ES2320006T3 - Marcador para la neuromielitis optica. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia o ausencia de un autoanticuerpo NMO-específico en una muestra biológica de un individuo, que comprende las etapas de: poner en contacto dicha muestra biológica con un polipéptido antigénico de NMO o su fragmento, en el que dicho polipéptido antigénico de NMO es acuaporina-4; y detectar la presencia o ausencia de la unión de dicho polipéptido antigénico de NMO a dicho autoanticuerpo NMOespecífico en dicha muestra biológica.
Description
Marcador para la neuromielitis óptica.
Esta invención se refiere, de forma general, a
trastornos neurológicos, y más en particular, a un marcador de
autoanticuerpo para la neuromielitis óptica, mielitis recurrente o
neuritis óptica, y la forma óptico-espinal asiática
de la esclerosis múltiple (EM).
La neuromielitis óptica (NMO) es un trastorno
neurológico también conocido como el síndrome de Devic en los
países occidentales y como esclerosis múltiple
óptico-espinal en Asia. La NMO está considerada como
una variante severa de la esclerosis múltiple (EM), y constituye el
30% de los casos de EM que aparecen en asiáticos. En Norteamérica,
los no caucásicos presentan una frecuencia más alta de pacientes con
NMO que la frecuencia de los de EM clásica. Las lesiones
desmielinizantes inflamatorias características de la NMO afectan
selectivamente y repetidamente a los nervios ópticos y a la médula
espinal, causando así tanto ceguera como parálisis.
Haase et al. (2001, Neuroscli.
Lett., 307 (2):131-3), describe la
detección de autoanticuerpos específicos cerebrales frente a la
glicoproteína de la mielina/oligodendrocito, S100beta y la proteína
básica de mielina en pacientes con neuromielitis óptica de Devic.
Fueron examinadas las respuestas de los anticuerpos frente a
mielina y a antígenos astrogliales en cuatro pacientes con NMO.
Vizuete et al. (1999, Neurobiology of
Disease 6:245-258) describen la
sobre-regulación diferencial de
acuaporina-4 en la expresión del mRNA en astrocitos
reactivos después de lesión cerebral. Los estudios de
colocalización demostraron que la acuaporina-4 en la
inducción del mRNA estaba restringida a los astrocitos
hipertróficos. Los autores sugieren que la inducción de la expresión
de mRNA de acuaporina-4 está relacionada con la
alteración de la barrera sangre-cerebro y en
condiciones de edema cerebral este canal de agua desempeña un papel
fundamental en el reestablecimiento del equilibrio osmótico
cerebral.
Se ha identificado un marcador específico en
suero y fluido cerebroespinal de pacientes con neuromielitis óptica
(NMO) y la forma óptico-espinal asiática de la EM.
La presencia de un anticuerpo NMO-específico puede
ser usada para distinguir la NMO de la EM, y también puede ser usada
para diagnosticar NMO en una etapa temprana de la enfermedad antes
de que sean cumplidos todos los criterios clínicos, justificándose
así una iniciación previa de la terapia inmunodepresiva apropiada
para NMO.
En un aspecto, la invención proporciona métodos
para detectar la presencia o la ausencia de un autoanticuerpo
NMO-específico en una muestra biológica de un
individuo. Tal método incluye poner en contacto la muestra biológica
con un polipéptido antigénico de NMO o su fragmento, donde el
polipéptido antigénico de NMO es acuaporina-4; y
detectar la presencia o ausencia de la unión del polipéptido
antigénico de NMO frente al autoanticuerpo
NMO-específico en la muestra biológica. En una
realización, el polipéptido antigénico de NMO es un polipéptido
antigénico de NMO recombinantemente expresado. En otra realización,
el polipéptido NMO-específico está en un tejido
sólido seleccionado del grupo que consiste en cerebro, médula
espinal, nervio óptico, riñón o estómago.
Por ejemplo, la presencia del autoanticuerpo
NMO-específico en la muestra biológica puede estar
asociado a una incapacidad visual, debilidad, entumecimiento,
espasmos o sensaciones anormales o dolorosas, y/o pérdida de
control de vejiga y/o intestino en el individuo. Además, la
presencia del autoanticuerpo NMO-específico está
asociada generalmente con la NMO en el individuo. La muestra
biológica representativa es seleccionada del grupo que consiste en
sangre, suero, plasma y fluido cerebroespinal.
En otro aspecto, la invención proporciona
métodos para detectar la presencia o la ausencia de un polipéptido
antigénico de NMO en una muestra biológica de un individuo. Tal
método incluye poner en contacto la muestra biológica con un
anticuerpo del antígeno anti-NMO, donde el antígeno
de NMO es acuaporina-4; y detectar la unión del
anticuerpo del antígeno anti-NMO frente a la muestra
biológica, en el que la unión es indicativa de la presencia del
polipéptido antigénico de NMO en la muestra biológica.
Generalmente, la presencia del polipéptido antigénico de NMO en la
muestra biológica es indicativa de NMO en el individuo. Tal
individuo puede ser parcialmente o completamente ciego. Las
muestras biológicas representativas incluyen sangre, suero, plasma,
fluido cerebroespinal, biopsia cerebral y biopsia de médula
espinal.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso
de un artículo de fabricación incluyendo un polipéptido antigénico
de NMO para el diagnóstico in vitro de NMO para detectar un
autoanticuerpo del antígeno anti-NMO en un
individuo. El polipéptido antigénico de NMO es
acuaporina-4. Tal artículo de fabricación puede ser
usado para diagnosticar NMO en el individuo. En una realización, el
artículo de fabricación puede incluir además un anticuerpo
monoclonal que tenga una afinidad de unión específica para un
polipéptido antigénico de NMO.
Los métodos para tratar a un individuo que tiene
NMO incluyen retirar un fluido corporal del individuo, en el que el
fluido corporal contiene uno o varios autoanticuerpos que se unen a
acuaporina-4; retirar una parte sustancial de los
autoanticuerpos del fluido corporal; y devolver el fluido corporal
al sujeto.
En otro aspecto más, la invención proporciona
usos médicos para métodos para tratar a un individuo que tiene NMO
administrando un polipéptido antigénico de NMO al individuo. El
polipéptido antigénico de NMO es acuaporina-4.
Generalmente, la administración es por un método tal como la
administración oral, intravenosa y parenteral.
En otro aspecto, la invención proporciona usos
médicos para métodos para tratar a un individuo que tiene NMO
administrando un ácido nucleico que codifica un polipéptido
antigénico de NMO al individuo. El polipéptido antigénico de NMO es
acuaporina-4.
A menos que se definan de otra forma, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo sentido que comúnmente se entiende por cualquier experto en la
técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque puedan ser
usados en la práctica o en las pruebas de la presente invención,
métodos y materiales similares, o equivalentes a los descritos en
este documento, los métodos y materiales convenientes son los
descritos más abajo. Además, los materiales, los métodos y los
ejemplos son sólo ilustrativos y no se tiene la intención de que
sean restrictivos. En caso de conflicto, la presente memoria
descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá.
Los detalles de una o varias realizaciones de la
invención son expuestos en adelante en los dibujos que acompañan y
la descripción de más abajo. Otras características, objetos y
ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y
de la descripción detallada, y de las reivindicaciones.
La figura 1 es una hoja de resultados usada para
evaluar el modelo de tinción inmunohistoquímico y la intensidad de
los tejidos puestos en contacto con el suero de un individuo.
La figura 2 es un mapa de restricción de un
ácido nucleico de acuaporina-4 humano.
Los símbolos de referencia típicos en los
diversos dibujos indican a los elementos típicos.
Se ha identificado un marcador de autoanticuerpo
de IgG específico en suero y fluido cerebroespinal de pacientes con
neuromielitis óptica (NMO) y EM óptico-espinal
asiática (la NMO es usada de forma sinónima en esta aplicación para
referirse tanto a NMO como a EM óptico-espinal
asiática). Además, este autoanticuerpo puede ser encontrado en
pacientes con un espectro de trastornos inflamatorios que impliquen
a la médula espinal, el nervio óptico, y más raramente, el tronco
encefálico u otras regiones del cerebro, que no han sido reconocidas
hasta ahora de que estén relacionadas con NMO.
La presencia de un anticuerpo
NMO-específico puede ser usada para diagnosticar NMO
en una etapa temprana de la enfermedad antes de que todos los
criterios clínicos sean satisfechos, justificándose así la
iniciación previa de una terapia inmunodepresiva apropiada para
NMO, y puede ser usada además para distinguir la NMO de la EM. La
detección del anticuerpo NMO-específico también
puede proporcionar un biomarcador cuantificable para monitorizar la
progresión de la enfermedad y la respuesta a la terapia. El modelo
de inmunotinción también puede ser usado para clasificar a los
trastornos relacionados con NMO, incluyendo variantes de la
esclerosis múltiple, episodio aislado de neuritis óptica, ciertas
mielopatías y los acompañamientos
"óptico-espinales" del lupus eritematoso
sistémico y el síndrome de Sjogren. Además, la identificación de un
anticuerpo asociado a NMO proporciona un instrumento de IgG valioso
para desarrollar modelos en animales (p. ej., por transferencia
pasiva de anticuerpos NMO-específicos o inmunización
activa con polipéptidos antigénicos de NMO o vacunas de ADN que
codifiquen tales polipéptidos antigénicos) para investigar la
patogénesis de lesiones de NMO y probar nuevas terapias potenciales
para NMO.
La presente invención proporciona métodos para
detectar autoanticuerpos NMO-específicos en un
individuo usando polipéptidos antigénicos de NMO. Los individuos
para quienes los métodos de la invención podrían ser usados
presentan típicamente incapacidad visual y/u hormigueo,
entumecimiento, debilidad, espasmos en miembros, pérdida de control
de vejiga y/o intestino, u otros síntomas neurológicos de origen
desconocido. El método de la invención está basado en una
asociación entre los síntomas neurológicos anormales y la presencia
de los autoanticuerpos NMO-específicos en el
individuo.
Los polipéptidos antigénicos de NMO incluyen a
uno o varios sitios epitópicos. También son descritos epítopos de
polipéptidos antigénicos de NMO que son pertinentes para la
activación y la supresión de células T. Están disponibles
algoritmos informáticos para predecir la unión de epítopos, p. ej.,
los epítopos de unión MHC-I y
MHC-II. Véase, por ejemplo,
http://bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bind/ (Parker et al.,
J. Immunol., 152:163 (1994); Southwood et al.,
J. Inmunol., 160:3363 (1998)). El término
"característico" en este contexto significa que el sitio
epitópico permite la detección inmunológica del anticuerpo
NMO-específico en sueros con un acierto razonable.
Por lo general, es deseable que el sitio epitópico sea
antigénicamente distinto a los de otros antígenos estrechamente
relacionados (p. ej., otros miembros de una familia de
polipéptidos). Un fragmento antigénico representativo puede
incluir, por ejemplo, el dominio extracelular de una proteína unida
a la membrana.
Los polipéptidos antigénicos de NMO pueden ser
obtenidos a partir de células (p. ej, células huésped transfectadas)
que expresen un ácido nucleico, o los polipéptidos pueden ser
sintéticos. Una molécula de ADN que codifique un polipéptido
antigénico de NMO o su fragmento puede ser natural o sintética,
siendo los genes naturales obtenibles a partir de tejidos humanos
por técnicas convencionales.
Los polipéptidos antigénicos de NMO pueden ser
obtenidos en una forma sustancialmente pura. Con respecto a los
polipéptidos, "purificado" se refiere a un polipéptido que
constituye el componente principal en una mezcla de componentes, p.
ej., el 50% o más, el 60% o más, el 70% o más, el 80% o más, el 90%
o más, o el 95% o más, en peso. Los polipéptidos purificados son
típicamente obtenidos por la purificación de un organismo que
produce el polipéptido, aunque sea también factible la síntesis
química. Los polipéptidos pueden ser purificados por métodos de
purificación de proteínas rutinarios, incluyendo la cromatografía de
afinidad o una columna de afinidad inmunoabsorbente.
Los polipéptidos antigénicos de NMO usados en la
presente invención pueden ser usados con o sin la modificación para
la detección de autoanticuerpos NMO-específicos. Con
frecuencia, los polipéptidos son marcados combinando covalentemente
o no covalentemente el polipéptido con una segunda sustancia que
proporcione la señal detectable. Una amplia variedad de marcadores
y técnicas de conjugación es conocida en la técnica y se discute
extensivamente tanto en la literatura científica como de patentes.
Algunos de los marcadores incluyen radioisótopos, enzimas,
sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes,
quimioluminiscentes, partículas magnéticas y otros por el
estilo.
Los polipéptidos antigénicos de NMO preparados
como se describe más arriba pueden ser usados en varias técnicas
inmunológicas para detectar autoanticuerpos
NMO-específicos en muestras biológicas, tales como
suero y fluido cerebroespinal. Según la naturaleza de la muestra,
pueden ser usadas tanto técnicas por inmunoensayos como de tinción
inmunocitoquímica. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima
(ELISA), transferencia Western, y radioinmunoensayos son métodos
rutinarios en la técnica y pueden ser usados para detectar la
presencia de autoanticuerpos NMO-específicos en
sueros.
Además se describen kits que contienen uno o
varios polipéptidos antigénicos de NMO. El kit puede incluir además
una segunda sustancia que proporcione la señal detectable. Un kit
típicamente también incluye directrices para usar el polipéptido
antigénico de NMO y/o para poner en práctica un método de la
invención (es decir, detectar autoanticuerpos
NMO-específicos en una muestra biológica).
La presente invención también proporciona
métodos para detectar polipéptidos antigénicos de NMO en una muestra
biológica de un individuo. El método describe una asociación entre
la presencia de niveles anormales o el modelo de expresión del
polipéptido antigénico de NMO, el autoanticuerpo
NMO-específico posteriormente producido, y el NMO
resultante en los individuos. Este ensayo es el más extensamente
aplicable para aquellos individuos que presenten síntomas
neurológicos o ceguera, y aquellos individuos que se sospeche que
padecen EM o NMO. La detección de un polipéptido es típicamente
realizada usando un anticuerpo, denominado en este documento como
un anticuerpo del antígeno anti-NMO para distinguir
a tales autoanticuerpos animales o recombinantemente generados a
partir de anticuerpos NMO-específicos producidos por
el sistema inmunológico del individuo. La invención también
proporciona el uso de un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo
monoclonal con una afinidad de unión específica para polipéptidos
antigénicos de NMO.
Una vez que haya sido obtenida una cantidad
suficiente de polipéptidos antigénicos de NMO, los anticuerpos
monoclonales o policlonales del antígeno anti-NMO
que tienen afinidad de unión específica con el polipéptido
antigénico de NMO pueden ser producidos por técnicas conocidas para
los expertos ordinarios de esta técnica. Como se usa en este
documento, los anticuerpos anti-NMO de antígeno que
tienen una "afinidad de unión específica" para los
polipéptidos antigénicos de NMO son definidos como aquellos
anticuerpos que se unen a polipéptidos antigénicos de NMO pero que
no se unen a otros polipéptidos, por ejemplo, otros miembros de una
familia de polipéptidos. Como se usa en este documento,
"anticuerpo del antígeno anti-NMO" se refiere a
anticuerpos enteros de cualquier clase, es decir, IgG, IgA, IgM o
cualquier otra clase conocida, y también incluye partes o fragmentos
de anticuerpos enteros (p. ej., Fab o fragmentos
(Fab)_{2}) que tienen una afinidad de unión específica
deseada, una molécula de Fv monocatenaria modificada, o una molécula
quimérica, p. ej., un anticuerpo que posee especificidad de unión
de un anticuerpo (p. ej., de origen murino) y las partes restantes
de otro anticuerpo (p. ej., de origen humano).
Los anticuerpos del antígeno
anti-NMO usados en la presente invención pueden ser
usados con o sin una modificación para la detección de polipéptidos
antigénicos de NMO. Los anticuerpos del antígeno
anti-NMO pueden ser marcados directamente o
indirectamente, y se conoce una amplia variedad de marcadores,
incluyendo radioisótopos, enzimas, sustratos, cofactores,
inhibidores, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes y partículas
magnéticas, y técnicas de conjugación y se publican extensivamente
en ambas literatura científica y de patentes.
Los anticuerpos del antígeno
anti-NMO preparados como se describe más arriba
pueden ser usados en varias técnicas inmunológicas para detectar
polipéptidos antigénicos de NMO en una muestra biológica. Una
"muestra biológica", según se usa en este documento, es
generalmente una muestra de un individuo. Los ejemplos no
restrictivos de muestras biológicas incluyen sangre, suero, plasma
o fluido cerebroespinal. Además, pueden ser usados tejidos sólidos,
por ejemplo, biopsias de médula espinal o cerebrales. El uso de
anticuerpos en ensayos de unión de proteínas es bien conocido.
Según la naturaleza de la muestra, pueden ser usadas técnicas de
inmunoensayos (p. ej., radioinmunoensayos) y/o de tinción
inmunohistoquímica/inmunocitoquímica. Los inmunoensayos en fase
líquida (p. ej., radioinmunoensayos de inhibición competitiva) o
inmunoensayos en fase sólida (p. ej., captura de antígeno o
análisis de transferencia Northern) también pueden ser usados para
detectar polipéptidos antigénicos de NMO en una muestra biológica.
Además, los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) son
rutinariamente puestos en práctica en la técnica, y pueden ser
usados para detectar la presencia de polipéptidos antigénicos de NMO
en una muestra biológica.
Se han descrito numerosos ensayos de unión de
proteínas competitivos y no competitivos en la literatura científica
y de patentes, y un gran número de tales ensayos está
comercialmente disponible. Un ejemplo de un tal ensayo competitivo
para detectar la presencia de un polipéptido antigénico de NMO en
una muestra biológica tal como suero, comprende: poner en contacto
un polipéptido antigénico de NMO (marcado o no marcado) con un
anticuerpo del antígeno anti-NMO (marcado o no
marcado) y la muestra biológica. El polipéptido antigénico de NMO
puede ser, por ejemplo, unido a una superficie sólida. Utilizando
cantidades conocidas del polipéptido antigénico de NMO y del
anticuerpo del antígeno anti-NMO marcado para
generar una curva de unión estándar, puede ser determinada la
cantidad relativa de polipéptido antigénico de NMO en una muestra
biológica.
Además se describe un kit que contiene
anticuerpos de antígeno anti-NMO que tienen afinidad
de unión con los polipéptidos antigénicos de NMO o sus fragmentos.
El kit también puede incluir polipéptidos antigénicos de NMO o sus
fragmentos que se usan como controles de unión o para generar una
curva cuantitativa estandarizada. El kit puede incluir además una
segunda sustancia que proporcione un marcador detectable. Un kit
incluye típicamente directrices para usar un anticuerpo del
antígeno anti-NMO y/o poner en práctica un método de
la invención (es decir, detectar polipéptidos antigénicos de NMO en
una muestra biológica).
También se proporciona mediante esta descripción
un anticuerpo del antígeno anti-NMO que tiene una
afinidad de unión específica de polipéptidos antigénicos de NMO
conjugados a un marcador detectable. Los marcadores detectables
convenientes incluyen, pero no están limitados a, enzimas,
radioisótopos, tintes y biotina. Esta descripción proporciona
además un anticuerpo del antígeno anti-NMO que tiene
una afinidad de unión específica para polipéptidos antigénicos de
NMO conjugados a un agente de visualización. Los agentes de
visualización convenientes incluyen, pero no están limitados a,
radioisótopos, tales como ^{32}P, ^{99}Tc, ^{111}In y
^{131}I.
El tratamiento de NMO requiere la modulación de
los síntomas neurológicos en el individuo que resultan de
mecanismos inmunes NMO-específicos. Los métodos para
tratar a un individuo con NMO incluyen, sin limitación, la aferesis
e inmunoterapia basada en receptor de células T.
Los métodos y los sistemas extracorporales para
la aferesis (es decir, el proceso de retirada de sangre de un
individuo, quitando componentes de la sangre, y devolviendo la
sangre, o sangre desprovista de uno o varios componentes, al
individuo) son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las
patentes de EE.UU. N^{os}. 4.708.713; 5.258.503; 5.386.734; y
6.409.696). La descripción proporciona un método para eliminar los
autoanticuerpos NMO-específicos de un fluido
corporal de un individuo. El método implica retirar un fluido
corporal de un sujeto; eliminar una parte sustancial de
autoanticuerpos NMO-específicos del fluido; y
devolver el fluido al sujeto. Los anticuerpos eliminados pueden ser
de cualquier clase, p. ej., anticuerpos de IgG (tales como IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgD, IgA, o IgE.
Como se usa en este documento, una "parte
sustancial" significa eliminar al menos el 20% (p. ej., al menos:
20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 93%; 95%;
96%; 97%; 98%; 99%; 99,5%; 99,8%; o hasta el 100%) de los
autoanticuerpos NMO-específicos que estaban
presentes en el fluido corporal antes de la eliminación. El fluido
corporal puede ser plasma sanguíneo o cualquier otro fluido
corporal, p. ej., linfa o fluido cerebroespinal. Según los métodos
de la descripción, el agotamiento de los autoanticuerpos
NMO-específicos de individuos con NMO causará una
disminución en los síntomas.
La eliminación de autoanticuerpos
NMO-específicos es realizada generalmente poniendo
en contacto un fluido corporal con un polipéptido antigénico de
NMO. El polipéptido antigénico de NMO puede estar unido a un soporte
sólido. Tales soportes sólidos pueden ser, sin limitación,
membranas, fibras, perlas esféricas o gránulos y pueden ser hechos
con una sustancia insoluble en agua, preferentemente porosa,
material biocompatible, p. ej., polímeros orgánicos tales como
agarosa, dextrano y poliacrilamida, o materiales porosos inorgánicos
tales como vidrio poroso o gel de sílice poroso. Tales materiales
son adecuados o pueden ser adaptados (p. ej., derivatizados con
grupos químicos apropiados) para la unión de un polipéptido
antigénico de NMO.
Cuando el fluido corporal es sangre, el plasma
y/o los leucocitos pueden ser separados de los glóbulos rojos (p.
ej., eritrocitos) y los glóbulos rojos pueden ser devueltos al
individuo con o sin leucocitos. Por lo general, las células de la
sangre son devueltas al individuo con plasma sanguíneo artificial en
vez del plasma sanguíneo original. El "fluido de reemplazo"
(p. ej., solución salina fisiológica) puede ser administrado al
individuo después de la eliminación del fluido. O bien, los
autoanticuerpos NMO-específicos pueden ser
eliminados selectivamente del plasma sanguíneo en el curso de la
aferesis y las células de la sangre pueden ser mezcladas con el
plasma agotado de autoanticuerpos NMO-específicos y
luego ser infundido de nuevo como una mezcla en el individuo.
El sistema puede ser uno continuo en el cual,
por ejemplo, la sangre sea bombeada desde un vaso sanguíneo (p.
ej., una arteria o una vena), pasada sobre un soporte sólido
derivatizado con polipéptidos antigénicos de NMO y bombeada
directamente de vuelta a un vaso sanguíneo del sujeto. Como en los
sistemas no continuos, las células de la sangre pueden ser
separadas del plasma antes del paso del plasma sobre el soporte
sólido.
Los métodos de terapia con receptores de células
T son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de
EE.UU. N^{os}. 5.614.192; Matsumoto et al., 2000, J.
Inmunol., 164:2248-54; y Mackay, 2000,
British Med. J., 321:93-6. Los
anticuerpos monoclonales o policlonales que tienen una afinidad de
unión específica para el(los) antígeno(s)
expresado(s) por el receptor del antígeno NMO u otro marcador
en la población de células T responsable de inducir y mantener la
producción de autoanticuerpos NMO-específicos pueden
ser usados para agotar o suprimir una o varias células T patógenas.
La espectrotipificación de CDR3 de receptores de células T puede
ser usada para identificar receptores de células T asociados a
enfermedades autoinmunes (Matsumoto et al., supra; y
Jambou et al., 2003, J. Clin. Invest.,
112:254-74). Además, la activación de
células T puede ser inhibida en un individuo administrando una
citoquina o un anticuerpo que tiene una afinidad de unión
específica para una citoquina. Por ejemplo, para disminuir una
respuesta inmune tipo Th1, una citoquina tal como una interleuquina
(IL)-4, IL-10 o
IL-13, o un anticuerpo específico para una
citoquina, tal como IL-12 o el interferón
(IFN)-K puede ser administrado a un individuo. Del
mismo modo, para inhibir una respuesta inmune tipo Th2, una
citoquina, tal como IL-12 o IFN-K o
un anticuerpo específico para IL-4,
IL-10, o IL-13 puede ser
administrado a un individuo.
Además, el método terapéutico puede incluir
administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica (p.
ej., un polipéptido antigénico de NMO o un ácido nucleico tal como
un oligonucleótido antisentido o un ácido nucleico que codifique un
polipéptido antigénico de NMO) al individuo. Una cantidad eficaz es
una cantidad de polipéptido antigénico de NMO que desvía la
respuesta inmune mediada del polipéptido antigénico de NMO del
individuo, modulando así un trastorno neurológico en el individuo.
Como se usa en este documento, "modular" un trastorno
neurológico puede referirse a reducir la severidad de uno o varios
síntomas, eliminar todos los síntomas, o cualquier nivel de síntomas
entre estos.
Un "oligonucleótido antisentido" es un
oligonucleótido que puede hibridarse específicamente a un ácido
nucleico objetivo, y la modulación de la expresión de un ácido
nucleico objetivo por un oligonucleótido antisentido se denomina
generalmente "tecnología antisentido." El término
"hibridación", según se usa en este documento con respecto a
la tecnología antisentido, se refiere a la unión de hidrógeno, que
puede ser una unión de hidrógeno Watson-Crick,
Hoogsteen o Hoogsteen invertida, entre regiones complementarias del
ácido nucleico objetivo y el oligonucleótido antisentido.
"Específicamente hibridizable" se usa para indicar un grado
suficiente de complementariedad o apareamiento preciso tal que se
dé una unión estable y específica entre el oligonucleótido
antisentido y el ácido nucleico objetivo. Se sobrentiende en la
técnica que la secuencia de un oligonucleótido antisentido no tiene
que ser 100% complementaria con la de su ácido nucleico objetivo
para ser específicamente hibridizable.
La hibridación específica de un oligonucleótido
antisentido con su ácido nucleico objetivo puede interferir con la
función normal del ácido nucleico objetivo. Para un ácido nucleico
de ADN objetivo, la tecnología antisentido puede alterar la
replicación y la transcripción. Para un ácido nucleico de ARN
objetivo, la tecnología antisentido puede alterar, por ejemplo, la
translocación del ARN al sitio de traducción de la proteína, el
empalme del ARN para proporcionar una o varias especies de mRNA, la
actividad catalítica del ARN y la traducción de la proteína a
partir del ARN. El efecto global de tal interferencia con la función
del ácido nucleico objetivo es, en el caso de un ácido nucleico que
codifique un polipéptido antigénico de NMO, la modulación de los
síntomas de la enfermedad asociados a NMO. En el contexto de la
presente invención, la tecnología antisentido puede ser usada para
disminuir la expresión de un gen que codifique un polipéptido
antigénico de NMO (p. ej., debido a la inhibición de la
transcripción) y/o para disminuir los niveles celulares del
polipéptido antigénico de NMO (p. ej., debido a la inhibición de
la
traducción).
traducción).
Los sitios objetivos preferidos para los
oligonucleótidos antisentido han incluido las regiones que abarcan
el codón de iniciación de la traducción o terminación del marco de
lectura abierto (ORF) del gen objetivo. Además, el marco de lectura
abierto ha sido modificado genéticamente con eficacia en la
tecnología antisentido, ya que tiene las regiones 5' y 3' no
traducidas. Además, los oligonucleótidos antisentido han sido
dirigidos con éxito a regiones intrón y regiones de unión
intrón-exón. Además, pueden ser usados múltiples
oligonucleótidos antisentido que se hibriden cada uno
específicamente a una región diferente de un gen objetivo.
Los oligonucleótidos antisentido (por ejemplo,
siARN) útiles en los métodos de la invención tienen generalmente de
aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud (p.
ej., de 12 a 40, de 14 a 30, o de 15 a 25 nucleótidos de longitud),
pero pueden ser más largos o más cortos siempre que el
oligonucleótido antisentido sea capaz de modular los síntomas
asociados a NMO. Como se usa en este documento, los oligonucleótidos
antisentido incluyen los oligonucleótidos formados de nucleobases
naturales, azúcares y enlaces de internucleósidos covalentes
(estructura), así como oligonucleótidos que contienen estructuras
modificadas (p. ej., restos de azúcares sustituidos) o enlaces de
internucleósidos artificiales. Los oligonucleótidos antisentido
también incluyen análogos de oligonucleótido tales como ácidos
nucleicos peptídicos (PNA) u oligonucleótidos quiméricos. Además,
los oligonucleótidos antisentido usados en la invención pueden ser
modificados por enlace químico a uno o varios restos o conjugados
que realcen la actividad, la distribución celular o el consumo
celular del oligonucleótido. Véanse, por ejemplo, las patentes de
EE.UU. N^{os}. 5.218.105 y 5.214.136.
La capacidad de un oligonucleótido antisentido
de inhibir la expresión y/o la producción de un polipéptido
antigénico de NMO puede ser evaluada, por ejemplo, midiendo los
niveles de mRNA o proteína en un individuo antes y después del
tratamiento. Los métodos para medir los niveles de mRNA y proteína
en tejidos o muestras biológicas son conocidos en la técnica.
Los polipéptidos antigénicos de NMO también
puede ser medicados in vivo administrando un vector que
exprese apropiadamente un ácido nucleico que codifique un
polipéptido antigénico de NMO al individuo. Vectores para
administrar ácidos nucleicos que codifiquen proteínas biológicamente
útiles (p. ej., un polipéptido antigénico de NMO) a un individuo
son conocidos en la técnica. Los vectores para administrar ácidos
nucleicos basados en virus actuales son típicamente derivados de
virus animales, tales como adenovirus, virus
adeno-asociados, retrovirus, lentivirus, virus de
vacuna, virus del herpes, y virus de papiloma bovino. Los vectores
para administrar ácidos nucleicos han sido, por lo general,
genéticamente modificados tal que el tropismo natural y la
patogenicidad del virus ha sido cambiada o eliminada. El genoma de
un virus también puede ser modificado para aumentar su infectividad
y acomodar la envoltura de los ácidos nucleicos que codifican, por
ejemplo, una proteína biológicamente útil. Además, los vectores no
virales y los métodos para usar tales vectores para la
administración de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos
en la técnica.
Como se usa en este documento,
"administrar" se refiere a un método para medicar una
composición de la invención (p. ej., un polipéptido antigénico de
NMO, un oligonucleótido antisentido que se hibride específicamente a
una parte del ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico
de NMO, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico
de NMO) al paciente. Tales métodos son conocidos por los expertos en
la técnica e incluyen, pero no están limitados a, la administración
oral, nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,
subcutánea, intratecal, intradermal o tópica. La ruta de
administración puede depender de una variedad de factores, tales
como los objetivos terapéuticos. Las composiciones usadas en la
invención pueden ser administradas en una base continua o
intermitente. Los métodos para la formulación y, posteriormente,
administración de composiciones terapéuticas son conocidos por los
expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, 2000, The
Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed., Gennaro y Gennaro,
ediciones, Lippincott, Williams y Wilkins. La dosis administrada
dependerá de muchos factores, incluyendo el modo de administración y
la formulación. Típicamente, la cantidad en una dosis individual es
una cantidad que reduce con eficacia el nivel de polipéptidos
antigénicos de NMO o autoanticuerpos NMO-específicos
en un individuo sin exacerbar los síntomas de enfermedad.
Además, un polipéptido antigénico de NMO puede
contener adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable
para la administración in vivo a un individuo, incluyendo,
sin limitación, soluciones acuosas o no acuosas estériles,
suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos
incluyen, sin limitación, propilenglicol, polietilenglicol, aceites
vegetales y ésteres orgánicos inyectables. Los vehículos acuosos
incluyen agua, alcohol, solución salina y soluciones tampón. Los
vehículos farmacéuticamente aceptables también pueden incluir
vehículos acuosos fisiológicamente aceptables (p. ej., solución
salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial) u otros
vehículos conocidos apropiados para rutas específicas de
administración. Los compuestos adicionales pueden ser incluidos con
un polipéptido antigénico de NMO, tales como esteroides, agentes
mucolíticos, agentes antinflamatorios, inmunodepresivos,
dilatadores, vasoconstrictores o sus combinaciones. También pueden
estar presentes conservantes, aromatizantes y otros aditivos tales
como, por ejemplo, anti-microbianos, antioxidantes,
agentes quelantes, gases inertes y otros por el estilo.
Los métodos para administrar una composición al
cerebro son conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición
puede ser modificada uniendo un ligando (p. ej., un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo) que reconoce un receptor específico
cerebral o específico neuronal. Además, los métodos para realzar el
transporte de moléculas a través de la barrera
sangre-cerebro son conocidos, y aprovechan la
difusión pasiva (p. ej., usando campos electromagnéticos, donadores
de óxido nítrico o caprato de sodio) o endocitosis mediada de
receptor (p. ej., la unión de la partícula de virus a, por ejemplo,
un anticuerpo anti-transferina o a putrescina). La
expresión de un vector viral que lleva la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica un polipéptido antigénico de NMO también
puede ser dirigada usando un promotor específico cerebral o
específico neuronal y/o elementos reguladores transcripcionales
(véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.976.872 o
6.066.726). Un promotor útil en particular para la expresión
específica del proceso de pie de astrocito de un ácido nucleico que
codifica un polipéptido antigénico de NMO es una proteína ácida
fibrilar glial (GFAP), que es un marcador de diferenciación de
astrocitos.
También se proporciona mediante esta descripción
un método de visualización de células que expresan el polipéptido
antigénico de NMO en un paciente. El método comprende administrar al
paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo del antígeno
anti-NMO que tiene una afinidad de unión específica
para un polipéptido antigénico de NMO marcado por un agente de
visualización, por ejemplo, ^{32}P, ^{99}Tc, ^{111}In o
^{131}I, para unir un polipéptido antigénico de NMO liberado de,
o accesible en, células, y detectar cualquier complejo así formado.
Como es conocido por los expertos ordinarios en la técnica, una
cantidad conveniente de un anticuerpo del antígeno
anti-NMO es cualquier cantidad que sea eficaz para
visualizar células, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mCi a
aproximadamente 50,0 mCi. Además, una cantidad eficaz de un
anticuerpo del antígeno anti-NMO puede ser una
cantidad de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg. Los
métodos convenientes para administrar el agente de visualización
son como los descritos anteriormente y pueden ser dirigidos (p. ej.,
al cerebro) como se describe anteriormente. Los métodos de
visualización son dependientes del agente usado y son conocidos por
los expertos en esta técnica.
\newpage
También se proporciona mediante la descripción
un método para contar o aislar linfocitos T específico del
polipéptido antigénico de NMO en un individuo. Este método puede ser
usado, por ejemplo, para monitorizar la respuesta inmune de un
individuo o para inmunoterapia usando células T citotóxicas
específicas del polipéptido antigénico de NMO. El método comprende
poner en contacto una muestra biológica que contiene linfocitos con
el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) tetramérico
soluble de clase I o clase II que lleva fragmentos del polipéptido
antigénico de NMO idénticos. Las moléculas de enlazantes tales como
avidina y biotina son usadas para producir el complejo tetramérico
polipéptido antigénico de NMO-MHC, que puede ser
marcado posteriormente con una molécula indicadora tal que aquellas
células T que reconocen el complejo tetramérico polipéptido
antigénico de NMO-MHC son contadas o aisladas (p.
ej., usando análisis FACS). Véase, por ejemplo, Schwartz, 1998,
New England J. Med., 339:1076-8, y
las referencias incluidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las pruebas experimentales según se revelan en
este documento sugieren que el polipéptido antigénico de NMO es
acuaporina-4. El término
"acuaporina-4" se refiere a un miembro de la
familia de acuaporina. La familia de acuaporina tiene 10 miembros
conocidos. La acuaporina-4 es expresada en la
membrana de proceso de pie astrocítico que pone en contacto los
capilares en el sistema nervioso central, y también en la membrana
basolateral de los túbulos recolectores y distales de riñón y las
células epiteliales gástricas. Los ejemplos de una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido de
acuaporina-4 humano son mostrados en los números de
entrada del GenBank U63622 y U63623. Las secuencias de aminoácidos
predichas de polipéptidos de acuaporina-4 humanos
representativos son mostradas en los números de entrada del GenBank
AAG17964, AAB26957, AAB26958, y 139178. Las secuencias de ácido
nucleico y aminoácido que codifican acuaporina-4 a
partir de otros organismos (p. ej., Mus musculus, Bos
taurus, Rattus norvegicus y Ovis aries) pueden ser
encontradas buscando en la base de datos del GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) usando "aquaporin-4"
como palabra de búsqueda.
Como se usa en este documento, el ácido nucleico
se refiere a ARN o ADN. Como se usa en este documento con respecto
a los ácidos nucleicos, "aislado" se refiere a (i) una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica parte o todo el
polipéptido de acuaporina-4 humano, pero sin
secuencias codificantes que normalmente bordean a uno o ambos lados
de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
acuaporina-4 en el genoma humano; o (ii) un ácido
nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un
organismo tal que la molécula resultante no sea idéntica a ningún
vector natural o ADN genómico.
En otro aspecto, la invención incluye usos de
fragmentos del ácido nucleico de acuaporina-4 humano
y polipéptido. Como se usa en este documento, fragmentos se refiere
a ácidos nucleicos o polipéptidos correspondientes a menos que la
secuencia de acuaporina-4 entera. Los fragmentos de
ácidos nucleicos pueden incluir aquellos fragmentos de
aproximadamente 100 nucleótidos de longitud así como fragmentos que
tengan varios cientos de nucleótidos de longitud de los números de
entrada del GenBank U63622 o U63623; o fragmentos de los números de
entrada del GenBank U63622 o U63623 de aproximadamente 10 a 50
nucleótidos de longitud. Los fragmentos incluyen, por ejemplo, los
nucleótidos 166-266, 283-306,
404-1104, 575-925,
648-698, 712-747 y
891-906 de los números de entrada del GenBank
U63622 o U63623. Tales fragmentos pueden codificar, por ejemplo, un
fragmento de polipéptido antigénico de
acuaporina-4, o tener utilidad como sondas de
hibridación o cebadores de amplificación.
La figura 2 muestra la posición relativa de
varios sitios de enzima de restricción dentro de una secuencia de
ácidos nucleicos de acuaporina-4 humana que, por vía
del ejemplo, definen posiciones, que, en varias combinaciones,
pueden ser usadas para generar fragmentos de ácidos nucleicos
útiles. Considerando la secuencia de nucleótidos de un polipéptido
de acuaporina-4 humano, prácticamente cualquier
fragmento de ácido nucleico puede ser generado por medios conocidos
(p. ej., digestión con enzima de restricción, la reacción en cadena
de la polimerasa) y, de ser deseado así, puede ser expresado para
producir el fragmento de polipéptido correspondiente. O bien, el
polipéptido de acuaporina-4 humano puede ser
dividido (p. ej., proteolíticamente) para generar directamente
fragmentos de polipéptidos.
Un fragmento de ácido nucleico o ácido nucleico
de acuaporina-4 humano puede tener una secuencia que
se desvíe de la mostrada en los números de entrada del GenBank
U63622 o U63623. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos
puede tener una identidad de secuencia de al menos el 80% respecto a
la secuencia de nucleótidos mostrada en los números de entrada del
GenBank U63622 y U63623. En algunas realizaciones, la secuencia de
ácidos nucleicos puede tener una identidad de secuencia de al menos
el 85%, una identidad de secuencia del 90%, una identidad de
secuencia del 95%, o una identidad de secuencia de al menos el 99%
respecto a los números de entrada del GenBank U63622 y U63623.
Véase, por ejemplo, los números de entrada del GenBank BC022286,
NM-004028 y NM-001650 para las
secuencias de ácidos nucleicos de la variante de
acuaporina-4.
La identidad de secuencia en porcentaje es
calculada determinando el número de posiciones emparejadas en las
secuencias de ácido nucleico alineadas o de polipéptido, dividiendo
el número de posiciones emparejadas por el número total de
nucleótidos alineados o aminoácidos, respectivamente, y
multiplicando por 100. Una posición emparejada se refiere a una
posición en la cual se dan nucleótidos idénticos o aminoácidos en la
misma posición en secuencias alineadas. El número total de
nucleótidos alineados o aminoácidos se refiere al número mínimo de
nucleótidos o aminoácidos de acuaporina-4 que son
necesarios para alinear la segunda secuencia, y no incluye la
alineación (p. ej., la alineación forzada) con secuencias de no
acuaporina-4, como las fusionadas a
acuaporina-4. El número total de nucleótidos
alineados o aminoácidos puede corresponder a la secuencia de
acuaporina-4 entera o puede corresponder a
fragmentos de la secuencia de acuaporina-4 de cadena
entera como se define en este documento.
Las secuencias pueden ser alineadas usando el
algoritmo descrito por Altschul et al. (1997, Nucleic
Acids Res., 25:3389-3402) como se
incorpora en los programas BLAST (instrumento de búsqueda de
alineación local básico), disponibles en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Las búsquedas o las alineaciones BLAST
pueden ser realizadas para determinar el porcentaje de identidad de
secuencia entre una molécula de ácido nucleico de
acuaporina-4 y cualquier otra secuencia o su parte
usando el algoritmo de Altschul et al. El BLASTN es el
programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias
de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP es el programa usado para
alinear y comparar la identidad entre secuencias de aminoácidos.
Utilizando los programas BLAST para calcular el porcentaje de
identidad entre una secuencia de acuaporina-4 y otra
secuencia, se usan los parámetros por defecto de los programas
respectivos.
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de
acuaporina-4 humano puede ser obtenido a partir de,
por ejemplo, una genoteca de cDNA hecha a partir de una línea
celular humana, o puede ser obtenido por otros medios, incluyendo,
pero no limitados a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La PCR se refiere a un procedimiento o técnica en la cual son
amplificados ácidos nucleicos objetivo. La PCR puede ser usada para
amplificar secuencias específicas de ADN así como ARN, incluyendo
secuencias del ADN genómico total o ARN celular total. Varios
métodos PCR son descritos, por ejemplo, en PCR Primer: A
Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1995. Generalmente, la información de
secuencia a partir de los extremos de la región de interés o más
allá es empleada para diseñar sondas de oligonucleótidos que son
idénticas o similares en secuencia frente a cadenas opuestas de la
plantilla que se amplifica.
Los ácidos nucleicos de
acuaporina-4 humanos pueden ser detectados, por
ejemplo, mediante una variedad de técnicas de hibridación. La
hibridación entre moléculas de ácidos nucleicos se discute
detalladamente en Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Secciones
7.37-7.57, 9.47-9.57,
11.7-11.8, y 11.45-11.57).
Para sondas de oligonucleótido menores de
aproximadamente 100 nucleótidos, Sambrook et al. muestran las
condiciones de transferencia Southern adecuadas en las Secciones
11.45-11.46. La Tm entre una secuencia que es menor
de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia puede ser
calculada usando la fórmula proporcionada en la Sección 11.46.
Sambrook et al. además describen condiciones de
prehibridación e hibridación para una transferencia Southern usando
sondas de oligonucleótidos mayores de aproximadamente 100
nucleótidos (véanse las Secciones 9.47-9.52). Las
hibridaciones con un oligonucleótido mayor que 100 nucleótidos
generalmente son realizadas a 15-25ºC por debajo de
la Tm. La Tm entre una secuencia mayor de 100 nucleótidos de
longitud y una segunda secuencia puede ser calculada usando la
fórmula proporcionada en las Secciones 9.50-9.51 de
Sambrook et al. Además, Sambrook et al. recomiendan
las condiciones indicadas en la Sección 9.54 para lavar una
transferencia Southern que ha sido sondada con un oligonucleótido
mayor de aproximadamente 100 nucleótidos.
Las condiciones bajo las cuales las membranas
que contienen ácidos nucleicos son prehibridadas e hibridadas, así
como las condiciones bajo las cuales las membranas que contienen
ácidos nucleicos son lavadas para quitar el exceso y la sonda no
expresamente ligada pueden desempeñar un papel significativo en la
severidad de la hibridación. Tales hibridaciones pueden ser
realizadas, cuando sea apropiado, en condiciones de severidad
moderadas o altas. Tales condiciones son descritas, por ejemplo, en
la sección 11.45-11.46 del Sambrook et al.
Por ejemplo, las condiciones de lavado pueden hacerse más rigurosas
disminuyendo la concentración de sal en las soluciones de lavado
y/o aumentando la temperatura a la cual se realizan los lavados.
Además, la interpretación de la cantidad de hibridación puede ser
afectada, por ejemplo, por la actividad específica de la sonda de
oligonucleótido marcada, por el número de sitios de unión de la
sonda en el ácido nucleico de plantilla al cual la sonda se ha
hibridado, y por la cantidad de exposición de una autoradiografía u
otro medio de detección.
Será fácilmente apreciado por los expertos
ordinarios en la técnica que aunque puedan ser usadas cualquier
número de condiciones de hibridación y lavadoras para examinar la
hibridación de una molécula de ácido nucleico sonda a ácidos
nucleicos objetivo inmovilizados, es más importante examinar la
hibridación de una sonda para reconocer ácidos nucleicos bajo
condiciones de hibridación idénticas, de lavado y de exposición.
Preferentemente, los ácidos nucleicos objetivo están en la misma
membrana.
Una molécula de ácido nucleico es valorada que
se hibrida a un primer ácido nucleico objetivo, pero no a un
segundo ácido nucleico objetivo si la hibridación al primer ácido
nucleico es al menos de 5 veces (p. ej., al menos 6 veces, 7 veces,
8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces) mayor
que la hibridación al segundo ácido nucleico. La cantidad de
hibridación puede ser cuantificada directamente en una membrana o a
partir de una autoradiografía usando, por ejemplo, un Phosphorlmager
o un Densitómetro (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California.).
La presente descripción incluye además vectores
que contienen un ácido nucleico de acuaporina-4
humano (véanse, por ejemplo, los números de entrada del GenBank
U63622 y U63623) o sus complementos, fragmentos de ácido nucleico
de acuaporina-4 o sus complementos, y aquellos
ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia de al menos
el 80% respecto a un ácido nucleico de acuaporina-4
o los fragmentos generados a partir de éste (o sus
complementos).
Los vectores de clonación adecuados para uso en
la presente invención están comercialmente disponibles y son usados
rutinariamente por los expertos ordinarios. Los vectores pueden
comprender además elementos necesarios para la expresión
operativamente unidos a una secuencia de ácidos nucleicos de
acuaporina-4 humana. Los "elementos necesarios
para la expresión" incluyen secuencias de promotor, y además
pueden incluir elementos reguladores, tales como secuencias
potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que
modulen la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de
acuaporina-4 humana. Como se usa en este documento,
"operativamente unido" se refiere a la colocación de un
promotor y/u otro(s) elemento(s) regulador(es)
en un constructo con relación a las secuencias de ácidos nucleicos
de acuaporina-4 humanas de tal modo que se dirige o
regula la expresión del ácido nucleico de
acuaporina-4. Tales constructos están comercialmente
disponible (p. ej., vectores de expresión) y/o son producidos por
la rutina de métodos de tecnología de ADN recombinante en la
técnica. La elección de sistemas de expresión depende de varios
factores, incluso, pero no está limitada a, la eficacia de
replicación, capacidad de selección, capacidad de inducción,
reconocimiento, el nivel de expresión deseada, la facilidad de
recuperación y la capacidad del huésped de realizar modificaciones
post-translacionales.
Como se usa en este documento, el término
"huésped" o la expresión "célula huésped" se sobrentiende
que incluye no sólo a procariotas, tales como E. coli, sino
también a eucariotas, tales como levaduras, células de insecto,
planta y animal. Las células de animal incluyen, por ejemplo,
células COS y células HeLa. Una célula huésped puede ser
transformada o transfectada con una molécula de ADN (p. ej., un
vector) usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por
los expertos ordinarios de esta técnica, tales como precipitación
de fosfato de calcio o acetato de litio, electroporación,
lipofección y bombardeo de partículas. Las células huésped que
contienen un vector para uso en la presente invención pueden ser
usadas con fines de propagación del vector, producción del ácido
nucleico de acuaporina-4 humano (p. ej., ADN, ARN,
ARN antisentido), o expresión del polipéptido de
acuaporina-4 humano o sus fragmentos.
En otro aspecto de la descripción, se
proporcionan métodos para producir polipéptidos de
acuaporina-4. Los métodos para producir
polipéptidos de acuaporina-4 incluyen, pero no están
limitados a, cultivar células huésped que contienen un vector de
expresión de acuaporina-4 en condiciones permisivas
para la expresión de acuaporina-4, y recuperar los
polipéptidos de acuaporina-4. Los métodos para
cultivar bacterias y recuperar los polipéptidos expresados son
conocidos por los expertos ordinarios de esta técnica.
Además, los ácidos nucleicos para uso en la
presente invención pueden ser detectados por métodos tales como el
análisis de transferencia Southern o Northern (es decir,
hibridación), PCR, o análisis de hibridación in situ. Las
proteínas de acuaporina-4 son típicamente detectadas
por inmunocitoquímica en líneas celulares transfectadas o por
electroforesis de gel de dodecil-sulfato de sodio
(SDS)-poliacrilamida seguido por tinción con azul
de Coomassie o análisis de transferencia Northern usando anticuerpos
(monoclonales o policlonales) que tienen una afinidad de unión
específica para un polipéptido de acuaporina-4
humano.
La invención será descrita a continuación en los
ejemplos siguientes, que no limitan el alcance de la invención
descrita en las reivindicaciones.
Para minimizar la tinción no específica, fue
preabsorbido cada suero de paciente con antígenos de hígado
mezclando 40 mg de polvo de tejido de conejillo de indias comercial
(Sigma Chemical Co., San Louis, MO) con 10 \mul de suero diluido
en 590 \mul de solución salina en tampón fosfato (PBS) que
contenía albúmina de suero bovino al 1%. Después de mezclar
suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente, el residuo
insoluble fue quitado por centrifugación (20.800xg durante 10
minutos). El polvo de hígado recién preparado (40 mg) fue
inmediatamente añadido entonces al sobrenadante del suero, y el
proceso fue repetido unas dos veces adicionales para un total de 3
absorciones consecutivas.
Un bloque de material compuesto congelado de
tres tejidos de mamíferos normales (p. ej., cerebro de ratón (tanto
cerebelo como cerebro medio), estómago y riñón) fueron
crioseccionados (4 \mu de grosor) en pocillos individuales de un
porta de microscopio de 8 pocillos. Estos portas fueron comprados
como un producto de encargo (de MeDiCa, Encinitas, California) y
fueron almacenados a -70ºC en paquetes individuales sellados que
contenían desecante. Antes de abrir para el uso, cada paquete fue
equilibrado a temperatura ambiente. El detergente enfriado (CHAPS
al 1% en PBS) fue aplicado a cada sección y fue aspirado después de
4 minutos. Después de 3 lavados en PBS enfriado (cada lavado fue
durante de 5 minutos en un agitador), fue aplicada formalina en
tampón fosfato al 10% enfriada y fue aspirada después de 4 minutos.
Después de 3 lavados de más 5 minutos en PBS enfriado, fue aplicado
PBS que contenía suero de cabra normal al 10% (a temperatura
ambiente) y fue aspirado después de 60 minutos.
Fueron aplicados sueros de paciente absorbidos,
diluidos y control (volúmenes de 40 \mul) individualmente a
pocillos que contenían las secciones de tejido tratadas como se
describe anteriormente. Después de 40 minutos a temperatura
ambiente, cada pocillo fue lavado a fondo con PBS enfriado. Una IgG
conjugada con fluorocromo comercial específica para IgG humano (p.
ej., IgG de cabra antihumano fluorinado, Southern Biotechnology
Assoc, Inc, Birmingham, AL) es aplicada entonces a la dilución
apropiada. Después de 35 minutos a temperatura ambiente, los
pocillos fueron lavados a fondo en PBS enfriado y un cubre de vidrio
(Nº. 1 de grosor) fue aplicado a cada porta con el medio de montaje
que contenía un reactivo antidescolorante. Los portas fueron
evaluadas por microscopia de fluorescencia (objetivo 20x) para el
modelo de NMO característico de IgG unido de tejido.
En el sistema nervioso central (SNC), el
antígeno de NMO fue localizado en la cara abluminal de los capilares
en la corteza cerebelar, cerebro medio y médula espinal; en el
nervio óptico, el antígeno de NMO estaba asociado a los procesos de
pia madre y astrocíticos en la región de los capilares entre las
columnas de axon. En secciones óptimamente tratadas de tejidos del
SNC, la microscopia confocal de inmunofluorescencia sugirió que el
antígeno de NMO era un componente de la barrera
sangre-cerebro. La
inmuno-reactividad era inherente en la cicatriz
glial de la unión astrocítica-pial, que se extiende
en el espacio de Virchow-Robin a los microcapilares
en la materia blanca y la materia gris. La inmunotinción dual con
anticuerpos purificados de afinidad de especificidad definida
reveló la co-localización del antígeno de NMO con
acuaporina-4, un componente de proteína de canal de
agua insensible mercurial de la barrera
sangre-cerebro. El antígeno de NMO no es detectable
en secciones de bazo o parénquima de hígado, pero, como
acuaporina-4, está prominentemente asociado a
membranas basolaterales de túbulos recolectores y distales en el
riñón, y con elementos básicos del epitelio mucosal gástrico
profundo.
Usando una dilución limitante de
NMO-IgG en un ensayo inmunofluorescente de
inhibición competitiva, fue demostrada
inmuno-reactividad en la fracción de la membrana
ordinaria preparada a partir de cerebro de rata homogeneizado
después de la eliminación de restos de tejidos y núcleos por
centrifugación diferencial. Esta fracción inactivó potentemente el
modelo inmunofluorescente de NMO-IgG. La fracción
del citosol no absorbió la reactividad de NMO-IgG.
La inmuno-reactividad de la fracción de la membrana
ordinaria resistió la extracción en una solución del 2% del
detergente CHAPS no iónico. Esta observación condujo al
descubrimiento de que el tratamiento de secciones de tejido con
CHAPS del 1% durante 4 minutos, antes o después de la fijación
durante 4 minutos en formalina tamponada con fosfato del 10%,
preservaba la morfología del tejido y realzaba la accesibilidad de
epítopos de NMO a IgG en suero del 70% de pacientes con un
diagnóstico clínico de NMO.
Aunque no esté vinculado a ninguna teoría
particular, la resistencia del antígeno de NMO a la extracción con
detergentes es consecuente con la unión propuesta del extremo
C-terminal citoplásmico de
acuaporina-4 a un dominio PDZ de la proteína
adaptadora \alpha-sintrofina, que es un componente
del complejo de la proteína distrofina (Neely et al.,
PNAS 98:14108, 2001). Otros componentes del complejo
de proteína distrofina de la barrera sangre-cerebro
también pueden ser objetivos pertinentes para los autoanticuerpos de
NMO (Neely et al., supra).
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La tabla 1 muestra los rasgos característicos
que fueron evaluados en cada uno de los tejidos indicados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La intensidad de tinción de cada característica
es clasificada en una hoja de resultados formal (Figura 1), usando
el sistema de puntuación siguiente:
negativo: - o \pm/-
aspecto positivo débil, puede ser ambiguo:
\pm
aspecto positivo definido y fuerte: \pm/+, + o
2+
Un resultado positivo requiere un mínimo de una
puntuación "\pm" que se asigna a los túbulos recolectores y
distales de riñón y a la madre pia cerebelar o cerebro medio o
microvasos.
Se muestran la presencia y la intensidad de
cualquier tinción de matriz nuclear, citoplásmica, membranosa o
extracelular que pueda interferir potencialmente con la
interpretación de NMO-IgG. En particular, la tinción
en cualquiera de los tejidos indicados en la Tabla 2 se muestra
para cada sección de tejido examinada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fue analizado suero de pacientes clasificados
como NMO "definida", la forma óptico-espinal
asiática de EM, o EM clásica por criterios clínicos, de
visualización y fluidos espinales, y a partir de pacientes control,
para autoanticuerpos que podrían unirse selectivamente a los tejidos
del SNC. Los experimentos descritos en este documento muestran el
valor de seropositividad para discriminar NMO de la forma clásica de
la esclerosis múltiple (EM). Los sueros (cifrados en pruebas) eran
de pacientes con NMO definida usando criterios diagnósticos de
grados variantes de severidad (n=45), pacientes con EM clásica
(n=19), pacientes que se evalúan que tienen un riesgo alto de MNO
(neuritis óptica bilateral o ataques aislados o recurrentes de
mielitis transversa recurrente; cada uno asociado a MRI cerebral
negativa, es decir, criterios rigurosos no cumplidos para la
clasificación de NMO "definida") (n=35), y pacientes
finalmente diagnosticados con EM pero que presentaban inicialmente
neuritis óptica o mielitis (n=22). Fue realizada la
inmunofluorescencia indirecta con un sustrato de material compuesto
estándar de cerebro de ratón, estómago y riñón; los sueros fueron
preabsorbidos con extracto de hígado como se describe antes en el
Ejemplo 1.
La IgG en 33 de 45 pacientes (73%) con NMO
proporcionó un modelo de tinción distintivo
("NMO-IgG") asociado a los microvasos en todas
partes de la corteza cerebelar y del cerebro medio, y con materia
pia y una "malla" subpial (prominente en el cerebro medio). El
modelo microvascular no fue visto en mucosa visceral, riñón o
hígado, y NMO-IgG no fue apreciado en ningún grupo
control de enfermedad. Los sueros de 16 de 35 pacientes (46%) que
tenían un riesgo alto de NMO proporcionaron el modelo de tinción
distintivo para NMO-IgG. Ninguno de los 19
pacientes diagnosticados con EM clásica tenía modelos de tinción
detectables de NMO-IgG, mientras que los sueros de
2 de los 22 pacientes (9%) que presentaban neuritis/mielitis óptica
poseían NMO-IgG.
Además, fue identificado NMO-IgG
a propósito en 14 pacientes entre 85 mil cuyos sueros fueron
enviados al Laboratorio de Neuroinmunología de la Clínica Mayo para
pruebas de autoanticuerpos paraneoplásicos a ciego en una base de
servicio. Sus historias posteriormente obtenidas revelaron que 3
cumplían los criterios clínicos para el diagnóstico de NMO, 9
fueron clasificados como de riesgo alto para NMO (7 tenían mielitis
transversa recurrente y 2 tenían neuritis óptica recurrente), 1
tenía mielopatía de nuevo inicio, y 1 tenía un trastorno
inflamatorio del SNC sensible a esteroides no clasificado.
Estos resultados indicaron que el autoanticuerpo
de NMO-IgG es el primer marcador biológico
específico de NMO y es capaz de distinguir entre NMO y EM.
Una proteína de fusión GST que contenía
acuaporina-4 recombinante de rata (residuos del
extremo C-terminal 249-323;
Laboratorios Alamone, Jerusalén, Israel) fue sometida a
electroforesis en un gel de poliacrilamida del 10% en tampón SDS
estándar de Laemmli que contenía
\beta-mercaptoetanol, y fue realizada una
transferencia Western usando suero de pacientes de NMO y de conejo
inmune como control positivo para determinar si la IgG de los
pacientes se unía a la proteína de fusión de
GST-acuaporina de 438 kDa. La transferencia fue
puesta en contacto con sueros humanos (dilución 1:50), que incluían
a 4 pacientes de NMO, 3 personas normales, 1 mielopatía de control,
2 pacientes con EM clásica, y 3 pacientes con trastornos
neuropsiquiátricos diversos. Los sueros de los cuatro pacientes NMO
y del conejo inmune, pero ninguno del suero de los pacientes control
o de pacientes que mostraban los otros trastornos, se unieron a la
proteína de fusión de acuaporina-4 de 38 kDa.
<110> Fundación Mayo para la Educación
Médica y la Investigación
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Marcador para la neuromielitis
óptica
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> FastSEQ para la Versión 4.0 de
Windows
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Un método para detectar la presencia o
ausencia de un autoanticuerpo NMO-específico en una
muestra biológica de un individuo, que comprende las etapas de:
poner en contacto dicha muestra biológica con un
polipéptido antigénico de NMO o su fragmento, en el que dicho
polipéptido antigénico de NMO es acuaporina-4; y
detectar la presencia o ausencia de la unión de
dicho polipéptido antigénico de NMO a dicho autoanticuerpo
NMO-específico en dicha muestra biológica.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la presencia de dicho autoanticuerpo NMO-específico
en dicha muestra biológica está asociada a la incapacidad visual,
debilidad, entumecimiento, espasmos o sensaciones anormales o
dolorosas, y/o pérdida de control de vejiga y/o intestino en dicho
individuo.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
la presencia de dicho autoanticuerpo NMO-específico
está asociada a NMO en dicho individuo.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho polipéptido antigénico de NMO es un polipéptido antigénico de
NMO recombinantemente expresado.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho polipéptido NMO-específico está en un tejido
sólido seleccionado del grupo que consiste en cerebro, médula
espinal, nervio óptico, riñón o estómago.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste en
sangre, suero, plasma y fluido cerebroespinal.
7. Un método para detectar la presencia o
ausencia de un polipéptido antigénico de NMO en una muestra
biológica de un individuo, que comprende las etapas de:
poner en contacto dicha muestra biológica con un
anticuerpo del antígeno anti-NMO, en el que dicho
antígeno NMO es acuaporina-4; y
detectar la unión de dicho anticuerpo del
antígeno anti-NMO a dicha muestra biológica, en el
que la unión es indicativa de la presencia de dicho polipéptido
antigénico de NMO en dicha muestra biológica.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
la presencia del polipéptido antigénico de NMO en dicha muestra
biológica es indicativa de NMO en dicho individuo.
9. El método de la reivindicación 7, en el que
dicho individuo es parcialmente o completamente ciego.
10. El método de la reivindicación 7, en el que
dicha muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste en
sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, biopsia cerebral y
biopsia de médula espinal.
11. El uso de un polipéptido antigénico de NMO
para el diagnóstico in vitro de NMO en un individuo, en el
que dicho polipéptido antigénico de NMO es
acuaporina-4.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que el
polipéptido antigénico de NMO es usado para detectar un
autoanticuerpo del antígeno anti-NMO en dicho
individuo.
13. El uso de la reivindicación 11, en el que el
polipéptido antigénico de NMO es usado junto con un anticuerpo
monoclonal que tiene una afinidad de unión específica para un
polipéptido antigénico de NMO.
14. El uso de un polipéptido antigénico de NMO
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de NMO, en
el que dicho polipéptido antigénico de NMO es
acuaporina-4.
15. Un uso como se reivindica en la
reivindicación 14, en el que el medicamento es para la
administración oral, intravenosa o parenteral.
16. El uso de un ácido nucleico que codifica un
polipéptido antigénico de NMO en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de NMO, en el que dicho polipéptido antigénico
de NMO es aguapolina-4.
17. Un ácido nucleico que codifica un
polipéptido antigénico de NMO para uso en el tratamiento de NMO, en
el que dicho polipéptido antigénico de NMO es
acuaporina-4.
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