida por la observación de que la relación ser humano/ratón de IL-B60 es muy próxima, como lo es la de CLF-1 de ser humano/ratón. Si los dos se asocian funcionalmente, podrían actuar juntos a la manera de IL-12. Véanse, p. ej., Trinchieri (1998) Adv. Immunol. 70:83-243; Gately, et al.(1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495-521; y Trinchieri (1998) Int. Rev. Immunol. 16:365-396.

Como complejo, no obstante, interactuará con dos receptores largos de la familia de receptores de citoquinas, p. ej., gp130, LIF-R, OSM-R, IL-12Rb1, IL-12Rb2, y NR30. Estos receptores se someterán a ensayo en busca de la unión al complejo soluble. Se han construido una serie de células BAF/3 que expresan establemente varios de estos receptores largos.

Los sobrenadantes de los transfectantes de IL-B60 y de CLF-1 (o un constructo combinado sencillo) en la misma célula, se utilizará para someter a ensayo estas diferentes células BAF/3 para ver si existe una respuesta de señalización proliferativa o diferente. Como tales, la mayoría de los efectos fisiológicos de la citoquina pueden estar debidos al complejo de las proteínas. Como tales, muchas de las descripciones de más abajo de la biología resultante de la citoquina pueden ser efectuadas realmente fisiológicamente por el complejo que comprende la combinación de las subunidades.

La Tabla 4 proporciona las secuencias del compañero de IL-B60, conocido como CLF-1. La subunidad alfa del receptor de CNTF (CNTF-R) fue descrita, p. ej., por Davis, et al. (1991) Science 253:59-63. Véanse también los números de acceso GenBank NM1001842 y M73238 (ser humano); AF068615 (ratón); y S54212 (rata).

TABLA 4 Alineamiento del Factor 1 de tipo Citoquina (CLF-1; SEQ ID NO: 12 y 13) humano y de ratón. Véase Elson, et al. (1998) J. Immunol. 161:1371-1379; Número de Acceso GenBank AF059293 y NM_004750; también descrito por Douglas J. Hilton (Australia) en la publicación WO9920755. Secuencia señal referida de 37 aminoácidos de la forma humana, escisión en GSG/AHT

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Los dominios convencionales de la secuencia del receptor de CLF-1 humano corresponden aproximadamente a: una señal de 1 a aproximadamente 38; primer dominio de tipo IG de aproximadamente el resto 39 a 130; un segundo dominio de aproximadamente 131 a aproximadamente 237; y el último de aproximadamente 238 hasta el final.

Las descripciones de más abajo se pueden aplicar también a CLF-1, o al complejo de IL-B60/CLF-1. Se puede construir una fusión de IL-B60 con CLF-1, como, p. ej., hyper-IL-6. Véanse, p. ej., Fischer, et al. (1997) Nature Biotechnol. 15:142-145; Rakemann, et al. (1999) J. Biol, Chem. 274:1257-1266; y Peters, et al.(1998) J. Immunol. 161:3575-3581.

El descubrimiento original y la caracterización molecular de CNTF como un potente factor de supervivencia para las células neuronales (véanse, p. ej., Hughes, et al. (1988) Nature 335:70-73; y Stockli, et al. (1989) Nature 342:920-923) sugirieron un uso terapéutico futuro como una molécula que podría reparar rápidamente neuronas motoras dañadas o divididas (Sendtner, et al. (1990) Nature 345:440-441; y Curtis, et al. (1993) Nature 365:253-256) o prevenir la degeneración nerviosa (Sendtner, et al. (1992) Nature 358:502-504; Emerich, et al. (1997) Nature 386:395-399; y Gravel, et al. (1997) Nature Med. 3:765-770). No obstante, el CNTF es singularmente una proteína sin un péptido señal secretor, y no parece escapar de la célula (Stockli, et al., ídem); además, las interrupciones diseñadas mediante ingeniería genética (Masu, et al. (1993) Nature 365:27-32) o de origen natural (Takahashi, et al. (1994) Nature Genet. 7:79-84) del gen CNTF no son perjudiciales. En contraste, las interrupciones del gen del receptor primario para el CNTF (CNTF-R\alpha) se mostraron letales inmediatamente después del nacimiento. DeChiara, et al. (1995) Cell 83:313-322). Juntas, estas observaciones apuntan a la existencia de un segundo ligando para CNTF-R\alpha que es sensible fisiológicamente a las acciones observadas in vitro, o deseadas in vivo, del CNTF. Este trabajo demuestra que es probable que la citoquina compuesta IL-B60/CLF-1 sea este factor codiciado que es crítico evolutivamente, es secretado desde órganos diana y dirige su inervación por neuronas motoras, así como terapéuticamente prometedor, puesto que la transección nerviosa da como resultado una inducción rápida y a largo plazo de IL-B60 y de CLF-1, indicando un papel para el complejo en la regeneración. En apoyo de este modelo, la interrupción génica de CLF-1 (Alexander, et al. (1999) Curr. Biol. 9:605-608) es bastante similar en fenotipo a la desactivación de CNTF-R\alpha.

En una peculiaridad curiosa, si bien IL-B60 tiene un péptido señal, su secreción queda críticamente dependiente de la formación del complejo con CLF-1, como se ha descrito. Una vez secretado, IL-B60 señaliza a través de un sistema receptor tripartito que por otra parte es idéntico al de CNTF, que consiste en dos componentes transductores de la señal expresados ubícuamente gp130 y LIF-R, y el receptor determinante de la especificidad, CNTF-R\alpha. De modo sorprendente, el papel de CLF-1 parece estar restringido al de una chaperona, puesto que se descarta del complejo de señalización después de la liberación de IL-B60 a CNTF-R\alpha; por supuesto, el requerimiento de CLF-1 se puede evitar fusionando IL-B60 directamente con una forma soluble de la cadena CNTF-R\alpha. Las tres cadenas proteicas implicadas en este sistema novedoso, IL-B60, CLF-1, y CNTF-R\alpha, representan las secuencias más altamente conservadas de la superfamilia de citoquinas/receptores hematopoyéticos, indicando una interacción evolutivamente crítica. Además, el uso condicional de un receptor hematopoyético como factor de secreción y acompañamiento presenta un paradigma novedoso para la actividad de las citoquina.

En resumen, este trabajo da luz a la función biológica entrelazada de dos moléculas huérfanas, IL-B60 y CLF-1, describiendo su compromiso novedoso con el complejo receptor del CNTF. Para hacerlo, los autores de la presente invención presentan el sólido argumento de que es la citoquina IL-B60/CLF-1 la que sirve como factor fisiológico clave en el desarrollo y la regeneración de las neuronas motoras.

II. IL-B60 o su complejo purificado

La secuencia de aminoácidos de IL-B60 humana purificada, se muestra, en una realización del SEQ ID NO: 2. Otros ácidos nucleicos de origen natural que codifican la proteína se pueden aislar mediante procedimientos convencionales utilizando la secuencia proporcionada, p. ej., técnicas de PCR, o mediante hibridación. Estas secuencias de aminoácidos, proporcionadas de amino a carboxi, son importantes al proporcionar información sobre la secuencia para la citoquina que permite distinguir el antígeno proteico de otras proteínas e ilustrar numerosas variantes. Por otra parte, las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer tales segmentos, y las secuencias de nucleótidos permiten la preparación de sondas oligonucleotídicas, ambas las cuales son estrategias de detección o aislamiento, p. ej., clonación, de genes que codifican tales secuencias.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "IL-B60 soluble humana" deberá abarcar, cuando se utilice en un contexto proteico, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido soluble del SEQ ID NO: 2. Sus fragmentos significativos a menudo conservarán funciones similares, p. ej., la antigenicidad. Las realizaciones preferidas de la descripción comprenden una pluralidad de segmentos distintos, p. ej., no solapantes, de la longitud especificada. Típicamente, la pluralidad será de al menos dos, más usualmente al menos tres, y preferiblemente 5, 7, o incluso más. Si bien se puede mencionar la longitud mínima, pueden ser apropiadas longitudes mayores, de diferentes tamaños, p. ej., una de longitud 7, y dos de longitud 12. Se aplican características similares a los polinucleótidos.

Los componentes de unión, p. ej., los anticuerpos, se unen típicamente a una IL-B60 con alta afinidad, p. ej., al menos aproximadamente 100 nM, usualmente más de aproximadamente 30 nM, preferiblemente más de aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente a lo sumo aproximadamente 3 nM. Las proteínas contraparte se encontrarán en especies de mamífero distintas de los seres humanos, p. ej., otros primates, ungulados, o roedores. Las especies que no son de mamífero también deben poseer genes y proteínas relacionadas estructuralmente o funcionalmente, p. ej., aves o anfibios.

En la presente memoria se describen polipéptidos que incluyen un fragmento o segmento significativo, y que abarcan un tramo de restos aminoácido de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente al menos aproximadamente 12 aminoácidos, típicamente al menos aproximadamente 16 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, y, en realizaciones particularmente preferidas de la descripción, al menos aproximadamente 30 aminoácidos o más, p. ej., 35, 40, 45, 50, etc. Tales fragmentos pueden tener extremos que comienzan y/o terminan virtualmente en todas las posiciones, p. ej., comenzando en los restos 1, 2, 3, etc., y finalizando, p. ej., en 150, 149, 148, etc., en todas las combinaciones prácticas. Los péptidos particularmente interesantes tienen extremos que corresponden a los límites del dominio estructural, p. ej., hélices A, B, C, y/o D. Véase la Tabla 1.

El término "composición de unión" hace referencia a moléculas que se unen con especificidad a IL-B60, p. ej., en una interacción anticuerpo-antígeno. La especificidad puede ser mayor o menor incluyendo, p. ej., específica para una realización concreta, o para grupos de realizaciones relacionadas, p. ej., primate, roedor, etc. El agotamiento o las absorciones pueden proporcionar las selectividades deseadas. También se proporcionan compuestos, p. ej., proteínas, que se asocian específicamente con IL-B60, incluyendo una interacción proteína-proteína relevante fisiológicamente natural, covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero, o reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula que tiene una forma molecular que interacciona con determinantes de unión apropiados. Los compuestos pueden servir como agonistas o antagonistas de una interacción de unión al receptor, véase, p. ej., Goodman, et al. (eds.) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (última ed.) Pergamon Press.

Esencialmente pura, p. ej., en un contexto proteico, significa típicamente que la proteína carece de otras proteínas, ácidos nucleicos, u otros agentes biológicos contaminantes derivados del organismo fuente original. La pureza se puede someter a ensayo mediante métodos convencionales, típicamente en peso, y será normalmente pura al menos aproximadamente en 40%, generalmente pura al menos en aproximadamente 50%, a menudo pura al menos en aproximadamente 60%, típicamente pura al menos en aproximadamente 80%, preferiblemente pura al menos en aproximadamente 90%, y en las realizaciones más preferidas, pura al menos en aproximadamente 95%. Con frecuencia se añadirán portadores o excipientes.

La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, en entorno de electrolitos, las características de tamaño y moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la que se utiliza el polipéptido oscila de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Usualmente la temperatura de uso es mayor de aproximadamente 18ºC. Con fines diagnósticos, la temperatura será usualmente de aproximadamente la temperatura ambiente o más caliente, pero menos de la temperatura de desnaturalización de los componentes del análisis. Con fines terapéuticos, la temperatura será usualmente la temperatura corporal, típicamente de aproximadamente 37ºC para los seres humanos y los ratones, aunque en algunas situaciones la temperatura puede aumentar o disminuir in situ o in vitro.

El tamaño y la estructura del polipéptido deben estar generalmente en un estado esencialmente estable, y usualmente no en estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, p. ej., para conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes.

El disolvente y los electrolitos serán usualmente un tampón biológicamente compatible, de un tipo utilizado para la conservación de las actividades biológicas, y usualmente estarán aproximados a un disolvente acuoso fisiológico. Usualmente el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirán uno o más detergentes, típicamente uno no desnaturalizante suave, p. ej., CHS (hemisuccinato de colesterol) o CHAPS (sulfonato de 3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano), o una concentración suficientemente baja para evitar la desorganización significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína. En otros casos, se puede utilizar un detergente fuerte para efectuar una desnaturalización significativa.

De acuerdo con esta descripción, un polipéptido IL-B60 que se une específicamente a o que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo, p. ej., tal como un anticuerpo policlonal, generado contra un inmunógeno definido, p. ej., tal como un inmunógeno que consiste en una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o un polipéptido generado a partir del ácido nucleico del SEQ ID NO: 1 es determinado típicamente en un
inmunoanálisis.

También se describen en la presente memoria las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria, incluyendo las variantes funcionales, que codifican los polipéptidos que se unen selectivamente a los anticuerpos policlonales generados contra el polipéptido IL-B60 prototípico como se define estructuralmente y funcionalmente en la presente memoria. En el inmunoanálisis se utiliza típicamente un antisuero policlonal que se originó, p. ej., contra una proteína del SEQ ID NO: 2. Este antisuero se selecciona, o se agota, para tener reactividad cruzada baja contra otros miembros de la familia estrechamente relacionada apropiados, preferiblemente de la misma especie, y cualquier reactividad cruzada se elimina mediante inmunoabsorción o agotamiento antes de su uso en el inmunoanálisis. Las preparaciones de suero selectivas apropiadas se pueden aislar, y caracterizar.

Con el fin de producir antisueros para su uso en un inmunoanálisis, la proteína, p. ej., del SEQ ID NO: 2, se aísla como se ha descrito en la presente memoria. Por ejemplo, la proteína recombinante se puede producir en una línea celular de mamífero. Un anfitrión apropiado, p. ej., una cepa endogámica de ratón tal como Balb/c, se inmuniza con la proteína del SEQ ID NO: 2 utilizando un coadyuvante convencional, tal como coadyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón convencional (véase Harlow y Lane). Alternativamente, se puede utilizar como inmunógeno un péptido sintético esencialmente completo derivado de las secuencias descritas en la presente memoria. Los sueros policlonales se recogen y se titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoanálisis, p. ej., un inmunoanálisis en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor se seleccionan y se someten a ensayo en busca de su reactividad cruzada contra otros miembros de la familia estrechamente relacionados, p. ej., LIF, CT-1, CNTF, DIL-40, u otros miembros de la familia IL-6, utilizando un inmunoanálisis de unión competitiva como el descrito por Harlow y Lane, supra, en la páginas 570-573. Preferiblemente se utilizan al menos dos miembros de la familia IL-6/IL-12 en esta determinación junto con la diana. Estos miembros de la familia de citoquinas de cadena larga se pueden producir en forma de proteínas recombinantes y aislar utilizando técnicas de biología molecular y química de proteínas convencionales como se ha descrito en la presente memoria. De este modo, se pueden identificar o producir preparaciones de anticuerpo que tienen la selectividad o especificidad deseadas para los subgrupos de miembros de la familia de IL-B60. En la invención, se pueden preparar anticuerpos que se unen al complejo que comprende IL-B60 con CLF-1 o IL-B60 con la cadena alfa de CNTF-R, pero no a estos polipéptidos cuando no son parte del complejo.

Los inmunoanálisis en el formato de unión competitiva se pueden utilizar para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína del SEQ ID NO: 2 se puede inmovilizar en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al análisis compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína del SEQ ID NO: 2. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores, utilizando cálculos convencionales. Los antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas enumeradas antes se seleccionan y se reúnen. Los anticuerpos que presentan reacción cruzada se separan después de los antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con las proteínas enumeradas antes.

Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se utilizan después en un inmunoanálisis de unión competitiva como se ha descrito antes para comparar una segunda proteína respecto a la proteína inmunógeno. Con el fin de realizar esta comparación, cada una de las dos proteínas se analiza en un amplio rango de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida tiene menos de dos veces la cantidad de la proteína que se requiere de, p. ej., el SEQ ID NO: 2, se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.

III. Variantes Físicas

También se describen en la presente memoria proteínas o péptidos que tienen una identidad de la secuencia de aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos del antígeno IL-B60. Las variantes incluyen variantes de especie, polimórficas, o alélicas.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o la identidad de la secuencia, se determina optimizando los emparejamientos de los restos, si fuera necesario, introduciendo los intervalos sin información que se requieran. Véanse también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol, 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Capítulo uno en Time Warps, String Edits, y Macromolecules: The Theory y Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de soporte lógico de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin, Madison, WI. La identidad de la secuencia cambia en cuando se consideran las sustituciones conservativas como emparejamientos. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente sustituciones en los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. La conservación se puede aplicar a las características biológicas, las características funcionales, o las características estructurales. Se pretende que las secuencias de aminoácidos homólogas típicamente incluyan variaciones polimórficas o alélicas e interespecíficas naturales de una secuencia de proteína. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una identidad de 25-100% (se pueden introducir intervalos sin información), a una identidad de 50-100% (si se incluyen las sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de IL-B60. Las mediciones de identidad serán de al menos aproximadamente 35%, generalmente al menos aproximadamente 40%, a menudo al menos aproximadamente 50%, típicamente al menos aproximadamente 60%, usualmente al menos aproximadamente 70%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90%.

El ADN de IL-B60 aislado se puede modificar fácilmente mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones de tramos cortos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado secuencias de ADN novedosas que codifican estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunogénica, antigénica, u otra actividad funcional similar. Estas secuencias modificadas se pueden utilizar para producir antígenos mutantes o para aumentar la expresión. El aumento de expresión puede implicar amplificación génica, aumento de transcripción, aumento de traducción, y otros mecanismos. El "IL-B60 mutante" abarca un polipéptido que por otra parte se encuentra en la definición de la secuencia de identidad de IL-B60 como se ha mostrado antes, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de IL-B60 como se encuentra normalmente en la naturaleza, sea por medio de deleción, sustitución, o inserción. Esto generalmente incluye proteínas que tienen una identidad significativa con una proteína que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 2, y comparte diferentes actividades biológicas, p. ej. antigénica o inmunogénica, con esas secuencias, y en realizaciones preferidas de la descripción contiene la mayoría de las secuencias descritas completas naturales. Se preferirán típicamente las secuencias completas, aunque también serán útiles las versiones truncadas, asimismo, los genes o las proteínas encontradas de fuentes naturales son típicamente las más deseadas. Se aplican conceptos similares a diferentes proteínas IL-B60, particularmente aquellas encontradas en diferentes animales de sangre caliente, p. ej., mamíferos y aves. Se entiende generalmente que estás descripciones abarcan todas las proteínas IL-B60, sin limitarlas a las realizaciones concretas de primate estudiadas específicamente.

La mutagénesis de IL-B60 también se puede llevar a cabo realizando inserciones o deleciones de aminoácidos. Se pueden generar sustituciones, deleciones, inserciones, o combinaciones cualesquiera para llegar a un constructo final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi-terminales. La mutagénesis al azar se puede llevar a cabo en un codón diana y los mutantes expresados se pueden escrutar después en busca de la actividad deseada. Los métodos para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante técnicas de mutagénesis con el cebador de M13 o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véanse, p. ej., Sambrook, et al. (1989); Ausubel, et al. (1987 y Suplementos); y Kunkel, et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382. Las realizaciones preferidas de la descripción incluyen, p. ej., sustituciones de 1 vez, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 7 veces, etc., preferiblemente sustituciones conservativas a niveles de nucleótido o aminoácido. Preferiblemente las sustituciones estarán lejos de las cisteínas conservadas, y a menudo estarán en las regiones lejanas a los dominios estructurales helicoidales. Tales variantes pueden ser útiles para producir anticuerpos específicos, y a menudo compartirán muchas o todas las propiedades biológicas. Véase la Tabla 2. El reconocimiento de la estructura de las citoquinas proporciona una percepción importante en la estructura y las posiciones de restos que se pueden modificar para efectuar los cambios deseados en la interacción con el receptor. Asimismo, la interacción de IL-B60 con la proteína CLF-1 requiere características estructurales complementarias en la superficie
interaccionante.

La presente invención también proporciona proteínas recombinantes como se define en las reivindicaciones adjuntas. También se describen en la presente memoria proteínas de fusión heterólogas que utilizan segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no se fusionan normalmente de la misma manera. Se aplica un concepto similar a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Además, se pueden realizar nuevos constructos de la combinación de dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, la diana de unión u otros segmentos se pueden "intercambiar" entre nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión diferentes. Véanse, p. ej., Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra, Letts, 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Se obtendrá a menudo un fragmento de doble hebra sintetizando la hebra complementaria o hibridando la hebra en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada, p. ej., técnicas de PCR.

Se puede aplicar un análisis estructural a este gen, en comparación con la familia de citoquinas de IL-6. La familia incluye, p. ej., IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, y Ob. El alineamiento de las secuencias de IL-B60 humana y de ratón con otros miembros de la familia de IL-6 deberá permitir la definición de las características estructurales. En concreto, los restos de la lámina \beta y la hélice \alpha se pueden determinar utilizando, p. ej., el programa RASMOL, véanse Bazan, et al. (1996) Nature 379:591; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269. Véase también, Wilkins, et al. (eds. 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY. Los restos preferidos para las sustituciones incluyen los restos expuestos de la superficie que se podría pronosticar que interactúan con el receptor. Otros restos que deberán conservar la función serán los de las sustituciones conservativas, particularmente en una posición lejana de los restos expuestos de la superficie.

IV. Variantes Funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a los IL-B60 puede dar como resultado la inhibición competitiva de la unión del ligando a su receptor.

En los análisis in vitro descritos en la presente memoria se utilizarán a menudo la proteína aislada, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión al receptor de estas proteínas, o fragmentos anclados a sustratos en fase sólida. Estos análisis también permitirán la determinación diagnóstica de los efectos de cualquier mutación y modificación del segmento de unión, o mutaciones y modificaciones de la citoquina, p. ej., análogos de IL-B60.

También se describen en la presente memoria análisis de escrutinio de fármacos competitivos, p. ej., cuando los anticuerpos neutralizadores de la citoquina, o los fragmentos de unión al receptor compiten con un compuesto de ensayo.

Los "derivados" de los antígenos de IL-B60 incluyen secuencias de aminoácidos mutantes de las formas de origen natural, variantes por glucosilación, y productos conjugados covalentes o agregados con otros radicales químicos. Los derivados covalentes se pueden preparar mediante unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en cadenas laterales de aminoácidos de IL-B60 o en el extremo N- o C-, p. ej., mediante métodos convencionales. Véanse, p. ej., Lundblad y Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, vols. 1-2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (ed. 1989) Techniques in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, CA; y Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL.

En concreto, se incluyen las alteraciones por glucosilación, p. ej., realizadas modificando los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y maduración, o en etapas de maduración adicionales. Véase, p. ej., Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497-534. También están abarcadas versiones de los péptidos con la misma secuencia primaria de aminoácidos que tienen otras modificaciones mínimas, incluyendo restos aminoácido fosforilados, p. ej., fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina.

Según se define en las reivindicaciones adjuntas, también se proporcionan polipéptidos de fusión entre los IL-B60 y otras proteínas homólogas o heterólogas. Muchos receptores de citoquinas u otras proteínas de superficie son entidades multiméricas, p. ej., homodiméricas, y un constructo de repetición puede tener diferentes ventajas, incluyendo disminución de la susceptibilidad a la escisión proteolítica. Los ejemplos típicos son las fusiones de un polipéptido indicador, p. ej., luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, p. ej., un segmento de unión al receptor, de manera que la presencia o localización del ligando fusionado se puede determinar fácilmente. Véase, p. ej., Dull, et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.859.609. Otros compañeros de fusión génica incluyen \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol deshidrogenasa, factor de emparejamiento alfa de levadura, y etiquetas de detección o purificación tales como una secuencia FLAG de la secuencia His6. Véase, p. ej., Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.

Los péptidos de fusión se elaborarán típicamente mediante métodos de ácido nucleico recombinante o mediante métodos de síntesis de polipéptidos. Las técnicas para la manipulación y expresión de ácidos nucleicos son descritas generalmente, p. ej., por Sambrook, et al. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^{a} ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y Ausubel, et al. (eds. 1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene y Wiley, NY. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos son descritas, p. ej., por Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Grant (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman, NY. Los métodos de replegamiento pueden ser aplicables a las proteínas sintéticas.

Esta invención también contempla el uso de derivados de proteínas IL-B60 distintos de las variaciones de la secuencia de aminoácidos o la glucosilación. Tales derivados pueden implicar la asociación covalente o agregativa con radicales químicos o portadores proteicos. Los derivados covalentes o agregativos serán útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoanálisis, o en métodos de purificación tales como la purificación por afinidad de compañeros de unión, p. ej., otros antígenos. Se puede inmovilizar un IL-B60 mediante unión covalente a un soporte sólido tal como SEFAROSA activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, o adsorbido sobre superficies poliolefínicas, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para su uso en el análisis o la purificación de anticuerpos anti-IL-B60 o una composición de unión alternativa. Las proteínas IL-B60 se pueden marcar también con un grupo detectable, p. ej., para su uso en análisis diagnósticos. La purificación de IL-B60 se puede efectuar mediante un anticuerpo inmovilizado o un compañero de unión complementario, p. ej., una porción de unión de un receptor.

Como se ha descrito en la presente memoria, se puede utilizar un IL-B60 solubilizado o fragmento como inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos para la unión. El antígeno purificado se puede utilizar para escrutar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno, abarcando fragmentos de unión a antígenos de anticuerpos naturales, p. ej., Fab, Fab', F(ab)_{2}, etc. Los antígenos IL-B60 purificados se pueden utilizar también como reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados de la citoquina, que pueden ser diagnósticos de una condición fisiológica o de enfermedad anómala o específica. También se describen en la presente memoria anticuerpos originados contra las secuencias de aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, o fragmentos de proteínas que lo contienen. En concreto, en la presente memoria se describen anticuerpos que tienen afinidad unión a, o que están originados contra, dominios específicos, p. ej., hélices A, B, C, o D de IL-B60, o los dominios Ig de CLF-1.

También se describe en la presente memoria el aislamiento de variantes de especies estrechamente relacionadas adicionales. Los análisis de transferencia Southern y Northern establecerán que existen entidades genéticas similares en otros mamíferos. Es probable que los IL-B60 estén ampliamente extendidos en variantes de especie, p. ej., roedores, lagomorfos, carnívoros, artiodáctilos, perisodactilos, y primates.

También se describen en la presente memoria los medios para aislar un grupo de antígenos relacionados que presentan diferencias y similitudes en la estructura, la expresión, y la función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de las moléculas resultará enormemente acelerada por el aislamiento y la caracterización de especies distintas adicionales o variantes polimórficas de ellas. En concreto, se describen sondas útiles para identificar entidades genéticas homólogas adicionales en diferentes especies.

Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de un IL-B60, p. ej., ya sean tipos de especies o células que carecen de las proteínas correspondientes y muestran una actividad del fondo negativa. Esto debe permitir el análisis de la función de IL-B60 en comparación con las células de control no transformadas.

La disección de los elementos estructurales críticos que efectúan las diferentes funciones fisiológicas mediadas a través de estos antígenos es posible utilizando técnicas convencionales de biología molecular moderna, particularmente comparando miembros de clases relacionadas. Véase, p. ej., la técnica de mutagénesis de escrutinio de homólogos descrita por Cunningham, et al. (1989) en Science 243:1339-1336; y los enfoques utilizados por O'Dowd, et al. (1988) en J. Biol, Chem. 263:15985-15992; y Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9:4381-4390.

Las funciones intracelulares podrían implicar probablemente la señalización del receptor. No obstante, se puede producir la internalización de la proteína bajo ciertas circunstancias, y se puede producir la interacción entre los componentes intracelulares y la citoquina. Los segmentos de interacción específicos de IL-B60 con los componentes interaccionantes se pueden identificar mediante mutagénesis o métodos bioquímicos directos, p. ej., métodos de entrecruzamiento o afinidad. También serán aplicables análisis estructurales mediante métodos cristalográficos u otros métodos físicos. La investigación adicional del mecanismo de transducción de la señal incluirá el estudio de los componentes asociados que pueden ser aislables mediante métodos de afinidad o mediante métodos genéticos, p. ej., análisis de complementación de mutantes.

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Se buscará el estudio adicional de la expresión y el control de IL-B60. Los elementos de control asociados con los antígenos deberán mostrar patrones de expresión fisiológicos, evolutivos, específicos de tejido, u otros diferenciales. Tienen interés las regiones genéticas aguas arriba o aguas abajo, p. ej., elementos de control.

Los estudios estructurales de los antígeno de IL-B60 conducirán al diseño de nuevos antígenos, particularmente análogos que muestran propiedades agonísticas o antagónicas sobre la molécula. Esto se puede combinar con los métodos de escrutinio descritos previamente para aislar los antígenos que muestran el espectro de actividades deseado.

V. Anticuerpos

Los anticuerpos se pueden originar contra diferentes epítopos de las proteínas IL-B60, incluyendo variantes de especie, polimórficas, o alélicas, y sus fragmentos, tanto en sus formas de origen natural como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, los anticuerpos se pueden originar contra los IL-B60 tanto en sus formas activas como en sus formas inactivas, incluyendo las versiones nativas o desnaturalizadas. También se contemplan los anticuerpos anti-idiotípicos.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y las versiones de cadena sencilla, contra fragmentos predeterminados de los antígenos se pueden originar mediante inmunización de animales con productos conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden escrutar en busca de la unión a los IL-B60 normales o defectuosos, o escrutar en busca de actividad agonística o antagónica, p. ej., mediada a través de un receptor. Los anticuerpos pueden ser agonísticos o antagónicos, p. ej., bloqueando estéricamente la unión a un receptor. Estos anticuerpos monoclonales se unirán usualmente con al menos una K_{D} de aproximadamente 1 mM, más usualmente al menos aproximadamente 300 \muM, típicamente al menos aproximadamente 100 \muM, más típicamente al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 \muM o mejor.

Los anticuerpos de esta invención pueden ser también útiles en aplicaciones diagnósticas. Como anticuerpos de captura o no neutralizadores, se pueden escrutar en busca de su capacidad para unirse a los antígenos sin inhibir la unión al receptor. Como anticuerpos neutralizadores, pueden ser útiles en análisis de unión competitiva. También serán útiles para detectar o cuantificar la proteína IL-B60 o sus receptores. Véanse, p. ej., Chan (ed. 1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds. 1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; y Ngo (ed. 1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N.Y. Las absorciones cruzadas u otros ensayos identificarán los anticuerpos que muestran diferentes espectros de especificidades, p. ej., especificidades de especie únicas o compartidas.

Adicionalmente, los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, de esta invención pueden ser potentes antagonistas que se unen al antígeno e inhiben la unión funcional, p. ej., a un receptor que puede lograr una respuesta biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizadores y se pueden acoplar a toxinas o radionúclidos de manera que cuando el anticuerpo se une al antígeno, se destruye la célula que lo expresa, p. ej., sobre su superficie. Adicionalmente, estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, directamente o indirectamente por medio de un conector, y puede efectuar la búsqueda de la diana para el fármaco.

Los fragmentos antigénicos se pueden unir a otros agentes, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para utilizarlos como inmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos se pueden fusionar o unir covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa ojo de cerradura, seralbúmina bovina, toxoide del tétano, etc. Véanse Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1, Academic Press, New York; y Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY, para las descripciones de los métodos de preparación de antisueros policlonales.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diferentes anfitriones mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de la técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se puede encontrar, p. ej., en Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4^{a} ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas allí; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2^{a} ed.), Academic Press, New York; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que estudia un método para generar anticuerpos monoclonales.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a una selección de colecciones de anticuerpos en vectores de fagos o similares. Véanse, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo, covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y son referidas extensamente en la literatura científica y de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, radicales fluorescentes, radicales quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes, que ilustran el uso de tales marcas incluyen las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Asimismo, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véanse Cabilly, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; Moore, et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.642.334; y Queen, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar también para la cromatografía de afinidad para el aislamiento de la proteína. Se pueden preparar columnas en las que los anticuerpos se unen a un soporte sólido. Véase, p. ej., Wilchek et al. (1984) Meth. Enzymol. 104:3-55. Por el contrario, la proteína se puede utilizar para el agotamiento o las absorciones cruzadas para preparar selectivamente composiciones de unión específicas.

Los anticuerpos originados contra cada IL-B60 también serán útiles para originar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles para detectar o diagnosticar diferentes condiciones inmunológicas relacionadas con la expresión de los respectivos antígenos.

VI. Ácidos Nucleicos

Las secuencias peptídicas descritas y los reactivos relacionados son útiles para detectar, aislar, o identificar un clon de ADN que codifica IL-B60, p. ej., de una fuente natural. Típicamente, serán útiles para aislar un gen de un mamífero, y se aplicarán procedimientos similares para aislar genes de otras especies, p. ej., animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de IL-B60 de la misma, p. ej., variantes polimórficas, u otras especies. Estarán disponibles varios enfoques diferentes para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado.

Las proteínas o polipéptidos purificados son útiles para generar anticuerpos mediante métodos convencionales, como se ha descrito antes. Los péptidos sintéticos o las proteínas purificadas se pueden presentar a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véanse, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press.

Por ejemplo, se podría utilizar una composición de unión específica para el escrutinio de una genoteca de expresión elaborada a partir de una línea celular que expresa un IL-B60. El escrutinio de la expresión intracelular se puede realizar mediante diferentes procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión se podrían utilizar para la purificación por afinidad o para clasificar las células que expresan la proteína de fusión de la superficie.

Los segmentos peptídicos se pueden utilizar también para pronosticar los oligonucleótidos apropiados para escrutar una genoteca. El código genético se puede utilizar para seleccionar los oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para el escrutinio. Véase, p. ej., el SEQ ID NO: 1. Combinados con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar los clones correctos de una genoteca. Las secuencias complementarias se utilizarán también como sondas, cebadores, o hebras antisentido. Algunos fragmentos deberán ser particularmente útiles, p. ej., acoplados a un vector anclado o a técnicas de PCR complementarias con poli-A o a ADN complementario de otros péptidos.

Esta invención puede implicar el uso de ADN aislado o, fragmentos para codificar un polipéptido IL-B60 correspondiente biológicamente activo, particularmente que carece de la porción que codifica las porciones no traducidas de la secuencia descrita. Además, también se describe en la presente memoria un ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activos y que es capaz de hibridar en condiciones apropiadas con las secuencias de ADN descritas en la presente memoria. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activos pueden ser un antígeno intacto, o un fragmento, y tienen una secuencia de aminoácidos descrita, p. ej., en el SEQ ID NO: 2, particularmente un polipéptido secretado, maduro. Adicionalmente, en la presente memoria se describe el uso de un ADN aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifica proteínas que muestran una alta identidad con un IL-B60 secretado. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', p. ej., promotores, intensificadores, señales de adición de poli-A, y otros. Alternativamente, la expresión se puede efectuar conectando operablemente un segmento codificante a un promotor heterólogo, p. ej., insertando un promotor aguas arriba de un gen endógeno.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, p. ej., un ARN, ADN, o un polímero mixto, que está separado esencialmente de otros componentes que acompañan naturalmente a una secuencia nativa, p. ej., ribosomas, polimerasas, y/o secuencias genómicas flanqueantes de las especies de origen. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido retirada de su entorno de origen natural, e incluye productos aislados de ADN recombinante o clonado y de análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula esencialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula. Generalmente, el ácido nucleico estará en un vector o fragmento de menos de aproximadamente 50 kb, usualmente menos de aproximadamente 30 kb, típicamente menos de aproximadamente 10 kb, y preferiblemente menos de aproximadamente 6 kb.

Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición de moléculas homogénea pero, en algunas realizaciones, contendrá una heterogeneidad mínima. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o en porciones no críticas para la función o actividad biológica deseadas.

Un ácido nucleico "recombinante" se define por su método de producción o por su estructura. En referencia a su método de producción, p. ej., un producto elaborado mediante un procedimiento, el procedimiento hace uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, p. ej., implica la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente selección o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico elaborado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos entre sí, pero se entiende que excluye los productos de la naturaleza, p. ej., los mutantes de origen natural. De este modo, p. ej., están abarcados los productos elaborados transformando las células con cualquier vector de origen no natural, puesto que son ácidos nucleicos que comprenden las secuencia derivadas utilizando cualquier procedimiento con oligonucleótidos sintéticos. Esto se realiza a menudo para remplazar un codón por un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, a la vez que se introduce o retira típicamente un sitio de reconocimiento de la secuencia.

Alternativamente, esto se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una entidad genética sencilla que comprende una combinación deseada de funciones no encontrada en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción son a menudo la diana de tales manipulaciones artificiales, pero se pueden incorporar mediante diseño otras dianas de sitio específico, p. ej., promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control, u otras características útiles. Se desea un concepto similar para un polipéptido recombinante, p. ej., de fusión. Están incluidos específicamente ácidos nucleicos sintéticos cualesquiera que, mediante redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de algunas especies o variantes polimórficas diferentes.

Un "fragmento" significativo en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de al menos aproximadamente 22 nucleótidos, normalmente de al menos aproximadamente 29 nucleótidos, más a menudo de al menos aproximadamente 35 nucleótidos, típicamente de al menos aproximadamente 41 nucleótidos, usualmente de al menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 55 nucleótidos, y en realizaciones particularmente preferidas de la descripción será de al menos aproximadamente 60 o más nucleótidos, p. ej., 67, 73, 81, 89, 95, etc.

Un ADN que codifica una proteína IL-B60 será particularmente útil para identificar genes, especies de ARNm, y ADNc que codifican proteínas relacionadas o similares, así como ADN que codifican proteínas homólogas de especies diferentes. Habrá homólogos en otras especies, incluyendo primates, roedores, cánidos, félidos, y aves. Algunas proteínas IL-B60 deben ser homólogas y se describen en la presente memoria. No obstante, incluso proteínas que tienen una relación evolutiva más distante con el antígeno se pueden aislar fácilmente en condiciones apropiadas utilizando estas secuencias si son suficientemente homólogas. Las proteínas IL-B60 de primate tienen un interés
particular.

Los clones recombinantes derivados de secuencias genómicas, p. ej., que contienen intrones, será útiles para estudios transgénicos, incluyendo, p. ej., células y organismos transgénicos, y para terapia génica. Véanse, p. ej., Goodnow (1992) "Transgenic Animals" en Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, págs. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199.

Homología sustancial, p. ej., identidad, en el contexto de comparación de la secuencia de ácido nucleico significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando se alinean óptimamente, con las inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos, en al menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente 58%, normalmente al menos aproximadamente 65%, a menudo al menos aproximadamente 71%, típicamente al menos aproximadamente 77%, usualmente al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente de 95 a 98% o más, y en realizaciones concretas de la descripción, tanto como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos hibridan en condiciones de hibridación selectivas, con una hebra, o su complementaria, típicamente utilizando una secuencia de IL-B60, p. ej., en el SEQ ID NO: 1. Típicamente, la hibridación selectiva se producirá cuando haya al menos aproximadamente una identidad de 55% a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 75% sobre un tramo de aproximadamente 25 nucleótidos, y muy preferiblemente al menos aproximadamente 90% sobre aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de la identidad, como se ha descrito, puede ser sobre tramos más largos, y en algunas realizaciones de la descripción será sobre un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos, y preferiblemente al menos aproximadamente de 75 a 100 o más nucleótidos.

Condiciones restrictivas, haciendo referencia a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones combinadas restrictivas de sal, temperatura, disolventes orgánicos, y otros parámetros, típicamente aquellos controlados en las reacciones de hibridación. Las condiciones de temperatura restrictivas usualmente incluirán temperaturas de más de aproximadamente 30ºC, usualmente de más de aproximadamente 37ºC, típicamente de más de aproximadamente 55ºC, preferiblemente de más de aproximadamente 70ºC. Las condiciones de sal restrictivas serán normalmente menos de aproximadamente 1000 mM, usualmente menos de aproximadamente 400 mM, típicamente menos de aproximadamente 250 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 150 mM, incluyendo aproximadamente 100, 50, o incluso 20 mM. No obstante, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, p. ej., Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. La hibridación en condiciones restrictivas proporcionará un fondo de al menos 2 veces el fondo, preferiblemente al menos 3-5 o más.

Para la comparación de la secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.

El alineamiento de secuencias óptimo para la comparación se puede llevar a cabo, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Sporte Lógico de la Universidad de Wisconsin, Grupo de Computación Genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase generalmente Ausubel et al., supra).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos por pares, progresivos para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de la secuencia. También traza un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método utilizado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza por el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento se alinea después con la siguiente secuencia o agrupamiento de secuencias alineadas más afines. Dos agrupamientos de secuencias se alinean mediante una simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra por una serie de alineamientos por pares, progresivos. El programa se pone en marcha designando las secuencias específicas y sus productos coordinados de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia se puede comparar con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relaciones de identidad de secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso de la interrupción por defecto (3,00), peso de la longitud de la interrupción por defecto (0,10), e interrupciones en el extremo pesadas.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que describen Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El soporte lógico para realizar los análisis BLAST está disponible al público en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica "National Center for Biotechnology Information" (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar los pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que se emparejan o satisfacen la puntuación T en el umbral de valoración positiva cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul, et al., supra). Estos aciertos en la palabra vecina inicial actúan como germen para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Los aciertos de palabras se prolongan después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda aumentar la puntuación de alineamiento cumulativa. La prolongación de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento cumulativa cae fuera de la cantidad X desde su valor máximo logrado; la puntuación cumulativa va hasta cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de la palabra (W) de 11, los alineamientos (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915) de 50, la expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual podría ocurrir un emparejamiento aleatorio entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es de menos de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico de polipéptidos son esencialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reacción cruzada inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. De este modo, un polipéptido es típicamente esencialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en las sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son esencialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas, como se describe más abajo.

Se puede clonar y aislar IL-B60 de otras especies de mamíferos mediante hibridación cruzada de especies de especies estrechamente relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies lejanamente relacionadas, y de este modo es aconsejable la hibridación de especies relativamente relacionadas estrechamente. Alternativamente, la preparación de una preparación de anticuerpo que muestra menos especificidad de especies puede ser útil para la expresión de los planteamientos de clonación.

VII. Elaboración de IL-B60 o de su complejo; Miméticos

El ADN que codifica IL-B60 o sus fragmentos se puede obtener mediante síntesis química, escrutando genotecas de ADNc, o escrutando genotecas genómicas preparadas a partir de una gran variedad de líneas celulares o muestras de tejidos. Véanse, p. ej., Okayama y Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2:161-170; Gubler y Hoffman (1983) Gene 25:263-269; y Glover (ed. 1984) ADN Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Alternativamente, las secuencias proporcionadas en la presente memoria proporcionan cebadores útiles para la PCR o permiten la preparación sintética u otra de genes adecuados que codifican un IL-B60; incluyendo las realizaciones de origen natural.

Este ADN se puede expresar en una gran variedad de células anfitrionas para la síntesis de un IL-B60 completo o de fragmentos que pueden a su vez, p. ej., ser utilizados para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para los estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para los estudios de estructura/función.

Los vectores, según se utilizan en la presente memoria, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que posibilitan la integración de fragmentos de ADN en el genoma del anfitrión. Véanse, p. ej., Pouwels, et al. (1985 y Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodriguez, et al. (eds. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Para los fines de esta invención, las secuencias de ADN se conectan operablemente cuando se relacionan funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está conectado operablemente a un polipéptido si se expresa como una preproteína o participa en la dirección del polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está conectado operablemente a una secuencia codificante si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión al ribosoma está conectado operablemente a una secuencia codificante si se sitúa para permitir la traducción. Usualmente, conectado operablemente significa contiguo y en marco de lectura, no obstante, algunos elementos genéticos tales como los genes represores no están conectados de manera contigua pero aun se unen a las secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión. Véanse, p. ej., Rodriguez, et al., Capítulo 10, págs. 205-236; Balbas y Bolivar (1990) Methods in Enzymology 185:14-37; y Ausubel, et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene y Wiley, NY.

Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMC1neo Poly-A, véase Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610. Véase, p. ej., Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177-199.

A menudo se desea expresar un polipéptido IL-B60 en un sistema que proporciona un patrón de glucosilación específico o definido. Véanse, p. ej., Luckow y Summers (1988) Bio/Technology 6:47-55; y Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185:487-511.

El IL-B60, o un fragmento del mismo, se pueden diseñar para que sean fosfatidil inositol (PI) unido a la membrana celular, pero se pueden separar de las membranas mediante tratamiento con una enzima que escinde fosfatidil inositol, p. ej., fosfatidil inositol fosfolipasa-C. Esta libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite su purificación mediante procedimientos convencionales de la química de proteínas. Véanse, p. ej., Low (1989) Biochim Biophys. Acta 988:427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283.

Ahora que se ha caracterizado el IL-B60, sus fragmentos o derivados se pueden preparar mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como describen Stewart y Young (1984) en Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; y Villafranca (ed. 1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, Ca.

VIII. Usos

La presente invención proporciona reactivos que tendrán uso en aplicaciones diagnosticas como se ha descrito en otra parte de la presente memoria, p. ej., en condiciones mediadas por IL-B60, o más abajo en la descripción de los kits de diagnosis. El gen puede ser útil en ciencias forenses, p. ej., para distinguir roedores de seres humanos, o como marcador para distinguir entre diferentes células que muestran patrones de expresión o modificación diferenciales. Las composiciones proporcionadas son reactivos útiles para, p. ej., análisis in vitro, investigación científica, y la síntesis o fabricación de ácido nucleicos, polipéptidos, o anticuerpos.

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Esta invención también proporciona reactivos con potencial comercial y/o terapéutico significativo. Según se describe en la presente memoria, IL-B60 (de origen natural o recombinante), sus fragmentos, y sus anticuerpos, junto con los compuestos identificados por tener afinidad de unión por IL-B60, deben ser útiles como reactivos para ilustrar técnicas de biología molecular, inmunología, o fisiología. Los kits apropiados se pueden preparar con los reactivos, p. ej., en ejercicios de laboratorio prácticos en la producción o uso de proteínas, anticuerpos, métodos de clonación, histología, etc.

Los reactivos también serán útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con la fisiología o el desarrollo anómalos, incluyendo condiciones inflamatorias. Pueden ser útiles en ensayos in vitro en busca de la presencia o ausencia de componentes interaccionantes, que se pueden correlacionar con el éxito de estrategias de tratamiento concretas. En concreto, la modulación de la fisiología de algunas células, p. ej., hematopoyéticas o linfoides, se logrará mediante métodos de tratamiento apropiados utilizando las composiciones proporcionadas en la presente memoria. Véanse, p. ej., Thomson (1994; ed.) The Cytokine Handbook (2^{a} ed.) Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; y Aggarwal y Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.

Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anómala o la señalización anómala por un IL-B60 debe ser una diana probable para un agonista o antagonista. La nueva citoquina debe jugar un papel en la regulación o el desarrollo de las células hematopoyéticas, p. ej., células linfoides, que afectan a las respuestas inmunológicas, p. ej., inflamación y/o trastornos autoinmunitarios. Alternativamente, puede afectar a la fisiología o el desarrollo vascular, o tener efectos neuronales.

En concreto, la citoquina debe mediar, en diferentes contextos, la síntesis de citoquinas por las células, la proliferación, etc. Los antagonistas de IL-B60, tales como las variantes muteína de una forma de origen natural de IL-B60 o los anticuerpos bloqueadores, pueden proporcionar una vía selectiva y potente para bloquear las respuestas inmunitarias, p. ej., en situaciones como las respuestas inflamatorias o autoinmunitarias. Véase también Samter, et al. (eds.) Immunological Diseases vols. 1 y 2, Little, Brown y Co.

Por añadidura, algunas composiciones combinadas podrían ser útiles, p. ej., con otros moduladores de la inflamación. Tales otras moléculas pueden incluir esteroides, otras versiones de IL-6 y/o G-CSF, incluyendo variantes de especie, u homólogos virales, y sus antagonistas respectivos.

Se conocen diversas condiciones anómalas en cada uno de los tipos celulares que se demuestra que producen ARNm de IL-B60 mediante análisis por transferencia Northern. Véanse Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; y Weatherall, et al. (eds.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Muchas otras condiciones médicas y enfermedades implican la activación por macrófagos o monocitos, y muchas de estas serán sensibles al tratamiento con un agonista o antagonista proporcionado en la presente memoria. Véanse, p. ej., Stites y Terr (eds.; 1991) Basic and Clinical Immunology Appleton y Lange, Norwalk, Connecticut; y Samter, et al. (eds.) Immunological Diseases Little, Brown y Co. Estos problemas deben ser susceptibles de prevención o tratamiento utilizando las composiciones proporcionadas en la presente memoria. La localización en los islotes pancreáticos sugiere una posible relevancia para la diabetes.

El IL-B60, los antagonistas, los anticuerpos, etc., se pueden purificar y después administrar a un paciente, veterinario o humano. Estos reactivos se pueden combinar para su uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, p. ej., en portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, p. ej., potenciadores inmunogénicos, junto con estabilizantes, excipientes, o conservantes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser filtradas en condiciones estériles y colocadas en formas de dosificación por ejemplo mediante liofilización en viales de dosificación o almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión, incluyendo las formas que no se unen al complemento.

El escrutinio de fármacos utilizando IL-B60 o sus fragmentos se puede realizar para identificar compuestos que tienen afinidad de unión por, u otros efectos biológicos relevantes sobre las funciones de IL-B60, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Los posteriores análisis biológicos se pueden utilizar después para determinar si el compuesto tiene actividad estimuladora intrínseca y por lo tanto es un bloqueador o antagonista puesto que bloquea la actividad de la citoquina. Igualmente, un compuesto que tiene actividad estimuladora intrínseca puede activar la ruta de la señal y de este modo es un agonista puesto que estimula la actividad de IL-B60. También se describe en la presente memoria el uso terapéutico de anticuerpos bloqueadores de IL-B60 como antagonistas y de anticuerpos estimuladores como agonistas. Este enfoque debe ser particularmente útil con otras variantes de especie de IL-B60.

Las cantidades de los reactivos necesarios para la terapia eficaz dependerá de muchos factores diferentes, incluyendo los métodos de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. De este modo, las dosificaciones de tratamiento se deben titular para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar una pauta provechosa en las cantidades útil para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo con animales de las dosis eficaces para el tratamiento de los trastornos concretos proporcionará una indicación predictiva adicional de la dosificación a los seres humanos. Se describen diferentes consideraciones, p. ej., por Gilman, et al. (eds. 1990) en Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases de Therapeutics, 8^{a} Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^{a} ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para la administración se estudian allí y más abajo, p. ej., para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, difusión transdérmica, y otras. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, disolución salina, tampones, y otros compuestos descritos, p. ej., en the Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Se podría esperar que los intervalos de dosificación se encontraran en cantidades menores que concentraciones 1 mM, típicamente concentraciones de menos de aproximadamente 10 \muM, usualmente menos de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 10 pM (picomolar), y muy preferiblemente menos de aproximadamente 1 fM (fentomolar), con un portador apropiado. A menudo se utilizarán formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta para la administración continua o a largo plazo. Véase, p. ej., Langer (1990) Science 249:1527-1533.

Como se ha descrito en la presente memoria, el IL-B60, sus fragmentos, y sus anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas, y agonistas, se pueden administrar directamente al anfitrión que se vaya a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos con proteínas portadoras tales como ovalbúmina o seralbúmina antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en muchas formulaciones de dosificación convencionales. Si bien es posible administrar solo el ingrediente activo, es preferible presentarlo en forma de una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente al menos un ingrediente activo, como se ha definido antes, junto con uno o más portadores aceptables del mismo. Cada portador debe ser farmacéuticamente y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no dañino para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocidos en la técnica de farmacia. Véanse, p. ej., Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman y Gilman's: The Pharmacological- Bases of Therapeutics. 8^{a} Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^{a} ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; y Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York. La terapia de esta invención se puede combinar con o utilizar asociada con otros agentes, p. ej., otras citoquinas, incluyendo IL-6 o G-CSF, o sus antagonistas respectivos.

Las formas de origen natural y recombinante de los IL-B60 de esta descripción son particularmente útiles en kits y métodos de análisis que son capaces de escrutar compuestos en busca de la actividad de unión a las proteínas. En los últimos años se han desarrollados varios métodos de análisis automatizados para permitir el escrutinio de decenas de miles de compuestos en un breve período. Véase, p. ej., Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773, que describe los medios para someter a ensayo la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de los análisis adecuados se puede facilitar enormemente por la disponibilidad de grandes cantidades de IL-B60 soluble, purificado de acuerdo con lo estipulado por esta invención.

Se pueden utilizar otros métodos para determinar los restos críticos en las interacciones del receptor IL-B60-IL-B60. Se pueden realizar análisis mutacionales, p. ej., véase Somoza, et al. (1993) J. Expt 1. Med. 178:549-558, para determinar los restos específicos críticos en la interacción y/o señalización. El PHD (Rost y Sander (1994) Proteins 19:55-72) y el DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310) pueden proporcionar predicciones de la estructura secundaria de la hélice \alpha (H), la lámina \beta (E), o la espiral (L). Las hélices A y D son muy importantes en la interacción con el receptor, siendo la hélice D la región más importante. Véase la Tabla 2.

Por ejemplo, los antagonistas se pueden encontrar normalmente una vez que el antígeno ha sido definido estructuralmente, p. ej., por sus datos de la estructura terciaria. El ensayo de los análogos de interacción potencial es ahora posible tras el desarrollo de métodos de análisis altamente automatizados utilizando un IL-B60 purificado. En concreto, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas utilizando las técnicas de escrutinio descritas en la presente memoria. Tienen una importancia concreta los compuestos que se ha encontrado que tienen una afinidad de unión combinada por un espectro de moléculas IL-B60, p. ej., compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especie de IL-B60.

Un método para escrutar fármacos utiliza células anfitrionas eucarióticas o procarióticas que son transformadas establemente con moléculas de ADN recombinante que expresan un IL-B60. Se pueden aislar células que expresan un IL-B60 aislado de otras moléculas. Tales células, en forma fijada o viable, se pueden utilizar para análisis de unión de compañeros de unión convencionales. Véase también, Parce, et al. (1989) Science 246:243-247; y Owicki, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares.

Otra técnica para el escrutinio de fármacos implica un enfoque que proporciona un escrutinio de alto rendimiento en busca de compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a un IL-B60 y la describe en detalle Geysen, Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. Primero, se sintetiza una gran número de compuestos de ensayo peptídicos pequeños diferentes sobre un sustrato sólido, p. ej., alfileres de plástico o alguna otra superficie apropiada, véase Fodor, et al. (1991). Después se hacen reaccionar todos los alfileres con IL-B60 solubilizado, no purificado o solubilizado, purificado, y se lavan. La siguiente etapa implica la detección de IL-B60 unido.

El diseño racional de fármacos puede estar basado también en estudios estructurales de las formas moleculares de IL-B60 y otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que median otras funciones en respuesta a la unión, u otras proteínas que interactúan normalmente con IL-B60, p. ej., un receptor. Un medio para determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, p. ej., cristalografía de rayos x o técnicas de RMN bidimensional. Estas proporcionarán orientación en cuanto a qué restos aminoácido forman las regiones de contacto molecular, como se modela, p. ej., contra otros modelos de citoquina-receptor. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, p. ej., Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.

IX. Los kits

Esta invención también contempla el uso de proteínas IL-B60, sus fragmentos, péptidos, y sus productos de fusión en una variedad de kits de diagnostico y métodos para detectar la presencia de otro IL-B60 o compañero unión. Típicamente el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido IL-B60 definido o un segmento génico o un reactivo que reconoce uno u otro, p. ej., fragmentos o anticuerpos de IL-B60.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo a un IL-B60 comprendería típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo un compañero de unión o anticuerpo que tienen afinidad de unión por IL-B60; una fuente de IL-B60 (de origen natural o recombinante); y un medio para separar el compuesto unido del marcado libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la molécula. Una vez escrutados los compuestos, se pueden evaluar aquellos que tienen una afinidad de unión adecuada para el antígeno en análisis biológicos adecuados, como es bien conocido en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas de la ruta de señalización de IL-B60. La disponibilidad de polipéptidos IL-B60 recombinantes también proporciona patrones bien definidos para calibrar tales análisis.

Un kit preferido para determinar la concentración de, p. ej., un IL-B60 en una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, p. ej., un compañero de unión o anticuerpo, que tiene una afinidad de unión conocida por el antígeno, una fuente de citoquina (de origen natural o recombinante) y un medio para separar el compuesto unido del marcado libre, p. ej., una fase sólida para inmovilizar el IL-B60. Se proporcionarán normalmente compartimentos que contienen reactivos, e instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para IL-B60 o los fragmentos son útiles en aplicaciones diagnósticas para detectar la presencia de niveles elevados de IL-B60 y/o sus fragmentos. Tales análisis de diagnóstico pueden emplear productos lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales, y pueden implicar adicionalmente la detección de antígenos relacionados con el antígeno en suero, o similares. Los análisis de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo antígeno-compañero de unión) o heterogéneo (con una etapa de separación). Existen diferentes análisis comerciales, tales como radioinmunoanálisis (RIA), análisis inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA), inmunoanálisis enzimático (EIA), técnica de inmunoanálisis por multiplicación enzimática (EMIT), fluoroinmunoanálisis con sustrato marcado (SLFIA), y similares. Véanse, p. ej., Van Vunakis, et al. (1980) Meth Enzymol. 70:1-525; Harlow y Lane (1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; y Coligan, et al. (eds. 1993) Current Protocols in Immunology, Greene y Wiley, NY.

Los anticuerpos antiidiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra un IL-B60, como tales pueden ser diagnósticos de diferentes estados anómalos. Por ejemplo, la sobreproducción de IL-B60 puede dar como resultado la producción de diferentes reacciones inmunológicas que pueden ser diagnósticas de estados fisiológicos anómalos, particularmente en condiciones celulares proliferativas tales como el cáncer o la activación o diferenciación anómalas. Además, el patrón de distribución disponible proporciona la información de que la citoquina se expresa en los islotes pancreáticos, sugiriendo la posibilidad de que la citoquina pueda estar implicada en el funcionamiento de este órgano, p. ej., en una condición médica relevante de diabetes.

Frecuentemente, los reactivos para los análisis diagnósticos se suministran en kits, para optimizar la sensibilidad del análisis. Para la invención sujeto, dependiendo de la naturaleza del análisis, el protocolo, y la marca, se proporciona el anticuerpo o el compañero de unión marcado o no marcado, o IL-B60 marcado. Esto está usualmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de la señal tales como sustratos para enzimas, y similares. Preferiblemente, el kit también contendrá instrucciones para el uso y disposición apropiados de los contenidos después de su uso. Típicamente el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan en forma de polvo liofilizado seco, donde los reactivos se pueden reconstituir en un medio acuoso proporcionando concentraciones apropiadas de los reactivos para realizar el análisis.

Muchos de los componentes anteriormente mencionados del escrutinio de fármacos y de los análisis diagnósticos se pueden utilizar sin modificación o se pueden modificar de varias maneras. Por ejemplo, el marcaje se puede lograr uniendo covalentemente o no covalentemente un radical que proporciona directamente o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos análisis, el compañero de unión, el compuesto de ensayo, IL-B60, o sus anticuerpos se pueden marcar directamente o indirectamente. Las posibilidades de marcaje directo incluyen grupos de marcaje: marcas radiactivas tales como I^{125}, enzimas tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcas fluorescentes (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.940.475) capaz de verificar el cambio de la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda, o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen la biotinilación de un componente seguido de la unión a avidina acoplada a uno de los grupos de marcaje
anteriores.

Existen también numerosos métodos para separar el IL-B60 unido del libre, o alternativamente el compuesto de ensayo unido del libre. El IL-B60 se puede inmovilizar sobre diferentes matrices seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos tales como una placa de ELISA, filtros, y cuentas. Véanse, p. ej., Coligan, et al. (eds. 1993) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Capítulo 2, Greene y Wiley, NY. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de la partícula magnetizable con anticuerpo de fluoresceína descrito por Rattle, et al. (1984) en Clin. Chem. 30:1457-1461, y la separación doble con partículas magnéticas con anticuerpo como se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.659.678.

Los métodos para conectar proteínas o sus fragmentos a las diferentes marcas han sido referidos extensamente en la literatura y no requieren un estudio detallado en la presente memoria. Muchas de las técnicas implican la utilización de grupos carboxilo activados a través del uso de carbodiimida o ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para la conexión, o similares. Las proteínas de fusión también tendrán uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto diagnóstico de esta descripción implica el uso de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas tomadas de la secuencia de un IL-B60. Estas secuencias se pueden utilizar como sondas para detectar los niveles del mensaje de IL-B60 en muestras de pacientes que se sospecha que tienen una condición anómala, p. ej., inflamatoria o autoinmunitaria. Puesto que la citoquina puede ser un marcador o mediador para la activación, ésta puede ser útil para determinar el número de células activadas para determinar, p. ej., cuándo se puede requerir terapia adicional, p. ej., de una manera preventiva antes de que empiecen los efectos y se vuelvan trascendentes. La preparación de las secuencias de nucleótidos de ARN y ADN, el marcaje de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias han recibido amplia descripción y estudio en la literatura. Véanse, p. ej., Langer-Safer, et al. (1982) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79:4381-4385; Caskey (1987) Science 236:962-967; y Wilchek et al. (1988) Anal. Biochem. 171:1-32.

También se describen los kits de diagnóstico que también someten a ensayo la expresión cualitativa o cuantitativa de otras moléculas. La diagnosis o prognosis pueden depender de la combinación de múltiples indicaciones utilizadas como marcadores. De este modo, los kits pueden someter a ensayo combinaciones de marcadores. Véase, p. ej., Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97. Otros kits se pueden utilizar para evaluar otros subgrupos de células.

X. Aislamiento de un Receptor de IL-B60

Habiendo aislado un ligando de una interacción ligando-receptor, existen métodos para aislar el receptor. Véase, Gearing, et al. (1989) EMBO J. 8:3667-3676. Por ejemplo, se pueden determinar los medios para marcar la citoquina IL-B60 sin interferir en la unión a su receptor. Por ejemplo, una marca de afinidad se puede fusionar al extremo amino o carboxilo del ligando. Tal marca puede ser una marca epitópica FLAG, o, p. ej., un dominio Ig o Fc. Se puede escrutar una genoteca de expresión en busca de la unión específica de la citoquina, p. ej., mediante clasificación celular, u otro escrutinio para detectar las subpoblaciones que expresan tal componente de unión. Véanse, p. ej., Ho, et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11267-11271; y Liu, et al. (1994) J. Immunol. 152:1821-29. Alternativamente, se puede utilizar un método de selección repetitiva "panning". Véase, p. ej., Seed y Aruffo (1987) Proc, Nat'l Acad, Sci. US 84:3365-3369.

Las técnicas de entrecruzamiento de proteínas con una marca se pueden aplicar para aislar patrones de unión de la citoquina IL-B60. Esto podría permitir la identificación de proteínas que interactúan específicamente con la citoquina, p. ej., de una manera similar al ligando-receptor.

Se realizarán los primeros experimentos para determinar si los componentes receptores IL-6 o G-CSF conocidos están implicados en la respuesta o las respuestas a IL-B60. También es bastante posible que estos complejos de receptores funcionales compartan muchos o todos los componentes con un complejo del receptor de IL-B60, en una subunidad específica del receptor o en una subunidad accesoria del receptor.

Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen únicamente a modo de ejemplo, y la invención ha de estar limitada sólo por los términos de las reivindicaciones adjuntas.

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Ejemplos I. Métodos Generales

Muchos de los métodos convencionales siguientes se describen o ilustran, p. ej., por Maniatis, et al. (1982) en Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^{a} ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al. Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; Ausubel, et al. (1987 y Supplements) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY; Bonifacino, et al. Current Protocols in Cell Biology Wiley, NY; y Doyle, et al. Cell and Tissue Culture: Laboratory Protocols Wiley, NY. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía en columna, la electroforesis, la centrifugación, la cristalización, y otros. Véanse, p. ej., Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes de esta serie; Coligan, et al. (1995 y suplementos) Current Protocols in Protein Science John Wiley y Sons, New York, NY; Matsudaira (ed. 1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; y las publicaciones de los fabricantes sobre el uso de los productos para la purificación de proteínas, p. ej., Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permiten la fusión a los segmentos apropiados (etiquetas epitópicas), p. ej., a una secuencia FLAG o un equivalente que se puede fusionar, p. ej., a través de una secuencia de proteasa separable. Véanse, p. ej., Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle y Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Se realiza el análisis de la secuencia por ordenador, p. ej., utilizando programas de soporte lógico disponibles, incluyendo los del Grupo de Computación Genética (GCG) de la Universidad de Wisconsin, Madison, WI, el NCBI en NIH, y GenBank, NCBI, EMBO, y otras fuentes de secuencias públicas. Otras fuentes de análisis incluyen, p. ej., el programa RASMOL, véase Bazan, et al. (1996) Nature 379:591; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269; y DSC, véase King y Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310. Véanse, también, Wilkins, et al. (eds. 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY; Salzberg, et al. (eds. 1998) Computational Methods in Molecular Biology Elsevier, NY; y Birren, et al. (eds. 1997) Genome Analysis: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

Las técnicas inmunológicas convencionales las describen, p. ej., Hertzenberg, et al. (eds. 1996) en Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991 y updates) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology vols. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, y 163. Los análisis con citoquinas los describen, p. ej., Thomson (ed. 1994) The Cytokine Handbook (2^{a} ed.) Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; y Aggarwal y Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.

Los análisis para las actividades biológicas vasculares son bien conocidos en la técnica. Estos cubrirán las actividades angiogénicas y angiostáticas en los tumores, u otros tejidos, p. ej., proliferación de la musculatura lisa arterial (véase, p. ej., Koyoma, et al. (1996) Cell 87:1069-1078), la adherencia de monocitos al epitelio vascular (véase McEvoy, et al. (1997) J. Exp. Med. 185:2069-2077), etc. Véanse también Ross (1993) Nature 362:801-809; Rekhter y Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147:668-677; Thyberg, et al. (1990) Atherosclerosis 10:966-990; y Gumbiner (1996) Cell 84:345-357.

Los análisis para las actividades biológicas de las células neuronales los describen, p. ej., Wouterlood (ed. 1995) en Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; y Neuromethods Human Press, Totowa, NJ. La metodología de los sistemas evolutivos la describen, p. ej., Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; y Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

Los análisis FACS los describen Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

II. Clonación de IL-B60 Humano

La secuencia del gen se proporciona en la Tabla 1. La secuencia está derivada de una secuencia genómica humana. Estas secuencias permiten la preparación de cebadores para PCR, o sondas, para determinar la distribución celular del gen. Las secuencias permiten el aislamiento del ADN genómico que codifica el mensaje.

Utilizando la sonda o los cebadores para PCR, se sondean diferentes tejidos o tipos celulares para determinar la distribución celular. Los productos de la PCR se clonan utilizando, p. ej., un kit de clonación TA (Invitrogen). Los plásmidos de ADNc resultante se secuencian desde ambos extremos en un secuenciador automático (Applied Biosystems).

III. Expresión Celular de IL-B60

Se preparan una sonda apropiada o cebadores específicos para el ADNc que codifica IL-B60 de primate. Típicamente, la sonda se marca, p. ej., mediante cebado al azar. La expresión está probablemente en los tipos celulares descritos, y quizás también en los islotes pancreáticos.

La presencia de una secuencia líder condujo a la expectativa de encontrar IL-B60 secretado cuando se expresó en células de mamífero. La transfección de células 293T con una forma etiquetada de hIL-B60 (hIL-B60-Etag) no dio como resultado una secreción eficiente de IL-B60. En cambio, IL-B60 podría sólo ser inmunoprecipitado desde el producto lisado de las células transfectadas. Se investigó la posibilidad de que IL-B60 fuera un factor compuesto de tipo IL-12 (p35/p40) y de este modo necesitara un compañero para la secreción. Entre los receptores no señalizadores de la familia de IL-6 el receptor CLF-1 (NR6) recientemente descrito y, hasta ahora, huérfano, también mostró un alto nivel de homología entre las formas humana y murina (identidad de aminoácidos >95%). Basándose en estas observaciones se generó la hipótesis de que IL-B60 y CLF-1 son compañeros.

Análisis Southern: ADN (5 \mug) de una genoteca de ADNc amplificado primario se digiere con las enzimas de restricción apropiada para liberar los insertos, se mueve en un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nailon (Schleicher y Schuell, Keene, NH).

Las muestras para el aislamiento del ARNm humano pueden incluir, p. ej., células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T, células NK, granulocitos, células B), en reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 h reunidas (T101); células T, clon TH0 Mot 72, en reposo (T102); células T, clon TH0 Mot 72, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h reunidas (T103); células T, clon TH0 Mot 72, anérgico tratado con péptido específico durante 2, 7, 12 h reunidas (T104); células T, clon TH1 HY06, en reposo (T107); células T, clon TH1 HY06, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h reunidas (T108); células T, clon TH1 HY06, anérgico tratado con péptido específico durante 2, 6, 12 h reunidas (T109); células T, clon TH2 HY935, en reposo (T110); células T, clon TH2 HY935, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 2, 7, 12 h reunidas (T111); líneas tumorales de células T Jurkat y Hut78, en reposo (T117); clones de células T, reunidas AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, en reposo (T118); clones de células T con células T \gamma\delta al azar, en reposo (T119); clones de células T CD28-; Esplenocitos, en reposo (B100); Esplenocitos, activados con anti-CD40 e IL-4 (B101); líneas EBV de células B reunidas WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, en reposo (B102); línea JY de células B, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidas (B103); clones NK 20 reunidos, en reposo (K100); clones NK 20 reunidos, activados con PMA e ionomicina durante 6 h (K101); clon NKL, derivado de sangre periférica de paciente con leucemia LGL, tratado con IL-2 (K106); línea precursora hematopoyética TF1, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunida (C100); línea premonocítica U937, en reposo (M100); línea premonocítica U937, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunida (M101); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h reunidos (M102); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h reunidos (M103); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 4, 16 h reunidos (M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 4, 16 h reunidos (M107); monocitos elutriados, activados con LPS durante 1 h (M108); monocitos elutriados, activados con LPS durante 6 h (M109); CDla+ DC 70%, de GM-CSF CD34+, TNF\alpha 12 días, en reposo (D101); CDla+ DC 70%, de GM-CSF CD34+, TNF\alpha 12 días, activado con PMA e ionomicina durante 1 hr (D102); CDla+ DC 70%, de GM-CSF CD34+, TNF\alpha 12 días, activado con PMA e ionomicina durante 6 hr (D103); DC 95% CDla+, de GM-CSF CD34+, TNF\alpha 12 días clasificado con FACS, activado con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunido (D104); DC 95% CD14+, ex GM-CSF CD34+, TNF\alpha 12 días clasificado con FACS, activado con PMA e ionomicina 1, 6 hr reunido (D105); DC CDla+ CD86+, de GM-CSF CD34+, TNF\alpha 12 días clasificado con FACS, activado con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunido (D106); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D107); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D108); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, activadas con LPS 4, 16 h reunidas (D109); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, TNF\alpha activado, monocito supe durante 4, 16 h reunidas (D110); células epiteliales, no estimuladas; células epiteliales, activadas con IL-1\beta; línea celular de sarcoma de fibroblasto de pulmón MRC5, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunida (C101); línea celular de carcinoma epitelial de riñón CHA, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunida (C102). La expresión del transcrito de IL-B60 fue muy alta en monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 4, 16 h reunidos (M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h reunidos (M102); monocitos elutriados, activados con LPS durante 6 h (M109); y monocitos elutriados, activados con LPS durante 1 h (M108).

Las muestras para la expresión de ARNm de ratón pueden incluir, p. ej., línea de células L fibroblásticas de ratón en reposo (C200); células transfectadas con Braf:ER (fusión de Braf con el receptor de estrógenos), control (C201); células T vírgenes Mel14+ de bazo, en reposo (T209); células T vírgenes Mel14+ de bazo, estimuladas con IFN\gamma, IL-12, y anti IL-4 para polarizarlas a células TH1, expuestas a IFN\gamma y IL-4 for 6, 12, 24 h, reunidas (T210); células T vírgenes Me114+ de bazo, estimuladas con IL-4 y anti IFN\gamma para polarizarlas a células Th2, expuestas a IL-4 y anti IFN\gamma durante 6, 13, 24 h, reunidas (T211); células T, polarizadas a TH1 (Mel14 brillantes, células CD4+ de bazo, polarizadas durante 7 días con IFN-\gamma y anti IL-4; T200); células T, TH2 polarizadas (Mel14 brillantes, células CD4+ de bazo, polarizadas durante 7 días con IL-4 y anti-IFN-\gamma; T201); células T, muy polarizadas a TH1 3x de Balb/C transgénicos (véase Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 24 h reunidas; T202); células T, muy polarizadas a TH2 3x de Balb/C transgénicos (activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 24 h reunidas (T203); células T, muy polarizadas a TH1 3x de C57 bl/6 transgénicos (activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 24 h reunidas; T212); células T, muy polarizadas a TH2 3x de C57 bl/6 transgénicos (activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 24 h reunidas; T213); células T, muy polarizadas a TH1 (células T CD4+ vírgenes T de Balb/C transgénicos, polarizadas 3x con IFN\gamma, IL-12, y anti-IL-4; estimuladas con IGIF, IL-12, y anti-IL-4 durante 6, 12, 24 h, reunidas); pre células T CD44- CD25+, clasificadas de thymus (T204); clon D1.1 de célula T TH1, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T205); clon D1.1 de célula T TH1, 10 \mug/ml estimulada con ConA 15 h (T206); clon CDC35 de célula T TH2, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T207); clon CDC35 de célula T TH2, 10 \mug/ml estimulada con ConA 15 h (T208); línea CH12 de célula B no estimulada (B201); línea celular de leucemia de células B madura no estimulada A20 (B200); células B grandes no estimuladas de bazo (B202); células B de bazo completo, activadas con LPS (B203); células dendríticas enriquecidas con metrizamida de bazo, en reposo (D200); células dendrítica de médula ósea, en reposo (D201); células dendríticas derivadas de médula ósea agotadas con anti B220, anti CD3, y anti Class II, cultivadas en GM-CSF y IL-4 (D202); células dendríticas derivadas de médula ósea agotadas con anti B220, anti CD3, y anti Class II, cultivadas en GM-CSF e IL-4, estimuladas con anti CD40 durante 1, 5 d, reunidas (D203); línea celular monocítica RAW 264.7 activada con LPS 4 h (M200); macrófagos de médula ósea derivados con GM y M-CSF (M201); macrófagos de médula ósea derivados con GM-CSF, estimulados con LPS, IFN\gamma, e IL-10 durante 24 h (M205); macrófagos de médula ósea derivados con GM-CSF, estimulados con LPS, IFN\gamma, y anti IL-10 durante 24 h (M206); macrófagos peritoneales (M207); línea celular de macrófagos J774, en reposo (M202); línea celular de macrófagos J774 + LPS + anti-IL-10 a 0,5, 1, 3, 6, 12 h reunidas (M203); línea celular de macrófagos J774 + LPS + IL-10 a 0,5, 1, 3, 5, 12 h reunidas (M204); líneas de mastocitos MC-9 y MCP-12 (M208); línea celular endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales microvasculares cerebrales, no estimulada (E200); línea celular endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales microvasculares cerebrales, estimulada durante la noche con TNF\alpha (E201); línea celular endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales microvasculares cerebrales, estimulada durante la noche con TNF\alpha (E202); línea celular endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales microvasculares cerebrales, estimulada durante la noche con TNF\alpha e IL-10 (E203); aorta completa de ratón wt C57 bl/6; aorta completa de ratón ApoE KO de 5 meses (X207); aorta completa de ratón ApoE KO de 12 meses (X207); timo wt (0214); timo completo, rag-1 (0208); riñón completo, rag-1 (0209); riñón completo, ratón NZ B/W; y corazón completo, rag-1 (0202).

Se encontró que el IL-B60 humano se expresaba en células T; el clon Th0 Mot72 (activado); PBL activados; monocitos; células dendríticas; pulmón fetal, y muestras de pulmón de fumador empedernido.

Se encontró que CLF-1 se expresaba en células dendríticas; esplenocitos; Células TH1; pulmón fetal; y muestras de pulmón. Esta distribución es coherente con el complejo siendo importante en la función inmunitaria, p. ej., células dendríticas e inmunitarias, y en la fisiología del pulmón.

Puesto que CLF-1 es necesario para la secreción de IL-B60 in vitro, se escrutaron diferentes genotecas de ADNc humano y de ratón en busca de la co-expresión de ambos ARNm. Se encontró que la expresión más alta para ambos en esplenocitos, células T, monocitos activados y células dendríticas de humanos adultos y en pulmón fetal, y útero. En genotecas de ratón, la co-expresión fue más fuerte en pulmón adulto.

IV. Mapeo cromosómico de IL-B60

Se utiliza un ADNc aislado que codifica IL-B60. El mapeo cromosómico es una técnica convencional. Véase, p. ej., BIOS Laboratories (New Haven, CT) y métodos para utilizar un panel híbrido de células somáticas de ratón con PCR.

El gen IL-B60 humano ha sido localizado en el cromosoma 11 humano.

V. Purificación de la Proteína IL-B60 o de sus complejos

Se escrutan líneas celulares transfectadas múltiples en busca de una que expresa la citoquina a un alto nivel en comparación con otras células. Alternativamente, se puede elaborar un constructo recombinante con ambas subunidades. Se escrutan diferentes líneas celulares y se seleccionan en busca de sus propiedades de manipulación favorables. El IL-B60 natural se puede aislar de fuentes naturales, o mediante la expresión de una célula transformada utilizando un vector de expresión apropiado. La purificación de la proteína expresada o del complejo se logra mediante procedimientos normalizados, o se pueden combinar medios diseñados para la purificación efectiva de alta eficacia de productos lisados celulares o sobrenadantes. Se pueden utilizar segmentos FLAG o His_{6} para tales características de purificación. Alternativamente, se puede utilizar cromatografía de afinidad con anticuerpos específicos, véase lo siguiente.

La proteína es producida en coli, células de insecto, o sistemas de expresión de mamíferos, según se desee.

VI. Aislamiento de Genes IL-B60 Homólogos

El ADNc de IL-B60, o una secuencia contraparte de otra especie, se pueden utilizar como sonda de hibridación para escrutar una genoteca de una fuente deseada, p. ej., una genoteca de ADNc de células de primate. Se pueden escrutar muchas especies diferentes en busca de la restricción necesaria para una fácil hibridación, y en busca de su presencia utilizando una sonda. Se utilizarán condiciones de hibridación apropiadas para seleccionar los clones que muestran una especificidad de hibridación cruzada.

El escrutinio mediante hibridación utilizando sondas degeneradas basándose en las secuencias peptídicas permitirá también el aislamiento de los clones apropiados. Alternativamente, el uso de cebadores apropiados para el escrutinio mediante PCR producirá el enriquecimiento de los clones de ácido nucleico apropiados.

Son aplicables métodos similares para aislar variantes de especie, polimórficas, o alélicas. Las variantes de especie se aíslan utilizando técnicas de hibridación cruzada de especies basadas en el aislamiento de un producto aislado o fragmento completos de una especie como sonda.

Alternativamente, se utilizarán anticuerpos originados contra IL-B60 humano para escrutar en busca de células que expresan proteínas con reactividad cruzada de una genoteca, p. ej., de ADNc apropiada. La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos convencionales, como se ha descrito antes. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada se presentan a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Los anticuerpos resultantes se utilizan para el escrutinio, la purificación, o la diagnosis, como se ha descrito.

VII. Anticuerpos específicos para IL-B60 o sus complejos

Los péptidos sintéticos o la proteína purificada se presentan a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véanse, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Se pueden preparar suero policlonal o hibridomas. En situaciones apropiadas, el reactivo de unión se marca como se ha descrito antes, p. ej., fluorescencia o de otro modo, o se inmoviliza en un sustrato para los métodos de selección repetitiva. La inmunoselección, inmunoagotamiento, y técnicas relacionadas están disponibles para preparar reactivos selectivos, según se desee, p. ej., para IL-B60 solo, o el complejo entre las dos subunidades.

VIII. Producto coprecipitado de IL-B60 y CLF-1

Se preparó un constructo de CLF-1-FLAG en un vector de expresión. También se preparó un constructo IL-B60Etag (epítopo etiquetado). Se realizó la transfección transitoria en células COS con el constructo IL-B60Etag solo, el constructo CLF-1-FLAG solo, o ambos a la vez. Las células se marcaron con metionina-S^{35}. Se recogieron las células y los sobrenadantes.

Después de la co-transfección de las células con IL-B60-Etag y el receptor soluble CLF-1-Flag, aumentó enormemente la secreción de ambos ligandos y del receptor soluble. Ambos pudieron ser inmunoprecipitados con anticuerpos contra el ligando (anti Etag) o el receptor (anti Flag), indicando que IL-B60 y CLF-1 forman un complejo de citoquina/receptor soluble similar a IL-12 (p35/p40). Véanse Gubler, et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4143-4147; Wolf, et al. (1991) J. Immunol. 146:3074-3081. De este modo, la coexpresión con un compañero correcto dará como resultado un incremento espectacular de la secreción de los productos génicos. La coexpresión de IL-B60 con otros receptores solubles incluyendo Ebi3 (Devergne, et al. (1996) J. Virol. 70:1143-1153), IL-12 p40, y sCNTFR (Davis, et al. (1991) Science 253:59-63) no dio como resultado la secreción eficaz del ligando.

Los sobrenadantes se inmunoprecipitaron con anti-FLAG M2 (precipita CLF-1) o anti-Etag Ab (precipita IL-B60). En los transfectantes IL-B60Etag solos, el nivel de expresión en el sobrenadante detectado utilizando los anticuerpos antiEtag fue muy bajo. En contraste, en los transfectantes dobles, IL-B60Etag y una segunda banda marcada inmunoprecipitaron. La segunda banda corresponde a CLF-1. De este modo, el anticuerpo Etag inmunoprecipita ambas proteínas, p. ej., forma un complejo. En el transfectante individual CLF-1FLAG, inmunoprecipita un poco de proteína CLF-1FLAG con el Ab anti-FLAG M2. Este resultado es coincidente con los otros receptores solubles, p. ej., para el componente p40 de IL-12. No obstante, en los transfectantes dobles no sólo se observa más CLF-1, sino ahora también IL-B60. La inmunoprecipitación trabaja en ambas direcciones.

IX. El IL-B60 se une al CNTFR

Para identificar los receptores de señalización para IL-B60/CLF-1 se añadió medio acondicionado de células 293T cotransfectadas con hIL-B60 y mCLF-1 a células BA/F3 transfectadas establemente con gp130 humano solo o hgp130 combinado con hIL-6R, hOSMR, hLIFR, o hLIFR y hCNTFR, respectivamente. Sólo las células BA/F3 que expresan gp130, LIFR, y CNTFR mostraron una respuesta proliferativa tras la estimulación con IL-B60/CLF-1: Para analizar la posibilidad de un complejo de señalización consistente en CNTFR/gp130 o CNTFR/LIFR sólo, se diseñaron dos proteínas de fusión solubles conectando el CNTFR o CLF-1 a IL-B60 a través de un conector flexible. Se ha demostrado que las denominadas hiper-citoquinas similares son 100-1000x más activas sobre las células que la citoquina y el receptor soluble añadidos separadamente. Véase Fischer, et al. (1997) Nature Biotechnol. 15:142-145. La Hyper-CNTFR-IL-B60 fue capaz de inducir la proliferación de células BAF3/gp130/LIFR pero no de células BAF3/gp130, mostrando que LIFR es un componente del complejo de señalización. La estimulación de células con hyper-CLF-1-IL-B60 no dio como resultado la proliferación de ninguna línea celular. Esto indicó que aunque necesario para la secreción de IL-B60, el CLF-1 no es una subunidad del complejo receptor de señalización
activo.

La implicación de gp130 en el complejo receptor activo se demostró con un anticuerpo neutralizador contra gp130 que bloqueó completamente esta respuesta. Además, el análisis de los transductores de la señal en productos lisados de células BA/F3 que expresan gp130, LIFR, y CNTFR demostró que STAT3 sólo es fosforilado tras la estimulación con IL-B60 y CLF-1 co-expresados o con la proteína de fusión CNTFR-IL-B60 pero no con la fusión CLF-1-IL-B60.

X. Evaluación de la Amplitud de las Funciones Biológicas

Las actividades biológicas de IL-B60 o su complejo se someten a ensayo basándose, p. ej., en la secuencia y la homología estructural entre IL-B60 e IL-6 y G-CSF. Inicialmente, se examinan los análisis que habían mostrado actividades biológicas de IL-6 o G-CSF.

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A. Regulación de IL-B60 y CLF-1 luego de lesión en el nervio ciático

Se analizó la expresión de IL-B60 y CLF-1 en médula espinal de ratón en transección unilateral del nervio ciático seguido de separación de los cabos nerviosos proximales y distales, evitando de este modo la regeneración. En diferentes momentos, se recogió tejido del área de transección y se analizó mediante PCR cuantitativa en busca de la expresión de IL-B60 y CLF-1. La transección del nervio ciático dio como resultado la regulación al alza rápida y de larga duración del ligando y del receptor. Al cabo de 6 hrs IL-B60 y CLF-1 fueron regulados al alza. La expresión todavía se elevó 20 días después de la transección cuando se comparó con nervios no lesionados o simuladamente lesionados. Al regenerar los axones (nervios triturados) IL-B60 y CLF-1 son regulados a la baja al cabo de 12 h, pero mientras que la expresión de IL-B60 casi alcanza los niveles de los nervios no lesionados al cabo de 20 días, los niveles de CLF-1 alcanzan el máximo al cabo de 20 días. Esto podría apuntar a una función adicional de CLF-1, posiblemente en la remielinización, que comienza al cabo de dos semanas. La transección del nervio ciático en ratones que carecen de una respuesta a GM-CSF y macrófagos en el nervio muestra que la expresión de IL-B60 al cabo de 4 días no se altera en comparación con los ratones normales. No obstante, los niveles de CLF-1 en aquellos ratones son heterogéneos, con un intervalo desde la no alteración a un intervalo de casi 4 veces de la expresión en comparación con las camadas normales.

B. Efectos sobre la proliferación de células

Los efectos sobre la proliferación de diferentes tipos celulares se evalúan con diferentes concentraciones de citoquina. Se realiza un análisis dosis-respuesta, en combinación con las citoquinas relacionadas IL-6, G-CSF, etc. Se puede utilizar una máquina citosensora, que detecta el metabolismo y el crecimiento celulares (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

C. Efectos sobre la expresión de las moléculas de la superficie celular sobre los monocitos humanos

Los monocitos se purifican mediante selección negativa a partir de células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos normales. Brevemente, se incuban 3 x 10^{8} células mononucleares en bandas de Ficoll sobre hielo con un cóctel de anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson; Mountain View, CA) que consiste, p. ej., en 200 \mul de \alphaCD2 (Leu-5A), 200 \mul de \alphaCD3 (Leu-4), 100 \mul de \alphaCD8 (Leu 2a), 100 \mul de \alphaCD19 (Leu-12 ), 100 \mul de \alphaCD20 (Leu-16), 100 \mul de \alphaCD56 (Leu-19), 100 \mul de \alphaCD67 (IOM 67; Immunotech, Westbrook, ME), y anticuerpo anti-glicoforina (10F7MN, ATCC, Rockville, MD). Las células unidas a anticuerpo se lavan y después se incuban con IgG anti-ratón de oveja acoplada a cuentas magnéticas (Dynal, Oslo, Norway) a una razón de cuenta a célula de 20:1. Las células unidas a anticuerpo se separan de los monocitos mediante aplicación de un campo magnético. Con posterioridad, los monocitos humanos se cultivan en medio de Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) que contiene suero AB humano al 1% en ausencia o presencia de IL-B60, IL-6, G-CSF o sus combinaciones.

Los análisis de la expresión de las moléculas de la superficie celular se pueden realizar mediante inmunofluorescencia directa. Por ejemplo, 2 x 10^{5} monocitos humanos purificados se incuban en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene suero humano al 1% sobre hielo durante 20 minutos. Las células se sedimentan a 200 x g. Las células se resuspenden en 20 ml de mAb marcado con PE o FITC. Después de una incubación adicional de 20 minutos sobre hielo, las células se lavan en PBS que contiene suero humano al 1% seguido de dos lavados en PBS solo. Las células se fijan en PBS que contiene paraformaldehído al 1% y se analizan en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson; Mountain View, CA). Se utilizan los mAbs ilustrativos, p. ej.: CD11b (anti-macl), CDllc (una gp150/95), CD14 (Leu-M3), CD54 (Leu 54), CD80 (anti-BB1/B7), HLA-DR (L243) de Becton-Dickinson y CD86 (FUN 1; Pharmingen), CD64 (32.2; Medarex), CD40 (mAb89; Schering-Plough France).

D. Efectos de IL-B60 o su complejo sobre la producción de citoquinas por los monocitos humanos

Se aíslan monocitos humanos como se ha descrito y se cultivan en medio de Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) que contiene suero AB humano al 1% en ausencia o presencia de IL-B60 (material expresado de baculovirus en dilución 1/100). Además, los monocitos son estimulados con LPS (E. coli 0127:B8 Difco) en ausencia o presencia de IL-B60 y la concentración de citoquinas (IL-1\beta, IL-6, TNF\alpha, GM-CSF, y IL-10) en el sobrenadante del cultivo celular se determina mediante ELISA.

Para la coloración intracitoplásmica en busca de citoquinas, los monocitos se cultivan (1 millón/ml) en medio de Yssel en ausencia o presencia de IL-B60 y LPS (E. coli 0127:B8 Difco) y 10 mg/ml de Brefeldina A (Epicentre technologies Madison WI) durante 12 hrs. Las células se lavan en PBS y se incuban en una disolución de formaldehído/PBS al 2% durante 20 minutos a RT. Con posterioridad las células se lavan, se resuspenden en tampón de permeabilización (saponina al 0,5% (Sigma) en PBS/BSA (0,5%)/Azida (1 mM)) y se incuban durante 20 minutos a RT. Las células (2 x 10^{5}) se centrifugan y se resuspenden en 20 ml de mAbs anti-citoquina conjugados directamente diluidos 1:10 en tampón de permeabilización durante 20 minutos a RT. Se pueden utilizar los siguientes anticuerpos: IL-1\alpha-PE (364-3B3-14); IL-6-PE (MQ2-13A5); TNF\alpha-PE (MAb11); GM-CSF-PE (BVD2-21C11); e IL-12-PE (C11.5.14; Pharmingen San Diego, CA). Con posterioridad, las células se lavan dos veces en tampón de permeabilización y una vez en PBS/BSA/Azida y se analizan en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson; Mountain View, CA).

E. Efectos de IL-B60 sobre la proliferación de células mononucleares de sangre periférica human (PBMC)

Las PBMC se aíslan de las capas leucocitarias de donantes sanos normales mediante centrifugación a través de ficoll-hypaque como se ha descrito (Boyum, et al.). Las PBMC se cultivan en 200 \mul de medio de Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) que contiene suero AB humano al 1% en placas de 96 pocillos (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) en ausencia o presencia de IL-B60. Las células se cultivan en medio solo o combinado con 100 U/ml de IL-2 (R&D Systems) durante 120 horas. Se añade timidina H^{3} (0,1 mCi) durante las seis últimas horas de cultivo y se determina la incorporación de timidina H^{3} mediante recuento de centelleo líquido.

Las proteínas nativas, recombinantes, y de fusión se podrían someter a ensayo en busca de actividad agonística y antagónica en muchos otros sistemas de análisis biológicos, p. ej., sobre células T, células B, NK, macrófagos, células dendríticas, progenitores hematopotéticos, etc. Debido a la relación estructural de IL-6 y G-CSF, se deben analizar los ensayos relacionados con estas actividades.

El IL-B60 se evalúa en busca de la actividad agonística o antagónica sobre las células transfectadas que expresan el receptor de IL-6 o G-CSF y los controles. Véanse, p. ej., Ho, et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90, 11267-11271; Ho, et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:5043-5053; y Liu, et al. (1994). J. Immunol. 152:1821-1829.

El IL-B60 se evalúa en busca del efecto en la activación de macrófagos/células dendríticas y los análisis de presentación de antígenos, la producción de citoquinas por las células T y la proliferación en respuesta a un estímulo antigénico o alogénico. Véanse, p. ej., de Waal Malefyt et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1209-1220; de Waal Malefyt et al. (1991) J. Exp. Med. 174:915-924; Fiorentino, et al. (1991) J. Immunol. 147, 3815-3822; Fiorentino, et al. (1991) J. Immunol. 146:3444-3451; y Groux, et al. (1996) J. Exp. Med. 184:19-29.

El IL-B60 también se evaluará en busca de los efectos de estimulación sobre células NK. Los análisis pueden estar basados, p. ej., en Hsu, et al. (1992) Internat. Immunol. 4:563-569; y Schwarz, et al. (1994) J. Immunother. 16:95-104.

Se analizarán los efectos de crecimiento y diferenciación de células B, p. ej., mediante la metodología descrita, p. ej., por Defrance, et al. (1992). en J. Exp. Med. 175:671-682; Rousset, et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:1890-1893; incluyendo análisis del factor de cambio de IgG2 e IgA2. Obsérvese que, a diferencia de los sobrenadantes de COS7, los sobrenadantes de NIH3T3 y COP aparentemente no interfieren en los análisis de células B humanas.

F. IL-B60 y CLF-1 inducen un cambio en las propiedades del neurotransmisor

Las neuronas simpáticas colinérgicas inervan al menos tres dianas diferentes: glándulas sudoríparas, vasculatura de la musculatura esquelética, y periostio. La inervación madura de las neuronas simpáticas comienza al final de la primera semana postnatal y está caracterizada por la aparición de las propiedades colinérgicas. Se analizaron los cultivos de neuronas simpáticas en busca de la inducción de diferentes neuromoduladores, que especifican el fenotipo colinérgico. La colecistoquinina (CCK), el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP), la sustancia P (SP) y la somatostatina (SOM) son regulados al alza después de la estimulación de las neuronas con medio acondicionado de células cotransfectadas con IL-B60/CLF-1 o la proteína de fusión CNTFR-IL-B60. De este modo, el complejo muestra una función biológica evolutiva significativa, puede ser eficaz en la inducción de ciertos aspectos del desarrollo neural.

XI. Generación y Análisis de Animales Alterados Genéticamente

Se pueden generar ratones transgénicos mediante métodos convencionales. Tales animales son útiles para determinar los efectos de la sobreexpresión del gen, en tejidos específicos, o en todo el organismo. Esto puede proporcionar una nueva percepción interesante en el desarrollo del animal o en tejidos concretos en diferentes fases. Por otra parte, se puede evaluar el efecto sobre las diferentes respuestas al estrés biológico. Véase, p. ej., Hogan, et al. (1995) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2^{a} ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Están disponibles técnicas con adenovirus en busca de la expresión del gen en diferentes células y órganos. Véase, p. ej., Hitt, et al. (1997) Adv. Pharmacol. 40:137-195; y literatura de Quantum Biotechnologies, Montreal, Canada. Los animales pueden ser útiles para determinar los efectos del gen sobre diferentes sistemas animales evolutivamente o fisiológicamente funcionales.

Se ha determinado la estructura genómica para el IL-B60 de ratón. Se puede desarrollar una estrategia para la producción de ratones con el gen de IL-B60 inactivado, y elaborar los constructos apropiados.

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El SEQ ID NO: 1. es una secuencia de ácido nucleico natural de primate de IL-B60

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El SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos natural de primate de IL-B60.

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El SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ácido nucleico natural de IL-B60 de roedor.

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El SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos natural de IL-B60 de roedor.

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El SEQ ID NO: 5 es un LIF de roedor.

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El SEQ ID NO: 6 es un LIF de primate.

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El SEQ ID NO: 7 es un CT-1 de primate.

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El SEQ ID NO: 8 es un CT-1 de roedor.

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El SEQ ID NO: 9 es un CNTF de primate.

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El SEQ ID NO: 10 es un CNTF de roedor.

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El SEQ ID NO: 11 es un ADNX IL-40 de primate.

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El SEQ ID NO: 12 es un CLF-1 de primate.

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El SEQ ID NO: 13 es un CLF-1 de roedor.

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<110> Schering Corporation

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<120> Citoquinas de Mamíferos; Reactivos y Métodos Relacionados

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<130> DX0935K

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<140>

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<141>

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<150> US 09/267,901

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<151> 1999-03-11

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<160> 13

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1790

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<212> ADN

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<213> primate

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<220>

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<221> CDS

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<222> (162)..(806)

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<220>

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<221> péptido_mad

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<222> (213)..(806)

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<400> 1

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13

15

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<210> 2

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<211> 215

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 2

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16

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<210> 3

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<211> 648

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<212> ADN

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<213> primate

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(645)

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<220>

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<221> péptido_mad

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<222> (52)..(645)

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<400> 3

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17

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<210> 4

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<211> 215

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 4

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18

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<210> 5

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<211> 203

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<212> PRT

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<213> roedor

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<400> 5

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19

20

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<210> 6

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<211> 202

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 6

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21

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<210> 7

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<211> 201

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 7

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22

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<210> 8

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<211> 203

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<212> PRT

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<213> roedor

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<400> 8

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23

24

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<210> 9

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<211> 200

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 9

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25

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<210> 10

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<211> 198

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<212> PRT

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<213> roedor

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<400> 10

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27

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<210> 11

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<211> 208

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 11

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28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> primate

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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29

30

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<210> 13

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<211> 407

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<212> PRT

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<213> roedor

\newpage

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<400> 13

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31

32

Claims (30)

1. Un complejo soluble aislado que comprende:

a)

un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13; o

b)

un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R.

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2. El complejo de la Reivindicación 1 que comprende el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 y el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12.

3. El complejo de la Reivindicación 1 que comprende el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 y el polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R humano.

4. El complejo de la Reivindicación 1 que comprende el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 4 y el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 13.

5. El complejo de la Reivindicación 1 que comprende el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 4 y el polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R de ratón o rata.

6. El complejo de la Reivindicación 1, donde el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2, 4, 12, 13, o la cadena alfa del CNTF-R se produce recombinantemente.

7. El complejo de la Reivindicación 1, que:

a)

está marcado detectablemente;

b)

está en una disolución tamponada; o

c)

está en una disolución estéril.

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8. El complejo de la Reivindicación 1, que:

a)

no está glucosilado;

b)

está anclado a un sustrato sólido;

c)

está conjugado a otro radical químico; o

d)

comprende una etiqueta de detección o purificación seleccionada del grupo que comprende secuencias FLAG, His6 y Ig.

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9. Un kit que comprende:

a)

un compartimento que contiene dicho complejo de la Reivindicación 1, e

b)

instrucciones para el uso o la disposición de los componentes del kit.

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10. El complejo de la Reivindicación 1, donde:

a)

el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13, son parte de una proteína de fusión; o

b)

el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y el polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R, son parte de una proteína de fusión.

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11. El complejo de la Reivindicación 10, que:

a)

no está glucosilado;

b)

está anclado a un sustrato sólido;

c)

está conjugado a otro radical químico; o

d)

comprende una etiqueta de detección o purificación, seleccionada de un grupo que comprende secuencias FLAG, His6 e Ig.

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12. Una composición que comprende dicho complejo de la Reivindicación 10 y un portador, donde dicho portador es:

a)

una composición acuosa que comprende un compuesto seleccionado de un grupo que comprende agua, disolución salina y tampón; o

b)

se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

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13. Un kit que comprende:

a)

un compartimento que contienen el complejo de la Reivindicación 10, y

b)

instrucciones para el uso o la disposición de los componentes del kit.

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14. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a dicho complejo de la Reivindicación 1, pero no a ninguno de dichos polipéptidos maduros cuando no están en el complejo.

15. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a dicho complejo de la Reivindicación 2, pero no al polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 cuando no están en el complejo.

16. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a dicho complejo de la Reivindicación 3, pero no al polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R humano cuando no están en el complejo.

17. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a dicho complejo de la Reivindicación 4, pero no al polipéptido maduro del SEQ ID NO: 4 o el polipéptido maduro del SEQ ID NO: 13 cuando no están en el complejo.

18. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a dicho complejo de la Reivindicación 5, pero no al polipéptido maduro del SEQ ID NO: 4 o al polipéptido maduro de la cadena alfa del CNTF-R de ratón o rata cuando no están en el complejo.

19. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la Reivindicación 14, que:

a)

es un fragmento Fv, Fab, o Fab2;

b)

está conjugado a otro radical químico;

c)

es un anticuerpo policlonal;

d)

muestra una Kd para el antígeno de al menos 30 \muM;

e)

está anclado a un sustrato sólido seleccionado de un grupo que comprende una membrana con cuentas y una membrana de plástico;

f)

está en una composición estéril;

g)

está marcado detectablemente, donde dicha marca se selecciona de un grupo que comprende una marca radiactiva y una marca fluorescente;

h)

es un anticuerpo monoclonal;

i)

es un anticuerpo quimérico;

j)

es un anticuerpo humanizado; o

k)

es un anticuerpo antagónico.

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20. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la Reivindicación 14 que:

a)

es estéril, o

b)

comprende adicionalmente un portador, donde dicho portador es una composición acuosa que comprende un compuesto seleccionado de un grupo que comprende agua, disolución salina y tampón; o

c)

se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral.

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21. Un kit que comprende:

a)

un compartimento que contienen el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la Reivindicación 14, y

b)

instrucciones para el uso o la disposición de los componentes del kit.

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22. Un método para producir un antígeno, anticuerpo o un complejo de antígeno-fragmento de unión, que comprende poner en contacto, en condiciones apropiadas, el complejo de la Reivindicación 1 con el anticuerpo o antígeno-fragmento de unión de la Reivindicación 14, permitiendo de ese modo que se forme dicho complejo de antígeno:anticuerpo o antígeno-fragmento de unión.

23. El método de la Reivindicación 22, donde:

a)

dicho complejo de antígeno:anticuerpo o antígeno-fragmento de unión se purifica de otras citoquinas;

b)

dicho complejo de antígeno:anticuerpo o antígeno-fragmento de unión se purifica de otros anticuerpos;

c)

dicho complejo de antígeno:anticuerpo o antígeno-fragmento de unión está con una muestra que comprende una citoquina;

d)

dicho contacto permite la detección cuantitativa de dicho antígeno;

e)

dicho contacto es con una muestra que comprende dicho anticuerpo; o

f)

dicho contacto permite la detección cuantitativa de dicho anticuerpo.

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24. Un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la Reivindicación 10.

25. El ácido nucleico recombinante de acuerdo con la Reivindicación 24 que:

a)

es un vector de expresión;

b)

comprende adicionalmente un origen de replicación;

c)

comprende una marca detectable;

d)

tiene menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb.

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26. Una célula que comprende dicho ácido nucleico recombinante de la Reivindicación 24.

27. La célula de la Reivindicación 26, donde dicha célula es:

a)

una célula procariótica;

b)

una célula eucariótica;

c)

una célula bacteriana;

d)

una célula de levadura;

e)

una célula de insecto;

f)

una célula de mamífero;

g)

una célula de ratón;

h)

una célula de primate; o

i)

una célula humana.

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28. Un kit que comprende un compartimento que contiene dicho ácido nucleico recombinante de la Reivindicación 24, donde dicho kit comprende adicionalmente:

a)

un compartimento que contiene un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2;

b)

un compartimento que contiene un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12;

c)

un compartimento que contiene un polipéptido maduro del la cadena alfa del CNTF-R humano; o

d)

instrucciones para el uso o la disposición de los componentes del kit.

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29. Un método in vitro para aumentar la secreción del complejo de la Reivindicación 1 que comprende la expresión de un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4, y un polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13, en una célula.

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30. El método de la Reivindicación 29, donde:

a)

dicho aumento es de al menos 3 veces; o

b)

dicha expresión es de un ácido nucleico recombinante que codifica

1)

dicho polipéptido maduro del SEQ ID NO: 2 o 4;

2)

dicho polipéptido maduro del SEQ ID NO: 12 o 13; o

3)

tanto 1) como 2).